Anlisis de Flujos

Metablicos (MFA)
BT7434/5301 - Ingeniera Metablica y Fermentacin
Ayudante: Carlos Humberto Gomez R.
10 de abril de 2014
La ingeniera metablica evala
los cambios que se generan en
forma controlada en el
metabolismo
Estrategias basadas en la
aplicacin de la Ingeniera
Gentica, as como la
optimizacin del proceso logran
incrementar de manera
importante el rendimiento del
producto.
pero ?
Para lograr rendimientos de
expresin cercanos al terico,
solo se lograra con la alteracin
de algunas de las rutas del
metabolismo.
La velocidad de formacin como
el rendimiento estn limitados
en ltima instancia por la
canalizacin del carbono desde
el metabolismo central hacia la
ruta de biosntesis del Producto.
Se debe contar entonces con
modelos matemticos que
describan el metabolismo de la
clula de inters.
La simulacin matemtica de una
red metablica permite
determinar los nodos principales
de la misma y el rendimiento
terico del producto
Niveles de regulacin de las rutas metablicas
Control de la velocidad de reaccin.
Control de las enzimas reguladoras.
Control gentico.
NODO FLEXIBLE
Clasificacin de los Nodos
NODO DBILMENTE RIGIDO
Clasificacin de los Nodos
NODO FUERTEMENTE RIGIDO
Clasificacin de los Nodos
Ejemplos
Fig. 3 Nodo dbilmente rgido
Fig. 5 Nodo fuertemente rgido
Control de la velocidad de reaccin.
Control de las enzimas reguladoras.
Flujos metablicos
Concepto:
Flujo metablico: tasa o velocidad a la que un sustrato
se convierte en producto mediante reacciones
bioqumicas, rutas metablicas.
Sustrato Metabolito Intermedio Producto
Los metabolitos intracelulares (intermediarios) son muy
difciles de cuantificar.
Desarrollo de herramientas para solucionar este
inconveniente.
Mediante el MFA se obtiene la distribucin de flujos intracelulares en
funcin de la medicin de metabolitos externos.
Anlisis de flujos metablicos (MFA)
Concepto:
Anlisis de flujos metablicos (MFA): clculo y el
anlisis de la distribucin de flujos de una va
metablica en un sistema biolgico.
Ejemplo 1
Nomenclatura Significado
A Sustrato
C, E, F Producto
B, D, NADH Metabolitos intermediarios
NADH Co-factor
v Flujo metablico
Definir el sistema.
Identificar las entradas y
salidas del sistema.
Identificar restricciones
(metabolitos).
Numero de reacciones.
Plantear los balances de
materia.
Determinar los grados
de libertad.
Modelacin matemtica del metabolismo

+
=
=

= cantidad de sustancia del compuesto i

0
= flujo de la sustancia i que entra al sistema (mol/tiempo)

= flujo de la sustancia i que sale del sistema (mol/tiempo)

= coeficiente estequiometrico del metabolito i

n = numero de reacciones en la red metablica (sistema)

=velocidad de la reaccin o flujo metablico

Ejemplo 1
Nomencla
tura
Significado
A Sustrato
C, E, F Producto
B, D,
NADH
Metabolitos
intermediarios
NADH Co-factor
v Flujo metablico
Plantear los balances de materia.

- V1 + 0 + 0 + 0 + 0

+
=
=

+ 0 + V2 + 0 + 0 + 0

+ V1 - V2 - V3 +0 + 0

+ 0 0 +V3 V4 - V5

+ 0 + 0 + 0 +V4+ 0

+ 0 + 0 + 0 + 0 + V5

+0+V2+ 0 0 - 2V5
Importante:
Asumir estado pseudo-estacionario para los metabolitos intermediarios
B, D y NADH, los cambios metablicos son muy rpidos (milisegundos
a dcimas de segundos) en comparacin con el crecimiento celular
(horas a das)
Ejemplo 1

+ 0 +V2 + 0 + 0 + 0

- V1 + 0 + 0 + 0 + 0

+ V1 - V2 - V3 +0 + 0

+ 0 +0 +V3 V4 - V5

+ 0 + 0 + 0 +V4+ 0

+ 0 + 0 + 0 + 0 + V5

+0 +V2 +0 + 0 - 2V5
1
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
1
0
1
0
0
0
0
1
1
0
0
0
1
0
0
1
0
0
0
0
1
0
1
2

=
.
1
2
3
4
5
Ejemplo 1
Grados de libertad ?
=

+ 0 +V2 + 0 + 0 + 0
=

- V1 + 0 + 0 + 0 + 0
= + V1 - V2 - V3 +0 + 0
= + 0 +0 +V3 V4 - V5 (D)
=

+ 0 + 0 + 0 +V4 + 0
=

+ 0 + 0 + 0 + 0 + V5
= + 0 + V2 + 0 + 0 - 2V5 (NADH)
Importante:
Asumir estado pseudo-estacionario para los metabolitos intermediarios
B, D y NADH, los cambios metablicos son muy rpidos (milisegundos
a dcimas de segundos) en comparacin con el crecimiento celular
(horas a das)
Ejemplo 1
Grados de libertad = # de reacciones - # metabolitos
Grados de libertad = 5 -3
Nomenclatur
a
Significado
A Sustrato
C, E, F Producto
B, D, NADH Metabolitos
intermediarios
NADH Co-factor
v Flujo metablico
T: matriz de coeficientes
estequiomtricos

=
.
1
2
3
4
5

= 0 + V2 + 0 + 0 + 0

=- V1 + 0 + 0 + 0 +0
= V1 - V2 - V3 +0 + 0
= 0 +0 +V3 V4 - V5 (D)

= 0 + 0 + 0 +V4 + 0

= 0 + 0 + 0 + 0 + V5
= 0 0 +V3 V4 - V5 (NADH)
Ejemplo 1
1 0 0 0 0
0 1 0 0 0
1
0
0
1
0
1
1
1
0
0
1
0
0
1
2
r : vector de flujos medibles
experimentalmente.
V : vector de flujos
intracelulares.
r = T
T
V
T
-1
*r = v
Revolver para :
A=1.0 mol/s
C=0.5 mol/s
Resolviendo (en unidades de mol/s).

1
= 1.0

2
= 0.5

3
= 0.5

4
= 0.25

5
= 0.25
Ejemplo 2
Sustrato (S)

1
Metabolito Intracelular 1 (A)

2

3
Metabolito Intracelular 2 (B) Producto 1 (P1)

4
Metabolito Intracelular 3 (C)

5

6
Producto 2 (P2) Producto 3 (P3)
Definir el sistema.
Identificar las entradas y salidas
del sistema.
Identificar restricciones
(metabolitos).
Numero de reacciones.
Plantear los balances de materia.
Determinar los grados de libertad.
Ejemplo 2
Paso 2: Balance en estado estacionario
para metabolitos intracelulares
A:
1
-
2
= 0
1
=
2
B:
2
-
3
-
4
= 0
2
=
3
+
4
C:
4
-
5
-
6
= 0
4
=
5
+
6
Balance en estado estacionario.
Ecuacin de balance metablico
-r
s
-1 0 0 0 0 0
1
r
p1
0 0 1 0 0 0
2
r
p2
0 0 0 0 1 0
3
r
p3
= 0 0 0 0 0 1
4
0 1 -1 0 0 0 0
5
0 0 1 -1 -1 0 0
6
0 0 0 0 1 -1 -1
6 reacciones, 3 metabolitos en estado estacionario.
Hay 3 grados de libertad, hay que medir 3 flujos:
r
s
= 1 r
p1
= 0,3 r
p2
= 0,5
Ecuacin de balance metablico
-1 -1 0 0 0 0 0
1
0,3 0 0 1 0 0 0
2
0,5 0 0 0 0 1 0
3
0 = 1 -1 0 0 0 0
4
0 0 1 -1 -1 0 0
5
0 0 0 0 1 -1 -1
6
Se omiti r
p3
, la cual queda en funcin de v
6
. Es posible calcular r
p3
resolviendo el sistema.
Esto se utiliza para corroborar lo medido experimentalmente (r
p3
).
r
p3
= 0 0 0 0 0 1
Ecuacin de balance metablico
-1 -1 0 0 0 0 0
1
0,3 0 0 1 0 0 0
2
0,5 0 0 0 0 1 0
3
0 1 -1 0 0 0 0 =
4
0 0 1 -1 -1 0 0
5
0 0 0 0 1 -1 -1
6
-1
Ecuacin de balance metablico
-1 0 0 0 0 0 -1
1
-1 0 0 -1 0 0 0,3
2
0 1 0 0 0 0 0,5
3
-1 -1 0 -1 -1 0 0 =
4
0 0 1 0 0 0 0
5
-1 -1 -1 -1 -1 -1 0
6
Resultado
1
1
1
2
0,3
3
0,7 =
4
0,5
5
0,2
6
Ejercicio 1
B A
C
D E
F G
H

1
ATP
CO
2

2
NAD
+
NADH

3
ATP

4
CO
2

5
ATP
CO
2

6
NAD
+
NADH

7
NAD
+
NADH
ATP
ADP
ADP
ADP
ADP
Reacciones

1
1. A + ATP C + CO
2

2
2. B + NAD
+
C

3
3. C D + ATP

4
4. C E + CO
2

5
5. D + ATP F + CO
2

6
6. D G + NAD
+

7
7. F + ATP H + NAD
+
Ojo! Slo considerar una especie de cada par de co-factor: o ATP o ADP; o NAD
+
o NADH, etc.
Balance en estado estacionario
para metabolitos intracelulares
C:
1
+
2
-
3
-
4
= 0
1
+
2
=
3
+
4
D:
3
-
5
-
6
= 0
3
=
5
+
6
F:
5
-
7
= 0
5
=
7
ATP: - 1 + 3 -
5
-
7
= 0
3 = 1 +
5
+
7
NAD
+
: -
2
+
6
+
7
= 0
2
=
6
+
7
Balance en estado estacionario.
7 incgnitas, 5 metabolitos en estado estacionario
2 grados de libertad, hay que medir 2 metabolitos:
r
A
= -2 r
B
= -3
Ecuacin de Balance Metablico
RA -1 0 0 0 0 0 0
RB 0 -1 0 0 0 0 0
RE 0 0 0 1 0 0 0 1
RG 0 0 0 0 0 1 0 2
RH 0 0 0 0 0 0 1 3
RCO2 = 1 0 0 1 1 0 0 4
0 1 1 -1 -1 0 0 0 5
0 0 0 1 0 -1 -1 0 6
0 0 0 0 0 1 0 -1 7
0 -1 0 1 0 -1 0 -1
0 0 -1 0 0 0 1 1
7 incgnitas, 5 metabolitos en estado estacionario
2 grados de libertad, hay que medir 2 metabolitos:
R
A
= -2 R
B
= -3
Ecuacin de balance metablico
RA -1 0 0 0 0 0 0
RB 0 -1 0 0 0 0 0
RE 0 0 0 1 0 0 0 1
RG 0 0 0 0 0 1 0 2
RH 0 0 0 0 0 0 1 3
RCO2 = 1 0 0 1 1 0 0 4
0 1 1 -1 -1 0 0 0 5
0 0 0 1 0 -1 -1 0 6
0 0 0 0 0 1 0 -1 7
0 -1 0 1 0 -1 0 -1
0 0 -1 0 0 0 1 1
Ecuacin de Balance Metablico
-2 -1 0 0 0 0 0 0 1
-3 0 -1 0 0 0 0 0 2
0 1 1 -1 -1 0 0 0 3
0 = 0 0 1 0 -1 -1 0 4
0 0 0 0 0 1 0 -1 5
0 -1 0 1 0 -1 0 -1 6
0 0 -1 0 0 0 1 1 7
Ecuacin de Balance Metablico
-1 0 0 0 0 0 0 -2 1
0 -1 0 0 0 0 0 -3 2
0 -1 0 1 1 0 1 0 3
-1 0 -1 -1 -1 0 -1 0 = 4
0,5 -0,5 0 0,5 1 -0,5 0,5 0 5
-0,5 -0,5 0 -0,5 0 0,5 0,5 0 6
0,5 -0,5 0 0,5 0 -0,5 0,5 0 7
Resultado
2 1
3 2
3 3
2 = 4
0,5 5
2,5 6
0,5 7
2 3
3
2
0.5
2.5
0.5
B A
C
D E
F G
H
ATP
CO
2
NAD
+
NADH
ATP
CO
2
ATP
CO
2
NAD
+
NADH
NAD
+
NADH
ATP
ADP
ADP
ADP
ADP
Matriz de coeficientes estequiomtricos
Nomenclatura Significado
S Sustrato
P Producto
M Metabolitos intermediarios
T =
Matriz:
1. Rango Completo. No hay
dependencia lineal.
2. Nmero de condicionamiento
<100. Baja propagacin de error.
Sistema exactamente determinado:
Si el nmero de tasas de metabolitos medidos es igual al
nmero de grados libertad del sistema, entonces la
solucin es nica.
Segn la estructura de la matriz estequiomtrica, el sistema
puede encontrarse de 3 formas:
1. Determinado.
2. Sobredeterminado.
3. Subdeterminado
Anlisis de flujos metablicos
v T ) (T r (T)
-1 -1

r
-1
) (T v
v T r
Anlisis de Flujos metablicos
Segn la estructura de la matriz estequiomtrica, el sistema puede
encontrarse de 3 formas:
1. Determinado.
2. Sobredeterminado.
3. Subdeterminado
v T r
Sistema sobredeterminado:
Si el nmero de tasas de metabolitos medidos es mayor al
nmero de grados libertad del sistema, entonces las
redundancias de valores de flujos pueden ser usadas para:
Calcular la mejor distribucin de flujos intracelulares.
Corroborar la hiptesis de estado estacionario comparando
los valores calculados de flujos extracelulares versus los
valores experimentales (no empleados para solucionar el
sistema).
Sistema subdeterminado:
Si el nmero de tasas de metabolitos medidos es menor al
nmero de grados libertad hay un nmero infinito de
soluciones para la red metablica.
Es necesario agregar restricciones: solucin con optimizacin
lineal, imponiendo una funcin objetivo apropiada (max.
biomasa; min. hidrlisis de ATP, etc.).
As, se obtiene una nica distribucin de flujos intracelulares
por medio de la optimizacin.
Anlisis de Flujos metablicos
v T r
Segn la estructura de la matriz estequiomtrica, el sistema
puede encontrarse de 3 formas:
1. Determinado.
2. Sobredeterminado.
3. Subdeterminado
max biomasa
Anlisis de flujos metablicos (MFA)
Herramienta utilizada para determinar flujos metablicos
intracelulares en funcin de las tasas de consumo (o produccin) de
compuestos medibles extracelularmente.
Se emplean modelos estequiomtricos de las vas y balances de masa
para metabolitos intracelulares.
Se miden los flujos de metabolitos extracelulares.
Unidad de medida caracterstica: [mmol X gDCW
-1
h
-1
]. Donde X es un
compuesto medible extracelularmente; DCW: biomasa en peso seco; h:
tiempo (horas, das, etc.).
Se obtiene un mapa de flujos metablicos que permite comparar
distintas condiciones y encontrar particularidades en la va:
Nodos rgidos.
Por lo tanto, para utilizar MFA se necesita:
Matriz estequiomtrica (T ).
Vector de flujos en estado estacionario (v).
Vector de flujos medibles (r). Considerar grados de libertad.
Indica el nmero mnimo de tasas extracelulares a medir para resolver
el sistema.
Grados de libertad = n Reacciones n metabolitos intracelulares.
PREGUNTAS