Gua de Laboratorio

EXTRACION DE ADN
Cdigo:
MC-2012-08-21
Versin:
03
Pgina:
1 de 5
Fecha de Emisin:
Febrero - 2014
Ttulo: FACULTAD DE SALUD DPTO. DE CIENCIAS FISIOLGICAS
FUNDAMENTOS DE BIOQUIMICA II
Elaborado por:
Profesional: Lic. Martha Solrzano
Revisado por:
Dra. Cecilia Aguilar de Plata
Aprobado por:
Dr. Jos Ma. Satizabal

EXTRACCIN DE ADN


1. INTRODUCCION.
El ADN no existe como molcula libre en las clulas, por el contrario se encuentra asociado
con protenas y RNA. Es por esto, que los procesos de extraccin y aislamiento de DNA de
una clula y de otras molculas es el primer paso para muchos procedimientos de
laboratorio. En biotecnologa, biologa molecular, gentica e inmunologa entre otras ciencias,
estos procesos involucran generalmente, el rompimiento de las clulas, desnaturalizacin de
protenas y la precipitacin del DNA como material fibroso. Una vez obtenido el DNA puede
ser sometido a diferentes procedimientos como: estudios de paternidad, trabajos forenses
para captura de criminales, la amplificacin mediante PCR de secuencias especficas con
fines comerciales o teraputicos, el estudio de expresin de genes entre otros.

Casi todas las clulas contienen ADN, pero la cantidad presente en algunos tejidos es muy
pequea de manera que no son una fuente particularmente conveniente. Algunos tejidos
contienen alta actividad deoxirribonucleasa- ADNasa y el ADN es roto en pequeos
fragmentos. Una fuente conveniente para el aislamiento del DNA debe contener una alta
cantidad del material y tener baja actividad deoxirribonucleasica. El tejido linfoide es muy
bueno en este aspecto y el timo es la mejor fuente, con el bazo como una buena alternativa.

El ADN es rpidamente desnaturalizado y en consecuencia debe tenerse mucho cuidado con
el objeto de obtener un producto que sea estructuralmente relacionado con el que se
encuentra en la clula. La tensin mecnica y condiciones existentes fsicas y qumicas,
deben evitarse y las nucleasas deben ser inhibidas.

El citrato de sodio presenta en solucin Ca
++
y Mg
++
, los cuales son factores para ADNasa y
las etapas hasta la remocin de protenas debe llevarse a cabo tan rpidamente como sea
posible y en fro.

La nucleoprotena es insoluble en agua y soluciones de baja fuerza inica pero es soluble en
soluciones de alta fuerza inica. Se hace uso de esta propiedad en la extraccin inicial.


2. OBJETIVO GENERAL:

a. Conocer y familiarizarse con las tcnicas y principios bsicos de la biologa molecular.
b. Extraer una muestra de ADN, a partir del bazo de cerdo y cuantificar la concentracin del
ADN obtenido.


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EXTRACION DE ADN
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Febrero - 2014
Ttulo: FACULTAD DE SALUD DPTO. DE CIENCIAS FISIOLGICAS
FUNDAMENTOS DE BIOQUIMICA II
Elaborado por:
Profesional: Lic. Martha Solrzano
Revisado por:
Dra. Cecilia Aguilar de Plata
Aprobado por:
Dr. Jos Ma. Satizabal

c. Comprender la tcnica de PCR conceptualmente y aplicaciones de la misma.
d. Conocer y comprender algunas aplicaciones mdicas de la investigacin de genes,
estudio de enfermedades hereditarias, huella gentica, protenas recombinantes, animales
transgnicos, terapia gnica

3. PROCEDIMIENTO.

3.1 EXTRACCIN DE ADN A PARTIR DE BAZO DE CERDO

a. Tome 25 ml de homogenizado de bazo de cerdo en solucin salina regulada con citrato de
sodio.
b. Centrifugue la suspensin durante 5 minutos, transfiera el sobrenadante en un beaker y
descarte el precipitado.
c. Agregue lentamente al sobrenadante 20 ml de etanol fro y con la ayuda de una varilla
enrolle suavemente las fibras de ADN




Trasfiera las fibras de ADN a 20 ml de solucin salina 2M
d. Nuevamente centrifugue por 5 minutos, transfiera el sobrenadante y descarte el
precipitado.
e. Agregue al sobrenadante lentamente 20 ml de etanol fro, espere que precipite el DNA y
con cuidado transfiralo a tubo de ensayo con 10 ml de solucin salina 2M hasta el momento
de su determinacin con la difenilamina.


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Dra. Cecilia Aguilar de Plata
Aprobado por:
Dr. Jos Ma. Satizabal


NOTA: Es importante que todo el proceso anterior se realice en hielo.


3.2 CUANTIFICACION DE LA CONCENTRACION DE ADN MEDIANTE EL METODO DE
DIFENILAMINA

a. Preparacin del reactivo difenilamina: 1 g de Difenilamina en 100 ml de cido actico ms
2.5 ml de cido sulfrico. Este reactivo debe prepararse en el momento de su uso.

b. Si se pretende un anlisis cuantitativo se deben preparar diferentes patrones de
desoxirribosa. Para llevar a cabo la determinacin y concentracin de ADN, prepare los
siguientes tubos:

SOLUCION
TUBO (ml)
Blanco
1
MUESTRA
2
DNA ESTANDAR
AGUA 0.5 ML 0 0
AC. TCA 10% 0.25 ML 0.25 ML 0.25 ML
DEFINILAMINA 1.25 ML 1.25 ML 1.25 ML
DNA 0 0.5 0.5
ABSORBANCIA 595 nm


c. Caliente los tubos por 15 min en bao de agua hirviendo a 100
O
C, hasta la aparicin de color
azul que indica la presencia de ADN
d. Leer la absorbancia en el espectrofotmetro a 595 nm .

La desoxirribosa (dR) del DNA, reacciona con difenilamina en medio cido para dar un compuesto azul,
determinable colorimtricamente a 595 nm. En el DNA slo dan la reaccin positiva las dR unidas a
bases pricas, pues stas se liberan y la dR adopta configuracin abierta dentro de la cadena del DNA.












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3.3 DETERMINACIN DEL ADN POR EL MTODO DE ELECTROFORESIS

a. Prepare el gel de agarosa, deje que solidifique y luego ubquelo en la cubeta de
electroforesis

b. Mezcle 3 ul de marcador molecular con buffer de carga. Tome 20ul de la muestra del
ADN extraido con buffer de carga.

c. Depostela la muestra de ADN en los pocillos del gel de agarosa para ser sometido a
electroforesis. Coloree el gel con bromuro de etidio.

d. Corra la electroforesis por 40 minutos a 80 voltios

e. Cuando finalice la electroforesis retire el gel y ubquelo en el trasiluminador para
revelar las bandas de ADN.




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PASOS DE LA ELABORACION DE ELECTROFORESIS DE ADN












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TALLER:

1. Calcule la concentracin de DNA extrado en su grupo. C =

2. Qu diferencia existe entre DNA Y RNA?

3. Por qu deben inhibirse las nucleasas?

4. Consulte otro mtodo de separacin y anlisis de cidos Nucleicos (ADN o ARN).

5. Consulte 4 aplicaciones clnicas de los cidos Nucleicos.

6. Cul es el principio de la reaccin de difenilamina?

7. Consulte las aplicaciones de los cidos nucleicos en la medicina forense.

8. Qu funcin cumple el NaCl en mtodo de extraccin de ADN?

9. Qu funcin cumple el etanol en el mtodo de extraccin de ADN?

10. Qu funcin tiene el acido actico en la determinacin de ADN?