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Electroforesis Capilar (CE).

Bases de Electroforesis Capilar.
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3
Qu es la Electroforesis?
Es el movimiento de una
molcula cargada debido a
un campo elctrico externo,
es decir, si se coloca una
muestra inica y le es
aplicado un potencial, sta
tender a dirigirse hacia el
polo opuesto a su propia
carga.
+
+
-
4
Movimiento de una molcula cargada
debido a un campo elctrico externo.
3
5
Fuerza de
aceleracin
Fuerza de
friccin
fv qE =
La movilidad electrofortica es la
constante de proporcionalidad entre la
velocidad del in y la fuerza del
campo elctrico.
E E
f
q
v =
q =carga del ion
E =campo elctrico
f =coeficiente de friccin
v =velocidad del ion
6
Separacin dentro de tubos capilares.
N
N
N
N
4
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Un poco de Historia
Es una tcnica relativamente
nueva, el primer instrumento
comercial apareci en los aos
80s.
La EC experiment desde su
aparicin un crecimiento muy
importante, situndose rpidamente
para el anlisis de una gran
variedad de muestras, compitiendo
en la mayora de ellas con las
tcnicas de mayor tradicin
analtica como HPLC y CG.
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Principales Caractersticas de
CE.
Se desarrolla en un capilar de slice fundida
(i.d. 25-150 m).
Opera en medio acuoso (aunque actualmente se
est desarrollando en solventes orgnicos
polares [NACE]).
5
9
Principales Caractersticas de
CE.
Se requieren volmenes muy pequeos de
muestra (1-50 nL inyectados).
A travs del capilar son aplicados altos voltajes
(10 a 30 kV) y campos elctricos (100 a 1000 V
cm
-1
)
10
Principales Caractersticas de
CE.
La alta resistencia del capilar limita la
generacin de corriente y el calentamiento
interno.
Presenta alta eficiencia (N>10
5
a 10
6
) y tiempos
de anlisis cortos.
Tiene numerosas modalidades y un amplio
rango de aplicacin.
6
11
Principales Caractersticas de
CE.
El desarrollo del mtodo es muy simple.
Instrumentacin automatizada.
La deteccin se puede llevar a cabo de 2
formas:
On-capillary.
Decoupleddetectioncell.
Instrumentacin.
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13
14
Principio de CE.
8
15
Mtodos de Inyeccin de Muestra.
Inyeccin Hidrodinmica.
16
Mtodos de Inyeccin de Muestra.
Inyeccin Electrocintica.
9
17
Mtodos de Inyeccin de Muestra.
Inyeccin por Vaco.
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Mtodos de Inyeccin de Muestra.
Inyeccin por Sifoneo.
10
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Cmo detecto las especies?
20
Flujo
Electroosmtico
(EOF)
11
21
Superficie de Slice fundida
cargada negativamente.
22
Los cationes hidratados se acumulan
cerca de la superficie.
12
23
El flujo va en direccin hacia el ctodo
cuando se aplica el campo elctrico.
24
EOF EOF
13
25
Caractersticas:
Flujo electroosmtico Flujo parablico
CE GC, HPLC CE GC, HPLC
Menor ancho de banda Menor ancho de banda Mayor ancho de banda Mayor ancho de banda
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La velocidad del EOF es mayor a
la movilidad de cualquier especie,
independientemente de su carga.
Caractersticas:
14
27
N
N
N
N
Separacin por Electroforesis Capilar
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Electroferograma
Tiempo de migracin (min)
S
e

a
l
15
Modos de Operacin de EC.
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Hidrofbicas/ interacciones
inicas con
micelas/retardacin.
Cromatografa Micelar
Electrocintica (MEKC)
Tamao y Carga Electroforesis Capilar en
Gel (CEG)
Solucin Libre/relacin
masa carga.
(FS/ capilares fundidos)
Electroforesis Capilar de
Zona (CZE)
Bases de la Separacin. Modo de Operacin
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Movimientos Frontera Isotacoforesis(ITP)
Interaccin con fases
slidas/retardacin.
Electrocromatografa
Capilar (CEC)
Punto Isoelctrico. Electroforesis de Enfoque
Isoelctrico(IEF)
Bases de la Separacin. Modo de Operacin
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Electroforesis Capilar de Zona
F
o
r
m
a

m

s

s
i
m
p
l
e

d
e

E
C
M
i
g
r
a
c
i

n

p
o
r

d
i
f
e
r
e
n
c
i
a

d
e

c
a
r
g
a
.
17
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Mecanismo de Separacin por
Electroforesis Capilar de Zona
Desarrollada en capilares de slice descubiertos y
permanentemente o dinmicamente en capilares
cubiertos.
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CE +Crom. =MECK
Caracterstica: separa especies neutras
A
d
i
c
i

n

d
e

t
e
n
s
o
a
c
t
i
v
o
s
p
o
r

a
r
r
i
b
a

d
e

s
u

C
M
C
N
N
N
N
N
N
N
N
CMC=concentracin micelar crtica
Cromatografa Micelar Electrocintica.
18
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Electroforesis Capilar en Gel
Basada en la
Electroforesis en Gel
convencional.
Separacin
basada en el
tamao.
Capilar relleno con
polmero, acta como
tamiz molecular.
Algunas protenas y ADN
tienen masa/carga similares
deben separarse por CGE.
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Electroforesis de Enfoque Isoelctrico
Separacin
basada en el
Punto Isoelctrico.
Generacin
de un gradiente
de pH
19
37
Electroforesis de Enfoque Isoelctrico
Separacin
basada en el
Punto Isoelctrico.
Generacin
de un gradiente
de pH
pH
38
Electroforesis de Enfoque Isoelctrico
pH
20
39
Electroforesis de Enfoque Isoelctrico
pH
Separacin
basada en el
Punto Isoelctrico.
Generacin
de un gradiente
de pH
40
Electroforesis de Enfoque Isoelctrico
pH
Separacin
basada en el
Punto Isoelctrico.
Generacin
de un gradiente
de pH
21
41
Electroforesis de Enfoque Isoelctrico
Separacin
basada en el
Punto Isoelctrico.
Generacin
de un gradiente
de pH
Instrumentacin.
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Reservorios
Electrolitos
Muestras
Fuente de poder
Sistema de deteccin Capilar
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23
45
Capilares
Composicin (Slice).
Dimetro interno (25-75 m).
Longitud (30-75 cm).
Modificados.
Control temperatura.
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Detectores
UV-VIS
Diseo especial
Deteccin Universal
Amplio intervalo
DAD
Fluorescencia
Fcil adaptacin
Alta sensibilidad
Derivatizacin
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Detectores
Espectrometra Masas
Problema de interfase (electro-spray)
Caracterizacin absoluta
Verstil
Aplicaciones.
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Separaciones quirales
Biociencia
Medioambiente
Alimentos
Industria
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Separaciones Quirales.
Gran importancia en Farmacia y Alimentos
Tradicionalmente se realizan por HPLC y GC
D,L aminocidos
Frmacos
Ismeros
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Biociencia
Gran cantidad de aplicaciones.
Pptidos y protenas (caracterizacin, secuenciacin, pI,
etc.)
cidos nucleicos y pruebas de pureza
Drogas, frmacos y metabolitos (tabletas, inyectables,
etc.)
Forense (LSD, morfina, cocana, plvora, etc.)
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Medioambiente
Variedad de anlisis medioambientales:
Aguas (ros, lagos, lluvia, potable, residuales, etc.)
Suelos (cultivos, lixiviados, suelos varios)
Ejemplos de aplicaciones: cidos orgnicos, colorantes,
sustancias hmicas, pesticidas, iones inorgnicos,
aminas, tensoactivos, cidos aromticos, etc.
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Alimentos
Muestras analizadas:
Aguas
Frutas
Bebidas refrescantes
Bebidas alcohlicas
Leche y productos lcteos
Pescados y mariscos
Carnes
Hortalizas y vegetales
Cereales
Y ms...
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Alimentos
Sustancias estudiadas:
Iones inorgnicos (sodio, potasio, calcio, magnesio,
cloruros, fosfatos, citratos, etc.).
cidos orgnicos (maleato, citrato, acetato, lactato,
ascrbico, etc.)
Otros compuestos Orgnicos (cafena, histaminas,
pesticidas, azcares, edulcorantes artificiales, etc.)
Protenas (Suero de leche, queso, preparados
protenicos, etc.)
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Industria
Diversas reas de aplicacin: materia prima, control
de calidad, aguas residuales, etc.
Caracterizacin de polmeros
Compuestos sintticos
Contaminantes
Se incluyen las aplicaciones anteriores
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0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5
Tiempo (min)
A
b
s

(
m
U
.
A
.
)
(Orina)
(Estndar)
(Orina dopada)
T
OTC
DT
R1
OH O
CH3 R2
R3
H
N(CH3)2
OH
OH O
OH
O
NH2
pKa1
pKa2
pKa3
pKa4
-OH -H -Cl Doxitetraciclina
-H -OH -H Oxitetraciclina
-H -OH -H Tetraciclina
R
3
R
2
R
1
Nombre comn