HPLC

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC)
CARACTERISTICAS Y EQUIPOS UTILIZADOS

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE AGROINDUSTRIAS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
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1. CARACTERISTICAS Y EQUIPOS.
1.1. Caractersticas ms importantes
Aplicaciones principales: Tcnica de separacin para los materiales menos
voltiles e inicos; anlisis cuantitativo de multicomponentes.
Fenmeno molecular: Reparto entre una solucin lquida y un substrato.
Ventajas en el anlisis cualitativo: Separa materiales para su examen por
medio de otras tcnicas.
Ventajas en el anlisis cuantitativo: Aplicacin amplia a los materiales menos
voltiles, anlisis de multicomponentes.
Muestra promedio deseable: 10 mg
Limitaciones del mtodo: Se tarda en desarrollar el mtodo
Limitaciones para la muestra: Ninguna
2. Equipos.
Detectores de absorbancia ultravioleta, de conductividad inica y de ndices de
refraccin.
Termostatos para control de la temperatura de la columna.
Detectores de absorcin ultravioleta, ndices de refraccin, fluorescencia,
conductividad, serie de diodos (UV) y espectrometra de masas.
Termostatos para control de la temperatura de la columna. Un inyector automtico de
muestras.
Ahora se va a tratar de los cuatro tipos bsicos de cromatografa en los que la fase
mvil es un lquido: (1) cromatografa de reparto; (2) cromatografa de adsorcin, o
lquido-slido; (3) cromatografa inica; y (4) cromatografa de exclusin por tamaos,
o en geles. Todo este captulo tiene relacin con las aplicaciones en columna de estos
cuatro importantes tipos de cromatografa.
En una primera etapa la cromatografa de lquidos se realizaba en columnas de vidrio
con dimetros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500 cm. En este tipo de columnas
realiz Tswett sus trabajos originales. Para asegurar unos caudales razonables, el
dimetro de las partculas de la fase estacionaria slida por lo general era de 150 a 200
m. Incluso as, los caudales eran bajos, llegando a unas pocas dcimas de mililitro por
minuto. En consecuencia, los tiempos de separacin eran largos -a menudo de varias

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horas-. Los intentos para acelerar el procedimiento clsico mediante la aplicacin de
vaco, o por bombeo no resultaron efectivos, puesto que el aumento de caudal originaba
un aumento de la altura de plato por encima del mnimo caracterstico que se observa en
las grficas de la altura de plato frente al caudal y el resultado era una menor eficacia.
En las primeras etapas del desarrollo de la cromatografa de lquidos, los cientficos se
dieron cuenta de que se podan conseguir grandes aumentos en la eficacia de la columna
disminuyendo el tamao de las partculas de los rellenos. Sin embargo, no fue sino
hasta finales de los aos sesenta cuando se desarroll la tecnologa adecuada para
producir y utilizar rellenos de tamao de partcula del orden de los 3 o 10 m. Esta
tecnologa requiere una instrumentacin sofisticada, que contrasta con las simples
columnas de vidrio de la cromatografa de lquidos clsica. Para distinguir estos
procedimientos ms nuevos de los mtodos bsicos, que todava se utilizan con fines
preparativos, se emplea la denominacin de cromatografa de lquidos de alta resolucin
(HPLC).
Es incuestionable que la cromatografa de lquidos de alta resolucin es la tcnica de
separacin ms ampliamente utilizada, con unas ventas anuales de equipos de HPLC
que se aproximan a la cifra de cientos de miles de millones de pesetas. Las razones de la
popularidad de esta tcnica son su sensibilidad, su fcil adaptacin a las
determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separacin de especies no
voltiles o termolbiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de
primordial inters en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en
general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los aminocidos, protenas,
cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas, terpenoides, plaguicidas,
antibiticos esteroides, especies organometlicas y una cierta variedad de sustancias
inorgnicas.
La Figura 4.1 pone de manifiesto que los distintos procedimientos que utilizan la
cromatografa de lquidos tienden a ser complementarios por lo que a sus campos de
aplicacin se refiere. As, para solutos con masas moleculares superiores a 10 000, a
menudo se utiliza la cromatografa de exclusin, aunque ahora tambin es posible tratar
estos compuestos con cromatografa de reparto en fase inversa. Para especies inicas de
baja masa molecular, se utiliza con frecuencia la cromatografa de intercambio inico.

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Los mtodos de reparto se aplican a las especies poco polares pero no inicas. Adems,
este procedimiento se utiliza muchas veces para la separacin de los integrantes de una
serie homloga. La cromatografa de adsorcin se elige con frecuencia para separar
compuestos como, por ejemplo, los hidrocarburos alifticos de los alcoholes alifticos.

Figura 4.1. Aplicaciones de la cromatografa de lquidos.
Por otro lado, la discusin sobre el ensanchamiento de banda del tema 2 es aplicable a
la cromatografa de lquidos. A continuacin se ilustra el importante efecto del tamao
de partcula del relleno y se describen otras dos causas del ensanchamiento de zona, que
a veces son de notable importancia en cromatografa de lquidos:

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Efectos del tamao de partcula del relleno. El coeficiente de transferencia de masa de
la fase mvil es funcin inversa del cuadrado del dimetro de las partculas que
constituyen el relleno. Como consecuencia de ello, la eficacia de una columna de HPLC
debera mejorar espectacularmente cuando disminuye el tamao de partcula. Por
ejemplo una reduccin del tamao de partcula de 45 a 6 m origina una disminucin
de diez o ms veces de la altura de plato.
Ensanchamiento de banda extracolumna en cromatografa de lquidos. En cromatografa
de lquidos, tiene lugar a veces un ensanchamiento de banda significativo fuera del
relleno de la columna. Este ensanchamiento, denominado ensanchamiento de banda
extracolumna, tiene lugar cuando se transporta el soluto a travs de tubos como los que
se utilizan en los sistemas de inyeccin, en los detectores y en los tubos que conectan
los distintos componentes del sistema. El ensanchamiento proviene de la diferente
velocidad de flujo que hay entre las capas de lquido adyacentes a las paredes del tubo y
las del centro. Como consecuencia, la parte central de una banda de soluto se mueve
con ms rapidez que la periferia. En cromatografa de gases la difusin compensa la
dispersin extracolumna. Sin embargo, la difusin en los lquidos es significativamente
menor, y con frecuencia este tipo de ensanchamiento de banda se hace evidente.
Cuando se utilizan columnas de pequeo dimetro, el ensanchamiento extracolumna
puede hacerse bastante importante. En este caso, todos los esfuerzos han de orientarse a
la reduccin del radio de los tubos del sistema externos a la columna.
Efecto del tamao de muestra en la eficacia de la columna. La cantidad de muestra (g
de muestra/g de relleno) tambin afecta a la eficacia de la columna. Para las
aplicaciones con columnas de reparto y adsorcin, la eficacia decrece notablemente con
la cantidad de muestra. En columnas de fase inversa el decrecimiento en eficacia es
mucho ms pequeo.
3. Instrumentacin para cromatografa de lquidos.
Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamao de
partcula entre 3 y 10 m, que, por otra parte, son comunes en la moderna
cromatografa de lquidos, se requieren presiones de algunos cientos de kilos por
centmetro cuadrado. Como consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo
necesario para la HPLC tiende a ser ms sofisticado y caro que el que se utiliza en otros

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tipos de cromatografa. La Figura 4.2 muestra un esquema de los componentes
fundamentales de un cromatgrafo de lquidos de alta resolucin tpico. Cada uno de los
componentes se trata en los prrafos que siguen a continuacin.

Figura 4.2. Esquema de un aparato de HPLC.
3.1. Recipientes para la fase mvil y sistemas para el tratamiento de los
disolventes.
Un aparato moderno de HPLC se equipa con uno o ms recipientes de vidrio o de
acero inoxidable, cada uno de los cuales contiene unos 500 mL de un disolvente.
Los recipientes a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases
disueltos en general oxgeno y nitrgeno- que interfieren formando burbujas en
los sistemas de deteccin. Un desgasificador puede consistir en un sistema de
bombeo por vaco, un sistema de destilacin, dispositivos para calentar y agitar los
disolventes o, como se muestra en la Figura 4.2, sistemas de difusin que permiten
arrastrar los gases disueltos fuera de la solucin mediante finas burbujas de un gas
inerte de baja solubilidad. Con frecuencia estos sistemas tambin contienen un
dispositivo para la filtracin del polvo y de las partculas slidas en suspensin de

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los disolventes. No es necesario que los desgasificadores y los filtros sean partes
integrantes de los sistemas de HPLC como se muestra en la Figura 4.2. Por
ejemplo, una forma conveniente de tratar los disolventes antes de introducirlos en
el recipiente, consiste en filtrarlos mediante el vaco a travs de un filtro de poro
muy pequeo. Este tratamiento elimina los gases adems de la materia en
suspensin.
Una separacin que utiliza un solo disolvente de composicin constante se
denomina una elucin isocrtica. Con frecuencia, la eficiencia de la separacin se
aumenta notablemente por una elucin con gradiente. En este caso se utilizan dos
(y a veces ms) disolventes con una polaridad significativamente distinta. Una vez
comienza la elucin, se vara la relacin de los disolventes de forma programada, a
veces continuamente y a veces mediante una serie de etapas escalonadas. Los
instrumentos en la moderna HPLC a menudo estn equipados con unos dispositivos
que permiten introducir los disolventes desde dos o ms recipientes en una cmara
de mezcla a una velocidad que vara continuamente y la relacin de volumen de los
disolventes se puede modificar lineal o exponencialmente con el tiempo. La Figura
4.3 ilustra la ventaja de una elucin con gradiente en la separacin de una mezcla
de cloro bencenos. La curva (b) corresponde a la elucin isocrtica con
metanol/agua 50:50 (v/v). La curva (a) muestra la elucin con gradiente, que se
inicia con una mezcla 40:60 de los dos disolventes y se va aumentando la
concentracin de metanol un 8%/min. Obsrvese que la elucin con gradiente
acorta notablemente el tiempo de separacin sin sacrificar la resolucin de los
primeros picos. Ntese tambin que la elucin con gradiente produce unos efectos
similares a los producidos por la programacin de temperatura en cromatografa de
gases.
3.2. Sistemas de bombeo.
Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son rigurosos e incluyen: (1) la
generacin de presiones por encima de 400 kg/cm2, (2) un flujo libre de
pulsaciones, (3) un intervalo de caudales de 0.1 a 10 mL/min, (4) el control y
reproducibilidad del caudal mejor del 0,5% relativo y (5) componentes resistentes a
la corrosin (juntas de acero inoxidable o tefln). Debe subrayarse que las altas

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presiones que generan las bombas de HPLC no constituyen un riesgo de explosin,
debido a que los lquidos no son muy compresibles. De este modo, la rotura de un
componente del sistema slo supone una prdida de disolvente. Es evidente que
esta prdida puede suponer un riesgo de incendio.

Figura 4.3. Mejora de la eficiencia de la separacin mediante la elucin con
gradiente. Columna de 1 m x 2.1 mm d.i. de acero inoxidable, relleno 1%
Permaphase ODS. Muestra: 5 L de bencenos clorados en isopropanol.
Detector: fotmetro de UV (254 nm). Condiciones: temperatura 60C, presin
80 kg/cm2. (a) elucin con gradiente: metanol 40% / agua 60% e incremento

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de la proporcin de metanol a una velocidad de un 8% / min (b) Elucin
isocrtica con metanol 50% / agua 50%.
3.2.1. Tipos de bombas.
Se utilizan tres tipos de bombas, cada una con sus propias ventajas y
desventajas: bombas recprocas, bombas de jeringa o de desplazamiento y
bombas neumticas o de presin constante.
Las bombas recprocas, que se utilizan en aproximadamente el 90% de los
sistemas de HPLC comercializados, consisten, por lo general, en una
pequea cmara en la que el disolvente es impelido por el movimiento de
vaivn de un pistn accionado por un motor. Dos vlvulas con cierre de
bola, que se abren y cierran alternativamente, controlan el flujo del
disolvente hacia dentro y hacia afuera de un cilindro. Las bombas
recprocas tienen la desventaja de que producen un flujo con pulsaciones,
las cuales se han de amortiguar dado que su presencia se manifiesta como
ruido en la lnea base en el cromatograma. Entre las ventajas de las
bombas recprocas se pueden citar su pequeo volumen interno (35 a 400
mL), sus altas presiones de salida (por encima de los 500 kg/cm
2
), su fcil
adaptacin a la elucin con gradiente, y sus caudales constantes, que son
prcticamente independientes de la contrapresin de la columna y de la
viscosidad del disolvente.
3.2.2. Amortiguadores de pulsos.
Muchos de los detectores utilizados en HPLC son sensibles a variaciones
de flujo. Un mtodo sencillo de amortiguacin contiene un fuelle flexible
o un gas compresible en la porcin superior cerrada de un tubo en T para
absorber parte de la energa de pulsacin. Cuando la bomba se rellena
esta energa se libera para ayudar a suavizar la pulsacin de presin. Los
amortiguadores electrnicos de pulsos proporcionan una carrera hacia
delante corta y rpida del pistn, y enseguida la carrera rpida de recarga
de la bomba. El pequeo impulso hacia delante amortigua el pulso de
flujo llevando disolvente a la presin del sistema.


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3.2.3. Control del caudal y sistemas de programacin.
Como una parte de sus sistemas de bombeo, muchos instrumentos
comerciales se equipan con dispositivos controlados por ordenador que
permiten medir el caudal mediante la determinacin de la cada de presin
a travs de un restrictor colocado en la salida de la bomba. Cualquier
diferencia entre la seal y un valor preestablecido se utiliza para aumentar
o disminuir la velocidad del motor de la bomba.
Por otro lado, la mayor parte de los instrumentos pueden variar la
composicin del disolvente bien sea de una forma continua o bien de
forma escalonada.
3.3. Sistemas de inyeccin de muestra
A menudo, el factor limitante en la precisin de las medidas en cromatografa de
lquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la
columna. El problema se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaa a
la sobrecarga de las columnas. Por ello, los volmenes que se emplean han de ser
muy pequeos, de unas pocas dcimas de micro litro a tal vez 500 L. Adems, se
ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema.
En cromatografa de lquidos el mtodo ms ampliamente utilizado para la
introduccin de la muestra utiliza bucles de muestra, como el que se muestra en la
Figura 4.4. Estos dispositivos estn normalmente integrados en el equipo
cromatogrfica y hay bucles intercambiables que permiten la eleccin de tamaos
de muestra desde 5 a 500 L. Con bucles de este tipo se puede introducir la
muestra a presiones de hasta 500 kg/cm2 con una precisin relativa de unas
dcimas por ciento.
Tambin existen vlvulas de inyeccin de micro muestras, con bucles con
volmenes de 0,5 a 5 L.

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Figura 4.4. Bucle de muestra para cromatografa de lquidos.
3.4. Columnas para cromatografa de lquidos.
Las columnas para cromatografa de lquidos se construyen de ordinario con tubo
de acero inoxidable de dimetro interno uniforme. Cientos de columnas
empaquetadas que difieren en tamao y relleno se comercializan por distintos
fabricantes y su coste oscila, por lo general, de 30 000 a 100 000 pesetas.
3.4.1. Columnas analticas.
La mayora de las columnas para cromatografa de lquidos tienen una
longitud entre 5 y 30 cm. Por lo comn, las columnas son rectas y se pueden
alargar, si es necesario, acoplando dos o ms columnas. El dimetro interno
de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaos de las partculas
de los rellenos ms comunes son 3, 5 y 10 m.
Tal vez la columna ms frecuentemente utilizada es la de 25 cm de longitud
y 4.6 mm de dimetro interno, y empaquetada con partculas de 5 m. Estas
columnas tienen de 40 000 a 60 000 platos/metro.
Tambin, se han empezado a fabricar columnas de alta resolucin ms
rpidas, las cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente
descritas. Estas columnas pueden tener dimetros internos que oscilan entre
1 y 4.6 mm y se rellenan con partculas de 3 o 5 m. A menudo su longitud
es de 3 a 7.5 cm. Estas columnas tienen hasta 100 000 platos/metro y
presentan la ventaja de la rapidez y del mnimo consumo de disolvente. La

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ltima propiedad es de considerable importancia, puesto que los disolventes
de alta pureza que se requieren en cromatografa de lquidos son muy caros.
3.4.2. Pre columnas.
En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analtica, se
coloca delante una pre columna que elimina la materia en suspensin y los
contaminantes de los disolventes. Adems, en cromatografa lquido-lquido,
la pre columna sirve para saturar la fase mvil con la fase estacionaria y as
minimizar las prdidas de sta en la columna analtica. La composicin del
relleno de la pre columna debe ser semejante al de la columna analtica; sin
embargo, el tamao de partcula es por lo comn mayor para minimizar la
cada de presin.
3.4.3. Termostatos.
En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura,
y las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces
si se controla la temperatura de la columna en unas pocas dcimas de grado
centgrado, se obtienen mejores cromatogramas. La mayora de los
instrumentos comerciales llevan actualmente hornos para las columnas que
controlan la temperatura de la columna a las dcimas de grado, desde la
temperatura ambiente hasta 150 C. Para poder controlar con precisin la
temperatura, las columnas tambin se pueden colocar en camisas con agua
que provenga de un bao a temperatura constante.
3.4.4. Tipos de rellenos de la columna.
En cromatografa de lquidos se han utilizado dos tipos bsicos de rellenos,
pelicular y de partcula porosa. El primero consiste en bolas de vidrio o de
polmero, no porosas y esfricas con unos dimetros caractersticos de 30 a
40 m. En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa
de slice, almina o de una resina de intercambio inico. Para algunas
aplicaciones se aplica un recubrimiento adicional, constituido por una fase
estacionaria lquida que se mantiene fija por adsorcin. Las bolas tambin se
pueden tratar qumicamente para obtener una capa superficial orgnica. Por
lo general, los rellenos peliculares se utilizan ampliamente en las pre

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columnas y no en las columnas analticas. Los tpicos rellenos de partculas
porosas de cromatografa de lquidos estn formados por micropartculas
porosas con dimetros entre 3 y 10 m y con la menor dispersin posible
para un tamao determinado. Las partculas son de slice, almina o resinas
de intercambio inico, aunque la slice es el material ms comn. Las
partculas de slice se sintetizan aglomerando partculas de slice de tamaos
inferiores al micrn en unas condiciones tales que se forman partculas
mayores con dimetros muy uniformes.
Las partculas que resultan se recubren muchas veces con pelculas
orgnicas, que se unen qumica o fsicamente a la superficie.
3.4.5. Detectores
A diferencia de la cromatografa de gases, en la cromatografa de lquidos no
hay detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los
detectores de ionizacin de llama y de conductividad trmica. Uno de los
mayores retos en el desarrollo de la cromatografa de lquidos ha sido el
perfeccionamiento de los detectores.
Un detector ideal para cromatografa de lquidos debera poseer todas las
propiedades listadas en relacin con la cromatografa de gases, con la
excepcin de que un detector para cromatografa de lquidos no es necesario
que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. Adems, un
detector de HPLC debe tener un volumen interno mnimo a fin de reducir el
ensanchamiento de banda.
Los detectores en cromatografa de lquidos son de dos tipos bsicos. Los
detectores basados en una propiedad de la disolucin responden a una
propiedad de la fase mvil, tal como el ndice de refraccin, la constante
dielctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos.
Por contraste, los detectores basados en una propiedad del soluto responden
a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia UV,
fluorescencia, o intensidad de difusin, que no son propias de la fase mvil.
En la Tabla 4.1 se indican los detectores ms comunes empleados en HPLC
y algunas de sus propiedades ms importantes. Un informe de 1982 sobre

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365 trabajos publicados en los que tena un papel importante la
cromatografa de lquidos, revel que el 71 % se utilizaban en la deteccin
de la absorcin UV, el 15% la fluorescencia, el 5,4% el ndice de refraccin,
el 4,3% empleaba medidas electroqumicas y el 4,3% restante otras medidas.
3.4.5.1. Detectores de absorbancia
La Figura 4.5 muestra el esquema de una cubeta de flujo en forma
de Z para la medida de la absorbancia de los efluentes de una
columna cromatogrfica. A fin de minimizar el ensanchamiento de
banda extra columna, el volumen de estas cubetas ha de ser lo
menor posible, de modo que los volmenes se limitan por lo comn
de 1 a 10 L y las longitudes de la cubeta de 2 a 10 mm. La
utilizacin de cubetas de este tipo est restringida a presiones no
mayores de unos 50 kg/cm
2
.
Tabla 4.1. Caractersticas de los detectores de HPLC.


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Figura 4.5. Celda de detector ultravioleta en HPLC.
Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, en
los que uno de los haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a
travs de un filtro que reduce su intensidad. Para comparar las
intensidades de los dos haces se utilizan detectores fotoelctricos
contrastados. Tambin se utilizan instrumentos de un solo haz. En
este caso, las medidas de intensidad del disolvente se almacenan en
la memoria de un ordenador y al final se recuperan para el clculo
de la absorbancia.
Detectores de absorbancia ultravioleta con filtros. Los detectores
de absorcin UV ms simples son los fotmetros de filtros con una
lmpara de mercurio como fuente. Lo ms comn en estos casos es
aislar la lnea intensa a 254 nm por medio de filtros; en algunos
equipos tambin se pueden utilizar las lneas a 250, 313, 334 y 365
nm empleando otros filtros. Resulta obvio que este tipo de detector
se utiliza de forma restringida para aquellos solutos que absorben a
alguna de estas longitudes de onda.
Algunos grupos funcionales orgnicos y diversas especies
inorgnicas exhiben una banda ancha de absorcin a una o ms de
esas longitudes de onda.

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Detectores de absorbancia ultravioleta con monocromadores. La
mayora de los fabricantes de instrumentos de HPLC ofrecen
detectores que consisten en un espectrofotmetro de barrido con
ptica de red. Algunos se limitan a la radiacin ultravioleta;
mientras que otros abarcan la radiacin ultravioleta y la visible. Se
pueden elegir varios modos operacionales. Por ejemplo, se puede
obtener el cromatograma completo a una sola longitud de onda o
alternativamente, cuando los picos que eluyen estn suficientemente
separados, se puede elegir distinta longitud de onda para cada pico.
En este caso, debe emplearse el control por ordenador para elegir la
mejor longitud de onda en cada caso. Cuando se desean los
espectros completos con fines de identificacin, se puede parar el
flujo del eluyente durante un tiempo suficiente que permita el
barrido de la regin de longitud de onda que interesa.
Los detectores espectrofotomtricos de ultravioleta ms potentes
son los instrumentos de series de diodos. Algunos fabricantes
ofrecen este tipo de instrumentos, que permiten recoger los datos de
un espectro completo en aproximadamente un segundo. De esta
forma, los datos espectrales para cada pico cromatogrfico se
pueden recoger y almacenar a medida que van saliendo de la
columna. Una de las formas de presentacin de los datos
espectrales, que resulta til para la identificacin de las especies y
para elegir las condiciones de la determinacin cuantitativa,
consiste en un grfico tridimensional tal como el que se muestra en
la Figura 4.6. En este caso, los espectros se obtuvieron a intervalos
de cinco segundos. La aparicin y desaparicin de cada uno de los
esteroides en el efluente de la columna resulta evidente.

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Figura 4.6. Espectros de absorcin del efluente de una columna de HPLC tomados a
intervalos de 5 s para una mezcla de tres esteroides.
Detectores de absorbancia en el infrarrojo. Comercialmente se
ofrecen dos tipos de detectores de infrarrojo. El primero con barrido
de longitud de onda que proporcionan tres segmentos de filtro
semicirculares. El segundo, mucho ms sofisticado, es un tipo de
detector infrarrojo que se basa en los instrumentos de transformada
de Fourier.
Las cubetas de los detectores de infrarrojo son semejantes a las de
radiacin ultravioleta excepto en que las ventanas se construyen de
cloruro de sodio o de fluoruro de calcio. Las longitudes de la cubeta
oscilan de 0.2 a 1.0 mm, y los volmenes de 1.5 a 10 L. Los
instrumentos de infrarrojo ms sencillos pueden trabajar a una o
ms longitudes de onda; alternativamente, se pueden obtener los
espectros de los picos parando el flujo en su tiempo de elucin. Los
instrumentos con transformada de Fourier se utilizan de manera
anloga a los instrumentos de series de diodos para las medidas de
absorbancia ultravioleta que se han descrito en la seccin anterior.
Una de las mayores limitaciones al uso de los detectores de
infrarrojo se debe a la baja transparencia de muchos de los

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disolventes que se utilizan. Por ejemplo, las bandas anchas de
absorcin infrarroja del agua y de los alcoholes impiden
prcticamente el uso de este detector para muchas aplicaciones.
3.4.5.2. Detectores de fluorescencia
Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en
diseo a los fluormetros y espectrofluormetros. En la mayora de
ellos, la fluorescencia se detecta por medio de un detector
fotoelctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de
excitacin. Los detectores ms sencillos utilizan una fuente de
excitacin de mercurio, y uno o ms filtros para aislar la radiacin
fluorescente. Los futuros desarrollos en los detectores de
fluorescencia probablemente se basarn en el uso de fuentes de
lser sintonizables, las cuales permiten una mayor sensibilidad y
selectividad.
Una ventaja inherente a los mtodos de fluorescencia es su alta
sensibilidad, que resulta ser ms de un orden de magnitud mayor
que la de los sistemas de absorbancia. En cromatografa de lquidos
se ha aprovechado esta ventaja para la separacin y determinacin
de los componentes fluorescentes de las muestras.
3.4.5.3. Detectores de ndice de refraccin
Estos detectores miden la diferencia de ndice de refraccin, entre el
disolvente que en su camino hacia la columna pasa a travs de una
mitad de la cubeta y el efluente de la columna que pasa por la otra
mitad. Los dos compartimentos estn separados por una placa de
vidrio montada a un ngulo de modo que si las dos disoluciones
difieren en el ndice de refraccin se produce una desviacin de un
haz de luz incidente. El desplazamiento del haz con respecto a la
superficie fotosensible del detector provoca una variacin de la
seal de salida, la cual, una vez amplificada y registrada,
proporciona el cromatograma.

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Los detectores de ndice de refraccin tienen la ventaja de que
responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores
universales anlogos a los detectores de llama en cromatografa de
gases. Adems, son fiables y no dependen del caudal. Sin embargo,
son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de
mantener a una temperatura constante en unas pocas milsimas de
grado centgrado. Por otra parte, no son tan sensibles como la
mayora de los otros detectores, y por lo general no se pueden
utilizar en la elucin con gradiente.
3.4.5.4. Detector de dispersin de luz
Recientemente, se ha comercializado un nuevo tipo de detector
general para la HPLC, el detector de dispersin de luz (ELSD). En
este detector, el efluente de la columna se pasa a un nebulizador
donde se convierte en una fina niebla mediante un flujo de
nitrgeno o aire. Las finas gotitas se llevan a travs de un tubo de
conduccin a temperatura controlada donde tiene lugar la
evaporacin de la fase mvil, lo que origina unas finas partculas de
analito. La nube de partculas de analito pasa a travs de un haz
lser. Mediante un fotodiodo de silicio se detecta la radiacin
dispersada perpendicularmente al flujo.
Una de las mayores ventajas de este tipo de detector es que su
respuesta resulta ser aproximadamente la misma para todos los
solutos no voltiles. Adems es notablemente ms sensible que el
detector de ndice de refraccin.
3.4.5.5. Detectores electroqumicos
Los fabricantes de instrumentos proporcionan en la actualidad
varios tipos de detectores electroqumicos. Estos dispositivos se
basan en cuatro mtodos electroanalticos que incluyen la
amperometra, la voltamperometra, la coulombimetra y la
conductimetra.

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