Biotecnologia Estado Da Arte e Aplicacoes Na Agropecuaria PDF

Editores Tcnicos
Fbio Gelape Faleiro

Solange Rocha Monteiro de Andrade
Fbio Bueno dos Reis Junior
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BIOTECNOLOGIA
estado da arte e aplicaes
na agropecuria
Editores Tcnicos
Fbio Gelape Faleiro
BIOTECNOLOGIA
estado da arte e aplicaes
na agropecuria
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria
Embrapa Cerrados
Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
Embrapa Cerrados
Planaltina, DF
2011
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Embrapa Cerrados
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Coordenao editorial
Jussara Flores de Oliveira
Reviso de texto
Francisca Elijani do Nascimento
Jussara Flores de Oliveira
Normalizao bibliogrfica
Marilaine Schaun Peluf
Paloma Guimares Correa de Oliveira
Shirley da Luz Soares Arajo
Capa, projeto grfico e diagramao
Fabiano Bastos
Tratamento de figuras
Wellington Cavalcanti
Fotos
Embrapa Cerrados
1 edio
1 impressao (2011): 2.000 exemplares
Todos os direitos reservados.
A reproduo no autorizada desta publicao, no todo ou em parte, constitui
violao dos direitos autorais
(Lei n 9.610).
Dados Internacionais de Catalogao na Publicao - CIP
Embrapa Cerrados
B616 Biot ecnologia: estado da arte e aplicaes na agropecuria / editores tcnicos:
Fbio Gelape Faleiro, Solange Rocha Monteiro de Andrade. Planaltina, DF :
Embrapa Cerrados, 2011.
730 p. : il.
ISBN 978-85-7075-059-4
1. Engenharia gentica. 2. Planta transgnica. 3. Organismo trangnico. 4.
Melhoramento gentico. I. Faleiro, Fbio Gelape. II. Andrade, Solange Rocha
Monteiro de.
631.5233 - CDD 21
Embrapa 2011
Autores:
Ana Maria Costa
Engenheira Agrnoma, D.Sc.
Pesquisadora da Embrapa Cerrados
abarros@cpac.embrapa.br
Artur Jordo de Magalhes Rosa
Zootecnista, D.Sc.
Pesquisador da Embrapa Cerrados
artur.rosa@cpac.embrapa.br
Austeclnio Lopes de Farias Neto
Engenheiro Agrnomo, Ph.D.
auster@cpac.embrapa.br
Carlos Frederico Martins
Mdico Veterinrio, D.Sc.
carlos.frederico@cpac.embrapa.br
Chang das Estrelas Wilches
Engenheiro Agrnomo, M. Sc.
Analista da Assessoria de Inovao Tecnolgica da Embrapa
chang.wilches@embrapa.br
Ccero Donizeti Pereira
Engenheiro Agrnomo, Dr.
cicero.pereira@cpac.embrapa.br
Cynthia Torres de Toledo Machado
Engenheira Agrnoma, Ph.D.
cynthia@cpac.embrapa.br
Erich Yukio Tempel Nakasu
Bilogo, M.Sc.
Bolsista de Desenvolvimento Tecnolgico Industrial do CNPq
erichnakasu@cenargen.embrapa.br
Fbio Bueno dos Reis-Junior
Engenheiro Agrnomo, D.Sc.
fabio@cpac.embrapa.br
Fbio Gelape Faleiro
ffaleiro@cpac.embrapa.br
Fbio Martins Mercante
Pesquisador da Embrapa Agropecuria Oeste
BR 163, km 253,6 - Caixa Postal 661
CEP 79804-970 - Dourados, MS
mercante@cpao.embrapa.br
Guilherme Montandon Chaer
Engenheiro Agrnomo, Ph. D.
Pesquisador da Embrapa Agrobiologia
Rodovia BR 465, km 7
Seropdica - RJ - Brasil - CEP: 23890-000
gchaer@cnpab.embrapa.br
Ieda de Carvalho Mendes
mendesi@cpac.embrapa.br
Jerri dson Zilli
Pesquisador da Embrapa Roraima, Rodovia BR-174, Km 8
Distrito Industrial, Boa Vista, RR - Brasil - CEP 69301-970
zilli@cpafrr.embrapa.br
Klecius Renato Silveira Celestino
Engenheiro Qumico, D.Sc.
Professor da Universidade de Braslia
Campus Universitrio Darcy Ribeiro, Braslia - CEP 70910-900
klecius@unb.br
Luciana Harumi Morimoto Figueiredo
Biloga, M. Sc.
luciana.gueiredo@embrapa.br
Luiz Gustavo B. Siqueira
Mdico Veterinrio, MSc, MVetSc.
Pesquisador da Embrapa Gado de Leite
lgbsiqueira@cnpgl.embrapa.br
Magnlia de Arajo Campos
Biloga, D.Sc.
Professora da Universidade Federal de Campina Grande UFCG
Rua Aprigio Veloso, 882 Bairro Universitrio CEP 58429-140
Campina Grande, PB
magnoliaacp@ufcg.edu.br
Marcelo Ferreira Fernandes
Pesquisador da Embrapa Tabuleiros Costeiros
Av. Beira Mar, 3250 - Jardins
Caixa Postal 44 - Aracaju, SE - Brasil - 49025-040
marcelo@cpatc.embrapa.br
Marco Aurlio Caldas de Pinho Pessoa-Filho
Bilogo, D.Sc.
marco.pessoa@cpac.embrapa.br
Margot Alves Nunes Dode
Mdica Veterinria, Ph.D.
Pesquisadora da Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
Parque Estao Biolgica - PqEB - Av. W5 Norte (nal)
Caixa Postal 02372 - Braslia, DF - Brasil - 70770-900
dode@cenargen.embrapa.br.
Maria Cristina Rocha Cordeiro
Biloga, D.Sc.
cristina@cpac.embrapa.br
Mariangela Hungria
Pesquisadora da Embrapa Soja, Rod. Carlos Joo Strass - Distrito de
Warta, Caixa Postal 231 - CEP 86001-970, Londrina - Paran- Brasil
hungria@cnpso.embrapa.br
Marilia Santos Silva
marilia@cpac.embrapa.br
Mrio Lcio Vilela de Resende
Professor da Universidade Federal de Lavras UFLA
Campus Universitrio - Prdio da Reitoria
Caixa Postal 3037 - CEP 37200-000 - Lavras MG
mlucio@ua.br
Mnica Cibele Amncio
Advogada e Biloga, M. Sc.
monica.amancio@embrapa.br
Nilton Tadeu Vilela Junqueira
junqueir@cpac.embrapa.br
Roberto Teixeira Alves
ralves@cpac.embrapa.br
Rodrigo da Rocha Fragoso
Bilogo, D.Sc.
rodrigo.fragoso@cpac.embrapa.br
Sebastio Pedro da Silva Neto
sebastiao.pedro@cpac.embrapa.br
Biloga, D.Sc.
solange@cpac.embrapa.br
Sonia Maria Costa Celestino
Engenheira Qumica, D.Sc.
sonia.costa@cpac.embrapa.br
Thales Lima Rocha
Bilogo, Ph.D.
Pesquisador da Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
Parque Estao Biolgica - PqEB - Av. W5 Norte (nal)
Caixa Postal 02372 - Braslia, DF - Brasil - 70770-900
thales@cenargen.embrapa.br
Valter Lopes
Gegrafo
Professor do Centro Educacional 03, Planaltina, DF
lopes.valtinho@gmail.com
Veronica Massena Reis
Engenheira Agrnoma, D.Sc.
Pesquisadora da Embrapa Agrobiologia
Rodovia BR 465, km 7, Seropdica - RJ - Brasil - CEP: 23890-000
vernica@cnpab.embrapa.br
Walter Quadros Ribeiro Jnior
Bilogo, Ph.D.
walter@cpac.embrapa.br
Sumrio
11 Apresentao
13 Captulo 1 Biotecnologia: uma viso geral
31 Captulo 2 Princpio cientco e anlises
genticas utilizando marcadores moleculares
55 Captulo 3 Aplicaes de marcadores
moleculares como ferramenta auxiliar
em programas de conservao,
caracterizao e uso de germoplasma
e melhoramento gentico vegetal
121 Captulo 4 Prospeco gnica e bioinformtica
143 Captulo 5 Genmica funcional
175 Captulo 6 Metagenmica:
princpios e aplicaes
195 Captulo 7 Biotecnologia e
diagnsticos moleculares
219 Captulo 8 Microbiologia do solo e
sustentabilidade de sistemas agrcolas
247 Captulo 9 Fixao biolgica de nitrognio:
uma revoluo na agricultura
283 Captulo 10 Fungos micorrzicos arbusculares:
pesquisa e desenvolvimento para a agricultura
321 Captulo 11 Biotecnologia aplicada
engenharia de alimentos
355 Captulo 12 Interaes
moleculares planta-patgeno
379 Captulo 13 Controle biolgico
de insetos-praga
409 Captulo 14 Cultura de tecidos
vegetais: princpios e aplicaes
435 Captulo 15 Engenharia gentica:
princpios cientcos e aplicaes
469 Captulo 16 Biossegurana
ambiental e alimentar de OGMs
511 Captulo 17 Recursos genticos:
conservao, caracterizao e uso
551 Captulo 18 Melhoramento gentico
de plantas e biotecnologia
567 Captulo 19 Anlise genmica
aplicada a produo animal
653 Captulo 20 Biotecnologia
aplicada a pecuria bovina
709 Captulo 21 Biotecnologia agropecuria
e propriedade intelectual
11
Apresentao
A biotecnologia hoje uma das ferramentas de grande importncia
para propiciar benefcios a diferentes setores da sociedade. No caso
da agropecuria, aes de pesquisa e desenvolvimento na rea biotec-
nolgica so fundamentais para o desenvolvimento de sistemas mais
produtivos e sustentveis. A biotecnologia envolve vrias reas do
conhecimento e, em consequncia, vrios prossionais, sendo uma
cincia de natureza multidisciplinar.
As vrias tcnicas relacionadas biotecnologia tm trazido, via de
regra, benefcios para a sociedade, sendo exemplos, as fermentaes
industriais na produo de vinhos, cervejas, pes, queijos e vinagres;
a produo de frmacos, vacinas, antibiticos e vitaminas; a utiliza-
o de biofungicidas no controle biolgico de pragas e doenas; o uso
de microrganismos visando a biodegradao de lixo e esgoto; o uso de
bactrias xadoras de nitrognio e fungos micorrzicos para a melho-
ria de produtividade das plantas; o desenvolvimento de plantas e ani-
mais melhorados utilizando tcnicas convencionais de melhoramento
gentico e tambm a transformao gentica.
Neste livro, estas vrias tcnicas so discutidas por vrios especia-
listas da Embrapa Cerrados e instituies parceiras, sendo um mate-
rial didtico importante para dar uma idia geral da biotecnologia,
incluindo aspectos conceituais, sua importncia histrica e atual e
tambm sua importncia futura, considerando toda sua potenciali-
dade e o que ainda vai ser descoberto.
Jos Roberto Rodrigues Peres
Chefe-Geral da Embrapa Cerrados
Captulo 1
13
Biotecnologia: uma viso geral
Fbio Gelape Faleiro
A Biotecnologia conceitualmente, a unio de biologia com tecno-
logia um conjunto de tcnicas que utiliza os seres vivos, ou parte
desses, no desenvolvimento de processos e produtos que tenham uma
funo econmica e (ou) social. A biotecnologia envolve vrias reas
do conhecimento e, em consequncia, vrios prossionais, sendo
uma cincia de natureza multidisciplinar. Na Figura 1A, ilustram-se
algumas reas do conhecimento com interface com a biotecnologia.
As vrias tcnicas relacionadas biotecnologia (Figura 1B) tm tra-
zido, via de regra, benefcios para a sociedade (Figura 1C). Podemos
citar como exemplos as fermentaes industriais na produo de
vinhos, cervejas, pes, queijos e vinagres; a produo de frmacos,
vacinas, antibiticos e vitaminas; a utilizao de biofungicidas no con-
trole biolgico de pragas e doenas; o uso de microrganismos visando
biodegradao de lixo e esgoto; o uso de bactrias xadoras de nitro-
gnio e fungos micorrzicos para a melhoria de produtividade das
plantas; o desenvolvimento de plantas e animais melhorados utili-
zando tcnicas convencionais de melhoramento gentico e tambm
a transformao gentica.
Neste captulo, apresentada uma viso geral da biotecnologia,
abordando aspectos conceituais e histricos da biotecnologia clssica e
moderna e fazendo um breve relato das principais tcnicas e produtos
biotecnolgicos e seus benefcios econmicos, sociais e ambientais.
BIOTECNOLOGIA estado da arte e aplicaes na agropecuria
14
Bioqumica
Engenharia
qumica
Biologia
Celular
Gentica e
Melhoramento
Biologia
Molecular
BIOTECNOLOGIA

Biomedicina
Gentica
Molecular
Fitopatologia
Engenharia
gentica
Microbiologia
agrcola
A
Fermentaes
industriais
Produo de
frmacos
Produo
das vacinas
Controle
biolgico
Transformao
gentica
Uso de microrganismos
na agricultura
Cultura de
tecidos e clulas
Melhoramento
gentico
Anlises
do DNA
Clonagem
BIOTECNOLOGIA

B
Vinhos, cerveja, pes,
queijos, iogurtes, vinagres
Antibiticos
e vitaminas Biodegradao
Plantas e animais
melhorados
geneticamente
Vacinas para o homem
e animais domsticos
Biofungicidas
Obteno
de OGMs
Bactrias fixadoras de nitrognio
e fungos micorrzicos
Multiplicao de
recursos genticos
Testes de
paternidade

BIOTECNOLOGIA

C
Figura 1. Principais disciplinas (A), tcnicas (B) e produtos (C) relacionados
biotecnologia.
15
Captulo 1 Biotecnologia: uma viso geral
O que biotecnologia ?
Podemos encontrar nos mais variados meios de comunicao vrias
denies para o termo biotecnologia. Uma denio ampla de bio-
tecnologia o uso de organismos vivos ou parte deles para a produ-
o de bens e servios. Podemos dizer que, nessa denio, enqua-
dram-se a biotecnologia clssica e a moderna. A biotecnologia clssica
envolve um conjunto de atividades que o homem vem desenvolvendo
h milhares de anos, como a produo de alimentos fermentados,
como o po e o vinho. A chamada biotecnologia moderna envolve
tecnologias de engenharia gentica, DNA recombinante, cultura de
clulas e embries para o desenvolvimento de produtos e processos.
Entre as vrias denies de biotecnologia, encontramos aquelas
em sentido amplo:
o uso de conhecimentos sobre os processos biolgicos e sobre as pro-
priedades dos seres vivos, com o fim de resolver problemas e criar produtos
de utilidade. (CONVENTION ON BIOLOGICAL DIVERSITY, 1992).
a tecnologia baseada na biologia, especialmente quando usada na
agricultura, cincia dos alimentos e medicina. (WIKIPDIA, 2009).
Algumas denies se enquadram mais dentro da biotecnologia
clssica:
o uso industrial de processos de fermentao... tecnologia que per-
mite a utilizao de material biolgico para fins industriais. (BORM
et al., 2007).
um conjunto de tcnicas que utiliza seres vivos, ou parte desses, para
produzir ou modificar produtos, aumentar a produtividade de plantas e
animais de maneira eficiente ou, ainda, produzir microrganismos para
usos especficos. (TORRES et al., 2000).
Outras denies esto mais relacionadas biotecnologia moderna:
o uso de clulas e biomolculas para a resoluo de problemas ou
transformao em produtos. um conjunto de tcnicas que potencializa
as melhores caractersticas das clulas, como a capacidades produtivas, e
disponibiliza molculas biolgicas, como DNA e protenas, para serem
utilizadas (AGNCIA BRASILEIRA DE DESENVOLVIMENTO
INDUSTRIAL, 2009).
o desenvolvimento de produtos por processos biolgicos, utilizando-se
a tecnologia do DNA recombinante. (BORM; SANTOS, 2004).
16
Espectro ou conjunto de tecnologias moleculares aplicadas ao estudo de
microrganismos, plantas e animais. (BORM et al., 2009; CONSELHO
DE INFORMAO SOBRE BIOTECNOLOGIA, 2009).
Dessa forma, biotecnologia pode ter diferentes significados,
principalmente quando comparamos a biotecnologia clssica e a
moderna. Podemos resumir o conceito de biotecnologia, com base
na origem da palavra: bio signica vida, tecno signica uso prtico
e aplicado da cincia e logos signica conhecimento, ou seja, conhe-
cimentos que usam organismos, clulas e molculas de forma pr-
tica na obteno de bens e servios. Podemos dizer tambm que
a tecnologia que gera produtos e processos de origem biolgica.
Histria da biotecnologia
O termo biotecnologia foi utilizado, pela primeira vez, no incio
do sculo passado. Apesar de o termo ser novo, o princpio muito
antigo. Considerando o seu conceito amplo, podemos dizer que a bio-
tecnologia iniciou-se com a agricultura ou agropecuria, ou seja, com
a capacidade do homem de domesticar plantas e animais para seu
benefcio. Estima-se que 8000 anos a.C., na Mesopotmia, bero da
civilizao, os povos selecionavam as melhores sementes das melho-
res plantas para aumentar a colheita. Outro exemplo histrico da bio-
tecnologia a utilizao da levedura na fermentao da uva e do trigo
para produo de vinho e po, o que j acontecia por volta de 7000
anos a.C. Estima-se que a utilizao de bactrias para a fermenta-
o do leite para produo de queijos j acontecia a 3000 anos a.C.
Logicamente, os povos dessa poca no faziam ideia que as levedu-
ras e bactrias fossem utilizadas nesses processos de fermentao. Os
microrganismos somente foram descobertos em 1675 por Anton Van
Leeuwenhoek e, somente em 1862, Louis Pasteur descobriu a associa-
o desses microrganismos com o processo de fermentao. O incio
da biotecnologia ilustrado na Figura 2 e, na Figura 3, a descoberta
dos microrganismos.
17
Figura 2. Incio da biotecnologia com a agricultura e a produo do po e
do vinho.
Figura 3. Anton Van Leeuwenhoek e Louis Pasteur e a descoberta dos micror-
ganismos.
Com a evoluo da cincia em seus diversos setores, inmeras
metodologias biotecnolgicas tm sido sistematizadas, aumentando
seus benefcios econmicos, sociais e ambientais. A descoberta da uti-
lidade dos microrganismos trouxe a primeira revoluo biotecnol-
gica, a qual ocorreu na medicina com a produo das vacinas. Louis
Pasteur foi o pioneiro e, no Brasil, Oswaldo Cruz foi um importante
seguidor. Oswaldo Cruz foi o pioneiro no estudo das molstias tro-
picais e da medicina experimental no Brasil (Figura 4). Fundou o
Instituto Soroterpico Nacional no Rio de Janeiro em 1900, transfor-
mado em Instituto Oswaldo Cruz, respeitado internacionalmente.
Quase 90 anos aps a sua morte, Oswaldo Cruz lembrado em cada
canto do territrio nacional, embora tenha tido na poca a incompre-
enso de seus contemporneos por causa de suas campanhas sanit-
rias, as quais permitiram que a vacinao se tornasse uma prtica cor-
riqueira e de extrema importncia no Brasil (FALEIRO; ANDRADE,
2009). Hoje, seria praticamente impossvel a vida sem as vacinas dos
seres humanos e animais domsticos.
18
Figura 4. Oswaldo Cruz e seu pioneirismo na produo de vacinas no Brasil.
Entre outros cientistas importantes para o desenvolvimento da bio-
tecnologia, merecem destaque Gregor Mendel, considerado o pai da
gentica, com a descoberta da hereditariedade (como as caractersticas
passam de gerao para gerao) em 1865 e Alexander Fleming, des-
cobridor do antibitico penicilina obtido a partir do fungo Penicillium
(Figura 5).
Figura 5. Gregor Mendel e Alexander Fleming.
E a biotecnologia moderna? Podemos dizer que a biotecnologia
moderna nasceu com a descoberta da estrutura do DNA (cido deso-
xirribonucleico, molcula responsvel pela informao gentica de
cada ser vivo) por James Watson e Francis Crick em 1953. Essa desco-
berta foi fundamental para entender como o DNA era capaz de codi-
car as protenas responsveis por todos os processos e pelo fen-
tipo de todos os seres vivos. Esse entendimento foi concludo com a
decifrao do cdigo gentico por Har Gobing Khorana e Marshall
Niremberg em 1967 (Figura 6). Esses pesquisadores explicaram como
apenas quatro nucleotdeos codicavam os 20 diferentes aminoci-
dos que constituem as milhares de protenas existentes (BORM;
SANTOS, 2004).
19
Figura 6. Watson e Crick e a estrutura do DNA; Niremberg e Khorana e o
cdigo gentico.
A partir da descoberta do DNA e do cdigo gentico, houve uma
revoluo incrvel na rea da gentica e biologia molecular, surgindo
a manipulao controlada e intencional do DNA por meio das tcni-
cas de engenharia gentica. Segundo Arago (2009), a engenharia
gentica surgiu em 1972, quando cientistas americanos consegui-
ram ligar sequncias de DNA de Escherichia coli a do Simian papi-
loma virus. Como consequncia dessas pesquisas, o primeiro orga-
nismo transgnico E. coli contendo sequncias de DNA de Xenopus
laevis foi produzido em 1973. Esse resultado levou o lder do pro-
jeto, Dr. Paul Berg, a ganhar o Prmio Nobel em 1980. Por meio des-
sas tcnicas, foi possvel a produo de insulina humana em bact-
rias e o desenvolvimento de inmeras plantas transgnicas a partir da
dcada de 1980, sendo a primeira uma planta de fumo transformada
com a capa proteica do vrus do mosaico do tabaco (Tobacco mosaic
virus TMV) (POWELL et al., 1986). Em 1994, a U.S. Food and Drug
Administration (FDA) liberou para o consumo humano o primeiro
alimento geneticamente modicado, o tomate Flavr Savr, produzido
pela empresa americana Calgene.
Na histria recente da biotecnologia moderna, merece destaque
a clonagem da ovelha Dolly (Figura 7), em 1996, que foi o primeiro
mamfero a ser clonado com sucesso a partir de uma clula adulta.
Dolly foi gerada a partir de clulas mamrias de uma ovelha adulta com
cerca de 6 anos, por meio de uma tcnica conhecida como transfern-
cia somtica de ncleo. Outro acontecimento marcante foi o anncio
do projeto genoma humano, em 1990, que tinha como objetivo conhe-
cer a sequncia completa dos nucleotdeos que o compem. O prazo
previsto para a concluso do projeto era de 15 anos. Em virtude da
grande cooperao da comunidade cientca internacional, associada
20
aos avanos no campo da biologia molecular relacionado s tcnicas de
sequenciamento, de bioinformtica e das tecnologias de informao,
um primeiro esboo do genoma foi anunciado em 26 de Junho de 2000.
Figura 7. Histria recente da biotecnologia moderna com a clonagem da ove-
lha Dolly e o sequenciamento do genoma humano .
Alm dos produtos tecnolgicos, a biotecnologia moderna tem pos-
sibilitado o desenvolvimento de diferentes tipos de marcadores mole-
culares e tcnicas de anlises genmicas e protemicas, as quais tm
permitido vrias aplicaes prticas na pesquisa e desenvolvimento
da agropecuria. Algumas das principais tcnicas e produtos biotec-
nolgicos ligados agropecuria so comentados resumidamente a
seguir e apresentados com maior profundidade nos prximos cap-
tulos do livro.
Principais tcnicas e produtos biotecnolgicos
As tcnicas e produtos biotecnolgicos possuem aplicaes em dife-
rentes reas, sendo as principais aquelas ligadas indstria, ambiente,
sade, agropecuria, alm da rea cientca. Abaixo so relatados algu-
mas tcnicas e produtos em cada uma das cinco reas principais de
aplicao. Na Figura 8, ilustra-se essa diversidade de aplicaes.
Figura 8. Diversidade de aplicaes da biotecnologia na rea industrial,
ambiental, sade, agropecuria e cientca .
21
rea industrial
Essas aplicaes esto relacionadas obteno e conservao de
alimentos, principalmente utilizando-se de processos fermentativos.
Esses processos foram utilizados, de forma inconsciente, h milhares
de anos a.C.. Com a descoberta dos microrganismos, os processos de
fermentao tm sido otimizados e utilizados em escala comercial.
Vrios so os alimentos obtidos ou modicados por processos fer-
mentativos. Vinhos, vinagres, cervejas, pes, queijos e leite fermen-
tado so os exemplos com relatos de uso mais antigos. Outras bebi-
das alcolicas obtidas a partir de frutas, cereais e at de folhas e razes
so exemplos de alimentos utilizados por ndios de forma tradicional.
Vrios microrganismos so utilizados em processos fermentati-
vos como as bactrias (Bacillus, Zymomonas, Acetobacter etc.) e fun-
gos (Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, etc.), incluindo a levedura
(Saccharomyces cerevisiae), exemplo mais comum e importante do
ponto de vista econmico. Os principais processos fermentativos so
a fermentao alcolica, lctica e biossntese actica. Os principais
produtos da fermentao alcolica so as bebidas alcolicas e o eta-
nol carburante, os da fermentao lctica so os leites fermentados,
queijos, chucrutes, picles e azeitonas e os da biossntese actica os
vinagres e cido actico.
Com o avano da biotecnologia, espera-se que novos produtos
industriais e processos de obteno sejam produzidos e aperfeioa-
dos, tornado o sistema mais eciente, com benefcios sociais, ambien-
tais e econmicos.
rea ambiental
A aplicao mais direta da biotecnologia na rea ambiental est
relacionada biodegradao, ou seja, decomposio de materiais ou
substncias qumicas pela ao dos seres vivos, sobretudo, pela ao
dos microrganismos. A biodegradao vantajosa ao meio ambiente
porque elimina certos contaminantes de origem orgnica como fezes,
detergentes, papeis, etc.
A tecnologia baseada na biodegradao chamada de biorreme-
diao, que a utilizao de seres vivos ou seus componentes (geral-
mente microrganismos ou enzimas) na recuperao de reas contami-
22
nadas, degradando compostos poluentes. Esse processo de degradao
pode no ser efetivo se o contaminante apresentar outras substncias,
tais como, metais pesados (chumbo e mercrio), ou se o meio apre-
sentar um pH extremo ou outras condies que dicultam a ao
microbiana. No caso dos metais pesados, a torremediao (utiliza-
o das plantas no processo de recuperao de reas contaminadas)
til, pois muitas plantas so capazes de acumular essas toxinas em
suas razes ou partes areas, as quais so colhidas e eliminadas da
rea contaminada. No caso das condies desfavorveis ao micro-
biana, um exemplo mais geral o tratamento de derramamentos de
leo com nitratos ou sulfatos, criando condies favorveis decom-
posio do leo pelas bactrias.
As experincias com a biodiversidade dos microrganismos mos-
tram que inmeros compostos poluentes podem ser degradados.
Pensando-se na transformao gentica, microrganismos transgni-
cos podem ser desenvolvidos para degradar determinado poluente.
Logicamente, o uso de tais microrganismos deve ser precedido de pes-
quisas relacionadas biossegurana, evitando que tal microrganismo
se torne um invasor do ecossistema.
Alm da biorremediao, a biotecnologia apresenta aplicaes indi-
retas relacionadas aos benefcios ambientais, como o uso de plan-
tas transgnicas. Andrade e Faleiro (2009) relataram diversos traba-
lhos que estudaram o efeito ambiental positivo dos OGMs. Segundo
Brookes e Barfoot (2005), as lavouras com plantas transgnicas con-
triburam para uma signicativa reduo no impacto ambiental global
da produo agrcola, relacionada uma diminuio do uso de pesti-
cidas. Outro benefcio de algumas plantas transgnicas est relacio-
nado viabilizao de sistemas de produo que utilizam o cultivo
mnimo ou plantio direto. As vantagens desse sistema so: conserva-
o do solo evitando-se a eroso, diminuio da emisso de gases de
efeito estufa, reduo do assoreamento dos rios e mananciais e con-
servao da fertilidade e da micro e macro fauna e ora do solo.
Acredita-se que muito ainda deve ser pesquisado e desenvolvido
considerando os benefcios ambientais da biotecnologia. Segundo
Fontes e Sampaio (1997), entre as novas ferramentas da cincia men-
cionadas como chave para a agricultura ambientalmente sustentvel,
a biotecnologia ocupa lugar de destaque.
23
rea da sade
Os benefcios da biotecnologia na rea da sade so impressio-
nantes. Villen (2009) relata de forma objetiva os principais impac-
tos positivos da biotecnologia na rea da sade, citando como exem-
plo histrico o uso de antibiticos. Os antibiticos so empregados
no combate a infeces causadas por microrganismos, notadamente
bactrias, tanto no organismo humano como no animal e vegetal.
Os antibiticos possuem destacada importncia econmica, entre os
produtos obtidos pela biotecnologia. Atualmente, existem mais de 5
mil tipos diferentes de antibiticos. Essa diversidade foi possvel e
impactada pelo melhoramento gentico dos microrganismos utiliza-
dos na produo.
Outro exemplo histrico e tambm citado por Villen (2009) o uso
das vacinas. As vacinas representam um importante instrumento no
controle de doenas infecciosas. Muitas doenas podem ser evitadas
pela imunidade induzida como a poliomielite, a varola, o sarampo,
entre outras. As vacinas podem ser de origem viral, bacteriana, proto-
zoria e mesozoria. A biotecnologia, pela tcnica do DNA recombi-
nante, tem permitido o desenvolvimento de novos agentes imunizan-
tes para inuenza, herpes, polio e hepatite A e B. Vacinas de origem
bacteriana, para diversos tipos de meningite, tm sido produzidas por
meio de fermentao.
A produo de macromolculas teis na medicina humana e ani-
mal pela biotecnologia tambm apresenta grande importncia. A
produo dessas macromolculas por microrganismos teve grande
impulso com a tecnologia do DNA recombinante. Entre os principais
produtos, esto a insulina humana, interferon, hormnio de cresci-
mento humano, peptdios neuroativos, hidrocortisona, testosterona,
vitaminas etc. Podemos dizer que a produo da insulina humana
por bactrias, na dcada de 1970, foi a primeira utilizao comercial
da engenharia gentica. Segundo Arago (2009), atualmente, mais de
400 genes de protenas com potencial para o uso teraputico na medi-
cina humana e veterinria j foram obtidos. Mais de 30 desses genes
foram introduzidos em organismos transgnicos que geraram medi-
camentos aprovados e utilizados em vrias partes do mundo.
24
Agropecuria
A atividade agropecuria, conforme documentada pela histria e
por registros arqueolgicos, tem sido inseparvel da evoluo e da ati-
vidade da sociedade humana. A sociedade como vista hoje no pode-
ria ter desenvolvido ou mesmo sobrevivido sem uma adequada fonte
de alimentos. A inveno da agricultura, contudo, no resolveu por
denitivo o problema do suprimento de alimentos. Quando a seca ou
a exploso de doenas e pragas caam sobre as culturas, o resultado
era fome e crise. Esses fatos j ocorriam h muitos anos, como citado
em numerosas referncias bblicas.
Alternativas biotecnolgicas para aumentar a produtividade das
plantas e dos animais e torn-los mais resistentes a fatores ambien-
tais foram sendo desenvolvidas ao longo dos anos. Um destaque espe-
cial deve ser dado ao melhoramento gentico que, desde o incio da
agricultura, vem sendo utilizado pelos povos, mesmo que de forma
emprica. Aps a redescoberta das leis de Mendel, o melhoramento
gentico comeou a ser realizado de forma mais eciente e precisa.
Inmeros so os exemplos dos benefcios do melhoramento gen-
tico vegetal e animal na agricultura. Com o advento da biotecnolo-
gia moderna, novas perspectivas so esperadas. Segundo Borm e
Milach (1998), a biotecnologia moderna ser gradativamente incor-
porada na rotina do melhoramento gentico, como instrumento para
desenvolver novas variedades, tornando a cincia ainda mais precisa.
Marcadores moleculares e da engenharia gentica esto permitindo
diminuir o tempo para obteno de novas variedades e expandir o con-
junto gnico disponvel para cada programa de melhoramento gen-
tico, entretanto muito ainda deve ser pesquisado considerando toda
potencialidade das tecnologias. Segundo Ferreira e Faleiro (2008),
do ponto de vista comercial, a indstria transgnica vegetal tem sido
marcada at agora pelo emprego de apenas dois tipos de genes: resis-
tncia herbicida e resistncia a insetos. Vrios outros produtos tm
sido testados, como aumento de vitamina A em gros de arroz (gol-
den rice, YE et al., 2000) ou vitamina E (SHINTANI; DELLAPENNA,
1998); qualidade de fruto; resistncia a fungos; resistncia bact-
ria; composio de amido nos gros (JOBLING et al., 2002); tolern-
25
cia estresse abitico, principalmente seca e salinidade (BARTELS;
NELSON, 1994).
Outra alternativa biotecnolgica utilizada na agropecuria o con-
trole biolgico, o qual baseia-se na utilizao de recursos genticos
microbianos, insetos predadores e parasitoides para o controle de
doenas e pragas, especialmente os insetos e caros tfagos, nos
sistemas de produo agrcola. Segundo Menezes (2006), o incio da
histria do uso do controle biolgico de pragas agrcolas ocorreu no
sculo III, quando os chineses se valeram da predao de formigas
(Oecophylla smaragdina) para o controle de pragas de citros. Todavia,
somente no sculo XX que o controle biolgico passou a ser objeto
de pesquisas constantes para sua implantao de forma mais presente
e intensiva nos ecossistemas agrcolas.
O uso de microrganismos na agricultura tambm merece desta-
que. Bactrias xadoras de nitrognio e fungos micorrzicos so dois
exemplos clssicos. A xao biolgica de nitrognio o processo pelo
qual esse elemento qumico captado da atmosfera, onde se caracte-
riza pela sua forma molecular relativamente inerte (N2) e conver-
tido em compostos nitrogenados, como amnio ou nitrato, usados em
diversos processos qumico-biolgicos do solo, especialmente impor-
tantes para a nutrio de plantas. A associao de bactrias diazotr-
cas, principalmente do gnero Rhizobium, com razes de plantas
um tipo de simbiose em as bactrias utilizam parte dos fotoassimi-
lados da planta hospedeira, a qual benecia-se do nitrognio xado
pela bactria.
A inoculao de bactrias diazotrcas em sementes de legumi-
nosas uma tecnologia capaz de reduzir consideravelmente a adu-
bao mineral nitrogenada e em alguns casos substitui-la. A micor-
riza tambm uma associao simbitica entre fungos micorrzicos
e as razes de algumas plantas. Nesse caso, os fungos utilizam parte
dos fotoassimilados das plantas para o desenvolvimento de hifas que
vo auxiliar as razes da planta na funo de absoro de gua e mine-
rais do solo, j que aumentam a superfcie de absoro ou rizosfera.
A cultura de tecidos, como biotecnologia, tambm apresenta vrios
benefcios para a agricultura e mais especicamente para os progra-
mas de melhoramento gentico de plantas. Ferreira et al. (1998) citam
26
algumas dessas aplicaes como a conservao e avaliao de ger-
moplasma; aumento da variabilidade gentica para ns de seleo;
introgresso de genes de interesse (polinizao in vitro, cultura de
embries, fuso de protoplastos, haploidizao por cultura de anteras);
acelerao do programa de melhoramento (germinao de sementes
in vitro, clonagem de gentipos) e produo comercial de mudas de
alta qualidade (multiplicao e limpeza clonal). Alm disso, para a
obteno de uma planta transgnica, indispensvel um mtodo e-
ciente de regenerao in vitro (ANDRADE, 2003).
Na agropecuria, importante considerar os avanos da biotecno-
logia na produo e no melhoramento gentico animal. Tecnologias
como a inseminao articial, transferncia de embries, a clonagem
animal e a transformao gentica podem ser destacadas pelos avan-
os obtidos nos ltimos anos. Alm do aumento da produtividade,
essas tcnicas tm sido importantes na seleo e reproduo de ani-
mais com caractersticas genticas de interesse, alm da diminuio
do intervalo entre geraes. Pensando-se na conservao de recursos
genticos animais, essas tecnologias tm permitido a reproduo de
animais ameaados de extino.
As aplicaes da biotecnologia na agropecuria so inmeras,
embora a perspectiva seja de que novas aplicaes sejam pesquisa-
das e desenvolvidas a cada ano. Alm do aumento da produtividade
dos sistemas agropecurios, essas aplicaes so importantes para
a busca da sustentabilidade, fazendo com que tais sistemas causem
menor impacto ambiental.
rea cientfica
As aplicaes da biotecnologia na pesquisa cientca e tecnolgica
so fantsticas. O desenvolvimento de processos e metodologias de
estudo dos microrganismos e mais recentemente as anlises do DNA,
das protenas e das rotas metablicas abriram novas portas para a
atuao dos cientistas. Palavras como genmica, transcriptmica,
protemica e metabolmica so cada vez mais comuns nos artigos
cientcos. Essas metodologias tm permitido os estudos de funo
e regulao da expresso gnica, anlise de processos de transcrio
e traduo. Esses estudos tm permitido a prospeco de genes de
27
interesse em diferentes seres vivos, o estudo de mecanismos envol-
vidos na resistncia de plantas e animais a estresses biticos e abiti-
cos, o desenvolvimento de tcnicas de diagnose molecular de doenas
e agentes patognicos, entre outras inmeras atividades cientcas e
pr-tecnolgicas.
Consideraes finais
inquestionvel que a biotecnologia, incluindo as tecnologias da
biotecnologia moderna, hoje uma das ferramentas de grande impor-
tncia para propiciar benefcios a diferentes setores da sociedade. No
caso da agropecuria, aes de pesquisa e desenvolvimento na rea
biotecnolgica so fundamentais para o desenvolvimento de sistemas
mais produtivos e sustentveis. A evoluo da cincia biotecnolgica
est caminhando a passos largos e pode-se dizer que a biotecnologia
moderna ainda uma criana, considerando todas as potencialidades
e o que ainda vai ser descoberto.
Referncias
AGNCIA BRASILEIRA DE DESENVOLVIMENTO INDUSTRIAL. Disponvel
em: <http://www.abdi.com.br/?q=node/22, 2009>. Acesso em: 24 jul. 2009.
ANDRADE, S. R. M. Transformao de plantas. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados,
2003. (Embrapa Cerrados. Documentos, 102). 8 p.
ANDRADE, S. R. M.; FALEIRO, F. G. Biossegurana ambiental. In: FALEIRO, F.
G.; ANDRADE, S. R. M. Biotecnologia, transgnicos e biossegurana. Planaltina,
DF: Embrapa Cerrados, 2009. p. 61-76.
ARAGO, F. J. L. Engenharia gentica: estado da arte. In: FALEIRO, F. G.;
ANDRADE, S. R. M. Biotecnologia, transgnicos e biossegurana. Planaltina, DF:
Embrapa Cerrados, 2009. p. 31-48.
BARTELS, D.; NELSON, D. Approaches to improve stress tolerance using
molecular genetics. Plant, Cell and Environment, Oxford, v. 17, p. 655-667.
BOREM, A.; MILACH, S. C. K. Plant breeding in the turn of the millennium.
Brazilian archives of biology and techonology, v. 41, p. 278-283, 1998.
BOREM, A.; ROMANO, E. S.; GROSSI, M. F. Fluxo gnico e transgnicos. 2. ed.
Viosa: UFV, 2007. v. 1. 199 p.
28
BOREM, A.; SANTOS, F. R. Biotecnologia Simplificada. 2. ed. Visconde do Rio
Branco: Suprema, 2004. v. 1. 302 p.
BORM, A.; VIEIRA, M. L. C.; COLLI, W. Glossrio de biotecnologia. 2. ed.
Visconde do Rio Branco: Suprema, 2009. 186 p.
BROOKES, G.; BARFOOT, p. GM Crops: The global economic and environmental
impact The rst nine years 1996-2004. AgBioForum, v. 8, p. 187-196, 2005.
CONSELHO DE INFORMAES SOBRE BIOTECNOLOGIA - CIB. Disponvel
em: <http://www.cib.org.br, 2009>. Acesso em: 29 jul. 2009.
CONVENTION ON BIOLOGICAL DIVERSITY.1992. Disponvel em: < http://
www.cbd.int/>. Acesso em: 17 out. 2009.
FALEIRO, F. G.; ANDRADE, S. R. M. Biotecnologia e transgnicos. In: FALEIRO,
F. G.; ANDRADE, S. R. M. Biotecnologia, transgnicos e biossegurana.
Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2009. p. 15-29.
FERREIRA, M. E.; CALDAS, L. S.; RESENDE, R. O. Aplicaes da cultura de
tecidos no melhoramento gentico de plantas. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.;
BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformao gentica de plantas. Braslia, DF:
Embrapa, 1998, p. 21-43.
FERREIRA, M. E.; FALEIRO, F. G. Biotecnologia: avanos e aplicaes no
melhoramento gentico vegetal. In: FALEIRO, F. G.; FARIAS NETO, A. L.
Savanas: desaos e estratgias para o equilbrio entre sociedade, agronegcio e
recursos naturais. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2008. p. 765-792.
FONTES, E. M. G.; SAMPAIO, M. J. A. Biossegurana e a agrobiotecnologia do ano
2000. Anurio ABRASEM, Braslia, p. 41-48, 1997.
JOBLING, S. A.; WESTCOTT, R. J.; TAYAL, A.; JEFFCOAT, R.; SCHWALL,
G. p. Production of a freeze-thaw-stabel potato starch by antisense inhibition of
three starch syntase genes. Nature Biotechnology, v. 20, p. 295-299, 2002.
MENEZES, E. L. A. Controle biolgico: na busca pela sustentabilidade da
agricultura brasileira. Disponvel em: <http://www.cnpab.embrapa.br/
publicacoes/artigos/artigo_controle_biologico.html>. Acesso em: 24 jul. 2009.
POWELL, P. A.; NELSON, R. C.; DE, B.; HOFFMANN, N.; ROGERS, S. G.;
FRALEY, R.T.; BEACHY, R. N. Delay of disease development in transgenic plants
that express the tobacco mosaic virus coat protein gene. Science, v. 232, p. 738-743,
1986.
SHINTANI, D.; DELLAPENNA, D. Elevating the vitamin E content of plants
though metabolic engineering. Science, v. 282, p. 2098-2100, 1998.
TORRES, A. C.; FERREIRA, A. T.; S, F. G.; BUSO, J. A.; CALDAS, L. S.;
NASCIMENTO, A. S.; BRGIDO, M. M.; ROMANO, E. Glossrio de biotecnologia
vegetal. Braslia, DF: Embrapa Hortalias, 2000. 128 p.
29
VILLEN, R. A. Biotecnologia: histrico e tendncias. Disponvel em <http://www.
hottopos.com/regeq10/rafael.htm>. 2009. Acesso em: 24 jul. 2009.
WIKIPDIA: a inciclopdia livre. Biotecnologia. Disponvel em: <http://
pt.wikipedia.org/wiki/Biotecnologia>. 2009. Acesso em: 24 jul. 2009.
YE, X.; AL-BADILI, S.; KLTI, A.; ZHANG, J.; LUCCA, P.; BEYER, P.;
POTRYKUS, I. Engineering the provitamin A (beta-carotene) biosynthetic pahtway
into (carotenoid-free) Rice endosperm. Science, v. 287, p. 303-305, 2000.
Bibliografia complementar
BOREM, A.; GIUDICE, M. P. Biotecnologia e Meio Ambiente. 2. ed. Visconde do
Rio Branco: Suprema, 2008. v. 1. 510 p.
BOREM, A.; SANTOS, F. R. Entendendo a Biotecnologia. Visconde do Rio Branco:
Suprema, 2008. v. 1. 342 p.
FALEIRO, F. G.; ANDRADE, S. R. M. Biotecnologia, transgnicos e biossegurana.
Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2009. 183 p.
SASSON, A. Plant and Agricultural Biotechnology: Achievements, Prospects and
Perceptions. Mxico: Ciencia y Tecnologa, 2006. 444 p.
Captulo 2
31
Princpio cientfico e anlises
genticas utilizando
marcadores moleculares
Fbio Gelape Faleiro
Introduo
Nos ltimos anos, com os avanos na rea da gentica e biolo-
gia molecular, principalmente com o advento da tecnologia do DNA
recombinante, da reao em cadeia da polimerase (PCR) e do sequen-
ciamento automtico do DNA, foram desenvolvidas poderosas tcni-
cas para o desenvolvimento de diferentes tipos de marcadores genti-
cos moleculares. O elevado nmero de artigos cientcos que utilizam
tais marcadores no estudo de vrias espcies e com as mais variadas
aplicaes evidencia o impacto dessa tecnologia na pesquisa cient-
ca e tecnolgica (AYAD et al., 1997; FERREIRA; GRATTAPAGLIA,
1998; FALEIRO, 2007; BORM; CAIXETA, 2009).
Marcadores moleculares podem ser definidos como marcado-
res genticos baseados na deteco de isoenzimas ou sequncias
de DNA. Entre as vantagens dos marcadores moleculares, podemos
citar a obteno de um nmero praticamente ilimitado de polimor-
smos genticos; a identicao direta do gentipo sem inuncia
do ambiente; a possibilidade de deteco de tais polimorsmos em
qualquer estdio do desenvolvimento da planta ou do animal ou a par-
tir de cultura de clulas ou tecidos e a possibilidade de gerar maior
quantidade de informao gentica por loco no caso de marcadores
co-dominantes.
Os diferentes tipos de marcadores moleculares tm permitido
estudos de evoluo, de diversidade gentica inter e intraespecca,
de identidade, origem gentica e identicao de novos variantes,
32
gerando informaes importantes para subsidiar diferentes aes de
pesquisa, principalmente relacionadas a programas de conservao,
caracterizao e uso de recursos genticos e programas de melhora-
mento animal e vegetal.
Neste captulo, so apresentadas informaes gerais sobre o prin-
cpio cientco e infraestrutura necessria para obteno de diferen-
tes tipos de marcadores moleculares. As principais anlises genticas
utilizando marcadores moleculares tambm so discutidas e exem-
plicadas.
Princpio cientfico dos marcadores moleculares
O princpio da utilizao dos marcadores moleculares baseado no
dogma central da biologia molecular e na pressuposio de que dife-
renas genticas no DNA signicam, na maioria das vezes, diferen-
as nas protenas codicadas, as quais em conjunto levam a diferen-
as no fentipo (Figura 1).
DNA RNA Protenas
Ambiente
Clula Fentipo
Figura 1. Dogma central da biologia molecular, evidenciando a inuncia
direta do DNA no fentipo .
Existem vrios questionamentos sobre o uso apropriado das vrias
tecnologias disponveis, incluindo questes nanceiras relacionadas
infraestrutura e material de custeio necessrios s metodologias,
questes metodolgicas de obteno e anlise dos marcadores mole-
culares considerando os diferentes tipos, questes relacionadas aos
recursos humanos com treinamento e experincia e questes relacio-
33
Captulo 2 Princpio cientfico e anlises genticas utilizando marcadores moleculares
nadas s aplicaes prticas desses marcadores. Tais questes sero
discutidas a seguir.
Infraestrutura necessria obteno
de marcadores moleculares
Para a obteno de marcadores genticos moleculares, necess-
ria uma infraestrutura para realizar as diferentes fases da metodolo-
gia, a qual varia de acordo com o tipo de marcador: de um modo geral,
so necessrios equipamentos de refrigerao para estocagem de rea-
gentes e enzimas, equipamentos para a extrao de DNA, amplica-
o via reao em cadeia da polimerase (PCR), separao por eletro-
forese, fotodocumentao e anlise gentica dos marcadores gerados
(FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998) (Figura 2).
Figura 2. Equipamentos utilizados na obteno e anlise de marcadores
moleculares: (A) centrfugas e banho maria; (B) espectrofotmetro; (C) sis-
temas para eletroforese; (D) sistema refrigerao; (E) computadores; (F) ter-
mocicladores; sistemas para fotodocumentao; e (G) sequenciadores auto-
mticos de DNA (H ).
Alm do tipo do marcador molecular, a infraestrutura tambm
depende do nmero de acessos a serem analisados, sendo que equi-
pamentos mais robustos so necessrios para anlises de grande
nmero de acessos. Normalmente, no incio do desenvolvimento das
diferentes tecnologias, tanto os equipamentos quanto o material de
F
o
t
o
s
:

F
b
i
o

G
e
l
a
p
e

F
a
l
e
i
r
o
34
custeio so muito caros, contudo, com a concorrncia entre as dife-
rentes empresas que fornecem tais materiais, o preo para a monta-
gem de infraestrutura e obteno de marcadores moleculares vem
reduzindo a cada ano.
Para montar uma infraestrutura necessria obteno de marcado-
res moleculares, importante considerar a demanda de uso de cada
equipamento a ser adquirido. importante considerar que equipa-
mentos robustos com alto custo de manuteno devem ser adquiri-
dos quando existe, no laboratrio, uma grande demanda de uso de
tal equipamento. Atualmente, existem empresas privadas especiali-
zadas em determinados tipos de gerao de dados genmicos, como
sequenciamento de DNA, testes de paternidade e identidade gentica,
alm de dados de genotipagem. Em determinadas situaes, o custo
da montagem e manuteno de infraestrutura laboratorial pode ser
maior que o custo da contratao de servios terceirizados. H uma
tendncia de diminuio do custo de dados genmicos nos ltimos
anos, considerando o desenvolvimento de equipamentos mais robus-
tos que permitem a anlise de grande quantidade de materiais gen-
ticos ao mesmo tempo e a otimizao de metodologias de anlises, as
quais utilizam menor quantidade de reagentes e suprimentos.
Outro ponto a ser considerado na montagem da infraestrutura
laboratorial est relacionado aos tipos de marcadores moleculares
e de anlises que sero implementadas. Alguns marcadores mole-
culares, como os isoenzimticos, exigem uma infraestrutura mais
simples, enquanto outros, como aqueles baseados em anlises de
sequncias, exigem estruturas mais complexas, envolvendo sequen-
ciadores automticos de DNA. De toda forma, considerando a impor-
tncia da tecnologia para centros de ensino e pesquisa, desejvel que
tais instituies tenham uma infraestrutura mnima para extrao e
amplicao de DNA, separao por eletroforese, alm de computa-
dores com acesso Internet, onde podem ser obtidas informaes
valiosas em banco de dados genmicos de acesso gratuito.
Diferentes tipos de marcadores moleculares
Existe, atualmente, um grande nmero de marcadores moleculares.
Cada tipo de marcador apresenta vantagens e desvantagens e a utili-
35
zao de um ou outro vai depender, entre outros fatores, do objetivo
do estudo; da infraestrutura disponvel; dos recursos nanceiros para
o investimento; da disponibilidade de recursos humanos com treina-
mento apropriado; e do nvel de conhecimento da gentica molecu-
lar da espcie a ser estudada (FALEIRO, 2007).
Vrios autores, entre eles, Ferreira e Grattapaglia (1998), Faleiro
(2007), Caixeta et al. (2009), descrevem com detalhes vrios tipos de
marcadores moleculares. Na Tabela 1, so apresentadas as principais
caractersticas dos principais tipos de marcadores moleculares e na
Figura 3, so ilustrados alguns deles.
Tabela 1. Diferentes tipos de marcadores moleculares e suas princi-
pais caractersticas, segundo Faleiro (2007).
Marcador Conceito / base gentica
Expresso
gentica
Conhecimento
prvio de
sequncia
Principais
aplicaes
Isoenzimas
Grupo de mltiplas formas
moleculares da mesma enzima
que ocorre em uma espcie,
como resultado da presena de
mais de um gene codicando
cada uma das enzimas. As
diferentes isoenzimas so
resultantes de variaes allicas
dos genes codicadores
C-dominante No
Fingerprinting
e diversidade
gentica
RAPD
Vem do ingls Random
Amplified Polymorphic DNA,
ou seja, DNA polimrco
amplicado ao acaso.
So fragmentos de DNA
amplicados pela PCR
utilizando primers curtos
(geralmente dez nucleotdeos)
de sequncia aleatria. Como
o primer possui sequncia
aleatria, a sequncia alvo da
amplicao desconhecida
Dominante No
Fingerprinting,
diversidade
gentica,
mapeamento
gentico
Continua
36
Expresso
gentica
Conhecimento
prvio de
sequncia
Principais
aplicaes
RFLP
Vem do ingls Restriction
Fragment Length Polymorphism,
ou seja, polimorsmo do
comprimento de fragmentos
de restrio. So fragmentos
de DNA obtidos com o uso de
enzimas de restrio, separados
por eletroforese e visualizados
por meio de hibridizaes
com sondas de sequncias
homlogas marcadas com
radioatividade ou uorescncia
C-dominante Sim
Anlise
logentica,
fingerprinting,
diversidade
gentica,
mapeamento
gentico
Microssatlites
/ SSR /SSLP
/ STMS
Marcadores microssatlites ou
SSR (Simple Sequence Repeats)
ou SSLP (Simple Sequence
Length Polymorphisms) ou STMS
(Sequence Tagged Microsatellites),
so sequncias do DNA muito
curtas (2 a 5 pb) repetidas em
tandem (lado a lado), cuja
deteco feita pela PCR,
utilizando primers especcos
C-dominante Sim
Mapeamento
gentico,
Fingerprinting,
diversidade
gentica,
anlise
logentica
AFLP / SFLA
/SRLA
Marcador AFLP (Amplified
Fragment Length Polymorphism)
ou SFLA (Selective Fragment
Length Amplification) ou
SRLA (Selective Restriction
Fragment Amplification) so
polimorsmos de comprimento
de fragmentos amplicados.
So fragmentos de DNA (80 a
500 pb) obtidos com a digesto
do DNA com enzimas de
restrio, seguida da ligao de
oligonucleotdeos adaptadores
e amplicao seletiva dos
fragmentos via PCR. Este
tipo de marcador combina os
princpios dos marcadores
RAPD (ver) e RFLP (ver)
Dominante No
Mapeamento
gentico,
diversidade
gentica e
fingerprinting
Tabela 1. Continuao.
Continua
37
Expresso
gentica
Conhecimento
prvio de
sequncia
Principais
aplicaes
Minissatlites
/ VNTRs
Marcadores minissatlites ou
VNTRs (Variable Number of
Tandem Repeats) so sequncias
do DNA de 10 a 100 pb repetidas
em tandem (lado a lado). O
nmero de repeties de tais
sequncias em cada regio
hipervarivel pode chegar a 50.
As regies hipervariveis esto
distribudas por todo genoma,
constituindo vrios locos nos
diferentes cromossomos
C-dominante
/ Dominante
(no caso de
sonda para
vrios locos)
Sim
Fingerprinting,
diversidade
gentica,
anlise
logentica
CAPS /
PCR-RFLP
Vem do ingls Cleaved
Amplified Polymorphic
Sequence, ou seja, sequncia
polimrca amplicada e
clivada. So fragmentos de
DNA amplicados via PCR,
utilizando-se primers especcos
(20 a 30 pb), seguido da digesto
com endonucleases de restrio.
um tipo de marcador
gentico molecular tambm
conhecido como PCR-RFLP
C-dominante Sim
Anlise
logentica,
fingerprinting,
diversidade
gentica,
mapeamento
gentico
SSCP /
DGGE /
TGGE
Vem do ingls Single-Strand
Conformation Polymorphism.
So fragmentos de DNA de 200
a 800 pb amplicados via PCR
usando primers especcos,
os quais so desnaturados
para ta simples e separados
por eletroforese. O princpio
deste tipo de marcador que
a eletroforese da ta simples
do DNA permite a deteco
da variao da sequncia
de nucleotdeos de cada
fragmento, responsvel por
sua estrutura secundria. As
tcnicas de DGGE (Denaturing
Gradient Gel Electrophoresis) e
TGGE (Thermal Gradient Gel
Electrophoresis) so utilizadas na
obteno destes marcadores.
C-dominante Sim
Anlise
logentica,
fingerprinting,
diversidade
gentica
Continua
38
Expresso
gentica
Conhecimento
prvio de
sequncia
Principais
aplicaes
ISSR
Vem do ingls Inter Simple
Sequence Repeats. So
fragmentos de DNA de 100 a
3000 pb amplicados via PCR
usando um nico primer (16-20
pb) construdo a partir de
sequncia de microssatlites
Dominante No
Fingerprinting,
diversidade
gentica,
anlise
logentica
PCR
sequencing
Este tipo de marcador
gentico molecular envolve a
determinao da sequncia de
nucleotdeos de um fragmento
de DNA amplicado via PCR
utilizando primers especcos (15
a 30 pb) para uma determinada
regio do genoma em estudo
Sequncia de
nucleotdeos
Sim
Taxonomia,
interespecca,
Anlise
logentica
S-SAP
Vem do ingls Sequence-Specific
Amplified Polymorphism. um
tipo de marcador molecular
baseado na deteco de
variao em fragmentos de
DNA que anqueiam stios de
insero de retrotransposons. Os
fragmentos so amplicados
via PCR usando um primer
desenhado a partir da regies
de terminao conservadas
(LTRs - Long Terminal Repeats)
e outro baseado na presena
de um stio de endonucleases
de restrio prximo s LTRs
C-dominante Sim
Anlise
logentica,
mapeamento
gentico
IRAP
Vem do ingls
Inter-Retrotransposon Amplified
Polymorphism. um tipo de
marcador molecular baseado
na deteco de variao
em stios de insero de
retrotransposons. Fragmentos
de DNA so amplicados
via PCR usando primers
desenhados a partir das regies
de terminao conservadas
(LTRs - Long Terminal Repeats)
C-dominante Sim
Anlise
logentica,
mapeamento
gentico
Continua
39
Expresso
gentica
Conhecimento
prvio de
sequncia
Principais
aplicaes
REMAP
Vem do ingls
Retrotransposon-Microsatellite
Amplified Polymorphism. um
tipo de marcador molecular
baseado na deteco de variao
em stios de insero de
retrotransposons. Fragmentos
entre retrotransposons e
microssatlites so amplicados
via PCR usando um primer
baseado nas regies de
terminao conservadas
(LTRs - Long Terminal
Repeats) e outro baseado em
regies de microssatlites
C-dominante Sim
Anlise
logentica,
mapeamento
gentico
RBIP
Vem do ingls Retrotransposon
Based Insertional Polymorphism.
um tipo de marcador
molecular amplicado via PCR
utilizando primers desenhados
a partir de retrotransposon e
suas regies anqueadoras.
A presena ou ausncia da
insero de retrotransposons so
investigadas com base em duas
PCRs: a primeira PCR usando
um primer desenhado a partir do
retrotransposon e outro a partir
de uma regio anqueadora
e a segunda PCR usando
primers desenhados a partir das
duas regies anqueadoras
C-dominante Sim
Anlise
logentica,
mapeamento
gentico
Continua
40
Expresso
gentica
Conhecimento
prvio de
sequncia
Principais
aplicaes
Genmica
funcional
um tipo de marcador
molecular do DNA utilizado
para identicar mutaes e
polimorsmos baseados em
informaes de seqenciamento
do DNA para o desenho de
primers e sondas especcas.
Entre estes marcadores, pode-se
citar aqueles baseados em
seqencias conservadas de
genes de resistncia como a
NBS (Nucleotide Binding Site) e
a LRR (Leucine Rich Repeat) e
aqueles baseados na tecnologia
do chip de DNA, os quais
so baseados na hibridizao
entre sondas e sequncias
complementares de microarrays
(microarranjos) de DNA
Sequncia de
nucleotdeos
Sim
Diversidade
funcional,
mapeamento
gentico,
estudos de
expresso
gnica
SNP
Vem do ingls Single Nucleotide
Polymorphism. um tipo de
marcador molecular do DNA
utilizado para identicar
mutaes e polimorsmos
baseados na posio de
um nico nucleotdeo,
necessitando de informaes
de seqenciamento do DNA
para o desenho de primers
e sondas especcas
Sequncia de
nucleotdeos
Sim
Diversidade
funcional,
anlise
logentica
DAF
Vem do ingls DNA
Amplification Fingerprinting.
uma estratgia para deteco
de diferenas genticas entre
organismos por meio da
amplicao do DNA genmico,
utilizando-se um nico primer
de sequncia arbitrria
Dominante No
Fingerprinting,
diversidade
gentica,
mapeamento
gentico
MAAP
Vem do ingls Multiple
Arbitrary Amplicon Profiling.
um termo coletivo para as
tcnicas de PCR que utilizam
primers de sequncia arbitrria,
como os marcadores RAPD,
AFLP, DAF, entre outros
Dominante No
Fingerprinting,
diversidade
gentica,
mapeamento
gentico
Continua
41
Expresso
gentica
Conhecimento
prvio de
sequncia
Principais
aplicaes
DAMD
Vem do ingls Directed
Amplification of
Minisatellite-region DNA.
uma tcnica de obteno
de marcadores genticos
moleculares amplicados via
PCR usando um nico primer
(16-20 pb) construdo a partir
de sequncia de minissatlites
Dominante Sim
Fingerprinting,
diversidade
gentica,
mapeamento
gentico
SPAR
Vem do ingls Single Primer
Amplification Reaction, ou seja,
reao de amplicao com
primer nico. uma tcnica
para obteno de marcadores
genticos moleculares do DNA
por meio da amplicao via
PCR usando um nico primer
(16-20 pb) construdo a partir de
sequncia de microssatlites
Dominante Sim
Fingerprinting,
diversidade
gentica,
mapeamento
gentico
A
B
A B
F E
C
G H
D
Figura 3. Polimorsmos dos marcadores moleculares: (A) isoenzimas;
(B) RAPD; (C) RFLP; (D) microssatlites; (E) AFLP; (F) minissatlites;
(G) CAPS; (H) e SSCP.
F
o
t
o
:

F
b
i
o

G
e
l
a
p
e

F
a
l
e
i
r
o
.
Continua
42
Anlises genticas com o uso de
marcadores moleculares
Embora exista um grande nmero de marcadores moleculares,
o princpio da anlise desses marcadores o mesmo: marcado-
res comuns aos acessos signicam semelhanas e marcadores no
comuns signicam diferenas genticas. Os dados sobre semelhan-
as e diferenas genticas entre acessos permitem gerar uma grande
quantidade de informaes sobre a diversidade gentica e relacio-
namentos logenticos entre eles. Tais informaes geradas pelos
marcadores moleculares representam uma amostra considervel do
genoma de cada material gentico, sem inuncia do ambiente.
Faleiro (2007) relata alguns passos envolvidos na anlise de marca-
dores moleculares, os quais so descritos a seguir.
O primeiro passo a codicao dos fragmentos moleculares em
dados binrios (no caso de marcadores dominantes) ou dados de coin-
cidncia allica (no caso de marcadores co-dominantes). Os dados
para marcadores dominantes normalmente so codicados como 1
(presena do marcador) e 0 (ausncia do marcador). Os dados para
marcadores co-dominantes normalmente so codicados como 0
(ausncia de alelos comuns no loco), (um alelo comum no loco) e
1 (os dois alelos comuns no loco). No caso de marcadores baseados
na sequncia de nucleotdeos, a codicao a prpria sequncia de
nucleotdeos, representados pelas quatro diferentes bases nitrogena-
das do DNA (Adenina, Timina, Citosina e Guanina).
O segundo passo utilizar os dados codicados para a estimativa
de ndices de similaridade ou de distncia gentica entre cada par de
materiais genticos. Existem vrios ndices descritos na literatura,
como o ndice de similaridade de Nei e Li (1979), Sneath e Sokal
(1973), Gower (1971) tambm citado como coeciente de similaridade
de Jaccard, entre outros. Normalmente, os coecientes de correlao
entre os diferentes ndices so muito altos (CORRA et al., 1999),
embora existam algumas diferenas importantes entre eles (DIAS,
1998). No caso de marcadores baseados na sequncia de nucleotdeos
de um determinado fragmento de DNA, os ndices de similaridade
43
ou de distncia so calculados com base na homologia de sequncia
(KIMURA, 1980).
Com base nos ndices, estabelece-se uma matriz de similaridade ou
de distncias entre os acessos, a qual vai servir de base para as anli-
ses de agrupamento e de disperso dos acessos. As anlises de agrupa-
mento normalmente so baseadas em mtodos hierrquicos, os quais
podem utilizar diferentes critrios de agrupamento: vizinho mais pr-
ximo (single linkage); vizinho mais distante (complete linkage); e base-
ado na mdia das distncias (unweighted pair-group method using ari-
thmetic average). Dias (1998) descreve a aplicao de cada um desses
critrios discutindo sobre as vantagens e desvantagens de cada um.
No caso da anlise de disperso dos acessos, o mtodo mais utilizado
aquele baseado em escalas multidimensionais por meio das coorde-
nadas principais. Esse mtodo tem sido denominado anlise de coor-
denadas principais (PCDA principal coordinates analysis) (GOWER,
1966) e tambm discutido por Dias (1998). Na Figura 4, observam-se
as etapas e os procedimentos mais utilizados para as anlises de mar-
cadores genticos moleculares.
1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5
1 1 1 1 1
0 1 0 0 1
0 1 0 1 1
1 0 1 1 1
0 0 0 0 0
0 1 1 1 1
1 1 1 1 1
6
1
1
1
1
1
1
1
1 2 3 4 5
1
2
3
4
5
-
0,50
0,14
0,25
0,33
-
-
0,33
0,20
0,09
-
-
-
0,11
0,20
-
-
-
-
0,09
-
-
-
-
-
6
-
-
-
-
-
6 0,40 0,17 0,27 0,17 - 0,08
1 2 3 4 5
1
2
3
4
5
-
0,50
0,86
0,75
0,67
-
-
0,67
0,80
0,91
-
-
-
0,89
0,80
-
-
-
-
0,91
-
-
-
-
-
6
-
-
-
-
-
6 0,60 0,83 0,73 0,83 - 0,92
< 1 > 1
< 2 > 3 4
< 3 > 2 5 6
2
6
5
4
3
1
1
3
4
2
5
6
Agrupamento
Marcadores
Dados binrios
Matriz de distncia Matriz de similaridade
Acessos
Grfico de disperso
Dendrograma
Anlise
Estatstica
Grupo
Figura 4. Etapas e os procedimentos mais utilizados para as anlises de mar-
cadores genticos moleculares.
Fonte: Faleiro (2007).
44
Os mtodos analticos e a interpretao dos dados moleculares com
relao gentica de populaes, logenia, evoluo e suas diferentes
aplicaes exigem procedimentos de anlise multivariada e dependem
do tipo do marcador molecular que est sendo utilizado e do objetivo
do trabalho (AVISE, 1993; HARTL; CLARK, 1989).
Com relao ao tipo de marcador, importante diferenciar aqueles
que fornecem dados a partir de um nico loco (por exemplo: PCR/
DNA sequencing) daqueles que fornecem dados multilocos obtidos de
mltiplas regies gnicas (por exemplo: RAPD, AFLP, Minissatlites).
Essa diferenciao importante porque a quantidade da informao
acessada inuencia as interpretaes dos dados. Outra diferenciao
importante so os dados gerados por marcadores dominantes (por
exemplo: RAPD, AFLP) e por marcadores co-dominantes (por exem-
plo: RFLP, microssatlites). Marcadores co-dominantes fornecem
informaes valiosas sobre nmero e frequncia allica em determi-
nado loco de uma populao ou grupo de indivduos, alm da por-
centagem de heterozigosidade dos locos de cada indivduo analisado.
Com relao ao objetivo do trabalho, marcadores moleculares mais
apropriados podem ser preferencialmente utilizados de acordo com
o objetivo do estudo (AVISE, 1993). De um modo geral, marcadores
moleculares multilocos utilizados em DNA fingerprinting (por exem-
plo: RAPD, AFLP, Microssatlites, Minissatlites) so mais apropria-
dos para estudos de identidade gentica, testes de paternidade e estu-
dos de variabilidade dentro da mesma espcie. Marcadores baseados
em comprimentos de fragmentos de restrio como os RFLPs obti-
dos de mtDNA, cpDNA, rDNA so mais apropriados para estudos de
diversidade gentica de espcies fortemente relacionadas. Marcadores
baseados em anlises de sequncias (por exemplo: PCR sequencing)
so apropriados para anlises de espcies com alto nvel de diver-
gncia evolucionria, embora possam ser utilizados para anlises de
espcies ou acessos com qualquer nvel de divergncia evolucionria
(FALEIRO, 2007).
A exibilidade dos marcadores PCR sequencing para estudos em
diferentes nveis de divergncia evolucionria deve-se existncia de
diferentes genes ou regies gnicas com diferentes taxas de substi-
tuio de nucleotdeos (AVISE, 1993), de modo que, dependendo do
45
nvel de divergncia evolucionria que se deseja investigar, genes ou
sequncias de regies gnicas mais apropriadas podem ser escolhi-
das para a realizao do estudo.
A anlise dessas sequncias para estudos logenticos baseada na
homologia de sequncias de diferentes indivduos, populaes, esp-
cies, gneros etc. Os resultados de tais anlises podem gerar matrizes
de distncias e suas variaes estatsticas (Figura 4) ou permitir a rea-
lizao de algoritmos de anlise logentica baseados no princpio de
agrupamento de Hennigian (AVISE, 1993) ou em anlises de parcim-
nia, como a parcimnia de Wagner (FARRIS, 1970), de Camin-Sokal
(CAMIN; SOKAL, 1965) e a parcimnia generalizada (SWOFFORD;
OLSEN, 1990). Arriel et al. (2009) fazem uma tima reviso sobre
mtodos de anlise logentica utilizando marcadores moleculares.
Os diferentes procedimentos estatsticos permitem que a recons-
truo logentica possa ser realizada utilizando construes gr-
cas baseadas em unidades de distncia gentica ou em unidades de
tempo (Figura 5). Unidades de tempo permitem, por exemplo, impor-
tantes estudos sobre a evoluo de um determinado grupo de esp-
cies ou gneros relacionados.
Seqncias
Unidade de tempo
1
5
6
4
2
3
tempo
Unidade de distncia
4
3
2
5
6
1
3
1
1 2 3 4 5 6
Figura 5. Ilustrao de anlises genticas utilizando como input sequncias
de regies genmicas, gerando como output construes grcas de agru-
pamento baseadas em unidades de tempo e distncia gentica.
46
A anlise em unidades de tempo pode ser baseada, por exemplo,
na porcentagem de substituio de nucleotdeos em uma determi-
nada sequncia, comparando-se diferentes indivduos, populaes,
espcies, gneros etc. Neste caso, os marcadores moleculares basea-
dos em anlises de sequncias so mais apropriados, entretanto exis-
tem metodologias para estimar a diversidade nucleotidica a partir de
marcadores moleculares baseados na PCR, como os RAPD (CLARK;
LANIGAN, 1993). A metodologia descrita por Clark e Lanigan (1993)
usa a frequncia de indivduos com ausncia de um fragmento para
estimar a frequncia de homozigotos recessivos e assim a frequncia
gnica e a diversidade nucleotdica. Tal metodologia foi utilizada com
sucesso por Carvalho e Schaal (2001). A ajuda computacional para
a realizao dessas anlises tambm essencial, considerando-se a
grande quantidade de dados moleculares.
Outro tipo de anlise muito comum em trabalhos cientcos que
utilizam marcadores moleculares so aquelas baseadas na co-segre-
gao das marcas moleculares (CRUZ; SILVA, 2009) e sua asso-
ciao com caractersticas de interesse econmico (FERREIRA;
GRATTAPAGLIA, 2009). Esse tipo de anlise muito utilizado em
trabalhos de mapeamento gentico ou construo de mapas de ligao
(SCHUSTER; CRUZ, 2004). A localizao de genes e regies gen-
micas que controlam caractersticas de interesse tem sido feita com
sucesso com o auxlio de marcadores moleculares organizados em
grupos de ligao, os quais so construdos com base nas anlises de
co-segregao. Mapas genticos baseados em marcadores molecula-
res possibilitam a localizao de genes relacionados a caractersticas
qualitativas, bem como a contagem aproximada dos principais locos
envolvidos no controle de caractersticas quantitativas, estimando a
magnitude do efeito destes locos no fentipo de interesse (FERREIRA;
GRATTAPAGLIA, 2009; CRUZ et al., 2009a; 2009b). O princpio das
anlises de co-segregao de marcadores moleculares e caractersti-
cas de interesse econmico so ilustrados na Figura 6.
47
. . .
x
x
Marcador molecular que c-segrega com o fentipo de resistncia
Genitor
Resistente
Genitor
Suscetvel
Populao
Segregante
F2
Planta
F1
Figura 6. Princpio da anlise de co-segregao de marcadores moleculares
e caractersticas de interesse econmico.
Bioinformtica e marcadores moleculares
A realizao de anlises genticas utilizando marcadores molecula-
res seria praticamente impossvel sem a ajuda computacional, princi-
palmente quando vrios acessos so analisados simultaneamente. Da
unio da cincia computacional com a matemtica e a biologia surgiu
a bioinformtica. Numa denio abrangente, a bioinformtica tida
como o estudo e a aplicao de tcnicas computacionais e matemticas
gerao e gerenciamento de informaes biolgicas, em especial, da
biologia molecular. De maneira geral, a bioinformtica pode combi-
nar informaes de qumica, fsica, biologia, cincia da computao
e matemtica/estatstica para processar dados biolgicos.
Apesar do grande avano obtido at os dias de hoje, a rapidez com
que surgem novas tcnicas da biologia molecular e o gigantesco
volume de dados e informaes produzidos pelos projetos nessa rea
exigem que a bioinformtica esteja em constante evoluo. O desen-
volvimento de ferramentas de bioinformtica para a organizao de
bancos de dados, respectivas anlises e modelagem, a adaptao de
ferramentas de bioinformtica para o desenvolvimento de protocolos
para apoio a programas de conservao, caracterizao e uso de ger-
48
moplasma e de melhoramento gentico so importantes demandas
para a pesquisa (FALEIRO et al., 2009).
Existem vrios softwares disponveis para a anlise de marcadores
moleculares, entre eles o Genes (CRUZ, 1997); o Statistica (STATSOFT,
1999); o NTSYS (ROHLF, 1992); o GQMOL (CRUZ; SCHUSTER, 2000);
o SPSS (NORUSIS, 1993); o SAS (SAS, 1989); Mapmaker (LANDER
et al., 1987; LINCOLN et al., 1992); Joinmap (VAN OOIJEN; VOORRIPS,
2001); Jump (SAS, 1989); QTL Cartographer (BASTEN et al., 1994;
BASTEN et al., 1999), entre outros. Na Figura 7, esto ilustradas algu-
mas das interfaces desses softwares.
Figura 7. Interface de alguns softwares utilizados para a anlise gentica uti-
lizando marcadores moleculares: (A) Genes; (B) Statistica; (C) NTSYS; (D)
GQMOL; (E) SPSS; (F) SAS; (G) Joinmap; (H) Jump; (I) QTL Cartographer.
As diferenas entre os vrios softwares disponveis esto relaciona-
das aos procedimentos e abrangncia das anlises; aos formatos dos
arquivos utilizados como entrada de dados; robustez e linguagem
de programao; e qualidade grca dos resultados ou sada dos
dados, bem como facilidade ou no da utilizao dos procedimen-
tos de anlises disponveis na interface com o usurio.
49
Embora a utilizao de cada software seja considerada difcil para
os iniciantes, a maioria dos manuais ou sistemas de ajuda so didti-
cos e contm exemplos de cada procedimento de anlise, facilitando,
dessa forma, sua utilizao. De toda forma, o conhecimento bsico da
gentica mendeliana, molecular e quantitativa fundamental para a
correta interpretao dos dados gerados pelos diferentes tipos de mar-
cadores moleculares.
Consideraes finais
O desenvolvimento de tcnicas de obteno de marcadores molecu-
lares tem sido fascinante. Vrias tcnicas de biologia e gentica mole-
cular esto disponveis para obteno de vrios tipos de marcadores
moleculares e, a cada ano, surgem novas. Algumas tcnicas so mais
robustas possibilitando a obteno de grande quantidade de polimor-
smos genticos em curto espao de tempo e outras so mais sim-
ples demandando uma infraestrutura bsica e baixa quantidade de
reagentes e suprimentos.
Paralelamente ao desenvolvimento das tcnicas de obteno, gran-
des avanos tm sido obtidos na rea da bioinformtica, possibilitando
diferentes tipos de anlises genticas cada vez mais acuradas e pre-
cisas, dando subsdios para diferentes aplicaes prticas dos marca-
dores moleculares em estudos genticos e como ferramenta auxiliar
em programas de conservao, caracterizao e uso de germoplasma
e melhoramento gentico vegetal e animal.
Referncias
ARRIEL, N. H. C.; COSTA, M. M.; TREVISOLI, S. H. U.; DI MAURO, A. O. Outras
aplicaes dos marcadores moleculares. In: BOREM, A.; CAIXETA, E. T. (Ed.).
Marcadores moleculares. Viosa, MG: Editora Folha de Viosa, 2009. p. 209-274.
AVISE, J. C. Molecular markers, natural history and evolution. New York:
Chapman & Hall, 1993. 511 p.
AYAD, W. G.; HODGKIN, T.; JARADAT, A.; RAO, V. R. (Ed.). Molecular genetic
techniques for plant genetic resources. Rome: International Plant Genetic
Resources Institute, 1997. 137 p.
50
BASTEN, C. J.; WEIR, B. S.; ZENG, Z. B. Zmap-a QTL cartographer. In: WORLD
CONGRESS ON GENETICS APPLIED TO LIVESTOCK PRODUCTION, 5., 1994,
Guelph. Proceedings... Guelph: University of Guelph, 1994. p. 65-66.
BASTEN, C. J.; WEIR, B. S.; E ZENG, Z. B. QTL cartographer, Version 1.13.
Raleigh, NC: North Caroline State University, Departament of Statistics, 1999.
BOREM, A.; CAIXETA, E. T. (Ed.). Marcadores moleculares. Viosa, MG: Editora
Folha de Viosa, 2009. 532 p.
CAIXETA, E. T.; OLIVEIRA, A. C. B.; BRITO, G. G.; SAKIYAMA, N. S. Tipos
de marcadores moleculares. In: BOREM, A.; CAIXETA, E. T. (Ed.). Marcadores
moleculares. Viosa, MG: Editora Folha de Viosa, 2009. p. 11-94.
CAMIN, J. H.; SOKAL, R. R. A method for deducing branching sequences in
phylogeny. Evolution, Lancaster, v. 19, p. 311-326, 1965.
CARVALHO, L. J. C. B.; SCHAAL, B. A. Assessing genetic diversity in the cassava
(Manihot esculenta Crantz) germplasm collection in Brazil using PCR-based
markers. Euphytica, Wageningen, v. 120, p. 133-142, 2001.
CLARK, A. G.; LANIGAN, C. M. S. Prospects for estimating nucleotide divergence
with RAPDs. Molecular Biology and Evolution, Chicago, v. 10, p. 1096-1111, 1993.
CORRA, R. X.; ABDELNOOR, R. V.; FALEIRO, F. G.; CRUZ, C. D.; MOREIRA,
M. A.; BARROS, E. G. Genetic distances in soybean based on RAPD markers.
Bragantia, Campinas, v. 58, p. 15-22, 1999.
CRUZ, C. D. Programa Genes: aplicativo computacional em gentica e estatstica.
Viosa, MG: UFV, 1997. 648 p.
CRUZ, C. D.; BHERING, L. L.; GOD, P. I. V. G. Mapeamento de QTLs em
populaes derivadas de cruzamentos controlados. In: BOREM, A.; CAIXETA,
E. T. (Ed.). Marcadores moleculares. Viosa, MG: Editora Folha de Viosa,
2009a. p. 485-532.
CRUZ, C. D.; GOD, P. I. V. G.; BHERING, L. L. Mapeamento de QTLs em
populaes exogmicas. In: BOREM, A.; CAIXETA, E. T. (Ed.). Marcadores
moleculares. Viosa, MG: Editora Folha de Viosa, 2009b. p. 443-482.
CRUZ, C. D.; SCHUSTER, I. Programa GQMOL: gentica quantitativa e
molecular. Viosa, MG: UFV, 2000. Disponvel em: <http://www.ufv.br/dbg/
gqmol/gqmol.htm>. Acesso em: 10 nov. 2009
CRUZ, C. D.; SILVA, L. C. Anlise de marcadores moleculares. In: BOREM, A.;
CAIXETA, E. T. (Ed.). Marcadores moleculares. Viosa, MG: Editora Folha de
Viosa, 2009. p. 361-442.
DIAS, L. A. S. Anlises multidimensionais. In: ALFENAS, A. C. (Ed.). Eletroforese
de isoenzimas e protenas afins. Viosa, MG: UFV, 1998. p. 405-475.
51
FALEIRO, F. G. Marcadores gentico-moleculares aplicados aos programas de
conservao e uso de recursos genticos. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2007.
102 p.
FALEIRO, F. G.; REIS JNIOR, F. B.; FRAGOSO, R. R.; CORDEIRO, M. C. R.;
PINTO, J. F. N.; OLIVEIRA, F. Biotecnologia, transgnicos e biossegurana:
demandas para a pesquisa. In: FALEIRO, F. G.; FARIAS NETO, A. L. Savanas:
demandas para a pesquisa. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2009.
FARRIS, J. S. Methods for computing Wagner trees. Systematic Zoology,
v. 19, p. 83-92, 1970.
FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introduo ao uso de marcadores
moleculares em anlise gentica. 3. ed. Braslia, DF: EMBRAPA-CENARGEN,
1998. 220 p.
FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Gentica de associao em plantas. In:
Folha de Viosa, 2009. p. 327-370.
GOWER, J. C. Some distance properties of latent root and vector methods used in
multivariate analysis. Biometrika, London, v. 53, p. 325-338, 1966.
GOWER, J. C. A general coefciente of similarity and some of its properties.
Biometrics, Washington, v. 27, p. 857-874, 1971.
HARTL, D. L.; CLARK, A. G. Principles of population genetics. 2. ed. Sunderland:
Sinauer Associates, 1989. 682 p.
KIMURA, M. A. A simple method for estimating evolutionary rate of base
substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of
Molecular Evolution, London, v. 16, p. 111-120, 1980.
LANDER, E.; GREEN, P.; ABRAHAMSON, J.; BARLON, A.; DALEY, M.;
LINCOLN, S.; NEWBURG, L. MAPMAKER: an interactive computer package
for constructing primary genetic linkages maps of experimental and natural
populations. Genomics, v. 1, p. 174-181, 1987.
LINCOLN, S.; DALY, M.; LANDER, E. Constructing genetic maps with
MAPMAKER/EXP 3.0. 3. ed. [s. I.]: Whitehead Institute, Technical Report, 1992.
NEI, M.; LI, W. H. Mathematical model for studying genetic variations in terms of
restriction endonucleases. Proceedings of the National Academy of Science USA,
Washington, v. 76, p. 5269-5273, 1979.
NORUSIS, M. J. SPSS for Windows, Advanced Statistics, Release 6.0. Chicago:
SPSS Inc., 1993.
ROHLF, F. J. NTSYS-pc. Numerical taxonomy and multivariate analysis system.
Version 1.70. New York: Exeter Software, 1992. 217 p.
52
SAS INSTITUTE INC. SAS/STAT users guide. Version 6. 4. ed. North Caroline:
SAS Institute, 1989. 846 p.
SCHUSTER, I.; CRUZ, C. D. Estatstica genmica aplicada a populaes derivadas
de cruzamentos controlados. Viosa, MG: UFV, 2004. 568 p.
SNEATH, P. H. A.; SOKAL, R. R. Numerical taxonomy. San Francisco: Freeman
and Company, 1973. 573 p.
STATSOFT INC. Statistica for Windows [Computer program manual]. Tulsa:
StatSoft Inc., 1999. Disponvel em: <http://www.statsoft.com>. Acesso em: 10 out.
2009.
SWOFFORD, D. L.; OLSEN, G. L. Phylogeny reconstruction. In: HILLIS, D.
M.; MORITZ, C. (Ed.). Molecular systematics. Sunderland: Sinauer Associates,
1990. p. 411-501.
VAN OOIJEN, J. W.; VOORRIPS, R. E. JoinMap Version 3.0, Software for the
calculation of genetic linkage maps. Wageningen: Plant Research International,
2001. 51 p.
102 p.
1998. 220 p.
SCHUSTER, I.; CRUZ, C. D. Estatstica genmica aplicada a populaes derivadas
de cruzamentos controlados. Viosa, MG: UFV, 2004. 568 p.
Captulo 3
55
Aplicaes de marcadores
moleculares como ferramenta
auxiliar em programas de
conservao, caracterizao
e uso de germoplasma e
melhoramento gentico vegetal
Fbio Gelape Faleiro
Introduo
Os marcadores moleculares permitem gerar uma grande quanti-
dade de informaes sobre identidade gentica, diversidade, frequ-
ncia gnica, relacionamentos logenticos, mapeamento gentico,
seleo assistida, entre outras. Essas informaes so extremamente
teis em programas de conservao, caracterizao e uso de germo-
plasma e melhoramento gentico.
As informaes moleculares podem complementar as informa-
es ecolgicas, morfolgicas e agronmicas dos recursos genticos,
contribuindo para aumentar a ecincia dos processos de coleta; dire-
cionar o enriquecimento da base gentica; formar e validar colees
nucleares e de trabalho; analisar a diversidade e a pureza gentica;
identicar acessos duplicados e redundantes; auxiliar trabalhos de
classicao botnica e logenia e subsidiar a seleo de genitores, o
planejamento dos cruzamentos e a seleo de gentipos com caracte-
rsticas desejadas em programas de melhoramento gentico.
Dessa forma, pode-se dizer que os marcadores moleculares so
ferramentas poderosas na gerao de informaes teis em diferen-
tes etapas, desde a coleta, caracterizao e uso de recursos genti-
cos, passando por atividades de pr-melhoramento, melhoramento
e ps-melhoramento. Vrios autores tm discutido as aplicaes pr-
ticas dos marcadores moleculares em programas de conservao,
caracterizao e uso de germoplasma (AYAD et al., 1997; FALEIRO,
56
2007; FALEIRO et al., 2008) e em programas de melhoramento
envolvendo as atividades de pr e ps-melhoramento (FERREIRA;
GRATTAPAGLIA, 1998; PINTO et al., 2007; FALEIRO et al., 2008;
PEREIRA et al., 2009; GUIMARES et al., 2009; SCHUSTER et al.,
2009).
Na Figura 1, so apresentadas as principais aplicaes dos marca-
dores moleculares em uma ordem cronolgica, subsidiando diferen-
tes atividades desde a coleta de recursos genticos at a caracteriza-
o molecular de variedades melhoradas e sua utilizao na proteo
da propriedade intelectual. Essas aplicaes sero discutidas e exem-
plicadas neste captulo.
Aplicaes prticas dos marcadores moleculares
Anlise da distribuio geogrfica da variabilidade gentica.

Estratgias de amostragem para coleta de recursos genticos.
Anlise de acessos duplicados e redundantes.
Anlise de pureza gentica e contaminao de germoplasma.
Anlise da diversidade gentica e frequncia gnica.
Auxlio em trabalhos de classificao botnica e filogenia.
Composio de colees nucleares e de trabalho.
Caracterizao de germoplasma.
Auxlio na seleo de genitores para programas de melhoramento.
Confirmao de hibridaes e autofecundaes.
Testes de ascendncia gentica e paternidade.
Recuperao mais rpida do genoma recorrente.
Desenvolvimento de mapas genticos.
Mapeamento comparativo.
Mapeamento gnico.
Seleo assistida por marcadores moleculares.
Seleo genmica ampla.
Predio de desempenho de hbridos simples.
Anlise de homogeneidade gentica de sementes.
Anlise de pureza gentica de sementes e mistura varietal
Anlise de identidade gentica ou fingerprinting.
Caracterizao e proteo de cultivares.
G
e
r
m
o
p
l
a
s
m
a
P
r
-
m
e
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P
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-
M
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r
a
m
e
n
t
o

Figura 1. Principais aplicaes prticas dos marcadores moleculares em pro-
gramas de conservao, caracterizao e uso de germoplasma e programas de
melhoramento gentico envolvendo atividades de pr e ps-melhoramento.
57
Captulo 3 Aplicaes de marcadores moleculares como ferramenta auxiliar em programas...
Anlise da distribuio geogrfica
da variabilidade gentica
O princpio dessa aplicao dos marcadores moleculares confron-
tar a variabilidade gentica molecular com a distribuio geogrca
de vrios acessos do germoplasma. Para a anlise da distribuio geo-
grca, informaes de latitude e longitude do local de coleta de cada
acesso podem ser plotadas conjuntamente com mapas do Sistema de
Informao Geogrca (SIG) (BRASIL, 1981) com o auxlio do pro-
grama ArcView GIS (www.esri.com) (COSTA, 2004). Dessa forma,
descritores ecolgicos do local de coleta de cada acesso, como o tipo
de vegetao, tipo de solo, estado, municpio, bacia hidrogrca, plu-
viometria mdia, entre outros, podem ser obtidos. Na Figura 2, ilus-
tra-se a distribuio geogrca de acessos de Stylosanthes macrocephala
salientando regies onde foram coletados acessos com maior diversi-
dade gentica entre si, segundo dados de Costa et al. (2005).
B A
N N
Figura 2. Distribuio geogrca de acessos de Stylosanthes macrocephala (A),
salientando as reas (B) onde foram coletados acessos com maior diversidade
gentica entre si calculada com base em marcadores moleculares RAPD.
Fonte: Costa (2004).
58
Marcadores moleculares associados a sistemas de informao
geogrca tm permitido estudos da diversidade gentica de aces-
sos por regies, identicao de regies de maior ou menor diver-
sidade (OLSEN; SCHAAL, 1999; CARVALHO et al., 2000a; COSTA
et al., 2005) e a recuperao de informaes importantes sobre as
condies ambientais e biolgicas dos locais de coleta de cada acesso
( GREENE et al., 1999; GUARINO et al., 2002). Essas informaes
so complementares aos dados fenotpicos e geogrcos e tm orien-
tado a escolha de locais para conservao in situ, atividades de coleta
para conservao ex situ e a busca de combinaes gnicas de inte-
resse para programas de melhoramento gentico (RICK et al., 1974;
ZIMMERER; DOUCHES, 1991; HUANG et al., 1998; COSTA, 2004;
FALEIRO et al., 2004a).
Estratgias de amostragem para
coleta de recursos genticos
A coleta de recursos genticos uma etapa bsica e de extrema
importncia para os programas de conservao e uso de recursos
genticos realizada por meio de expedies, com o objetivo de resga-
tar plantas ou populaes de plantas de interesse. Normalmente, em
uma expedio, plantas so resgatadas por meio de sementes e (ou)
mudas e, geralmente, procura-se amostrar ecientemente a diver-
sidade gentica existente. A escolha inadequada dos locais de coleta
pode fazer com que no haja uma boa representatividade da variabi-
lidade gentica que precisa ser conservada e utilizada.
Na Figura 3, ilustra-se um estudo sobre a diversidade gentica de
acessos de cacaueiro coletados nas regies amaznicas do Brasil, Peru
e Equador (FALEIRO et al., 2004a), mostrando a formao de grupos
contendo materiais de diferentes origens amaznicas, no eviden-
ciando uma regionalizao clara da variabilidade gentica. Esta no
regionalizao, na verdade, explicada pela alta variabilidade gentica
dos materiais utilizados no presente estudo, conrmando a impor-
tncia da regio amaznica para misses de coleta de recursos gen-
ticos visando ampliao da base gentica de programas de melho-
ramento do cacaueiro.
59
Estudos da diversidade gentica molecular de acessos ou popula-
es em diferentes regies podem fornecer informaes importantes
sobre estratgias de amostragem para realizao de ecientes traba-
lhos de coleta (nmero de acessos, tamanho de cada populao, an-
lise quantitativa e qualitativa das regies onde sero feitas as coletas,
etc.) (LAMBOY et al., 1994; 1996; CESKA et al., 1997; ZORO BI et al.,
1998; NEBAUER et al., 1999).
Brasil
Peru
Equador
1
1
1
2
2
2
3
3
3
4
4
4
5
5
5
6
6
6
7
7
7
8
8
8
9
10
9
9
CSUL 3
SCA 6
SIAL 70
LCTEEN 37
CAB 324
EQX 3360
COCA 3370
EQX 3348
CAB 191
ICS 1
11
11
11
12
12
12
13
13
10
10
13
14
14
14
15
15
15
16
16
16
17
17
17
18
18
18
19
19
19
CSUL 8
Amaznia brasileir a
LEGENDA
Amaznia peruana
Amaznia equatoriana
Material trinitrio
U 32
CAB 148
U 6
U 11
U 14
EQX 107
U 10
EQX 3161
RAPD
Microssatlites

Figura 3. Disperso grfica e anlise de agrupamento de 19 acessos de
cacaueiro (Theobroma cacao L.) provenientes das amaznias brasileira, peruana
e equatoriana com base em distncias genticas calculadas a partir de marca-
dores RAPD (A) e microssatlites (B).
Anlises de acessos duplicados ou redundantes
Em colees base de trabalho e bancos ativos de germoplasma, a
presena de acessos duplicados ou redundantes, em conjunto com
problemas de sinonmia, homonmia e erros de identicao, diculta
a transferncia de resultados e recomendaes entre diferentes pro-
gramas de melhoramento e aumenta o gasto de tempo e recursos para
a conservao e avaliao do potencial gentico dos acessos. Esses pro-
60
blemas so agravados em bancos de germoplasma de acessos manti-
dos in vivo em espaos nobres como telados antiafdeos onde o custo
de construo do espao e a manuteno do acesso so muito altos
(Figura 4) e em bancos de germoplasma de plantas perenes man-
tidas em condies de campo em reas extensas que implicam em
rduo trabalho nas atividades de manuteno e avaliao (Figura 5).
Marcadores moleculares tm sido utilizados para eliminar ou dimi-
nuir tais problemas, sendo exemplos a anlise de acessos duplicados
ou redundantes em bancos ativos e colees de trabalho de cacaueiro
(FALEIRO et al., 2002); amendoim forrageiro (FALEIRO et al., 2003a);
alface (WAYCOTT; FORT, 1994); cevada (HINTUM; VISSER, 1995);
arroz (VIRK et al., 1995); couve-or (HINTUM et al., 1996); uva
(CERVERA et al., 1998); mandioca (CHAVARRIAGA-AGUIRRE et al.,
1999); sorgo (DEAN et al., 1999); batata (MCGREGOR et al., 2002);
entre outras culturas.
Figura 4. Banco de germoplasma de acessos de maracujazeiro mantidos sob
telado antiafdeo, Embrapa Cerrados, Planaltina, DF .
61
Figura 5. Realizao de tratos culturais em banco ativo de germoplasma de
cacaueiro, Centro de Pesquisas do Cacau, Itabuna, BA .
Anlise de pureza gentica e
contaminao de germoplasma
Acessos, principalmente de espcies autgamas, normalmente
so representados em bancos de germoplasma por vrias sementes.
Anlise da pureza gentica dessas sementes pode ser feita utilizando
marcadores moleculares (TANKSLEY; JONES, 1981; TREUREN;
HINTUM 2001). O princpio dessa aplicao estimar o parentesco
gentico entre as sementes com base na similaridade gentica calcu-
lada a partir dos marcadores moleculares. possvel, por exemplo,
quanticar taxas de polinizao cruzada (FERREIRA et al., 2000) e
vericar contaminaes genticas em amostras de sementes de um
determinado acesso (STEINER et al., 1997; BORNER et al., 2000). Na
Figura 6, ilustra-se a deteco de contaminao gentica de semen-
tes do acesso CPAC 2251 de Stylosanthes macrocephala com base em
anlises de marcadores moleculares (COSTA, 2004). Essa deteco
62
baseada na diferena gentica da planta 11 em relao s demais, a
qual no seria esperada dentro do acesso.
A estabilidade gentica de uma determinada coleo de germo-
plasma tambm pode ser analisada com base em marcadores mole-
culares (ISABEL et al., 1993; WU et al., 1998; GOTO et al., 1998;
BORNER et al., 2000). A manuteno da integridade e da estabilidade
gentica dos recursos genticos um dos principais objetivos dos pro-
gramas de conservao. A perda da estabilidade gentica devido a
mudanas nas frequncias gnicas, as quais podem ocorrer devido
seleo, mutao, eroso gentica e migrao/contaminao. No
caso de colees de germoplasma, a eroso gentica e os processos de
contaminao, normalmente decorrentes dos ciclos de rejuvenesci-
mento para a recuperao da viabilidade das sementes, so as princi-
pais causas da perda da estabilidade gentica. Marcadores moleculares
podem auxiliar o acompanhamento da estabilidade gentica de aces-
sos ao longo do tempo em diferentes condies de armazenamento
ou aps perodos de regenerao (REEDY et al., 1995; WU et al., 1998;
PARZIES et al., 2000) e, dessa forma, subsidiar as melhores estrat-
gias de manuteno e manejo dos acessos no banco de germoplasma.
A perda da estabilidade gentica de um grupo de acessos em uma
determinada condio de armazenamento pode subsidiar a no-uti-
lizao ou ajustes da referida condio. A perda da estabilidade aps
um perodo de ciclos de rejuvenescimento pode subsidiar a melhoria
do processo de modo a evitar ou diminuir o problema.
63
Distncia de Ligao
PL2
Bulk
PL11
PL10
PL9
PL6
PL3
PL5
PL4
PL8
PL7
PL1
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Distncia de Ligao
PL11
PL7
PL9
PL4
PL3
PL5
PL6
Bulk
PL10
PL2
PL8
PL1
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
B
A
Figura 6. (A) Anlises de agrupamento de plantas do acessos CPAC 1043 e
(B) CPAC 2251 de Stylosanthes macrocephala, evidenciando a contaminao
de sementes do CPAC 2251 .
Fonte: Costa (2004).
64
Anlise da diversidade gentica e
frequncia gnica populacional
Os diferentes tipos de marcadores moleculares disponveis apresen-
tam a capacidade de analisar de forma ampla genomas de interesse,
sem inuncia do ambiente, e, dessa forma, gerar informaes precisas
sobre a diversidade gentica e a frequncia gnica populacional (HARTL;
CLARK, 1989; OUBORG et al., 1999). Essas informaes so extrema-
mente teis em todas as fases dos programas de conservao de recur-
sos genticos, passando pela coleta (DEL RIO et al., 1997a), conserva-
o (WU et al., 1998), manuteno (SPAGNOLETTI-ZEULI et al., 1995;
REEDY et al., 1995) e manejo (DEL RIO et al., 1997b) das colees, alm
de facilitar o uso do germoplasma em programas de melhoramento
gentico (ABDELNOOR et al., 1995; BELLON et al., 2007; BELLON
et al., 2009; KARP et al., 1997; FALEIRO et al., 2004b; 2004c; 2009).
Um exemplo da importncia dos estudos de diversidade gentica e
frequncia gnica populacional utilizando marcadores moleculares
o trabalho realizado no Centro de Pesquisas do Cacau. Desde 1993,
um trabalho de identicao e seleo de plantas resistentes vas-
soura-de-bruxa e com boas caractersticas de produtividade est sendo
realizado em plantaes comerciais da regio cacaueira baiana, com
a valiosa ajuda dos produtores (Figura 7). Diferentes critrios vm
sendo utilizados para a seleo dos acessos de cacaueiro em planta-
es comerciais, os quais visam atingir dois requisitos bsicos: pro-
dutividade e resistncia vassoura-de-bruxa (PINTO; PIRES, 1998).
Alm dessas duas caractersticas principais, o processo de seleo
busca acessos de cacaueiro com alta diversidade gentica entre si e,
tambm, geneticamente distintos das tradicionais fontes de resistn-
cia vassoura-de-bruxa, como o Scavina-6 (FALEIRO et al., 2004d).
Nesse sentido, Faleiro et al. (2004e) realizaram um estudo da diversi-
dade gentica desses acessos selecionados em relao ao Scavina-6,
identicando acessos de extrema importncia para uso em programas
de melhoramento e multiplicao para distribuio aos produtores.
Esses acessos selecionados esto contribuindo para a ampliao da
base gentica da resistncia das atuais variedades clonais recomen-
dadas para o plantio.
65
1 Scavina-6
1
2 ICS-1
2
3 SIC-19
3
4 IMC-67
4
Acessos selecionados
em plantaes comerciais
Acessos distintos
geneticamente de Scavina-6
5
8
24
29
12
15
11
10
22
21
28
25
7
16
23
9
14
17
18
19
13
34
33
30
31
26
27
32
20
6
Figura 7. Identificao e seleo de plantas (acessos) resistentes vas-
soura-de-bruxa em plantaes comerciais com a ajuda de produtores e estudo
de diversidade gentica desses acessos em relao ao Scavina-6 (principal
fonte de resistncia) e outros genitores utilizados no programa de melhora-
mento gentico do cacaueiro .
As informaes de diversidade gentica e frequncia gnica obti-
das com o uso dos marcadores moleculares geram uma grande quan-
tidade de caractersticas adicionais, que podem ser combinadas com
dados de pedigree, do local de coleta e com caractersticas morfolgi-
cas, siolgicas e agronmicas, fornecendo uma anlise mais com-
pleta da coleo e de cada acesso (LIVINI et al., 1992; ABDELNOOR
et al., 1995; VASCONCELOS et al., 1996; CARVALHO et al, 2000b;
2000c; HUANG et al., 2002; FALEIRO et al., 2004b; 2004c; 2004d;
VIEIRA et al., 2008).
Auxlio em trabalhos de classificao
botnica e filogenia
Diversos sistemas de classicao botnica e logentica de plantas
e outros organismos, baseados em diferentes critrios, tm sido uti-
lizados e aperfeioados ao longo dos anos. Inicialmente era utilizada
a sistemtica evolutiva (baseada na morfologia, paleontologia, ecolo-
gia, ontogenia), depois a taxonomia numrica ou sistemtica fen-
tica (baseada na quantidade de similaridade geral entre os organis-
mos estudados interpretada como distncia evolutiva), e atualmente
a sistemtica cladstica (baseada apenas nas caractersticas homlo-
66
gas derivadas e compartilhadas de um ancestral comum prximo).
Paralelamente ao avano dos sistemas de classicao, a utilizao
de marcadores moleculares nesses estudos foi se tornando cada vez
mais comum (ARRIEL et al., 2009).
Segundo Arriel et al. (2009), embora os mtodos morfolgicos sejam
muito teis em uma grande variedade de situaes, em muitos casos,
eles no podem ser aplicados, uma vez que no existem caractersti-
cas morfolgicas sucientes compartilhadas entre organismos gene-
ticamente mais distantes. Diante das diculdades encontradas para a
obteno da logenia pelos mtodos tradicionais, usando caracteres
morfolgicos, siolgicos, comportamentais, entre outros, passou-se
a utilizar dados moleculares para obteno das rvores logenticas,
surgindo a chamada logenia molecular, que o estudo das relaes
evolucionrias entre os organismos usando dados moleculares, como
sequncias de DNA, RNA e protenas, inseres de elementos trans-
ponveis, ou outros marcadores moleculares (ARRIEL et al., 2009).
Um exemplo da utilidade dos marcadores e anlises moleculares
para uma srie de estudos evolucionrios, logenticos e taxonmi-
cos o trabalho de Muschner (2005), estudando diferentes subgne-
ros e espcies do gnero Passiora. Importantes informaes sobre
logenia molecular, taxas evolutivas e tempo de divergncia so apre-
sentadas e discutidas. Na Figura 8, ilustra-se uma construo loge-
ntica obtida com base em marcadores moleculares.
Com relao classicao botnica, muitas vezes o uso da meto-
dologia no fcil, por causa da alta variabilidade intraespecca e o
efeito ambiental sobre o fentipo diferenciador entre espcies e varie-
dades botnicas dentro da espcie. Marcadores moleculares podem
ser utilizados para auxiliar tais trabalhos, considerando o poder
de diferenciao inter e intraespecco e a no inuncia ambien-
tal nas informaes geradas (BRONDANI, 1996; LAKSHMI et al.,
1997; OUBORG et al., 1999.; KIM et al., 1999; NICOLOSI et al., 2000;
CABRAL et al., 2000; CHANDLER et al., 2001; RAINA et al., 2001;
FALEIRO et al., 2003b; 2003c). Na Figura 9, ilustra-se a diferenciao
interespecca de trs espcies do gnero Stylosanthes e, na Figura 10,
a diferenciao de variedades botnicas de Stylosanthes guianensis veri-
cada com base em marcadores moleculares RAPD.
67
87
74
89
75
100
92
100
100
100
100
100
75
58
89
95
80
79
65 69
100
100
96
100
88
100
74
100
95
100
100
100
100
100
70
72
60
71
100
93
93
94
95
95
98
100
77
59
77
64
87
100
72
73
78
73
60
P. multiflora
P. lobii var. ayaucuchoensis
P. rufa
P. morifolia
P. penduliflora
P. tacsonioides
P. helleri
P. talamancensis
P. murucuja
P. tulae
P. misera
P. pohlii
P. organensis
P. tricuspis
P. punctata
P. ornithoura
P. capsularis
P. sanguinolenta
P. sexflora
P. coriacea
P. suberosa
P. xiikzodz
P. cupraea
P. lancetillensis
P. microstipula
P. cirrhiflora
Tetrastylis ovalis
P. racemosa
P. galbana
P. tenuifila
P. edmundoi
P. miersii
P. caerulea
P. campanulata
P. setulosa
P. villosa
P. jilekii
P. mendoncae
P. sprucei
P. reflexiflora
P. umbilicata
P. speciosa
P. vitifolia
P. actinia
P. elegans
P. sidaefolia
P. alata
P. ambigua
P. incarnata
P. cincinnata
P. edulis
P. maliformis
P. luetzelburgii
P. clathrata
P. foetida
P. palmeri
P. antioquiensis
P. mathewsii
P. tripartita
P. mixta
P. manicata
P. trisecta
P. trifoliata
P. rhamnifolia
P. haematostigma
P. ceratocarpa
P. mansoi
P. kawensis
P. amoena
P. candida
P. citrifolia
P. lindeniana
P. macrophylla
P. pittieri
P. tryphostemmatoides
Dilkea johannesii
Mitostemma brevifilis
Adenia sp.
Deidamia sp.
Turnera subulata
Paropsia sp.
Barteria sp.
Malesherbia linearifolia
10 mudanas
Figura 8. Construo logentica de espcies do gnero Passiflora, obtidas
com base em anlises moleculares de sete regies genmicas .
Fonte: Muschner (2005).
68
CP AC 1348
S. capitata
cv. Mineiro
S. guianensi s
135 acessos
S. macrocephal a
Figura 9. Diferenciao de trs espcies do gnero Stylosanthes com base na
diversidade gentica analisada com o uso de marcadores moleculares RAPD.
Fonte: Faleiro et al. (2003c).
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
1
10
12
8
17
3
29
30
31
32
35
5
18
21
23
22
25
28
33
24
26
27
2
4
6
7
13
15
16
14
9
11
19
34
20
vulgaris
canescens
pauciflora
pauciflora?
Figura 10. Diferenciao de variedades botnicas de Stylosanthes guianen-
sis com base em distncias genticas calculadas com o uso de marcadores
moleculares RAPD. Um erro de classicao fenotpica do acesso 3 como
pertencente variedade botnica pauciora foi detectado com base nos mar-
cadores moleculares.
Fonte: Faleiro et al. (2004b).
69
Os marcadores moleculares, principalmente aqueles baseados em
anlises de sequncia, tm um grande potencial como ferramenta
auxiliar em trabalhos de classicao botnica e em estudos de loge-
nia, origem gentica e evoluo; entretanto nunca iro substituir o tra-
balho essencial e de grande importncia dos botnicos e taxonomistas.
Composio e validao de colees
nucleares e de trabalho
A coleo nuclear um grupo de acessos que representa a diver-
sidade gentica de uma coleo original. De um modo geral, a cole-
o nuclear possui 10% a 15% do tamanho e representa mais de 70%
da variabilidade gentica da coleo original. Normalmente, a cole-
o original uma coleo base, ou seja, uma coleo abrangente de
acessos da espcie de interesse e de seus parentes silvestres (VALOIS
et al., 1996; 2002). Logicamente, o princpio da composio de cole-
es nucleares pode ser aplicado em diferentes tipos de colees de
germoplasma, como as colees ativas e as colees de trabalho.
A composio de colees nucleares no tem como objetivo a subs-
tituio de uma coleo base ou coleo ativa, nem mesmo de uma
coleo de trabalho muito especializada. Um dos principais objetivos
facilitar e viabilizar a caracterizao e avaliao de acessos de ban-
cos de germoplasma, o que fundamental e subsidia a utilizao pr-
tica de tais recursos genticos e sua incorporao em programas de
melhoramento. Muitas vezes, a avaliao agronmica, a qual neces-
sita da montagem de experimentos com repeties em vrios ambien-
tes, muito difcil, principalmente quando um nmero elevado de
acessos deve ser avaliado ao mesmo tempo. Estratgias para reduzir
o nmero de acessos de uma coleo base sem a perda signicativa
da variabilidade gentica, s vezes, so fundamentais para viabilizar
a montagem de tais experimentos (FALEIRO, 2007).
A estrutura da coleo nuclear e sua dimenso, alm de facilitar a
caracterizao do germoplasma, estimula o usurio a utilizar os recur-
sos genticos com maior ecincia (UPADHYAYA; ORTIZ, 2001). Na
composio da coleo nuclear, cada acesso vai representar a varia-
bilidade gentica de outros acessos que caram no mesmo grupo de
70
similaridade. Aps uma caracterizao detalhada da coleo nuclear,
caso seja vericado o potencial de um determinado acesso, tal poten-
cial pode ser extrapolado para todos os acessos do mesmo grupo de
similaridade, o que pode ser conrmado por meio de caracterizaes
detalhadas desses acessos.
Vrias colees nucleares de diferentes espcies tm sido desen-
volvidas utilizando diferentes tipos de caractersticas e estratgias de
amostragem (DIWAN et al., 1995; MARITA et al., 2000; TAI; MILLER,
2001; CHANDRA et al., 2002; LI et al., 2004). Entre as caractersti-
cas utilizadas para o estabelecimento de colees nucleares, esto
os dados de pedigree, caractersticas ecogeogrcas, morfolgicas,
siolgicas, agronmicas, bioqumicas e moleculares (LI et al., 2004).
Entre as caractersticas utilizadas, marcadores moleculares tm sido
utilizados tanto para a composio quanto para a validao de cole-
es nucleares (GEPTS, 1995; TOHME et al., 1996; SKROCH et al.,
1998; HOKANSON et al., 1998; GHISLAIN et al., 1999; GRENIER
et al., 2000; HUAMAN et al., 2000; FALEIRO et al., 2003c; LI et al.;
2004). O uso de marcadores moleculares pode aumentar considera-
velmente, na coleo nuclear, a representatividade da variabilidade
gentica da coleo original (FALEIRO, 2007).
O princpio mais utilizado na composio de colees nucleares
analisar a variabilidade gentica da coleo base, subdividir todos os
acessos em grupos de similaridade gentica e selecionar um acesso
para representar cada grupo, de modo que os acessos selecionados
representem mais de 70% da variabilidade gentica inicial. Na Figura
11, ilustra-se o princpio utilizado para reduzir uma populao base
de 136 acessos de Stylosanthes macrocephala para uma de 20 aces-
sos (FALEIRO et al., 2003c). Pode-se observar, na Figura 11, que os
acessos selecionados ocupam praticamente toda disperso grca e
dessa forma representam boa parte da variabilidade gentica da cole-
o inicial.
71
124
114
17
3
50
62 105
25
19
98
12
6
x
78
Grupo 1 ( ) 1, 9, 10, 11,
16, 32, 37, 38, 39, 40, 41,
54, 66, 67, 68, 69, 70, 71,
72, 73, 74, 97, 107, 109,
116, 123, 124, 126, 127,
128, 129, 130, 131, 134, 137
Grupo 3 ) 8, 13, 15, 21,
23, 24, 26, 27, 30, 31, 43,
44, 46, 47, 48, 49, 51, 57,
58, 59, 60, 61, 64, 65, 75,
76, 77, 79, 80, 81, 86, 87,
88, 89, 91, 94, 99, 102, 103,
104, 106, 11 3, 117, 119,
122, 132,133.
Grupo 4 ( ) 5, 22, 28, 42,
45, 55, 56, 84, 85, 90, 93,
110, 120, 125, 135 e 136.
Grupo 5 ( ) 14, 52, 96,
108, 111, 112, 115, 121.
Grupo 6 ( ) 29, 36, 92, 118.
Grupo 7 ( ) 4, 35, 82
Grupo 8 ( x ) 34, 114.
Grupo 9 ( ) 7, 17, 33, 83, 95
Grupo 10 ( ) 3, 18
*
*
Grupo 2 ( ) 20, 100, 101.
-0,25
-0,25
-0,15
-0,15
-0,05
-0,05
Dim 1
D
i
m

2
0,05
0,05
0,15
0,15
0,25
0,25
0,35
63
100
96
113
92
125
82
(
Figura 11. Disperso grca de 136 acessos de Stylosanthes macrocephala com
base em distncias genticas calculadas usando marcadores moleculares. Os
acessos em verde so aqueles selecionados para a composio de uma cole-
o para representar a variabilidade gentica da coleo inicial.
Fonte: Faleiro et al. (2003c).
Com relao validao de colees nucleares, o princpio analisar
a variabilidade gentica da coleo base e da coleo nuclear e veri-
car a porcentagem da variabilidade presente na coleo nuclear. Para
essa anlise, clculos de distncias genticas entre os acessos da cole-
o base e da coleo nuclear com base em polimorsmos do DNA,
clculos da riqueza e frequncia allica baseados em marcadores mul-
tiallicos e codominantes podem ser utilizados com sucesso (GEPTS,
1995; SKROCK et al., 1998; HUAMAN et al., 2000).
Caracterizao de germoplasma
Para que a variabilidade gentica de acessos de espcies cultivadas
e silvestres conservada nos bancos de germoplasma seja utilizada e
aproveitada de forma prtica, atividades de caracterizao so essen-
ciais. Diferentes grupos de caractersticas so utilizados na caracte-
rizao de germoplasma, destacando-se as caractersticas ecolgicas,
morfolgicas, agronmicas e moleculares (Figura 12). Essa caracteri-
72
zao de cada acesso vai subsidiar a sua utilizao prtica fornecendo
genes de interesse para programas de melhoramento gentico e tam-
bm seu uso per se.
Caractersticas
morfolgicas
Caractersticas
agronmicas e
quantitativas
Caractersticas
moleculares
Descritore s
ecolgicos
latitude
l
o
n
g
i
t
u
d
e
Figura 12. Principais grupos de caractersticas utilizadas na caracterizao
de germoplasma .
Nos ltimos anos, houve um aumento signicativo do uso de mar-
cadores moleculares na caracterizao de germoplasma. Tecnologias
modernas de anlise molecular permitem a gerao de marcado-
res moleculares diretamente no DNA. O princpio da utilizao des-
ses marcadores moleculares baseado no dogma central da biologia
molecular e na pressuposio de que diferenas genticas no DNA
signicam, na maioria das vezes, diferenas fenotpicas. Entre as van-
tagens dos marcadores, pode-se citar a obteno de um nmero prati-
camente ilimitado de polimorsmos genticos; a identicao direta
do gentipo sem inuncia do ambiente; a possibilidade de deteco
em qualquer estdio do desenvolvimento da planta ou a partir de cul-
tura de clulas ou tecidos; e a possibilidade de gerar maior quantidade
de informao gentica por loco no caso de marcadores co-dominan-
tes. Com base nas caractersticas moleculares geradas pelos polimor-
smos do DNA dos diferentes acessos ou espcies do banco de ger-
73
moplasma, vrias informaes podem ser obtidas (FALEIRO, 2007),
muitas delas discutidas e exemplicadas neste captulo.
Auxlio na seleo de genitores para
programas de melhoramento gentico
A escolha de genitores e o planejamento de cruzamentos em pro-
gramas de melhoramento gentico so etapas iniciais e fundamentais
para o sucesso do programa (BORM, 1997). Para subsidiar essas eta-
pas, essencial uma caracterizao gentica renada e completa da
coleo e de cada acesso do germoplasma, a qual obtida com base na
avaliao acurada de caractersticas morfolgicas, siolgicas e agro-
nmicas, alm dos dados de pedigree.
Dados adicionais sobre a diversidade gentica de potenciais geni-
tores obtidos com base em marcadores moleculares podem auxiliar
na escolha dos genitores e no planejamento dos cruzamentos visando
maximizao da heterose e das combinaes gnicas desejadas.
Faleiro et al. (2010) analisaram genitores atuais e potenciais do pro-
grama de melhoramento gentico da mangueira com base em marca-
dores moleculares e vericaram similaridades genticas entre alguns
dos atuais genitores. No entanto, os resultados do trabalho mostra-
ram que novos genitores poderiam ser selecionados e utilizados no
programa para ampliar sua base gentica e maximizar a heterose e as
chances de obteno de combinaes gnicas desejadas (Figura 13).
Genitores selecionados apenas com base em caractersticas agronmi-
cas podem estreitar a base gentica do programa de melhoramento,
caso no haja uma preocupao do melhorista em complementar as
informaes com dados de pedigree e diversidade gentica.
74
0,20
0,20
0,15
0,15
0,10
0,10
0,05
0,05
0,00
0,00
-0,05
-0,05
-0,10
-0,10
-0,15
-0,15
-0,20
-0,20 -0,25
Coord.1
C
o
o
r
d
.
2
11
23
5
27
26
2
24
28
12
7
16
25
10
9
1
21
20
6
22
4
15
14
13
8
18
17
19
3
Figura 13. Disperso grca de 28 variedades de manga com base nas dis-
tncias genticas entre elas calculadas com 350 marcadores RAPD. As varie-
dades analisadas so originadas do Mexico ( ); India ( ); Estados Unidos ( );
frica do Sul ( ); e Brasil ( ). As setas indicam as variedades atualmente usa-
das no programa de melhoramento gentico da manga realizado na Embrapa
Cerrados .
Fonte: Faleiro et al. (2010).
Estudos de diversidade gentica de linhagens de milho tm permi-
tido a caracterizao e o agrupamento das mesmas em grupos hete-
rticos distintos (LIVINI et al., 1992) e tais informaes tm sido
importantes na escolha de genitores para a obteno de hbridos com
elevada performance agronmica (GUIMARES; MOREIRA, 1999).
Pires et al. (2000) propuseram uma estratgia de melhoramento gen-
tico do cacaueiro, utilizando a seleo recorrente envolvendo cru-
zamentos entre acessos silvestres e domesticados, cujos dados de
diversidade gentica dos acessos estimados com base em marcadores
moleculares auxiliariam a escolha dos genitores. Dados de diversidade
gentica, principalmente de fontes de resistncia vassoura-de-bruxa,
tambm tm auxiliado na escolha de genitores para o melhoramento
75
gentico do cacaueiro visando obteno de variedades com resistn-
cia mais efetiva e duradoura, baseada na ampliao da base gentica
da resistncia (FALEIRO et al., 2001a; 2004d; 2004e).
A escolha de genitores tambm pode ser baseada no agrupamento
de potenciais genitores em grupos de similaridade. A escolha de
menor nmero de genitores para representar determinado grupo de
similaridade pode reduzir o nmero inicial de cruzamentos sem per-
das signicativas na diversidade gentica, reduzindo os custos e via-
bilizando a execuo do programa. Faleiro et al. (2004b) estudaram a
diversidade gentica de 35 potenciais genitores de Stylosanthes guia-
nensis; estabeleceram 11 grupos de similaridade gentica e seleciona-
ram um genitor de cada grupo (Figura 14). Nesse trabalho, os auto-
res estabeleceram 11 grupos de similaridade com um ponto de corte
no dendrograma a 0,35 de distncia gentica relativa. Em cada grupo
de similaridade, foi escolhido um genitor, utilizando caractersticas
agronmicas (resistncia a doenas, produo de sementes etc.) como
critrio de seleo dentro do grupo.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 ,4 1
Distncia Gentica Relativa
1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
10
12
8
17
3
29
30
31
32
35
5
18
21
23
22
25
28
33
24
26
27
2
4
6
7
13
15
16
14
9
11
19
34
20
Figura 14. Anlise de agrupamento de 35 acessos de Stylosanthes guiane-
nis com base na matriz de distncias genticas geradas por 159 marcado-
res RAPD. As setas indicam os genitores selecionados com base na diversi-
dade gentica .
Fonte: Faleiro et al., 2004b.
76
Confirmaes de hibridaes e autofecundaes
As conrmaes de hibridaes articiais em programas de melho-
ramento so importantes para garantir que as sementes hbridas
sejam utilizadas no avano das geraes. Normalmente, os melho-
ristas utilizam marcadores morfolgicos para conrmar que a planta
originada de uma hibridao articial realmente hbrida e no ori-
ginada por autofecundao. Por exemplo, a cor de or um marca-
dor morfolgico muito utilizado (Figura 15). O princpio da utilizao
desse marcador a dominncia da caracterstica cor de or prpura
sobre cor de or branca. Para utilizar tal marcador, deve-se utilizar
como genitor masculino a linhagem com or prpura e como geni-
tor feminino a linhagem com or branca. A prognie com or pr-
pura indica que foi obtida por hibridao e a prognie com or branca
indica que foi obtida por autofecundao.
plen
BB
GENITORES
PROGNIE
Bb
originada por
hibridao
originada por
autofecundao
bb bb
Figura 15. Utilizao da cor da or como marcador morfolgico para conr-
mao de hibridaes e autofecundaes.
A utilizao de marcadores morfolgicos, apesar de muito til, apre-
senta limitaes prticas para o melhorista. Alm de o nmero de
marcadores morfolgicos ser reduzido, em muitos casos, os genito-
res utilizados em cruzamentos no apresentam caractersticas mor-
folgicas contrastantes que possam ser utilizadas como gene marca-
dor. Para contornar tais limitaes, marcadores moleculares podem
ser utilizados para a conrmao de hibridaes e autofecundaes.
77
Na Figura 16, ilustra-se a utilizao de marcadores moleculares RAPD
para a conrmao de hibridao e autofecundao. Essa estratgia
foi utilizada por Junqueira et al. (2008) para a conrmao de vrios
cruzamentos interespeccos de espcies do gnero Passiflora.
P1 (Prognie obtida por
hibridao)
P2 (Prognie obtida por
autofecundao)
P1 P2
Figura 16. Uso de marcadores moleculares RAPD para conrmao de hibri-
dao e autofecundao. As setas indicam marcas moleculares teis, ou seja,
marcas presentes no genitor masculino e ausentes no genitor feminino.
A presena dessas marcas na prognie 1 (P1) indica que ela foi obtida por
hibridao e a ausncia na prognie 2 (P2) indica que foi obtida por autofe-
cundao.
O princpio da utilizao de marcadores moleculares dominan-
tes, como o RAPD, para a conrmao de hibridaes e autofecunda-
es o mesmo utilizado para marcadores morfolgicos dominan-
tes. Marcadores moleculares co-dominantes, como os microssatlites,
tambm podem ser utilizados (FALEIRO et al., 2003d). Nesse caso, os
genitores masculino e feminino devem possuir alelos diferentes, de
modo que a prognie obtida por hibridao vai possuir os dois alelos,
e a prognie obtida por autofecundao vai possuir apenas o alelo do
genitor feminino (GUIMARES et al., 2009).
78
Testes de ascendncia gentica e paternidade
Baseando-se no mesmo princpio da utilizao de marcadores mole-
culares para conrmao de hibridaes e autofecundaes, a anlise
da herana de cada marcador molecular ao longo das geraes oferece
uma poderosa ferramenta para a realizao de testes de ascendncia
gentica e paternidade. Praticamente todos os tipos de marcadores
moleculares do DNA podem ser utilizados para esses testes, no obs-
tante marcadores co-dominantes e multiallicos sejam os mais indi-
cados (FALEIRO, 2007).
A realizao de testes de paternidade e testes de ascendncia de
acessos de bancos de germoplasma importante, principalmente
para a escolha de potenciais genitores para programas de melhora-
mento gentico. Essa aplicao pode ser ilustrada pelos trabalhos de
Yamada e Lopes (1999), Faleiro et al., (2001a; 2004d; 2004e) e Yamada
et al. (2009), que analisaram a paternidade e origem gentica de sele-
es de cacaueiros resistentes vassoura-de-bruxa com o objetivo de
identicar potenciais genitores que pudessem ser utilizados em pro-
gramas de melhoramento para ampliar a base gentica da resistncia.
Testes de paternidade e de ascendncia gentica tambm tm sido
teis no programa de melhoramento gentico da manga e do mara-
cuj realizados na Embrapa Cerrados. No caso da manga, os testes
tm sido realizados para identicao de genitores masculinos de pro-
gnies de meio-irmos e para distinguir os embries zigticos daque-
les nucelares em sementes poliembrinicas (CORDEIRO et al., 2006a;
2006b). No caso do maracujazeiro, os testes tm sido realizados para
conrmar ou descartar possveis genitores masculinos em diferen-
tes cruzamentos interespeccos (JUNQUEIRA et al., 2008), o que
ilustrado na Figura 17.
79
Chave 1
Chave 8
Chave 3
Chave 9
Chave 4
Chave 11
Chave 5
Chave 14
Chave 6
Chave 15
Chave 7
Chave 16
Figura 17. Produtos de amplicao de amostras de DNA genmico dos
genitores femininos; possveis F1 (F1?); e dos genitores masculinos
conrmados e descartados nos testes de paternidade. Bandas informativas
esto destacadas .
Fonte: Junqueira et al. (2008).
Recuperao mais rpida do genitor recorrente
O mtodo dos retrocruzamentos muito utilizado para transferir
caractersticas de alta herdabilidade para gentipos elite (BORM,
1997). Nesse mtodo de melhoramento, aps cada ciclo de retrocru-
zamento, a proporo do genoma do genitor recorrente recuperada e
a do genitor doador reduzida pela metade (Figura 18). Dessa forma,
estima-se que so necessrias, aproximadamente, sete a nove geraes
para recuperar de forma satisfatria o genoma do genitor recorrente.
Baseado no conceito de gentipos grcos (YOUNG; TANKSLEY,
1989), o uso de marcadores moleculares pode acelerar a recuperao
do genoma do genitor recorrente. O objetivo dessa aplicao utilizar
marcadores moleculares distribudos ao longo de todo o genoma para
genotipar plantas obtidas por retrocruzamentos (RC) juntamente com
o genitor recorrente. Aps a genotipagem, as plantas RC que possu-
rem o gene que est sendo introduzido e constituio gentica mais
prxima do genitor recorrente so selecionadas para o prximo ciclo de
80
retrocruzamentos. Dessa forma, pode-se reduzir o nmero de geraes
necessrias para recuperar a constituio gentica do genitor recorrente.
F1
RC1
RC2
RC3
50%
75%
87,5%
93,75%
50%
>75%
>87,5%
>93,75%
Genitor recorrente Genitor doador x
Recuperao mdia do genoma recorrente (%)
sem marcadores com marcadores
Distncia gentica em relao ao genitor recorrente
* Plantas RC mais prximas do genitor recorrente
selecionadas para o prximo ciclo de retrocruzamentos
100
80
60
40
20
0
GD 3 6 13 24 14 25 35 40 42 43 44 45 48
* * * * *
GD 1 2 3 5 7 14 16 15 18 20 23 26 29 30 33 36 37 43 44
100
80
60
40
20
0
3 6 9 10 14 15 17 24 25 27 28 GD
100
80
60
40
20
0
* *
*
Figura 18. Recuperao do genoma do genitor recorrente em programa de
retrocruzamento sem e com o uso de marcadores moleculares.
O nmero de geraes que podem ser reduzidas depender do
tamanho do genoma da espcie; do nmero de marcadores mole-
culares utilizados na anlise; do nmero de plantas RC genotipadas
e selecionadas; e da proporo do genoma recorrente a ser recupe-
rada. Segundo Openshaw et al. (1994), considerando uma espcie
com genoma de 200 cM distribudos em 10 cromossomos, poss-
vel reduzir o nmero de ciclos de retrocruzamento de sete para trs
e recuperar 99% do genoma recorrente, utilizando-se 80 marcadores
para genotipar 50 plantas a cada ciclo de retrocruzamentos.
Faleiro et al. (2004f), com o uso de marcadores moleculares como
ferramenta auxiliar de seleo, aceleraram a recuperao do genoma
recorrente de feijoeiro-comum aps a introduo de genes de resistn-
cia ferrugem e antracnose, o que foi conseguido aps trs ciclos de
retrocruzamentos. Fonseca et al. (2009) utilizaram o mesmo princpio
para acelerar a recuperao do genoma recorrente de maracujazeiro.
81
Desenvolvimento de mapas genticos
Segundo Ferreira e Grattapaglia (1998), o desenvolvimento de
mapas genticos considerado uma das aplicaes de maior impacto
da tecnologia de marcadores moleculares na anlise gentica de esp-
cies, e, potencialmente, no melhoramento gentico, possibilitando a
cobertura e anlise completa de genomas, a decomposio de carac-
tersticas genticas complexas nos seus componentes Mendelianos,
a localizao de regies genmicas que controlam caractersticas de
importncia e a canalizao de toda essa informao para uso em pro-
gramas de melhoramento, principalmente pensando na seleo assis-
tida por marcadores moleculares.
At meados da dcada de 1960, o desenvolvimento de mapas
genticos de ligao era baseado em marcadores morfolgicos, em
geral fentipos de fcil identicao visual, como cor de ptalas, de
semente, de hipoctilo, morfologia oral e foliar. Esses marcadores
contriburam signicativamente para o desenvolvimento terico da
anlise de ligao gnica e para a construo das primeiras verses
de mapas genticos. Entretanto, devido ao seu nmero limitado, a
probabilidade de se encontrar associaes signicativas entre esses
marcadores e caracteres de importncia econmica era reduzida. A
revoluo nesse quadro iniciou-se com o desenvolvimento de marca-
dores isoenzimticos, os quais dobraram o nmero de marcadores
genticos disponveis. Com o advento das tcnicas modernas de bio-
logia molecular, surgiram diversos mtodos de deteco de polimor-
smo gentico diretamente no DNA, os quais tm possibilitado o
desenvolvimento de mapas genticos com elevado nvel de informa-
o e saturao para vrias espcies vegetais (CARNEIRO; VIEIRA,
2002) e animais (AMARAL et al., 2008). Na Figura 19, ilustra-se um
mapa gentico desenvolvido para o cacaueiro, o qual, a cada ano, est
sendo saturado com novas marcas moleculares e caractersticas agro-
nmicas de interesse.
Alm das vrias aplicaes prticas dos mapas genticos
(FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998; CARNEIRO; VIEIRA, 2002), o
desenvolvimento desses mapas tem possibilitado o mapeamento com-
parativo de diferentes espcies e o mapeamento gnico e seus desdo-
82
bramentos relacionados seleo assistida por marcadores molecu-
lares, o que discutido a seguir.
sactcat.202 0
sZ1.2070 4
saccctg.80 10
sacacac.78 13
saaccag.106 26
sacgcag.138 0
iaaccat.130 4
saaccat.129 10
iacgcag.133 16
mTcCIR1 24
iO03900 0
iQ01350 21
iAC01.695 0
iacacta.283 13
iaaccag.108 0
iAR04.710 13
sAE06.1710sAE06.2140
sAE06.1430
0
0
4
10
13
26
0
4
10
16
24
0
21
0
13
0
13
0
iAH05.980 0
iM09370 3
sacactc.97 5
saaccag.89 12
sAV16.610 15
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sY18.800 40
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iactcac.219 42
sAH18.1230mTcCIR19 43
iAX07.1020 45
iF091130 49
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iK18580 11
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mTcCIR29 18
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iI04.870 22
sAB11.775 23
iaagcac.248 24
iagccat.85 26
sacgcag.710 27
iAL02.1100 29
iAR17.390 30
sZ4.1355 31
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sactcat.80 35
iacacac.281 37
iagccat.105 41
sAL04.410 42
iacacta.198 43
iY18.1150 47
iJ18.540 53
sAV18.980 56
mTcCIR22 66
sactcat.106 0
sJ09520 6
sZ03.2100 10
sactctc.278 16
sactcat.216 20
saaccat.177 21
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sactcat.355iacgcat.102 30
sAI12.790 32
iacacac.145 33
sZ06.470 34
iX05.505 36
mTcCIR55 39
sacacac.113 41
mTcCIR56 43
mTcCIR46 47
iY20.800 51
sZ10.1590 57
0
8
iaagctc.65
66
F
E D
C
8b
B
8a
10 A
9
3
7
1 2
5
4
/6
Figura 19. Mapa gentico do cacaueiro .
Fonte: Faleiro et al., 2006.
83
Mapeamento comparativo
A facilidade para construir mapas genticos para diferentes espcies
utilizando marcadores moleculares tem possibilitado anlises compa-
rativas da estrutura genmica dessas espcies, quanto homologia de
genes e conservao de distncia e ordem de ligao desses genes nos
cromossomos (AHN; TANKSLEY, 1993; KELLER; FEUILLET, 2000).
Essas anlises so chamadas de mapeamento comparativo ou mape-
amento de sintenia genmica. O termo sintenia tem sido usado em
anlises genticas comparativas para se referir a segmentos cromos-
smicos ou locos gnicos de diferentes espcies localizados e conser-
vados a partir de uma mesma regio cromossmica de espcie ances-
tral comum.
Existem diferentes nveis de conservao entre genomas de dife-
rentes espcies (KELLER; FEUILLET, 2000) (Figura 20). Um pri-
meiro nvel, chamado de ortologia, a simples conservao de genes
ou locos gnicos derivados de uma espcie ancestral comum entre
diferentes espcies. Esses genes ou locos gnicos podem ser conser-
vados mantendo-se uma mesma ordem linear entre eles dentro do
segmento cromossmico. Nesse caso, esse tipo de conservao cha-
mado de colinearidade. Dentro desse segmento cromossmico con-
servado, pode haver inverses, inseres, duplicaes ou delees ao
longo do processo evolucionrio. Um ltimo nvel de conservao,
chamado de microcolinearidade, refere-se conservao da ordem
de regies codicadoras dentro do gene ou do fragmento de DNA
ortlogo. Inverses, inseres, duplicaes ou delees so frequen-
temente observadas nesse nvel.
84
Ortologi a
1 2 3
A,B, C
D, E
A
C
D
E
C
A A
B
D
E
C
D
E
B
B
1 2 3
C
C
C
1 2 3
Colineridade
Microcolinearidade
Figura 20. Diferentes nveis de conservao entre genomas. Nesta gura, so
ilustrados segmentos cromossmicos de trs espcies (1, 2 e 3), contendo
cinco genes ou locos gnicos (A, B, C, D e E) e, dentro do loco C, regies
codicadoras ().
Fonte: Adaptada de Keller e Feuillet (2000).
A anlise dos diferentes nveis de conservao da estrutura gen-
mica de diferentes espcies relacionadas, por meio do mapeamento
comparativo, apresenta importantes aplicaes cientcas. O conhe-
cimento detalhado da estrutura genmica de diferentes espcies
pode facilitar a construo de mapas de ligao de uma espcie com
o mapeamento e utilizao de genes da espcie relacionada. Como
exemplo, Pereira et al. (1994) construram um mapa gentico de liga-
o em sorgo, utilizando sondas genmicas e de cDNA j mapeadas
em milho. Esse tipo de sonda heterloga, alm de facilitar a constru-
o de mapas genticos, pode ser muito til na avaliao do grau de
conservao dos grupos de ligao de espcies relacionadas e do grau
de colinearidade entre essas espcies. Sondas heterlogas podem ser-
vir como ncoras permitindo a anlise conjunta de mapas genticos
de diferentes espcies. Essas informaes so valiosas para estudos de
evoluo (MOORE et al., 1995) e tambm para o estabelecimento de
85
modelos e mapa genticos nicos de referncia para grupos de esp-
cies relacionadas (SEWELL et al., 1999).
Mapeamento gnico
O desenvolvimento de um nmero praticamente ilimitado de mar-
cadores genticos moleculares associados evoluo dos aparatos
computacionais para clculos de co-segregao, agrupamento e dis-
tncias entre as marcas e sua associao com caractersticas de inte-
resse tem permitido o mapeamento de importantes genes em dife-
rentes espcies (CARNEIRO; VIEIRA, 2002; AMARAL et al., 2008).
Esse mapeamento tem sido feito tanto para genes associados a carac-
tersticas qualitativas quanto para genes associados a caractersticas
quantitativas.
O mapeamento de genes associados a caractersticas qualitativas
ou caractersticas cujos fentipos observados apresentam segrega-
es Mendelianas (3:1; 1:2:1; 1:1) bastante simples. Nesse caso,
a co-segregao do fentipo e os marcadores moleculares so ana-
lisados diretamente, ou seja, a caracterstica qualitativa tratada
como se fosse um outro marcador. O resultado desse tipo de mape-
amento so distncias (centiMorgan) entre os marcadores mole-
culares e o gene associado caracterstica qualitativa (FALEIRO
et al., 2003e). No caso do mapeamento de genes associados a carac-
tersticas quantitativas ou de locos de caractersticas quantitativas
(QTLs), o resultado ser uma porcentagem da variao fenotpica
da caracterstica de interesse explicada pelos marcadores molecula-
res de forma isolada e conjunta (FALEIRO et al., 2006) (Figura 21).
86
Marcador Ox1 est
a 8,9 cM do gene de
resistncia ferrugem
(fer52)
550
1
5
1
0 5 0
2
0
Mapeamento de caracterstica
quantitativa (resistncia
vassoura-de-bruxa)
Mapeamento de caracterstica
qualitativa (resistncia
ferrugem)
sAV18.950
Marcador mT cCIR35
explica 35,5% da varinci a
fenotpica da resistncia
vassoura-de-bruxa
sacacac.307
sAV14.940
sacgcat.78
.mTcCIR35
mTcCIR30
MTcCIR24
saggcat.108
sAR15.1380
Valor de LO D
Dist
eM
5.4
0.3
8.0
8.9
2.4
2.0
0.7
1.0
3.5
ant89
ant73
ant81
fer32
fer49
fer56
fer47
fer52
OX1 1-550
OF10-105052
SCARF10-1050
SCARBA8-560
3.5
5.8
Marcadores
Figura 21. Resultados das associaes de marcadores moleculares com carac-
terstica qualitativa e quantitativa em mapas genticos .
Tanto para caractersticas qualitativas quanto para quantitativas, a
acurcia das avaliaes fenotpicas fundamental para o sucesso do
mapeamento gnico. No caso do mapeamento de genes associados
a caractersticas quantitativas, a fenotipagem mais difcil exigindo
a avaliao de grande nmero de indivduos em experimentos com
repeties e, de preferncia, em diferentes ambientes. A utilizao
de populaes segregantes de espcies que permitem a propagao
vegetativa ou a utilizao de linhagens endogmicas recombinantes
obtidas pelo mtodo de descendente de uma nica semente (SSD)
tm possibilitado o aumento da acurcia das avaliaes fenotpicas,
melhorando a qualidade do mapeamento de QTLs (FALEIRO et al.,
2003f; FALEIRO et al., 2006).
Uma aplicao prtica do mapeamento gnico o acmulo de infor-
maes sobre a herana das caractersticas qualitativas e quantitativas
de interesse. No caso das caractersticas quantitativas, naturalmente
controladas por vrios genes, os marcadores moleculares permitem a
identicao e anlise de cada um dos genes signicativamente asso-
ciados caracterstica. Alm do mapeamento, possvel o estudo dos
87
efeitos gnicos e da ao dos genes de maneira isolada, interativa e
cumulativa (PEREIRA et al., 2009). Alm disso, possvel identicar
a origem dos genes favorveis, ou seja, qual genitor doador dos ale-
los favorveis associados caracterstica de interesse.
Outra aplicao e possibilidade do mapeamento gnico a gera-
o de informaes para se caminhar no cromossomo em direo
aos genes de interesse e para aterrissar no gene (TANKSLEY et al.,
1995), o que provocou uma verdadeira revoluo na capacidade de iso-
lar genes na ausncia de informao sobre sua sequncia ou seu pro-
duto (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 2009). Essa estratgia culminou
na clonagem de um grande nmero de genes do genoma humano
(COLLINS et al., 1997) e tambm de vrios genes de plantas e animais
que controlam caractersticas de interesse em diferentes espcies,
metodologia conhecida como clonagem posicional (GRATTAPAGLIA;
FERREIRA, 2009). Para realizar a clonagem posicional, necessrio
um mapeamento gnico de alta resoluo, ou seja, um mapeamento
gnico baseado em anlises de co-segregao de milhares de indiv-
duos segregantes.
Alm das aplicaes citadas acima, o mapeamento gnico com base
em marcadores moleculares abriu novas perspectivas para a seleo
assistida, ou seja, a seleo indireta de caractersticas de interesse.
Para o sucesso da seleo indireta, necessrio que a herdabilidade do
marcador e a correlao deste com a caracterstica de interesse sejam
altos. Como a herdabilidade dos marcadores moleculares igual a 1,
o sucesso da seleo indireta depende da identicao de marcado-
res moleculares altamente correlacionados com as caractersticas de
interesse, ou seja, a qualidade e resoluo do mapeamento gnico a
base para a seleo assistida por marcadores moleculares.
Seleo assistida por marcadores moleculares
A seleo assistida por marcadores moleculares (SAMM) uma
forma de seleo indireta de caractersticas de interesse com base
em marcadores moleculares. No melhoramento gentico, o principal
objetivo da seleo propiciar ganhos genticos. O ganho gentico da
seleo de uma caracterstica (GS
Y
) depende diretamente da intensi-
dade de seleo (k
Y
), do controle parental (p), da acurcia da avaliao
88
fenotpica (h
Y
) e da variabilidade gentica disponvel da caracterstica
na populao submetida seleo (g
Y
) (CRUZ; REGAZZI, 1997),
conforme a frmula abaixo.
GS
Y
= k
Y
. p . h
Y
. g
Y
Quando pensamos na seleo indireta de uma caracterstica Y com
base em uma caracterstica X [GS
Y(X)
], o GS pode ser quanticado con-
forme a frmula abaixo.
GS
Y(X)
= k
X
. p . h
X
. rg
XY
. g
Y
A relao entre o ganho gentico baseado na seleo indireta e o
ganho gentico baseado na seleo direta apresentada abaixo.
GS
Y(X)
GS
Y
p s
gY
s
gY
K
X
K
Y
.
p .
.
.
h
X
h
Y
.
.
rg
XY
.
Ao analisarmos essa relao, podemos vericar que, em algumas
situaes, a seleo indireta pode propiciar ganhos genticos maio-
res que a seleo direta. Isso vai acontecer quando a acurcia fenot-
pica da caracterstica auxiliar (h
x
) for alta, a da caracterstica principal
(h
x
) for baixa e a correlao gentica entre as caractersticas auxiliar e
principal (rg
XY
) for alta. Uma das vantagens da utilizao de marca-
dores moleculares como caracterstica auxiliar na seleo indireta
que a acurcia mxima, ou seja, igual a 1. Como mencionado no
item anterior, a correlao gentica entre o marcador molecular e a
caracterstica principal denida pelo mapeamento gentico. Com
base em trabalhos de mapeamento gentico, j foram identicados
vrios marcadores moleculares associados a locos para caractersti-
cas de herana gentica qualitativa quanto a locos para caractersti-
cas quantitativas (QTLs).
A utilizao dos marcadores moleculares na seleo de caracters-
ticas qualitativas uma realidade, embora existam, ainda, algumas
restries por parte dos melhoristas. O principal argumento que
caractersticas qualitativas no necessitam de marcadores para seleo
indireta, uma vez que, de um modo geral, as plantas com tais carac-
89
tersticas podem ser facilmente identicadas e selecionadas. Apesar
da veracidade do argumento, em algumas situaes, o uso de marca-
dores moleculares pode trazer algumas vantagens como na seleo
em estgios iniciais de desenvolvimento, na seleo de genes de resis-
tncia sem a necessidade de inoculao das plantas com o patgeno
ou praga, na seleo de caractersticas qualitativas de difcil avaliao
fenotpica e tambm na seleo simultnea de diferentes genes de
interesse (FALEIRO et al., 2003g).
A seleo em estgios iniciais de desenvolvimento possui grande
aplicabilidade em espcies perenes, com perodo juvenil longo, e em
casos onde a expresso da caracterstica s ocorre na fase nal do ciclo
da espcie, a exemplo de caractersticas de interesse para agroinds-
tria em gros de soja (MOREIRA et al., 2001). Outra importante vanta-
gem da seleo em estgios iniciais com base em marcadores molecu-
lares para as situaes em que a avaliao fenotpica da caracterstica
de interesse necessita da destruio da planta, como, por exemplo, a
avaliao da resistncia a nematoides (ALZATE-MARIN et al., 2006).
A seleo de genes de resistncia sem a necessidade de inocula-
o das plantas importante no desenvolvimento de materiais resis-
tentes a um patgeno ou praga extica, ainda no detectado em uma
regio, onde sua entrada proibida pelo servio de quarentena e con-
trole tossanitrio. Um exemplo seria o desenvolvimento de varieda-
des de cacaueiro resistentes Moniliophthora roreri no Brasil, o que
tem sido viabilizado mediante um projeto internacional envolvendo
instituies de pesquisa do Equador, Peru e Brasil e o uso de marca-
dores moleculares (www.cepec.gov.br/ biotecnologia.htm).
A seleo de caractersticas qualitativas de difcil avaliao fenot-
pica seria outra vantagem da SAMM. Essa diculdade de avaliao
fenotpica pode ser relacionada complexidade e (ou) aos elevados
custos envolvidos da fenotipagem. A avaliao da resistncia de plan-
tas a insetos, por exemplo, na maioria das vezes, exige procedimentos
demorados e laboriosos envolvendo a multiplicao do inseto, mon-
tagem de diferentes bioensaios e diferentes avaliaes. Um exemplo,
citado por Milach (2001), a seleo de plantas com resistncia a inse-
tos, conferida pelo transgene Bt. Nesse caso, a seleo pode ser feita
com a utilizao de primers especcos que possibilitam a amplica-
90
o direta do gene. Guimares et al. (2009) citam outros exemplos de
avaliaes fenotpicas complexas ou caras como de caractersticas rela-
cionadas qualidade nutricional, composio aminoacdica, caracte-
rsticas organolpticas, entre outras.
No caso da seleo simultnea de diferentes genes de resistncia, o
exemplo prtico da SAMM a piramidizao de genes que conferem
resistncia a doenas. Nesse caso, podemos pensar na piramidiza-
o de genes ou blocos gnicos que conferem resistncia a diferentes
raas de um patgeno (MILACH; CRUZ, 1997; FALEIRO et al., 2000a)
ou que conferem resistncia a diferentes patgenos (FALEIRO et al.,
2000b; 2003e; 2004f). Uma das diculdades da piramidizao de genes
a seleo das plantas que apresentam todos os genes R a serem pira-
midizados. Quando pensamos na resistncia a diferentes raas de um
patgeno, o fentipo da resistncia o mesmo quando um, dois ou
mais genes de resistncia esto presentes e, quando pensamos na
resistncia a diferentes patgenos, a diculdade so as interaes exis-
tentes entre diferentes patgenos inoculados simultaneamente. As
diculdades so ainda maiores quando pensamos na piramidizao
de genes de efeito menor junto com genes de efeito maior, visto que
estes mascaram a presena daqueles (FALEIRO et al., 2001b). Essas
diculdades so eliminadas com a utilizao da SAMM. Logicamente,
para a utilizao da SAMM, necessrio que marcadores moleculares
associados aos genes de resistncia sejam identicados. A utilizao
de marcadores moleculares anqueando o gene ou o bloco gnico
fortemente ligado a ele aumenta muito a conabilidade e a ecincia
da seleo indireta (FALEIRO et al., 2000a).
Outra vantagem da SAMM relatada por Guimares et al. (2009)
a possibilidade de maximizar os ganhos genticos com a seleo em
ambos os sexos. Essa possibilidade importante no melhoramento
gentico animal, quando as caractersticas de interesse so expres-
sas somente em um sexo, como, por exemplo, a produo de leite
em bovinos.
Quando pensamos em caractersticas quantitativas, ou seja, caracte-
rsticas controladas por vrios genes e fortemente inuenciadas pelo
ambiente, a SAMM dos QTLs mais complexa. Existem, na literatura
cientca, numerosos trabalhos de deteco e mapeamento de QTLs
91
utilizando marcadores moleculares, entretanto poucos so os exem-
plos de variedades comerciais obtidas com o auxlio de marcadores
moleculares na seleo desses QTLs. Segundo Guimares e Moreira
(1999), a baixa variabilidade gentica dos genitores utilizados nos pro-
gramas de melhoramento e a falta de interao entre as equipes envol-
vidas no mapeamento gentico e no melhoramento gentico so fato-
res que contribuem para esse fato.
Antes de pensar na SAMM, deve-se questionar a repetibilidade da
informao de ligao entre o marcador e o QTL, a interao entre o
QTL e o ambiente e a seleo simultnea de vrias caractersticas mui-
tas vezes correlacionadas. Outro questionamento a validao desses
QTLs para outras populaes e outros ambientes. Temos que consi-
derar tambm a diculdade de selecionar concomitantemente vrios
QTLs, cada um explicando uma parte da variao fenotpica da carac-
terstica de interesse (BEARZOTI, 2000). Essa ltima diculdade foi
analisada por Lande e Thompson (1990), os quais propuseram o uso
de um ndice de seleo que combina o valor fenotpico com a infor-
mao molecular, a qual o somatrio dos efeitos de cada marca-
dor-QTL na caracterstica ponderados por um fator que depende da
herdabilidade da caracterstica e da proporo da varincia gentica
aditiva explicada pelos marcadores-QTLs (Figura 22).
( jXji)
k
j =1
i= i b
Valor
fentipo
Efeito do marcador
gentico j
Marcador
gentico j
Herdabilidade
da caracterstica
Proporo da varincia gentica
aditiva explicada pelos marcadores
(R da regresso)
2c
1
h
2
1
1
1 p
Figura 22. ndice proposto por Lande e Thompson (1990) para seleo de
caractersticas de interesse, combinando informaes fenotpicas e molecu-
lares derivadas do mapeamento de QTLs.
92
Apesar de todas as diculdades, existem experincias de sucesso
na transferncia de QTLs de efeito maior para gentipos elite
(EATHINGTON et al., 1997). Outro exemplo de sucesso da SAMM
de caractersticas quantitativas a identicao e posterior transfern-
cia de alelos (QTLs) de interesse agronmico de acessos no adaptados
ou silvestres para gentipos elite. So exemplos, QTLs para aumento
do tamanho do fruto em tomate (TANKSLEY et al., 1996) e para
aumento da produtividade em arroz (XIAO et al., 1996; BRONDANI
et al., 2002). Esse uso de espcies silvestres no melhoramento gen-
tico vegetal e da SAMM de caractersticas quantitativas normalmente
feito utilizando-se o mtodo dos retrocruzamentos, o qual permite
a recuperao do genoma recorrente, mantendo-se os genes de inte-
resse provenientes da espcie silvestre (FERREIRA; RANGEL, 2005).
A integrao do mtodo dos retrocruzamentos com a SAMM de
caractersticas quantitativas tem sido referenciada na literatura como
um novo mtodo de melhoramento, chamado retrocruzamento avan-
ado de QTLs (AB-QTLs) (FERREIRA; RANGEL, 2005; FERREIRA;
FALEIRO, 2008). Nesse mtodo, um mapa gentico para caracters-
ticas quantitativas de interesse gerado e a recuperao do genoma
recorrente realizada com base na seleo de marcadores molecula-
res associados ao controle gentico da caracterstica quantitativa de
interesse. Esses marcadores podem ser provenientes tanto da espcie
silvestre quanto do acesso elite. O mtodo do AB-QTLs tem sido apli-
cado com sucesso em diferentes espcies, permitindo no somente a
compreenso da base gentica de caractersticas quantitativas de inte-
resse econmico, como tambm o desenvolvimento de linhagens para
programas de melhoramento gentico (FERREIRA; RANGEL, 2005).
A seleo indireta de caractersticas quantitativas utilizando mar-
cadores moleculares poderia ser facilitada se fosse possvel identi-
car todos os genes/alelos que controlam a caracterstica, conhecer a
localizao de cada gene e mensurar o efeito individual no fentipo
(FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998). Contudo, ao desenvolver um
estudo de mapeamento de QTLs, apenas uma frao dos genes envol-
vidos no controle da caracterstica quantitativa detectada. Os QTLs
mapeados, em geral, so de grande efeito, relativamente queles que
tambm contribuem para o fentipo. Embora seja importante detectar
e utilizar os QTLs de maior efeito para ns de seleo, inevitvel a
93
constatao de que o limite mximo de incremento de uma caracters-
tica quantitativa no poder ser atingido sem o mapeamento de todos
os locos envolvidos ( FERREIRA; FALEIRO, 2008). Outro ponto a ser
considerado que, dependendo do nmero de genes envolvidos, um
grande nmero de indivduos e um grande nmero de anlises mole-
culares em cada indivduo pode tornar a SAMM invivel do ponto de
vista prtico, considerando o custo das anlises e, principalmente, o
tempo necessrio para a realizao delas, considerando o curto tempo
entre os ciclos de seleo em programas de melhoramento gentico.
Considerando as limitaes, diculdades envolvidas e raros casos
de sucesso, a SAMM de caractersticas quantitativas baseada no
modelo atual de mapeamento e utilizao de QTLs est passando por
um momento de reexo. Para que esse mtodo de seleo seja til,
os QTLs mapeados devem explicar grande parte da variao gentica
da caracterstica quantitativa, a qual controlada por vrios genes de
pequenos efeitos. Esse fato no tem sido observado na prtica, exata-
mente em funo da natureza polignica e da alta inuncia ambien-
tal nos caracteres quantitativos (RESENDE et al., 2008). Em funo
desses aspectos e outras limitaes mencionadas anteriormente, a
implementao prtica da SAMM de caractersticas quantitativas tem
sido limitada e os ganhos em ecincia muito reduzidos (DEKKERS,
2004; RESENDE et al., 2008).
Seleo genmica ampla
Considerando as principais limitaes da SAMM de caractersti-
cas quantitativas baseadas no mapeamento e utilizao de QTLs, um
novo mtodo de seleo chamado seleo genmica ampla (SGA)
ou Genomic wide selection (GWS) foi proposto (MEUWISSEN et al.,
2001). Recentemente, com o desenvolvimento de marcadores do tipo
SNP (Single Nucleotide Polymorphism), com as novas tecnologias de
sequenciamento de alto desempenho (HT High Throughput e UHT
Ultra High Throughput) e com o aumento da capacidade de anlises
computacionais, o mtodo tornou-se mais atrativo, sendo claras as
possibilidades de utilizao prtica com importantes benefcios para
o melhoramento gentico vegetal (BERNARDO; YU, 2007) e animal
(SCHAEFFER, 2006).
94
Resende et al. (2008) apresentaram os fundamentos do mtodo da
seleo genmica ampla enfatizando suas vantagens e possibilidades
para maximizao da ecincia da seleo em programas de melhora-
mento gentico. Conforme relatado por Resende et al. (2008), a sele-
o genmica ampla pode ser denida como a seleo simultnea de
centenas ou milhares de marcadores, os quais cobrem o genoma de
uma maneira densa, de forma que todos os genes de um carter quan-
titativo estejam em desequilbrio de ligao com pelo menos uma
parte dos marcadores. Esses marcadores em desequilbrio de ligao
com os QTLs, tanto de grandes quanto de pequenos efeitos, explica-
ro quase a totalidade da variao gentica de um carter quantitativo.
A seleo genmica dita ampla porque atua em todo o genoma,
capturando todos os genes que afetam uma caracterstica quantita-
tiva. Uma grande vantagem da SGA que no h necessidade prvia
de identicar os marcadores com efeitos signicativos e de mapear
QTLs. Os marcadores moleculares tero seus efeitos genticos estima-
dos a partir de uma amostra de pelo menos 1.000 indivduos genotipa-
dos e fenotipados. Por esse motivo, a SGA fundamenta-se nos marca-
dores genticos moleculares do tipo SNP (polimorsmo de um nico
nucleotdeo). Esses marcadores so a forma mais abundante de varia-
o do DNA em genomas e so preferidos em relao a outros mar-
cadores genticos por causa da sua baixa taxa de mutao e facilidade
de genotipagem. Milhares de SNPs podem ser usados para cobrir o
genoma de um organismo com marcadores que no esto a mais de
1 cM um do outro no genoma inteiro. Tecnologias para genotipagem
de milhares de SNPs em microarranjos esto disponveis atualmente.
Com o processo de genotipagem e fenotipagem dos indivduos,
so identicados os QTNs (nucleotdeos de caractersticas quantitati-
vas), que so polimorsmos funcionais, causadores diretos da varia-
o quantitativa observada. A anlise de SNPs permite a deteco de
polimorsmos funcionais ou polimorsmos em forte desequilbrio
de ligao com os QTNs (RESENDE et al., 2008).
Segundo descrito por Goddard e Hayes (2007) e Resende et al.
(2008), para a implementao prtica da seleo genmica ampla,
trs populaes ou conjuntos de dados so necessrios:
95
a) Populao de Descoberta. Esse conjunto de dados contempla um
grande nmero de marcadores SNPs avaliados em 500 a 1.000
indivduos, os quais devem ter seus fentipos avaliados para
as vrias caractersticas de interesse. Equaes de predio de
valores genticos genmicos so obtidas para cada caracters-
tica de interesse.
b) Populao de Validao. Esse conjunto de dados menor do que
aquele da populao de descoberta e contempla indivduos ava-
liados para os marcadores SNPs e para os vrios caracteres de
interesse. As equaes de predio de valores genticos gen-
micos so testadas para vericar suas acurcias nessa amos-
tra independente.
c) Populao de Seleo. Esse conjunto de dados contempla apenas
os marcadores SNPs avaliados nos candidatos seleo. Essa
populao ser submetida seleo indireta da caracterstica
de interesse com base nos marcadores moleculares de acordo
com as equaes de predio derivadas na populao de desco-
berta. As equaes de predio vo gerar um ndice chamado
valor gentico genmico (VGG), o qual ser utilizado na predi-
o dos fentipos futuros dos candidatos seleo.
Os resultados de simulao revelam um grande potencial da SGA
em aumentar a ecincia do melhoramento. Entretanto, conforme
relatado por Resende et al. (2008), esse benefcio somente ser concre-
tizado se houver um alto grau de desequilbrio de ligao envolvendo
marcadores SNPs proximamente espaados e se os efeitos genticos
dos marcadores nas caractersticas sob melhoramento forem esti-
mados (a partir dos fentipos) com alta acurcia e usados na prpria
populao e ambientes em que forem estimados. preciso adquirir
experincia prtica com a SGA para uma real inferncia sobre sua
efetividade.
Predio de desempenho de hbridos simples
A produo e avaliao de hbridos a partir do cruzamento de linha-
gens uma estratgia muito utilizada em programas de melhora-
mento gentico de plantas algamas. Diferentes tipos de hbridos
96
podem ser obtidos, tais como: hbridos simples, simples modicado,
triplo, triplo modicado e duplo (BORM, 1997).
O hbrido simples obtido pelo cruzamento de duas linhagens.
Em geral, o hbrido simples mais produtivo que os demais e apre-
senta maior uniformidade. Com um pequeno nmero de linhagens
possvel a produo de grande quantidade de hbridos diferentes.
Por exemplo, com 100 linhagens possvel a produo de 4.950 hbri-
dos simples, 485.100 hbridos triplos e 11.763.675 hbridos duplos.
A obteno e avaliao de um nmero muito grande de hbridos em
experimentos com repeties e em diferentes locais so extremamente
difceis, considerando os custos nanceiros e a viabilidade experimen-
tal. Diante dessa diculdade, a predio de hbridos com base no com-
portamento dos genitores (linhagens ou hbridos simples) tornou-se
uma estratgia importante dentro dos programas de melhoramento
(BORM, 1997).
Existem diferentes mtodos para predio do desempenho de
hbridos (BORM, 1997). No caso de hbridos simples, a predio
baseada na habilidade da linhagem genitora em transmitir uma per-
formance desejada para a prognie hbrida. Existem dois tipos de
habilidade de combinao. A capacidade geral de combinao (CGC)
que mede o comportamento mdio da linhagem, ou seja, o desem-
penho mdio dos hbridos obtidos pelo cruzamento desta linhagem
com diversas outras. A capacidade especca de combinao (CEC)
que mede o comportamento de uma linhagem em uma combinao
especca com outra linhagem.
O desempenho dos hbridos funo da heterose expressa no
cruzamento entre os genitores utilizados. A heterose geralmente
aumentada em funo da distncia gentica entre os genitores. Com
base nesse princpio, marcadores moleculares poderiam ser utilizados
para estimar, com detalhes, a distncia gentica entre diferentes linha-
gens e tais distncias poderiam ser utilizadas na predio do desempe-
nho dos hbridos. Vrios trabalhos foram realizados para avaliar a cor-
relao entre distncias genticas entre linhagens estimadas com base
em marcadores moleculares e o desempenho dos hbridos (SMITH
et al., 1990; BERNARDO, 1992; BARBOSA et al., 2003; GUIMARES
et al., 2007). Guimares et al. (2009) analisaram os resultados de vrios
97
desses trabalhos e vericaram que essas correlaes foram positivas
e altas quando os hbridos eram obtidos pelo cruzamento de linha-
gens do mesmo grupo hetertico, entretanto eram muito baixas para
hbridos obtidos a partir de linhagens de grupos heterticos distintos.
Como os hbridos so, normalmente, obtidos a partir de cruzamentos
de linhagens pertencentes a grupos heterticos distintos, as informa-
es de distncias genticas obtidas por marcadores moleculares no
poderiam ser utilizadas na predio de hbridos simples. Bernardo
(1992) mostrou que os valores de correlao entre distncias genti-
cas e performance de hbridos dependem da ligao entre os marca-
dores e QTLs que controlam a caracterstica.
Diante das limitaes da ecincia do uso de marcadores mole-
culares para predio do desempenho de hbridos, Bernardo (1996)
props a utilizao de uma nova metodologia de predio de hbridos
baseada no uso de modelos mistos, mais especicamente do BLUP
(Best Linear Unbiased Predictor), com informaes obtidas por marca-
dores moleculares. Nessa metodologia, o desempenho dos hbridos
simples predito em funo do parentesco com outros hbridos j
fenotipados. As linhagens genitoras so genotipadas com marcadores
moleculares e os coecientes de parentesco entre elas so estimados
e utilizados na predio dos hbridos simples. Guimares et al. (2009)
explicam com detalhes a utilizao dessa metodologia. Segundo esses
autores, trabalhos de validao dessa metodologia, como o realizado
por Charcosset et al. (1998), sugerem que tal metodologia no seria
eciente para predizer o hbrido mais produtivo, entretanto seria e-
ciente para predizer o desempenho dos hbridos simples a partir de
um grupo de hbridos simples j fenotipados com elevada preciso.
Dessa forma, um conjunto menor de hbridos simples com potencial
superior seria selecionado para ser efetivamente avaliado em condi-
es de campo.
Anlise de homogeneidade gentica de sementes
Cultivares de espcies autgamas, assim como as linhagens envol-
vidas na obteno de hbridos de espcies algamas, devem possuir
elevado nvel de homogeneidade. Normalmente, sementes genticas
de uma nova cultivar so obtidas a partir de dezenas de plantas feno-
98
tipicamente idnticas oriundas de uma gerao com elevado nvel
de homozigose. Pelo fato da acurcia da avaliao fenotpica no ser
100% devido dependncia dos fatores ambientais, as plantas feno-
tipicamente idnticas, podem no ser genotipicamente idnticas, ou
seja, podem apresentar falta de homogeneidade ou de uniformidade
gentica.
Marcadores moleculares podem ser utilizados para avaliar essa
homogeneidade gentica com altssima preciso. Mesmo com todo
o rigor adotado nas etapas de seleo fenotpica, linhagens de com-
posio gentica diferente so detectadas na anlise molecular
(SCHUSTER et al., 2009). A possibilidade de identicar e eliminar
as linhagens que apresentam composio molecular diferente certa-
mente vai proporcionar maior nvel de homogeneidade das semen-
tes genticas e, por consequncia, maior nvel de homogeneidade da
cultivar a ser recomendada aos produtores.
Anlise de pureza gentica de
sementes e mistura varietal
Como comentado no item anterior, sementes de uma cultivar ou
variedade podem apresentar caractersticas fenotpicas semelhantes,
mas serem genotipicamente diferentes. A contaminao ou mistura
gentica pode ocorrer nas fases nais do programa de melhoramento,
nos campos de produo de sementes e nos processos de manuteno
de estoques de sementes genticas (SCHUSTER et al., 2009; PINHO
et al., 1996; GETHI et al., 2002).
Segundo Schuster et al. (2009), o monitoramento e rastreamento de
contaminaes genticas no sistema de produo de sementes devem
ser ecientes, de maneira a garantir elevados padres de pureza gen-
tica no material disponibilizado aos produtores de sementes certi-
cadas e, consequentemente, aos produtores de gros. Isso se torna
ainda mais importante com a abertura do sistema de certicao a
entidades privadas e produtores de sementes e tambm com o for-
talecimento do sistema de scalizao da produo e comercializa-
o de sementes no Pas, previstos na Nova Lei de Sementes (Lei n
10.711 de agosto de 2003).
99
Dentro desse contexto, o uso de marcadores moleculares assume
grande importncia. Alm da avaliao da pureza gentica, marca-
dores moleculares podem ser utilizados em processos de puricao
da cultivar ou linhagem. Nesse caso, os marcadores podem identi-
car plantas homozigotas idnticas reais representantes da cultivar ou
linhagem, de modo a utiliz-las na multiplicao das sementes.
Marcadores moleculares tambm podem ser utilizados para ava-
liao de pureza gentica de sementes hbridas. A contaminao
gentica em campos de produo de sementes hbridas pode ocor-
rer, principalmente, pela autofecundao da linhagem genitora femi-
nina. Nesse caso, vai haver uma mistura das sementes hbridas com
as sementes das linhagens autofecundadas, as quais vo gerar plantas
com baixo desempenho agronmico. Nesse caso, marcadores mole-
culares co-dominantes, como os microssatlites, so indicados para
o monitoramento da pureza gentica, pois permitem a vericao da
contribuio de ambos os pais na composio gentica das sementes
hbridas. Schuster et al. (2009) ilustram esse processo de avaliao
de pureza gentica em sementes de milho evidenciando as sementes
hbridas (com contribuio gentica de ambas linhagens genitoras)
e as sementes contaminantes (com contribuio gentica apenas da
linhagem genitora feminina).
Anlise de identidade gentica ou fingerprinting
Cada material gentico (acessos em bancos de germoplasma, linha-
gem, hbrido, matriz, variedade, cultivar, organismos geneticamente
modicados etc.) possui uma sequncia de nucleotdeos que com-
pem o seu DNA. A deteco de diferenas entre essas sequncias
atravs de polimorsmos de fragmentos de DNA revela um padro
nico, ou seja, uma impresso digital gentica (genetic fingerprinting)
que pode ser utilizada na identicao de indivduos (FERREIRA;
GRATTAPAGLIA, 1998). A impresso digital gentica obtida com
base em marcadores moleculares pode ser comparada a uma impres-
so digital utilizada nas carteiras de identidade (Figura 23), sendo to
ou mais eciente para trabalhos de identicao.
100
~
Figura 23. Analogia entre impresso digital e a impresso digital gentica
obtida com base em marcadores moleculares.
A correta identicao de um material gentico animal ou vege-
tal essencial. A transferncia de resultados e recomendaes entre
diferentes instituies de pesquisa muitas vezes dicultada em vir-
tude da identicao errada de materiais genticos. Erros de identi-
cao podem ser causados por problemas de homonmia (o mesmo
nome para diferentes acessos); de sinonmia (diferentes nomes para
o mesmo acesso); administrao e controle inadequado do material
gentico; problemas de etiquetagem, mistura de material propagativo
(sementes, mudas, garfos para enxertia, estacas, etc.) utilizado na mul-
tiplicao do material gentico; crescimento de ramos a partir de porta-
enxerto em materiais genticos mantidos no campo, entre outros.
A anlise de fingerprinting de DNA uma ferramenta poderosa para
a identicao desses erros e tem sido utilizada em vrios trabalhos
(CAETANO-ANOLLES et al., 1997; SMITH, 1998; YAMADA et al.,
2004). Praticamente todos os tipos de marcadores moleculares do DNA
podem ser utilizados para a identicao de acessos por fingerprinting,
embora diferenas relativas ao contedo de informao gentica por
loco, nmero de polimorsmos detectados, diculdade e custo da an-
lise so observadas entre os diferentes marcadores (POWELL et al.,
1996; RUSSELL et al., 1997; PEJIC, 1998; MCGREGOR et al., 2000;
FALEIRO et al., 2004e). De um modo geral, marcadores co-domi-
nantes e multiallicos so os mais indicados para esses estudos.
101
Caracterizao e proteo de cultivares
Entre as vrias aplicaes dos marcadores moleculares no
ps-melhoramento, a caracterizao molecular de variedades e cul-
tivares e sua utilizao na proteo da propriedade intelectual, ou do
direito do obtentor merecem destaque (SCHUSTER et al., 2009). O
desenvolvimento e disponibilizao de novas variedades e cultivares
das mais diversas espcies aumentam a cada ano. Para que os direi-
tos autorais dos obtentores dessas variedades e cultivares possam
ser respeitados, legislaes especcas so criadas, em diversos pa-
ses. Em 1961, ocorreu a Conveno Internacional para a Proteo
de Cultivares, que resultou na criao da Unio Internacional para
Proteo de Novas Variedades de Plantas (UPOV). Trata-se de um
acordo multilateral que determina normas comuns para o reconhe-
cimento e a proteo da propriedade intelectual dos obtentores de
novas variedades vegetais (UPOV, 2010). Esse marco regulatrio deve
ser seguido pelos pases signatrios ao estabelecerem os certicados
de Proteo de Variedades de Plantas (PVP) nas legislaes locais
(AVIANI et al., 2008).
No Brasil, a proteo de cultivares foi instituda pela Lei n 9.456,
de 25 de abril de 1997, a qual criou o Servio Nacional de Proteo de
Cultivares (SNPC). Para a proteo de uma cultivar no Brasil, alguns
requisitos so necessrios: (a) ser produto de melhoramento gentico;
(b) ser de uma espcie passvel de proteo no Brasil; (c) no ter sido
comercializada no exterior h mais de quatro anos, ou h mais de seis
anos, no caso de videiras ou rvores; (d) no ter sido comercializada
no Brasil h mais de um ano; (e) ser distinta; (f) ser homognea e (g)
ser estvel. Os trs ltimos requisitos so comprovados por meio dos
testes de distinguibilidade, homogeneidade e estabilidade (DHE).
A distinguibilidade entre as cultivares feita por meio do preenchi-
mento de um formulrio contendo os descritores mnimos recomen-
dados pelo SNCP. O SNPC, seguindo as recomendaes da UPOV,
j possui listas de descritores mnimos para um grande nmero de
espcies. Esses descritores baseiam-se principalmente em caracte-
rsticas morfolgicas de sementes, plntulas, folhas, ores e frutos
e apresentam algumas limitaes como o tempo gasto para realizar
as avaliaes e a falta de acurcia devido ao efeito ambiental e sub-
102
jetividade de alguns descritores. Alm disso, com o estreitamento da
base gentica da maioria das espcies cultivadas, as cultivares apre-
sentam muitos marcadores morfolgicos em comum, no podendo
ser distinguidos. Nessas situaes, o uso de marcadores molecula-
res pode ser requerido (SCHUSTER et al., 2009). As tcnicas mole-
culares para caracterizar cultivares, apesar de ainda no serem reco-
nhecidas como metodologia ocial, vm sendo utilizadas para se ter
informao adicional em alguns processos de descrio de cultivares
para ns de proteo.
As cultivares melhoradas tendem a ser muito parecidas. de se
esperar que, medida que maior nmero de cultivares seja caracteri-
zado, ser mais difcil discriminar, com base em caractersticas morfo-
lgicas, as novas cultivares entre as j existentes. Nesse contexto, o uso
de marcadores moleculares pode assumir grande importncia, uma
vez que podem distinguir com facilidade as cultivares, mesmo quando
elas possuem a mesma genealogia. Schuster et al. (2009) citam um
exemplo em que marcadores moleculares microssatlites permitiram
a diferenciao clara e precisa de duas cultivares de soja com 99,22%
de parentesco. Apesar da comprovada ecincia dos marcadores mole-
culares na caracterizao de cultivares, ainda no existe metodologia
padronizada aceita pelo SNPC para ser utilizada ocialmente ao pro-
cesso de caracterizao e proteo de cultivares.
Consideraes finais
Neste captulo, foram discutidas e exemplicadas as principais
aplicaes de marcadores moleculares como ferramenta auxiliar em
programas de conservao, caracterizao e uso de germoplasma e
melhoramento gentico vegetal. Considerando todas as aplicaes
discutidas em diferentes etapas, desde a coleta de germoplasma at
a caracterizao molecular de variedades melhoradas, difcil imagi-
nar uma cultura ou um programa de pesquisa ou desenvolvimento
tecnolgico envolvendo germoplasma e (ou) melhoramento gentico
que no possa ser beneciado com o uso de tal tecnologia em algu-
mas situaes.
importante mencionar que prticas de avaliao fenotpica conta-
bilizando os efeitos ambientais e das interaes gentipo x ambiente
103
continuaro sendo de grande importncia e essenciais para subsidiar
a caracterizao e utilizao prtica dos recursos genticos, bem como
para subsidiar os procedimentos de recombinao e seleo realiza-
dos em programas de melhoramento gentico. Tais avaliaes nunca
sero substitudas pelos marcadores moleculares. adequado supor
que, em vez de substituio, haver, na verdade, uma integrao cada
vez mais intensiva entre as avaliaes fenotpicas e os marcadores
moleculares. A formao de equipes multidisciplinares e trabalhos
envolvendo maior interao entre os pesquisadores ligados gentica
molecular e pesquisadores ligados ao desenvolvimento tecnolgico
vo permitir que marcadores moleculares sejam utilizados de forma
prtica para resolver problemas, aumentar ecincia, reduzir custos
e atender demandas reais das atividades cientcas e tecnolgicas.
Referncias
ABDELNOOR, R. V.; BARROS, E. G.; MOREIRA, M. A. Determination of
genetic diversity within brazilian soybean germplasm using random amplied
polymorphic DNA techniques and comparative analysis with pedigree data.
Brazilian Journal of Genetics, Ribeiro Preto, v. 18, p. 265-273, 1995.
AHN, S.; TANKSLEY, S. D. Comparative linkage maps of the rice and maize
genomes. Proceedings of the National Academic of Sciences of the United States
of America, Washington, v. 90, n. 17, p. 7980-7984, 1993.
ALZATE-MARIN, A. L.; CERVIGNI, G. D. L.; MOREIRA, M. A.; BARROS, E.
G. Seleo assistida por marcadores moleculares visando ao desenvolvimento
de plantas resistentes a doenas, com nfase em feijoeiro e soja. Fitopatologia
Brasileira, v. 30, p. 333-342, 2006.
AMARAL, M. E.; SABETE, J.; GRANT, J. R.; RIGGS, P. K.; STAFUZZA, N. B.;
FILHO, E.; GOLDAMMER, T.; WEIKARD, R.; BRUNNER, R. M.; KOCHAN, K. J.;
GRECO, A. J.; JEONG, J.; CAI, Z.; LIN, G.; PRASAD, A.; KUMAR, S.; SARADHI,
G. P.; MATHEW, B.; KUMAR, M. A.; MIZIARA, M. N.; MARIANI, P.; CAETANO,
A. R.; GALVO, S. R.; TANTIA, M. S.; VIJH, R. K.; MISHRA, B.; KUMAR, S. T. B.;
PELAI, V. A.; SANTANA, A. M.; FORNITANO, L. C.; JONES, B. C.; TONHATI, H.;
MOORE, S.; STOTHARD, P.; WOMACK, J. E. A rst generation whole genome
RH map of the river buffalo with comparison to domestic cattle. BMC Genomics,
v. 9, p. 631, 2008.
ARRIEL, N. H. C.; COSTA, M. M.; TREVISOLI, S. H. U.; DI MAURO, A. O. Outras
aplicaes dos marcadores moleculares. In: BOREM, A.; CAIXETA, E. T. (Ed.).
104
AVIANI, D. M.; SANTOS, F. S.; CARVALHO, I. M.; MACHADO, V. L. S.;
PACHECO, L. G. A. Abordagem sobre proteo e registro de cultivares.
In: FALEIRO, F. G.; FARIAS NETO, A. L.; RIBEIRO JNIOR, W. Q.
Pr-melhoramento, melhoramento e ps-melhoramento: estratgias e desaos.
AYAD, W. G.; HODGKIN, T.; JARADAT, A.; RAO, V. R. (Ed.). Molecular genetic
techniques for plant genetic resources. Rome: International Plant Genetic
Resources Institute, 1997. 137 p.
BARBOSA, A. M. M.; GERALDI, I. O.; BENCHIMOL, L. L.; GARCIA, A. A. F.;
SOUZA, C. L.; SOUZA, A. P. Relationship of intra and interpopulation tropical
maize single cross hybrid performance and genetic distances computed from
AFLP and SSR markers. Euphytica, v. 130, p. 8799, 2003.
BEARZOTI, E. Mapeamento de QTL. In: PINHEIRO, J. B.; CARNEIRO, I. F. (Ed.).
Anlise de QTL no melhoramento de plantas. Goinia: FUNAPE, 2000. p. 63-223.
BELLON, G.; FALEIRO, F. G.; JUNQUEIRA, K. P.; JUNQUEIRA, N. T. V.;
SANTOS, E. C.; BRAGA, M. F.; GUIMARES, C. T. Variabilidade gentica de
acessos silvestres e comerciais de Passiflora edulis Sims. com base em marcadores
RAPD. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 29, n. 1, p. 124-127, 2007.
BELLON, G.; FALEIRO, F. G.; PEIXOTO, J. R.; JUNQUEIRA, K. P.; JUNQUEIRA,
N. T. V.; FONSECA, K. G.; BRAGA, M. F. Variabilidade gentica de acessos
obtidos de populaes cultivadas e silvestres de maracujazeiro doce com base em
marcadores RAPD. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 31, n. 1, p. 197-202, 2009.
BERNARDO, R. Relationship between singlecross performance and molecular
marker heterozygosity. Theoretical and Applied Genetics, v. 83, p. 628634, 1992.
BERNARDO, R; YU, J. Prospects for genome wide selection for quantitative traits
in maize. Crop Science, v. 47, p. 1082-1090, 2007.
BERNARDO, R. Best linear unbiased prediction of maize single-cross
performance. Crop Science, Madison, v. 36, p. 50-56, 1996.
BORM, A. Melhoramento de Plantas. Viosa, MG: Editora UFV, 1997. 574 p.
BORNER, A.; CHEBOTAR, S.; KORZUN, V. Molecular characterization of the
genetic integrity of wheat (Triticum aestivum L.) germplasm after long-term
maintenance. Theoretical and Applied Genetics, New York, v. 100, p. 494-497, 2000.
BRASIL. Ministrio das Minas e Energia. Secretaria Geral. Projeto Radam Brasil.
Rio de Janeiro, 1981. 640 p.
BRONDANI, C.; RANGEL, P. H. N.; BRONDANI, R. P. V. FERREIRA, M. E. QTL
mapping and introgression of yield related traits from Oryza glumaepatula to
cultivated rice (O. sativa) using microsatellite markers. Theoretical and Applied
Genetics, New York, 104: 1192-1203, 2002.
105
BRONDANI, C. Variao isoenzimtica de trs espcies do gnero Manihot
(Euphorbiaceae) relacionadas morfologicamente mandioca (Manihot esculenta
Crantz). Pesquisa Agropecuria Brasileira, Braslia, v. 31, p. 287-289, 1996.
CABRAL, G. B.; CARVALHO, L. J. C. B.; SCHAAL, R. A. Relationship
analysis of closely related species to cassava (Manihot esculenta Crantz) based
on microsatellite-primed PCR. In: CARVALHO, L. J. C. B.; THRO, A. M.;
VILARINHOS, A. D. (Ed.). Cassava biotechnology IV International Scientific
Meeting CBN. Braslia, DF: Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia/CBN,
2000. p. 36-50.
CAETANO-ANOLLES, G.; CALLAHAN, L. M.; GRESSHOFF, P. M. The origin of
bermudagrass (Cynodon) off-types inferred by DNA amplication ngerprinting.
Crop Science, Madison, v. 37, p. 81-87, 1997.
CARNEIRO, M. S; VIEIRA, M. L. C. Mapas genticos em plantas. Bragantia,
Campinas, v. 61, p. 89-100, 2002.
CARVALHO, L. J. C. B.; SCHAAL, B. A.; FUKUDA, W. M. G. Phenetic
relationships and genetic diversity among geographic landraces of cassava
(Manihot esculenta Crantz) revealed by PCR-based markers. In: CARVALHO, L.
J. C. B.; THRO, A. M.; VILARINHOS, A.D. (Ed.). Cassava biotechnology IV
International Scientific Meeting CBN. Braslia, DF: Embrapa Recursos Genticos
e Biotecnologia/CBN, 2000a. p. 65-79.
CARVALHO, L. J. C. B.; SCHAAL, B. A.; FUKUDA, W. M. G. Morphological
descriptors and random amplied polymorphic DNA (RAPD) marker used to
assess the genetic diversity of cassava (Manihot esculenta Crantz). In: CARVALHO,
L. J. C. B.; THRO, A. M.; VILARINHOS, A. D. (Ed.). Cassava biotechnology IV
International Scientific Meeting CBN. Braslia, DF: Embrapa Recursos Genticos
e Biotecnologia/CBN, 2000b. p. 51-64.
CARVALHO, L. J. C. B.; SCHAAL, B. A.; FUKUDA, W. M. G. Genetic diversity of
cassava (Manihot esculenta Crantz) in a germplasm collection assessed by RAPD
assay. In: CARVALHO, L. J. C. B.; THRO, A. M.; VILARINHOS, A. D. (Ed.).
Cassava biotechnology IV International Scientific Meeting CBN. Braslia, DF:
Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia/CBN, 2000c. p. 80-92.
CERVERA, M. T.; CABEZAS, J. A.; SANCHA, J. C.; MARTINEZ, D. E.; TODA,
F.; MARTINEZ-ZAPATER, J. M. Application of AFLPs to the characterization of
grapevine Vitis vinifera L. genetic resources. A case study with accessions from
Rioja (Spain). Theoretical and Applied Genetics, New York, v. 97, p. 51-59, 1998.
CESKA, J. F.; AFFOLTER, J. M.; HAMRICK J. L. Developing a sampling strategy
for Baptisia arachnifera based on allozyme diversity. Conservation Biology, v. 11,
p. 11331139, 1997.
106
CHANDLER, G. T.; BAYER, R. J.; CRISP, M. D. A molecular phylogeny of the
endemic Australian genus Gastrolobium (Fabaceae: Mirbelieae) and allied genera
using chloroplast and nuclear markers. American Journal of Botany, Bronx, v. 88,
p. 1675-1687, 2001.
CHANDRA, S.; HUAMAN, Z.; HARI KRISHNA, S.; ORTIZ, R. Optimal sampling
strategy and core collection size of Andean tetraploid potato based on isozyme
dataa simulation study. Theoretical and Applied Genetics, New York, v. 104.
p. 13251334, 2002.
CHARCOSSET, A.; BONISSEAU, B.; TOUCHEBEUF, O.; BURSTIN, J.;
DUBREUIL, P.; BARRIRE, Y.; GALLAIS, A.; DENIS, J. B. Prediction of maize
hybrid silage performance using marker data: comparison of several models for
specic combining ability. Crop Science, Madison, v. 38, p. 38-44, 1998.
CHAVARRIAGA-AGUIRRE, P.; MAYA, M. M.; TOHME, J.; DUQUE, M. C.;
IGLESIAS, C.; BONIERBALE, M. W.; KRESOVICH, S.; KOCHERT, G. Using
microsatellites, isozymes and AFLPs to evaluate genetic diversity and redundancy
in the cassava core collection and to assess the usefulness of DNA-based markers
to maintain germplasm collections. Molecular Breeding, v. 5, p. 263273, 1999.
COLLINS, F. S.; GUYER, M. S.; CHAKRAVARTI, A. Variations on a Theme:
Cataloging Human DNA Sequence Variation. Science, v. 278, p. 1580-1581, 1997.
CORDEIRO, M. C. R.; PINTO, A. C. Q.; RAMOS, V. H. V.; FALEIRO, F. G.;
FRAGA, L. M. S. RAPD markers utilization and other parameters in the
determination of mango hybrids genitors. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 28,
n. 2, p. 164-167, 2006a.
CORDEIRO, M. C. R.; PINTO, A. C. Q.; RAMOS, V. H. V.; FALEIRO, F. G.;
FRAGA, L. M. S. Identicao da origem gentica de plntulas em sementes
poliembrinicas de mangueira (Mangifera indica L.) cv. Rosinha por meio de
marcadores RAPD. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 28, n. 3, p. 454-457, 2006b.
COSTA, A. M. Uso de marcadores RAPD e do Sistema de Informao Geogrfica
no estudo da variabilidade gentica e ecolgica de Stylosanthes macrocephala
M. B. Ferr et S. Costa. 2004. 79 f. Tese (Mestrado em Cincias Genmicas e
Biotecnologia) - Universidade Catlica de Braslia, Braslia, 2004.
COSTA, A. M.; FALEIRO, F. G.; KARIA, C. T.; SHIRATSUCHI, L. S.; ANDRADE,
R. P.; LOPES, G. K. B. Variabilidade gentica e ecolgica de Stylosanthes
macrocephala determinadas por RAPD e SIG. Pesquisa Agropecuria Brasileira,
v. 40, n. 9, p. 899-909, 2005.
CRUZ, C. D.; REGAZZI, A. J. Modelos biomtricos aplicados ao melhoramento
gentico. Viosa, MG: UFV, 1997. 390 p.
107
DEAN, R. E.; DAHLBERG, J. A.; HOPKINS, M. S.; MITCHELL, S. E.;
KRESOVICH, S. Genetic redundancy and diversity among orange accessions
in the US National Sorghum Collection as assessed with simple sequence repeat
(SSR) markers. Crop Science, Madison, v. 39, p. 1215-1221, 1999.
DEKKERS, J. C. M. Commercial application of marker and gene assisted selection
in livestock: strategies and lessons. Journal of Animal Science, v. 82, p. 313-328,
2004.
DEL RIO, A. H.; BAMBERG, J. B.; HUAMAN, Z.; SALAS, A.; VEJA, S. E.
Assessing changes in the genetic diversity of potato gene banks. 2. In situ vs ex
situ. Theoretical and Applied Genetics, New York, v. 95, p. 199-204, 1997a.
DEL RIO, A. H.; BAMBERG, J. B.; HUAMAN, Z. Assessing changes in the genetic
diversity of potato gene banks. 1. Effects of seed increase. Theoretical and Applied
Genetics, New York, v. 95, p. 191-198, 1997b.
DIWAN, N.; MCLNTOSH, M. S.; BAUCHAN, G. R. Methods of developing a core
collection of annual medicago species. Theoretical and Applied Genetics, New
York, v. 90, p. 755-761, 1995.
EATHINGTON, S. R.; DUDLEY, J. W.; RUFENER II, G. K. Usefulness of
marker-QTL association in early generation selection. Crop Science, v. 37,
p. 1686-1693, 1997.
FALEIRO, A. S. G.; FALEIRO, F. G; LOPES, U. V; MELO, G. R. P.; MONTEIRO,
W. R.; YAMADA, M. M.; BAHIA, R. C. S.; CORRA, R. X. Variability in cacao
selected by producers for resistance to witches broom based on microsatellite
markers. Crop Breeding and Applied Biotechnology, Viosa, MG, v. 4, p. 290-297,
2004e.
102 p. il.
FALEIRO, F. G. Seleo assistida por marcadores moleculares
Diferentes aplicaes. Mesa Redonda. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE
MELHORAMENTO DE PLANTAS, 2, 2003. Porto Seguro, Anais... 2003. Londrina,
Sociedade Brasileira de Melhoramento de Plantas, 2003g. 1 CD-ROM. 6 p.
FALEIRO, F. G.; ANDRADE, R. P.; KARIA, C. T.; CORDEIRO, M. C. R.; SOUZA,
T. L. P. O.; MRIDA, J. L. Similaridade gentica de acessos de Arachis pintoi com
diferentes nveis de produtividade de matria seca com base em marcadores RAPD.
In: REUNIO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE ZOOTECNIA, 40.,
2003, Santa Maria. Anais... Braslia, DF: Sociedade Brasileira de Zootecnia, 2003a.
1 CD-ROM. 5 p.
108
FALEIRO, F. G.; BARROS, A. M.; FALEIRO, A. S. G.; CORDEIRO, M. C. R.;
KARIA, C. T.; GOMES, A. C.; ANDRADE, R. P. Caracterizao molecular e
estabelecimento de coleo de trabalho de Stylosanthes macrocephala com base em
marcadores RAPD. In: In REUNIO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE
ZOOTECNIA, 40., 2003, Santa Maria. Anais... Braslia: Sociedade Brasileira de
Zootecnia, 2003c. 1 CD-ROM. 7 p.
FALEIRO, F. G.; FERNANDES, F. D.; KARIA, C. T.; BELLON, G.; RAMOS,
A. K. B.; MARTHA JNIOR, G. B.; ANDRADE, R. P.; JANK, L. Diversidade
gentica de uma coleo de trabalho de Panicum maximum com base em
marcadores moleculares. REUNIO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE
ZOOTECNIA, 41., 2004, Campo Grande. Anais... Braslia, DF: Sociedade Brasileira
de Zootecnia, 2004c. CD-ROM. 5 p.
FALEIRO, F. G.; JUNQUEIRA, N. T. V.; BRAGA, M. F. Caracterizao de
germoplasma e melhoramento gentico do maracujazeiro assistidos por
marcadores moleculares: resultados de pesquisa 2005-2008. Planaltina,
DF: Embrapa Cerrados, 2008. (Embrapa Cerrados. Boletim de Pesquisa e
Desenvolvimento, 207).
FALEIRO, F. G.; KARIA, C. T.; ANDRADE, R. P.;

BARROS, A. M.; SILVA, D. O.
C. Diversidade gentica de uma coleo de trabalho de Stylosanthes guianensis
com base em marcadores RAPD. In REUNIO ANUAL DA SOCIEDADE
BRASILEIRA DE ZOOTECNIA, 40., 2003, Santa Maria. Anais... Braslia, DF:
Sociedade Brasileira de Zootecnia, 2003b. 1 CD-ROM. 6 p.
FALEIRO, F. G.; KARIA, C. T.; ANDRADE, R. P.; RAMOS, A. K. B. Seleo de
genitores de Stylosanthes guianensis utilizando a diversidade gentica analisada com
base em caractersticas morfolgicas, agronmicas e moleculares. In: REUNIO
ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE ZOOTECNIA, 41., 2004, Campo
Grande. Anais... Braslia, Sociedade Brasileira de Zootecnia, 2004b. 1 CD-ROM. 6 p.
FALEIRO, F. G.; LOPES, U. V.; YAMADA, M. M.; MELO, G. R. P.; MONTEIRO,
W. R.; PIRES, J. L.; ROCHA, J. B.; BAHIA, R. C. S.; GOMES, L. M. C.; ARAJO, I.
S.; FALEIRO, A. S. G. Genetic diversity of cacao accessions selected for resistance
to witches broom disease based on RAPD Markers. Crop Breeding and Applied
Biotechnology, Viosa, MG, v. 4, p. 12-17, 2004d.
FALEIRO, F. G.; LOPES, U. V.; YAMADA, M. M.; PIRES, J. L.; BAHIA, R.
C. S.; SANTOS, R. S.; GOMES, L. M. C.; ARAJO, I. S.; FALEIRO, A. S.
G.; GRAMACHO, K. P.; MELO, G. R. P.; MONTEIRO, W. R.; VALLE, R. R.
Caracterizao de variedades clonais de Theobroma cacao L. com base em
marcadores RAPD, AFLP e microssatlites. Agrotrpica, Itabuna, v. 13, p. 79-86,
2001a.
109
FALEIRO, F. G.; PINTO, A. C. Q.; CORDEIRO, M. C. R.; ANDRADE, S. R.
M.; RAMOS, V. H. V.; BELLON, G.; DIAS, J. N. Genetic variability of mango
cultivars developed by Embrapa Cerrados Program using RAPD markers. Acta
Horticulturae, v. 820, p. 177-181. 2009.
FALEIRO, F. G.; PINTO, A. C. Q.; CORDEIRO, M. C. R.; RAMOS, V. H. V.;
BELLON, G.; ANDRADE, S. R. M.; PINTO, J. F. N. Genetic variability of mango
(Mangifera indica L.) cultivars used in the Embrapa Cerrados breeding program
using RAPD markers. Acta Horticulturae, 2010 (no prelo).
FALEIRO, F. G.; PIRES, J. L.; LOPES, U. V. Uso de marcadores moleculares RAPD
e microssatlites visando a conrmao da fecundao cruzada entre Theobroma
cacao e Theobroma grandiflorum. Agrotrpica, Itabuna, v. 15, p. 41-46, 2003d.
FALEIRO, F.G.; PIRES, J.L.; MONTEIRO, W.R.; LOPES, U.V.; YAMADA, M.M.;
PIEDRA, A.G.; MOURA, A.D., ARVALO-GARDINI, E.; MARQUES, J.R.B.;
GRAMACHO, K.P.; FALEIRO, A.S.G.; SANTOS, M.C.M. Variability in cacao
accessions from the Brazilian, Ecuadorian, and Peruvian Amazons based on
molecular markers. Crop Breeding and Applied Biotechnology, Viosa, MG, v. 4,
p. 227-233, 2004a.
FALEIRO, F. G.; QUEIROZ, V. T.; LOPES, U. V.; GUIMARES, C. T.; PIRES, J.
L.; YAMADA, M. M.; ARAJO, I. S.; PEREIRA, M. G.; SCHNELL, R.; SOUZA
FILHO, G. A.; FERREIRA, C. F.; BARROS, E. G.; MOREIRA, M. A. Mapping QTLs
for Witches Broom (Crinipellis perniciosa) Resistance in cacao (Theobroma cacao L.).
Euphytica, v. 149, p. 227-235, 2006.
FALEIRO, F. G.; RAGAGNIN, V. A. CORRA, R. X.;VINHADELLI, W. S.;
MOREIRA, M. A.; BARROS, E. G. Inheritance of the rust resistance of the
common bean cultivar Ouro Negro (Honduras-35) and identication of linked rapd
markers. Annual Report of the Bean Improvement Cooperative, v. 44, p. 105-106,
2001b.
FALEIRO, F. G.; RAGAGNIN, V. A. CORRA, R. X.;VINHADELLI, W. S.;
MOREIRA, M. A.; BARROS, E. G. Ligao gnica da resistncia ferrugem e
antracnose na variedade de feijo ouro negro. Revista Ceres, v. 47, p. 375-382,
2000b.
FALEIRO, F. G.; RAGAGNIN, V. A.; MOREIRA, M. A.; BARROS, E. G. Use of
molecular markers to accelerate the breeding of common bean lines resistant to
rust and anthracnose. Euphytica, v. 138, p. 213-218, 2004f.
FALEIRO, F. G.; RAGAGNIN, V. A.; SHUSTER, I.; CORRA, R. X.; GOOD-GOD,
P. I.; BROMMONSHENKEL, S. H.; MOREIRA, M. A.; BARROS, E. G.
Mapeamento de genes de resistncia do feijoeiro-comum ferrugem, antracnose
e mancha-angular com o auxlio de marcadores RAPD. Fitopatologia Brasileira,
Fortaleza, v. 28, p. 59-66, 2003e.
110
FALEIRO, F. G.; SCHUSTER, I.; RAGAGNIN, V. A.; CRUZ, C. D.; CORRA, R.
X.; MOREIRA, M. A.; BARROS, E. G. Caracterizao de linhagens endogmicas
recombinantes e mapeamento de locos de caractersticas quantitativas associadas
a ciclo e produtividade do feijoeiro-comum. Pesquisa Agropecuria Brasileira,
Braslia, v. 38, p. 1387-1397, 2003f.
FALEIRO, F. G.; VINHADELLI, W. S.; RAGAGNIN, V. A.; CORRA, R. X.;
MOREIRA, M. A.; BARROS, E. G. RAPD markers linked to a block of genes
confering rust resistance to the commom bean. Genetics and Molecular Biology,
Ribero Preto, v. 23, p. 399-402, 2000a.
FALEIRO, F. G.; YAMADA, M. M.; LOPES, U. V.; FALEIRO, A. S. G.; BAHIA,
R. C. S.; GOMES, L. M. C.; SANTOS, R. C.; SANTOS, R. F. Genetic similarity of
Theobroma cacao L. accessions maintained in duplicates in the Cacao Research
Center germplasm collection, based on RAPD markers. Crop Breeding and
Applied Biotechnology, Londrina, v. 2, p. 435-440, 2002.
FERREIRA, J. J.; ALVAREZ, E.; FUEYO, M. A.; ROCA, A.; GIRALDEZ, R.
Determination of the outcrossing rate of Phaseolus vulgaris L. using seed protein
markers. Euphytica, Wageningen, v. 113, p. 257-261, 2000.
moleculares em anlise gentica. 3. ed. Braslia, DF: EMBRAPA-CENARGEN, 1998.
220 p.
FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Gentica de associao em plantas. In:
Folha de Viosa, 2009. p. 327-370.
FERREIRA, M. E.; RANGEL, P. H. N. Emprego de espcies silvestres no
melhoramento gentico vegetal: experincia em outras espcies com anlise de
retrocruzamento avanado de QTLs (AB-QTL). In: FALEIRO, F. G.; JUNQUEIRA,
N. T. V.; BRAGA, M. F. (Ed.). Maracuj, germoplasma e melhoramento gentico.
FONSECA, K. G.; FALEIRO, F. G.; JUNQUEIRA, N. T. V.; PEIXOTO, J. R.;
BELLON, G.; JUNQUEIRA, K. P.; SANTOS, E. C. Anlise da recuperao do
genoma recorrente em maracujazeiro-azedo com base em marcadores RAPD.
Revista Brasileira de Fruticultura, v. 31, n. 1, p. 145-153, 2009.
GEPTS, P. Genetic markers and core collections. In: HODGKIN, T.; BROWN, A.
H. D.; HINTUM, TH. J. L. VAN; MORALES, E. A. V. (Ed.). Core Collections of
Plant Genetic Resources. Chichester: John Wiley & Sons, 1995. p. 127-146.
111
GETHI, J. G.; LABATE, J. A.; LAMKEY, K. R.; SMITH, M. E.; KRESOVICH, S. SSR
variation in important U. S. maize inbred lines. Crop Science, Madison, v. 42, n. 4,
p. 952-957, 2002.
GHISLAIN, M.; ZHANG, D.; FAJARDO, D.; HUAMAN, Z.; HIJMANS, R.
J. Marker-assisted sampling of the cultivated Andean potato Solanum phureja
collection using RAPD markers. Genetic Resources and Crop Evolution,
Dordrecht, v. 46, p. 547-555, 1999.
GODDARD, M. E.; HAYES, B. J. Genomic selection. Journal of Animal Breeding
and Genetics, v. 124, p. 323-330, 2007.
GOTO, S.; THAKUR, R. C.; ISHII, K. Determination of genetic stability in
long-term micropropagated shoots of Pinus thunbergii Parl. using RAPD markers.
Plant Cell Reports, New York, v.18, p. 193-197, 1998.
GRATTAPAGLIA, D.; FERREIRA, M. E. Mapeamento fsico e clonagem
posicional. In: BOREM, A.; CAIXETA, E. T. (Ed.). Marcadores moleculares. Viosa,
MG: Editora Folha de Viosa, 2009. p. 275-326.
GREENE, S. L.; HART, T. C.; AFOONIN, A. Using geographic information to
acquire wild crop germoplasm for ex situ collections: II. Post-collection analysis.
Crop Science, v. 39, p. 843-849, 1999.
GRENIER, C; DEU, M.; KRESOVICH, S.; BRAMEL-COX, P. J.; HAMON, P.
Assessment of genetic diversity in three subsets constituted from the ICRISAT
sorghum collection using random vs non-random sampling procedures B. Using
molecular markers. Theoretical and Applied Genetics, New York, v. 101, p. 197-202,
2000.
GUARINO, L.; JARVIS, A.; HIJMANS, R. J.; MAXTED, N. Geographic
information systems (GIS) and the conservation and use of plant genetic resource.
In: EGELS, J. M. M.; RAMATHA RAO, V.; BROWN, A. H. D.; JACKSON, M.
T. (Ed.). Managing plant genetic diversity. Wallingford: CABI Publishing, 2002.
p. 387-404.
GUIMARES, C. T.; MOREIRA, M. A. Gentica molecular aplicada ao
melhoramento de plantas. In: BORM, A. (Ed.). Melhoramento de espcies
cultivadas. Viosa, MG: Editora UFV, 1999. p. 715-740.
GUIMARES, C. T.; SCHUSTER, I.; MAGALHES, J. V.; SOUZA JNIOR, C. L.
Marcadores moleculares no melhoramento. In: BOREM, A.; CAIXETA, E. T. (Ed.).
GUIMARES, P. S.; PATERNIANI, M. E. A. G. Z.; LDERS, R. R.; SOUZA, A.
P.; LABORDA, P. R.; OLIVEIRA, K. M.; Correlao da heterose de hbridos de
milho com divergncia gentica entre linhagens. Pesquisa Agropecuria Brasileira,
Braslia, v. 42, n. 6, p. 811-16, 2007.
112
HARTL, D. L.; CLARK, A. G. Principles of population genetics. 2. ed. Sunderland:
Sinauer Associates, Inc. Publishers, 1989. 682 p.
HINTUM, TH. J. L. VAN; VISSER, D. L. Duplication within and between
germplasm collections. II. Duplication in four European barley collections. Genetic
Resources and Crop Evolution, Dordrecht, v. 42, p. 135-145, 1995.
HINTUM, TH. J. L. VAN; BOUKEMA, I. W.; VISSER, D. L. Reduction of
duplication in a Brassica oleracea germplasm collection. Genetic Resources and
Crop Evolution, v. 43, p. 343-349, 1996.
HOKANSON, S. C.; SZEWC-MCFADDEN, A. K.; LAMBOY, W. F.; MCFERSON,
J. R. Microsatellite (SSR) markers reveal genetic identities, genetic diversity and
relationships in a Malus x domestica borkh. core subset collection. Theoretical and
Applied Genetics, New York, v. 97, p. 671-683, 1998.
HUAMAN, Z.; ORTIZ, R.; ZHANG, D. P.; RODRIGUEZ, F. Isozyme analysis of
entire and core collections of Solanum tuberosum subsp andigena potato cultivars.
Crop Science, Madison, v. 40, p. 273-276, 2000.
HUANG, H. W.; LAYNE, D. R.; RIEMENSCHNEIDER, D. E. Genetic diversity and
geographic differentiation in pawpaw [Asimina triloba (L) Dunal] populations from
nine states as revealed by allozyme analysis. Journal of the American Society for
Horticultural Science, Mount Vernon, v. 123, p. 635-641, 1998.
HUANG, X.; BRNER, A.; RDER, M.; GANAL, M. Assessing genetic diversity of
wheat (Triticum aestivum L.) germplasm using microsatellite markers. Theoretical
and Applied Genetics, New York, v. 105, p. 699-707, 2002.
ISABEL, N.; TREMBLAY, L.; MICHAUD, M.; TREMBLAY, F. M.; BOUSQUET, J.
RAPDs as an aid to evaluate the genetic integrity of somatic embryogenesis-derived
populations of Picea mariana (Mill.) B.S.P. Theoretical and Applied Genetics, New
York, v. 86, p. 81-87, 1993.
JUNQUEIRA, K. P.; FALEIRO, F. G.; JUNQUEIRA, N. T. V.; BELLON,
G.; RAMOS, J. D.; BRAGA, M. F.; SOUZA, L. S. Conrmao de hbridos
interespeccos articiais no gnero Passiflora por meio de marcadores RAPD.
Revista Brasileira de Fruticultura, v. 30, n. 1, p. 191-196, 2008.
KARP, A.; KRESOVICH, S.; BHAT, K. V.; AYAD, W. G.; HODGKIN, T. Molecular
tools in plant genetic resources conservation: a guide to the technologies. Rome:
IPGRI. 1997. 47 p. (Technical Bulletin, 2).
KELLER, B.; FEUILLET, C. Colinearity and gene density in grass genomes. Trends
in Plant Science, London, v. 5, n. 6, p. 246-251, 2000.
KIM, S. C.; CRAWFORD, D. J.; JANSEN, R. K.; SANTOS-GUERRA, A. The use
of a non-coding region of chloroplast DNA in phylogenetic studies of the subtribe
Sonchinae (Asteraceae: Lactuceae). Plant Systematics and Evolution, New York,
v. 215, p. 8599, 1999.
113
LAKSHMI, M.; RAJALAKSHMI, S.; PARANI, M.; ANURATHA, C. S.; PARIDA,
A. Molecular phylogeny of mangroves I. Use of molecular markers in assessing the
intraspecic genetic variability in the mangrove species Acanthus ilicifolius Linn.
(Acanthaceae). Theoretical and Applied Genetics, New York, v. 94, p. 1121-1127, 1997.
LAMBOY, W. F.; MCFERSON, J. R.; WESTMAN, A. L.; KRESOVICH, S.
Application of isozyme data to the management of the United States national
Brassica oleracea L. genetic resources collection. Genetic Resources and Crop
Evolution, Dordrecht, v. 41, p. 99-108, 1994.
LAMBOY, W. F.; YU, J.; FORSLINE, P. L.; WEEDEN, N. F. Partitioning of allozyme
diversity in wild populations of Malus sieversii L. and implications for germplasm
collection. Journal of the American Society for Horticultural Science, Mount
Vernon, v. 121, p. 982-987, 1996.
LANDE, R.; THOMPSON, R. Efciency of marker-assisted selection in the
improvement of quantitative traits. Genetics, v. 124, p. 743-756, 1990.
LI, C. T.; SHI, C. H.; WU, J. G.; XU, H. M.; ZHANG, H. Z.; REN, Y. L. Methods of
developing core collections based on the predicted genotypic value of rice (Oryza
sativa L.). Theoretical and Applied Genetics, New York, v. 108, p. 11721176, 2004.
LIVINI, C.; AJMONE-MARSAN, P.; MELCHINGER, A. E.; MESSEMER, M. M.;
MOTTO, M. Genetic diversity of maize inbred lines within and among heterotic
group revealed by RFLPs. Theoretical and Applied Genetics, New York, v. 84,
p. 17-25, 1992.
MARITA, J. M.; RODRIGUEZ, J. M.; NIENHUIS, J. Development of an algorithm
identifying maximally diverse core collections. Genetic Resources and Crop
Evolution, Dordrecht, v. 47, p. 515526, 2000.
McGREGOR, C. E.; LAMBERT, C. A.; GREYLING, M. M.; LOUW, J. H.;
WARNICH, L. A comparative assessment of DNA ngerprinting techniques
(RAPD, ISSR, AFLP and SSR) in tetraploid potato (Solanum tuberosum L.)
germplasm. Euphytica, Wageningen, v. 113, p. 135-144, 2000.
McGREGOR, C. E.; TREUREN, R. Van; HOEKSTRA, R.; HINTUM, Th. J. L.
VAN. Analysis of the wild potato germplasm of the series Acaulia with AFLPs:
implications for ex situ conservation. Theoretical and Applied Genetics, New York,
v. 104, p. 146-156, 2002.
MILACH, S. C. K. Seleo assistida por marcadores moleculares em programas
de melhoramento gentico vegetal. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE
MELHORAMENTO DE PLANTAS, 1., 2001. 1 CD-ROM.
MILACH, S. C. K.; CRUZ, R. P. Piramidizao de genes de resistncia s ferrugens
em cereais. Cincia Rural, v. 27, p. 685-689, 1997.
114
MOORE, G.; DEVOS, K. M.; WANG, Z.; GALE, M. D. Cereal Genome Evolution:
Grasses, line up and from a circle. Current Biology, London, v. 5, n. 7, p. 737-749,
1995.
MOREIRA, M. A.; BARROS, E. G.; PIOVESAN, N. D.; SCHUSTER, I.; OLIVEIRA,
M. G. A.; SEDIYAMA, C. S. Programa de melhoramento gentico da qualidade
da soja para agroindstria em desenvolvimento na UFV. In: CONGRESSO
BRASILEIRO DE MELHORAMENTO DE PLANTAS, 1., 2001. 1 CD-ROM.
MUSCHNER, V. C. Filogenia molecular, taxas evolutivas, tempo de divergencia e
heranca organelar em Passiora L. (Passifloraceae). 162 f. 2005. Tese (Doutorado
em Gentica e Biologia Molecular) - Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
NEBAUER, S. G.; DEL CASTILLO-AGUDO, L.; SEGURA, J. RAPD variation
within and among natural populations of outcrossing willow-leaved foxglove
(Digitalis obscura L.). Theoretical and Applied Genetics, New York, v. 98, p. 985-994,
1999.
NICOLOSI, E.; DENG, Z. N.; GENTILE, A.; LA MALFA, S.; CONTINELLA, G.;
TRIBULATO, E. Citrus phylogeny and genetic origin of important species as
investigated by molecular markers. Theoretical and Applied Genetics, New York,
v. 100, p. 1155-1166, 2000.
OLSEN, K. M.; SCHAAL, B. A. Evidence on the origin of cassava: phylogeography
of Manihot esculenta. Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
Washington, v. 96, p. 5586-5591, 1999.
OPENSHAW, S. J.; JARBOE, S. G.; BEAVIS, W. D. Marker-assisted selection in
backcross breeding. In: ASHS/CSSA JOIN PLANT BREEDING SYMPOSIUM, 2.,
Corvallis. Proceedings... Corvallis: Oregon State University, 1994.
OUBORG, N. J.; PIQUOT, Y.; VAN GROENENDAEL, J. M. Population genetics,
molecular markers and the study of dispersal in plants. Journal of Ecology, Oxford,
v. 87, p. 551-568, 1999.
PARZIES, H. K.; SPOOR, W.; ENNOS, R. A. Genetic diversity of barley landrace
accessions (Hordeum vulgare ssp vulgare) conserved for different lengths of time in
ex situ gene banks. Heredity, Edinburgh, v. 84, p. 476-486, 2000.
PEJIC, I.; AJMONE-MARSAN, P.; MORGANTE, M.; KOZUMPLICK, V.;
CASTIGLIONI, P.; TARAMINO, G.; MOTTO, M. Comparative analysis of genetic
similarity among maize inbred lines detected by RFLPs, RAPDs, SSRs, and AFLPs.
Theoretical and Applied Genetics, New York, v. 97, p. 1248-1255, 1998.
PEREIRA, M. G.; LEE, M.; BRAMEL-COX, P.; WOODMAN, W.; DOEBLEY,
J.; WHITKUS, R. Construction of an RFLP map in sorghum and comparative
mapping in maize. Genome, v. 37, p. 236243, 1994.
115
PEREIRA, M. G.; PEREIRA, T. N. S.; COSTA, F. R. Marcadores moleculares
no pr-melhoramento. In: BOREM, A.; CAIXETA, E. T. (Ed.). Marcadores
PINTO, L. R. M.; PIRES, J. L. Seleo de plantas de cacau resistentes
vassoura-de-bruxa. Ilhus: Ceplac/Cepec, 1998. 35 p. (Boletim tcnico, 181).
PINTO, A. C. Q.; FALEIRO, F. G.; ANDRADE, S. R. M.; CORDEIRO, M. C.
R.; ANJOS, J. R. N.; JUNQUEIRA, N. T. V.; RAMOS, V. H. V.; BRAGA, M. F.;
ROSSETO, C. J.; SOUZA, V. A. B.; COSTA, J. G.; SCAVANACA JNIOR, L.;
DIAS, J. N. Melhoramento gentico da mangueira em ambiente tropical por
meio da hibridao intervarietal e com auxlio de marcadores moleculares. In:
ANDRADE, S. R. M.; FALEIRO, F. G.; SERENO, J. R. B.; CORTE, J. L. D.; SOUSA,
E. S. Resultados de Pesquisa para o Cerrado 2004-2005. Planaltina, DF: Embrapa
Cerrados, 2007. p. 27-36.
PIRES, J. L.; MARITA, J. M.; LOPES, U. V.; YAMADA, M. M.; AITKEN, W. M.;
MELO, G. P.; MONTEIRO, W. R.; AHNERT, D. Diversity for phenotypic traits
and molecular markers in CEPECs germplasm collection in Bahia, Brazil.
In: PROCEEDINGS OF THE INTERNATIONAL WORKSHOP ON NEW
TECHNOLOGIES AND COCOA BREEDING, 16-17, 2000, Kota Kinabalu, Ingenic,
2000. p. 72-88.
POWELL, W.; MORGANTE, M.; ANDRE, C.; HANAFEY, M.; VOGEL, J.; TINGEY,
S.; RAFALSKI, A. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite)
markers for germplasm analysis. Molecular Breeding, Dordrecht, v. 2, p. 225-238,
1996.
RAINA, S. N.; RANI, V.; KOJIMA, T.; OGIHARA, Y.; SINGH, K. P.;
DEVARUMATH, R. M. RAPD and ISSR ngerprints as useful genetic markers for
analysis of genetic diversity, varietal identication, and phylogenetic relationships
in peanut (Arachis hypogaea) cultivars and wild species. Genome, Ottawa, v. 44,
p. 763-772, 2001.
REEDY, M. E.; KNAPP, A. D.; LAMKEY, K. R. Isozyme allelic frequency changes
following maize (Zea mays L.) germplasm regeneration. Maydica, Bergamo, v. 40,
p. 269-273, 1995.
RESENDE, M. D. V.; LOPES, P. S.; SILVA, R. L.; PIRES, I. E. Seleo genmica
ampla (GWS) e maximizao da ecincia do melhoramento gentico. Pesquisa
Florestal Brasileira, Colombo, v. 56, p. 63-77, 2008.
RICK, C. M.; ZOBEL, R. W.; FOBES, J. F. Four peroxidase loci in red-fruited
tomato species: genetics and geographic distribution. Proceedings of the National
Academy of Sciences USA, Washington, v. 71, p. 835-839, 1974.
116
RUSSELL, J. R.; FULLER, J. D.; MACAULAY, M.; HATZ, B. G.; JAHOOR, A.;
POWELL, W.; WAUGH, R. Direct comparison of levels of genetic variation among
barley accessions detected by RFLPs, AFLPs, SSRs and RAPDs. Theoretical and
Applied Genetics, New York, v. 95, p. 714-722, 1997.
SCHAEFFER, L. R. Strategy for applying genome-wide selection in dairy cattle.
Journal of Animal Breeding and Genetics, v. 123, p. 218-223, 2006.
SCHUSTER, I.; VIEIRA, E. S. N.; PADILHA, L. Marcadores moleculares
no ps-melhoramento. In: BOREM, A.; CAIXETA, E. T. (Ed.). Marcadores
SEWELL, M. M.; SHERMAN, B. K.; NEALE, D. B. A consensus map for Loblolly
Pine (Pinus taeda L.): I. Construction and integration of individual linkage maps from
two outbred three-generation pedigrees. Genetics, Baltimore, v. 151, n. 1, p. 321-330,
1999.
SKROCH, P. W.; NIENHUIS, J.; BEEBE, S.; TOHME, J.; PEDRAZA, F.
Comparison of Mexican common bean (Phaseolus vulgaris L.) core and reserve
germplasm collections. Crop Science, Madison, v. 38, p. 488-496, 1998.
SMITH, O. S.; SMITH, J. S. C.; BOWEN, S. L.; TENBORG, R. A.; WALL, S. J.
Similarities among a group of elite maize inbreds as measured by pedigree, F
1
grain
yield, heterosis, and RFLPs. Theoretical and Applied Genetics, v. 80, p. 833840,
1990.
SMITH, S. Cultivar identication and varietal protection. In: CAETANO
ANNOLS, G.; GRESSHOFF, P.M. (Ed.). DNA markers: Protocols, applications
and overviews. New York: Wiley VCH, 1998. p. 383-400.
SPAGNOLETTI-ZEULI, P. L.; SERGIO, L.; PERRINO, P. Changes in the genetic
structure of wheat germplasm accessions during seed rejuvenation. Plant
Breeding, Berlin, v. 114, p. 193-198, 1995.
STEINER, A. M.; RUCKENBAUER, P.; GOECKE, E. Maintenance in genebanks,
a case study: contaminations observed in the Nurnberg oats of 1831. Genetic
Resources and Crop Evolution, Dordrecht, v. 44, p. 533-538, 1997.
TAI, P. Y. P.; MILLER, J. D. A core collection for Saccharum spontaneum L. from the
world collection of sugarcane. Crop Science, Madison, v. 41, p. 879-885, 2001.
TANKSLEY, S. D.; JONES, R. A. Application of alcohol dehydrogenase allozymes in
testing the genetic purity of F1 hybrids of tomato. HortScience, Alexandria, v. 16,
p. 179-181, 1981.
TANKSLEY, S. D.; GANAL, M. W.; MARTIN, G. B. Chromosome landing: a
paradigm for map-based gene cloning in plants with large genomes. Trends
Genetics. v. 11, p. 63-68, 1995.
117
TANKSLEY, S. D.; GRANDILLO, S.; FULTON, T. M.; ZAMIR, D.; ESHED, Y.;
PETIARD, V.; LOPEZ, J.; BECK-BUNN, T. Advanced backcross QTL analysis
in a cross between an elite processing line of tomato and its wild relative L.
pimpinellifolium. Theoretical and Applied Genetics, v. 92, p. 213-224, 1996.
TOHME, J.; GONZALEZ, D. O.; BEEBE, S. DUQUE, M. C. AFLP analysis of gene
pools of a wild bean core collection. Crop Science, Madison, v. 36, p. 1375-1384, 1996.
TREUREN, R. VAN; HINTUM, TH. J. L. VAN Identication of intra-accession
genetic diversity in selng crops using AFLP markers: implications for collection
management. Genetic Resources and Crop Evolution, Dordrecht, v. 48, p. 287-295,
2001.
UPADHYAYA, H. D.; ORTIZ, R. A mini core subset for capturing diversity
and promoting utilization of chickpea genetic resources in crop improvement.
Theoretical and Applied Genetics, New York, v. 102, p. 1292-1298, 2001.
UPOV. International Union for the Protection of New Varieties of Plants.
INTERNATIONAL CONVENTION FOR THE PROTECTION OF NEW VARIETIES
OF PLANTS, 1978, Geneva. Act of 1978. Disponvel em: <http://www.upov.int/en/
publications/conventions/1978/content.htm>. Acesso em: 18 dez. 2009.
VALOIS, A. C. C.; SALOMO, A. N.; ALLEM. A. C. (Ed.). Glossrio de recursos
genticos. Braslia, DF: EMBRAPA-SPI, 1996. 62 p.
VALOIS, A. C. C.; SALOMAO, A. L.; ALLEM, A. C. (Ed.). Glossrio de recursos
genticos vegetais. Braslia, DF: Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia,
2002. Disponvel em: <http://www.cenargen.embrapa.br/recgen/sibrargen/
glossario/welcome.html>. Acesso em: 15 out. 2009.
VASCONCELOS, M. J.; BARROS, E. G.; MOREIRA, M. A.; VIEIRA, C. Genetic
diversity of the common bean Phaseolus vulgaris L. determined by DNA-based
molecular markers. Brazilian Journal of Genetics, Ribeiro Preto, v. 19, p. 447-451,
1996.
VIEIRA, E. A.; FIALHO, J. F.; FALEIRO, F. G.; BELLON, G.; FONSECA, K.
G.; CARVALHO, L. J. C. B.; SILVA, M. S.; PAULA-MORAES, S. V.; SANTOS
FILHO, M. O. S.; SILVA, K. N. Divergncia gentica entre acessos aucarados
e no aucarados de mandioca. Pesquisa Agropecuria Brasileira, v. 43, n. 12,
p. 1707-1715, 2008.
VIRK, P. S.; NEWBURY, H. J.; JACKSON, M. T.; FORD-LLOYD, B. V. The
identication of duplicate accessions within a rice germplasm collection using
RAPD analysis. Theoretical and Applied Genetics, New York, v. 90, p. 1049-1055,
1995.
PINHO, E. V. R. VON; PINHO, R. G. VON; CCERO, S. M. Efeito da contaminao
gentica em campos de produo de sementes sobre o comportamento de
diferentes hbridos de milho (Zea mays L.). Revista Brasileira de Sementes,
Londrina, v. 18, n. 2, p. 256-261, 1996.
118
WAYCOTT, W.; FORT, S. B. Differentiation of nearly identical germplasm
accessions by a combination of molecular and morphologic analyses. Genome,
Ottawa, v. 37, p. 577-583, 1994.
WU, X. M.; WU, N. F.; QIAN, X. Z.; LI, R. G.; HUANG, F. H.; ZHU, L. Phenotypic
and genotypic changes in rapeseed after 18 years of storage and regeneration. Seed
Science Research, Oxon, v. 8, p. 55-64, 1998.
XIAO, J. H.; GRANDILLO, S., AHN, S. N.; MCCOUCH, S. R.; TANKSLEY, S.
D.; LI, J. M.; YUAN, L. P. Genes from wild rice improve yield. Nature, v. 384,
p. 223-224, 1996.
YAMADA, M. M.; LOPES, U. V. Paternity analysis of cacao trees selected for
resistance to witches broom disease in plantations of Bahia, Brazil. Agrotrpica,
Itabuna, v. 11, p. 83-88, 1999.
YAMADA, M. M.; GAIOTTO, F.A.; FLORES, A. B.; FALEIRO, F. G. Parent pair
analysis of cacao trees selected in farms for resistance to Moniliophthora perniciosa
using microsatellites. Agrotrpica, v. 21, n. 2, p. 123-126, 2009
YAMADA, M. M.; FALEIRO, F. G.; LOPES, U. V.; DANTAS NETO, A.; PIRES,
J. L.; FLORES, A. B.; FALEIRO, A. S. G.; BAHIA, R. C. S. Use of RAPD markers
in the germplasm collection of the Cacau Reseach Center (CEPEC) for genotype
identication. Agrotrpica, v. 16, n. 2, p. 35-38, 2004.
YOUNG, N. D.; TANKSLEY, S. D. Restriction fragment length polymorphism
maps and the concept of graphical genotypes. Theoretical and Applied Genetics,
v. 77, p. 95-101. 1989.
ZIMMERER, K. S.; DOUCHES, D. S. Geographical approaches to crop
conservation: the partitioning of genetic diversity in Andean potatoes. Economic
Botany, New York, v. 45, p. 176-189, 1991.
ZORO BI, I.; MAQUET, A.; DEGREEF, J.; WATHELET, B.; BAUDOIN, J. P.
Sample size for collecting seeds in germplasm conservation: the case of the Lima
bean (Phaseolus lunatus L.). Theoretical and Applied Genetics, New York, v. 97,
p. 187-194, 1998.
Bibliografia Complementar
conservao e uso de recursos genticos. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2007. 102 p.
1998. 220 p.
Captulo 4
121
Prospeco gnica e
bioinformtica
Ana Maria Costa
Introduo
A biotecnologia vem contribuindo signicativamente para a gera-
o de novos produtos como frmacos e alimentos. Genes isolados
de diferentes organismos hoje so transferidos para outros, confe-
rindo-lhes novas propriedades. Por exemplo, a insulina disponvel
para tratamento do diabetes e o hormnio GH utilizado no controle
de distrbios do crescimento, que antes eram extrados de sunos e
cadveres, so produzidos atualmente por microorganismos portado-
res de genes humanos construdos por engenharia gentica. Como
resultado, a sociedade pde usufruir de medicamentos de melhor qua-
lidade a preos mais acessveis e sem os riscos sade decorrentes do
processo de obteno antigo.
Hoje a indstria biotecnolgica emprega microorganismos, plantas
e animais como biofbricas de substncias de interesse. Plantas e ani-
mais geneticamente modicados esto sendo construdos para usos
especiais dos mais diversos. Como por exemplo, temos os alimen-
tos vacinas, que so alimentos que carregam informaes genticas
que promovem imunizao para diferentes doenas e bras de alta
qualidade para confeco de tecidos produzidos no leite de animais
(TRIPURANI et al., 2003; BOLDUC; LAZARIS, 2002).
Na agropecuria, a biotecnologia vem contribuindo para acelerar os
programas de melhoramento gentico. Os marcadores moleculares do
DNA, regies que cossegregam com genes de interesse, so emprega-
dos para selecionar plantas e animais que apresentem as proprieda-
des desejadas antes que elas se manifestem. Permitindo, assim, que
produtos dos cruzamentos sejam selecionados logo nas primeiras eta-
pas do desenvolvimento da planta ou do embrio de animais, econo-
mizando tempo e recursos dos programas de pesquisa.
evidente, portanto, a importncia da biotecnologia para a melho-
ria da qualidade de vida do homem. A questo : como so identi-
122
cados os genes de interesse para a construo de organismos gene-
ticamente modicados e marcadores moleculares? A seguir sero
apresentadas algumas estratgias comumente empregadas pelos pro-
ssionais da rea.
Projetos genoma
Os projetos genomas foram criados para compreender as bases do
funcionamento dos seres vivos. a partir das informaes geradas
nesses estudos que se obtm os segmentos genmicos utilizados no
desenvolvimento biotecnolgico.
Genoma estrutural
A palavra genoma foi cunhada por Hans Winkler, em 1920, como
uma conjugao de gene e cromossomo. No entanto, o conceito geral
de genoma pode ser atribudo ao sculo IV antes da era crist, quando
Aristteles apontou os primeiros conceitos em relao hereditarie-
dade. Embora os trabalhos de Mendel no nal do sculo XIV tenham
trazido grandes contribuies no campo da hereditariedade, essa
rea mostrava-se ainda bastante abstrata. Com o avano dos mtodos
cientcos e das tecnologias, a hereditariedade passou a ser associada
s estruturas presentes no ncleo das clulas chamadas cromosso-
mos (nal do sculo XIX e incio do sculo XX) e nalmente com os
polmeros de nucleotdeos dupla-ta chamados de DNA (meados do
sculo XX) que formam os cromossomos (COSTA; MARTINS, 2010).
No DNA, encontram-se codicados segmentos associados expres-
so de cadeias polipeptdicas e regies estruturais diversas, impor-
tantes na manuteno da estrutura do cromossomo e diviso celu-
lar. Denomina-se de genoma estrutural ao conjunto das informaes
contidas nos cromossomos e de projeto genoma estrutural ao pro-
grama de pesquisa que vem determinando a ordem das bases nitro-
genadas dos polmeros de DNA dos genomas de diversos organismos
(Figura 1). Os resultados do sequenciamento dos segmentos clona-
dos so depositados nos bancos de dados internacionais, sendo o mais
comum e mais importante na atualidade o do NCBI (NCBI, 2009
123
Captulo 4 Prospeco gnica e bioinformtica
ACTTGGAAGTAAAGCTCTCCTCAGCAAATGTAAAAGAACACAAATTATAACAAACTATC
CTCAGACCACAGTGCAATCAAACTAGAACTCAGGATTAAGAATCTCACTCAAAACCGCT
AACTACATGGAAACTGAACAACCTGCTCCTGAATGACTACTGGGTACATAACGAAATGA
GGCAGAAATAAAGATGTTCTTTGAAACCAATGAGAACAAAGACACAACATACCAGAATC
CTGGGACGCATT CAAAGCAGTGTGTAGAGAGAAATTTATAGCACTAAATGCCCACAAG
AAAGCAGGAAAGATCCAAAATTGACACCCTAACATCACAATTAAAAGAACTAGAAAAGC
AGACCAAACACATTCAAAAGCTAGCAGAAGGCAAGAAATAACTAAAATCAGAGCAGAA
GAAGGAAATAGAGACACAAAAAACCCTTCAAAAAATTAATGAATCCAGGAGCTGGTTTT
TGAAAGGATCAACAAAATTGATAG ACCGCTAGTAAGACTAATAAAGAAAAAAAGAGA
GAATCAAATAGACACAATAAAAAATGATAAAGGGGATATCACCACCGATCCAACAGAAA
ACAAACTACCATCAGAGAATACTACAAACACCTCTACGCAAATAAACTAGAAAATCTAG
AGAAATGGATAAATTCCTCAACACATACACTCTCCCAAGACTAAACCAGGAAGAAGTTG
ATCTCTGAATAGACCAATAACAGGAGCTGAAATTGTGGCAATAATCAATAGCTTACCAA
CAAAAAGAGTCCAGGACCAGATGGATTCACAGCCGAATTCTACCAGAGGTACAAGGAG
ACTGGTACCATTCCTTCTGAAACTATTCCAATCAATAGAAAAAGAGGGAATCCTCCCTAA
CTCATTTTATGAGTCCAGCATCATTCTGATACCAAAGCCTGGCAGAGACACAACCAAAA
Banco de dados
Genoma estrutural
Banco de DNA
Extrao do DNA
Clonagem vetor
Sequenciamento
Figura 1. Sequncia de eventos para obteno das informaes genticas que
alimentam o banco de dados do genoma estrutural a partir de um banco de DNA.
Genoma funcional
Todas as clulas de um mesmo indivduo, salvo algumas excees,
possuem o mesmo genoma estrutural, ou seja, apresentam todas as
informaes genticas necessrias para gerar um organismo inteiro.
Contudo, cada clula, ao se especializar, passa a expressar somente
uma parte dessas informaes. Nos estudos de genmica funcional,
obtm-se as informaes do que est sendo expresso nas clulas e teci-
dos (RNAs e protenas) do organismo. Como se trata de uma anlise
fenotpica, as informaes expressas podem se modicar em funo
das variaes ambientais, tais como temperatura, umidade, nutrio,
estgio de desenvolvimento e idade do organismo.
A genmica funcional, portanto, compreende a anlise das sequ-
ncias de RNAs mensageiros e do padro proteico codicado pelo
genoma estrutural numa determinada condio ambiental. So cha-
mados de transcriptomas os bancos de genticos construdos com
os RNAs de um determinado tipo celular (Figura 2). O estudo pro-
temico determina o padro de protenas/peptdeos peculiar cada
tipo celular (Figura 3). E o estudo metabolmico avalia e organiza em
mapas metablicos os compostos qumicos resultantes da expresso
gnica (Figura 4).
124
ACTTGGAAGTAAAGCTCTCCTCAGCAAATGTAAAAGAACACAAATTATAACAAACTATCT
CTCAGACCACAGTGCAATCAAACTAGAACTCAGGATTAAGAATCTCACTCAAAACCGCTC
AACTACATGGAAACTGAACAACCTGCTCCTGAATGACTACTGGGTACATAACGAAATGAA
GGCAGAAATAAAGATGTTCTTTGAAACCAATGAGAACAAAGACACAACATACCAGAATCT
CTGGGACGCATTCAAAGCAGTGTGTAGAGAGAAATTTATAGCACTAAATGCCCACAAGAG
AAAGCAGGAAAGATCCAAAATTGACACCCTAACATCACAATTAAAAGAACTAGAAAAGCA
AGACCAAACACATTCAAAAGCTAGCAGAAGGCAAGAAATAACTAAAATCAGAGCAGAACT
GAAGGAAATAGAGACACAAAAAACCCTTCAAAAAATTAATGAATCCAGGAGCTGGTTTTT
TGAAAGGATCAACAAAATTGATAGACCGCTAGTAAGACTAATAAAGAAAAAAAGAGAGAA
GAATCAAATAGACACAATAAAAAATGATAAAGGGGATATCACCACCGATCCAACAGAAAT
ACAAACTACCATCAGAGAATACTACAAACACCTCTACGCAAATAAACTAGAAAATCTAGA
AGAAATGGATAAATTCCTCAACACATACACTCTCCCAAGACTAAACCAGGAAGAAGTTGA
ATCTCTGAATAGACCAATAACAGGAGCTGAAATTGTGGCAATAATCAATAGCTTACCAAC
CAAAAAGAGTCCAGGACCAGATGGATTCACAGCCGAATTCTACCAGAGGTACAAGGAGGA
ACTGGTACCATTCCTTCTGAAACTATTCCAATCAATAGAAAAAGAGGGAATCCTCCCTAA
CTCATTTTATGAGTCCAGCATCATTCTGATACCAAAGCCTGGCAGAGACACAACCAAAAA
Genoma funcional
Isolamento do RNA mensageiro
Banco cDNA
Construo Banco de cDNA
Sequenciamento
Banco de dados
Figura 2. Sequncia de eventos para obteno das informaes genticas
expressas na forma de RNA mensageiro (transcriptoma) para compor o
banco de dados do genoma funcional de transcritos.
MSASFSPHTITLIKSTVPLLAEHGTTIIEAMYHQLFEDPQIEALFNQ
ANQKNGTQIHALAGAILAYARNIDNPGVLASAIERISQKHVGYAIHP
EHYPHVATALLGAIKQVLGDVATSEVLQAWGEAYWFIANLLKDRE
AVIREGIMTKNGGWIHWRRFVISKRIPESETITSFMLHPDDGGPVV
PHQAGQYLTFRFDAAGMPGMKRNYSISCGPNSDHYRITVKREHG
TGASAFLHDQAKVGTIIECTPPVGDFFLPSVIERPIVLLSGGVGLTP
MVSMMEQIAEAYPDAQVWYVHGTQNRETHAMDAHIRALVSRHK
HMKATTFYTQRSEADDAEAGFITIDWLRANTPFQKADFYLCGPRP
FLRTFVRDLIGAGVPAAQVHYEFFGPMDEEMAA
Banco de dados
Purificao e
sequenciamento
de peptdeos
Proteoma

Separao em gel bidimensional
Isolamento
Sequenciamento do peptideo
Extrao de peptdeos
Figura 3. Sequncia de eventos para obteno das informaes genticas
expressas na forma de RNA mensageiro (transcriptoma) para compor o
banco de dados do genoma funcional de transcritos.
125
Zetacaroteno
cido Abscsico
Lutena
Beta-caroteno Violaxantina
Figura 4. Exemplo de mapa metablico disponvel nos bancos de dados.
Os resultados depositados nos bancos de dados no caso de DNAs
e ou cDNAs (DNA sintetizado a partir da ta de RNA mensageiro)
em geral so sequncia de letras que representam a ordem das bases
nitrogenadas orientadas da extremidade 5fosfato para a extremidade
3 OH. No caso das protenas, as sequncias de letras representam a
ordem dos aminocidos da cadeia polipeptdica da extremidade amino
para a carboxiterminal (Figura 5). A grande questo como decifrar o
signicado biolgico das frases fornecidas pelas centenas de milhares
de sequncias obtidas dos diferentes materiais genticos, para que se
possa utilizar a informao gerada nos sequenciamentos.
126
MSASFSPHTITLIKSTVPLLAEHGTTIIEAMYHQLFEDPQIEALFNQ
ANQKNGTQIHALAGAILAYARNIDNPGVLASAIERISQKHVGYAIHP
EHYPHVATALLGAIKQVLGDVATSEVLQAWGEAYWFIANLLKDRE
AVIREGIMTKNGGWIHWRRFVISKRIPESETITSFMLHPDDGGPVV
PHQAGQYLTFRFDAAGMPGMKRNYSISCGPNSDHYRITVKREHG
TGASAFLHDQAKVGTIIECTPPVGDFFLPSVIERPIVLLSGGVGLTP
MVSMMEQIAEAYPDAQVWYVHGTQNRETHAMDAHIRALVSRHK
HMKATTFYTQRSEADDAEAGFITIDWLRANTPFQKADFYLCGPRP
FLRTFVRDLIGAGVPAAQVHYEFFGPMDEEMAAJFKDSLASLDKF
ACTTGGAAGTAAAGCTCTCCTCAGCAAATGTAAAAGAACACAAATTATAACAAACTATCT
CTCAGACCACAGTGCAATCAAACTAGAACTCAGGATTAAGAATCTCACTCAAAACCGCTC
AACTACATGGAAACTGAACAACCTGCTCCTGAATGACTACTGGGTACATAACGAAATGAA
GGCAGAAATAAAGATGTTCTTTGAAACCAATGAGAACAAAGACACAACATACCAGAATCT
CTGGGACGCATTCAAAGCAGTGTGTAGAGAGAAATTTATAGCACTAAATGCCCACAAGAG
AAAGCAGGAAAGATCCAAAATTGACACCCTAACATCACAATTAAAAGAACTAGAAAAGCA
AGACCAAACACATTCAAAAGCTAGCAGAAGGCAAGAAATAACTAAAATCAGAGCAGAACT
GAAGGAAATAGAGACACAAAAAACCCTTCAAAAAATTAATGAATCCAGGAGCTGGTTTTT
TGAAAGGATCAACAAAATTGATAGACCGCTAGTAAGACTAATAAAGAAAAAAAGAGAGAA
GAATCAAATAGACACAATAAAAAATGATAAAGGGGATATCACCACCGATCCAACAGAAAT
ACAAACTACCATCAGAGAATACTACAAACACCTCTACGCAAATAAACTAGAAAATCTAGA
AGAAATGGATAAATTCCTCAACACATACACTCTCCCAAGACTAAACCAGGAAGAAGTTGA
DNA e cDNA
Banco com sequncias de peptdeosdeos
Figura 5. Exemplo de resultados gerados a partir do sequenciamento de
DNAs e peptdeos.
Ferramentas de bioinformtica
As ferramentas de bioinformtica so programas de computador
que auxiliam na interpretao dos resultados gerados pelos diferen-
tes sequenciamentos. Permitem identicar um possvel papel biol-
gico para os segmentos de DNAs e protenas, por meio de compara-
es com sequncias e estruturas depositadas em bancos de dados e
desenvolver marcadores moleculares especcos e iniciadores de repli-
cao (primers) para identicao e ou captura de genes de interesse.
Na pesquisa biotecnolgica, existem duas situaes corriqueiras em
que o pesquisador busca as ferramentas de bioinformtica:
1) Quando se tem uma ou conjunto de sequncias da qual se
deseja identicar a funo biolgica.
2) Quando se tem um problema biolgico para o qual h necessi-
dade de se identicar os genes ou rotas metablicas.
A seguir sero apresentadas algumas dessas ferramentas no con-
texto da situao um e dois.
127
Ferramentas para anotao de
sequncias genmicas
Nos estudos de genmica, protemica, engenharia gentica e desen-
volvimento de marcadores moleculares, frequentemente o pesquisa-
dor tem necessidade de conrmar se o segmento obtido realmente o
desejado. Para tanto, faz-se a determinao da ordem das bases nitro-
genadas (no caso de DNAs) ou dos aminocidos (no caso de peptdeos)
pelo mtodo de sequenciamento de DNA ou de peptdeos. Uma vez
obtidos os dados dos sequenciadores, inicia-se a etapa de tratamento
informatizado para interpretao dos resultados.
No caso especco de DNAs, chama-se de sequncia bruta quela
recm-obtida da leitura do eletroferograma (representao grca da
ordem das bases nitrogenadas gerado pelo sequenciador automtico
de DNA). Essas sequncias podem conter, alm do DNA de interesse,
segmentos do vetor de clonagem que necessitam ser identicados
e removidos antes de qualquer estudo para se evitar interpretaes
errneas. A remoo de vetores da sequncia bruta feita compa-
rando-se o segmento com bancos genticos de vetores de clonagem.
Identicada a similaridade, faz-se a retirada da regio correspondente
ao vetor. Esse processo pode ser feito visualmente e o prprio pesqui-
sador analisa e identica a sequncia do vetor, ou com auxlio de pro-
gramas de bioinformtica.
Aps esse tratamento inicial, faz-se o envio da sequncia para a
comparao com outras depositadas em bancos de dados. O objetivo
da etapa de comparao identicar similaridades com segmentos de
DNA ou de peptdeos disponveis nos bancos de dados, permitindo
atribuir provveis funes ao segmento em estudo. O programa de
busca de similaridades mais conhecido na atualidade o Blast, que
est disponvel na pgina inicial do NCBI (NCBI, 2009; BLAST, 2009).
A Embrapa desenvolveu um programa de bioinformtica que per-
mite, de forma automatizada, identicar e retirar o vetor, enviar e
recuperar as sequncias similares dos bancos de dados. O programa
dispe de um tutorial e est disponvel para pesquisadores cadastra-
dos no site: www.genoma.embrapa.br (SISGEN, 2009).
Na Figura 6, ilustra-se o resultado de uma pesquisa de similaridade
em bancos de dados provenientes do Blast. No exemplo, foi identi-
128
cado apenas um segmento similar sequncia pesquisada, contudo
comum aparecer mltiplas sequncias ou a situao inversa em que
no aparecem similaridades.
Figura 6. Pgina de resultados da busca de similaridades com sequncias
depositadas no banco de dados BLAST. No exemplo foi pesquisada a similari-
dade no banco de arroz da sequncia de tocoferol obtida do sequenciamento
do banco genmico do milho. A representao grca mostra a regio do seg-
mento do milho com similaridade ao clone NR008395.1 do banco de arroz.
Igualmente comum a situao em que apenas uma parte da sequ-
ncia apresenta similaridade com outras provenientes dos bancos de
dados. Esses casos geralmente ocorrem quando existem domnios
conservados entre famlias gnicas ou genes com origem evolutiva
comum, ou mesmo em virtude da presena de elementos repetiti-
vos diversos de origem viral ou no viral (COSTA; MARTINS, 2010).
Identicada a similaridade, faz-se a anotao das bases e (ou) ami-
nocidos de incio e m e sua funo hipottica, destacando o termo
hipottico quando a funo no tiver sido comprovada experimen-
talmente.
O Blast permite identicar e recuperar dos bancos de dados as fases
abertas de leitura (open reading frame ORF), ou seja, possveis pep-
tdeos que poderiam ser codicados pelo segmento se a regio cor-
129
respondesse a um gene. Esse procedimento pode ser feito de forma
menos automatizada por meio de outros programas de bioinform-
tica disponveis gratuitamente ou no para esse m (ex.: ORF nder
encontrado no prprio site do ncbi: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
projects/gorf/) (Figura 7).
Aes necessrias e anotaes
genticasmais frequentes
Consensos da
expresso gnica
(transcrio e traduo)
(http://www.bimas.cit.nih.gov/molbio/signal/)
Anlise estrutural
(http://hydra.icgeb.trieste.it/~kristian/dna/)
Consenso com
elementos repetitivos
(transposons)
Retirada vetor
Sequncia bruta
Fase aberta de
leitura (ORF)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
gorf/gorf.html)
Comparao com
sequncias depositadas
(www.ncbi.nlm.nih.gov)
Figura 7. Anotaes mais comuns realizadas nas sequncias brutas: (1) reti-
rada da regio do vetor; (2) Comparao com sequncias depositadas em
banco de dados; (3) Identicao de fases abertas de leitura; (4) Identicao
de consensos da transcrio ou traduo; (5) Identicao de elementos repe-
titivos; e (6) Anlise estrutural.
No caso particular de no existirem similaridades com as sequn-
cias depositadas nos bancos de dados, dependendo da necessidade
do pesquisador, faz-se uso de outros programas de bioinformtica
que permitam identicar outras informaes que possam auxiliar na
identicao do papel biolgico. Entre esses programas, destacam-se
aqueles que identicam consensos ativadores ou repressores da trans-
crio, segmentos caractersticos de regio promotora. Essas regies
podem ser caracterizadas com o auxlio de programas do tipo Signal
scan. Tambm, podem-se fazer anlises de curvaturas e dobramen-
tos de DNAs e cadeias polipeptdicas com ferramentas especcas dis-
ponveis para tal (Figura 7).
130
Aps a etapa de anotao, em geral as sequncias caracterizadas so
enviadas para depsito nos bancos de DNA ou de protenas. A forma
de envio e depsito depende do banco de dados. No caso do site do
NCBI, h a possibilidade de se depositar a sequncia de forma uni-
tria ou em conjunto por meio do programa especcos. No caso de
depsito no NCBI, o tutorial encontra-se na pgina http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/Genbank/update.html. (UPDATING INFORMATION
ON GENBANK RECORDS, 2009).
Com base no conhecimento gerado pelas anotaes, possvel de-
nir as estratgias para comprovao da funo do segmento no orga-
nismo. Portanto, a anotao bastante til na situao em que o pes-
quisador tem alguma sequncia (ou conjunto de sequncias) da qual
necessita identicar a funo biolgica.
De tempos em tempos, as sequncias depositadas nos bancos de
dados so atualizadas. Somente a equipe que as depositou poder pro-
mover modicaes nas informaes disponibilizadas. Essa situao
comum quando so disponibilizados os resultados de sequenciamen-
tos parciais ou quando se deseja atualizar as anotaes.
Uma vez publicadas as sequncias pelos bancos, qualquer usu-
rio pode salvar a informao em seu computador. Os arquivos no for-
mato Genebank fornecem a sequncia com todas as informaes ano-
tadas pelo depositante (Figura 8). Por meio desse arquivo, possvel
conectar as informaes complementares disponibilizadas na inter-
net como, por exemplo, a bibliograa relacionada ao arquivo.
131
Figura 8. Exemplo de sequncia no format Genebank. As anotaes em azul
permitem o acesso ao detalhamento da informao, incluindo acesso s
publicaes via ligao com o Medline e Pubmed (seta em vermelho).
O formato Fasta disponibiliza a sequncia sem as anotaes
(Figura 9). Esse formato de apresentao til quando a informao
obtida utilizada em algum programa de anlise de bioinformtica,
como no caso de desenho de primers para amplicao de regies
especca do genoma.
132
>C5 regio hibrida humana/minicrculo kDNA, 1075 bp
GAATTCTCTGTGGCATAGTTCCCAACTTCGATGGCTTACCCTGTTACTCAGCAACATCCTAG
GACTGTCCATCCTGCTTGAAAAATAAGGAAGTTGGCCAAAGTTATGGTTCAGAGGGTAACAT
ACTTGTGGAACAGCATGAGGGACCTCAGTTTGAATCCCCAGCGACCCTGTAAAAGTCAGTTG
TGACTGTACTACAAGTATCATGCTATAACTCCAGTTCTGGGAGGCAGAGACAGGTGGGTCCC
TGGAGTTCACAAGTCAGTCATCCTATTTCAATAGATAGTTTTATGTTCAGGGAAAGGGACTG
TCTCAAAATCGAGGAAGATACACGCACAACTCTGGTATACACACACACACACACACACACAC
ACACACACACACACTCACACACAGTTTTCAGCACCTCCATTTACCATAAAACACCACAACTA
TCACCAAACTCTCTATATTACACCAACCCCAATCGAACCCCACCTCCCGTAAACAACCCCCC
ACTTTCGGCCAAATAATGTACGGGGGAGATGCATGAATTTTCCGGCCAAAATCTGA
>FOSB_MOUSE Protein fosB. 338 bp
MFQAFPGDYDSGSRCSSSPSAESQYLSSVDSFGSPPTAAASQECAGLGEMPGSFVPTVTA
ITTSQDLQWLVQPTLISSMAQSQGQPLASQPPAVDPYDMPGTSYSTPGLSAYSTGGASGS
GGPSTSTTTSGPVSARPARARPRRPREETLTPEEEEKRRVRRERNKLAAAKCRNRRRELT
DRLQAETDQLEEEKAELESEIAELQKEKERLEFVLVAHKPGCKIPYEEGPGPGPLAEVRD
LPGSTSAKEDGFGWLLPPPPPPPLPFQSSRDAPPNLTASLFTHSEVQVLGDPFPVVSPSY
TSSFVLTCPEVSAFAGAQRTSGSEQPSDPLNSPSLLAL
FASTA
Figura 9. Exemplo de sequncia de DNA (A) e de peptdeo (B) no formato
fasta. O sinal maior (>) indica que a linha o cabealho da sequncia e que
o pargrafo seguinte contm a sequncia.
A segunda situao muito comum enfrentada pelos prossionais
que atuam na rea de biotecnologia aquela em que se tem um pro-
blema biolgico para o qual h a necessidade de se identicar os
genes ou rotas metablicas. Nesses casos, os bancos de dados podem
ser muito teis para obter as informaes desejadas. Entre os ban-
cos, destacam-se os do NCBI (ENTREZ, 2009) e os do KEGG (Kyoto
Encyclopedia of Genes and Genomes) (KEGG,2009).
A pesquisa do tema geralmente feita por meio de palavras-chave
grafadas em ingls. Os resultados so pginas com dados gerais e
links para o acesso s informaes especcas.
O NCBI um portal que integra diferentes bancos de dados por
meio do sistema Entrez (NCBI, 2009; ENTREZ, 2009). A entrada
para o sistema feita pela pgina inicial do NCBI (Figura 10). Nessa
pgina, o usurio visualiza dois campos. O campo 1 destinado
colocao da palavra-chave, e o segundo, marcado com a frase All
Database, permite a escolha do banco de dados onde ser realizada a
busca, clicando-se na seta ao lado da frase. Ao realizar o procedimento,
abre-se uma janela com as opes: Pubmed, Protein, Nucleotide, EST,
GSS, Structure, Genome, Biosystems, Books, Cancercromossome,
Conserved Domains, 3D Domains, Gene, Genome Project, DBGAP,
Gensat, Geoproles, Unigene, entre outros. Aps a escolha do banco
133
de dados e colocao da palavra-chave, o usurio dever clicar na pala-
vra Go para iniciar a consulta. Para a busca geral, a pesquisa feita
sem a denio de um banco. Nesse caso, todos os bancos sero con-
sultados, gerando-se uma relao com o nmero de ocorrncias da
palavra-chave em cada um dos bancos e chamadas para acesso.
Figura 10. Resultado da pesquisa da palavra-chave tolerncia seca no Entrez.
Os nmeros esquerda de cada cone indicam a quantidade de arquivos obti-
dos com a palavra-chave em cada banco de dados. Para acessar o resultado,
basta clicar sobre o cone.
A seguir sero apresentados alguns dos bancos disponveis no site
com maior utilidade geral. Contudo, em virtude da importncia espe-
cca de algumas das ferramentas, sugerimos a navegao no Entrez
para maiores detalhes.
O Pubmed um banco de dados que disponibiliza os trabalhos
publicados conforme a palavra-chave (resumos e artigos). muito
til no caso de revises bibliogrcas, principalmente em temas volta-
134
dos para a rea de sade, veterinria, bioqumica, gentica molecular,
siologia vegetal e cincias biolgicas em geral. Contudo, o sistema
no varre as revistas que focam temas agronmicos ou zootcnicos
propriamente ditos (sistemas de cultivo, adubao, mecanizao agr-
cola, manejo animal, etc.), fazendo-se necessria a busca em outros
portais como o Science Direct (SCIENCE DIRECT, 2009).
Os bancos Protein, Nucleotide, EST, GSS disponibilizam acessos
s sequncias de protenas e de DNAs obtidos por diferentes mto-
dos biotecnolgicos (isolamento e sequenciamento de peptdeos, clo-
nagem e sequenciamento de bancos genmicos, sequenciamento
de segmentos de DNA expressos, sequenciamento de segmentos de
DNA isolados, clonados ou no, entre outros). A consulta a esses ban-
cos gera uma pgina com relao de arquivos Genbank classicada
por organismo. Por sua vez, cada arquivo permite o acesso s publi-
caes correspondentes e outras informaes quando disponveis,
como localizao do segmento visualizado no cromossomo, nmero
de cpias, via metablica, etc.
O banco Estructure til quando se deseja consultar a estrutura
cristalogrca relacionada palavra-chave permite acesso aos arqui-
vos de banco de dados de protenas (PDB). Da mesma forma, permite
recuperar a literatura correspondente.
O Biosystems disponibiliza o acesso s rotas de sntese metab-
lica que envolvem a palavra-chave. Interliga-se com o banco de dados
KEGG. O portal KEGG especialmente til quando se deseja corre-
lacionar vias celulares, genes e fentipos, e na predio de comporta-
mento biolgico do organismo em funo do ambiente ou do perl
allico. O banco oferece mapas metablicos com acesso a informaes
de sequncias de protenas e DNAs, estruturas qumicas, cinticas
enzimticas, alm de acesso s publicaes correspondentes. Entre
os mapas, destacam-se os das rotas fotossintticas e dos carboidra-
tos, sntese de vitaminas, metabolismo secundrio (Figura 11 e 12).
O banco Books disponibiliza os livros sobre o assunto. O
Cancercromossome possibilita a localizao e informaes cromos-
smicas relacionadas palavra-chave e relacionadas formao de
tumores. Conserved Domains e 3D Domains so bancos teis quando
se realiza estudos de distncias genticas e elaborao de iniciali-
135
zadores (primers) para amplicar genes em organismos aparenta-
dos. O banco DBGAP disponibiliza os projetos e estudos que corre-
lacionam os padres genotpicos aos fenotpicos, compreendendo
a diversidade allica e documentaes. O Gensat acessa o banco
de dados do projeto que objetiva o mapeamento dos genes expres-
sos no sistema nervoso central de camundongo. O Geoproles e
Unigene disponibilizam a organizao e anlises de transcriptomas.

Lutena
Zetacaroteno
Beta-caroteno
cido Abscsico
VioIaxantina
Figura 11. Sequncia de busca da via de sntese de carotenides via banco de

dados Kegg. (A) Pgina inicial do Kegg. Verica-se o campo para a colocao
da palavra chave e recursos do KEGG; (B) Resultado da busca com a palavra
chave carotenoid; (C) Mapa de sntese de carotenoide; (D) detalhamento
do mapa: enzimas e substratos.
136

Sequncla
da proLelna
Sequncla
do Cene

Figura 12. Detalhamento do mapa de sntese de carotenoides. Os smbolos
so portas de acesso para o detalhamento da informao (A): Ao clicar no
crculo, visualiza-se a estrutura do substrato (B), que, por sua vez, permite o
acesso a outras informaes como as das enzimas envolvidas no processo (C
e E) e sequncia da protena/gene (D) entre outras informaes.
137
Exemplo de problema biolgico aplicado ao melhoramento
gentico
Existe hoje uma grande expectativa da sociedade por alimentos mais
ricos em nutrientes e bencos sade, os chamados alimentos fun-
cionais. Uma categoria de composto correlacionada a propriedades
funcionais a dos antioxidantes. Para tanto, alguns grupos de pes-
quisa desenvolveram alimentos com maiores teores de compostos
fenlicos e carotenoides. No melhoramento gentico clssico, iden-
ticam-se os materiais genticos ricos nesses compostos e, por meio
de cruzamentos e selees, agregam-se as propriedades bencas s
caractersticas agronmicas da variedade comercial. Mas, como predi-
zer o comportamento biolgico da planta rica em carotenoide? Como
identicar as variantes allicas da via dos carotenoides para sntese em
sistemas biotecnolgicos com o auxlio das ferramentas de bioinfor-
mtica? Como aplicar as ferramentas de bioinformtica para desen-
volver marcadores moleculares especcos para acelerar os progra-
mas de melhoramento gentico?
Para responder essas questes, h a necessidade de se identicar
os genes envolvidos na via de sntese dos carotenoides. A pesquisa
pode ser feita pelo Entrez (NCBI, 2009; ENTREZ, 2009), no banco
Biosystems ou consultar diretamente a existncia dos mapas meta-
blicos no Kegg (KEGG, 2009), utilizando-se a palavra-chave caro-
tenoid nos campos de busca correspondentes. Nas Figura 11 e 12,
mostra-se o resultado da pesquisa realizada no banco de dados Kegg.
A anlise da via permite identicar uma correlao da via de sn-
tese dos carotenoides com a de sntese de cido abscsico. O cido abs-
csico um hormnio vegetal associado aos processos de maturao
de frutos, queda de folhas e proteo da planta ao estresse ambien-
tal. Esse hormnio provoca dormncia das sementes e diminuio do
porte da planta. Como existe ligao entre as duas vias, possvel infe-
rir que plantas ricas em carotenoides podem, eventualmente, apre-
sentar maior expresso do hormnio, o que poderia afetar no porte e
dormncia das sementes.
A manifestao ou no do prognstico, entretanto, vai depender
da combinao allica da planta. No caso do exemplo, para haver ac-
138
mulo dos carotenoides, faz-se necessrio combinaes allicas mais
ecientes na sntese do composto. Como esse produto substrato de
outras vias biossintticas, necessrio tambm que essas vias pos-
suam alelos menos ecientes no consumo do composto.
No momento, ainda no esto disponveis programas de pre-
dio do comportamento fenotpico em funo do perl allico. A
diculdade est na falta de informaes organizadas sobre o com-
portamento gentico dos alelos frente s variaes ambientais que
permitam subsidiar a elaborao de programas preditivos. Contudo
j existem alguns estudos em andamento conforme pode ser consta-
tado na lista de projetos sobre o assunto disponibilizado pelo Entrez
(DBGAP, 2009).
Para se identicar os alelos conhecidos de um determinado gene,
o interessado pode fazer a busca nos bancos Protein ou Nucleotide,
EST, GSS do Entrez (ENTREZ, 2009) ou pelo Kegg (KEGG, 2009). Se
o usurio dispuser de informao da sequncia gnica ou da protena,
tambm o Blast pode ser til na pesquisa (BLAST, 2009).
Recuperados os alelos, faz-se o alinhamento das sequncias para
identicar as regies mutadas e no mutadas. Existem programas que
auxiliam nesse processo, sendo um dos mais utilizados o ClustalW
(CLUSTALW, 2009). O ClustalW pode ser utilizado online ou instalado
no terminal do usurio. O programa aceita a comparao de sequn-
cias que estejam no formato Fasta. Essas podem ser copiadas e cola-
das diretamente no campo disponibilizado na pgina inicial do pro-
grama ou podem ser carregadas pelo programa a partir de arquivos
tipo DOC ou TXT (Figura 13).
139
Clustal W: www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html
>C1, 181 bp
GAATTCGGCTTGGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATAGAGAGTTTGGTGATAGTTGTGGTGTTTTATGTAAAT
GGAGGTGCTGAAATGCAGATTTTGATTTTNAGGGCGTCAGATTTCCGACAAATCATTCATCTCCCCGACNNNG
CGAAGTGGTGNNGTTACTTAGTGTCGATGGGTGGG
>C2, 666 bp
GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATAGAGAGTTTGGTGATAGTTGTGGTGTTTTATGGTAAATGGAGGTGCTG
AAAATTGGCAGAATTTTGATTTTGGGAGGGGCGTTCAGATTTCGGCGGAAAATTCATGCATCTCCCCCGTACA
TTATTTGGCCGAAAGTGGGGGTTGTTTACGCGAGGTGGGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATAGAGAGTTTGG
TGATAGTTGTGGTGTTTATGGTAAATGGAGGTCTAAAATGCAGATTTATTTGGAGGCTCAGTTGCGAATCATG
CATCTCCCCCGTACTGACTGCTAATAGGTCTCACGACGCGGTTCGATGGGTGGTGTATATAAAAGGTTGTGAT
AGTTGTGCTGCTTTATGTCAAATGGAGGTGCTTGAAAATGCAGAACTTTTGATTTTGGGAGGGCGTTCAGACT
TTTGGGCGGAAAACTTCATGCATCTCCCCCGTACATTACCTTTGGCCGAAAGTGGGGGTCTGTTTACGGGAGG
CTGGGGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATAGAGAGTTTGGTGATAGTTGTGGTGTTTTATGGTAAATGGAGGT
GCTGAAAACTGGCAGAATTTTGATTTTGGGAGGGGCGTTCAGATTTTGGCCGGAAAATTCATGCATCTCCCCC
GTACATTAT
>C4, 151 bp
GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATAGAGAGTTTGGTGATAGTTGTGGTGTTTTATGGTAAATGGAGGTGNTG
AAAATTGGCAGAATTTTGATTTTNGGAGGGGCGTTCAGATTTTGGGCGGAAAATTCATGCATCNCCCCCNTAC
ATTAT
Figura 13. Pgina inicial do programa ClustalW. As sequncias devem ser
colocados no formato Fasta.
Na Figura 14, mostra-se o resultado da comparao de segmen-
tos de DNA por meio do ClustalW. Identicada as regies simila-
res e no similares, a informao pode servir para diferentes nali-
dades, incluindo o desenvolvimento de marcadores moleculares ou
para desenho de inicializadores que iro amplicar regies espec-
cas para estudo e uso biotecnolgico.
140
Comparao das sequncias para busca de primers
Regio potencial para
desenho de primer/sonda
Figura 14. Exemplo de comparao de trs alelos realizada com o auxlio do
programa ClustalW. A linha pontilhada indica ausncia das bases no alelo.
O smbolo estrela na linha abaixo dos clones indica que todos os alelos apre-
sentam a mesma base no ponto indicado. Os nmeros direita indicam a
posio no alelo da ultima base visualizada na linha.
Consideraes finais
As ferramentas de bioinformtica e bancos de dados permitem que
o usurio adquira uma noo do estado da arte e acesso ao detalha-
mento de informaes biolgicas teis, tais como sequncias de DNA
e de protena, estruturas tridimencionais de cidos nucleicos e pept-
deos, localizao de segmentos gnicos e no gnicos nos cromoss-
micos, identicao de rotas metablicas, entre outros. Esse conhe-
cimento de extrema utilidade na gerao, interpretao e discusso
de dados e formulao de hipteses.
Como qualquer fronteira do conhecimento, os programas de bio-
informtica esto em constante aprimoramento. Dia aps dia, novas
ferramentas surgem no mercado, exigindo ateno e esforos por
141
parte do usurio no sentido de conhecer os novos recursos. Contudo,
trata-se de um esforo compensador que resulta em grande econo-
mia de tempo e tambm de esforos, que, se bem explorado, pode ser
uma poderosa ferramenta para o avano tecnolgico.
Referncias
BLAST. 2009. Disponvel em: <http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi>. Acesso
em: nov. 2009.
BOLDUC, M.; LAZARIS, A. Spider Silk-based advanced performance fiber for
improved personnel ballistic protection systems. Defence R&D Canada Valcartier.
Technical Memorandum DRDC Valcartier TM 2002.222. 2002. Disponvel em: <
http://cradpdf.rddc.gc.ca/PDFS/unc07/p518792.pdf >. Acesso em: nov. 2009.
CLUSTALW. 2009. Disponvel em: <www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html>.
Acesso em: nov. 2009.
COSTA, A. M.; MARTINS, C. Estrutura e evoluo dos genomas. Planaltina, DF:
Embrapa Cerrados, 2010. 110 p.
DBGAP. Disponvel em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gap>.
Acesso em: nov. de 2009.
ENTREZ. Disponvel em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/> . Acesso em:
nov. de 2009.
KEGG. Disponvel em: <http://www.genome.jp/kegg/>. Acesso em: nov. de 2009.
MARTINS, C.; BARROS, A. M. Estrutura e evoluo de genomas. Planaltina, DF:
Embrapa Cerrados, 2007.
NCBI. Disponvel em: <www.ncbi.nlm.nih.gov.br>. Acesso em: nov. 2009.
SCIENCE DIRECT. Disponvel em: <http://www.sciencedirect.com/>. Acesso em:
nov. 2009.
SISGEN. Disponvel em: <www.genoma.embrapa.br>. Acesso em: nov. 2009.
TRIPURANI, S. K.; REDDY, N. S.; RAO, K. R. S. S. Green revolution vaccines,
edible vaccines. African Journal of Biotechnology, v. 2, n. 12, p. 679-683, Dec. 2003.
Disponvel em: <http://www.academicjournals.org/AJB>. Acesso em: nov. 2009.
UPDATING INFORMATION ON GENBANK RECORDS. Disponvel em: <http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/update.html>. Acesso em: nov. 2009.
Captulo 5
143
Genmica funcional
Erich Yukio Tempel Nakasu
Thales Lima Rocha
Introduo
A biodiversidade existente hoje, ou mesmo a extinta, que obser-
vada nos registros fsseis desde 3 billhes de anos atrs, nos mos-
tra uma innita variedade de formas, tamanhos, cores, nichos e rela-
es ecolgicas. Paradoxalmente, os seres vivos so bioquimicamente
iguais e, essa innita variabilidade constituda basicamente de umas
dezenas de precursores moleculares idnticos. Da mesma forma,
incrvel que quase toda informao biolgica esteja armazenada
no cido desoxirribonucleico, o DNA, que apresenta apenas quatro
tipos de bases nitrogenadas diferentes (Adenina, Citosina, Timina
ou Guanina). Da mesma forma, quase todas protenas so consti-
tudas de apenas 20 tipos de aminocidos, encadeados sequencial-
mente. A variao de nmero e de sequncia nucleotdica o que pode
gerar teoricamente innitos genes diferentes (para uma introduo
detalhada, CORDEIRO, 2003). De forma semelhante, essa informa-
o do gene pode ser utilizada para determinar a sequncia precisa
de aminocidos que constitui uma determinada protena, que aps
seu enovelamento, endereamento e ativao, ir assumir sua fun-
o celular. Como os carboidratos, lipdeos e metablitos podem ser
observados como produtos enzimticos gerados por protenas espe-
ccas, muito pode ser entendido a partir dos genes e suas protenas
codicadas, num nico mecanismo de uxo de informao biolgica,
que est baseado num nmero nmo de precursores moleculares.
O conjunto completo dos genes de determinado ser vivo chamado
de genoma. A genmica a cincia que trata do sequenciamento e
os diversos estudos da informao gerada. J a genmica funcional
um campo da Biologia Molecular e Bioqumica que descreve a fun-
o especca de genes e protenas, relacionando as etapas do uxo de
144
informao biolgica, relacionando a regulao da expresso gnica
com mecanismos bioqumicos e siolgicos. A genmica funcional
inclui estudo da atividade molecular, que compreende vrias mi-
cas (Figura 1), como transcriptmica (expresso gnica), protemica
(expresso proteica) e, mais recentemente, metabolmica (presena
e abundncia de metablitos).
DNA
RNA
Protena
Metablito
Genmica
Transcriptoma
Proteoma
Metaboloma
Figura 1. Cincias micas e os tipos de biomleculas estudadas. As setas
mostram o sentido direto do uxo de informao biolgica, onde a informa-
o gentica transmitida do DNA do ncleo para o citoplasma na forma
de RNA, cuja informao utilizada para sntese de protenas nos ribosso-
mos. Enzimas controlam o transporte, a sntese e a degradao dos meta-
blitos celulares .
Ao contrrio da genmica, a genmica funcional focaliza os aspec-
tos dinmicos como transcrio gnica, traduo proteica, intera-
o protena-protena e alterao metablica, alternativamente aos
aspectos estticos da informao genmica como sequncia de DNA
e estrutura gnica. Por natureza, a genmica estuda um fenmeno
populacional e apresenta enfoque gentico e evolutivo, enquanto a
genmica funcional aborda um fenmeno siolgico com enfoque
celular, molecular e bioqumico.
145
Captulo 5 Genmica funcional
Considerando a reproduo sexuada de espcies diploides, cada
indivduo herda dois genomas haploides, cada qual oriundo de um
gameta e constitudo de segmentos cromossomais que podem sofrer
mutao, recombinao, duplicao, transposio e segregados pela
meiose, que foram combinados pela fecundao. A grande variabili-
dade gerada matria-prima para a seleo natural dos indivduos, e
para seus genomas nicos, que apresentam caractersticas mais van-
tajosas em determinadas condies (adaptao). Salvo raras excees,
todas as clulas de determinado indivduo compartilham o mesmo
genoma, do momento de sua formao at a sua morte. A genmica
tem gerado descobertas fascinantes com relao evoluo das esp-
cies, comparando tanto a sequncia dos genes e famlias gnicas como
sua arquitetura nos cromossomos em estudos de sintenia.
Entretanto, sendo o genoma funcional um fenmeno siolgico.
Quando um indivduo modica sua siologia em resposta a variaes
ambientais (aclimatao), o que ocorre em nvel celular a alterao
da expresso gnica (transcrio) e expresso proteica (traduo), que
reetem nos metablitos. Ou seja, o genoma funcional varia conforme
diversos estmulos do prprio organismo (local e tipo de tecido, fase
da vida, hormnios, etc) e do meio ambiente (temperatura, fotoper-
odo, umidade, altitude, latitude, estao do ano, patgenos, etc).
A questo principal como atribuir uma funo especca a genes e
protenas dentro de clulas extremamente complexas e pequenas? As
melhores abordagens de estudo so baseadas em comparao entre
espcies, indivduos ou tratamentos. Conceitualmente simples, a solu-
o est organizada em trs princpios comparativos:
a) Comparativo de sequncia Assumindo a ancestralidade
comum de todos os seres vivos e sua diversicao conforme
a evoluo biolgica, faz-se a comparao da informao bio-
lgica. Constata-se que alta a probabilidade de que mol-
culas com sequncias similares desempenhem papel seme-
lhante, mesmo comparando espcies bem diversificadas.
Logicamente, espcies mais distantes logeneticamente apre-
sentam menor identidade de sequncia de determinada mol-
cula, assim como espcies mais prximas evolutivamente tm
sequncias com alta identidade. Normalmente, mecanismos
146
biolgicos bsicos so idnticos em todas as espcies, e seus
genes, transcritos e protenas relacionados so extremamente
conservados ao longo do tempo. Considerando isso, infere-se
a funo predita a uma molcula recm-descoberta com base
na funo conrmada numa outra espcie, desde que compar-
tilhem relativa identidade de sequncia nucleotdica ou pept-
dica. As bioinformtica genmica se encarrega dessa compara-
o em larga escala de sequncias de genes, mRNAs (cDNAs)
e protenas, assim como das relaes evolutivas entre as esp-
cies estudadas.
b) Comparativo de abundncia Indivduos da mesma espcie
submetidos a diferentes condies e tratamentos so compa-
rados com relao resposta siolgica que induzida e quais
molculas so utilizadas nesse mecanismo, observando quais
mRNAs, protenas e metablitos aumentam e quais diminuem
de abundncia. As principais tcnicas de genmica funcional
atuam na identicao, isolamento e quanticao de mRNAs,
protenas e metablitos para comparao entre situaes con-
trastantes. Infere-se a funo relacionada a determinadas situ-
aes por quanticao diferencial das molculas.
c) Comparativo de fentipo A comparao de indivduos com
alteraes genticas e indivduos sem alteraes genticas pode
indicar a funo especca do gene mutante. Infere-se a fun-
o da molcula nos indivduos silvestres ou selvagens pela
observao da perda de funo nos mutantes. Essa forma de
estudo conhecida como gentica reversa e dispe de vrias
tcnicas. Inicialmente, os mutantes de vrias espcies, inclu-
sive humanos, eram detectados para serem estudados e relacio-
nados aos genes mutantes. Depois, mutantes podiam ser gera-
dos por mutao gnica aleatria induzida por irradiao ou
quimicamente, principalmente em fungos, droslas e plan-
tas. Com o advento das tcnicas de Biologia Molecular, genes
especcos podiam ser introduzidos, modicados ou nocaute-
ados (OGM), gerando indivduos sob encomenda para estudo
da funo de genes especcos.
147
A gentica reversa muito poderosa e rene os trabalhos que de
fato demonstram a relao de causa e efeito e formou grande parte da
base do conhecimento atual da Biologia e reas correlatas. Porm, a
gerao de OGM demorada, laboriosa e onerosa, mesmo para orga-
nismos modelo, sendo, portanto, atualmente impraticvel a gerao
de em torno de 25 mil OGMs (nmero predito para vrios eucario-
tos multicelulares) para estudar a funo de todos os genes para cada
espcie. O silenciamento gnico, entretanto, relativamente mais
rpido, fcil e acessvel, pois no envolve transformao gentica e,
sim, ingesto e (ou) injeo e (ou) infeco viral de molculas de RNA
dupla ta (dsRNA) no organismo em estudo. O gene especco des-
ligado e a funo individual perdida observada. Gene a gene, so
meticulosamente estudados.
Utilizando essas estratgias possvel: comparar padres de expres-
so gnica e proteica entre diferentes tecidos, diferentes estdios de
desenvolvimento, processos patolgicos e imunolgicos; correlacio-
nar abundncia diferencial de mRNA, protenas e metablitos com
mudanas siolgicas; descobrir mecanismos biolgicos; estudar as
respostas celulares a drogas, diferentes condies siolgicas e expo-
sies ao ambiente; descobrir relaes funcionais entre genes, pro-
tenas e metablitos; rastrear genes de interesse para melhoramento
gentico, transgenia, desenvolvimento de frmaco entre outros.
Transcriptmica
Transcriptmica a cincia que estuda o transcriptoma, que, por
denio, o conjunto completo de RNA transcritos de determinado
indivduo, de determinada espcie, de determinada idade, de deter-
minado tecido, em determinadas condies ambientais, sob determi-
nado tratamento experimental, etc. Ou seja, se o genoma o conjunto
de genes de um certo indivduo, ele no varia para aquele indivduo.
Todas as clulas daquele indivduo apresentam o mesmo genoma,
exceto linfcitos e clulas germinativas devido a peculiaridades fun-
cionais. Bastaria fazer um genoma por espcie, determinando todos
os alelos para cada lcus gnico. No entanto, um enorme nmero de
diferentes transcriptomas pode ser gerado de um nico indivduo,
considerando todas as condies especcas utilizadas para coletar as
148
amostras. Se a soma dos recursos aplicados para obter cada genoma
atualmente conhecido (4.955 incompletos e 1.043 completos, http://
www.genomesonline.org/gold.cgi) fosse aplicada em transcriptomas
de uma nica espcie, por exemplo Homo sapiens, seriam, quem sabe,
uns 3 mil transcriptomas. Entretanto, se for considerado que o ser
humano apresenta diversas fases da vida, centenas de tipos celula-
res, dezenas a centenas de disfunes siolgicas, doenas genticas,
parasitas e patgenos, provavelmente esse nmero de transcriptomas
no atenderia a todas as perguntas biolgicas. Por isso, vrias estrat-
gias metodolgicas foram criadas para abordar transcriptmica sem
necessariamente sequenciar transcritos em larga escala.
Biblioteca de cDNA
Molculas de RNA so sintetizadas (transcrio) para cumprir
diversas funes, sendo o mRNA responsvel por levar a informa-
o biolgica armazenada no DNA para os ribossomos, local da sn-
tese de protenas (traduo). Em eucariotos, a grande maioria dos
mRNA possui na sua extremidade 3 uma sequncia homopolim-
rica de adenosinas (cauda PoliA). Tal caracterstica explorada nas
tcnicas de transcriptmica para excluir outros tipos funcionais
de RNA. Utilizando um iniciador oligonucleotdeo com sequncia
homopolimrica de timidinas (Oligo-dT) e uma DNA polimerase
RNA-dependente (transcriptase reversa viral), possvel sintetizar
in vitro molculas de DNA complementar (cDNA), que podem ser
clonados (ligados em plasmdeos com DNA ligase e inseridos em
clulas bacterianas de Escherichia coli por eletroporao) para pro-
duo de massa e sequenciamento (GUBLER; HOFFMAN, 1983).
A biblioteca de cDNA representa todos os genes expressos nas condi-
es de coleta da amostra.
Ferramentas de bioinformtica para anlise de sequncia so utili-
zadas para inferir funo gnica, mecanismos siolgicos, vias meta-
blicas, etc que atuam em determinada situao. Quando se pretende
comparar tratamentos experimentais, devem ser geradas bibliotecas
de cDNA para cada situao. Posteriormente, faz-se a subtrao in
silico por bioinformtica, que resulta na discriminao de quais genes
ocorrem apenas em um tratamento, apenas no outro tratamento ou
149
ambos, ou seja, um resultado qualitativo. Apenas quando um grande
nmero de clones sequenciado (alta taxa de redundncia), os dados
podem ser considerados quantitativos com certa conana, mas com
custo muito elevado.
Biblioteca subtrativa
A biblioteca subtrativa representa o subconjunto de cDNA que
ocorre exclusivamente em uma determinada situao. Apesar de haver
certas variaes, os protocolos se baseiam na extrao de RNA de dois
tratamentos (A e B, por exemplo) e na incubao conjunta dos respec-
tivos cDNA desnaturados para subtrao in vitro, que teoricamente
seleciona os exclusivos (ocorre em A, mas no em B, ou vice-versa).
Assim, apenas so clonados e sequenciados os cDNA diferencial-
mente expressos, diminuindo o tempo e o custo em relao subtra-
o in silico, que sua principal vantagem (SARGENT; DAVID, 1983).
Na verdade, essa estratgia de subtrao foi idealizada para permitir
a clonagem de genes com baixa taxa de expresso, em que a amos-
tra de cDNA era subtrada dela mesma usando uma massa de 10 a
30 vezes da mesma amostra (TIMBERLAKE, 1980; ZIMMERMANN
et al., 1980).
Apesar das vantagens de se clonar cDNA raros ou comparar dois
tratamentos sem a necessidade de sequenciar dezenas de milhares
de clones (SAMBROOK et al., 1989), tal estratgia no est to pre-
sente nas publicaes mais recentes devido provavelmente ao surgi-
mento de novas estratgias e a gerao de grande nmero de falsos
positivos, ou seja, genes expressos nos dois tratamentos so clonados
como sendo genes diferencialmente expressos. Outra desvantagem
que variaes quantitativas menores no so detectadas e, inversa-
mente, grandes variaes quantitativas podem ser confundidas com
variaes qualitativas.
DDRT-PCR
A estratgia de apresentao diferencial por transcrio reversa
seguida de reao em cadeia da polimerase (DDRT-PCR, do ingls
Differential Display RT-PCR) uma poderosa tcnica de identicao
150
e isolamento de genes diferencialmente expressos (LIANG; PARDEE,
1992). Essa tcnica consiste na sntese de cDNA em subconjuntos uti-
lizando oligo-dT diferentes. Por exemplo, utilizando paralelamente
os oligo-dT terminados em A, C ou G (M) e transcriptase reversa,
os mRNAs servem de molde para a sntese de trs subpopulaes
de cDNA que terminam em T, G ou C logo antes da cauda PoliA.
Tambm possvel separar a populao de mRNA em doze subpo-
pulaes utilizando iniciadores oligo-dT diferenciados nos dois lti-
mos nucleotdeos (AA, AC, AG, CA, CC, CG, TA, TC, TG, GA, GC e
GG, ou NM). Dessa forma, considerando dois tratamentos amostra-
dos, os cDNAs de cada subpopulao so separados por tamanho em
gel de poliacrilamida por eletroforese. Como os cDNAs so marca-
dos com radioatividade (normalmente fsforo 33, mais seguro que o
fsforo 32) ou digoxigenina (eptopo para anticorpo fusionado com
enzima), eles so selecionados como diferencialmente expressos visu-
almente e as bandas cortadas do gel so diretamente sequenciadas ou
so primeiro clonadas em E. coli. Apesar de laborioso, normalmente
depender de radioatividade e demorar algumas semanas, uma tc-
nica eciente para isolamento de genes diferencialmente expressos,
incluindo genes desconhecidos.
Macroarranjo de DNA
O princpio do macroarranjo de DNA est baseado na tcnica de
hibridizao, sendo uma estratgia de anlise interessante para orga-
nismos que j apresentam estudos genmicos prvios. A utilizao de
uma coleo de DNA distintos arranjados para observao do padro
de expresso foi primeiramente descrito por Kulesh et al. (1987). O
macroarranjo pode ser interpretado como o inverso de um Southern
blot (SOUTHERN, 1975), que tem como princpio a separao das
amostras de DNA por eletroforese em gel desnaturante, transfern-
cia do DNA para membrana, imobilizao por ligao covalente do
DNA com a membrana e a hibridizao com sondas de DNA marca-
das com radioatividade correspondentes a um nico gene (Figura 2).
151
Hibridaes
paralelas
Revelao
Marcao
radioativa de
cidos nuclicos
Controle Teste
12 cm
m
2 - 3,000
Sondas
Figura 2. Esquema representativo de um Macroarranjo. Duas situaes so
contrastadas, controle e o teste (tratamento). Amostras de RNA so obtidas
para sntese de cDNA, em que essas molculas recebem uma marcao nor-
malmente radioativa. Robs, em larga escala, ou carimbos, em menor escala,
so utilizados para aplicao uniforme e localizada das sondas especcas (at
3 mil sondas). A hibridizao das sondas assegura uma marcao detectvel
por revelao fotogrca. Dessa forma, a presena e abundncia so perce-
bidas como sinais escuros na membrana, indicando uma anlise de expres-
so diferencial qualitativa e quantitativa.
Inversamente, a estratgia de macroarranjo inicia com a imobili-
zao em membrana de nylon de produtos de PCR ou cDNA clona-
152
dos, com sequncia, nome e funo conhecidos, de forma que, em
cada posio exata (spot), tem um nico cDNA associado para poste-
rior hibridizao com uma populao de cDNA marcado com radioa-
tividade ou digoxigenina. Robs podem ser utilizados para depositar
os cDNA nas membranas de nylon numa densidade aproximada de
40 spots/cm
2
. Tambm possvel utilizar um carimbo prprio (para
placa de 96 poos) para aplicar o cDNA em estudos de menor escala.
Quando existe complementaridade com alguma sequncia imobili-
zada, o cDNA marcado que sondado ca pareado e pode ser detec-
tado em lme fotogrco devido s emisses. Alternativamente, existe
um tipo de marcao enzimtica, sendo aplicada s mesmas etapas
iniciais, variando apenas a forma de deteco. Nesse caso, o cDNA
sintetizado com um eptopo para reconhecimento por anticorpos
fusionados a enzimas. Ao se adicionar o substrato incolor, aqueles
spots sem homologia permanecem incolores e os spots com homo-
logia cam coloridos. A colorao se deve a uma sequncia de even-
tos: (a) o DNA xado na membrana forma ligaes de hidrognio com
o cDNA complementar sondado; (b) essa sonda sintetizada com
nucleotdeo contendo digoxigenina, um eptopo; (c) um anticorpo
antidigoxigenina se liga nos spots; (d) conjugado ao anticorpo est a
fosfatase alcalina; e (e) essa enzima cataliza a converso do substrato
incolor em um produto colorido, marcando os spots onde houve as
etapas anteriores.
Dessa forma, centenas de cDNA, vistos como pontos na membrana,
so sondados simultaneamente para gerao de dados qualitativos e
quantitativos de expresso gnica. Utilizando algum programa dedi-
cado para detectar os spots, quanticar a intensidade das imagens
geradas, procede-se a anlise estatstica considerando as duplicatas e
os controles. Assim, diferentes tratamentos so observados quanto
expresso diferencial de centenas de genes conhecidos, de modo que
possvel relacion-los com os mecanismos bioqumicos que atuam
nos processos siolgicos estudados.
Microarranjo de DNA
O microarranjo de DNA (Microarray) tem sido a principal ferra-
menta de transcriptmica e que mais contribuiu para o avano do
153
conhecimento na era ps genmica at o momento. A miniaturiza-
o do macroarranjo foi relatada em 1995 (SCHENA et al., 1995) e,
apenas dois anos depois, j era possvel organizar o primeiro genoma
eucaritico completo, da levedura Saccharomyces cerevisiae, em uma
nica e pequena lmina (LASHKARI et al., 1997).
A metodologia do microarranjo apresenta algumas melhorias em
relao estratgia anterior. Inicialmente, robs depositam dezenas
de milhares de sondas especcas em lminas de vidro ou silicone
(6.000 spots/cm
2
) em empresas privadas que comercializam chips de
DNA, padronizados ou encomendados (Figura 3). Assim, instituies
de pesquisa e universidades realizam seus experimentos de expresso
gnica em larga escala, gerando grande quantidade de dados com alta
reprodutibilidade e conabilidade, sem precisar investir nos equipa-
mentos de elevado custo de aquisio, operao e manuteno.
Outra melhoria foi na forma de marcao. No lugar da radioati-
vidade, os cDNAs so marcados com dois uorforos, cando cada
tratamento com uma determinada cor. Aps a hibridizao, moder-
nos aparelhos excitam as molculas uorforas com laser e captam
imagens coloridas com alta resoluo em escaner uorescente para
compor os dados de expresso gnica quando comparadas pela inten-
sidade e colorao apresentada em cada ponto que representa um
determinado gene. O uso de diferentes uorocromos permite que os
sinais de hibridizao sejam determinados para os dois tratamentos
distintos em um nico experimento. Cada spot apresenta uma cor
que resultante da mistura dos dois uorocromos, cada qual com
sua intensidade, e representa aquela sequncia de DNA em relao
aos dois tratamentos observados. Dessa forma, o microarranjo de
DNA permite a anlise simultnea de expresso de milhares de genes.
Tambm existe o chip de DNA para genotipagem, em que os pontos
xados correspondem a marcadores moleculares (normalmente do
tipo SNPs) que se correlacionam com fentipos conhecidos.
A maior desvantagem do microarranjo de DNA sua dependncia
de genes previamente caracterizados. Por isso, existem alguns estudos
de hibridizao heterloga, em que amostras de espcies sem genoma
utilizam chip de DNA da espcie-modelo logeneticamente mais pr-
xima. A dependncia de empresas privadas eleva o custo, porm os
154
arranjos montados em laboratrios so tecnicamente trabalhosos e
podem resultar em dados no to conveis. A anlise estatstica
igualmente trabalhosa e a imensa quantidade de dados pode dicul-
tar a interpretao nal.
Controle Teste
Hibridao
competitiva
Marcao
fluorescente de
cidos nuclicos
2
,
5
c
m
7
,5
c
m
20.000
Sondas
Scanner
Cy5 Cy3
Figura 3. Esquema representativo de um Microarranjo. Duas situaes so
contrastadas: controle e teste (tratamento). Amostras de RNA so obtidas
para sntese de cDNA, em que essas molculas recebem uma marcao u-
orescente distinta. Robs so utilizados para aplicao uniforme e localizada
das sondas especcas (20 mil sondas). A hibridizao competitiva ocorre
no mesmo suporte slido. A cor resultante est associada combinao de
cores das amostras, controle ou teste, indicando a presena e abundncia de
cada, resultando numa anlise de expresso diferencial qualitativa e quan-
titativa em larga escala.
SAGE
A poderosa tcnica de anlise seriada da expresso gnica (SAGE,
do ingls Serial Analysis of Gene Expression) permite estudar o
padro global de expresso gnica e foi desenvolvida e publicada em
155
1995 (VELCULESCU et al., 1995). O SAGE pode ser utilizado para
identicar e quanticar a expresso de genes novos ou previamente
conhecidos.
Sua metodologia se baseia na gerao de etiquetas de cDNAs (tags)
de 10 a 14 pares de bases, que contm informao suciente para
identicao especca de transcritos. Os tags so gerados de uma
nica posio dentro de cada transcrito, evitando redundncia ou
superestimativa. Os tags gerados so ligados numa molcula longa
e serial de DNA (concatmero), que clonado e sequenciado. Dessa
forma, cada clone sequenciado traz informao de dezenas de trans-
critos, multiplicando a gerao de dados e minimizando custo. Todas
sequncias obtidas devem ser processadas por programas de bioin-
formtica para reconhecer e separar os tags dos concatmeros, ano-
tar individualmente e fazer a contagem das vezes que cada tag espe-
cco representado.
Por ser um mtodo direto e quantitativo de medir abundncia dos
transcritos, seu resultado de nvel de expresso gnica muito con-
vel e tem alta correlao com experimentos conrmatrios utili-
zando PCR em tempo real.
Entretanto, o SAGE tem como desvantagens alto custo e longo
tempo demandado para clonar, sequenciar e analisar os tags, alm da
maior dependncia de genomas completamente sequenciados para a
associao entre os tags e os genes correspondentes. Outro problema
que os tags representam as extremidades 3 dos mRNAs e, em alguns
genes, essa regio pode ser muito polimrca, dicultando a anlise.
Algumas melhorias tcnicas foram desenvolvidas em estratgias
derivadas, como LongSAGE, RL-SAGE e SuperSAGE, para capturar
tags mais longos, melhorando a correta identicao do gene corres-
pondente.
Sequenciamento de nova gerao
Mais recentemente, novas tecnologias de sequenciamento de DNA
(conhecidas como Next Generation Sequencing) foram desenvol-
vidas e novos equipamentos esto sendo comercializados, como o
454 FLX (Roche), SoLiD (Applied Biosystems) e Solexa (Illumina).
Considerando apenas os ltimos sete anos, o custo do sequencia-
156
mento foi reduzido mais de 100 vezes e a capacidade de sequencia-
mento por mquina aumentou mais de 1.000 vezes. De fato, est
acontecendo uma mudana de paradigma na execuo dos experi-
mentos. Os fatores tempo e dinheiro, que determinaram o sucesso
e insucesso de adoo das estratgias anteriormente descritas, j ini-
ciam um redirecionamento metodolgico.
Num futuro bem prximo, teoricamente qualquer ser vivo conhe-
cido poder ter seu genoma completamente sequenciado para estu-
dos de genmica comparativa. Imaginem a gerao de milhares de
genomas de indivduos da mesma espcie para genotipagem total e
identicao de marcadores moleculares para todos os genes e seus
alelos. Ou milhares de transcriptomas de uma espcie direcionados
para responder questes biolgicas, mdicas, patolgicas, siolgi-
cas e tantas outras. Ou ainda, genomas de inmeras amostras com-
plexas de gua e solo (metagenmica), sem identicao prvia dos
seres vivos presentes.
Entretanto, novos desaos so lanados para a bioinformtica,
pois o tipo de dado gerado requer novos programas dedicados, e o
volume de dados que pode ser gerado a baixo custo em curto tempo
absurdamente grande, dicultando seu armazenamento e anlise.
Curiosamente, maior custo e tempo sero necessrios para armazenar
e analisar os dados do que para gerar as sequncias, ou seja, o inverso
do que vinha ocorrendo com a utilizao do sequenciamento autom-
tico (SMITH et al., 1985; SMITH et al., 1986), baseado no mtodo de
Sanger (SANGER; COULSON, 1975).
Considerando essa transio, o sequenciamento de nova gerao
oferece nova perspectiva para genmica funcional. A rapidez e baixo
custo tornam o sequenciamento completo do transcriptoma melhor
que qualquer tcnica atual, que foram desenvolvidas justamente para
contornar a demora e alto custo necessrios para sequenciar um trans-
criptoma. Provavelmente, em pouco tempo, no haver mais inte-
resse em se executar microarranjo ou SAGE para avaliar e comparar
a expresso gnica. O transcriptoma rene todos os transcritos, sejam
conhecidos ou no, codicadores ou no, mais abundantes ou no.
Seu dado quantitativo podendo ser utilizado para determinar nveis
de expresso gnica.
157
Protemica
A protemica pode ser denida como a varredura, em larga escala,
de protenas provenientes de uma clula, organismo ou uido biol-
gico. O estudo de proteomas desaador, uma vez que a expresso
gentica de uma clula muito dinmica e dependente do seu est-
dio de desenvolvimento, da presena de ativadores e inibidores e das
condies ambientais. Apesar disso, a protemica, por estudar os pro-
dutos nais do genoma, oferece as ferramentas mais adequadas para
a anlise e interpretao das funes gnicas.
Os dados gerados pela protemica, pela alta capacidade de resolver
diferenas mnimas entre protenas, incluem importantes descober-
tas relacionadas a vias de transduo de sinais, protenas regulado-
ras, modicaes ps-traducionais, assim como condies siolgi-
cas e patolgicas de clulas e organismos (WESTERMEIER; NAVEN,
2002). Do ponto de vista agronmico, a protemica de plantas culti-
vadas pode fornecer informaes como diferenas de expresso pro-
teica entre cultivares com nveis variados de produo, de resistncia
a estresses biticos e abiticos, bem como no desenvolvimento de ali-
mentos com altos valores nutritivos.
O estudo de um determinado proteoma tem aplicaes diretas na
descoberta de vias metablicas em todos os estdios do ciclo celular,
gerando uma massiva quantidade de conhecimento em biologia celu-
lar e bioqumica. Alm disso, permite a identicao de novas mol-
culas bioativas em extratos naturais, levando ao desenvolvimento de
novos medicamentos e a caracterizao de marcadores biolgicos,
incluindo molculas endgenas e exgenas especcas a um estado
patolgico. Atualmente, as principais tcnicas utilizadas para an-
lise de proteomas so a eletroforese bidimensional, a cromatograa
lquida e a identicao por espectrometria de massa (MS, do ingls
mass spectrometry).
Eletroforese bidimensional
A eletroforese bidimensional (2-DE, do ingls Two-Dimensional
Electrophoresis) uma tcnica amplamente utilizada para a anlise
de misturas complexas de protenas extradas de clulas, tecidos ou
158
outras amostras biolgicas. Esse mtodo permite separar protenas de
acordo com duas propriedades independentes, em duas etapas distin-
tas (OFARRELL, 1975). Inicialmente, h separao de protenas de
acordo com seu ponto isoeltrico (pI), etapa conhecida como primeira
dimenso ou focalizao isoeltrica (IEF, do ingls isoelectric focu-
sing); posteriormente, as protenas so separadas de acordo com suas
massas moleculares por eletroforese em gel de poliacrilamida con-
tendo dodecil sulfato de sdio (SDS-PAGE, do ingls Sodium Dodecyl
Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis), etapa essa conhecida
como segunda dimenso (Figura 4). Dessa forma, pequenos pontos
ou spots aparecem no gel, cada um deles potencialmente correspon-
dendo a uma nica forma de uma protena. Uma caracterstica mar-
cante de 2-DE a capacidade de separar de centenas a milhares de pro-
tenas em uma amostra, podendo gerar informaes como pI, massa
molecular aparente e a quantidade relativa de cada protena. Aps a
separao e gerao desses dados, os spots podem ser identicados
por diferentes tcnicas de espectrometria de massa.
Outras caractersticas inerentes tcnica de 2-DE incluem a detec-
o de modicaes ps transcricionais e ps-traducionais, que no
podem ser preditas a partir de sequncias genmicas.
159
Figura 4. Eletroforese bidimensional de protenas de razes de algodoeiro.
Horizontalmente as protenas foram separadas levando em conta a variao
de carga pI intrnseca de cada protena, o que depende da composio dos
aminocidos carregados positivamente ou negativamente. Verticalmente, as
protenas foram separadas por massa, caracterstica que considera todos os
aminocidos que constituem a protena.
Imagem: Dr. Thales Lima Rocha.
Preparao de amostras
O preparo de amostras para 2-DE essencial para aumentar a reso-
luo e representatividade dos spots derivados de misturas comple-
xas (ROCHA et al., 2005). Devido grande diversidade das protenas,
160
a otimizao do preparo de amostras deve ser feita empiricamente.
Idealmente, o processo resultar em completa solubilizao, desa-
gregao, desnaturao e reduo das protenas na amostra. Dilises,
precipitaes (usualmente utilizando cido tricloroactico TCA) e
(ou) tratamentos com nucleases podem ser utilizadas para aumentar
a qualidade dos gis bidimensionais, evitando a presena de cidos
graxos, sais, metablitos secundrios e cidos nucleicos como interfe-
rentes. Alguns cuidados especiais devem ser levados em considerao
quando amostras ricas em protenas hidrofbicas com baixa abundn-
cia ou com valores extremos de pI e (ou) massa molecular so anali-
sadas. Recentemente, mtodos alternativos foram desenvolvidos para
contornar essas limitaes, como adio de detergentes para solubili-
zar amostras muito hidrofbicas, mtodos de extrao diferencial de
protenas e faixas contendo pH extremos.
Focalizao isoeltrica
A focalizao isoeltrica (IEF, do ingls Isoelectric Focusing) um
mtodo eletrofortico que separa as protenas de acordo com seus
pontos isoeltricos. Na IEF, os gradientes so normalmente imobili-
zados em tiras contendo um intervalo especco de pH (por exemplo,
pH 3-10, pH 4-7). As protenas so molculas anfotricas, podendo
ter carga positiva, negativa ou igual zero, dependendo do pH do
meio. A carga lquida de uma protena pode ser calculada pela soma
de todas as cargas positivas e negativas dos grupos laterais dos res-
duos de aminocidos e extremidades amino- e carboxi-terminais. O
ponto isoeltrico o pH especco onde carga lquida da protena
zero. Protenas so carregadas positivamente em pH abaixo do seu
pI e negativamente carregadas em pH acima do pI.
A presena de um gradiente de pH essencial para a tcnica de IEF.
Em um gradiente de pH e sob inuncia de um campo eltrico, as
protenas movem-se para a posio onde sua carga ser igual zero.
Dessa forma, uma protena com carga positiva migrar na direo do
ctodo, tornando-se progressivamente menos positiva ao mover-se
pelo gradiente, at chegar ao seu prprio pI. Inversamente, uma prote-
na com carga negativa migrar para o nodo, at atingir a carga zero.
Se uma protena difunde de seu pI, ela imediatamente adquire uma
161
carga, migrando novamente para a faixa de pH correspondente ao pI.
Esse o efeito focalizador da IEF, concentrando protenas em seus
respectivos pIs, permitindo separ-las por diferenas de carga nmas.
Para aplicar as amostras nessa primeira dimenso, recomend-
vel quanticar por mtodos como Bradford, Lowry ou BCA e vericar
integridade das molculas utilizando SDS-PAGE. Adicionalmente,
o mtodo de colorao a ser utilizado deve levar em considerao a
complexidade (extratos proteicos ou protenas puricadas) e a quan-
tidade da amostra.
Segunda dimenso (SDS-PAGE )
Aps a IEF, as tiras so posicionadas sobre um gel de poliacrilamida
contendo o detergente SDS. Dessa forma, as protenas so separadas
de acordo com sua massa molecular. O gel, constitudo de polmeros
de acrilamida com N-metil-bis-acrilamida, permite escolha da porosi-
dade da malha. Assim, o poder de resoluo do SDS-PAGE selecio-
nado pela porcentagem de acrilamida contida no gel. De uma forma
geral, gis contendo uma determinada porcentagem contnua de acri-
lamida oferecem uma resoluo eciente para protenas presentes em
uma faixa especca de tamanho. Entretanto, quando um gradiente
de concentrao de acrilamida utilizado, o intervalo de separao
maior. A escolha de um ou outro mtodo est diretamente relacionada
ao tipo de amostra a ser analisada.
Mtodos de colorao de gis
Os mtodos mais comuns de colorao de gis so aqueles que uti-
lizam Coomassie Brilliant Blue ou nitrato de prata, que diferem em
relao sensibilidade de deteco. Enquanto a colorao com nitrato
de prata oferece um poder de deteco cerca de 50 vezes maior que
Coomassie Brilliant Blue, essa tcnica laboriosa e de relativa baixa
reprodutibilidade. Entretanto, outras estratgias, como eletroforese
em gel diferencial (DIGE, do ingls Differencial Gel Electrophoresis),
empregam marcaes uorescentes, podendo-se analisar mais de
uma amostra em um nico gel, comparando-se diferenas de expres-
so gnica e abundncia relativa de protenas. Marcaes contendo
162
radioatividade como 35P, 14C, 3H e 32P podem ser feitas in vivo e
possuem alta capacidade de deteco por autoradiograa.
Espectrometria de massa
A espectrometria de massa (MS, do ingls Mass Spectrometry)
uma ferramenta amplamente utilizada para identicao de prote-
nas, podendo caracterizar ainda modicaes ps-traducionais, assim
como interaes protena-protena e formao de complexos.
As protenas a serem identicadas podem ser inicialmente sepa-
radas eletroforeticamente (protemica top-down) ou cromatograca-
mente (bottom-up ou mudpit). Utilizando-se hidrlise enzimtica des-
sas protenas, comumente utilizando tripsina, possvel identic-las
por um perl de digesto ou impresso digital de peptdeos (PMF,
do ingls Peptide Mass Fingerprinting) utilizando MS ou sequencia-
mento de novo via tandem MS (MS/MS).
Para a gerao desses dados, dois tipos de ionizao so mais
comumente utilizados: aqueles do tipo MALDI (matrix-assisted laser
desorption/ionization) e ionizao do tipo eletrospray (ESI). No pri-
meiro caso, as amostras so cocristalizadas com molculas pequenas
de cidos orgnicos em placas metlicas, seguindo-se dessoro e
ionizao por pulsos intensos e curtos de uma fonte de laser. Na ESI,
peptdeos em soluo acdica so dispersos por um spray e a soluo
em gotculas evapora, deixando os peptdeos ionizados.
Os analisadores de massa mais empregados em estudos protemi-
cos so os baseados em tempo de voo (TOF, do ingls time of ight),
quadrupolo, ion trap (IT) e Fourier transform ion cyclotron (FTIC),
apresentando interfaces ou com MALDI ou com ESI. Cada um des-
ses analisadores possui caractersticas especcas, podendo ser utili-
zados dois ou mais analisadores de massa em um mesmo aparelho,
possibilitando separar ons de acordo com sua razo massa/carga.
Finalmente, um detector utilizado para registrar o nmero de ons
que emergem de um analisador.
Os dados gerados por espectrometria so confrontados com ban-
cos de dados computacionais, como NCBI e Swiss-Prot, que contm
milhares de sequncias peptdicas e nucleotdicas, que podem ser
convertidas em sequncias de aminocidos.
163
Metabolmica
Metabolmica a cincia que estuda o metaboloma, denido como
o conjunto total de metablitos de um indivduo em condies espe-
ccas. Essas molculas podem atuar como precursores de importan-
tes rotas metablicas, bem como substratos, inibidores ou ativadores
alostricos de diferentes enzimas. De uma forma geral, os metabli-
tos so divididos em duas classes: primrios e secundrios, cuja com-
posio varia enormemente conforme as condies genticas, sio-
lgicas e ambientais.
Os metablitos primrios so encontrados dissolvidos no citosol de
qualquer clula, estando envolvidos nas principais rotas metablicas.
Entre esses, esto os aminocidos, nucleotdeos, lipdeos, carboidratos
e seus derivados fosforilados, alm de um grande nmero de cidos
mono-, di- e tricarboxlicos. So molculas altamente polares ou car-
regadas eletricamente, solveis em gua e presentes nas clulas em
pequenas concentraes (entre milimolar e micromolar).
Existe outro grupo de pequenas biomolculas que, ao contrrio dos
metablitos primrios, so especcas de certos tipos de clulas ou
organismos. Essas molculas so comumente chamadas de metab-
litos secundrios (DIXON, 2001). Os principais grupos de metab-
litos secundrios so os alcaloides, terpenos, taninos, avonoides e
glicosdeos (HALL, 2006). Os alcaloides so bases nitrogenadas com
grande variao na estrutura molecular. Possuem sabor amargo e pH
alcalino quando em soluo. Nas plantas, tm funo de regulao do
crescimento e de proteo. Os terpenos so molculas de estrutura
cclica, tambm conhecidos como leos essenciais. Eles so volteis
e por isso so responsveis pelos odores dos vegetais.
Quanto ao nmero de tomos de carbono, podem ser classicados
como mono, sesqui, di e triterpenos. Nas plantas, possuem funes
como estimular polinizao por insetos, proteo contra patgenos
etc. Os taninos so compostos fenlicos (poli fenis) de estrutura vari-
vel. Apresentam atividade adstringente, ou seja, precipitam prote-
nas. Nos vegetais, tm funo de proteo. Os avonoides so hete-
rosdeos contendo uma poro acar (diferente da glicose) ligada a
uma poro no-glicdica (aglicnio), que, neste caso, um pigmento.
Esses compostos possuem cores de acordo com o tipo de pigmento
164
presente na molcula; como exemplo, as avonas so amarelas e os
avonoides antocinicos so azuis. Nas plantas atuam na colorao
dos rgos vegetais e na diferenciao celular. Por m, os glicosdeos
so compostos que contm um acar ligado a um aglicnio, sendo
esse a poro ativa da molcula. Possuem gosto amargo e so classi-
cados de acordo com o tipo de aglicnio. Por exemplo, em glicosdeos
alcolicos o aglicnio um lcool; os glicosdeos cianognicos libe-
ram cido ciandrico quando hidrolisados; glicosdeos esterides pos-
suem um esteride como aglicnio; glicosdeos antraquinnicos pos-
suem antraquinona como aglicnio etc. Nos vegetais, a funo varia
de acordo com a poro no-glicdica (MARASCHIN; VERPOORTE,
1999; ZHANG et al., 2003).
Metaboloma, metabolmica, metabolic profiling e
engenharia de metabolismo
A metabolmica, em virtude do seu objetivo de estudar a composi-
o metablica, no utiliza parmetros, mas sim os determina. Aps
serem determinados, o metabolic proling os utiliza (ROBERTSON,
2005; WECKWERTH; MORGENTHAL, 2005). A linha que divide
essas duas plataformas geralmente muito tnue. Tcnicas como a
Ressonncia Magntica Nuclear de biouidos ou a Espectrometria de
Massa de biouidos so utilizadas para os dois propsitos. No entanto,
o que se sabe acerca do biouido e o conhecimento prvio de parme-
tros a serem analisados que vai denir se a anlise se enquadra na
metabolmica ou no metabolic proling.
Aps a descoberta dos metablitos de uma amostra qualquer e
a identicao de algum composto de interesse (farmacutico, por
exemplo), possvel iniciar os estudos de engenharia de metabolismo
(Figura 5). Tais estudos primam por identicar os genes e as rotas
metablicas desses compostos, visando aumentar ou diminuir a sua
produo. Alm disso, a engenharia de metabolismo pode ser aplicada
na modicao gentica de outro organismo, para que este possa pro-
duzir o metablito em questo (AHARONI et al., 2005).
165
Escolha do organismo
Fracionamento
Converso de
Preparo da
amostra
Pr-
fracionamento
Anlise estatstica
Identificao dos genes e rotas metablicas envolvidos
na produo de metablitos especficos
1
2
3
4
5
6
7
Figura 5. Esquema bsico de anlise metablica de plantas.
Fonte: adaptado de Fukusaki e Kobayashi (2005).
Muitas amostras, antes de serem analisadas, necessitam de um
pr-fracionamento, que tem por finalidade agrupar os compos-
tos de acordo com suas caractersticas moleculares utilizando dife-
rentes solventes (WANT et al., 2006). O ponto mais crtico desse
pr-fracionamento a escolha do solvente usado para a separao
(FUKUSAKI; KOBAYASHI, 2005). Deve-se prestar muita ateno
nas possveis interferncias que esse solvente pode causar nos equi-
pamentos de anlise, assim como nas possveis reaes indesejadas
que podem ocorrer entre o solvente e a amostra, produzindo novos
compostos (ROBERTSON et al., 2000; BECKWITH-HALL et al., 2002;
ROBERTSON, 2005; WANT et al., 2006).
Embora qualquer ferramenta que permita mensurar os metab-
litos possa ser usada na metabolmica, a Espectrometria de Massa
(MS) acoplada a Cromatograa lquida, Cromatograa Gasosa ou
Eletroforese Capilar, juntamente com a Ressonncia Magntica
Nuclear (RMN), so as mais utilizadas (NICHOLSON et al., 1999;
166
FIEHN, 2002; REO, 2002; LINDON et al., 2003, 2004; NICHOLSON;
WILSON, 2003; WECKWERTH, 2003; BINO et al., 2004; FERNIE
et al., 2004; GOODACRE et al., 2004; ROBERTSON, 2005;
WECKWERTH; MORGENTHAL, 2005). A MS muito mais sens-
vel do que a RMN, muito embora isso nem sempre represente uma
vantagem. Essa maior sensibilidade implica em uma menor reprodu-
tibilidade da anlise no mesmo equipamento ou em equipamentos
equivalentes (FUKUSAKI; KOBAYASHI, 2005; ROCHFORT, 2005;
WECKWERTH; MORGENTHAL, 2005; WILSON et al., 2005). Uma
variao da RMN, conhecida como Magic Angle Spinning (MAS),
permite a anlise direta de tecidos, no necessitando das etapas de
extrao e pr-fracionamento. Entretanto essa tcnica necessita de
equipamentos especiais e recursos humanos altamente qualicados,
acabando por limitar seu uso (STRAUS, 2004). Devido a essas pecu-
liaridades, a maioria dos grupos de pesquisa voltados aos estudos de
metabolmica est usando tanto os equipamentos associados a MS
quanto os associados a RMN (ROBERTSON, 2005).
Aps todos os passos de fracionamento, faz-se necessria a con-
verso dos valores obtidos por diferentes equipamentos para uma
unidade padro. Contudo, isso nem sempre fcil, ainda mais se
forem utilizados muitos passos para o fracionamento (FUKUSAKI;
KOBAYASHI, 2005; ROBERTSON, 2005; ROCHFORT, 2005). Dados
obtidos por cromatograas, eletroforeses ou mesmo RMN necessi-
tam ser convertidos em uma linguagem digital que possa ser utili-
zada em anlises multivariadas utilizando ferramentas estatsticas
(FIEHN, 2002; DURAN et al., 2003; STEUER et al., 2003; FUKUSAKI;
KOBAYASHI, 2005; MUNGUR et al., 2005; ROBERTSON, 2005;
ROCHFORT, 2005; WECKWERTH; MORGENTHAL, 2005).
A escolha do tipo de anlise estatstica a ser utilizada nos dados obti-
dos pelas tcnicas de fracionamento varia de acordo com a estrutura dos
dados e da inteno da anlise. Entretanto, a Anlise de Componente
Principal (ACP) a mais utilizada na metabolmica (NICHOLLS et al.,
2001; NICHOLSON et al., 2002). Essa anlise til para se reduzir gru-
pos de dados muito grandes e identicar sinais importantes nesses
grupos, sobretudo se o fracionamento no foi bem sucedido. A partir
de uma srie de clculos conhecidos por anlise dos vetores de Eigen,
167
a ACP permite identicar os compostos mais abundantes e, a partir
disso, visualizar as diferenas dentro da amostra e agrupar os compos-
tos hierarquicamente (FUKUSAKI; KOBAYASHI, 2005).
Associando-se todo esse conhecimento gerado pela metabolmica
queles obtidos pelas outras micas, possvel determinar quais so
as rotas metablicas e os genes que possivelmente estejam envolvi-
dos na produo dos compostos de maior destaque. Essa integrao
entre as diferentes plataformas tecnolgicas chamada de Biologia
de Sistemas.
Aplicabilidade da metabolmica
As informaes obtidas pela metabolmica, assim como aquelas
obtidas pelo metabolic proling, tm sido frequentemente usadas
em pesquisas de diversas reas. Exemplos especcos para indicar o
alcance dessa tecnologia incluem a correlao entre pers metabli-
cos dos biouidos e doenas em animais, na inuncia da dieta no
padro metablico do indivduo, na investigao dos efeitos causados
pela insero de um gene em um organismo transgnico, entre outras
(BRINDLE et al., 2003; FUKUSAKI; KOBAYASHI, 2005; GIBNEY
et al., 2005; ROBERTSON, 2005; ROCHFORT, 2005; WECKWERTH;
MORGENTHAL, 2005).
Farmacologia
A metabolmica tem uma gama de aplicaes na rea farmacu-
tica, tendo grande destaque as pesquisas para seleo de frmacos
efetivos e seguros, a identicao de marcadores biolgicos de toxi-
cidade e doenas e o entendimento dos mecanismos de toxicidade
(ROBERTSON, 2005).
Certamente, a maior parte do esforo em prol da utilizao da meta-
bolmica para esse m realizada pelo Consrcio de Metabolmica
aplicada a Toxicologia (Comet). Esse consrcio visa montar um banco
de dados com milhares de espectros de RMN utilizando biouidos
de animais tratados com toxinas modelo. Esse grupo formado pela
Imperial College de Londres e mais seis companhias farmacuticas
que investem milhes de dlares na seleo e produo de frmacos.
168
Nutrio
Assim como na farmcia, a metabolmica tem varias aplicaes na
rea nutricional. Como a dieta inuencia diretamente no desenvol-
vimento do indivduo, a metabolmica possibilita conhecer os arran-
jos e desarranjos metablicos causados pela alimentao (GERMAN
et al., 2005). Dessa forma, o papel que os componentes alimentares
desempenham na sade e na doena, assim como os efeitos causados
pela falta ou excesso de determinados nutrientes podem muito bem
ser conhecidos pela metabolmica (WATKINS et al., 2001; GERMAN
et al., 2003).
Ecologia e evoluo
Outro campo de notria aplicabilidade da metabolmica a ecolo-
gia (ROBERTSON, 2005; ROCHFORT 2005). A utilizao dessa pla-
taforma nos estudos com vegetais tem sido constante nos ltimos
anos. A realizao desses estudos visa entender, sobretudo, o meca-
nismo de ao de compostos bioativos e a diferenciao de varieda-
des selvagens daquelas modicadas geneticamente (OTT et al., 2003;
FUKUSAKI; KOBAYASHI, 2005; MUNGUR et al., 2005; RISCHER,
H.; OKSMAN-CALDENTEY, 2006).
Outra aplicao da metabolmica na botnica reside no entendi-
mento da relao planta-patgeno. Ao serem parasitadas por inse-
tos ou nematoides, por exemplo, as plantas produzem e liberam
uma srie de compostos como fenis, terpenos ou alcaloides. Esse
aumento de produo induzido pelo contato com sinalizadores qu-
micos oriundos dos patgenos. Contudo, apesar de todas as plantas
reagirem ao parasitismo, nem todas produzem os metablitos neces-
srios para o controle do patgeno. Dessa forma, a metabolmica pode
ser aplicada na identicao dos metablitos diferenciais entre varie-
dades resistentes e susceptveis a uma determinada praga. Esse tipo
de trabalho j largamente efetuado a nvel transcriptmico e pro-
temico. Entretanto, em se tratando de metabolmica, isso j bem
mais incomum (FORST, 2006).
169
Consideraes finais
Devido ao grande avano das modernas tecnologias de deteco, iso-
lamento e quanticao em larga escala de genes, transcritos, prote-
nas e metablitos, cujos estudos so organizados em micas (gen-
mica, transcriptmica, protemica e metabolmica) e da capacidade
de armazenamento e anlise de dados pela bioinformtica (BINNECK,
2004), j possvel formar uma viso ampla de toda malha bioqumica
de interao, sinalizao, regulao e converso metablica, que per-
meia os mecanismos moleculares, processos bioqumicos e siologia
celular, considerando cada mica.
Mais recentemente, surgiu um novo conceito cientco cunhado
como Biologia Sistmica ou Biologia de Sistemas (do ingls Systems
Biology), que objetiva compreenso funcional abrangente devido
integrao das cincias micas. Idealizada como a sobreposio de
dados de transcriptmica, protemica, metabolmica, glicmica
(todos carboidratos de uma clula) e lipidmica (conjunto completo
de lipdeos), a Biologia Sistmica opera numa viso holstica sobre
os fenmenos biolgicos. Dessa forma, espera-se que os complexos
fenmenos biolgicos sejam desvendados profundamente, gerando
novas aplicaes biotecnolgicas em prol da sade humana, maior
qualidade de vida e uso sustentvel dos recursos naturais.
Referncias
AHARONI, A.; JONGSMA, M. A.; BOUWMEESTER, H. J. Volatile science?
Metabolic engineering of terpenoids in plants. Trends in Plant Science, v. 10, n. 12,
p. 594-602, 2005.
BECKWITH-HALL, B. M.; HOLMES, E.; LINDON, J. C.; GOUNARIDES, J.;
VICKERS, A.; SHAPIRO, M.; NICHOLSON, J. K. NMR-based metabonomic
studies on the biochemical effects of commonly used drug carrier vehicles in the
rat. Chemical Research in Toxicology, v. 15, p. 1136-1141, 2002.
BINNECK, E. As micas: integrando a bioinformao. Biotecnologia Cincia &
Desenvolvimento, v. 1, n. 32, p. 28-37, 2004.
BINO, R. J.; HALL, R. D.; FIEHN, O.; KOPKA, J.; SAITO, K.; DRAPER, J.;
NIKOLAU, B. J.; MENDES, P.; ROESSNER-TUNALI, U.; BEALE, M. H. Potential
of metabolomics as a functional genomics tool. Trends in Plant Science, v. 9,
p. 418-425, 2004.
170
BRINDLE, J. T.; NICHOLSON, J. K.; SCHOFIELD, P. M.; GRAINGER, D.
J.; HOLMES, E. Application of chemometrics to 1H NMR spectroscopic data
to investigate a relationship between human serum metabolic proles and
hypertension. The Analyst, v. 128, p. 32-36, 2003.
CORDEIRO, M. C. R. Engenharia gentica: conceitos bsicos, ferramentas e
aplicaes. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2003. 43 p. (Embrapa Cerrados.
Documentos, 86).
DIXON, R. A. Natural products and plant disease resistance. Nature, v. 411,
p. 843-847, 2001.
DURAN, A. L.; YANG, J.; WANG, L.; SUMNER, L. W. Metabolomics spectral
formatting, alignment and conversion tools (MSFACTs). Bioinformatics, v. 19,
p. 2283-2293, 2003.
FERNIE, A. R.; TRETHEWEY, R. N.; KROTZKY, A. J.; WILLMITZER, L. Metabolite
proling : From diagnostics to systems biology. Natural Review of Molecular Cell
Biology, v. 5, p. 763-769, 2004.
FIEHN, O. Metabolomicsthe link between genotypes and phenotypes. Plant
Molecular Biology, v. 48, p. 155-171, 2002.
FORST, C. V. Hostpathogen systems biology. Drug Discovery Today, v. 11, n. 6,
p. 220-227, 2006.
FUKUSAKY, E.; KOBAYASHI, A. Plant metabolomics: potential for practical
operation. Journal of Bioscience and Bioengineering, v. 100, n. 4, p. 347-354, 2005.
GERMAN, J. B.; ROBERTS, M. A.; WATKINS, S. M. Genomics and metabolomics
as markers for the interaction of diet and health: lessons from lipids. Journal of
Nutrition, v. 133, n. 2078-2083, 2003.
GERMAN, J. B.; WATKINS, S. M.; FAY, L. B. Metabolomics in practice: emerging
knowledge to guide future dietetic advice toward individualized health. Journal of
the American Dietetic Association, v. 105, p. 1425-1432, 2005.
GIBNEY, M. J.; WALSH, M.; BRENNAN, L.; ROCHE, H. M.; GERMAN, B.; VAN
OMMEN, B. Metabolomics in human nutrition: opportunities and challenges. The
American Journal of Clinical Nutrition, v. 82, p. 497-503, 2005.
GOODACRE, R.; VAIDYANATHAN, S.; DUNN, W. B.; HARRIGAN, G. G.; KELL,
D. B. Metabolomics by numbers: Acquiring and understanding global metabolite
data. Trends in Biotechnology, v. 22, p. 245-252, 2004.
GUBLER, U.; HOFFMAN, B. J. A simple and very efcient method for generating
cDNA libraries. Gene, v. 25, p. 263-269, 1983.
HALL, R. D. Plant metabolomics: from holistic hope, to hype, to hot topic. New
Phytologist, v. 169, p. 453-468, 2006.
171
KULESH, D. A.; CLIVE, D. R.; ZARLENGA, D. S.; GREENE, J. J. Identication of
interferon-modulated proliferation-related cDNA sequences. Proceedings of the
National Academy of Sciences, v. 84, p. 8453-8457, 1987.
LASHKARI, D. A.; DeRISI, J. L.; McCUSKER, J. H.; NAMATH, A. F.; GENTILE,
C.; HWANG, S. Y.; BROWN, P.O.; DAVIS, R. W. Yeast microarrays for genome
wide parallel genetic and gene expression analysis. Proceedings of the National
Academy of Sciences, v. 94, p. 13057-13062, 1997.
LIANG, P.; PARDEE, A. B. Differential display of eukaryotic messenger RNA by
means of the polymerase chain reaction. Science, v. 257, p. 967-971, 1992.
LINDON, J. C.; HOLMES, E.; NICHOLSON, J. K. Metabolomics and its role in
drug development and disease diagnosis. Expert Review of Molecular Diagnosis,
v. 4, p. 189-1999, 2004.
LINDON, J. C.; HOLMES, E.; NICHOLSON, J. K. So whats the deal with
metabonomics? Analitical Chemistry, v. 75, p. 384-391, 2003.
MARASCHIN, M.; VERPOORTE, R. Engenharia do metabolismo secundrio.
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento, v. 23, p. 24-28, 1999.
MUNGUR, R.; GLASS, A. D. M; GOODENOW, D. B.; LIGHTFOOT, D. A.
Metabolite ngerprinting in Nicotiana tabacum altered by the Escherichia coli
glutamate desidrogenase gene. Journal of Biomedicine and Biotechnology, v. 2,
p. 198-214, 2005.
NICHOLLS, A. W.; HOLMES, E.; LINDON, J. C.; SHOCKCOR, J. P.; FARRANT, R.
D.; HASELDEN, J. N.; DAMMENT, S. J.; WATERFIELD, C. J.; NICHOLSON, J. K.
Metabonomic investigations into hydrazine toxicity in the rat. Chemical Research
in Toxicology, v. 14, p. 975-987, 2001.
NICHOLSON, J. K.; CONNELLY, J.; LINDON, J. C.; HOLMES, E. Metabonomics:
a platform for studying drug toxicity and gene function. Nature Reviews Drug
Discovery, v. 1, p. 153-161, 2002.
NICHOLSON, J. K.; LINDON, J. C.; HOLMES, E. Metabonomics: understanding
the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via
multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica,
v. 29, p. 1181-1189, 1999.
NICHOLSON, J. K.; WILSON, I. D. Opinion: understanding global systems
biology: metabonomics and the continuum of metabolism. Natural Review of Drug
Discovery, v. 2, p. 668-676, 2003.
OTT, K. H; ARANIBAR, N.; SINGH, B.; STOCKTON, G. W. Metabonomics
classies pathways affected by bioactive compounds. Articial neural network
classication of NMR spectra of plant extracts. Phytochemistry, v. 62, n. 6,
p. 971-985, 2003.
172
OFARRELL, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.
Journal of Biological Chemistry, v. 270, p. 4007-4021, 1975.
Reo, N.V. NMR-based metabolomics. Drug Chemical Toxicology, v. 25, p. 375-382,
2002.
RISCHER, H.; OKSMAN-CALDENTEY, K. M. Unintended effects in genetically
modied crops: revealed by metabolomics? Trends in Biotechnology, v. 24, n. 3,
p. 102-104, 2006.
ROBERTSON, D. G.; REILY, M. D.; SIGLER, R. E.; WELLS, D. F.; PATERSON,
D. A.; BRADEN, T. K. Metabonomics: evaluation of nuclear magnetic resonance
(NMR) and pattern recognition technology for rapid in vivo screening of liver and
kidney toxicants. Toxicological Science, v. 57, p. 326-337, 2000.
ROBERTSON, D. G. Metabonomics in toxicology: a review. Toxicological Sciences,
v. 85, p. 809-822, 2005.
ROCHA, T. L.; COSTA, P. H. A.; MAGALHES, J. C. C.; EVARISTO, R. G. S;
VASCONCELOS, E. A. R.; COUTINHO, M. V.; PAES, N. S.; SILVA, M. C. M.;
GROSSI-DE-S, M. F. Eletroforese bidimensional e anlise de proteomas. Braslia,
DF: Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, 2005. 12 p. (Embrapa Recursos
Genticos e Biotecnologia. Comunicado Tcnico, 136).
ROCHFORT, S. Metabolomics Reviewed: a new omics platform technology for
systems biology and implications for natural products research. Journal of Natural
Products, v. 68, n.12, p. 1813-1820, 2005.
SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular cloning. 2nd ed. New
York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
SANGER, F.; COULSON, A. R. A rapid method for determining sequences in
DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal Molecular Biology, v. 94,
p. 3, p. 441-448, 1975.
SARGENT, T. D.; DAVID, I. B. Differential gene expression in the gastrula of
Xenopus laevis. Science, v. 222, p. 135-139, 1983.
SCHENA, M.; SHALON, D.; DAVIS, R. W.; BROWN, P. O. Quantitative
monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.
Science, v. 270, p. 467-470, 1995.
SMITH, L. M.; FUNG, S.; HUNKAPILLER, M. W.; HUNKAPILLER, T. J.; HOOD,
L. E. The synthesis of oligonucleotides containing an aliphatic amino group at
the 5 terminus: synthesis of uorescent DNA primers for use in DNA sequence
analysis. Nucleic Acids Researches, v. 13, n. 7, p. 2399-412, 1985.
SMITH, L. M.; SANDERS, J. Z.; KAISER, R. J.; HUGHES, P.; DODD, C.;
CONNELL, C. R.; HEINER, C.; KENT, S. B.; HOOD, L. E. Fluorescence detection
in automated DNA sequence analysis. Nature, v. 321, n. 6071, p. 674-679, 1986.
173
SOUTHERN, E. M. Detection of specic sequences among DNA fragments
separated by gel electrophoresis, Journal of Molecular Biology, v. 98, p. 503-517,
1975.
STEUER, R.; KURTHS, J.; FIEHN, O.; WECKWERTH, W. Observing and
interpreting correlations in metabolomic networks. Bioinformatics, v. 19, n. 8,
p. 1019-1026, 2003.
STRAUS, S.K. Recent developments in solid-state magic-angle spinning, nuclear
magnetic resonance of fully and signicantly isotopically labelled peptides and
proteins. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B,
Biological sciences, v. 359, n. 1446, p. 997-1008, 2004.
TIMBERLAKE, W. E. Developmental gene regulation in Aspergillus nidulans.
Developmental Biology, v. 78, p. 497-510, 1980.
VELCULESCU, V. E.; ZHANG, L.; VOGELSTEIN, B.; KINZLER K. W. Serial
analysis of gene expression. Science, v. 270, n. 5235, p. 484-487, 1995.
WANT, E. J.; OMAILLE, G.; SMITH, C. A.; BRANDON, T. R.; URITBOONTHAI,
C. Q.; TRAUGER, S. A.; SIUZDAK, G. Solvent-dependent metabolite distribution,
clustering, and protein extraction from serum proling with mass spectrometry.
Analytical Chemistry, v. 78, p. 743-752, 2006.
WATKINS, S. M.; HAMMOCK, B. D.; NEWMAN, J. W.; GERMAN, J. B. Individual
metabolism should guide agriculture toward foods for improved health and
nutrition. American Journal of Clinical Nutrition, v. 74, p. 283-286, 2001.
WECKWERTH, W. Metabolomics in systems biology. Annual Review of Plant
Biology, v. 54, p. 669-689, 2003.
WECKWERTH, W.; MORGENTHAL, K. Metabolomics: from patterns recognition
to biological interpretation. Drug Discovery Today: Targets, v. 10, n. 22,
p. 1551-1558, 2005.
WESTERMEIER, R.; NAVEN, T. Proteomics in practice: a laboratory manual of
proteome analysis. Weinheim: Wiley-VCH, 2002.
WILSON, I. D.; PLUMB, R.; GRANGER, J.; MAJOR, H.; WILLIAMS, R.; LENZ,
E. M. HPLC-MS-based methods for the study of metabonomics. Journal of
chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences,
v. 817, p. 67-76, 2005.
ZIMMERMANN, C. R.; ORR, W. C.; LECLERC, R. F.; BARNARD, E. C.;
TIMBERLAKE, W. E. Molecular cloning and selection of genes regulated in
Aspergillus development. Cell, v. 21, p. 709-715, 1980.
ZHANG, Q.; ZHAO, Y.; WANG, B.; TU, G. New Triterpenoid Saponins from
Stelmatocrypton khasianum. Chemical & pharmaceutical bulletin, v. 51, n. 5,
p. 574-578, 2003.
Captulo 6
175
Metagenmica: princpios
e aplicaes
Marco Aurlio Caldas de Pinho Pessoa Filho
Introduo
O primeiro genoma microbiano sequenciado por completo foi
o do patgeno Haemophilus influenzae (FLEISCHMANN et al.,
1995). Nesse mesmo ano, o genoma de outro patgeno humano
Mycoplasma genitalium tambm foi publicado (FRASER et al., 1995).
Desde ento, dados genmicos tm sido gerados de forma exponen-
cial para centenas de microrganismos. O sucesso na realizao de pro-
jetos genoma dos mais diversos organismos de interesse biotecnol-
gico evidenciado pela elevada quantidade de informaes presentes
em bancos de dados genmicos pblicos, disponveis online. Uma
consulta ao banco Entrez Genome, pertencente ao National Center for
Biotechnolgy Information (NCBI), demonstra que existem informa-
es armazenadas sejam elas sobre genomas, cromossomos com-
pletos, mapas de sequncia com contigs, ou mapas genticos e fsicos
integrados sobre 6.527 espcies. Considerando-se somente geno-
mas microbianos, uma busca no banco Entrez Genome Project lista
mais de 1.000 projetos j completos, de organismos pertencentes aos
mais variados grupos microbianos.
Para aqueles organismos cujo genoma completo j foi obtido, uma
srie de produtos e ferramentas resultantes do esforo de sequencia-
mento de DNA pode ser desenvolvida com maior rapidez. A poste-
rior montagem genmica e anotao gnica e a integrao entre mapa
fsico e mapas genticos, permitem a elaborao e o teste de hip-
teses visando comparao entre dados genotpicos e fenotpicos.
Estratgias como a genmica comparativa e estudos de sintenia per-
mitem que conhecimento baseado em experimentos prvios possa ser
transferido para novos genomas, e que ferramentas criadas como
o desenvolvimento de marcadores moleculares possam ser aplica-
das em organismos evolutivamente prximos, para os quais pouco
176
conhecimento acerca de genmica tenha sido gerado. Dessa forma,
nos casos em que as bases sobre a compreenso do genoma j esto
em fase avanada, possvel mudar o foco das iniciativas de estudo:
esforos em sequenciamento e (ou) genotipagem teriam como obje-
tivo a predio de caractersticas de interesse, a m de se compreen-
der a sua base gentica (TRINGE; RUBIN, 2005). A quantidade de
informao armazenada e disponvel para consulta em bancos de
dados signicativa.
Historicamente, os projetos genoma focaram em organismos pos-
suidores de uma caracterstica distinta, que vai alm do prprio inte-
resse cientco ou econmico na espcie: a facilidade em se obter
amostras biolgicas como o caso de animais e plantas e, no caso
de microrganismos, daqueles que poderiam ser facilmente cultiva-
dos em laboratrio (TRINGE; RUBIN, 2005). Isso ca claro a partir
da constatao de que a maioria dos genomas microbianos j publica-
dos pertence a espcies patognicas (BINNEWIES et al., 2006). Essa
tendncia reete a prpria histria da pesquisa em microbiologia e
diversidade microbiana, brevemente apresentada a seguir.
Mudanas de paradigma em diversidade microbiana
Por muitos anos, o foco de pesquisa em microbiologia estava locali-
zado na rica fonte de descobertas existentes nos microrganismos cul-
tivveis, j estabelecidos como modelo biolgico. As razes da micro-
biologia esto associadas ao advento da microscopia, com o primeiro
relato da visualizao de uma clula bacteriana datando de 1663, por
Antonie van Leeuwenhoek. Por 200 anos, o microscpio permitiu a
visualizao de bactrias heterotrcas, autotrcas, ou de parasitas
obrigatrios (HANDELSMAN, 2004).
A primeira mudana de paradigma em microbiologia surgiu com
os trabalhos de Robert Koch. A partir dos anos 1880, seus postulados e
sua inovao no desenvolvimento de meios de cultura levaram divi-
so do mundo microbiolgico em cultivvel e no cultivvel. O inte-
resse de pesquisadores foi dedicado ao estudo de bactrias mantidas
em cultura pura, gerando a considervel quantidade de informaes
contidas em livros-texto de microbiologia. Por muito tempo, micro-
biologistas ignoraram o desao de identicar e caracterizar organis-
177
Captulo 6 Metagenmica: princpios e aplicaes
mos no cultivveis. Entre os anos 1960 e 1970, tal trabalho foi deixado
nas mos de cientistas que persistiam em acumular informaes que
sugeriam que meios de cultura no capturavam o espectro completo
da diversidade microbiana (HANDELSMAN, 2004).
De fato, trabalhos de levantamento da atividade de microrganis-
mos aquticos no fotossintticos evidenciaram que grande parte do
mundo microbiano no era representada pelos organismos cultivveis
(STALEY; KONOPKA, 1985). Havia uma grande discrepncia entre os
tamanhos populacionais estimados por diferentes mtodos de quanti-
cao. Esse fenmeno cou conhecido como a grande anomalia em
contagem em placas. Era comum o relato de valores muito maiores
de clulas bacterianas por contagem microscpica direta do que por
contagem em placa de cultivo. Especulava-se que as bactrias que no
cresciam em meio de cultura no eram viveis, ou como alternativa,
que elas poderiam ser consideradas vivas, mas incapazes de crescer
sob as condies fornecidas pelo procedimento de cultivo (STALEY;
KONOPKA, 1985). Em ambientes como o solo, os valores chegavam
a 0,1 % a 1 % de bactrias presentes no ambiente que poderiam ser
cultivadas em meios de uso padro (TORSVIK et al., 1990).
Uma nova mudana de paradigma aconteceu em 1985, com um
grande avano experimental embasado no trabalho pioneiro de Carl
Woese, que demonstrou que genes do RNA ribossomal (rRNA) pode-
riam ser utilizados como ferramentas de medida de divergncia evolu-
tiva (WOESE, 1987). A anlise direta das sequncias dos genes rRNA
5S e 16S foi utilizada para a descrio da diversidade de microrganis-
mos em uma amostra ambiental, sem isolamento ou cultivo (LANE
et al., 1985). Essa metodologia cou conhecida como lotipagem. Na
poca, essa abordagem apresentava o grande desao tcnico de se
trabalhar com sequenciamento direto de RNA ou de cpias de DNA
geradas por transcriptase reversa. O desenvolvimento da tecnologia
da reao em cadeia da polimerase (PCR) e o desenho de iniciadores
que poderiam ser utilizados na amplicao do gene ribossomal ace-
leraram a descoberta de novos txons nos mais diversos ambientes
terrestres (HANDELSMAN, 2004).
A partir da, diferentes tcnicas moleculares foram implementa-
das para a utilizao do gene ribossomal bacteriano como medida de
178
diversidade logentica. A amplicao da regio 16S a partir de uma
amostra ambiental, com iniciadores conservados, foi seguida da uti-
lizao de tcnicas como eletroforese em agarose ou poliacrilamida,
eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE) (MUYZER
et al., 1993), ou eletroforese capilar. A amplicao da regio espaa-
dora entre as unidades 16S e 23S (a regio ITS) tambm foi utilizada
como medida de diversidade entre txons mais prximos, em razo
da sua maior taxa de mutao e maiores nveis de diversidade de sequ-
ncia. Essa tecnologia cou conhecida como RISA (do ingls rRNA
internal spacer analysis) (BORNEMAN; TRIPLETT, 1997). A poste-
rior fragmentao do amplicon por enzimas de restrio (ARDRA)
tambm foi implementada como ferramenta molecular de anlise
de diversidade bacteriana. A tcnica , na verdade, um tipo de RFLP,
e envolve a fragmentao por uma ou vrias enzimas de restrio
do fragmento ribossomal amplicado, seja ele 16S, 23S, ou espaador,
dependendo do tipo de aplicao desejado (REIS JUNIOR et al., 2002).
A incluso de um passo de clonagem de fragmentos de DNA
ambiental em um hospedeiro cultivvel levou ao surgimento de
uma nova linha de pesquisa em diversidade microbiana e na bio-
tecnologia de microrganismos. A anlise genmica de uma popula-
o de microrganismos surgiu como pea chave de um novo avano
na pesquisa em microbiologia. Assim, capturado para estudo e pre-
servao, DNA microbiano poderia ser utilizado na busca de infor-
maes sobre a siologia e a gentica de organismos no cultivveis
(HANDELSMAN, 2004). A esse novo insight no mundo das bactrias
no cultivveis foi dado o nome de metagenmica.
Metagenmica anlise genmica
de populaes microbianas
O primeiro relato de clonagem de DNA diretamente extrado e puri-
cado de amostras ambientais foi feito em uma anlise de comuni-
dades microbianas marinhas (SCHMIDTet al., 1991). Esse trabalho
tratava da amplicao e clonagem do gene 16S, e posterior sequen-
ciamento de clones dessa biblioteca, permitindo um levantamento
da diversidade logentica das populaes de picoplncton marinho.
179
Posteriormente, a construo de uma biblioteca metagenmica a par-
tir de uma mistura de organismos enriquecidos em gramneas res-
secadas em laboratrio permitiu a deteco de clones que expressa-
vam atividade celuloltica (HEALY et al., 1995). A partir da, estavam
embasados dois dos componentes principais da pesquisa em meta-
genmica: a anlise de diversidade microbiana da frao no cultiv-
vel de organismos e a anlise funcional de genes de organismos pre-
sentes em um ambiente de interesse, independente do cultivo desses.
O termo metagenmica foi descrito pela primeira vez por Jo
Handelsman, da Universidade de Wisconsin (EUA), a partir da suges-
to de uma srie de procedimentos para acessar o metabolismo de
microrganismos desconhecidos no solo. Seu propsito era avanar
a pesquisa em produtos naturais. Partindo do pressuposto de que a
grande maioria dos microrganismos de solo nunca foi isolada nem
cultivada em laboratrio, foi sugerido que esse ambiente poderia cons-
tituir a maior fonte de recursos intocados para a qumica de produ-
tos naturais (HANDELSMAN et al., 1998). A maneira sugerida seria
a clonagem de metagenomas a m de se acessar os genomas coleti-
vos e o maquinrio biossinttico da microbiota de solos.
Dessa forma, assim como a genmica, a metagenmica consiste
tanto de um conjunto de tcnicas de pesquisa, contendo diferen-
tes abordagens e metodologias, bem como de uma rea de pesquisa
propriamente dita. O signicado do prexo meta (alm, transcen-
dente, em grego) inclui o ideal de se superar a impossibilidade de
se isolar e avaliar a diversidade genmica da grande maioria dos
microrganismos. Por um lado, a metagenmica busca a compre-
enso da biologia em um nvel de comunidades, transcendendo
o organismo individual e focando em genes e seus efeitos na pr-
pria comunidade. Por outro, expressa a necessidade do desenvolvi-
mento de mtodos computacionais que maximizem o entendimento
da composio gentica e das atividades de comunidades por vezes
to complexas que s podem ser avaliadas por amostragem, e nunca
completamente caracterizadas (RESEARCH COUNCIL (U.S.), 2007).
Em termos prticos, as diversas abordagens que compem o que
se chama hoje de metagenmica incluem a caracterizao de comu-
nidades microbianas ou seus membros por mtodos que no depen-
180
dem de cultivo, aplicando tcnicas de anlise em alta escala (ferra-
mentas da genmica, protemica, transcriptmica, etc.)(RESEARCH
COUNCIL (U.S.), 2007).
A metagenmica difere da genmica na medida em que independe
do isolamento de um organismo em particular para posterior an-
lise de seu genoma individual. A princpio, a metagenmica poderia
acessar 100 % dos recursos genticos presentes em um ambiente,
enquanto mtodos tradicionais de cultivo e da genmica acessariam
1 % dessa diversidade. Os primeiros estudos de lotipagem respon-
diam com conana perguntas sobre quem estava presente no
ambiente amostrado, sem grandes possibilidades de responder o
que esses organismos estavam fazendo, ou seja, que funes eles
potencialmente exerciam nesses ambientes. As tcnicas aplicadas atu-
almente em metagenmica aprofundam a capacidade de avaliar ecos-
sistemas como unidades biolgicas, possuidoras dos seus prprios
mecanismos genticos, indo alm da considerao de espcies indi-
viduais. Sugere-se que a pergunta principal em projetos em metage-
nmica seja O que est sendo feito pela comunidade microbiana?
(RESEARCH COUNCIL (U.S.), 2007)..
Principais abordagens em projetos
de metagenmica
Em linhas gerais, anlises metagenmicas consistem no isola-
mento de DNA proveniente de uma amostra ambiental, fragmenta-
o e clonagem do DNA em um vetor adequado, insero dos clones
em um hospedeiro bacteriano, e screening das clulas transformadas.
Os clones podem ser avaliados quanto presena de marcadores lo-
genticos (conhecidos como ncoras), tais como o prprio gene rRNA
16S ou o gene recA, ou de outros genes conservados. Tambm podem
ser testados quanto expresso de fentipos ou caractersticas espe-
ccas, tais como atividades enzimticas ou a produo de antibiti-
cos. Por m, outra possibilidade o sequenciamento aleatrio de clo-
nes da biblioteca (HANDELSMAN, 2004). Na Figura 1, mostra-se um
organograma clssico em projetos de metagennmica.
181
Escolha de um metagenoma
Amostra
Extrao
DNA/RNA
Criar biblioteca
Depsito e
curadoria de
banco de
Avaliar diversidade :
Anlises de rRNA 16S
Fingerprinting com T-RFLP
Anlises baseadas em hibridizao
QUAIS ORGANISMOS?
O QUE ELES
ESTO FAZENDO?
Descrever ambiente
(coleta de metadados)
Projetos Genoma
Tradicionais
Projetos em
Metagenmica
Baseados em sequncia
Diagrama completo de um organismo
Bioinformtica
e Anlise
Novas tecnologias permitem
o sequenciamento sem
a construo de bibliotecas
dados
Sequenciamento
Montagem
Anotao
Gerao
de genomas
completos
Avaliar funo
Expresso de genes
em sistemas heterlogos
Deteco de clones positivos
para a funo de interesse
Sequenciamento de clones
Identificar
genes
Comparar
com outras
comunidades
Identificar
vias
metablicas
Traduzido e adaptado de: RESEARCH COUNCIL (U.S.). COMMITTEE ON METAGENOMICS: CHALLENGES AND FUNCTIONAL APPLICATIONS, 2007
Baseados em funo
Figura 1. Organograma das diferentes etapas de um projeto em metagen-
mica .
Fonte: Traduzido e adaptado de Research Council (US). Committee on Metagenomics:
Challenges and Functional Application, 2007.
Dessa forma, duas estratgias so mais frequentemente utilizadas
na busca de alvos funcionais presentes em bibliotecas metagenmi-
cas, sendo possvel dividir os estudos nos seguintes tipos de aborda-
gens: screenings baseados em anlise funcional e screenings baseados
em sequenciamento.
Uma abordagem baseada em funo gnica busca por clones que
expressam a caracterstica de interesse nas bibliotecas construdas. A
partir da seleo de clones positivos, possvel a obteno de informa-
es acerca do controle gentico da caracterstica em estudo. Isso pode
ser realizado por subclonagem e sequenciamento do fragmento meta-
genmico inserido no vetor de expresso, e posterior anotao gnica
para denio das ORFs presentes no fragmento clonado (MIRETE
et al., 2007). Uma das vantagens desse tipo de estratgia est na pos-
sibilidade de se capturar clones com potencial aplicao direta por
182
exemplo, na descoberta de enzimas de interesse biotecnolgico para
a indstria. Outra vantagem a chance de descoberta de sequncias
funcionais no descritas em estudos anteriores, com papis distintos
de biocatalisadores j conhecidos (YUN; RYU, 2005).
Por outro lado, para que os fragmentos metagenmicos inseridos
nos hospedeiros de expresso (por exemplo, E. coli) possibilitem a
deteco de clones positivos para a caracterstica de interesse na biblio-
teca, preciso que os genes contidos nos fragmentos sejam correta-
mente transcritos, traduzidos e que as enzimas sintetizadas sejam
biologicamente funcionais. Alm disso, caso a funo biolgica exija
a expresso de mltiplos genes, necessria a presena de todos os
genes da via em questo, para que esta seja identicada. Em uma situ-
ao em que centenas ou milhares de clones precisam ser avaliados,
essa estratgia exige o estabelecimento de mtodos ecientes e econ-
micos para que a avaliao seja feita em alta escala (YUN; RYU, 2005).
Os primeiros estudos que utilizaram um screening baseado em
sequncia zeram uso de hibridizao ou PCR para a deteco de
genes de interesse, tendo como referncia sequncias de DNA con-
servadas. Assim, essa estratgia no poderia ser aplicada para um
nmero grande de alvos, e tambm no garantiria a obteno de genes
completos, ou grupos gnicos necessrios para a sntese de um pro-
duto desejado. Apesar de j ter sido utilizada na descoberta de vrias
enzimas de importncia industrial, a aplicao tpica para esse tipo
de abordagem acabou sendo a amplicao de genes ribossomais em
estudos de diversidade logentica (YUN; RYU, 2005).
Estudos de sequenciamento de bibliotecas metagenmicas tm
feito uso de sequenciamento shotgun, e mais recentemente, sequen-
ciamento de nova gerao (como, por exemplo, pirosequenciamento).
Essas metodologias fornecem uma grande quantidade de informao,
desde relaes logenticas, descoberta de novos genes e deduo de
vias metablicas em bactrias no cultivveis. A quantidade de dados
leva a anlises laboriosas para as quais novos paradigmas de estudo
em bioinformtica ainda esto sendo estabelecidos.
Tanto os estudos baseados em prospeco de funo, quanto os
estudos que fazem uso de sequenciamento de DNA apresentam uma
baixa frequncia de deteco de clones positivos (to baixas quanto
183
quatro clones positivos em 930.000 clones avaliados) (HENNE et al.,
2000). Vrias estratgias foram implementadas para aumentar a eci-
ncia no screening. Entre elas, o uso de organismos hospedeiros como
Streptomyces lividnas ou Pseudomonas putida e E. coli a m de se supe-
rar as limitaes e diculdades da expresso heterloga de metabli-
tos secundrios (KOMATSU et al., 2010). Etapas de enriquecimento
de microrganismos no cultivveis que contm as caractersticas de
interesse tambm tm sido empregadas antes da construo de biblio-
tecas metagenmicas (ENTCHEVA et al., 2001).
Outra abordagem de screening (Screening de Expresso Gnica
Induzida por Substrato SIGEX, em sua sigla em ingls) foi pro-
posta como alternativa para o aumento na frequncia de deteco de
clones positivos (UCHIYAMA et al., 2005), tendo sido testada inicial-
mente na busca por genes induzidos por hidrocarbonetos aromticos
em uma biblioteca metagenmica de guas subterrneas.
Sua lgica se baseia no fato de a expresso de genes catablicos ser,
em geral, induzida por substratos ou metablitos de enzimas catabli-
cas. Alm disso, a expresso de genes catablicos controlada por ele-
mentos regulatrios em grande parte localizados em regies prximas
aos genes. Dessa forma, a tcnica detecta clones que hospedam genes
catablicos expressos na presena de substratos, e no expressos na
ausncia destes. A estratgia faz uso de um vetor (p18GFP) no qual o
stio de clonagem divide o promotor lac e o gene gfp. Aps a construo
da biblioteca metagenmica utilizando esse vetor, clones sem inserto
e clones expressando GFP constitutivamente na ausncia de substrato
so removidos por induo por IPTG. A expresso de genes catabli-
cos na biblioteca determinada pela expresso de GFP na presena
do substrato. Dessa forma, clones positivos so separados em placas
contendo gar e posteriormente caracterizados (YUN; RYU, 2005).
Evidentemente, um dos primeiros e mais importantes passos
em qualquer projeto em metagenmica o isolamento de DNA do
ambiente em estudo. No existe um nico protocolo adequado para
a extrao de DNA de todos os ambientes imaginveis. Quantidade,
pureza, integridade e representatividade do DNA aps o isolamento
so elementos-chave passveis de considerao. A extrao pode ser
realizada por lise direta ou indireta, ou seja, diretamente da amostra
184
ambiental ou aps a separao e concentrao das clulas microbia-
nas presentes na matriz ambiental (LEVEAU, 2007). O tipo de proto-
colo escolhido altamente dependente do ambiente em estudo, dada a
diferena gritante entre fatores como densidade microbiana, presena
de contaminantes ou inibidores de amplicao por PCR, por exem-
plo. Em alguns casos, um passo de puricao includo no protocolo
aps a extrao, a m de se minimizar a contaminao com substn-
cias indesejveis. Vrios kits comerciais tambm esto disponveis no
mercado, otimizados para tipos especcos de amostra.
Outros fatores que tambm devem ser levados em considerao
envolvem a representatividade microbiana na amostra de DNA extra-
do. Em alguns casos, o mtodo de extrao necessrio na obteno
de DNA de um organismo pode degradar o DNA de outro. Dessa
forma, possvel que, em algumas situaes, mais de um mtodo de
extrao deva ser utilizado na construo de uma biblioteca metage-
nmica. Alm disso, a integridade do DNA isolado vai reetir no tipo
de uso posterior desse material no uxo do projeto: procedimentos
que envolvem lise por triturao com beads tendem a fragmentar o
DNA e so mais adequados construo de bibliotecas de pequenos
insertos, como, por exemplo, para sequenciamento shotgun. Por outro
lado, protocolos de lise qumica de clulas recuperadas de plugues de
gar podem produzir fragmentos clonveis de tamanho superior a 1
milho de pares de base, adequados ao screening de ncoras logen-
ticas ou de fentipos de interesse (LEVEAU, 2007).
Projetos pioneiros
Projeto Efluente cido de Minerao
A produo de cidos a partir da oxidao de minerais sulfdicos
expostos ao ar consequncia de atividade mineradora em vrias par-
tes do mundo. As solues cidas que se formam nesses casos so
denominadas euentes cidos de minerao (EAM). Comunidades
microbianas conduzem essa acidicao, e elas foram foco de uma
importante anlise em metagenmica, com o objetivo de explorar
a distribuio e a diversidade de vias metablicas envolvidas com o
185
EAM. Exemplos dessas vias so a xao de nitrognio e a oxida-
o de enxofre e ferro. Esse estudo permitiria compreender como
microrganismos toleram ambientes altamente cidos, avaliando como
estes mecanismos de tolerncia afetam a geoqumica do ambiente
(RESEARCH COUNCIL (U.S.), 2007; TYSON et al., 2004).
A comunidade avaliada nesse tipo de ambiente estabeleceu um
paradigma de anlise em metagenmica em virtude de seu nvel de
complexidade relativamente simples: havia somente cinco principais
organismos (trs espcies bacterianas e duas espcies de Archaea) for-
mando um denso biolme no local de coleta. Isso tambm permitiu
que o ambiente fosse estudado em grande profundidade. Por causa
da baixa complexidade da comunidade microbiana, um processo de
sequenciamento shotgun do DNA do ambiente permitiu a monta-
gem quase completa de dois genomas (dos cinco presentes) e a recu-
perao parcial dos outros trs. O desao na montagem simultnea
de mltiplos genomas foi atingido por procedimentos de direciona-
mento de contigs genmicos a cada genoma especco, tendo como
base a composio de bases da sequncia e frequncia de recupera-
o (RESEARCH COUNCIL (U.S.), 2007)
A anlise de dados de sequncia por bioinformtica demonstrou
as interaes bioqumicas que poderiam ocorrer entre os membros
da comunidade microbiana, alm de evidenciar interaes genticas
em termos de recombinao e transferncia gentica lateral. Foi pos-
svel se determinar a presena de um processo de xao de nitrog-
nio ligado a uma espcie no abundante. Essa informao permitiu
que essa bactria fosse isolada em laboratrio em forma pura, a par-
tir da elaborao de mtodos de isolamento baseados em informao
de metabolismo bacteriano gerada por sequenciamento e anlises do
genoma do organismo. Foi demonstrado, ento, um dos benefcios
de estudos em metagenmica: a possibilidade de se cultivar organis-
mos previamente no cultivveis, a partir da compreenso das neces-
sidades metablicas destes microrganismos (RESEARCH COUNCIL
(U.S.), 2007).
Um dos principais motivos do sucesso e rpido avano do projeto
relacionado aos euentes cidos de minerao foi a baixa complexi-
dade da comunidade microbiana em estudo. A maioria dos conjuntos
186
microbianos na natureza no possui o mesmo nvel bsico de com-
plexidade, sendo este um caso raro a exceo, e no a regra. Para os
nveis de complexidade mais altos encontrados em outros objetos de
estudo, sabe-se que somente o sequenciamento shotgun no pode ser
utilizado com o propsito de se montar genomas microbianos com-
pletos, mesmo que essa complexidade seja moderada. Nesses casos,
outras metodologias se fazem necessrias (RESEARCH COUNCIL
(U.S.), 2007).
O Projeto Mar de Sargasso
A iniciativa de se sequenciar, em altssima escala, DNA presente
em menos de 2m
3
de gua do Mar de Sargasso (VENTER et al., 2004)
demonstrou o potencial de gerao de dados de projetos em metage-
nmica. Aproximadamente 1 Gpb de sequncia no redundante, o
que representava entre duas a trs ordens de magnitude mais dados
do que aqueles gerados pelo Projeto Genoma Humano, foi produzido.
A quantidade de informao em diversidade microbiana era sem pre-
cedentes: 148 lotipos bacterianos desconhecidos e 1.200.000 genes,
tambm desconhecidos, foram listados (LEVEAU, 2007). Somente
essa quantidade de protenas putativas era dez vezes maior do que as
sequncias presentes em todos os bancos de dados curados poca
(RESEARCH COUNCIL (U.S.), 2007). Estimou-se a presena de apro-
ximadamente 1.800 espcies na amostra, a maioria consistentes com
o que se esperava ser prevalente em oceanos.
Devido complexidade da comunidade amostrada, foi evidenciada
a diculdade em se montar contigs de grande tamanho a partir de
dados de sequenciamento shotgun de comunidades mais abundantes
em espcies. Nenhum genoma completo foi gerado no Projeto Mar
de Sargasso, e somente poucos contigs puderam ser agrupados a par-
tir da populao microbiana (RESEARCH COUNCIL (U.S.), 2007).
A contaminao amostral tambm foi um problema detectado nesse
projeto, indicando a necessidade de esforos integrados de amostra-
gem cuidadosa.
187
Projeto Resistoma do Solo
Esse projeto utilizou uma abordagem de metagenmica funcional
na busca de genes de resistncia a antibiticos presentes no solo. Em
suma, fragmentos de DNA metagenmico do solo foram clonados, e
os clones foram avaliados quanto presena de fentipos expressando
resistncia a antibiticos (DCOSTA et al., 2006). O projeto levou ao iso-
lamento de novos grupos de genes de resistncia a antibiticos. O fato
de o objeto de estudo a resistncia a antibiticos representar um
fentipo de fcil seleo foi uma das vantagens do projeto. Clones posi-
tivos crescem na presena de antibitico, sendo possvel a avaliao de
bibliotecas contendo milhes de clones. Genes de resistncia a amino-
glicosdeos, que codicam um grupo de enzimas chamadas acetiltrans-
ferases, foram descritos (RIESENFELD et al., 2004), alm de genes de
resistncia a -lactmicos (semelhantes a penicilina), distintos de enzi-
mas descritas anteriormente (RESEARCH COUNCIL (U.S.), 2007).
Aplicaes da metagenmica
A metagenmica possibilita aplicaes de ordem prtica em diferen-
tes reas, como, por exemplo, em biomedicina, agricultura, indstria
e meio ambiente. Na agropecuria, por exemplo, existe potencial no
desenvolvimento de metodologias de deteco precoce de ameaas
produo de alimentos como patologias vegetais ou animais. Em segu-
rana alimentar, pode-se monitorar e detectar contaminantes micro-
bianos nocivos. Alm disso, permite estudos que possibilitam o desen-
volvimento de estratgias e prticas que maximizam os benefcios
de comunidades microbianas agindo em conjunto com culturas de
importncia agronmica, ou animais. Na pesquisa em bioenergia, per-
mite estudos para o desenvolvimento de sistemas microbianos capazes
de processar novas fontes de bioenergia, mais sustentveis economi-
camente e ambientalmente. Ferramentas biotecnolgicas provenien-
tes de estudos em metagenmica levariam identicao e explora-
o de mecanismos metablicos microbianos gerando benefcios em
produtos industrias, alimentcios e de sade. Em meio-ambiente,
ferramentas como a biorremediao podem ser resultantes de pro-
jetos em metagenmica, a partir do desenvolvimento de tcnicas de
188
monitoramento de dano ambiental em diferentes nveis, levando a
mtodos de restaurao de ambientes com a utilizao de micror-
ganismos biorremediadores (RESEARCH COUNCIL (U.S.), 2007).
Na pesquisa em agricultura, provavelmente a maior contribuio da
metagenmica resida em estudos de comunidades microbianas pre-
sentes no solo, em associao ou no com plantas de interesse agron-
mico. Uma srie de projetos em metagenmica de solos j identicou
diversos tipos de genes de interesse, entre pigmentos, antibiticos,
enzimas lipolticas, e outros biocatalistas (DANIEL, 2005). H possibi-
lidade de aplicao da metagenmica no estudo de rizobactrias pro-
motoras do crescimento de plantas (PGPR) (LEVEAU, 2007)
No Cerrado, levantamentos de diversidade microbiana de bactrias
e fungos j foram realizados por meio do sequenciamento de bibliote-
cas 16S e 18S, respectivamente (DE CASTRO et al., 2008; QUIRINO
et al., 2009). No caso do levantamento de populaes bacterianas,
detectou-se uma maior riqueza de espcies no Cerrado sensu stricto
em relao a Cerrado convertido em pastagem. A riqueza esperada
de espcies no Cerrado sensu stricto seria 10 vezes maior do que a do
Cerrado convertido em pastagem, por meio da plotagem de linhagens
atravs do tempo (QUIRINO et al., 2009). No caso das populaes fn-
gicas, foi detectada uma reduo na diversidade de espcies, associada
a atividades antropognicas como o cultivo de soja, em comparao
com Cerrado nativo (DE CASTRO et al., 2008).
Um exemplo de uso da metagenmica em projetos envolvendo
meio-ambiente e potenciais aplicaes biotecnolgicas de recursos
genticos microbianos envolve a descoberta de mecanismos meta-
blicos relacionados com a resistncia ao excesso de nquel em uma
populao bacteriana. Populaes de bactrias da rizosfera de Erica
andevalensis (MIRETE et al., 2007), presentes em reas de oxidao de
sulfetos minerais, ricas em metais txicos e altamente cidas, foram
analisadas em termos de sua diversidade logentica, e do potencial
de expresso de genes de tolerncia ao excesso de nquel. O artigo
apresenta o primeiro relato sobre a descoberta de genes de resis-
tncia a Ni a partir de uma comunidade microbiana desse tipo de
ambiente. Genes j conhecidamente envolvidos com resistncia a
Ni foram detectados, e de um total de 13 clones positivos, 5 codica-
189
vam protenas j conhecidas, porm nunca associadas resistncia
Ni, enquanto 6 clones codicavam protenas hipotticas ou de fun-
o desconhecida. Este trabalho demonstra a possibilidade de aplica-
o de abordagens recentes em microbiologia ambiental, associando
genmica avanada em alta escala, prospeco de funo gnica, alm
da anlise em alta escala de diversidade de populaes microbianas.
Na busca de genes de interesse na produo de biocombustveis,
diversos trabalhos j foram publicados. Um deles (BRULC et al.,
2009) fez uso de pirosequenciamento, uma tecnologia de sequen-
ciamento de nova gerao que gera uma quantidade de dados maior
que o sequenciamento tradicional de Sanger, a um custo mais baixo,
permitindo estudos em altssima escala. Essa metodologia elimina
a necessidade de clonagem, partindo diretamente para o sequencia-
mento (LIU, 2009; SNYDER et al., 2009). O trabalho de Brulc e cola-
boradores tambm utilizou uma abordagem de metagenmica com-
parativa entre 3 microbiomas aderidos a bras e 1 amostra lquida.
Os microbiomas dos trs animais amostrados foram completamente
diferentes, apesar da dieta similar, quanto a sua estrutura, diversidade
logentica e potencial metablico.
Na indstria, a busca por enzimas de interesse como biocatalisado-
res tem ligado a metagenmica a aplicaes e processos industriais.
Diversos empreendimentos em biotecnologia tm sido estabeleci-
dos com o propsito de prospectar enzimas com potencial aplicao
industrial (LORENZ; ECK, 1988).
Consideraes finais
Apesar do enorme potencial de uso da metagenmica em diferen-
tes objetos de pesquisa, o conhecimento de suas limitaes permite
um uso racional de suas metodologias e um melhor planejamento
de futuros projetos. Abordagens que fazem uso de uma triagem fun-
cional dependem da expresso bem sucedida de genes clonados na
bactria hospedeira, conforme j mencionado anteriormente. Em
triagens baseadas em sequenciamento, no possvel a obteno de
genes completamente novos. Alm disso, pode ocorrer a clonagem de
genes parciais, e a seleo de genes no funcionais (DANIEL, 2005).
190
O pesquisador deve ter em mente que o valor de predio e inter-
pretao de dados em metagenmica limitado pela validade de infor-
mao presente em banco de dados. A quantidade de genes listados
com funo desconhecida enorme, e para aqueles genes com fun-
o inferida a partir de anlises de similaridade, ainda necessria
validao experimental. Nesse sentido, o progresso no cultivo de bac-
trias antes no cultivveis, a m de se obter representantes isolados
do ambiente em estudo, de extremo valor. Dessa forma, a metagen-
mica deve ser recebida como uma metodologia complementar a abor-
dagens tradicionais em testes de hiptese sobre a composio, diversi-
dade e funcionalidade de comunidades microbianas (LEVEAU, 2007).
A mudana de paradigmas de sequenciamento que tem ocorrido
nos ltimos anos tambm um fator limitante de abordagens que
geram quantidades exorbitantes de informao. Sero necessrios
avanos em bioinformtica diante da adaptao enorme quantidade
de dados de sequenciamento gerados. Em virtude da inexistncia de
pacotes para anlise global de dados, devem ser levados em conta,
em projetos de metagenmica, a complexidade da amostra e a mon-
tagem de genomas a partir de amostras complexas. Vale salientar que
todo o progresso e desenvolvimento em bioinformtica atenderam a
projetos que utilizavam a tecnologia de sequenciamento de Sanger,
sendo necessria uma renovao e adequao de processos e meto-
dologias que atendam projetos futuros (CHEN; PACHTER, 2005;
KUNIN et al., 2008; RESEARCH COUNCIL (U.S.), 2007).
Referncias
BINNEWIES, T. T.; MOTRO, Y.; HALLIN, P. F.; LUND, O.; DUNN, D.; LA, T.;
HAMPSON, D. J.; BELLGARD, M.; WASSENAAR, T. M.; USSERY, D. W. Ten
years of bacterial genome sequencing: comparative-genomics-based discoveries.
Functional and Integrative Genomics, v. 6, n. 3, p. 165-85, 2006.
BORNEMAN, J.; TRIPLETT, E. W. Molecular microbial diversity in soils from
eastern Amazonia: evidence for unusual microorganisms and microbial
population shifts associated with deforestation. Applied Environmental
Microbiology, v. 63, n. 7, p. 2647-2653, 1997.
191
BRULC, J. M.; ANTONOPOULOS, D. A.; MILLER, M. E. B.; WILSON, M.
K.; YANNARELL, A. C.; DINSDALE, E. A.; EDWARDS, R. E.; FRANK, E. D.;
EMERSON, J. B.; WACKLIN, P.; COUTINHO, P. M.; HENRISSAT, B.; NELSON,
K. E.; WHITE, B. A. Gene-centric metagenomics of the ber-adherent bovine
rumen microbiome reveals forage specic glycoside hydrolases. Proceedings of the
National Academy of Sciences USA, v. 106, n. 6, p. 1948-53, Feb. 2009.
CHEN, K.; PACHTER, L. Bioinformatics for whole-genome shotgun sequencing of
microbial communities. PLoS Computational Biology, v. 1, n. 2, p. 106-112, 2005.
DCOSTA, V. M.; MCGRANN, K. M.; HUGHES, D. W.; WRIGHT, G. D. Sampling
the antibiotic resistome. Science, v. 311, n. 5759, p. 374-7, Jan. 2006.
DANIEL, R. The metagenomics of soil. Nature Reviews Microbiology, v. 3, n. 6,
p. 470-478, 2005.
DE CASTRO, A. P.; QUIRINO, B. F.; PAPPAS, G.; KUROKAWA, A. S.; NETO, E.
L.; KRGER, R. H. Diversity of soil fungal communities of Cerrado and its closely
surrounding agriculture elds. Archives of Microbiology, v. 190, n. 2, p. 129-139,
2008.
ENTCHEVA, P.; LIEBL, W.; JOHANN, A.; HARTSCH, T.; STREIT, W. R.
Direct cloning from enrichment cultures, a reliable strategy for isolation of
complete operons and genes from microbial consortia. Applied Environmental
Microbiology, v. 67, n. 1, p. 89-99, Jan. 2001.
FLEISCHMANN, R. D.; ADAMS, M. D.; WHITE, O.; CLAYTON, R. A.;
KIRKNESS, E. F.; KERLAVAGE, A. R.; BULT, C. J.; TOMB, J. F.; DOUGHERTY,
B. A.; MERRICK, J. M. Whole-genome random sequencing and assembly of
Haemophilus inuenzae Rd. Science, v. 269, n. 5223, p. 496-512, Jul. 1995.
FRASER, C. M.; GOCAYNE, J. D.; WHITE, O.; ADAMS, M. D.; CLAYTON, R. A.;
FLEISCHMANN, R. D.; BULT, C. J.; KERLAVAGE, A. R.; SUTTON, G.; KELLEY,
J. M.; FRITCHMAN, R. D.; WEIDMAN, J. F.; SMALL, K. V.; SANDUSKY, M.;
FUHRMANN, J.; NGUYEN, D.; UTTERBACK, T. R.; SAUDEK, D. M.; PHILLIPS,
C. A.; MERRICK, J. M.; TOMB, J. F.; DOUGHERTY, B. A.; BOTT, K. F.; HU, P. C.;
LUCIER, T. S.; PETERSON, S. N.; SMITH, H. O.; HUTCHISON, C. A.; VENTER,
J. C. The minimal gene complement of Mycoplasma genitalium. Science, v. 270,
n. 5235, p. 397-403, Oct. 1995.
HANDELSMAN, J. Metagenomics: application of genomics to uncultured
microorganisms. Microbiology and Molecular Biology Reviews, v. 68, n. 4, p. 669,
2004.
HANDELSMAN, J.; RONDON, M. R.; BRADY, S. F.; CLARDY, J.; GOODMAN, R.
M. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new
frontier for natural products. Chemical Biology, v. 5, n. 10, p. R245-9, Oct. 1998.
192
HEALY, F. G.; RAY, R. M.; ALDRICH, H. C.; WILKIE, A. C.; INGRAM, L. O.;
SHANMUGAM, K. T. Direct isolation of functional genes encoding cellulases
from the microbial consortia in a thermophilic, anaerobic digester maintained
on lignocellulose. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 43, n. 4, p. 667-74,
Aug./Sep. 1995.
HENNE, A.; SCHMITZ, R. A.; BOMEKE, M.; GOTTSCHALK, G.; DANIEL, R.
Screening of environmental DNA libraries for the presence of genes conferring
lipolytic activity on Escherichia coli. Applied Environmental Microbiology, v. 66,
n. 7, p. 3113-6, Jul. 2000.
KOMATSU, M.; UCHIYAMA, T.; OMURA, S.; CANE, D. E.; IKEDA, H.
Genome-minimized Streptomyces host for the heterologous expression of
secondary metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 107,
n. 6, p. 2646-2651, Feb. 2010.
KUNIN, V.; COPELAND, A.; LAPIDUS, A.; MAVROMATIS, K.; HUGENHOLTZ,
P. A bioinformaticians guide to metagenomics. Microbiology and Molecular
Biology Reviews, v. 72, n. 4, p. 557, 2008.
LANE, D.; PACE, B.; OLSEN, G.; STAHL, D.; SOGIN, M.; PACE, N. Rapid
determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses.
Proceedings of the National Academy of Sciences USA, v. 82, n. 20, p. 6955-6959,
Jan, 1985.
LEVEAU, J. The magic and menace of metagenomics: prospects for the study of
plant growth-promoting rhizobacteria. European Journal of Plant Pathology, v. 119,
n. 3, p. 279-300, 2007.
LIU, G. Applications and Case Studies of the Next-Generation Sequencing
Technologies in Food, Nutrition and Agriculture. Recent Patents on Food,
Nutrition & Agriculture, v. 1, n. 1, p. 75-79, 2009.
LORENZ, P.; ECK, J. Metagenomics and industrial applications. Genomics, v. 2,
p. 231-239, 1988.
MIRETE, S.; DE FIGUERAS, C. G.; GONZLEZ-PASTOR, J. E. Novel nickel
resistance genes from the rhizosphere metagenome of plants adapted to acid mine
drainage. Applied and Environmental Microbiology, v. 73, n. 19, p. 6001-11, Oct.
2007.
MUYZER, G.; DE WAAL, E. C.; UITTERLINDEN, A. G. Proling of complex
microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis
of polymerase chain reaction-amplied genes coding for 16S rRNA. Applied
Environmental Microbiology, v. 59, n. 3, p. 695-700, 1993.
QUIRINO, B. F.; PAPPAS, G. J.; TAGLIAFERRO, A. C.; COLLEVATTI, R. G.;
NETO, E. L.; DA SILVA, M. R. S. S.; BUSTAMANTE, M. M. C.; KRGER, R. H.
Molecular phylogenetic diversity of bacteria associated with soil of the savanna-like
Cerrado vegetation. Microbiological Research, v. 164, n. 1, p. 59-70, Jan. 2009.
193
REIS JNIOR, F. B.; MENDES, I. C.; TEIXEIRA, K. R. S.; REIS, V. M. Uso de
ferramentas moleculares em estudos da diversidade de microrganismos do solo.
Planaltina: Embrapa Cerrados, 2002. 33 p. (Embrapa Cerrados. Documentos, 51). 2002.
RESEARCH COUNCIL (U.S.). Committee on metagenomics: challenges and
functional applications, n. The new science of metagenomics: revealing the secrets
of our microbial planet. [S. l.], 2007. 158 p.
RIESENFELD, C. S.; SCHLOSS, P. D.; HANDELSMAN, J. Metagenomics:
genomic analysis of microbial communities. Annual Review Genetics, v. 38,
p. 525-52, Jan. 2004.
SCHMIDT, T.; DELONG, E.; PACE, N. Analysis of a marine picoplankton
community by 16S rRNA gene cloning and sequencing. Journal of Bacteriology,
v. 173, n. 14, p. 4371, 1991.
SNYDER, L.; LOMAN, N.; PALLEN, M.; PENN, C. Next-Generation
Sequencing-the Promise and Perils of Charting the Great Microbial Unknown.
Microbial Ecology, v. 57, n. 1, p. 1-3, 2009.
STALEY, J. T.; KONOPKA, A. Measurement of in situ activities of
nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annual
Reviews Microbiology, v. 39, p. 321-46, Jan. 1985.
TORSVIK, V.; GOKSOYR, J.; DAAE, F. L. High diversity in DNA of soil bacteria.
Applied Environmental Microbiology, v. 56, n. 3, p. 782-7, Mar. 1990.
TRINGE, S.; RUBIN, E. Metagenomics: DNA sequencing of environmental
samples. Nature Reviews Genetics, v. 6, n. 11, p. 805-814, 2005.
TYSON, G.; CHAPMAN, J.; HUGENHOLTZ, P.; ALLEN, E.; RAM, R.;
RICHARDSON, P.; SOLOVYEV, V.; RUBIN, E.; ROKHSAR, D.; BANFIELD,
J. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial
genomes from the environment. Nature, v. 428, n. 6978, p. 37-43, 2004.
UCHIYAMA, T.; ABE, T.; IKEMURA, T.; WATANABE, K. Substrate-induced
gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of
catabolic genes. Nature Biotechnology, v. 23, n. 1, p. 88-93, Jan. 2005.
VENTER, J. C.; REMINGTON, K.; HEIDELBERG, J. F.; HALPERN, A. L.; RUSCH,
D.; EISEN, J. A.; WU, D.; PAULSEN, I.; NELSON, K. E.; NELSON, W.; FOUTS, D.
E.; LEVY, S.; KNAP, A. H.; LOMAS, M. W.; NEALSON, K.; WHITE, O.; PETERSON,
J.; HOFFMAN, J.; PARSONS, R.; BADEN-TILLSON, H.; PFANNKOCH, C.;
ROGERS, Y.-H.; SMITH, H. O. Environmental genome shotgun sequencing of the
Sargasso Sea. Science, v. 304, n. 5667, p. 66-74, Apr. 2004.
WOESE, C. R. Bacterial evolution. Microbiological Reviews, v. 51, n. 2, p. 221-271,
Jun. 1987.
YUN, J.; RYU, S. Screening for novel enzymes from metagenome and SIGEX, as a
way to improve it. Microbial Cell Factories, v. 4, n. 1, p. 8, Mar. 2005.
Captulo 7
195
Biotecnologia e diagnsticos
moleculares
Maria Cristina Rocha Cordeiro
Introduo
Em primeiro lugar, necessrio conceituar o que seja biotecnolo-
gia e diagnstico molecular para, em seguida, explicar qual a rela-
o entre biotecnologia e diagnstico molecular.
Biotecnologia um termo relativamente novo, muito embora sua
prtica seja at antiga. A biotecnologia em si a utilizao de proces-
sos biolgicos como geradores de tecnologias de forma que se agre-
gue valor a um dado produto. A biotecnologia pode ser considerada
um processo antigo quando nos referimos por exemplo tecnologia
de produo de vinhos, cerveja, queijo etc. O que so, em ltima ins-
tncia, essas prticas? So processos biolgicos que foram aprovei-
tados para a gerao de tecnologia tendo em vista a formao de um
novo produto com valor agregado. No caso do vinho e da cerveja, o
aproveitamento foi da fermentao anaerbica do suco da uva ou da
cevada e, no caso do queijo, do leite.
Diagnstico molecular pode ser conceituado como sendo o uso de
ferramentas moleculares que indique, ou demonstre, a soluo de
uma dada questo. Por exemplo, no campo da sade, o termo diag-
nstico utilizado como um meio de esclarecer os sintomas de uma
doena. Diagnstico molecular quando esse esclarecimento reali-
zado em nvel molecular. No campo da biologia, o diagnstico molecu-
lar pode ser utilizado, por exemplo, quando se quer identicar especi-
camente uma planta ou um animal. Na agropecuria, o diagnstico
molecular pode estar relacionado com a identicao de uma dada
cultivar mais produtiva, mais resistente a uma dada doena, a identi-
cao de um dado patgeno etc. O diagnstico molecular pode ser
considerado como um caminho que leva biotecnologia e esta, como
geradora de um processo, uma tecnologia nova com valor agregado.
Como exemplo dessa relao esto os processos de identicao em
196
nvel molecular de, por exemplo, plantas e animais transgnicos e (ou)
kits de identicao de patgenos que podem resultar em processos
patenteveis (com valor agregado).
Para que um diagnstico molecular seja efetivo, para qualquer situ-
ao, ele deve ser considerado dentro de quatro quesitos importan-
tes como: a reprodutibilidade, a especicidade, a distinguibilidade e
a sensibilidade. Reprodutibilidade signica que o diagnstico deve
ser sempre repetido exatamente da mesma maneira dentro da situa-
o especca. Especicidade signica que deve ser especco para a
questo estudada (ex.: planta, patgeno etc); distinguibilidade signi-
ca que o diagnstico ou a identicao distinta e no assume ml-
tiplas formas (no h falsos positivos ou negativos), nica; e sensi-
bilidade signica que o diagnstico ou a identicao capaz de ser
realizado com quantidade muito reduzidas de matria-prima (ex. san-
gue, tecido vegetal, animal, DNA, RNA, protena etc). Esses quesitos
esto diretamente relacionados com o objeto que conduz identi-
cao, que chamado de biomarcador.
Biomarcador a molcula que identica, reconhece, diagnostica
um determinado sistema como uma cultivar, um patgeno, uma
enfermidade etc. Essa molcula deve ser selecionada e relacionada
com o ser que se quer identicar, o agente causal da enfermidade ou
um sistema biolgico especco. Pode ser de origem proteica ou outra
como o cido desoxiribonucleico (DNA), cido ribonuclico (RNA),
compostos fenlicos etc.
Outra relao entre biotecnologia e diagnsticos moleculares diz
respeito s ferramentas moleculares da biotecnologia moderna que
so utilizadas para selecionar e relacionar uma molcula como bio-
marcadora de um determinado ser vivo, processo ou sistema. Essas
ferramentas moleculares assim utilizadas podem ter origem na gen-
mica, na transcriptmica, na protemica ou no metaboloma.
Genmica a parte da biotecnologia que estuda os genomas em
sentido macro, sua estrutura bsica. So, por exemplo, os grandes tra-
balhos de sequenciamento de genomas que tm, por principal obje-
tivo, revelar o tamanho preciso dos diversos genomas animais ou
vegetais; inferir no nmero provvel de genes que se encontra nesse
genoma; bem como conhecer a sequncia desses diversos genes. As
197
Captulo 7 Biotecnologia e diagnsticos moleculares
principais ferramentas utilizadas pela genmica so o sequencia-
mento automatizado de DNA e as ferramentas de bioinformtica de
anotao e anlise das sequncias gnicas. Porm, o sequenciamento
completo dos genomas no informa sobre a funcionalidade de muitas
das sequncias gnicas conhecidas nos estudos da genmica e esta
somente pode ser revelada por meio das ferramentas da transcript-
mica e da protemica.
A transcriptmica representa todos os estudos que visam iden-
ticao e anlise de genes expressos especicamente em um deter-
minado sistema como, por exemplo, os genes expressos em tecidos
vegetais infectados por diversos patgenos, em tecidos de plantas tole-
rantes a condies desfavorveis como a seca ou a presena de metais
pesados no solo e outras. Diversas metodologias moleculares so uti-
lizadas nos estudos da transcriptmica como a sntese de biblotecas
de cDNA (DNA complementar), o PCR (Polymerase Chain Reaction),
o RT-PCR (Reverse transcrition PCR), o PCR quantitativo (RTqPCR)
etc. Esses estudos inferem, em ltima anlise, situaes siolgicas
especcas e contribuem para respostas e identicao dos principais
genes (biomarcadores potenciais), que so ativados em diversas des-
sas situaes siolgicas diferentes.
A protemica representa os estudos de todas as protenas que so
expressas em clulas especcas (tecidos especcos, situaes sio-
lgicas especcas). As principais ferramentas metodolgicas utili-
zadas, hoje, nesses estudos so a eletroforese em duas dimenses, o
sequenciamento de protenas, a espectroscopia de massa e as anli-
ses de bioinformtica.
E, por m, a metabolmica o conjunto de ferramentas utiliza-
das para estudar molculas relacionadas identifcao de compostos
no proteicos ou DNA/RNA como os alcaloides, avonoides etc. e sua
relao com seus ciclos de sntese. Algumas dessas metodologias so
a cromatograa lquida de alta presso (HPLC), a cromatograa em
camada na (TLC) e a ressonncia nuclear magntica (NMR).
Outros estudos no campo da genmica so aqueles relacionados
com a gentica. Nesse tipo de abordagem, utilizam-se como ferra-
mentas experimentais as tecnologias dos marcadores moleculares
198
que auxiliam no mapeamento de genomas. Esses estudos so melhor
estudados em outros captulos desse livro.
Metodologias e seleo de biomarcadores
para o diagnstico molecular
Uma vez introduzido o assunto, agora podemos discorrer mais
sobre como que algumas metodologias utilizadas pela biotecnologia
auxiliam a seleo e distino de molculas biomarcadoras capazes
de serem o objeto de diagnsticos moleculares.
Construo de biblioteca de cDNA
Uma biblioteca de cDNA um conjunto de cDNAs (DNA comple-
mentar) obtido de todos os RNAs mensageiros (RNAs-m) presentes
e que se expressam em um determinado sistema biolgico em um
tempo especco. Os fundamentos tericos para a sua construo
esto relacionados com a associao de diversas ideias e ferramen-
tas da engenharia gentica, tais como, a construo de bibliotecas
de DNA; polimerizao de cadeia de DNA em sentido reverso pela
enzima transcriptase reversa; clonagem molecular; transformao
bacteriana e outros.
A construo de bibliotecas de cDNA objetiva facilitar a seleo
de um gene especco que se expresse em uma situao siolgica
especca. Para que uma biblioteca de cDNA seja construda, neces-
srio obter como primeira etapa os RNAs-m presentes no sistema
desejado (ex:. tecido de planta infectada com um patgeno, tecido
de cultivar tolerante seca, entre outros). A partir dos RNA-m, sin-
tetiza-se o cDNA correspondente para cada RNA-m por meio da uti-
lizao de um primer oligodT e a enzima transcriptase reversa. Esse
passo possvel para todos os sistemas eucariticos, pois seus RNA-m
tem uma extenso de poli-A na extremidade 3 terminal. Essa enzima
(transcriptase reversa), alm de poder sintetizar uma cadeia de DNA
em sentido reverso (3 para 5) a partir do RNA-m tambm, ao nal
da extenso, constitui uma formao em gancho (Figura 1) que per-
mite que, em uma segunda etapa, o DNA polimerase I possa sinteti-
zar a segunda cadeia constituindo o cDNA de dupla cadeia. Ao nal
199
da polimerizao das duas cadeias, esse gancho destrudo e o pool
de cDNAs gerado ligado a um vetor de clonagem (plasmdeo, cos-
mdeo ou DNA de fago) e os cDNAs clonados so transformados em
clulas bacterianas ou incorporados a partculas virais que vo infectar
clulas bacterianas. A presena desses clones em clulas bacterianas
importante para a manuteno da biblioteca por um perodo de tempo
longo, alm de permitir sua amplicao para anlises posteriores.
AAAAA
TTTTT
RNA-m
Polimerizao das cadeias de
cDNa com a utilizao da
transcriptase reversa e DNA
polimerase I
3 5
Vetor de clonagem
Sequncia biomarcadora
Figura 1. Esquema geral da construo de uma biblioteca de cDNA.
As diversas bibliotecas de cDNA possveis assumem importncia
para o diagnstico molecular no sentido em que elas permitem a sele-
o de uma sequncia gnica especca que est relacionada como
uma molcula biomarcadora de um sistema siolgico.
Uma variao dessa metodologia a construo de bibliotecas sub-
tradas de cDNA. Essas bibliotecas subtradas so o produto da sub-
trao de dois diferentes pools de cDNAs, por exemplo, biblioteca de
cDNA dos genes expressos em um planta tolerante a estresse hdrico
de onde foram subtrados a maior parte dos genes constitutivos, ou
seja, que existiam na planta independentemente a expresso de genes
diretamente relacionados com o processo de tolerncia antes da etapa
de clonagem molecular. Bibliotecas de cDNA subtradas minimizam
200
muito o trabalho para a seleo de um biomarcador para a situao
estudada.
Outra variao, que na verdade anterior e, a partir dela, foi ideali-
zada a biblioteca de cDNA, a construo de bibliotecas genmicas,
que nada mais do que o conjunto completo de fragmentos gni-
cos que, juntos, representam todo um genoma. Porm, nesse caso,
utilizado o DNA genmico. So utilizadas para selecionar sequn-
cias gnicas completas (regies no transcritas para o RNA-m como
regies de introns, sequncias gnicas regulatrias, sequncias gni-
cas promotoras etc).
Microarranjos de DNA
Microarranjos de DNA a metodologia mais avanada para a sele-
o de uma ou mais sequncias biomarcadoras ao mesmo tempo para
diversas situaes. Ela realizada por meio da construo prvia de
uma biblioteca de DNA genmico (biblioteca genmica). A partir do
pool de fragmentos genmicos, adiciona-se cada um desses clones em
uma microplaca de forma automatizada. Cada microplaca, portanto,
tem a representao de uma grande parte dos clones da biblioteca de
DNA para um determinado genoma. Logo, cada spot na microplaca
representa um clone de DNA que j conhecido por uma sequncia
gnica especca, sequenciada previamente. Para a seleo das mol-
culas biomarcadoras (p.ex., os genes expressos em um dado sistema),
faz-se a hibridizao com diferentes pools de cDNA, cada um mar-
cado com um uorforo diferente (Figura 2). A leitura das diferentes
emisses de uorescncia na microplaca analisada em um software
especco e clculos estatsticos de forma a dizer qual dos genes ati-
vado somente em um determinado sistema. Essa expresso diferen-
cial, no entanto, deve ser conrmada por meio de experimentos de
RTqPCR. Os fundamentos tericos ou ideias fundamentais que esto
por trs dos microarranjos de DNA so, por exemplo, as bibliotecas
de DNA, a hibridizao em Southern blot etc. conveniente ressaltar
que a base da anlise em microarronjos de DNA o Southern blot que
rendeu o prmio Lasker de 2005 a seu inventor.
201
Microplaca
Gene
selecionado
Figura 2. Esquema geral de um anlise em microarrnjos de DNA ( microarray).
Eletroforese em 2D
A eletroforese em 2D foi descrita pela primeira vez por OFarrel
em 1975. Ela consiste na separao de protenas em duas dimenses
em um gel de eletroforese de poliacrilamida. O fundamento terico
dessa metodologia consiste na qumica de protenas que, por meio
desses estudos, sabe-se quais protenas tm cargas eltricas positivas
e negativas em meio aquoso, por causa dos grupos amino e carboxila
dos aminocidos. Porque possuem cargas eltricas, podem migrar
em um campo eltrico (princpio da eletroforese), seja para o plo
positivo (se a predominncia de carga for negativa) ou negativo (se a
predominncia de carga for positiva). No entanto, se a protena tem
uma proporo de cargas positivas e negativas iguais, esta no migra
no campo eltrico, ento esse ponto chamado de ponto isoeltrico.
por esse motivo que se consegue a separao de uma amostra hete-
rognea de protenas na primeira dimenso da eletroforese em 2D.
O outro princpio que molculas proteicas grandes migram em um
campo eltrico com uma velocidade menor do que molculas peque-
nas, podendo serem separadas por seu peso molecular. E essa a sepa-
rao obtida na segunda dimenso da eletroforese em 2D. A vantagem
para um diagnstico molecular que essa metodologia, associada ao
sequenciamento de protenas, tem o potencial de identicar todas as
protenas componentes de um determinado tecido, como tambm
as protenas diferenciais expressas entre dois diferentes tecidos (bio-
marcadores proticos em potencial). Atualmente, essa identicao
realizada por meio de softwares especializados que escaneiam os
gis em anlise e subtraem in silico as marcas de protenas de um em
relao ao outro (Figura 3).
202
A
(-)
(+)
(-) (+)
B
Figura 3. Esquema geral de uma anlise de eletroforese em 2D demons-
trando a expresso de protenas diferentes nos tecidos A e B.
Recapitulando, as duas dimenses em que so separadas as prote-
nas em gel de eletroforese consistem na separao por pontos isoe-
ltricos (pH em que a protena tem carga nula e, portanto, estaciona
no gel) em uma primeira etapa, e, em seguida, a separao em gel por
peso molecular. Essa tcnica parte da premissa de que as diversas pro-
tenas que existem no tm, ao mesmo tempo, o mesmo ponto isoe-
ltrico e o mesmo peso molecular.
Sequenciamento de DNA
A metodologia do sequenciamento de DNA foi descrita por
Frederick Sanger na dcada de 1970. O procedimento original rea-
lizado por meio da amplicao em PCR da sequncia alvo com oli-
gonucleotdeos (primers) especcos localizados no vetor (DNA plas-
midial) onde est clonado a sequncia de interesse alvo (gene) e a
utilizao de dideoxnucleotdeos (ddNTPs). ddNTPs so nucleotdeos
que contm duas oxidrilas ao invs de apenas uma, normalmente
encontrada nos dNTPs. Esses dideoxinucleotdeos so adicionados
um a um no processo de amplicao em PCR (Polymerase Chain
Reaction). Na verdade, fazem-se 4 reaes diferentes em que 3 dos
dNTPs so normais e apenas 1 ddNTP. A reao de polimerizao
das novas cadeias de DNA onde est o ddNTP parada com a adio
do mesmo gerando como produto da PCR uma gama de fragmentos
de DNA de tamanhos diferentes de acordo com a adio do ddNTP.
Assim, cada uma das reaes possuem fragmentos cujas pontas con-
tm ddATP, outra ddTTP, outra ddCTP e outra ddGTP. Alm da adi-
203
o diferencial dos ddNTPs nas reaes do PCR, adicionado a cada
reao um dos dNTPs (geralmente dATP ou dCTP) marcados com
radioatividade. Portanto, os fragmentos gerados em cada reao tero
um diferencial na ponta (por causa do ddNTP) e so radioativos.
Essas quatro reaes so adicionadas em um gel de poliacrilamida
com uria que permite a resoluo dos diferentes fragmentos de DNA
sintetizados em cada reao. Aps a corrida eletrofortica, o gel seco
e exposto a um lme radiogrco. Esse procedimento chamado de
autorradiograa, que representa uma imagem negativa dos fragmen-
tos resolvidos no gel que imprimem sua imagem no lme radiogr-
co por estarem radioativos. A leitura dessa autorradiograa faz-se
de baixo para cima, pois os fragmentos mais baixos so menores do
que os fragmentos que esto acima. Como se aplica as quatro reaes
no mesmo gel, a leitura feita da banda mais baixa, seja na linha do
ddATP, ou ddCTP, ou ddTTP, ou ddGTP, e vai-se alternando con-
forme as diferentes posies (Figura 4).
A T C G
A
T
T
C
T
T
G
A
C
G
A
T
a
b
c
Figura 4. Esquema do procedimento de sequenciamento automtico. (a)
dideoxinucleotdeos marcados com uorescncia diferencial; (b) reao de
polimerizao de fragmentos; e (c) separao eletrofortica dos fragmentos
gerados na reao do PCR.
204
A sequncia lida estar no sentido direto ou reverso conforme a
orientao do primer utilizado no plasmdeo para a reao de sn-
tese dos fragmentos homlogos gerados do gene alvo. Com a sequn-
cia lida, pode-se buscar uma sequncia homloga a ela em banco de
dados gnicos ou proteicos utilizando ferramentas de bioinformtica
como o Blast em suas mltiplas formas como nBlast, tBlast, Blastx etc.
Ou vrias sequncias podem ser analisadas em comparao utilizando
o programa Clustal W ou ainda montadas de forma que se encontre a
continuidade das sequncias gerando uma sequncia maior.
Em resumo, como fundamentos tericos da metodologia do
sequenciamento, podemos apresent-los assim: (1) para a cadeia do
DNA crescer em uma reao de polimerizao em PCR, necessria
a adio de um nucleotdeo do tipo dNTP, caso contrrio ela parada
(adio de ddNTP); (2) se um dos dNTPs na reao de polimerizao
for marcado de alguma maneira (com radioatividade ou uorescn-
cia), toda a cadeia ser marcada da mesma forma; (3) fragmentos de
DNA de tamanhos diferentes migram em um gel submetido a um
campo eltrico em geral para o plo positivo e os menores com mais
velocidade do que os maiores (princpio da eletroforese); (4) partcu-
las radioativas, porque emitem radioatividade na forma de eltrons
livres da camada mais externa dos tomos, podem imprimir lmes
radiogrcos permitindo uma autorradiograa.
A metodologia do sequeciamento atual mais utilizada a do
sequenciamento automtico. Ela est baseada na metodologia ori-
ginal de Sanger, contudo realizada em um mesmo tubo onde so
adicionados os quatro ddNTPs marcados com quatro diferentes u-
orforos que emitem intensidade luminosa diferente quando sub-
metidos luz. Os picos de diferentes uorescncias so relacionados
presena de um diferente ddNTP. Essa metodologia mais vanta-
josa porque tem o poder maior de leitura em relao ao tamanho da
sequncia, que pode ser lida em uma nica reao, e tambm por no
utilizar radioatividade.
O sequenciamento de DNA auxilia um diagnstico molecular, uma
vez que permite o conhecimento de sequncias gnicas espcie-espe-
ccas que podem ser comparadas por programas de bioinformtica
e, a partir dessa comparao, primers especcos podem ser sintetiza-
dos de forma a permitirem a amplicao especca de fragmentos
espcie-especcos que funcionem para identicar especicamente
205
patgenos, plantas, animais, plantas transgnicas (geram biomarca-
dores) (Figuras 5 e 6). Esses diagnsticos tm sido alvo de muitos tra-
balhos (FERRI, 2009).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
?
Figura 5. Esquema geral do diagnstico molecular de uma planta.
Figura 6. Gel de agarose 2% corado com brometo de etdio que demons-
tra o diagnstico molecular especco para o nematoide Heterodera glycines.
Mi-Meloidogynes incognita; Mj-M. javanica; Ma-M. arenaria; Hg-Heterodera
glycines; Pb-Pratylenchus brachyurus e Rr-Rotylenchulus reniformis.
206
Tecnologias principais utilizadas
em diagnstico molecular
PCR e variaes
A reao do Polymerase Chain Reaction (PCR) uma metodologia
que mimetiza a duplicao do DNA em um tubo de ensaio e esse o
seu fundamento terico. Ela foi descrita pela primeira vez por Mullins
em 1983 (SAIKI et al., 1988), provavelmente aps a identicao de
uma enzima DNA polimerase (enzima que polimeriza cadeias novas
de DNA) chamada Taq polimerase, que tem esse nome por ter sido
puricada pela primeira vez de uma bactria chamada Thermophilus
aquaticus. A Taq polimerase capaz de resistir a ciclos de alta tem-
peratura peridicos, por ser termoresistente. E essa alta temperatura
(92
o
C a 94
o
C) necessria na reao de PCR na etapa de desnatura-
o do DNA.
O PCR constitudo de trs etapas fundamentais (Figura 7): des-
naturao do DNA; o anelamento de oligonucleotdeos (primers); e a
polimerizao de novas cadeias. A etapa de desnaturao necess-
ria para que a dupla cadeia do DNA seja aberta, permitindo assim o
anelamento dos primers; a etapa de polimerizao aquela que poli-
meriza novas cadeias de DNA a partir de uma cadeia que serve como
molde (a duplicao do DNA semiconservativa). Esse ciclo se repete
sucessivas vezes de forma a aumentar a quantidade do fragmento
amplicado de maneira que obedea uma progresso geomtrica.
Assim, a partir de quantidades nmas de DNA, podem-se detectar
fragmentos especcos e analis-los. A grande vantagem do PCR
que uma metodologia muito sensvel, rpida e de relativo pouco
custo, dessa forma um diagnstico molecular que utiliza essa reao
tem um grande impacto.
207
Polimerizao de
novas cadeias do
DNA
Desnaturao
do
DNA
Hibridizao
do
primer
Figura 7. Esquema geral da reao de PCR.
Com o passar do tempo, foram aparecendo variaes permitindo
assim diversas aplicaes, como as anlises genticas com marcado-
res moleculares do tipo Rapid Amplied Polymorphic DNA (RAPD);
Inter Sequence Simple Repeats (ISSR); Sequence Simple Repeats
(SSR); Amplied Fragment Length Polymorphism (AFLP). Todas
essas metodologias genticas so muito teis como ferramentas que
auxiliam programas de melhoramento gentico. Um dos atributos do
uso de marcadores moleculares visando um diagnstico molecular
seu implemento para a gerao de fingerprintings (impressos digitais)
que servem para identicar cultivares, animais etc, alm de permitir
anlise de divergncia gentica entre elas (Figura 8). Outra aplicao
do RAPD que gera diferentes fingerprintings de cultivares o estudo de
variaes somaclonais gerado na cultura de tecidos vegetais in vitro.
208
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Figura 8. gel de agarose a 1,2% corados com brometo de etdio demosn-
trando o fingerprinting obtido por meio da metodologia do RAPD de diferen-
tes plantas de mangueira.
Outras variaes do PCR so o RT-PCR (Reverse transcription
PCR), o RTqPCR (Real time quantitative PCR). O primeiro ocorre
basicamente da mesma maneira que o PCR convencional, porm,
aps uma reao inicial de sntese da primeira ta de cDNA (DNA
complementar), pois o RT-PCR amplica transcritos gnicos (a partir
do RNA mensageiro). Essa metodologia importante quando se tem o
objetivo de estudar a expresso de um determinado gene em um sis-
tema biolgico especco. A vantagem do RT-PCR para o diagnstico
molecular que, alm de selecionar um biomarcador com ela, tam-
bm se pode inferir sobre a expresso de um dado transcrito gnico
relacionando-o ao sistema como um biomarcador.
O RTqPCR um processo semelhante, que pode ser realizado com
DNA ou RNA inicial, porm a sua vantagem que ele permite a quan-
ticao do gene ou transcrito especco gerado em tempo real de
forma bastante sensvel e precisa, porque utiliza um corante que inter-
cala nas cadeias dos fragmentos gerados no PCR (geralmente o Syber
green) e que pode ser detectado por sensores do equipamento utili-
zado no PCR, permitindo a quanticao do aumento da concentrao
do fragmento gerado em tempo real. Essa metodologia pode relacio-
nar genes como muito ou pouco expressos em um sistema ou quan-
tidade do DNA presente na amostra analisada. uma metodologia
209
muito sensvel e os trabalhos com ela hoje tm um grande impacto.
a metodologia por excelncia para validar os estudos realizados em
bibliotecas de cDNA ou microarranjos de DNA.
Southern e Northern blot
A metodologia do Southern blot foi inventada pelo bilogo brit-
nico Edwin Southern. Ela consiste na identicao da presena de um
gene em um dado genoma. Tambm pode ser utilizada para estimar
o nmero de cpias gnicas, para um gene especco, nesse genoma.
O embasamento terico dessa metodologia reside na associao de
vrias metodologias e descobertas como: o tipo de corte de restrio
gerado em DNA genmico por diversas enzimas; a eletroforese; a
transferncia de fragmentos, utilizando-se o processo da capilaridade
ou campo eltrico; a desnaturao da dupla cadeia de DNA com lcalis
fortes; a complementariedade de sequncias e preferncia para hibri-
dizao especca; a marcao de nucleotdeos com tomos radioati-
vos; a impresso de eltrons em lmes radiogrcos (autorradiogra-
a). O protocolo para a sua realizao depende em primeiro lugar que
se obtenha o DNA de interesse extrado e digerido com quatro dife-
rentes tipos de enzimas de restrio.
Em geral, utilizam-se enzimas que cortam pouco e muito o DNA.
Em seguida, os fragmentos gerados na digesto enzimtica so sepa-
rados em gel de eletroforese de agarose a 0,8%. Ao trmino da corrida,
o gel utilizado para fazer a transferncia desses fragmentos separa-
dos para um ltro de nylon (Figura 9). Essa transferncia pode ocor-
rer por algumas horas utilizando-se corrente eltrica ou pela noite
por capilaridade. No outro dia, os fragmentos transferidos para o l-
tro de nylon so desnaturados com solues alcalinas desnaturantes e
xados nele. Esse ltimo fenmeno chamado de crosslinking e pode
ocorrer pela ao do ultravioleta por alguns segundos ou a 2 horas em
forno +80
o
C. O ltro com os fragmentos de DNA transferidos e xa-
dos ento submetido a uma pr-hibridizao e, em seguida, a uma
hibridizao em tampes especcos, em temperaturas especcas.
A temperatura pode variar conforme a homologia do gene em
estudo, se bastante homlogo, geralmente 52
o
C a 65
o
C, se no, 37
o
C
a 45
o
C. Se a temperatura alta, dizemos que a hibridizao de alta
210
estringncia; e, se a temperatura baixa, dizemos que a estringncia
baixa. A hibridizao realizada em sacos de plstico selados onde
adicionado um fragmento gene especco marcado com radioati-
vidade (sonda) em banhos trmicos por um pernoite. Tambm pode
ser utilizado hibridizadores comerciais. Atualmente tambm rea-
lizado com sondas marcadas com uorescncia. No dia seguinte, o
ltro hibridizado lavado de forma a remover a radioatividade de
excesso em tampes especcos, utilizando temperatura de acordo
com a estringncia apropriada. O ltro ento seco e exposto em cas-
setes a lmes radiogrcos a 80
o
C (autorradiograa).
gel
transferncia
Marcao fluorescente
ou radioativa

Southern / Northern blotting
Filtro de Nylon
gel
filtro de Nylon

Southern / Northern Blot
F
r
a
g
m
e
n
t
o
s

d
e

D
N
A
/

R
N
A
Figura 9. Esquema geral de um Southern / Northern blot.
De acordo com o sinal radioativo remanescente no ltro, o lme
revelado em um dia, dois, uma semana ou um ms, obtendo-se ento
o resultado. Se a marcao foi uorescente, o resultado obtido por
meio do escaneamento do ltro em equipamentos leitores espec-
cos que emitem feixe de luz capazes de fazer uorescer a(s) banda(s)
hibridizada(s) para sua identicao. O Southern blot para estimar o
nmero de cpias gnicas vem, atualmente, sendo substitudo pelo
RTqPCR. Contudo, pode ser ainda utilizada como diagnstico de plan-
tas transgnicas.
211
A metodologia do Northern blot foi batizada por Southern, pois con-
siste em uma anlise similar ao Southern blot, porm realizada com
RNA. As diferenas representam o gel de eletroforese que, nesse caso,
de glioxal ou formaldedo, e a etapa de desnaturao omitida pelo
fato dos RNA-m serem cadeia simples. Essa metodologia tambm
tende a ser substituda pelos microarranjos de DNA em que se utiliza
como sondas pools de cDNA diferentes marcados com diferentes u-
orforos e pela RTqPCR, j que essas tcnicas tambm so capazes de
detectar a expresso de um dado gene em um dado sistema, porm
de maneira muito mais sensvel. A deteco da expresso de um dado
gene em um dado sistema o principal resultado que a metodologia
do Northern blot pode trazer para um diagnstico molecular.
Western blot
A metodologia do Western blot foi batizada por Southern, assim
como o Southern e o Northern blot, realizada para identicar espe-
cicamente genes. Nesse caso, o reconhecimento especco de pro-
tenas e, por isso, pode identicar apenas uma protena que est pre-
sente em uma amostra heterognea. Dessa maneira, a identicao
especca proteica no realizada no Western blot por meio de son-
das e, sim, pelo reconhecimento especco com anticorpos monoclo-
nais ou policlonais.
O fundamento terico dessa metodologia est na imunologia e o
reconhecimento especco antgeno-anticorpo. Em seu processo, tam-
bm realizada uma separao eletrofortica de protenas em gel de
poliacrilamida-SDS similar segunda dimenso da eletroforese em
2D (separao por peso molecular). Em seguida, realiza-se a trans-
ferncia das protenas separadas no gel para um ltro de nylon por
meio de corrente eltrica. Nessa tcnica, no necessrio xar as
protenas no ltro porque o processo mais rpido, o que evita per-
das por difuso das protenas transferidas para o ltro. Em seguida,
realizada uma pr-lavagem do ltro em tampes especcos e, aps,
adicionado o anticorpo primrio especco para a protena-alvo. A
ligao antgeno (regio antignica na protena alvo reconhecida pelo
anticorpo) anticorpo realizada por algumas horas e, depois, rea-
liza-se a ligao de um segundo anticorpo especco a outra a regio
212
dos anticorpos IgG (anticorpo secundrio) (uma regio diferente da
regio de reconhecimento especco que igual em todos os anticor-
pos) especco para a protena alvo. Esse segundo anticorpo mar-
cado com algum tipo de (Figura 10) molcula indicadora (ex.: peroxi-
dase, biotina, substncia luminescente etc).
Wessern
blot
1 2 3 4
1 2 3 4
***
gel
Marcao
luminescente
Membrana
de Nylon
Polo (- )
Polo (+)
Identificao de transgnicos
Identificao de doenas
(pecuria)
Figura 10. Esquema geral de um Western blot.
A revelao do complexo antgeno-anticorpo realizada com um
revelador especco marcao no segundo anticorpo que produz rea-
o no complexo antgeno-anticorpo (ex.: biotina/avidina). Essa revela-
o geralmente uma reao enzimtica, por conseguinte ocorre em
um tampo especco e produz uma cor ou luz. A protena especca
alvo da amostra analisada no gel assim revelada como presente ou
ausente diretamente no ltro ou em um lme radiogrco.
O Western blot utilizado como ferramenta do diagnstico mole-
cular todas as vezes que permite o reconhecimento especco de uma
dada protena. Essa protena, por exemplo, pode ser expressa em uma
planta transgnica e assim conrma a expresso de um dado gene uti-
lizado para transform-la. Tambm pode ser uma protena relacionada
com alguma enfermidade seja vegetal, animal ou humana expressa
no tecido, sangue, entre outros.
213
Elisa
A metodologia do Enzyme linked Immuno Sorbent Assay (Elisa),
assim como o Western blot e a eletroforese em 2D constitui mais uma
tcnica utilizada para gerar um diagnstico molecular tendo como
base biomolculas de protenas. O fundamento terico dessa meto-
dologia o mesmo do Western blot. Nela tambm se identica uma
protena especca com anticorpos especcos desenvolvidos a ela e
a revelao tambm realizada de forma indireta com indicadores
luminescente, radioativos ou uorescentes. Porm, utilizam-se pla-
cas apropriadas para xar a protena de escolha (protena alvo) que
(Figura 11) contm vrios pocinhos. Em cada pocinho, adicionado
um material que se quer investigar se h anticorpos especcos para
a protena alvo (ex.: soro humano). Aps essa primeira etapa, adicio-
nado o segundo anticorpo marcado com um indicador. E, nalmente,
a revelao realizada por meio de reaes enzimticas tpicas para
cada indicador. Se o indicador for uorescente, a placa lida em equi-
pamentos adequados que indicar em qual pocinho encontrado a
marcao positiva. Essa a metodologia mais utilizada no teste de
Sndrome da Imuno Decincia Adquirida (AIDS).
A metodologia do Elisa tambm pode ser realizada utilizando-se
reconhecimento gnico especco.
Elisa
Marcao
fluorescente
Anticorpo primrio
Anticorpo secundrio marcado
com fluorescncia
Protena biomarcadora
Identificao de
doenas (pecuria)
Figura 11. Esquema geral de um Elisa.
214
Consideraes finais
Como uma recaptulao geral, podemos dizer que as metodolo-
gias de preparao de bibliotecas genmicas, de cDNA (subtrativas
ou no), os micorarranjos de DNA e a eletroforese em duas dimen-
ses fornecem informaes valiosas sobre biomarcadores em poten-
cial para diversos sistemas biolgicos sejam de origem DNA ou prote-
na. O sequenciamento de DNA ou protena complementa a primeira
informao e permite o desenho de primers especcos ao biomarca-
dor. E, nalmente, o PCR em suas vrias modalidades bem como as
metodologias do Southern blot, Northern blot, Western blot e Elisa
oferecem a possibilidade de um diagnstico molecular especco, seja
para sequncias gnicas ou proteicas.
Todas essas metodologias so muito sensveis. Praticamente a elei-
o de uma ou outra depende do custo, da expertise e da velocidade
para a obteno de resultados.
O ideal para o diagnstico molecular ter 100% de sensibilidade
(deteco do biomarcador em quantidades nmas de matria prima),
100% de reprodutibilidade, 100% de especicidade (que evita falsos
positivos e negativos), 100% de distinguibilidade em um custo baixo,
um tempo rpido e necessitando de pouca expertise para o opera-
dor. Porm, essa situao utpica. Portanto, deve ser avaliado o que
seja melhor caso a caso. Alguns problemas como reprodutibilidade
podem ser resolvidos com anlises em duplicata, triplicata e anli-
ses estatsticas, e a especicidade, que pode gerar falsos positivos ou
negativos, pode ser resolvida com o uso de controles positivos e nega-
tivos no diagnstico. Com relao ao custo, em geral, avalia-se e rela-
ciona-se ao custo/benefcio do diagnstico, e o tempo e a expertise so
aspectos em que h sempre novos estudos na tentativa de super-los
o mximo possvel de modo a ter um diagnstico mais barato e de
fcil manipulao.
Na Tabela 1, apresentam-se as vantagens e desvantagens de algu-
mas metodologias utilizadas no diagnstico molecular para servir de
tomada de deciso para cada caso.
2
1
5
C
a
p
t
u
l
o

7

B
i
o
t
e
c
n
o
l
o
g
i
a

e

d
i
a
g
n
s
t
i
c
o
s

m
o
l
e
c
u
l
a
r
e
s
Tabela 1. Resumo das principais caractersticas, vantagens e desvantagens das metodologias utilizadas no diagns-
tico molecular.
Metodologia Sensibilidade Distinguibilidade Reproducibilidade Especificidade Custo
Tempo para
obteno de
resultados
Expertise
PCR
RT-PCR
++++ ++++ ++++ ++++ + + +
RAPD ++++ +++ +++ ++ + + +
ISSR ++++ +++ +++ +++ ++ + +
SSR ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ + ++
Southern blot
Northern blot
++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ ++
Elisa ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ ++
Wessern blot ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ ++
Microarranjos
de DNA
+++++++ ++++ ++++ +++++ +++++ ++ ++++
RTqPCR +++++++ ++++ ++++ ++++ +++++ + +++
216
Referncias
FERRI, E.; BARBUTO, M.; BAIN, O.; GALIMBERTI, A.; SHIGEHIKO,
U.; GUERRERO, R. A.; FERTE, H.; BANDI, C.; MATIN, C.; CASIRAGHI,
M. Integrated taxonomy: traditional approach and DNA barcoding for the
identication of larioid worms and related parasites (Nematoda). Frontiers in
Zoology, v. 6, p. 1-26, 2009.
OFARREL, P.H. High Resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.
Journal of Biological Chemistry, v. 250, p. 4007-4021, 1975.
SAIKI, R. K.; GELFAND, D. H.; STOFFEL, S.; SCHARF, S. J.; HIGUCHI,
R.; HORN, G. T.; MULLIS, K. B.; ERLICH, H. A. Primer-Directed Enzymatic
Amplication of DNA with a Thermostable DNA Polymerase. Science, v. 239,
p. 487-491, 1988.
Captulo 8
219
Microbiologia do solo
e sustentabilidade de
sistemas agrcolas
Ieda de Carvalho Mendes; Fbio Bueno dos Reis-Junior; Mariangela
Hungria; Marcelo Ferreira Fernandes; Guilherme Montandon Chaer;
Fbio Martins Mercante; Jerri dson Zilli
Introduo
Embora a armao de que os microrganismos controlam o mundo
parea um pouco exagerada, no . Todos os processos responsveis
pela vida no planeta terra dependem da atividade microbiana. Trata-se,
de fato, de um universo paralelo. Por exemplo, um nico grama de
solo possui mais de 10 mil espcies diferentes de microorganismos,
cerca de 1 bilho de bactrias, 1 milho de actinomicetos e 100 mil
fungos. Esses nmeros tambm do uma ideia da imensa diversidade
metablica dessas comunidades microbianas e da diversidade de pro-
cessos em que elas atuam.
O maior desao para a agricultura do sculo XXI est na resolu-
o de uma equao que envolve o aumento da produo de alimen-
tos baratos e saudveis a um baixo custo ambiental. A soluo dessa
equao, por sua vez, no pode negligenciar o componente biolgico
do solo, pois ele apresenta uma estreita inter-relao com os compo-
nentes fsicos e qumicos, os quais iro em conjunto inuenciar no
s a produtividade das culturas, mas tambm a sustentabilidade dos
sistemas agrcolas (Figura 1).
Neste captulo, sero abordados aspectos relacionados ao uso de bio-
indicadores nas avaliaes de qualidade do solo, os indicadores bio-
lgicos mais apropriados para esse m, o estado da arte da pesquisa
com bioindicadores e os ndices de qualidade de solo no Brasil e no
mundo e as suas perspectivas de uso pelos agricultores.
220
Maquinaria
biolgica do solo
Minimizar o preparo
mecnico
+
Maximizar o retorno
de resduos vegetais
+
Rotao de Culturas
Altas produtividades,
baixo custo
ambiental, social
=
SUSTENTABILIDADE
Figura 1. O aumento da produo de alimentos baratos e saudveis a um
baixo custo ambiental no pode negligenciar o componente biolgico do solo.
Qualidade do solo e bioindicadores
Pesquisadores e a sociedade, de uma maneira geral, esto bastante
familiarizados com os conceitos de qualidade da gua e do ar, e de
como o uso inadequado desses recursos pode afetar a sade humana
e o meio ambiente. Entretanto, a despeito da importncia do solo
para a humanidade, como base para todo o sistema de produo ali-
mentar, de bras e de agroenergia, o interesse pelo tema Qualidade
de solo relativamente recente, datando do m da dcada de 1980 e
incio da dcada de 1990. De acordo com Doran e Parkin (1994), qua-
lidade do solo seria a sua capacidade de funcionar dentro dos limi-
tes dos ecossistemas para: (a) sustentar a produtividade biolgica; (b)
manter a qualidade da gua e do ar e (c) promover a sade humana,
de plantas e animais (Figura 2). Ou seja, alm da importncia do solo
para a produo de alimentos, o conceito de qualidade do solo tam-
bm destaca a importncia desse recurso para o funcionamento glo-
bal dos ecossistemas.
221
Captulo 8 Microbiologia do solo e sustentabilidade de sistemas agrcolas
Sustentar a
produtividade
Promover a
sade
das pessoas,
animais e
plantas
Qualidade
Ambiental
Qualidade
do Solo
Figura 2. O conceito de qualidade do solo destaca a importncia desse recurso
para o funcionamento global dos ecossistemas .
Embora haja consenso entre pesquisadores e agricultores de que
a manuteno/melhoria da qualidade do solo um elemento-chave
para a sustentabilidade dos sistemas agrcolas, a avaliao dessa qua-
lidade no uma tarefa fcil. A multiplicidade de fatores qumicos,
fsicos e biolgicos que controlam os processos biogeoqumicos e
suas variaes em funo do tempo e espao, aliados complexidade
do solo, esto entre os fatores que dicultam a capacidade de acessar
a sua qualidade e identicar parmetros-chaves que possam servir
como indicadores do seu funcionamento. Por essa razo, um conjunto
mnimo de indicadores englobando atributos fsicos, qumicos e bio-
lgicos deve ser utilizado nas anlises de qualidade do solo (DORAN;
PARKIN, 1994), uma vez que nenhum indicador individualmente ir
descrever e quanticar todos os aspectos da qualidade do solo.
O componente biolgico do solo est intimamente relacionado ao
seu funcionamento, apresentando uma estreita inter-relao com os
componentes fsicos e qumicos. Os microrganismos do solo so res-
222
ponsveis por servios ambientais de importncia fundamental, tais
como os processos de formao do solo, decomposio de resduos
orgnicos (animais e vegetais), ciclagem de nutrientes e formao da
matria orgnica, biorremediao de poluentes e agrotxicos, entre
outros. A participao dos microrganismos em todos esses processos
justica a incluso dos indicadores biolgicos ou bioindicadores nos
ndices de qualidade do solo e a necessidade de estudos visando sele-
cionar quais desses indicadores biolgicos seriam os mais apropria-
dos para esse m. Como o estabelecimento de diferentes agroecossis-
temas inuencia diretamente a biota do solo e os processos realizados
por ela, o uso de bioindicadores emerge como um componente impor-
tante dos estudos envolvendo a avaliao da qualidade dos solos agr-
colas, devido a sua sensibilidade para detectar, em etapa anterior em
comparao a outros parmetros fsicos e qumicos, alteraes que
ocorrem nesse ambiente em funo do seu uso e manejo, seja ele
mantenedor, melhorador ou degradador da qualidade (DORAN, 1980;
DICK, 1994; MATSUOKA et al., 2003; SILVA et al., 2009).
Diferentemente do que ocorre com os indicadores qumicos de fer-
tilidade, cujos nveis (muito baixo, baixo, mdio, adequado e alto) j
esto relativamente bem denidos para cada nutriente e tipo de solo
(sempre levando em considerao caractersticas como: textura, teor
de matria orgnica, etc.), a base de informaes disponvel sobre
os dados biolgicos ainda muito pequena. Dessa forma, as dicul-
dades na interpretao dos bioindicadores de qualidade, ou seja, de
saber quando que os valores obtidos indicam ou no um bom solo,
constituem um dos grandes obstculos a serem transpostos para o
uso dessas variveis nas avaliaes de qualidade do solo (TTOLA;
CHAER, 2002).
Outro aspecto a ser destacado que os valores ideais para os bioin-
dicadores podem variar conforme o tipo de solo, sistemas de manejo
e condies climticas. Santana e Bahia-Filho (1999) utilizaram o
termo limite de sustentabilidade para separar a condio sustentvel
da no-sustentvel e sugeriram dois enfoques para o estabelecimento
de critrios de referncias: (1) condio de solo nativo e (2) condies
que maximizem a produo e conservem o meio ambiente. Pode-se
ainda adotar como referncia critrios de variao temporal, quando
223
ocorre o acompanhamento de uma mesma rea ao longo do tempo.
Nesse caso, os valores determinados para os bioindicadores podem
ser monitorados para se avaliar tendncias ao longo do tempo. Na
realidade, tanto as avaliaes comparativas usando as reas de refe-
rncias (comparative assessment), como as avaliaes temporais
(dynamic assessment), so complementares, pois permitem dife-
rentes escalas de avaliao. Desses critrios de referncia, o uso de
reas nativas, com mnimos impactos antropognicos, tem prevale-
cido (DICK, 1994; DORAN; PARKIN, 1994; TRASAR-CEPEDA et al.,
1998; MENDES et al., 2003).
Entre os parmetros utilizados pela comunidade cientca para
caracterizar o componente biolgico dos solos, destacam-se as avalia-
es de biomassa, atividade e diversidade microbiana.
A biomassa microbiana do solo (geralmente expressa em g de
C. g
-1
de solo ou mg de C. kg
-1
de solo) a parte viva e mais ativa da
matria orgnica do solo e constituda principalmente por fungos,
bactrias e actinomicetos. Apesar da sua importncia em relao ao
teor total de C orgnico no solo, o tamanho dos componentes vivos
da matria orgnica relativamente pequeno, variando de 1% a 5%
do C orgnico total dos solos (JENKINSON; LADD, 1981; SMITH;
PAUL, 1990). Como de 99% a 95% da matria orgnica constitu-
da por fraes mortas, relativamente estveis e resistentes a altera-
es, mudanas signicativas nessas fraes podem levar anos e (ou)
dcadas para serem detectadas (RICE et al., 1996). Entretanto, altera-
es signicativas na biomassa microbiana podem ser detectadas com
maior antecedncia quando comparadas a mudanas na matria org-
nica (POWSON et al., 1987; TURCO et al., 1994), porque a biomassa
a frao mais dinmica do C orgnico do solo. Por essa razo, a bio-
massa microbiana tem sido proposta como um indicador do estado e
das alteraes da matria orgnica total do solo e sugerida como uma
medida sensvel do aumento ou decrscimo de sua quantidade.
Entre os mtodos mais utilizados na determinao da biomassa
microbiana no Brasil, destacam-se o de clorofrmio-fumigao-incu-
bao CFI (JENKINSON; POWLSON, 1976) e clorofrmio-fumiga-
o-extrao CFE (VANCE et al., 1987), ambos baseados na esterili-
zao parcial (fumigao) de amostras de solos com clorofrmio. No
224
mtodo CFI, a determinao do tamanho da biomassa feita com base
no uxo de CO
2
liberado das amostras de solo fumigadas e no fumi-
gadas aps um perodo de incubao de 7 a 10 dias (Figura 1). No CFE,
essa determinao feita a partir da extrao do C-orgnico das amos-
tras fumigadas e no fumigadas utilizando um extrator fraco como o
sulfato de potssio (Figura 3). Maiores informaes sobre esses mto-
dos podem ser encontradas em Oliveira et al. (2001), Roscoe et al.
(2006), Reis-Junior e Mendes (2007), Brando-Junior et al. (2008).
Na Reunio de Fertilidade e Biologia do Solo (Fertbio) organi-
zada pela Sociedade Brasileira de Cincia do Solo em Lages, SC, em
2004 , os pesquisadores que trabalham com o intuito de identicar
bioindicadores de qualidade do solo se reuniram e deniram sobre
a padronizao de algumas condies mnimas entre os laborat-
rios, visando permitir a construo de uma base nacional de dados.
Principalmente pela praticidade, menor tempo e trabalho envolvidos
nas anlises e boa repetibilidade na maioria dos ensaios, o mtodo
CFE foi escolhido, com amostragem de solo na camada de 0 cm a 10
cm. Essa deciso visou, tambm, incentivar a adoo dessa anlise em
um nmero maior de laboratrios. O maior desao a essa metodolo-
gia, porm, consistir em encontrar novos mtodos para a anlise do
C, evitando produtos txicos como o dicromato de potssio, uma vez
que h uma demanda mundial de anlises utilizando uma qumica
limpa. Para ns de pesquisa, o mtodo CFI continua a ser til em
diversas situaes. Finalmente, de grande importncia mencionar
que, em qualquer mtodo utilizado, as medidas devem ser feitas sob
condies totalmente padronizadas, a m de permitir a reprodutibi-
lidade e comparao dos resultados.
O quociente microbiano (qMIC) um ndice utilizado para forne-
cer indicaes sobre a qualidade da matria orgnica sendo expresso
pela relao entre o C da biomassa microbiana e o C orgnico total.
Em circunstncias de fatores estressantes para os microrganismos
(pH, decincias nutricionais, presena de metais pesados), a capa-
cidade de utilizao do C menor e, consequentemente, o qMIC tam-
bm diminui (WARDLE, 1994). J com a adio de matria orgnica
de boa qualidade ou com o trmino de uma situao de estresse, a bio-
225
massa aumenta, assim como o qMIC, mesmo se os teores de C org-
nico permanecerem inalterados (POWLSON et al., 1987).
Determinaes da biomassa microbiana no fornecem indicaes
sobre os nveis de atividade das populaes microbianas do solo, ou
seja, podem ocorrer situaes em que os solos apresentem elevadas
quantidades de biomassa inativa e vice-versa. Da a importncia das
anlises que medem a atividade microbiana ou o estado metablico
atual e potencial das comunidades de microrganismos do solo. Entre
esses, destacam-se as determinaes do C e N prontamente minera-
lizveis e as de atividade enzimtica dos solos.
A quantidade de CO
2
liberada pela respirao dos microrganismos
(tambm denominada, C prontamente mineralizvel) um dos
mtodos mais tradicionais e mais utilizados para avaliar a atividade
metablica da populao microbiana do solo (ZIBILSKE, 1994). Da
mesma forma que outras atividades metablicas, a respirao depende
do estado siolgico das clulas e inuenciada por diferentes fatores,
como a umidade, a temperatura e a disponibilidade de nutrientes.
Enquanto os ensaios para determinao da respirao do solo como
um todo podem ser realizados no campo, os ensaios para respirao
microbiana so comumente realizados em vasos hermeticamente
fechados, incubados sob condies controladas de temperatura e
umidade em laboratrio, utilizando-se uma base (KOH ou NaOH)
para capturar o CO
2
que evoludo do solo. Atualmente, nos EUA,
o kit Solvita
produzido pelo Woods End Research Laboratory,

baseado na tecnologia de gel colorimetria, tem sido comercializado
para que os prprios agricultores possam avaliar a respirao do
solo de uma maneira eciente, rpida e barata (www.solvita.co.uk/
products/soil-life-test-kit.htm).
O quociente metablico (qCO
2
) um ndice que expressa a relao
entre a respirao basal do solo e o tamanho da biomassa microbiana.
Esse quociente foi proposto originalmente por Andersom e Domsch
(1978) baseado na teoria do desenvolvimento bionergtico dos ecos-
sistemas de Odum (1969). Essa teoria prediz que comunidades micro-
bianas sob estresse (metais pesados, limitaes de nutrientes, baixo
pH, etc.) ou expostas a qualquer tipo de perturbao (cultivo, quei-
mada, etc.) sero menos ecientes em converter o C assimilado em
226
nova biomassa, pois uma maior parte desse C dever ser utilizado
para fornecer energia (e portanto, respirado como CO
2
) para proces-
sos metablicos necessrios manuteno da homeostase celular. Por
conseguinte, sob tais condies de estresse ou distrbio, o qCO
2
ser
mais elevado quando comparado a ambientes (solos) mais estveis,
ou mais prximos do seu estado de equilbrio.
As enzimas do solo participam das reaes metablicas intercelu-
lares, responsveis pelo funcionamento e pela manuteno dos seres
vivos e tambm desempenham papel fundamental atuando como
catalizadoras de vrias reaes que resultam na decomposio de res-
duos orgnicos (ligninases, celulases, proteases, glucosidases, galacto-
sidases), ciclagem de nutrientes (fosfatases, amidases, urease, sulfa-
tase), formao da matria orgnica e da estrutura do solo (MENDES;
VIVALDI, 2001). A atividade enzimtica de um solo o resultado do
somatrio da atividade enzimtica dos organismos vivos (plantas,
microrganismos e animais) e das enzimas abinticas (enzimas asso-
ciadas frao no viva, que se acumulam no solo protegidas da ao
de proteases atravs da adsoro em partculas de argila e na mat-
ria orgnica). Os ensaios para determinao da atividade enzimtica
so simples e rpidos e baseiam-se na adio de substratos espec-
cos para cada tipo de enzima, a uma amostra de solo suspensa em
um tampo (DICK et al., 1996). Aps um curto perodo de incubao,
as amostras so ltradas e realizada a determinao do produto,
por colorimetria (Figura 3). Quanto maior a intensidade da colora-
o, maior a quantidade de produto formado e, consequentemente,
maior a atividade enzimtica do solo (Figura 4) . Como esses ensaios
so realizados sob condies ideais de pH, temperatura e disponibili-
dade de substrato, representam a atividade potencial mxima e no a
atividade enzimtica real do solo (ALEF; NANNIPIERI, 1995). Vrios
trabalhos tm demonstrado o grande potencial das anlises enzim-
ticas como indicadores sensveis para detectar diferenas entre solos
e mudanas que variam em funo da inuncia antrpica nos mes-
mos (DICK,1994; DICK et al., 1996; TRASAR-CPEDA et al., 1998;
MENDES et al., 2003).
227
Biomassa microbiana (CFI)
Pr-incubao
Amostras no fumigadas
CO
2
das
amostras
fumigadas
CO
2
das
amostras
no fumigadas
Incubao
10 dias
CO
2
KOH
Amostras
fumigadas
Bomba
de vcuo
Dessecador
CHCl
3
Pr incubao -
Extrao com K S O
2 4
Biomassa microbiana (CFE)
Amostras no fumigadas
C extrado das
amostras
fumigadas
C extrado das
amostras
no fumigadas
Fumigao por 48 horas
Amostras
fumigadas
Bomba
de vcuo
solo solo
solo
solo
solo
solo
solo
solo
solo
solo
solo
Dessecador
CHCl
3
solo solo solo solo
solo
Figura 3. Metodolodogias de determinao do carbono da biomassa micro-
biana.
228
Ta mpo + solo
Incubao
por 1 hora
Formao do produto
Filtragem
fosfato
sulfato
glucopiranosideo
Temperatura
pH
p-nitrofenil
Determinao
colorimtrica
420 mm
Adio do substrato
p-nitrofenil
Figura 4. Mtodo colorimtrico de determinao da atividade enzimtica
do solo.
As avaliaes de diversidade microbiana fornecem indicativos sobre
a variedade e a variabilidade, em termos de nmero (riqueza) e abun-
dncia (equitatividade), de espcies presentes em um determinado
solo. O advento de tcnicas moleculares tem permitido identicar
que o nmero de espcies microbianas presentes no solo bastante
superior ao estimado com base em tcnicas tradicionais de cultivo em
placa (WARD et al., 1990). Torsvik et al. (1990), com base em dados
de reassociao de DNA extrado de solo, estimaram que o nmero
de genomas em uma grama de solo estaria em torno de 10.000, dos
quais uma pequena minoria (de 0,1% a 10%) teria capacidade de cres-
cer em meios de cultivo no laboratrio. Embora menos evidente, a
diversidade microbiana to importante quanto diversidade de plan-
tas e animais. Quanto maior a diversidade, maior ser a estabilidade
do ecossistema e a ecincia do uso dos recursos disponveis, pois
menor ser o gasto de energia para sustentar a biomassa ali presente
(TTOLA; CHAER, 2002). Uma alta diversidade microbiana garante
a estabilidade do ecossistema, pois ela produz um efeito tampo no
solo contra estresses ambientais naturais ou causados pelo homem.
Por exemplo, o estabelecimento de uma condio ambiental desfa-
229
vorvel no solo pode resultar na inibio de algumas populaes que
desempenham funes essenciais na comunidade. Em comunidades
com alta diversidade, entretanto, h uma alta probabilidade de ocor-
rncia de microorganismos quiescentes que poderiam desempenhar
a mesma funo, mas que possuem exigncias diferentes relaciona-
das a fatores fsicos, qumicos e biolgicos. Consequentemente, essas
populaes podem atuar como substitutos funcionais, assegurando
que algumas funes vitais sejam sustentadas independentemente
das mudanas ambientais (VAN BRUGGEN; SEMENOV, 2000). Para
um determinado solo, as avaliaes de diversidade envolvem aspec-
tos genticos (riqueza/abundncia de genomas) e funcionais (varie-
dade de funes de decomposio, transformao de nutrientes, pro-
moo/supresso do crescimento de plantas etc.).
Em geral, os estudos de diversidade gentica microbiana so base-
ados na extrao e puricao do DNA das comunidades microbia-
nas do solo, seguidas da amplicao dos genes que codicam para
o RNA ribossmico (rDNA), pela reao da polimerase em cadeia
(PCR), utilizando-se oligonucleotdeos iniciadores universais, para
espcies ou domnios especcos. Posteriormente, os produtos da
amplicao so separados por tcnicas como o eletroforese em gel
de gradiente desnaturante (DGGE); eletroforese gel com gradiente
trmico (TGGE); polimorsmo do comprimento dos fragmentos de
restrio (RFLP); anlise de restrio do rDNA amplicado (ARDRA);
polimorsmo conformacional de ta simples (SSCP); e polimorsmo
do comprimento de fragmentos de restrio terminal (t-RFLP).
O padro de bandas obtidos nessas anlises reete os gentipos
dominantes e a diversidade gentica. As anlises de steres metlicos
de cidos graxos (FAME) e cidos graxos ligados a steres de fosfoli-
pidios (PLFAs), baseadas nos pers de lipdios extrados do solo, tam-
bm so utilizadas para a caracterizao da estrutura da comunidade
microbiana. Alguns cidos graxos com estruturas qumicas distintas
esto associados com maior frequncia e abundncia a determinados
grupos taxonmicos de microrganismos. Essa associao possibilita o
uso dessas molculas como biomarcadores para investigao de alte-
raes na estrutura da comunidade microbiana. Inferncias sobre
mudanas nas estruturas dessas comunidades so baseadas em dife-
230
renas na composio do perl cromatogrco de cidos graxos deri-
vados de fosfolipdios entre amostras. Maiores detalhes sobre todas
essas tcnicas podem ser obtidos em Kirk et al. (2004).
Tambm merecem destaque as metodologias moleculares que inde-
pendem do cultivo, baseadas na extrao direta de cidos nuclicos
de amostras ambientais (metagenmica), associada s tcnicas de
hibridizao com sondas grupo-especcas e (ou) PCR, clonagem e
sequenciamento, que vm permitindo uma avaliao mais precisa da
diversidade microbiana no ambiente e a descoberta de novos grupos
de organismos, nunca antes cultivados (CANHOS; MANFIO, 2004).
O uso do sistema Biolog
TM
(GARLAND; MILLS, 1991), baseado na
incubao de suspenses de solo em microplacas contendo sais de
tetrazlio e 95 fontes diferentes de C, permite a determinao dos per-
s siolgicos da comunidade microbiana (community-level physiologi-
cal profiles; CLPP). Originalmente essas placas destinavam-se carac-
terizao de isolados bacterianos provenientes de amostras clnicas
(havia placas especcas para bactrias gram-positivas e gram-negati-
vas) e no para anlises de estrutura das comunidades microbianas do
solo. Posteriormente, foi desenvolvida a microplaca EcoPlate
TM
Biolog,
que utiliza o mesmo princpio, porm, com 3 repeties de 31 fontes
de carbono consideradas ambientalmente mais relevantes. O corante
tetrazlio, presente em cada poo das microplacas, incolor, mas, ao
ser reduzido pela atividade microbiana, torna-se roxo. A intensidade
dessa colorao medida por espectrofotometria, e a absorbncia uti-
lizada como medida da capacidade da comunidade em degradar os
substratos. Muitas espcies de fungos presentes no solo no conse-
guem promover a reduo dos sais de tetrazlio, por isso placas espe-
ccas para anlises das comunidades de fungo tambm foram desen-
volvidas (CLASSEN et al., 2003). De acordo com a utilizao dessas
fontes, a similaridade entre as comunidades comparada por meio
de uma anlise de agrupamento dos dados. A importncia das an-
lises de diversidade funcional reside no fato de que, somente com
base nas alteraes na diversidade gentica, no possvel inferir se
algumas funes do solo foram perdidas ou no (TTOLA; CHAER,
2002). Alm disso, as anlises de diversidade funcional permitem uma
melhor compreenso do funcionamento da comunidade microbiana,
231
pois possibilitam averiguar a presena de redundncia funcional no
solo, isto , a existncia de populaes que desempenham um mesmo
papel funcional. Quanto maior a redundncia funcional e a diversi-
dade, mais rpido o ecossistema pode retornar s condies originais
iniciais, ou seja, maior a sua resilincia.
Os estudos sobre o efeito de diferentes manejos de solo na micro-
biota dos solos tropicais utilizando avaliaes qualitativas e quan-
titativas da biomassa, atividade e diversidade microbianas so fun-
damentais para identicar quais os parmetros que poderiam ser
recomendados como bioindicadores (Figura 5). Todos os procedimen-
tos mencionados anteriormente para a avaliao da biomassa, ativi-
dade e diversidade microbiana permitem avaliar alguns aspectos do
componente microbiolgico dos solos e auxiliam nos estudos sobre
os efeitos do manejo do solo na microbiota (BALOTA et al., 2003;
BALOTA et al., 2004a,b; MENDES et al., 2003; FRANCHINI et al.,
2007; HUNGRIA et al., 2009; SILVA et al., 2009). Entretanto, consi-
derando que, alm de (a) reetir algum aspecto do funcionamento
do ecossistema; (b) mostrar uma resposta precisa e rpida a qualquer
perturbao; (c) possuir distribuio universal mas com especicida-
des regionais, um bom indicador ecolgico de qualidade do solo tam-
bm deve (d) ser de simples determinao e barato (Holloway & Stork,
1991), possvel que alguns desses procedimentos, devido sua com-
plexidade de anlise e custo elevado (por exemplo, anlises de diversi-
dade genotpica), sejam limitados para utilizao como biondicadores.
Outro aspecto importante e que tambm deve ser considerado que,
como um nico parmetro no capaz descrever e quanticar todos
os aspectos da qualidade do solo, torna-se imprescindvel a combina-
o de vrias determinaes.
232
Biomassa microbiana (CFI)
Pr-incubao
Amostra no fumigadas
CO2 das
amostras
fumigadas
CO2 das
amostras
no fumigadas
Incubao
10 dias
CO 2
KOH
Amostra
fumigadas
Bomba
de vcuo
Dessecador
CHCl 3
solo solo
solo
solo
solo solo
solo
solo
Atividade enzimtica do solo
Ta mpo + solo
Incubao
por 1 hora
Formao do produto
Filtragem
fosfato
sulfato
glucosidase
Temperatura
pH
p-nitrofenil
Determinao
colorimtrica
420 mm
Adio do substrato
p-nitrofenil
Figura 5. Para que possa vir a ser utilizado rotineiramente em anlises de
solo, o bioindicador de qualidade dever ser de simples determinao e
barato .
Em um futuro prximo, o que se vislumbra a possibilidade de que,
alm das propriedades qumicas e fsicas, determinaes das proprie-
dades biolgicas possam fazer parte das rotinas de anlises de solo. A
incluso dos bioindicadores em anlises de solo ser importante tanto
no sentido de atestar a sustentabilidade dos sistemas de produo com
adoo de manejos conservacionistas, como para alertar agricultores
que estejam adotando sistemas de manejo que possam levar degra-
dao do solo. Outras utilizaes dos bioindicadores podem envolver
a ecocerticao de produtos agrcolas, o monitoramento de progra-
mas de recuperao de reas degradadas, o monitoramento de trans-
gnicos, entre outros.
F
o
t
o
s
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I
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C
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X
a
v
i
e
r
233
ndices de qualidade do solo
Tendo em vista que a quanticao da qualidade de um solo um
processo complexo, a elaborao de ndices de Qualidade de Solo
(IQS) (Figura 6) , englobando aspectos fsicos qumicos e biolgi-
cos, constitui-se numa forma de agregar e simplicar informaes
de natureza diversa (SMITH et al., 1994; KARLEN; STOTT, 1994;
TRASAR-CEPEDA et al., 1998; HUSSAIN et al., 1999).
Qumicas
Fsicas
Biolgicas
ndice de
qualidade
do solo
Diversidade
Biomassa
Atividade microbiana
Mat. orgnica
pH
Al
Ca+Mg
P
K
Textura
Densidade
Cap. ret. H O
2
Figura 6. Nenhum indicador individualmente descreve e quantica todos os
aspectos da qualidade do solo. O ndice de Qualidade de Solo (IQS) agrega
e simplica informaes sobre as propriedades fsicas, qumicas e biolgi-
cas do solo.
Karlen e Stott (1994) propuseram uma estratgia para calcular um
IQS baseado na determinao de parmetros qumicos, fsicos e biol-
gicos que avaliassem funes especcas do solo. Posteriormente, essa
estratgia foi replicada/adaptada por diversos autores (HUSSAIN et al.,
1999; CHAER, 2001; SILVA, 2008). A ttulo de exemplo, no modelo
proposto por Chaer (2001) para quanticar o efeito de diferentes mane-
jos na cultura do eucalipto sobre a qualidade do solo, as propriedades
fsicas, qumicas e biolgicas foram relacionadas s seguintes funes
do solo: (1) receber, armazenar e suprir gua; (2) armazenar, suprir e
ciclar nutrientes; (3) promover o crescimento das razes; (4) promo-
ver a atividade biolgica; e (5) manter a homeostase. A cada funo foi
associado um peso numrico, expresso em porcentagem, que deter-
mina o seu peso dentro do modelo. Similarmente, foram denidos
234
pesos para cada indicador associado a cada funo do solo. Cada indi-
cador do modelo foi pontuado em uma escala de 0 a 1 por meio de fun-
es de pontuao padronizada (FPPs) (WYMORE, 1993).
As FPPs possuem forma sigmoide e descendente ou do tipo menos
melhor, quando o aumento do valor do indicador representa piora
da funo do solo (ex.: densidade aparente); ascendente ou do tipo
mais melhor, quando o aumento do valor do indicador representa
melhora da funo (ex.: matria orgnica ou biomassa microbiana do
solo); e do tipo timo, usada para indicadores que possuem nvel
timo para a funo (ex.: pH ou nveis de determinados nutrientes).
Os valores dos limites inferiores, superiores e timo que determi-
nam a forma das curvas das funes de pontuao foram denidos
com base na literatura (para os indicadores qumicos) e nos valores
encontrados em uma rea com mata nativa adjacente ao povoamento
de eucalipto (para os indicadores fsicos e biolgicos). Finalmente, o
IQS foi calculado pela soma das pontuaes obtidas por cada indica-
dor, ponderada pelos pesos denidos de acordo com o grau de impor-
tncia atribudo tanto ao indicador, em relao funo do solo ao qual
ele foi associado, quanto prpria funo, em relao qualidade glo-
bal do solo. Na profundidade de 0 cm a 5 cm, o maior IQS foi obtido
no solo sob vegetao natural, seguido dos solos sob eucalipto sub-
metidos a manejos que priorizaram a conservao dos resduos org-
nicos por ocasio da reforma do povoamento. Os valores mais baixos
dos IQS foram observados nos tratamentos em que houve a remoo
ou queima do material orgnico da superfcie do solo.
Wienhold et al. (2004) tambm usaram uma estratgia semelhante
e compararam vrios sistemas de manejo por meio do clculo de um
IQS a partir de valores normalizados de vrios indicadores. A pas-
tagem fertilizada e bem manejada foi o sistema que apresentou o
maior IQS seguida em ordem decrescente pelos seguintes sistemas
de manejo: pastagem com moderada carga animal; pastagem sem
animais; pastagem com alta carga de animais; cultura anual sob plan-
tio direto; e cultura anual sob plantio convencional, que apresentou
o menor IQS.
As planilhas utilizadas no trabalho de Chaer (2001) constituram
a base para o desenvolvimento do software SIMOQS Sistema de
235
Monitoramento da Qualidade do Solo, uma ferramenta computa-
cional desenvolvida na Universidade Federal de Viosa. O Simoqs
permite a construo e conduo de testes de modelos para clculos
de ndices de qualidade de solos de forma rpida, com uma interface
amigvel e que podem ser aplicados a diferentes regies e culturas
(CHAER, 2001). Mendes et al. (2008) vericaram que o uso do Simoqs
foi ecaz como ferramenta para auxiliar na avaliao da qualidade do
solo em diferentes agroecossistemas na regio do Cerrado. Por meio
dos clculos do IQS, foi possvel conrmar os benefcios das pasta-
gens bem manejadas (principalmente quando em consrcio com legu-
minosas), da rotao lavoura/pastagem e do plantio direto como sis-
temas de manejo capazes de favorecerem a qualidade desses solos.
Outra estratgia para elaborao de ndices de qualidade de solo
baseada na construo de modelos orientados por anlises de com-
ponentes principais (ACP) (ANDREWS et al., 2002) ou de regresso
mltipla (TRASAR-CEPEDA et al., 1998; CHAER et al., 2009). Por
exemplo, Trasar-Cepeda et al. (1998) sugeriram que a matria org-
nica de solos no perturbados (sob vegetao nativa) est em equil-
brio com vrias propriedades biolgicas e bioqumicas do solo. Esse
equilbrio pde ser expresso por uma equao de regresso linear
mltipla que estimou o contedo total de N do solo em funo do C
da biomassa microbiana, da capacidade de mineralizao de N e das
atividades de fosfatase, -glucosidase e urease (R
2
=0,97). Desse modo,
esses autores propuseram um ndice bioqumico de qualidade de solo
calculado a partir dos teores reais e estimados de N do solo (relao N
medido/N estimado). Estudos posteriores demonstraram a validade
desse ndice para indicar a degradao ou o distrbio de solos afeta-
dos pelo manejo, minerao ou contaminao com euentes orgni-
cos e metais pesados (LEIROS et al., 1999; TRASAR-CEPEDA et al.,
2000). Chaer et al. (2009), utilizando a mesma estratgia proposta por
Trasar-Cepeda et al. (1998), observaram que o teor de C total de dife-
rentes solos de orestais de conferas no-perturbadas do noroeste
dos EUA pde ser explicado apenas pelo C da biomassa microbiana e
pela atividade de fosfatase, independentemente do horizonte do solo
ou da poca de coleta das amostras. A relao entre o C medido (C
med
)
e o C estimado (C
est
) por meio de um modelo de anlise de regresso
236
linear mltipla (R
2
=0,97) provou ser um indicador simples para aces-
sar os efeitos de diferentes estresses (pH e metais pesados) e distr-
bios (ciclos de umedecimento e secagem e de congelamento e des-
congelamento) aplicados aos solos daquela regio.
Em um mundo globalizado, em que a preocupao com a valora-
o dos servios ambientais e as barreiras ao comrcio internacional
se tornam cada vez mais evidentes, possvel que, uma vez bem de-
nidos e normatizados, o uso de ndices de qualidade de solo permita
a agregao de valor aos produtos agrcolas oriundos de proprieda-
des rurais/pases que sejam capazes de comprovar que as prticas de
manejo adotadas em suas lavouras permitem a manuteno/melho-
ria da qualidade do solo, garantindo a preservao desse recurso para
as geraes futuras. Seguindo esse raciocnio, o uso desses ndices
poderia tambm servir como referencial para a valorao das terras
(TTOLA; CHAER, 2002). Vrias agncias reguladoras internacio-
nais tm discutido os padres a serem utilizados nas avaliaes de
qualidade do solo. A ttulo de exemplo, o comit tcnico internacio-
nal ISO 190, Qualidade do Solo, props uma lista de 35 parme-
tros (qumicos, fsicos e biolgicos) como indicadores de qualidade
de solo; o US Environmental Protection Agency (EPA) props uma
lista de 1.800 parmetros como indicadores de qualidade qumica
do solo, enquanto, na Organization for Economic Cooperation and
Development (OECD), esto sendo denidos diversos indicadores
agroambientais (aproximadamente 250, dos quais 58 relacionados
qualidade do solo) (BURNS et al., 2006).
Atualmente, a Nova Zelndia j possui um sistema governamental
on-line (http://sindi.landcare.cri.nz ) para avaliao da qualidade do
solo, denominado The New Zealand Soil Indicators (SINDI), que uti-
liza apenas sete parmetros. Os dados obtidos em cada propriedade
rural podem ser comparados, simultaneamente, a um banco de dados
nacional oriundo de 500 solos ou ao melhor conhecimento disponvel
para cada indicador (interpretao do especialista). A Holanda tam-
bm possui um programa de monitoramento da qualidade do solo em
larga escala, onde 200 locais so monitorados (BLOEM et al., 2006). A
rede holandesa para monitoramento da qualidade do solo dividiu os
solos do pas, com seus respectivos usos da terra, em 10 classes. Para
237
cada classe de solo/uso, 20 locais diferentes (repeties) so amostra-
dos. Desde 1997, um grupo de bioindicadores (biomassa, C e N mine-
ralizvel, incorporao de timidina) foi includo no monitoramento
holands. As amostras de solo so coletadas na profundidade de 0 cm
a 10 cm, armazenadas em geladeira (12 C) e pr-incubadas a 12 C e
50% da capacidade de campo por quatro semanas antes do incio das
determinaes analticas.
Longe da pretenso de representar um consenso, as vrias aborda-
gens utilizadas para o monitoramento da qualidade do solo e para os
clculos de IQS constituem, antes de tudo, subsdios para discusses
tcnicas e loscas sobre:
a) Quais os atributos (qumicos, fsicos e biolgicos) devem fazer
parte de um conjunto mnimo de dados para avaliar a quali-
dade do solo.
b) Como padronizar as metodologias utilizadas na sua determi-
nao e os procedimentos para coleta e armazenamento das
amostras de solo.
c) Como ajustar modelos de referncia para cada sistema de
manejo/cultura avaliado, denindo os pesos e valores de cada
funo/indicador nesses modelos e levando em considerao
os aspectos locais, principalmente aqueles relacionados s con-
dies edafoclimticas.
Conforme destacado por Chaer (2001), o estudo da qualidade do
solo implica na avaliao de um grande nmero de caractersticas que,
alm de gerarem um grande volume de dados, geram tambm muitas
diculdades na interpretao dos mesmos, pois comum a ocorrn-
cia de tendncias divergentes entre os indicadores. A ttulo de exem-
plo, esse autor cita que, em solos sob vegetao nativa que foram con-
vertidos para agricultura com base em adubaes qumicas e calagem
do solo, a rpida melhoria nos atributos qumicos para o desenvolvi-
mento das plantas cultivadas acompanhada simultaneamente por
uma drstica alterao nos aspectos relacionados biologia do solo,
tais como a reduo do carbono da biomassa microbiana, que no so
passveis de reconstituio no curto/mdio prazo. A compatibilizao
dessas questes, a incluso do componente econmico relacionado
produtividade das culturas nos clculos de IQS e a prpria forma de
238
utilizao desses ndices so aspectos importantes que tambm deve-
ro ser objeto de discusso em estudos futuros. Uma certeza, porm,
permanece, conforme destacado por Mendes e Reis Junior (2004): a de
que a busca por prticas agrcolas que proporcionem altas produtivi-
dades, mas que tambm levem em considerao os diversos aspectos
relativos qualidade ambiental uma equao complexa cuja resolu-
o no pode, denitivamente, negligenciar o componente biolgico
do solo, pois este apresenta uma estreita inter-relao com os compo-
nentes fsicos e qumicos, os quais iro em conjunto inuenciar no
s a produtividade das culturas, mas tambm a sustentabilidade dos
sistemas agrcolas.
Consideraes finais
O futuro da utilizao dos bioindicadores nos estudos de quali-
dade dos solos brasileiros depende das aes que esto sendo con-
duzidas hoje. Existe a necessidade de um esforo a nvel nacional
para a realizao de avaliaes sistemticas para se medir e inter-
pretar os parmetros que sirvam adequadamente como bioindicado-
res, padronizando os mtodos desde a amostragem, a estocagem e o
pr-tratamento das amostras at os procedimentos analticos e a apre-
sentao dos resultados. Embora j existam atualmente algumas ini-
ciativas nesse sentido no Pas, tais como o Projeto Uso de parme-
tros microbiolgicos como bioindicadores para avaliar a qualidade
do solo e a sustentabilidade dos agroecossistemas (www.cpac.cnptia.
embrapa.br), a articulao/estruturao de uma rede Rede Brasileira
para Monitoramento da Qualidade de Solos Agrcolas, com arranjo
multi-institucional e carter transdiciplinar, seria uma forma de agre-
gar todos os especialistas envolvidos no assunto. Esse esforo favo-
receria a otimizao dos recursos investidos na pesquisa e auxiliaria
na comparao dos resultados obtidos em diferentes pontos do ter-
ritrio nacional.
Outra questo refere-se necessidade da construo de uma base
de dados consistente sobre os atributos biolgicos de diferentes solos
brasileiros, semelhantemente ao banco de dados de 500 solos utiliza-
dos pelos pesquisadores neozelandeses para a elaborao do Sindi. A
formao, manuteno e alimentao constante de uma base de dados
239
dessa natureza auxiliariam fortemente na superao de diculdades
na interpretao dos valores dos bioindicadores, permitindo saber, por
exemplo, quo distantes os valores obtidos esto ou no de um bom
solo, localizado sob condies similares. Outro aspecto que tambm
deve ser considerado o fato de que, num pas de dimenses conti-
nentais, como o Brasil, possvel a ocorrncia de variaes regionais,
com relao aos bioindicadores.
Enm, existe no cenrio atual uma forte demanda de pesquisa
sobre Bioindicadores de qualidade solo, tema complexo, de abran-
gncia nacional, cujas respostas no podem ser atendidas por pro-
jetos de pesquisa isolados. O Brasil possui especialistas com capaci-
dade para responder esses desaos cabendo a ns cientistas do solo,
nossas instituies, rgos governamentais e sociedades cientcas
envidar todos os esforos para tornar esse sonho realidade no mais
breve perodo de tempo.
Referncias
ALEF, K; NANNIPIERI, P. Enzyme activities. In: ALEF, K; NANNIPIERI, P. (Ed.).
Methods in applied microbiology and biochemistry. London: Academic Press,
1995. p. 311-374.
ANDERSON, J. P.; DOMSCH, K. H. A physiological method for the quantitative
measurement of microbial biomass in soils. Soil Biology and Biochemistry, v. 10,
p. 215-221, 1978.
ANDREWS, S. S.; KARLEN, D. L.; MITCHELL, J. P. A comparison of soil quality
indexing methods for vegetable production systems in Northern California.
Agriculture Ecosystems & Environment, v. 90, p. 25-45, 2002.
BALOTA, E. L.; KANASHIRO, M.; COLOZZI FILHO, A.; ANDRADE, D. S.; DICK,
R. P. Soil enzyme activities under long-term tillage and crop rotation systems.
Brazilian Journal of Microbiology, v. 35, p. 300-306, 2004a.
BALOTA, E. L.; COLOZZI FILHO, A.; ANDRADE, D. S.; DICK, R. P. Long-term
tillage and crop rotation effects on microbial biomass and C and N mineralization
in a Brazilian Oxisol. Soil & Tillage Research, v. 77, p. 137-145, 2004b.
BALOTA, E. L.; ANDRADE, D. S.; COLOZZI FILHO, A.; DICK, R. P. Microbial
biomass in soils under different tillage and crop rotation systems. Biology and
Fertility of Soils, v. 38, p. 15-20, 2003.
240
BLOEM, J.; SCHOUTEN, A. J.; SOREN, J. S; RUTGERS, M.; WERF, A.;
BREURE,M. Monitoring and evaluating soil quality. In: BLOEM, J.; HOPKINS,
D. W.; BENEDETTI, A. (Ed.). Microbiological methods for evaluating soil quality.
Cambridge: CABI, 2006. p. 23-49.
BRANDO-JUNIOR, O.; HUNGRIA, M.; FRANCHINI, J. C.; ESPNDOLA, C. R.
Comparao entre os mtodos de fumigao-extrao e fumigao-incubao para
a determinao do carbono da biomassa microbiana em um Latossolo Vermelho
distrofrrico eutrco do norte do Paran. Revista Brasileira de Cincia do Solo,
v. 32, p. 1911-1919, 2008.
BURNS, R. G.; NANNIPIERI, P.; BENEDETTI, A.; HOPKINS, D. W. Dening soil
quality. In: BLOEM, J.; HOPKINS, D. W.; BENEDETTI, A. (Ed.). Microbiological
methods for evaluating soil quality. Cambridge: CABI, 2006. p. 23-49.
CHAER, G. M. Modelo para determinao de ndice de qualidade do solo baseado
em indicadores fsicos, qumicos e microbiolgicos. 2001. 89 f. Dissertao
(Mestrado) - Universidade Federal de Viosa, Viosa, 2001.
CHAER, G. M.; MYROLD, D. D.; BOTTOMLEY, P. J. A soil quality index based
on the equilibrium between soil organic matter and biochemical properties of
undisturbed coniferous forest soils of the Pacic Northwest. Soil Biology and
Biochemistry, v. 41, p. 822-830, 2009.
CLASSEN, A. T.; BOYLE, S. I; HASKINS, K. E.; OVERBY, S. T.; HART, S. C.
Community-level physiological proles of bacteria and fungi: plate type and
incubation temperature inuences on contrasting soils. FEMS Microbiology
Ecology, v. 44, p. 319-328, 2003.
DICK, R. P. Soil enzymes activities as indicators of soil quality. In: DORAN, J. W.;
COLEMAN, D. C.; BEZDICEK, D. F.; STEWART, B. A. (Ed.). Defining soil quality
for a sustainable environment. Madison: Soil Science Society of America, 1994.
p. 107-124. (Special Publication number, 35).
DICK, R. P.; BREAKWELL, D. P; TURCO, R. Soil enzyme activities and
biodiversity measurements. In: DORAN, J. W.; JONES, A. J. (Ed.). Methods for
assessing soil quality. Madison: Soil Science Society of America, 1996. p. 247-272.
(Special publication number, 49).
DORAN, J. W. Soil microbial and biochemical changes associated with reduced
tillage. Soil Science Society of America Journal, Madison, v. 44, p. 765-771, 1980.
DORAN, J. W.; PARKIN, T. B. Dening and assessing soil quality. In: DORAN,
J. W.; COLEMAN, D. C.; BEZDICEK, D. F.; STEWART, B. A. (Ed.). Defining soil
quality for a sustainable environment. Madison: Soil Science Society of America,
1994. p. 107-124. (Special Publication number, 35).
241
FRANCHINI, J. C.; CRISPINO, C. C.; SOUZA, R. A.; TORRES, E.; HUNGRIA,
M. Microbiological parameters as indicators of soil quality under various soil
management and crop rotation systems in southern Brazil. Soil and Tillage
Research, Dordrecht, v. 92, p. 18-29, 2007.
GARLAND, J. L.; MILLS, A. L. Classication and characterization of
heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community-level
sole-carbon-source utilization. Applied and environmental Microbiology, v. 57,
p. 2351-2359, 1991.
HOLLOWAY, J. D.; STORK, N. E. The dimension of biodiversity: the use of
invertebrates as indicators of human impact. In: HAWKSWORTH, D. L. (Ed.).
The biodiversity of microorganisms and invertebrates: Its role in sustainable
agriculture. Wallington: CAB International, 1991. p. 37-63.
HUNGRIA, M.; FRANCHINI, J. C.; BRANDO-JUNIOR, O.; KASCHUK,
G.; SOUZA, R. A. Soil microbial activity and crop sustainability in a long-term
experiment with three soil-tillage and two crop-rotation systems. Applied Soil
Ecology, 2009.
HUSSAIN, I; OLSON, K. R.; WANDER, M. M.; KARLEN, D. L. Adaptation of soil
quality indices and application to three tillage systems in southern Illinois. Soil and
tillage Research, v. 50, p. 237-249, 1999.
JENKINSON, D. S.; LADD, J. N. Microbial biomass in soils: measurement and
turnover. In: PAUL, E. A.; LADD, J. N. (Ed.). 5th ed. Soil Biochemistry. New York:
Marcel Decker, 1981. p. 415-471.
JENKINSON, D. S.; POWLSON, D. S. The effects of biocide treatment on
metabolism in soil. V. A method for measuring soil biomass. Soil Biology and
Biochemistry, v. 8, p. 209-213, 1976.
KARLEN, D. L.; STOTT, D. E. A framework for evaluating physical and chemical
indicators of soil quality. In: DORAN, J. W.; COLEMAN, D. C.; BEZDICEK, D.
R.; STEWART, B. A. (Ed). Defining soil quality for a sustainable environment.
Madison: Soil Science Society of America, 1994. p. 53-72. (Special Publication, 35).
KIRK, J. L; BEAUDETTE, L. A.; HART, M.; MOUTOGLIS, P.; KLIRONOMOS, J.
N.; LEE, H.; TREVORS, J. T. Methods of studying soil microbial diversity. Journal
of Microbiological Methods, v. 58, p. 169-188, 2004.
LEIROS, M. C.; TRASAR-CEPEDA, C.; GARCIA-FERNANDEZ, F.; GIL-SOTRES,
F. Dening the validity of a biochemical index of soil quality. Biology and Fertility
of Soils, v. 30, p. 140-146, 1999.
MANFIO, G. P.; CANHOS, V. P. Recursos microbiolgicos para Biotecnologia.
In: SILVEIRA, J. M.; DAL POZ, M. E.; ASSAD, A. L. D. (Org.). Biotecnologia e
recursos genticos: desaos e oportunidades para o Brasil. Campinas: Instituto de
Economia Unicamp: FINEP, 2004. p. 233-252.
242
MATSUOKA, M.; MENDES, I. C.; LOUREIRO, M. F. Biomassa microbiana e
atividade enzimtica em solos sob vegetao nativa e sistemas agrcolas anuais e
perenes na regio de Primavera do Leste- MT. Revista Brasileira de Cincia do Solo,
v. 27, p. 425-433, 2003.
MENDES, I. C.; REIS JUNIOR, F. B. Uso de parmetros microbiolgicos
como indicadores para avaliar a Qualidade do Solo e a sustentabilidade dos
agroecossistemas. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2004. 34 p. (Embrapa
Cerrados. Documentos, 112).
MENDES, I. C.; SOUZA, L. V.; RESCK, D. V. S.; GOMES, A. C. Propriedades
biolgicas em agregados de um LE sob plantio convencional e direto no Cerrado.
Revista Brasileira de Cincia do Solo, v. 27, p. 435-443, 2003.
MENDES, I. C.; SILVA, L. G.; REIS JNIOR, F. B.; TTOLA, M. R. Clculo de
um ndice de qualidade de solo para diferentes agroecossistemas do Cerrado. In:
SIMPSIO NACIONAL SOBRE O CERRADO, 9.; SIMPOSIO INTERNACIONAL
SOBRE SAVANAS TROPICAIS, 2., 2008, Braslia, DF. Anais... Planaltina, DF:
Embrapa Cerrados, 2008. 1 CD-ROM.
MENDES, I. C; VIVALDI, L. Dinmica da biomassa e atividade microbiana em
uma rea sob mata de galeria na regio do DF. In: RIBEIRO, J. F.; FONSECA, C. E.
L. da; SOUSA-SILVA, J. C. (Ed.). Cerrado: caracterizao e recuperao de Matas de
Galeria. Planaltina, DF: EMBRAPA-CPAC, 2001. p. 664-687.
ODUM, E. P. The strategy of ecosystem development. Science, v. 164, p. 262-270,
1969.
OLIVEIRA, J. R. A.; MENDES, I. C.; VIVALDI, L. Carbono da biomassa microbiana
em solos de cerrado sob vegetao nativa e sob cultivo: avaliao dos mtodos
fumigao- incubao e fumigao-extrao. Revista Brasileira de Cincia do Solo,
v. 25, p. 863-871, 2001.
POWLSON, D. S; BROOKES, P. C; CHRISTENSEN, B. T. Measurement of soil
microbial biomass provides an early indication of changes in total organic matter
due to straw incorporation. Soil Biology and Biochemistry, v.19, p.159-164, 1987.
REIS JUNIOR, F. B.; MENDES, I. C. Biomassa microbiana do solo. Planaltina, DF:
Embrapa Cerrados, 2007. 40 p. (Embrapa Cerrados. Documentos, 205).
RICE, C. W.; MOORMAN, T. B.; BEARE, M. Role of microbial biomass carbon
and nitrogen in soil quality. In: DORAN, J. W.; JONES, A. J. (Ed.). Methods for
assessing soil quality. Madison: Soil Science Society of America, 1996. p. 203-216.
(Special Publication, 49).
243
ROSCOE, R.; MERCANTE, F. M.; MENDES, I. C.; REIS-JUNIOR, F. B.;
FRANCHINI, J. C.; HUNGRIA, M. Biomassa microbiana do solo: frao mais ativa
da matria orgnica. In: ROSCOE, R.; MERCANTE, F. M.; SALTON, J. C. (Ed.).
Dinmica da matria orgnica do solo sistemas conservacionistas: modelagem
matemtica e mtodos auxiliares. Dourados: Embrapa Agropecuria Oeste, 2006.
p. 163-198.
SANTANA, D. P.; BAHIA-FILHO, A. F. C. Indicadores de qualidade do solo. In:
CONGRESSO BRASILEIRO DE CINCIA DO SOLO, 27., 1999, Braslia, DF.
Cincia do solo e qualidade de vida: resumos. Braslia, DF: Embrapa Cerrados:
UnB, 1999. 1 CD-ROM.
SILVA, L. G. Uso e monitoramento de indicadores microbiolgicos para avaliao
da qualidade dos solos de cerrado sob diferentes agroecossistemas. 2008. 121 f.
Dissertao (Mestrado)- Universidade de Braslia, Braslia, DF.
SILVA, L. G.; MENDES, I. C.; REIS JUNIOR, F. B.; FERNANDES, M. F.; MELO,
J. T; KATO, E. Atributos fsicos, qumicos e biolgicos de um Latossolo de cerrado
sob plantio de espcies orestais. Pesquisa Agropecuria Brasileira, v. 44, n. 6,
p. 613-620, jun. 2009.
SMITH, J. L; HALVORSON, J.; PAPENDICK, R. I. Variable indicator Kriging: a
procedure for integrating soil quality indicators. In: DORAN, J. W.; COLEMAN, D.
C.; BEZDICEK, D. F.; STEWART, B. A. (Ed.). Defining soil quality for a sustainable
environment. Madison: Soil Science Society of America, 1994. p. 107-124. (Special
Publication number, 35).
SMITH, J. L.; PAUL, E. A. The signicance of soil microbial biomass estimations.
In: BOLLAG, J.; STOTZKY, D. G. (Ed.). Soil biochemistry. New York: M. Dekker,
1990. v. 6. p. 357-396.
TORSVIK, V.; GOKSOYR, J.; DAEE, F. L. High diversity in DNA soil bacteria.
Applied and Environmental Microbiology, v. 56, p. 782-787, 1990.
TTOLA, M. R.; CHAER, G. M. Microrganismos e processos microbiolgicos
como indicadores da qualidade dos solos. In: ALVAREZ, V. H; SCHAEFER, C. E.
G. R; BARROS, N. F.; MELLO, J. W. V.; COSTA, L. M. (Ed.). Tpicos em Cincia do
Solo. Viosa: Sociedade Brasileira de Cincia do Solo, 2002. p. 195-276. v. 2.
TRASAR-CEPEDA, C.; LEIRS, M. C.; GIL-SOTRES, F.; SEOANE, S. Towards a
biochemical quality index for soils: an expression relating several biological and
biochemical properties. Biology and Fertility of Soils, v. 26, p. 100-106, 1998.
TRASAR-CEPEDA, C.; LEIRS, M. C.; SEOANE, S.; GIL-SOTRES, F. Limitations
of soil enzymes as indicators of soil pollution. Soil Biology & Biochemistry, v. 32,
p. 1867-1875, 2000.
244
TURCO, R. F.; KENNEDY, A. K.; JAWSON, M. D. Microbial indicators of soil
quality. In: DORAN, J. W.; COLEMAN, D. C.; BEZDICEK, D. F.; STEWART, B. A.
(Ed.). Defining soil quality for a sustainable environment. Madison: Soil Science
Society of America, 1994. p. 107-124. (Special Publication number, 35).
VAN BRUGGEN, A. H. C.; SEMENOV, A. M. In: Search of biological indicators for
soil health and disease suppression. Applied Soil Ecology, v. 15, p. 13-24, 2000.
VANCE, E. D.; BROOKES, P. C.; JENKINSON, D. S. An extraction method
for measuring soil microbial biomass C. Soil Biology and Biochemistry, v. 19,
p. 703-707, 1987.
WARD, D. M.; WELLER, R.; BATESON, M. M. 16S rRNA sequences reveal
numerous uncultured microrganisms in a natural community. Nature, v. 345,
p. 63-65, 1990.
WARDLE, D. Metodologia para quanticao da biomassa microbiana do solo. In:
HUNGRIA, M.; ARAUJO, R. S. (Ed.). Manual de mtodos empregados em estudos
de microbiologia agrcola. Braslia, DF: EMBRAPA-CNPAF, 1994. p. 419-436.
(EMBRAPA-CNPAF. Documentos, 46).
WIENHOLD, B. J.; ANDREWS, S. S.; KARLEN, D. L. Soil quality: a review of the
science and experiences in the USA. Environmental Geochemistry and Health,
v. 26, p. 89-95, 2004.
WYMORE, A. W. Model-Based systems engineering: An Introduction to the
mathematical theory of discrete systems and to the tricotyledon theory of system
design. Boca Raton: CRC, 1993.
ZIBILSKE, L. M. Carbon mineralization. In: WEAVER, R. W.; SCOTT, A.;
BOTTOMLEY, P. J. (Ed.). Methods of soil analysis: microbiological and
biochemical properties. Madison: Soil Science Society of America, 1994.
p. 836-864. (Special Publication, 5).
Captulo 9
247
Fixao biolgica de nitrognio:
uma revoluo na agricultura
Ida de Carvalho Mendes
Veronica Massena Reis
Mariangela Hungria
Introduo
Entre os nutrientes minerais essenciais s plantas, o nitrognio
(N) o mais caro, o que consome mais energia para sua produo e,
potencialmente, o mais poluente, sendo geralmente o mais limitante
produo vegetal (HUNGRIA et al., 2007). No entanto, no Brasil, o
uso do nitrognio bem menor quando comparado a outros pases,
o que se deve, em parte, utilizao e busca por sistemas produtivos
que se beneficiem da fixao biolgica do nitrognio (FBN).
A FBN considerada, aps a fotossntese, o mais importante pro-
cesso biolgico do planeta, sendo fundamental para vida na terra.
baseada no fato de que alguns microrganismos especiais, conhecidos
como microrganismos fixadores de N
2
, tambm chamados de diazo-
trficos, so capazes de quebrar a tripla ligao que une os dois to-
mos de nitrognio atmosfrico (N
2
), transformando-o em amnia,
que assimilvel pelas plantas. Se a associao entre esses microrga-
nismos e as plantas for eficiente, o N fixado pode suprir quase todas
as necessidades do vegetal, dispensando o uso de fertilizantes nitro-
genados e oferecendo, assim, vantagens econmicas e ecolgicas.
O exemplo mais conhecido consiste na simbiose de bactrias da
ordem Rhizobiales, denominadas corriqueiramente como rizbios,
com plantas da famlia Leguminosae. Nesse caso, as bactrias diazo-
trficas se associam simbioticamente s plantas, formando estrutu-
ras especializadas nas razes chamadas ndulos, nos quais ocorre o
processo de FBN. Ainda nos ndulos, amnia sintetizada so rapi-
damente incorporados ons hidrognio (H
+
), abundantes nas clulas
das bactrias, ocorrendo a transformao em ons amnio (NH
4
+
) que
248
sero, ento, distribudos para a planta hospedeira e incorporados em
diversas formas de N orgnico, como os uredos, aminocidos e ami-
das (HUNGRIA et al., 2007).
No so apenas as plantas da famlia das leguminosas que se benefi-
ciam da FBN. Estudos iniciados na dcada de 1970 tm mostrado que
valores de 10% a 60% do N acumulado na planta tambm podem ser
provenientes do nitrognio atmosfrico em milho (Zea mays), arroz
(Oryza sativa), cana-de-acar (Saccharum spp.), algumas gramneas
forrageiras e outras no leguminosas. O N proveniente da FBN nessas
plantas seria derivado, principalmente, de associaes com bactrias
diazotrficas localizadas na regio rizosfrica, ou at mesmo dentro
dos tecidos das razes, colmos e folhas das plantas (bactrias endof-
ticas). So conhecidas vrias espcies de bactrias associadas a no
leguminosas, como exemplo, podemos citar aquelas pertencentes aos
gneros Azospirillum, Herbaspirillum e Gluconacetobacter.
Fixao biolgica de nitrognio na soja
Das leguminosas produtoras de gros, a soja a de maior importn-
cia econmica e a que recebe maior contribuio da FBN (Figura 1).
Para a produo de uma tonelada de gros de soja, com 6,5% de N,
so necessrios, pelo menos, 80 kg de N (gros + parte vegetativa).
Considerando-se a produtividade mdia de 2.661 kg/ha (CONAB,
2009), so necessrios cerca de 200 kg de N por hectare. Resultados
experimentais indicam que a FBN contribui com cerca de 85% do N
total acumulado, somado ao N existente no solo, que absorvido pela
planta. Consequentemente, a FBN contribuiu com 170 kg de N/ha,
correspondentes a 378 kg de uria/ha, pois esse fertilizante contm
45% de N. Com o preo da uria a U$ 600,00/ton (cotao em junho
de 2009), seriam gastos, portanto, U$ 4,9 bilhes para a utilizao
de uria nos 21,6 milhes de hectares cultivados com soja no Brasil
(CONAB, 2009). Contudo, como a eficincia de utilizao do fertili-
zante nitrogenado , em mdia, de apenas 50%, devido imobiliza-
o microbiana e a possveis perdas por volatilizao de amnia, lixi-
viao e desnitrificao, por exemplo, essa economia pode atingir at
U$ 9,8 bilhes/ano. Isso mostra que, alm dos trabalhos de melhora-
mento, que resultaram no lanamento de cultivares de alta produti-
249
Captulo 9 Fixao biolgica de nitrognio: uma revoluo na agricultura
vidade adaptadas aos trpicos, a viabilidade econmica da cultura da
soja, no Brasil, deve-se tambm ao desses microrganismos que
trabalham de graa para o agricultor.
Figura 1. Ndulos nas razes de soja (Glycine max (L.) Merr.). Dentro dos
ndulos, ocorre o processo de fixao biolgica de N
2
, pela ao do com-
plexo enzimtico da nitrogenase, responsvel pela reduo do N
2
atmosf-
rico em amnia.
Fonte: Hungria et al., (2007) .
No incio da expanso da cultura da soja no Brasil, nossos solos
no possuam populao estabelecida de rizbios capazes de for-
mar uma simbiose eficaz com essas plantas e a qualidade dos inocu-
lantes era sofrvel. Nos anos 1970, no antigo Instituto de Pesquisas
Agropecurias do Centro Sul (IPEACS), hoje Embrapa Agrobiologia,
a estirpe de Bradyrhizobium elkanii 29W (=Semia 5019) foi isolada
e inicialmente testada em diversos trabalhos de seleo e adaptao
de estirpes de rizbio (DE-POLLI et al., 2008). Esses trabalhos foram
muito importantes para que o grupo de pesquisadores da Embrapa
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Cerrados, em trabalho conjunto com a UFRGS, selecionasse essa
estirpe para utilizao em inoculantes comerciais para soja (PERES;
VIDOR, 1980). Em 1980, alm da SEMIA 5019, outra estirpe de B.
elkanii, a Semia 587, tambm foi selecionada (VARGAS; SUHET,
1980). Com a incluso dessas duas estirpes nos inoculantes comer-
ciais, foi possvel viabilizar o cultivo da soja no Cerrado brasileiro sem
o uso de fertilizantes nitrogenados e com produtividade semelhante
a obtida na regio Sul poca. Treze anos depois do lanamento das
estirpes Semia 5019 e Semia 587, grande parte das reas plantadas
com soja j tinha sido inoculada e apresentavam populao estabe-
lecida de Bradyrhizobium, mas a continuidade dos trabalhos culmi-
nou com o lanamento, em 1993, de duas estirpes de Bradyrhizobium
japonicum, a CPAC-7 (=Semia 5080) e a CPAC-15 (=Semia 5079), que
se mostraram mais eficientes que as estirpes lanadas anteriormente
(PERES et al., 1993). Ainda, hoje, so essas as quatro estirpes reco-
mendadas para o inoculante comercial de soja no Brasil (Figura 2).
Figura 2. Ensaio conduzido em rea de primeiro cultivo de soja, comparando
plantas no inoculadas (primeiro plano) com plantas inoculadas com estir-
pes eficientes (segundo plano).
Fonte: Hungria et al., (2007).
Quando a soja comeou a ser cultivada havia o temor, por parte
dos agricultores, de que somente a inoculao no seria suficiente
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para suprir todo o nitrognio necessrio para alcanar boas produti-
vidades. No entanto, vrias pesquisas realizadas na dcada de 1980
demonstraram que, utilizando-se um inoculante de boa qualidade, a
prtica da adubao nitrogenada na semeadura da soja era totalmente
desnecessria (VARGAS; SUHET,1980; VARGAS et al., 1982). Mais
recentemente, outros estudos confirmaram que no h a necessi-
dade da utilizao de doses de arranque de adubo nitrogenado na
semeadura, visando superar possveis problemas relacionados imo-
bilizao do N mineral do solo e (ou) competio inicial com ervas
daninhas, tanto em reas de plantio direto quanto de plantio conven-
cional (HUNGRIA et al. 1997; MENDES et al., 2003). No entanto, o
lanamento de cultivares com tetos mais elevados de produtividade e
resultados de pesquisa obtidos nos Estados Unidos evidenciando res-
posta da soja inoculada aplicao tardia de nitrognio no pr-flores-
cimento e no incio do enchimento de gros voltaram a gerar dvidas
sobre a necessidade de adubar a soja brasileira com nitrognio. Diante
disso, uma srie de experimentos foi conduzida nos ltimos anos
pela Embrapa Cerrados e pela Embrapa Soja, reforando, mais uma
vez, os benefcios econmicos que resultam da substituio dos fer-
tilizantes nitrogenados pela inoculao com rizbio e indicando que
no existe razo para a utilizao desses insumos em nenhum est-
gio do cultivo da soja no Brasil (HUNGRIA et al., 2006a; HUNGRIA
et al., 2006b; MENDES et al., 2008).
Outra questo importante e que geralmente motivo de debates
trata da necessidade de reinoculao, ou seja, a inoculao de reas
que j foram inoculadas anteriormente. Quanto a essa questo, os
resultados de pesquisa tm mostrado que vantajoso inocular as reas
de produo de soja a cada safra e que os incrementos mdios na pro-
duo de gros giram em torno de 8% (HUNGRIA et al. 2006a).
Considerando-se todos os benefcios advindos dos estudos brasi-
leiros em FBN, e que o potencial gentico de rendimento da soja de
8 mil quilos por hectare (SPECHT et al., 1999), as abordagens de pes-
quisa devem priorizar a realizao de projetos que permitam o apri-
moramento contnuo desse processo. Assim, deve-se garantir que as
novas cultivares de soja estabeleam simbioses altamente eficazes no
processo de FBN (NICOLS et al., 2006), inclusive no caso de mate-
252
riais transgnicos. Em relao s estirpes, o bem sucedido programa
de seleo deve continuar, mas acelerado pelo uso de marcadores
moleculares (BARCELLOS et al., 2007). Estudos de ecologia dos riz-
bios tambm devem ser complementados, uma vez que taxas elevadas
de recombinao gnica e de transferncia horizontal de genes, entre
estirpes inoculantes e rizbios nativos, foram observadas em nossos
solos (BARCELLOS et al., 2007; BATISTA et al., 2007), e podem afe-
tar, no futuro, as respostas inoculao. Finalmente, necessrio dar
continuidade ao desenvolvimento e validao de novos inoculantes
e tecnologias de inoculao, dos quais se pode citar como exemplo
a inoculao no sulco, para a compatibilizao com o tratamento de
sementes com fungicidas e o enriquecimento das sementes em moli-
bdnio (CAMPO et al., 2002). fundamental o contnuo aprimora-
mento das pesquisas em fixao biolgica do nitrognio para que se
evite a necessidade futura de adubao suplementar com nitrognio
na cultura da soja.
Fixao biolgica de nitrognio no feijoeiro
Principal fonte de protenas para a populao brasileira, o feijoeiro
uma planta que tambm se beneficia do processo da FBN (Figura 3).
Em relao filogenia das bactrias capazes de nodular o feijoeiro,
at 1984 estava definida uma nica espcie, Rhizobium leguminosa-
rum bv. phaseoli (JORDAN, 1984). Contudo, com o avano nas tc-
nicas de biologia molecular, foi possvel definir mais quatro novas
espcies e biovares: R. tropici tipo IIA e IIB (MARTNEZ-ROMERO
et al., 1991), R. etli bv. phaseoli (SEGOVIA et al., 1993), R. gallicum
(bv. phaseoli e bv. gallicum) e R. giardinii (bv phaseoli e bv. giardi-
nii) (AMARGER et al., 1997). Estirpes pertencentes a outros gneros,
como Sinorhizobium e Mesorhizobium, bem como estirpes sem posi-
o taxonmica conhecida, podendo representar novas espcies, tam-
bm tm capacidade de formar ndulos em associao com o feijoeiro
(GRANGE; HUNGRIA, 2004).
Ao contrrio da soja, existem estirpes de rizbio nativas nos solos
brasileiros capazes de nodular o feijoeiro (MERCANTE et al., 1998;
STRALIOTTO et al., 1999; ANDRADE et al., 2002; GRANGE et al.,
2007) e que, geralmente, so de baixa eficincia fixadora (GRANGE
253
et al., 2007). Essa presena nos solos brasileiros de estirpes nativas
capazes de nodular o feijoeiro um dos principais motivos que podem
prejudicar o sucesso da inoculao. Vargas et al. (2000) observaram
que o cultivo sucessivo do feijoeiro em uma mesma rea favoreceu
o aumento de populaes nativas dessa bactria, capazes de compe-
tir com as estirpes selecionadas, introduzidas atravs da inoculao.
Dessa forma, observa-se a importncia da seleo de estirpes que,
alm de elevada eficincia fixadora, tambm possuam uma maior
capacidade competitiva e de estabelecimento nos solos cultivados.
Entre outros fatores limitantes para um bom desempenho das plan-
tas inoculadas, podem ser citados a susceptibilidade do feijoeiro ao
estresse hdrico (PERES et al., 1994), a variabilidade de resposta das
diferentes cultivares inoculao (DBEREINER; RUSCHEL, 1961;
PERES et al., 1994) e a instabilidade gentica de algumas estirpes
devido a ocorrncia de rearranjamentos genmicos e a perda de plas-
mdeos (HUNGRIA; ARAUJO, 1995).
Figura 3. Resultados da inoculao do feijoeiro com rizbio sob condies
controladas em casa de vegetao.
Fonte: Mendes et al., (2007) .
Por todas essas razes, a resposta do feijoeiro inoculao, em con-
dies de campo, tem apresentado resultados que variam em fun-
o do solo, da cultivar e do histrico de cultivo da rea (Figura 4).
Ausncias de respostas inoculao foram observadas na dcada de
1980, por Pereira et al. (1984) e Ramos e Boddey (1987). Entretanto,
sob condies irrigadas, em um solo Gley Humico de vrzea sem
populaes nativas de rizbio, Mendes et al. (1994) reportaram ganhos
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de at 1,5 mil quilos por hectare em relao testemunha no ino-
culada em cultivares responsivas inoculao (esses ganhos foram
semelhantes aos obtidos com 100 kg N/ha). Peres et al. (1994) obser-
varam, sob condies de sequeiro, em latossolos de Cerrado de pri-
meiro cultivo de feijoeiro, ou seja, apresentando baixas populaes
nativas de rizbios, que as respostas em termos de ganhos mdios
de produtividade foram menores que as obtidas sob condies irri-
gadas e variaram de 63 a 290 kg/ha, em relao aos tratamentos sem
inoculao (mdias de trs anos de experimentao). Hungria et al.
(2003) obtiveram, no Paran, respostas expressivas a inoculao, com
ganhos mdios, em seis experimentos, de 450 kg gros/ha, utilizando
as estirpes de R. tropici CPAC H12 e CPAC H20. As produtividades
obtidas com a inoculao foram comparadas a das plantas que rece-
beram 60 kg de N/ha.
Figura 4. Diferenas entre plantas inoculadas e plantas no inoculadas, em
condies de campo.
Fonte: Mendes et al. (2007)
Os trabalhos com R. tropici dentro dos programas de seleo de estir-
pes conduzidos no Brasil so baseados no fato de que essa esp-
cie apresenta maior tolerncia acidez e a temperaturas elevadas,
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assim como maior estabilidade gentica em comparao com outras
espcies que nodulam o feijoeiro (MARTNEZ-ROMERO et al.,
1991; HUNGRIA et al. 1993, 2000, 2003; MICHIELS et al., 1994).
Atualmente, trs estirpes so autorizadas para a fabricao de inocu-
lante comercial no Brasil, a Ciat 899 (=Semia 4077), isolada pelo Ciat,
na Colmbia; a PRF 81(=Semia 4080), isolada no Paran pelo Iapar e
pela Embrapa Soja, e que permitiu ganhos de at 906 kg/ha em rela-
o ao controle no-inoculado (Hungria et al, 2000); e a CPAC H-12
(=Semia 4088), isolada no Distrito Federal (MOSTASSO et al., 2002;
HUNGRIA et al., 2003).
Embora vrias pesquisas realizadas no Brasil tenham mostrado res-
postas expressivas inoculao do feijoeiro em condies de campo,
o nvel de adoo dessa tecnologia, especialmente entre os agricul-
tores familiares, ainda muito baixo. Na safra 2006/2007 (feijo das
guas), a inoculao do feijoeiro foi testada em 11 lotes de assentados
da reforma agrria, em Una, MG (MENDES et al., 2007). Foi obser-
vado que, na mdia, em relao ao tratamento controle no inoculado,
a produtividade do feijo com inoculao aumentou em 209 kg/ ha
para a cultivar Requinte (grupo do feijo carioca) e em 128 kg/ha
para a cultivar Diamante Negro (grupo do feijo preto). Na cultivar
Requinte, o rendimento obtido com 120 kg de ureia (858 kg/ha) foi
semelhante ao obtido com a inoculao (875 kg/ha). J na cultivar
Diamante Negro, o rendimento obtido com a uria (934 kg/ha) foi
maior. Entretanto, importante destacar que o custo do adubo nitro-
genado na safra 2006/2007 foi de R$ 90,00, enquanto o custo do ino-
culante foi de R$ 6,00. Para o pequeno agricultor, essa diferena de
preos muito significativa, principalmente em se tratando do cultivo
do feijo das guas onde fatores climticos podem afetar o desempe-
nho da cultura. Ou seja, em alguns casos, o ganho com a inoculao
pode ser menor que o ganho obtido com o adubo nitrogenado, mas,
como o inoculante custa menos, o risco associado ao seu uso tambm
menor, principalmente nos casos em que as chances de ocorrer que-
bras de produo por fatores adversos so elevadas.
Pode-se afirmar que FBN nessa cultura realmente importante,
pois se estima que mesmo as estirpes nativas possam contribuir com
at 40% do N presente na planta. A adoo da tcnica de inoculao
256
com estirpes selecionadas pela pesquisa, aliada ao uso de cultivares
melhoradas, tcnicas de manejo integrado de pragas e doenas e de
correo e adubao do solo podero, no mnimo, duplicar a mdia de
produtividade nacional a um baixo custo para o agricultor.
Fixao biolgica de nitrognio
em outras leguminosas
Ainda na famlia das leguminosas, as espcies forrageiras, arbusti-
vas e arbreas, fixadoras de nitrognio, assumem papis importantes,
seja na produo de alimentos, ou na produo de forragem, madeira,
lenha, carvo e na recuperao de reas degradadas, entre outros.
Diversas leguminosas produtoras de gros utilizados na alimenta-
o humana, que se beneficiam da FBN, ainda podem ser citadas. O
feijo-caupi ou feijo-de-corda (Vigna unguiculata) um desses exem-
plos. Sendo um componente importante dos sistemas de produo da
regio semirida brasileira, essa cultura, geralmente, apresenta baixos
nveis de FBN quando noduladas por estirpes nativas. Recentemente,
porm, a seleo de estirpes eficientes e adaptadas s condies regio-
nais culminou com o lanamento da estirpe BR 3267, que possibili-
tou incrementos de produtividade de at 40% em condies expe-
rimentais e de at 52% nas reas de agricultores experimentadores
(RUMJANEK et al., 2006).
Trabalhos conduzidos na dcada de 1980, por exemplo, demons-
traram que a ervilha poderia ser cultivada sem a utilizao de adu-
bos nitrogenados, quando inoculada com estirpes selecionadas de
Rhizobium leguminosarum biovar viceae. Nesses trabalhos, os ganhos
com a inoculao variaram de 63% a 240% em relao testemunha.
O rendimento de gros das plantas inoculadas atingiu valores de at
3.500 kg/ha e foram iguais ou superiores aos obtidos com a utilizao
de 80 kg de N fertilizante/ha (VARGAS et al., 1994).
A resposta da lentilha inoculao, principalmente em solos onde
no existe populao estabelecida de R. leguminosarum biovar viceae,
foi demonstrada nos trabalhos de Khumar et al. (1988) e Bhattacharyya
e Sengupta (1981). No Brasil, isolados de Rhizobium obtidos em solos
de Cerrados anteriormente cultivados com lentilha, foram seleciona-
257
dos e apresentaram alto potencial de fixao de N
2
(VARGAS et al.,
1994). Alm de propiciar menor custo de produo, a inoculao pro-
moveu ganhos adicionais de at 873 kg/ha de gros em relao ao tra-
tamento com 60 kg N-fertilizante/ha (VARGAS et al., 1994).
Outros estudos mostraram o potencial das plantas de gro-de-bico
para obteno de quantidades significativas de N via FBN. Em ava-
liaes de quantificao da FBN, utilizando os mtodos de diluio
isotpica de
15
N ou abundncia natural de
15
N, Doughton et al. (1995)
afirmaram que essas plantas podem obter mais de 100 kg de N/ha. A
seleo de estirpes de Rhizobium que se associam com essas plantas
pode ser uma estratgia interessante visando uma maior eficincia
da FBN. No trabalho de Cleyet-Marel et al. (1990), foram demonstra-
das diferenas entre estirpes de bactria quanto habilidade de for-
necer N para as plantas.
Em relao ao uso de leguminosas forrageiras, por exemplo, dados
experimentais indicam que pastagens com uma composio botnica
contendo, aproximadamente, 30% de leguminosas consorciadas com
gramneas seriam suficientes para manter a produtividade vegetal e
animal, assim como a fertilidade do solo no longo prazo (THOMAS,
1992; CADISH et al., 1994). Alm de incorporarem N, fixado sim-
bioticamente, as leguminosas ainda contribuem efetivamente para a
produo e sustentabilidade dos sistemas de pastejo, especialmente
em regies com limitaes ambientais. Diversos trabalhos com pas-
tagens consorciadas mostram sua superioridade quando comparadas
s pastagens puras de gramneas. Em um estudo realizado em rea
de Cerrado, no consrcio de Brachiaria ruziziensis com a leguminosa
forrageira Stylosantis guianenensis, a produo vegetal e animal da pas-
tagem consorciada foi bem superior da pastagem em monocultura
(AYARZA et al., 1997). Zimmer e Correa (1993) tambm mostraram
o efeito positivo da consorciao de leguminosas em pastagens, con-
cluindo que, com a presena da leguminosa em consrcio, depen-
dendo do manejo aplicado, os resultados se equiparam a pastos de
gramnea pura adubados com at 100 kg N/ha.
Em condies de solos cidos e de baixa fertilidade dos Cerrados,
as leguminosas que mais tm persistido em consrcio com
Brachiaria so o Calopogonium muconoides, Stylosanthes guianensis
258
cvs. Bandeirante e Mineiro, S. macrocephala cv. Pioneiro e Arachis
pintoi (VALLE et al., 2000). Infelizmente, apesar de todos os resulta-
dos positivos, na prtica o uso da consorciao continua sendo pouco
significativo. Em geral, o fracasso na utilizao de pastagens consor-
ciadas atribudo falta de persistncia das leguminosas nas pasta-
gens, exigncia de melhor manejo que pastagens de gramneas puras,
necessidade de solos mais frteis, susceptibilidade a doenas provo-
cadas por fungos e nematoides ou, ainda, pelas leguminosas no se
adaptarem s regies de implantao.
A utilizao de leguminosas arbreas nos programas de recupera-
o de reas degradadas outro exemplo de sucesso onde a FBN tem
papel de destaque. O uso de leguminosas nativas ou introduzidas,
como Acacia spp., Albizia spp. e Mimosa spp., entre outras, em asso-
ciao com bactrias diazotrficas selecionadas pela pesquisa e fungos
micorrzicos, tem sido preconizado para a revegetao de solos depau-
perados, com o objetivo de restabelecer sua fertilidade (FRANCO;
FARIA, 1997). A interao entre as plantas e os microrganismos per-
mite um rpido crescimento das espcies tornando-as mais tolerantes
aos estresses ambientais (FRANCO; BALIEIRO, 2000), o que propcia
um incremento do contedo de matria orgnica e da atividade biol-
gica do solo por meio do aporte de material orgnico via serrapilheira.
Os Beta-Rizbios
Entre as pesquisas atuais envolvendo a simbiose entre bactrias
diazotrficas e leguminosas, devem ser citados os estudos que ajuda-
ram a dissolver a velha idia de que apenas Rhizobium e seus relati-
vos poderiam formar ndulos e fixar nitrognio em associao com
essas plantas. H alguns anos, acreditava-se que as leguminosas eram
noduladas, exclusivamente, por membros das -proteobactrias. Essas
bactrias seriam pertencentes a alguns gneros relacionados ordem
Rhizobiales, o que inclui Allorhizobium, Azorhibium, Bradyrhizobium,
Mesorhizobium, Rhizobium e Sinorhizobium (YOUNG, 1996). Em estu-
dos recentes, entretanto, um nmero de outras -proteobactrias
foram mostradas como noduladoras de leguminosas (MOULIN
et al., 2002) incluindo estirpes de Methylobacterium (SY et al., 2001),
Blastobacter (VAN BERKUN; EARDLY, 2002) e Devosia (RIVAS
259
et al., 2002). Alm disso, tambm foram descobertos membros das
-proteobactrias em ndulos de leguminosas tropicais e passaram
imediatamente a serem conhecidos como os -rizbios (MOULIN
et al., 2002).
Entre os -rizbios, bactrias da espcie Cupriavidus taiwanensis
foram isoladas de ndulos de Mimosa pudica e M. diplotricha, nos tra-
balhos desenvolvidos por Chen et al. (2001) e Verma et al. (2004). Em
um trabalho com espcies vegetais coletadas na frica do Sul e Guiana
Francesa, Moulin et al. (2001) tambm isolaram, a partir dos ndulos
das leguminosas Aspalathus carnosa e Machaerium lunatum, estirpes
de bactrias que pertencem ao gnero Burkholderia, includo na sub-
diviso das proteobactrias. Outras estirpes de Burkholderia tam-
bm foram isoladas de ndulos de Mimosa casta, M. pellita, M. pudica
e Abarema macradenia, no Panam (BARRET; PARKER, 2005). Chen
et al. (2005) apresentaram um estudo em que 20 estirpes isoladas de
ndulos de vrias espcies de Mimosa na Amrica do Sul foram classi-
ficadas como pertencentes ao gnero Burkholderia e so intimamente
relacionadas com outras espcies nodulantes deste gnero, como B.
caribensis, B. phymatum e B. tuberum. Algumas dessas estirpes foram
descritas como novas espcies dentro do gnero Burkholderia, como
B. mimosarum e B. nodosa (CHEN et al., 2006, 2007). Na Figura 5, so
apresentados alguns exemplos que comprovam a existncia de sim-
biose entre as leguminosas do gnero Mimosa com os -rizbios.
260
Figura 5. (A) Ndulos de Mimosa pigra inoculados com uma estirpe de
Burkholderia sp. marcada com o gene gfp (green fluorescent protein); (B)
Ndulos de Mimosa pigra inoculados com uma estirpe de Burkholderia mar-
cada com o gene gfp sob fluorescncia; (C) Microscopia Confocal Laser mos-
trando o incio do processo de nodulao (encurvamento do plo radicular)
em Mimosa pudica inoculada com Cupriavidus taiwanensis; (D) Microscopia
Confocal Laser de bacterides (Burkholderia sp.) expressando o gene gfp em
ndulo de Mimosa pellita .
Fonte: Reis Junior et al.( 2006).
Em uma parceria com pesquisadores de diferentes unidades da
Embrapa e universidades brasileiras e do Reino Unido, foi desenvol-
vido um projeto para o estudo da ocorrncia e capacidade simbitica
de -rizbios associados com plantas nativas pertencentes ao gnero
Mimosa, do qual o Cerrado o maior centro de diversidade. Os resul-
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tados obtidos at o presente momento indicam que a nodulao nes-
sas plantas decorrente, em sua grande maioria, da simbiose com
bactrias do gnero Burkholderia e que a fixao biolgica promovida
por essa interao, provavelmente, valiosa para a ciclagem do N no
Bioma Cerrado (REIS JUNIOR et al., 2006, 2009).
Na maior parte dos casos, os -rizbios foram encontrados em asso-
ciao com leguminosas da sub-famlia Mimosoideae. No entanto,
novas descobertas sugerem que a nodulao de leguminosas por essas
bactrias parece ser muito mais ampla do que era imaginado inicial-
mente. Como exemplo, nos trabalhos de Garau et al. (2009) e Beukes
et al. (2009), foram encontradas bactrias do gnero Burkholderia
em simbiose com plantas de gneros diversos, como Rhynchosia,
Podalyria, Virgilia, Cyclopia e Hypocalyptus.
Fixao biolgica de nitrognio em
gramneas e outras no leguminosas
Diferentemente dos rizbios em simbiose com leguminosas, as
bactrias diazotrficas associadas a gramneas, entre outras plan-
tas, no formam ndulos e localizam-se preferencialmente na regio
rizosfrica, na superfcie das razes ou at mesmo dentro dos teci-
dos de razes, colmos e folhas, quando so conhecidas como bact-
rias endfitas ou endofticas (Figura 6). O termo endfito era utili-
zado, originalmente, referindo-se colonizao interna das razes por
microrganismos (bactrias e fungos) que normalmente no causam
danos a planta hospedeira e vivem a maior parte de suas vidas no inte-
rior dos tecidos dos vegetais sem promover sintomas de patogenici-
dade (PEREIRA, 1995). Kloepper e Beauchamp (1992) classificaram
como endfitos os microrganismos que colonizavam o interior das
razes e promoviam benefcios as plantas. Dbereiner (1992) esten-
deu o termo endfito para as bactrias diazotrficas, tendo em vista
a habilidade de algumas bactrias de gneros como Herbaspirillum e
Gluconacetobacter de colonizarem o interior dos vegetais, e apresen-
tarem uma baixa capacidade de sobrevivncia no solo.
262
Figura 6. Fotomicrografias de microscopia eletrnica de varredura mostrando
a colonizao de Gluconacetobacter diazotrophicus em uma juno de raiz late-
ral (A) e nos espaos intercelulares do parnquima cortical (B) de plntulas
de cana-de-acar .
Fonte: Reis Junior (1998).
A ocorrncia de bactrias no interior das plantas assume um car-
ter ecolgico muito importante, j que essas bactrias recebem os
nutrientes diretamente no interior do vegetal, sem sofrer estresses
ou competio com outros organismos do solo. Alm disso, prova-
velmente, podem colonizar stios onde o acesso de O
2
restrito, no
tendo assim problemas de inibio da atividade da nitrogenase (com-
plexo enzimtico responsvel pela FBN, que sensvel ao O
2
). Em con-
trapartida, a bactria pode prontamente disponibilizar o nitrognio
fixado e outras molculas promotoras de crescimento para as plantas
(DBEREINER et al., 1995a; BALDANI et al., 1997). No entanto, a
contribuio das bactrias de vida livre no solo ou rizosfera no deve
ser subestimada, devido a seu alto nmero e diversidade encontrados
(BALDANI; BALDANI, 2005).
Bactrias diazotrficas associativas, dos mais diferentes gneros e
espcies, tm sido relatadas em associao com um grande nmero de
plantas no leguminosas, tanto em clima tropical como em clima tem-
perado. Diversos estudos tm mostrado que essas bactrias, de ocorrn-
cia natural nos solos, podem ser responsveis por boa parte do N neces-
srio para a nutrio das plantas (BODDEY; DBEREINER, 1995).
Alm da FBN, a maioria das bactrias diazotrficas em associa-
o com plantas no leguminosas tambm conhecida pela sua
capacidade de produzir hormnios de crescimento, tais como auxi-
nas, giberelinas e citoquininas (FUENTES-RAMREZ et al., 1993;
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HARTMANN; ZIMMER, 1994; BASHAN; HOLGUIN, 1997;
BASTIN et al., 1998; RADWAN et al., 2002). A produo dessas subs-
tncias promotoras de crescimento pode estimular o aumento na den-
sidade de pelos radiculares, da taxa de aparecimento de razes secun-
drias e da superfcie radicular quando as plantas so colonizadas por
essas bactrias (Figura 7). Esse incremento resulta numa melhora da
absoro de gua e nutrientes aumentando, assim, a capacidade da
planta de produzir e suportar estresses ambientais (BALDANI et al.,
1983; LIN et al., 1983; KAPULNIK et al., 1985; KAPULNIK et al., 1987).
Sem inoculao
Inoculado com
H. seropedicae
Figura 7. Efeito da inoculao com H. seropedicae sobre o desenvolvimento
de razes de plntulas de cana-de-acar .
Fonte: Reis Junior (1998).
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Fixao biolgica de nitrognio
em gramneas forrageiras
A primeira associao entre uma gramnea forrageira tropical e
bactrias fixadoras de nitrognio, estudada detalhadamente, foi a des-
crita entre Paspalum notatum e Azotobacter paspali (DBEREINER;
CAMPELO, 1971). Boddey et al. (1983), utilizando a tcnica de dilui-
o isotpica de
15
N, demonstraram que P. notatum cv. Batatais con-
seguiu obter aproximadamente 10% do seu N (20 kg N/ha/ano) via
fixao biolgica. Evidncias da FBN em outras gramneas forragei-
ras continuaram sendo apresentadas, como nos casos de Cynodon
dactylon (DBEREINER; DAY, 1975), Digitaria decumbens (DE-POLLI
et al., 1977), Panicum maximum (MIRANDA et al., 1990) e Pennisetum
purpureum (QUESADA, 2001), entre outras.
Em Brachiaria, mesmo com as observaes de perdas de N do solo,
existem relatos na literatura indicando que alguns gentipos no apre-
sentam redues significativas em sua produtividade. Essas perdas
de N poderiam estar sendo compensadas pela FBN que, pelos pou-
cos estudos disponveis, poderia ser responsvel pela introduo de
30 a 45 kg de N/ha/ano no sistema solo-planta (BODDEY; VICTORIA,
1986; LOUREIRO; BODDEY, 1988). Os estudos para a quantificao
da FBN efetuados por Boddey e Victoria (1986) demonstraram que
as espcies B. decumbens e B. humidicola receberam uma quantidade
de N via FBN bem mais significante que aquelas apresentadas por B.
radicans e B. ruziziensis. Os resultados de Loureiro e Boddey (1988)
tambm sugerem uma maior contribuio da FBN para a espcie B.
humidicola.
Embora esses estudos tenham mostrado que as contribuies da
FBN no ultrapassaram 30% a 40% do N acumulado pelas plantas,
possvel que, para sistemas de manejo mais extensivos onde as vias
de perdas so menos expressivas, a quantidade de N fixado seja sufi-
ciente para proporcionar um balano nulo ou at positivo de N para
o sistema solo-planta e com isso permitir uma maior longevidade da
pastagem com uma produtividade em nvel aceitvel.
265
Fixao biolgica de nitrognio na cana-de-acar
O Brasil o maior produtor mundial de cana-de-acar com, apro-
ximadamente, nove milhes de hectares cultivados e produo anual
girando em torno de 690 milhes de toneladas (IBGE, 2009). Essa cul-
tura altamente exigente em N e, para alcanar uma produtividade de
100 Mg de colmos por ha, acumula em sua parte area 120 a 250 kg
de nitrognio (XAVIER, 2002). Resultados de pesquisa mostram que
at 60% do N exigido pela cultura pode ser oriundo da FBN (BODDEY
et al., 2001; POLIDORO et al., 2001), valor esse que dependente do
gentipo da planta, de sua interao com bactrias diazotrficas e
caractersticas edafoclimticas das reas de plantio. J na dcada de
1950, a pesquisadora da Embrapa, Dra. Johanna Dbereiner, havia
isolado algumas espcies de bactrias diazotrficas associadas
cana (DBEREINER, 1961). O avano desses estudos permitiu que,
hoje, sejam conhecidas diversas espcies de bactrias, pertencentes
a gneros distintos, com destaque para Azospirillum, Herbaspirillum,
Gluconacetobacter e Burkholderia.
Boddey (1995) sugere que a caracterstica de obteno de signi-
ficativas contribuies da FBN, presente em variedades brasileiras
de cana-de-acar, pode ser devida aos processos de melhoramento
e seleo feitos sob condies de baixa disponibilidade de N. Como
exemplo, no estudo de Coelho et al. (2003), as variedades do grupo
das RBs (RB 739735, RB 758540 e RB 835089) foram as que mais se
destacaram, obtendo maior contribuio da FBN. Provavelmente isso
se deve ao fato de que essas variedades foram melhoradas em solo
com pouco N e, naturalmente, terem sido selecionadas para alta efi-
cincia fixadora.
Algumas medidas tambm poderiam ajudar a maximizar as contri-
buies da fixao biolgica de nitrognio para a cultura da cana. Entre
essas medidas est a aplicao do micronutriente molibdnio, espe-
cialmente em solos cidos, onde sua disponibilidade prejudicada
(BODDEY et al., 2003). Alguns estudos mostraram resultados onde,
mesmo em solos pobres, a FBN pode ajudar a cultura a alcanar produ-
es prximas ao dobro da mdia atual de produtividade, se os outros
nutrientes forem supridos de acordo com as necessidades mostra-
das pela anlise do solo e se a tecnologia for adequada, usando, entre
outras, a aplicao de molibdnio e irrigao (URQUIAGA et al., 1998).
266
Inoculantes de bactrias diazotrficas para no leguminosas
Diante da comprovao de que bactrias diazotrficas associadas a
plantas no leguminosas possuam a capacidade de fixar o N
2
atmos-
frico e produzir outras substncias promotoras de crescimento, logo
surgiram os primeiros estudos buscando avaliar os benefcios da ino-
culao dessas plantas com estirpes de bactrias selecionadas pela
pesquisa. Avaliaes de experimentos com inoculao, feitos prin-
cipalmente com Azospirillum, mostraram que esses organismos so
capazes de promover incrementos na produtividade de importantes
culturas em diferentes situaes de solo e clima. Entre 60% e 70%
dos experimentos levantados por Okon e Labandera-Gonzalez (1994)
apresentaram resposta positiva inoculao com Azospirillum com
aumentos no rendimento estatisticamente significativos na ordem
de 5% a 30%. Utilizando a estratgia de combinar a inoculao com
a aplicao de fertilizantes nitrogenados, constatou-se a possibili-
dade de substituio de at 40% da dose recomendada de nitrognio
para a cultura do milho e, no caso do trigo e aveia, at 30% (OKON;
LABANDERA-GONZALEZ, 1994). Sumner (1990), em outro estudo
sobre inoculao de cereais, observou que 32 ensaios apresentaram
respostas positivas inoculao, enquanto outros sete (a maioria com
trigo) mostraram resultados negativos na produo de gros.
Embora ainda no se constitua em prtica agrcola consoli-
dada, principalmente no Brasil, inoculantes comerciais con-
tendo A. brasilense foram lanados no mercado mundial (OKON;
LABANDERA-GONZALEZ, 1994). Nos Estados Unidos, um produto
com o nome de Azo-Green
TM
foi produzido pela companhia Genesis
Turfs Forages e recomendado para aumentar o vigor da semente, esta-
belecimento do sistema radicular, resistncia a geada e uma melhoria
geral da sade da planta (REIS, 2007). Na Itlia, Alemanha e Blgica
foi desenvolvido um produto contendo uma mistura de A. brasilense
(estirpe Cd) e A. lipoferum (estirpe Br17) comercializado na forma de
mistura com vermiculita ou em forma lquida. O nome comercial
desse produto Zea-Nit
TM
, produzido pela companhia Heligenetics.
Segundo os fabricantes, esse produto reduziria a aplicao do nitro-
gnio necessrio cultura em 30% a 40% (REIS, 2007). Na Frana,
foi lanado outro produto base de Azospirillum, estirpe CRT1. O
267
uso desse inoculante, em um experimento com milho na Estao
de Agbasar, a nordeste de Togo na frica, promoveu aumentos de
100% na produo de gros (FAGES; MULARD, 1988). No Mxico,
foi desenvolvido, pela Universidade de Puebla, um inoculante a base
de Azospirillum que tem sido usado com sucesso nas culturas de
milho trigo e cevada. Ainda no Mxico, a empresa Asia (Assessoria
Integral Agropecuria S.A.) comercializa um produto para milho e
sorgo e outro para trigo e cevada, contendo uma mistura de estirpes
de A. brasilense (REIS, 2007). Na Argentina, foi lanado um produto
denominado Graminante
TM
, base de p de carbonato de clcio, con-
tendo uma mistura de estirpes de Azospirillum. Os fabricantes infor-
mam que o produto pode aumentar a produo de gros em cerca
de 20% (REIS, 2007). Na ndia, vrias indstrias produzem biofer-
tilizantes contendo Azospirillum para diversas culturas e at mesmo
Gluconacetobacter para cana-de-acar (REIS, 2007).
No Brasil, diversos estudos tm mostrado resultados tanto interes-
santes quanto promissores. No trabalho de Pereira e Baldani (1995), a
inoculao de sementes de arroz com Herbaspirillum seropedicae pro-
moveu incrementos na produtividade das plantas equivalentes aos
obtidos com a dose de 40 kg de N/ha. Guimares et al. (2000) tam-
bm mostraram incrementos significativos na produtividade de arroz
quando inoculado com Herbaspirillum, no entanto as respostas eram
dependentes das cultivares avaliadas. Guimares et al. (2003) mostra-
ram que a inoculao de arroz com a estirpe ZAE 94, de H. seropedicae,
proporcionou aumento da produo de gros da variedade Guarani
em mais de 50% sob condies de sequeiro, mostrando potencial
dessa estirpe como inoculante. A inoculao dessa mesma bactria
em sementes de milho tambm contribuiu significativamente para o
aumento do rendimento de gros no hbrido BRS 1010, ao passo que
na variedade BRS 4157 este efeito no foi observado (ZILLI et al., 2007).
A Embrapa Soja e a UFPR realizaram um trabalho de validao
de estirpes de Azospirillum brasilense para as culturas do milho e do
trigo. Obedecendo a todos os critrios da legislao brasileira para
inoculantes, foram testadas e selecionadas as estirpes que apresenta-
ram melhor crescimento e sobrevivncia no solo, maior promoo de
crescimento das plantas e maior adaptao s tecnologias utilizadas
268
nessas culturas. Os resultados de ensaios a campo, totalizando cinco
safras, foram consistentes e resultaram em incrementos mdios de
25% a 30% no rendimento do milho e de 8% a 11% no rendimento do
trigo. Seis estirpes de A. brasilense comprovaram a eficincia agron-
mica e passaram a serem autorizadas para a produo de inoculantes
comerciais (HUNGRIA et al., 2006c). Como resultado dessa pesquisa,
uma grande novidade foi o lanamento e a comercializao do pri-
meiro inoculante para milho do mercado brasileiro. Os fabricantes do
Masterfix Gramneas
TM
, que chegou as lojas na segunda quinzena de
julho de 2009, apontam um potencial para economia de at 50% na uti-
lizao de fertilizantes nitrogenados industriais (AGROLINK, 2009).
A cana-de-acar naturalmente colonizada por bactrias diazo-
trficas, no entanto trabalhos recentes tm mostrado o potencial da
inoculao dessas plantas com bactrias selecionadas pela pesquisa.
Sevilla et al. (2001) mostraram que plantas, quatro meses aps terem
sido inoculadas com a estirpe padro de G. diazotrophicus (PAL-5),
apresentaram produtividade 40% maior que as plantas no inocu-
ladas. Em experimentos de campo onde foram utilizadas misturas
com as bactrias Gluconacetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum sero-
pedicae, Herbaspirillum rubrisubalbicans, Azospirillum amazonense e
Burkholderia tropica, foram observados incrementos de at 24,7% na
produtividade e 31,4% na produo de matria seca das plantas ino-
culadas, que tambm obtiveram at 42,7% do N acumulado prove-
niente da fixao biolgica, dependendo do tipo de solo, do gentipo
da planta e da combinao de bactrias utilizada como inoculante
(OLIVEIRA et al., 2006).
Diante da persistncia dos efeitos benficos da inoculao obser-
vada por Oliveira et al. (2006), os autores desse trabalho foram estimu-
lados a levar em considerao a recomendao dessa tecnologia para
uso futuro pelos produtores de cana brasileiros. Como desdobramento
dos resultados alcanados nesse estudo, a Embrapa Agrobiologia lan-
ou, em maio de 2008, o inoculante desenvolvido para a cultura da
cana-de-acar. Por enquanto, o produto vem sendo utilizado em reas
experimentais e avaliado em usinas produtoras de lcool e acar
espalhadas pelo Pas. A princpio, a utilizao da inoculao tem como
principal impacto a substituio de parte do N utilizado na cana de
269
primeiro ano. Os resultados tm mostrado que, com o uso do inocu-
lante, cerca de 30 kg de N/ha/ano podem deixar de ser aplicados. As
estirpes de bactrias que fazem parte do inoculante j foram repas-
sadas para quatro empresas que se mostraram interessadas e partici-
param de edital para o desenvolvimento do produto comercial (REIS
JUNIOR; REIS, 2009).
Apesar dos resultados animadores, a utilizao de inoculantes con-
tendo essas bactrias como uma prtica usual na agricultura requer
anlise crtica cuidadosa devido alta variabilidade observada, geral-
mente, na resposta de plantas de diferentes gentipos sob condies
edafoclimticas distintas (OLIVEIRA et al., 2006). Sabe-se que as
associaes ocorrem em diferentes graus de interao e, em muitos
casos, esto relacionadas especificidade das caractersticas genticas
dos microrganismos e da planta hospedeira (BASHAN; HOLGUIM,
1997). De fato, as razes para a variabilidade de resposta da FBN em
gramneas ainda no foram completamente elucidadas. Tem sido
sugerido que a interao gentipo da planta e ambiente exera um
papel decisivo sobre a eficincia do diazotrfico (GYANESHWAR
et al., 2002). Essas diferenas entre gentipos em relao FBN mos-
tram um grande potencial para a sua melhor explorao atravs de
melhoramento vegetal.
Consideraes finais
Alm da inegvel importncia econmica, muito importante a
busca por uma melhor eficincia de uso dos fertilizantes nitrogena-
dos industriais para evitar ao mximo suas perdas por lixiviao e (ou)
transformaes para formas gasosas, que contribuem para a poluio
de cursos e mananciais de gua, a degradao da camada de oznio
e o aquecimento global. Nesse contexto, a explorao e a utilizao
da FBN em sistemas agrcolas visando substituio ou, ao menos, a
complementao do N fornecido por meio de fertilizantes industriais
uma estratgia fundamental.
Programas de melhoramento de plantas contando com equipes for-
madas por especialistas de diversas reas, com nfase na busca por
gentipos capazes de suprir suas necessidades em N, principalmente
por meio da associao com bactrias diazotrficas, poderiam trazer
270
grande contribuio. Com os resultados recentes de mapeamento dos
genomas de plantas e bactrias fixadoras de nitrognio, espera-se que
o conhecimento gerado possa incrementar o entendimento dessas
associaes, consequentemente, abrindo caminho para uma melhor
explorao de seu potencial.
O investimento na pesquisa e difuso da FBN, por meio de estudos
multidisciplinares e integrados, em reas como microbiologia, cin-
cia do solo, melhoramento de plantas, manejo de culturas, etc., pode
trazer um grande benefcio para o planeta, aumentando a produo
de alimentos, reduzindo o uso de combustveis fsseis e a contami-
nao dos recursos hdricos, proporcionada pela diminuio do uso
de fontes externas de fertilizantes nitrogenados.
Referncias
AGROLINK. Primeiro inoculante para arroz e milho lanado no mercado.
Disponvel em: <http://www.agrolink.com.br/sementes/NoticiaDetalhe.
aspx?codNoticia=94052>. Acesso em: 29 jul. 2009.
AMARGER, N.; MACHERET, V.; LAGUERRE, G. Rhizobium gallicum sp. nov.and
Rhizobium giardinii sp. nov. from Phaseolus vulgaris nodules. International Journal
of Systematic Bacteriology, v. 47, p. 996-1006, 1997.
ANDRADE, D. S.; HUNGRIA, M. Maximizing the contribution of biological
nitrogen fixation in tropical legume crops. In: FINAN, T. M.; OBRIAN, M. R.;
LAYZELL, D. B.; VESSEY, J. K.; NEWTON, W. (Ed.). Nitrogen fixation: global
perspectives. London: CAB International, 2002. p. 341-345.
AYARZA, M.; ALVES, B. J. R.; BODDEY, R. M.; URQUIAGA, S. Introduo de S.
guianenesis cv. Mineiro em pastagens de Brachiaria ruziziensis: influncia na
produo da pastagem e na reciclagem da liteira. Seropdica: EMBRAPA-CNPAB,
1997. 16 p. (EMBRAPA-CNPAB. Boletim Tcnico, 1).
BALDANI, J. I.; BALDANI, V. L. D. History on the biological nitrogen fixation
research in graminaceous plants: special emphasis on the Brazilian experience.
Anais da Academia Brasileira de Cincias, v. 77, p. 549-579, 2005.
BALDANI, V. L .D.; BALDANI, J. I.; DBEREINER, J. Effects of Azospirillum
inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat. Canadian
Journal of Microbiology, v. 29, p. 924-929, 1983.
BALDANI, J. I.; CARUSO, L.; BALDANI, V. L. D.; GOI, S. R.; DBEREINER, J.
Recent advances in BNF with non-legume plants. Soil Biology and Biochemistry,
v. 29, p. 911-922, 1997.
271
BARCELLOS, F. G.; MENNA, P.; BATISTA, J. S. S.; HUNGRIA, M. Evidence of
horizontal transfer of symbiotic genes from a Bradyrhizobium japonicum inoculant
strain to indigenous diazotrophs Sinorhizobium (Ensifer) fredii and Bradyrhizobium
elkanii in a Brazilian savannah soil. Applied and Environmental Microbiology,
v. 73, p. 2635-2643, 2007.
BARRETT, C. F.; PARKER, M. A. Prevalence of Burkholderia sp. nodule symbionts
on four mimosoid legumes from Barro Colorado Island, Panama. Systematic and
Applied Microbiology, v. 28, p. 57-65, 2005.
BASHAN, Y.; HOLGUIN, G. Azospirillum-plant relationships: environmental
and physiological advances (1990-1996). Canadian Journal of Microbiology, v. 43,
p. 103-121, 1997.
BASTIN, F.; COHEN, A.; PICCOLI, P.; LUNA, V.; BARALDI, R.; BOTTINI,
R. Production of 3-idol-3-acetic acid and gibberellins A1 and A3 by Acetobacter
diazotrophicus and Herbaspirillum seropedicae in chemically-defined culture media.
Plant Growth Regulation, v. 24, p. 7-11, 1998.
BATISTA, J. S. S.; HUNGRIA, M.; BARCELLOS, F. G.; FERREIRA, M. C.;
MENDES, I. C. Variability in Bradyrhizobium japonicum and B. elkanii seven years
after introduction of both the exotic microsymbiont and the soybean host in a
Cerrados soil. Microbial Ecology, v. 53, p. 270-284, 2007.
BHATTACHARYYA, P; SENGUPTA, K. Effect of seed inoculation with Rhizobium
on grain yield in lentil. Indian Biology, v. 14, p. 31-35, 1981.
BEUKES, C. W.; LAW, I. J.; VENTER, S. N.; MALULEKE, M. D.; STEENKAMP, E.
T. Indigenous Hypocalyptus, Podalyria, Cyclopia and Virgilia species are nodulated
by diverse beta-rhizobia. South African Journal of Botany, v. 75, n. 2, 2009.
BODDEY, R. M. Biological nitrogen fixation in sugar cane: A key to energetically
viable biofuel production. Critical Reviews in Plant Science, v. 14, p. 263-279, 1995.
BODDEY, R. M.; CHALK, P. M.; VICTORIA, R. L.; MATSUI, E.; DBEREINER,
J. The use of the 15N isotope dilution technique to estimate the contribution
of associated biological nitrogen fixation to the nitrogen nutrition of Paspalum
notatum cv. Batatais. Canadian Journal of Microbiology, v. 29, p. 1036-1045, 1983.
BODDEY, R. M.; DBEREINER, J. Nitrogen fixation associated with grasses and
cereals: recent progress and perspectives for the future. Fertility Research, v. 42,
p. 241-250, 1995.
BODDEY, R. M.; POLIDORO, J. C.; RESENDE, A. S.; ALVES, B. J. R.;
URQUIAGA, S. Use of 15N natural abundance technique for the quantification of
the contribution of N2 fixation to sugar cane and others grasses. Australian Journal
of Agricultural Research v. 28, p. 889-895, 2001.
272
BODDEY, R. M.; URQUIAGA, S.; ALVES, B. J. R.; REIS, V. M. Endophytic
nitrogen fixation in sugarcane: present knowledge and future applications. Plant
and Soil, v. 252, p.139-149, 2003.
BODDEY, R. M.; VICTORIA, R. L. Estimation of biological nitrogen fixation
associated with Brachiaria and Paspalum grasses using 15N labelled organic
matter and fertilizer. Plant & Soil, v. 90, p. 256-292, 1986.
CADISH, G.; SHUNKE, R. M.; GILLER, K. E. Nitrogen cycling in a pure grass
pasture and a grass legume misture on a red latossol in Brazil. Tropical Grassland,
v. 28, p. 43-52, 1994.
CAMPO, R. J.; HUNGRIA, M.; MIURA, L. M.; MORAES, J. Z.; SIBALDELLI, R.
N. R.; MESQUITA, C. M. Avaliao de estirpes de Bradyrhizobium, inoculantes
microbianos e mtodos de inoculao em diferentes regies do Brasil. In:
HOFFMANN-CAMPO, C. B.; SARAIVA, O. F. (Ed.). Resultados de pesquisa da
Embrapa Soja 2001: microbiologia dos solos. Londrina: Embrapa Soja, 2002.
p. 30-35. (Embrapa Soja. Documentos, 197).
CHEN, W. M.; LAEVENS, S.; LEE, T. M.; COENYE, T.; DE VOS, P.; MERGEAY,
M.; VANDAMME, P. Ralstonia taiwanensis sp. nov., isolated from root nodules of
Mimosa species and sputum of a cystic fibrosis patient. International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology, v. 51, p. 1729-1735, 2001.
CHEN, W. M.; FARIA, S. M.; STRALIOTO, R.; PITARD, R. M.; ARAJO, J. L.
S.; CHOU, J. H.; CHOU, Y. J.; BARRIOS, E.; PRESCOTT, A. R.; ELLIOT, G. N.;
SPRENT, J. I.; YOUNG, J. P. W.; JAMES, E. K. Proof that Burkholderia strains
form effective symbioses with legumes: a study of novel mimosa-nodulating
strains from South America. Applied and Environmental Microbiology, v. 71,
p. 7461-7471, 2005.
CHEN, W. M.; JAMES, E. K.; COENYE, T.; CHOU, J. H.; BARRIOS, E.; DE
FARIA, S. M.; ELLIOTT, G. N.; SHEU , S. Y.; SPRENT, J. I.; VANDAMME, P.
Burkholderia mimosarum sp. nov., isolated from root nodules of Mimosa spp. from
Taiwan and South America. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology, v. 56, p. 1847-1851, 2006.
CHEN, W. M.; DE FARIA, S. M.; JAMES, E. K.; ELLIOTT, G. N.; LIN, K. Y.; CHOU,
J. H. Burkholderia nodosa sp. nov. isolated from root nodules of the woody Brazilian
legumes Mimosa bimucronata and Mimosa scabrella. International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology, v. 57, p. 1055-1059, 2007.
CLEYET-MAREL, J. C.; DI BONITO, R.; BECK, D. P. Chickpea and its root-nodule
bacteria: implications of their relationships for legume inoculation and biological
nitrogen fixation. Options Mditerranennes - Srie Sminaires, n. 9, p. 101-106,
1990.
273
COELHO, C. H. M.; MEDEIROS, A. F. A; POLIDORO, J. C.; XAVIER, R. P.;
RESENDE, A.; QUESADA, D. M.; ALVES, B. J. R.; BODDEY, R.; URQUIAGA, S.
Identificao de gentipos de cana-de-acar quanto ao potencial de contribuio
da fixao biolgica de nitrognio. Agronomia, v. 37, p. 37-40, 2003.
CONAB. Indicadores da Agropecuria, v. 28, n. 5, maio, 2009,67 p.
DE-POLLI, H.; MATSUI, E.; DBEREINER, J.; SALATI, E. Confirmation of
nitrogen fixation in two tropical grasses by 15N2 incorporation. Soil Biology &
Biochemistry, v. 9, p. 119-123, 1977.
DE-POLLI, H.; FRANCO, A. A.; BALDANI, J. I. Agricultura com base em fixao
biolgica de nitrognio. In: ALBUQUERQUE, A. C. S.; SILVA, A. G. (Ed.).
Agricultura tropical: quatro dcadas de inovaes tecnolgicas institucionais
e polticas. 2. ed. Braslia, DF: Embrapa Informaco Tecnolgica, 2008. v. 2.
p. 1273-1290.
DBEREINER, J. History and new perspectives of diazotrophs in association with
non-leguminous plants. Symbiosis, v. 13, p. 1-13, 1992.
DBEREINER, J. Nitrogen-fixing bacteria of the genus Beijerinckia Derx in the
rhizosphere of sugar cane. Plant and Soil, v. 15, p. 211-216, 1961.
DBEREINER, J.; BALDANI, V. L. D.; REIS, V. M. Endophytic occurrence of
diazotrophic bacteria in non-leguminous crops. In: FENDRICK, I.; GALLO, M.;
VANDERLEYDEN, J.; ZAMAROCZY, M. (Ed.). Azospirillum VI and Related
Microorganisms. Berlin: Springer-Verlag, 1995a. p. 3-14.
DOBEREINEJR, J.; CAMPELO, A. B. Non-symbiotic nitrogen fixing bacteria in
tropical soils. In: LIE, T. A.; MULDER, E. G. (Ed.). Biological nitrogen fixation in
natural and agricultural habitats. [S. l. : S. n.], 1971. p. 457-470. Plant & Soil, special
volume.
DBEREINER, J.; DAY, J. M. Nitrogen fixation in the rhizosphere of tropical
grasses. In: STEWART, W. P. D. (Ed.). Nitrogen fixation by free-living
micro-organisms. Cambridge: Cambridge University, 1975. p. 39-56.
DBEREINER, J.; RUSCHEL, A. P. Fixao simbitica do nitrognio atmosfrico
em feijo (Phaseolus vulgaris L.). I- Influncia do solo e da variedade. Rio de
Janeiro: Instituto de Ecologia e Experimentao Agrcola, 1961. 16 p. (IEEA.
Comunicado Tcnico, 10).
DOUGHTON, J. A.; SAFFIGNA, P. G.; VALLIS, I.; MAYER, R. J. Nitrogen Fixation
in Chickpea II. Comparison of 15N enrichment and 15N natural abundance
methods for estimating nitrogen fixation. Australian Journal of Agricultural
Research, v. 46, p. 225-236, 1995b.
FAGES, J.; MULARD, D. Isolement de bactries rhizosphriques et effect de leur
inoculation and pots chez Zea mays. Agronomie, v. 8, p. 309-315, 1988.
274
FRANCO, A. A.; BALIEIRO, F. C. The role of biological nitrogen fixation in
land reclamation agroecology and sustainability of tropical agriculture. In:
ROCHA-MIRANDA, C. E. (Ed). Transition to global sustainability: the contribution
of Brazilian science. Rio de Janeiro: Academia Brasileira de Cincias, 2000.
p. 209-234.
FRANCO, A. A.; FARIA, S. M. The contribution of N2-fixing tree legumes to land
reclamation and sustainability in the tropics. Soil Biology and Biochemistry, v. 29,
p. 897-903, 1997.
FUENTES-RAMIRZ, L. E.; JIMENEZ-SALGADO, T.; ABARCA-OCAMPO, I.
R.; CABALLERO-MELLADO, J. Acetobacter diazotrophicus, an indoleacetic acid
producing bacterium isolated from sugarcane cultivars of Mxico. Plant and Soil,
v. 154, p. 145-150. 1993.
GARAU, G.; YATES, R. J.; DEIANA, P.; HOWIESON, J. G. Novel strains
of nodulating Burkholderia have a role in nitrogen fixation with papilionoid
herbaceous legumes adapted to acid, infertile soils. Soil Biology & Biochemistry,
v. 41, p. 125-134, 2009.
GRANGE, L.; HUNGRIA, M. Genetic diversity of indigenous common bean
(Phaseolus vulgaris) rhizobia in two Brazilian ecosystems. Soil Biology and
Biochemistry, v. 36, p. 1389-1398, 2004.
GRANGE, L.; HUNGRIA, M.; GRAHAM, P. H.; MARTINEZ-ROMERO, E. New
insights into the origins and evolution of rhizobia that nodulate commom bean
(Phaseolus vulgaris) in Brazil. Soil Biology and Biochemistry, v. 39, p. 867-876, 2007.
GUIMARES, S. L.; BALDANI, J. I.; BALDANI, V. L. D. Efeito da inoculao de
bactrias diazotrficas em arroz de sequeiro. Revista Agronomia, v. 37, p. 25-30,
2003.
GUIMARES, S. L.; SILVA, R. A.; BALDANI, J. I.; BALDANI, V. L. D.;
DBEREINER, J. Effects of the inoculation of endophytic diazotrophic bacteria
on grain yield of two rice varieties (guarani and CNA 8305) grown under field
conditions. In: PEDROSA, F. O; HUNGRIA, M.; YATES, G.; NEWTON, W. E (Ed.).
Nitrogen fixation: from molecules to crop productivity. Dordrecht: Kluwer, 2000.
431 p. (Current Plant Sciences and Biotechnology in Agriculture, 38).
GYANESHWAR, P.; JAMES, E. K. REDDY, P. M.; LADHA, J. Herbaspirillum
colonization increases growth and nitrogen accumulation in aluminium-tolerant
rice varieties. New Phytologist, v. 154, p. 131-145, 2002.
HARTMANN, A.; ZIMMER, W. Physiology of Azospirillum. In: OKON, Y. (Ed.).
Azospirillum/Plant Associations. Boca Raton: CRC Press, 1994. p. 15-39.
275
HUNGRIA, M.; CAMPO, R. J.; MENDES, I. C. A importncia do processo de
fixao biolgica do nitrognio para a cultura da soja: componente essencial
para a competitividade do produto brasileiro. Londrina: Embrapa Soja, 2007.
80 p. (Embrapa Soja. Documentos, 283).
HUNGRIA, M.; ANDRADE, D. S.; CHUEIRE, L. M. O.; PROBANZA, A.;
GUTTIERREZ-MANERO, J.; MEGAS, M. Isolation and characterization of new
efficient and competitive bean (Phaseolus vulgaris L.) rhizobia strains. Soil Biology
and Biochemistry, v. 32, p. 1515-1528, 2000.
HUNGRIA, M.; ARAUJO, R. S. Relato da VI reunio de laboratrios para
recomendao de estirpes de Rhizobium e Bradyrhizobium. In: HUNGRIA, M.;
BALOTA, E. L.; COLOZZI-FILHO, A.; ANDRADE, D. S. (Ed.). Microbiologia do
solo: desafios para o sculo XXI. Londrina: Embrapa Soja, 1995. p. 476-489.
HUNGRIA, M.; CAMPO, R. J.; MENDES, I. C. Benefits of inoculation of the
common bean (Phaseolus vulgaris ) crop with efficient and competitive Rhizobium
tropici strains. Biology and Fertility of Soils, v. 39, p. 88-93, 2003.
HUNGRIA, M.; CAMPO, R. J.; MENDES, I. C.; GRAHAM, P. H. Contribution
of biological nitrogen fixation to the N nutrition of grain crops in the tropics: the
success of soybean (Glycine max (L.) Merr.) in South America. In: SINGH, R. P.;
SHANKAR, N.; JAIWAL, P. K. (Ed.). Nitrogen nutrition in plant productivity.
Houston: Studium Press, 2006a. p. 43-93.
HUNGRIA, M.; FRANCHINI, J. C.; CAMPO, R. J.; CRISPINO, C.C.; MORAES,
J. Z.; SIBALDELLI, R. N. R.; MENDES, I. C.; ARIHARA, J. Nitrogen nutrition of
soybean in Brazil: contributions of biological N2 fixation and of N fertilizer to grain
yield. Canadian Journal of Plant Science, v. 86, n. 4, p. 927-939, 2006b.
HUNGRIA, M.; FRANCO, A. A.; SPRENT, J. I. New sources of high-temperature
tolerant rhizobia for Phaseolus vulgaris L. Plant and Soil, v. 149, p. 95-102, 1993.
HUNGRIA, M.; PEDROSA, F. O.; SOUZA, E. M.; CAMPO, R. J. Teste de eficincia
agronmica de inoculante contendo Azospirillum spp. In: RELARE, 13., 2006,
Londrina. Resumos... Londrina: Embrapa Soja, 2006c.
HUNGRIA, M.; VARGAS, M. A. T.; CAMPO, R. J.; GALERANI, P. R. Adubao
nitrogenada na soja? Londrina: Embrapa Soja, 1997. 4 p. (Embrapa Soja.
IBGE. Lavouras. Disponvel em: <http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/
indicadores/agropecuaria/lspa/lspa_200905comentarios.pdf>. Acesso em: 30 jun.
2009.
JORDAN, D. C. Rhizobiaceae Conn 1938. In: KRIEG, N. R.; HOLT, J. G. (Ed.).
Bergeys manual of systematic bacteriology. Baltimore: Williams & Wilkins, 1984.
p. 235-244.
276
KAPULNIK, Y.; OKON, Y.; HENIS, Y. Changes in root morphology of wheat caused
by Azospirillum inoculation. Canadian Journal of Microbiology, v. 31, p. 881-887,
1985.
KAPULNIK, Y.; OKON, Y.; HENIS, Y. Yield response of spring wheat cultivars
(Triticum aestivum and T. turgidum) to inoculation with Azospirillum brasilense
under field conditions. Biology and Fertility of Soils, v. 4, p. 27-35, 1987.
KHUMAR, A.; MALIK, M. K.; AHMAD, N. Effect of mixed culture inoculation
of Rhizobium and Azotobacter on yield, nutrient uptake and quality of lentil in
calcareous soil. Lens Newsletter, v. 15, p. 21-27, 1988.
KLOEPPER, J. W.; BEAUCHAMP, C. J. A Rewiew of issues related to measuring
colonization of plant roots by bacteria. Canadian Journal of Microbiology, v. 38,
p. 1219-1232, 1992.
LIN, W.; OKON, Y.; HARDY, R. W. F. Enhanced mineral uptake by Zea mays and
Sorghum bicolor roots inoculated with Azospirillum brasilense. Applied and
Environmental Microbiology, v. 45, p. 1775-1779, 1983.
LOUREIRO, M. F.; BODDEY, R. M. Balano de nitrognio em quatro gramneas
do gnero Brachiaria. Pesquisa Agropecuria Brasileira, v. 23, p. 1343-1353, 1988.
MARTNEZ-ROMERO, E.; SEGOVIA, E.; MERCANTE, F. M.; FRANCO, A. A.;
GRAHAM, P. H.; PARDO, M. A. Rhizobium tropici, a novel species nodulating
Phaseolus vulgaris L. beans and Leucaena sp. trees. International Journal of
Systematic Bacteriology, v. 41, p. 417-426, 1991.
MENDES, I. C.; REIS JUNIOR, F. B.; HUNGRIA, M.; SOUSA, D. M. G.; CAMPO,
R. J. Adubao nitrogenada suplementar tardia em soja. Pesquisa Agropecuria
Brasileira, v. 43, p. 1053-1060, 2008.
MENDES, I. C.; HUNGRIA, M.; VARGAS, M. A. T. Soybean response to starter
nitrogen and Bradyrhizobium inoculation on a Cerrado Oxisol under no-tillage and
conventional tillage systems. Revista Brasileira de Cincia do Solo, v. 27, p. 81-87,
2003.
MENDES, I. C.; REIS JUNIOR, F. B.; MORAES, C. B.; HUNGRIA, M. Inoculao
do feijoeiro em Una, MG: cartilha para o produtor rural. Planaltina, DF: Embrapa
Cerrados, 2007. 16 p. (Embrapa Cerrados. Documentos, 175).
MENDES, I. C.; SUHET, A. R.; PERES, J. R. R.; VARGAS, M. A. T. Eficincia
fixadora de estirpes de rizbio em duas cultivares de feijoeiro. Revista Brasileira de
Cincia do Solo, v. 18, n. 3, p. 421-426, 1994.
MERCANTE, F. M.; CUNHA, C. O.; STRALIOTTO, R.; RIBEIRO JNIOR,
W.; VANDERLEYDEN, J.; FRANCO, A. A. Leucaena leucocephala as a trap-host
for Rhizobium tropici strains from the Brazilian Cerrado region. Revista de
Microbiologia, v. 29, p. 49-58, 1998.
277
MICHIELS, J.; VERRETH, C.; VANDERLEYDEN, J. Effects of temperature stress
on bean-nodulating Rhizobium strains. Applied and Environmental Microbiology,
v. 60, p. 206-1212, 1994.
MIRANDA, C. H. B.; URQUIAGA, S.; BODDEY, R. M. Selection of Panicum
maximum for associated biological nitrogen fixation using the 15N isotope dilution
technique. Soil Biology & Biochemistry, v. 22, p. 657-663, 1990.
MOULIN, L.; MUNIVE, A.; DREYFUS, B.; BOIVIN-MASSON, C. Nodulation
of legumes by members of the -subclass of Proteobacteria. Nature, v. 411,
p. 948-950, 2001.
MOULIN, L.; CHEN; W. M.; BNA, G.; DREYFUS, B.; BOIVIN-MASSSON,
C. Rhizobia: the family is expanding. In: FINAN, T.; OBRIAN, M.; LAYZELL,
D.; VESSEY, K.; NEWTON, W. (Ed). Nitrogen Fixation: global perspectives.
Wallingford: CAB International, p. 61-65, 2002.
MOSTASSO, L.; MOSTASSO, F. L.; VARGAS, M. A. T.; HUNGRIA, M. Selection
of bean (Phaseolus vulgaris) rhizobial strains for the Brazilian Cerrados. Field Crops
Research, v. 73, p. 121-132, 2002.
NICOLS, M. F.; HUNGRIA, M.; ARIAS, C. A. A. Identification of quantitative
trait loci controlling nodulation and shoot mass in progenies from two Brazilian
soybean cultivars. Field Crops Research, v. 95, p. 355-366, 2006.
OKON, Y.; LABANDERA-GONZALEZ, C. A. Agronomic applications of
Azospirillum: an evaluation of 20 years worldwide field inoculation. Soil Biology &
Biochemistry, v. 26, p. 1591-1601, 1994.
OLIVEIRA, A. L. M.; CANUTO, E. L.; URQUIAGA, S.; REIS, V. M.; BALDANI,
J. I. Yield of micropropagated sugarcane varieties in different soil types following
inoculation with diazotrophic bacteria, Plant and Soil, v. 284, p. 23-32, 2006.
PEREIRA, J. A. R.; BALDANI, J. I. Selection of Azospirillum spp. and
Herbaspirillum seropedicae strains to inoculate rice and maize plants. In:
INTERNATIONAL SYMPOSIUM SUSTAINABLE AGRICULTURE FOR THE
TROPICS: THE ROLE OF BIOLOGICAL NITROGEN FIXATION, 1995, Angra
dos Reis. Programme and abstracts... Seropdica: EMBRAPA-CNPAB: UFRRJ,
1995. p. 220-221.
PEREIRA, J. O. Microrganismos endofticos em espcies tropicais. In: REUNIO
ANUAL DE GENTICA DE MICRORGANISMOS, 20., 1995. Anais... Sociedade
Brasileira de Gentica, Piracicaba - So Paulo. Anais, v. 20, p. 3, 1995.
PEREIRA, P. A. A.; ARAJO, R. S.; ROCHA, R. E. M.; STEINMETZ, S.
Capacidade dos gentipos de feijoeiro de fixar N2 atmosfrico. Pesquisa
Agropecuria Brasileira, v. 19, p. 811-815, 1984.
278
PERES, J. R. R.; MENDES, I. C.; SUHET, A. R.; VARGAS, M. A. T. Eficincia e
competitividade de estirpes de rizbio para a soja em solos de Cerrados. Revista
Brasileira de Cincia do Solo, v. 17, p. 357-363, 1993.
PERES, J. R. R.; SUHET, A. R.; MENDES, I. C.; VARGAS, M. A. T. Efeito da
inoculao com rizbio e da adubao nitrogenada em sete cultivares de feijo em
um solo de cerrados. Revista Brasileira de Cincia do Solo, v. 18, n. 3, p. 415-420,
1994.
PERES, J. R. R.; VIDOR, C. Seleo de estirpes de Rhizobium japonicum e
competitividade por stios de infeco nodular em cultivares de soja. Agronomia
Sulriograndense, v. 16, p. 205-219, 1980.
POLIDORO J. C.; RESENDE A. S.; QUESADA, D. M.; XAVIER R. P.; COELHO
C. H. M.; ALVES B. J. R.; BODDEY R. M.; URQUIAGA, S. Levantamento da
contribuio da fixao biolgica de nitrognio (FBN) para a cultura cana-de-acar
no Brasil. Seropdica: Embrapa Agrobiologia, 2001. p. 26. (Embrapa Agrobilogia.
Documentos, 144).
QUESADA, D. M. Seleo de gentipos de capim elefante (Pennisetum
purpureum Schum.) para a alta produo de biomassa e eficincia da fixao
biolgica de nitrognio (FBN). 2001. 119 f. Dissertao (Mestrado)- Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropdica, 2001.
RADWAN, T. El-S. El-D.; MOHAMED, Z. K.; REIS, V. M. Production of
indole-3-acetic acid by different strains of Azospirillum and Herbaspirillum spp.
Symbiosis, v. 32, p. 39-54, 2002.
RAMOS, M. L. G.; BODDEY, R. M. Yield and nodulation of Phaseolus vulgaris and
the competitivity of an introduced Rhizobium strain: effects of lime, mulch and
repeated cropping. Soil Biology and Biochemistry, v. 19, p. 171-177, 1987.
REIS, V. M. Uso de bactrias fixadoras de nitrognio como inoculante para
aplicao em gramneas. Seropdica: Embrapa Agrobiologia, 2007. 22 p. (Embrapa
Agrobiologia. Documentos, 232).
REIS JUNIOR, F. B. Influncia do gentipo da planta, micropropagao
e fertilizao nitrogenada sobre a populao de bactrias diazotrficas em
cana-de-acar (Saccharum.). 2008. 160 f. Dissertao (Mestrado)- Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropdica, 1998.
REIS JUNIOR, F. B.; FARIA, S. M.; MENDES, I. C.; SIMON, M. F.; LOUREIRO,
M. F.; ELLIOT, G. N.; YOUNG, P.; SPRENT, J. I.; JAMES, E. K. Beta-Rizbios: os
novos simbiontes encontrados em espcies de Mimosa. Planaltina, DF: Embrapa
Cerrados, 2006. 20 p. (Embrapa Cerrados. Srie Documentos, 153).
279
REIS JUNIOR, F. B.; SIMON, M. F.; GROSS, E.; BODDEY, R. M.; ELLIOTT, G. N.;
NETO, N. E.; LOUREIRO, M. F.; QUEIROZ, L. P. de; CHEN, W. -M.; NORN, A.;
FARIA, S. M.; BONTEMPS, C.; GOI, S. R.; YOUNG, P. W.; SPRENT, J. I.; JAMES,
W. K. Nodulation and nitrogen fixation by Mimosa spp. in the cerrado and caatinga
biomes of Brazil. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE FISIOLOGIA VEGETAL,
12., 2009, Fortaleza. Desafios para produo de alimentos e bioenergia: livro de
resumos. Fortaleza: Sociedade Brasileira de Fisiologia Vegetal: UFC: Embrapa
Agroindstria Tropical, 2009. p. 283.
REIS JUNIOR, F. B.; REIS, V. M. Inoculante em cana novidade. Campo &
Negcios, v. 76, p. 31-32, 2009.
RIVAS, R.; VELAZQUEZ, E.; WILLEMS, A.; VIZCAINO, N.; SUBBA-RAO, N.
S.; MATEOS, P. F.; GILLIS, M.; DAZZO, F. B.; MARTINEZ-MOLINA, E. A new
species of Devosia that forms a unique nitrogen-fixing root-nodule symbiosis with
the aquatic legume Neptunia natans (L.f.) Druce. Applied and Environmental
Microbiology, v. 68, p. 5217-5222, 2002.
RUMJANEK, N. G.; XAVIER, G. R.; MARTINS, L. M. V.; MORGADO, L.
B.; NEVES, M. C. P. Feijo-Caupi tem uma nova estirpe de rizbio, BR3267,
recomendada como inoculante. Seropdica: Embrapa Agrobiologia, 2006. 16
p. (Embrapa Agrobiologia. Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento, 15).
SEGOVIA, L.; YOUNG, J. P. W.; MARTNEZ-ROMERO, E. Reclassification of
American Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli type I strains as Rhizobium
etli sp. nov. International Journal of Systematic Bacteriology, v. 43, p. 374-377, 1993.
SEVILLA, M.; BURRIS, R. H.; GUNAPALA, N; KENNEDY, C. Comparison of
benefit to sugarcane plant growth and 15N2 incorporation following inoculation
of sterile plants with Acetobacter diazotrophicus wild-type and mutant strains.
Molecular Plant-Microbe Interaction, v. 14, p. 358-366, 2001.
SPECHT, J. E.; HUME, D. J.; KUMUDINI, S. V. Soybean yield potential: a genetic
and physiological perspective. Crop Science, v. 39, p. 1560-1570, 1999.
STRALIOTTO, R.; CUNHA, C. O.; MERCANTE, F. M.; FRANCO, A. A.;
RUMJANEK, N.G. Diversity of rhizobia nodulating common beans (Phaseolus
vulgaris L.) isolated from Brazilian tropical soils. Anais da Academia Brasileira de
Cincias, v. 71, p. 3-11, 1999.
SUMNER, M. E. Crop responses to Azospirillum inoculation. Advances in Soil
Sciences, v. 12, p. 54-123, 1990.
SY, A.; GIRAUD, E.; JOURAND, P.; GARCIA, N.; WILLEMS, A.; DE LAJUDIE,
P.; PRIN, Y.; NEYRA, M.; GILLIS, M.; BOIVIN-MASSON, C.; DREYFUS, B.
Methylotrophic Methylobacterium bacteria nodulate and fix nitrogen in symbiosis
with legumes. Journal of Bacteriology, v. 183, p. 214-220, 2001.
280
THOMAS, R. J. The role of the legume in the nitrogen cycle in pastures. Grass &
Forrage Science, v. 47, p. 133-142, 1992.
URQUIAGA, S.; ALVES, B. J. R.; BODDEY, R. M.; OLIVEIRA, O. C. de; RESENDE,
A. S. de; WEBER, H. Efeito da queima, aplicao de N, irrigao e molibdnio na
produo e acumulao de nitrognio na cana de acar a longo prazo. Seropdica:
Embrapa Agrobiologia, 1998. 13 p. (Embrapa Agrobiologia. Documentos, 72).
VALLE, C. B.; EUCLIDES, V. P. B.; MACEDO, M. C. M. Caractersticas das
plantas forrageiras do gnero Brachiaria. In: SIMPOSIO SOBRE MANEJO DE
PASTAGEM, 17., 2000, Piracicaba. Anais: a planta forrageira no sistema de
produo. Piracicaba: FEALQ, 2000. p. 65-108.
VAN BERKUM, P.; EARDLY, B. D. The aquatic budding bacterium Blastobacter
denitrificans is a nitrogen-fixing symbiont of Aeschynomene indica. Applied and
Environmental Microbiology, v. 68, p. 1132-1136, 2002.
VARGAS, M. A. T.; SUHET, A. R.; MENDES, I. C.; PERES, J. R. R. Fixao
Biolgica de nitrognio em solos de Cerrados. Planaltina, DF: EMBRAPA-CPAC:
SPI, 1994. 83 p.
VARGAS, M. A. T.; MENDES, I. C.; HUNGRIA, M. Response of field grown bean
[Phaseolus vulgaris (L)] to Rhizobium inoculation and N fertilization in two Cerrados
soils. Biology and Fertility of Soils, v. 32, p. 228-233, 2000.
VARGAS, M. A. T.; PERES, J. R. R.; SUHET, A. R. Adubao nitrogenada,
inoculao e pocas de calagem para a soja em um solo sob Cerrado. Pesquisa
Agropecuria Brasileira, v. 17, p. 1227-1132, 1982.
VARGAS, M. A. T.; SUHET, A. R. Efeitos de tipos e nveis de inoculantes na
soja cultivada em um solo de Cerrado. Pesquisa Agropecuria Brasileira, v. 15,
p. 343-347, 1980.
VERMA, S. C.; CHOWDHURY, S. P.; TRIPATHI, A. K. Phylogeny based on
16S rDNA and nifH sequences of Ralstonia taiwanensis strains isolated from
nitrogen-fixing nodules of Mimosa pudica, in India. Canadian Journal fo
Microbiology, v. 50, p. 313-322, 2004.
XAVIER, R. P. Adubao verde em cana-de-acar: influncia na nutrio
nitrogenada e na decomposio dos resduos da colheita. 2002. 108 f. Dissertao
(Mestrado em Agronomia)- Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro,
Seropdica, 2002.
YOUNG, J. P. W. Phylogeny and taxonomy of rhizobia. Plant & Soil, v. 186,
p. 45-52, 1996.
281
ZILLI, J. E.; MARSON, L. C.; REIS, V. M.; ALVES, G. C.; BALDANI, V. L. D.;
CORDEIRO, A. C. C. Contribuio da bactria diazotrfica Herbaspirillum
seropedicae para o rendimento de gros de arroz e milho em Roraima. Boa
Vista: Embrapa Roraima, 2007. 20 p. (Embrapa Roraima. Boletim de Pesquisa e
Desenvolvimento, 6).
ZIMMER, A. H.; CORREA, E. S. A pecuria nacional, uma pecuria de pasto? In:
ENCONTRO SOBRE RECUPERAO DE PASTAGENS, 1., 1993. Nova Odessa.
Anais... Nova Odessa: Instituto de Zootecnia, 1993. p. 1-25.
Captulo 5 Captulo 10
283
Fungos micorrzicos arbusculares:
pesquisa e desenvolvimento
para a agricultura
Cynthia Torres de Toledo Machado
Ccero Donizete Pereira
Valter Lopes
Introduo
A micorriza arbuscular , provavelmente, a simbiose planta-micror-
ganismo mais comum. Cerca de 70% a 90% das plantas terrestres so
hospedeiros desse grupo de fungos biotrficos obrigatrios altamente
especializados (HAYMAN, 1982; SMITH; READ, 1997; RENKER
et al., 2003).
As micorrizas arbusculares representam, entre os sete tipos distin-
tos de associaes micorrzicas descritas (arbuscular, ectomicorriza,
ectendomicorriza, arbutide, monotropide, ericide e orquidide), a
associao simbitica mais abundante em todos os ecossistemas nas
mais diversas regies do planeta. As especificidades desses tipos so
descritas e ilustradas em Moreira e Siqueira (2002) e Miranda (2008).
As diferenas bsicas residem no fato de que, nas ectomicorrizas que
predominam em espcies arbreas de clima temperado, o fungo se
localiza externamente s clulas dos hospedeiros, enquanto, nas endo-
micorrizas (arbusculares), parte das estruturas fngicas so intrace-
lulares (PARNISKE, 2008).
Os primeiros estudos cientficos sobre a anatomia e a ocorrncia
dessas associaes entre fungos e razes, j especulando sobre os pos-
sveis benefcios para as plantas, comprovando experimentalmente a
natureza mutualista da relao e descrevendo as bases funcionais da
mesma, foram conduzidos por Frank, cientista alemo considerado o
pai da micorrizologia, a partir de 1885. Foi ele tambm quem empre-
gou o termo micorriza (mico, do grego mykes = fungo e riza, do grego
284
rhiza = razes) pela primeira vez (SIEVERDING, 1991; MOREIRA;
SIQUEIRA, 2002; PARNISKE, 2008).
A infeco micorrzica se caracteriza pela formao de hifas no
septadas externas s razes e hifas intra e intercelulares nas camadas
das clulas crtex, alm de arbsculos intracelulares e vesculas intra
e intercelulares (SIEVERDING, 1991).
O desenvolvimento dessa simbiose resulta na formao de estru-
turas ramificadas dentro das clulas vegetais os arbsculos que
parecem ser o principal ponto de troca de nutrientes entre os fungos
e as plantas. Essa associao responsvel no s pelo incremento
na absoro de nutrientes, principalmente fosfato, mas tambm pela
aquisio de gua e pela promoo da resistncia das plantas a diver-
sos estresses biticos e abiticos, sendo considerada por Smith e Read
(1997), como ecologicamente obrigatria.
A contribuio das plantas na simbiose o fornecimento de carboi-
dratos aos fungos (SOLAIMAN; SATO, 1997), e estima-se que mais
de 20% dos produtos da fotossntese das plantas terrestres (aproxima-
damente 5 bilhes de toneladas de carbono/ano) sejam consumidos
pelos fungos micorrzicos arbusculares (FMAs) (BAGO et al., 2000).
Essa associao contribui de forma importante para o ciclo global do
carbono (C).
Os efeitos benficos da micorriza arbuscular so mais aparentes sob
condies de disponibilidade limitada de nutrientes. Verifica-se que a
colonizao radicular reduzida significativamente sob condies de
abundncia de nutrientes. Entretanto, esses mecanismos regulatrios
ainda no foram completamente elucidados, bem como os que indu-
zem inibio de patgenos em razes colonizadas (PARNISKE, 2008).
Ocorrncia e importncia ecolgica dos
fungos micorrzicos arbusculares (FMAs )
H indcios, a partir de estudos realizados em razes fossilizadas,
que essa simbiose tenha surgido h aproximadamente 400 milhes
de anos e, a partir dessas evidncias, supe-se que as plantas terres-
tres e os fungos micorrzicos tenham coevoludo juntos (HECKMAN
et al., 2001; PARNISKE, 2008).
285
Captulo 10 Fungos micorrzicos arbusculares: pesquisa e desenvolvimento para a agricultura
O processo evolucionrio no bem conhecido, mas muito pro-
vavelmente os fungos micorrzicos originaram-se de fungos saprof-
ticos que adquiriram, ao longo da evoluo, alto grau de compatibi-
lidade gentica e funcional com os parceiros autotrficos. No incio
desse processo, a colonizao se dava na rizosfera e na superfcie
das razes. Posteriormente, esses fungos desenvolveram mecanis-
mos que permitiram a penetrao inter e intracelular das razes. Em
seguida, os fungos perderam a capacidade saproftica, tornando-se
essencialmente biotrficos. A perda da capacidade de patognese se
deu quando esses organismos adquiriram a capacidade de regular a
sntese e a atividade de enzimas hidrolticas que causam a citlise e
necrose das clulas do hospedeiro. Essas hipteses so relatadas por
Moreira e Siqueira, 2002.
O tempo que os fungos micorrzicos arbusculares tiveram para se
dispersar e a falta de hospedeiro especfico explicam a ocorrncia das
micorrizas arbusculares nos diversos eco e agroecossistemas, como
as reas agrcolas, florestas tropicais e temperadas, desertos, dunas
e pradarias (BRUNDRETT, 1991, citado por MOREIRA; SIQUEIRA,
2002). No existem padres biogeogrficos que descrevam a ocorrn-
cia dessas associaes, que so raras apenas nos ambientes rticos e
nas regies de tundras, onde predominam as ericceas e suas micor-
rizas especficas (MOREIRA; SIQUEIRA, 2002).
Portanto, micorrizas arbusculares so a regra na natureza e no
a exceo, e a ausncia da associao simbitica uma situao res-
trita a poucas famlias, gneros ou espcies vegetais como as cruc-
feras, que pertencem famlia das brssicas, em que 87% de seus
membros no formam micorrizas. Famlias tipicamente micorrzi-
cas, como as leguminosas, possuem espcies que no se associam
aos FMAs, como acontece com 4% das espcies do gnero Lupinus.
Outras famlias que possuem membros que no formam micorri-
zas so: Chenopodiaceae, Poligonaceae, Amarantaceae, Comelinaceae,
Juncaceae, Proteaceae e Cyperaceae (MOREIRA; SIQUEIRA, 2002).
As razes para a condio no micorrzica de algumas espcies so
pouco conhecidas, mas alguns fatores j foram identificados, como
a produo de compostos fungistticos como os glicosinolatos pelas
crucferas, a insuficincia de fatores estimulantes ou sinais molecu-
286
lares nos exudatos de certas espcies e at mesmo deficincias na
aderncia ou existncia de barreiras fsicas na parede do hospedeiro
(MOREIRA; SIQUEIRA, 2002).
At o momento so conhecidas entre 180 e 200 espcies de FMAs,
listadas na pgina do International Culture Collection of Arbuscular
and Vesicular-Arbuscular Mycorrhizal Fungi (INVAM), http://invam.
caf.wvu.edu, sendo esse nmero significativamente pequeno quando
comparada a outros microorganismos, considerando os 400 milhes
de anos de seu surgimento. Smith e Read (1997) comentam que o
reduzido nmero de espcies e a ausncia de especificidade com hos-
pedeiro podem ser explicados pelo modo de reproduo exclusiva-
mente clonal desses fungos, bem como pela possibilidade de uma
nica planta hospedeira ser colonizada por diferentes espcies desse
fungo. Portanto, essa diversidade gentica considervel e inesperada
para organismos de reproduo assexuada.
As possveis razes para tal variabilidade gentica podem ser expli-
cadas por algumas caractersticas. A primeira delas que as hifas
dos FMAs so asseptadas e cenocticas, ou seja, no possuem sep-
tos e concentram mltiplos ncleos dentro da mesma clula. Outro
aspecto muito relevante que os esporos individuais contm centenas
de ncleos geneticamente distintos (PARNISKE, 2008). Alm disso,
embora no haja relatos de fases sexuais no ciclo de vida desses fun-
gos, possvel que o material gentico dos mesmos seja trocado e
recombinado porque ocorre anastomose nas hifas (GIOVANNETTI
et al., 2004), ou seja, a fuso dessas com conexo citoplsmica e con-
sequente troca de ncleos.
De acordo com Husband et al. (2002), a aparente baixa diversidade
dos FMAs comparada com a variedade de comunidades de plantas
associadas a eles leva a acreditar que esses fungos constituem um
grupo homogneo e que as espcies so funcionalmente redundan-
tes. A simbiose micorrzica considerada no especfica, mas existe
entre fungos e planta hospedeira o que se denomina habilidade dis-
criminatria, que o que ir determinar as variaes de infectividade,
eficincia e efetividade para as combinaes fungo, planta e condi-
es ambientais (PAULA et al., 1988). Entretanto, vrios estudos tm
demonstrado que espcies individuais de FMAs podem apresentar
287
uma gama de efeitos em diferentes plantas hospedeiras, promovendo
o crescimento de algumas e retardando o desenvolvimento de outras
(TALUKDAR; GERMIDA, 1994; STREITWOLF-ENGEL et al., 1997;
VAN DER HEIJDEN et al., 1998). A resposta em crescimento das
plantas tambm pode variar em funo da colonizao por espcies
diferentes de FMAs (SANDERS; FITTER, 1992; BEVER et al., 1996).
O certo que os FMAs so determinantes potenciais da estrutura
das comunidades vegetais e sua diversidade determina a biodiversi-
dade vegetal, bem como a variabilidade e produtividade dos agro e
ecossistemas (VAN DER HEIJDEN et al., 1998). Da a enorme impor-
tncia do conhecimento da diversidade dos fungos micorrzicos e seu
comportamento e organizao em condies de campo, tais como
os fatores ambientais que determinam a esporulao dos fungos, a
relao entre a populao e a colonizao das razes, a identificao
de quais espcies esto colonizando razes de determinadas plantas,
entre outros aspectos importantes.
Parte desses estudos dificultada pelo biotrofismo obrigatrio que
caracteriza essa relao simbitica, bem como pela natureza hip-
gea do micosimbionte (FORTIN et al., 2002). Enormes esforos vm
sendo dispensados nas ltimas dcadas para a obteno da simbiose
in vitro, com estudos que envolvem culturas de razes (transformadas
geneticamente ou no), escolha de espcies hospedeiras, tcnicas de
inoculao e preservao e meios de cultura.
Fortin et al. (2002) realizaram uma reviso sobre o assunto, ver-
sando sobre o potencial da cultura de razes no avano de estudos
sobre morfologia dos FMAs, taxonomia, filogenia, entendimento dos
processos de colonizao radicular e desenvolvimento micelial, envol-
vendo descobertas nos nveis fisiolgicos, bioqumicos e moleculares.
Vrias espcies de FMAs, representativas das famlias Acaulosporaceae,
Gigasporaceae e Glomaceae tm sido cultivadas com sucesso em cultu-
ras de razes e existe uma coleo internacional de FMAs cultivados in
vitro, a Ginco (Glomales In Vitro Collection), resultado de parcerias
de universidades e centros de pesquisa da Blgica e Canad (FORTIN
et al., 2002). No obstante esses avanos, ainda no se conseguiu o
cultivo desses fungos em meios de culturas artificiais na ausncia de
clulas vivas do hospedeiro (MIRANDA, 2008).
288
Mtodos de avaliao de fungos micorrzicos
arbusculares em razes e solos
Colorao das razes e quantificao da infeco
As razes das plantas no sofrem alteraes morfolgicas em decor-
rncia da colonizao pelos fungos micorrzicos arbusculares. Assim,
observaes ao microscpio so necessrias para determinar e quan-
tificar a infeco micorrzica, aps as razes finas serem clarificadas
e coradas. Sieverding (1991) ressalta a necessidade da colorao pelo
fato de o miclio e outras estruturas fngicas serem hialinas ou trans-
parentes e de difcil deteco, passveis de serem confundidas com
estruturas de fungos saprofticos ou parasitas. A colorao facilita a
caracterizao das estruturas e sua diferenciao, mas estruturas de
outros fungos alm dos FMAs podem ser coradas tambm, reque-
rendo certa experincia do observador.
O mtodo clssico de colorao foi desenvolvido por Phillips e
Hayman (1970), sendo relativamente simples. Essa metodologia ainda
utilizada, com modificaes propostas para reduo de uso de pro-
dutos txicos como o fenol, componente da soluo corante de azul
de tripano (KOSKE; GEMMA, 1989; MIRANDA, 2008) e para a cla-
rificao e colorao de razes mais lignificadas (SCHENCK, 1984),
para espcies lenhosas e para espcies arbreas exticas e nativas
do Cerrado, entre outras. Essas ltimas foram desenvolvidas no
Laboratrio de Micorrizas da Embrapa Cerrados e so descritas deta-
lhadamente em Miranda (2008).
Aps a colorao, a avaliao da colonizao radicular em percenta-
gem de segmentos de razes que contenham estruturas fngicas se d
por meio da tcnica da intercesso radicular proposta por Giovannetti
e Mosse (1980).
Extrao de esporos
A diversidade dos FMAs a campo tem sido tradicionalmente esti-
mada pelo nmero de esporos das diferentes espcies encontradas. A
identificao dos fungos se d aps os mesmos terem esporulado no
289
incio de sua fase reprodutiva, pela separao dos esporos do solo ou
do substrato onde est se cultivando a planta hospedeira.
Os procedimentos para a separao dos esporos do solo so sim-
ples e se baseiam em suspenso do material (solo e razes) em gua,
com posterior peneiramento, decantao e centrifugao. A meto-
dologia clssica de extrao de esporos por peneiramento mido foi
descrita por Gerdemann e Nicolson (1963), e desde ento vem sendo
utilizada com algumas variaes. Descries detalhadas de outros
procedimentos so encontradas em Schenck (1984); Pacioni (1994) e
Tommerup (1994).
O material de solo e razes, em massa e (ou) volume conhecido,
(geralmente 50 g) suspenso em gua por tempo suficiente para
a sedimentao de partculas grosseiras e a suspenso decantada
em uma srie de peneiras acopladas com gradiente decrescente de
malhas. Esse procedimento repetido vrias vezes (Figura 1). O mate-
rial retido nas peneiras inferiores submetido centrifugao em
gua e caulim ou em soluo de sacarose para a separao dos espo-
ros das partculas mais pesadas do substrato. Quando a centrifugao
feita em soluo de sacarose, os esporos permanecem na camada
superficial, enquanto as partculas de solo se mantm na parte infe-
rior do tubo de centrfuga. J quando a suspenso de solo centri-
fugada com a adio de caulim, os esporos se prendem no fundo do
tubo da centrfuga.
A metodologia adaptada e utilizada no Laboratrio de Micorrizas
da Embrapa Cerrados uma combinao daquelas estabelecidas por
Gerdemann e Nicolson (1963) e Coolen (1979), utilizando duas penei-
ras, de 710 m e 53 m. A centrifugao feita com caulim tende a
preservar a integridade dos esporos, j a soluo de sacarose pode
provocar o rompimento das paredes e vazamento do contedo cito-
plasmtico, desde que os esporos permaneam na mesma. Esses pro-
cedimentos e particularidades metodolgicas so descritos detalhada-
mente em Miranda (2008).
Uma vez extrados, os esporos so contados em placas de petri espe-
ciais e observados em lupas e microscpios, para identificao a par-
tir de suas caractersticas morfolgicas.
290
Figura 1. Etapas da tcnica de peneiramento mido: (A) peneira metlica;
(B) decantao atravs do conjunto de peneiras; e (C) remoo dos esporos
para a placa de Petri.
Fonte: Extrado de Pacioni (1994).
Determinao do potencial de inculo pelo mtodo do
nmero mais provvel (NMP )
Os esporos so estruturas de sobrevivncia dos FMAs e, em deter-
minadas situaes, constituem a nica forma de propgulo infectivo
desses fungos no solo. Esse o caso de longos perodos de seca e (ou)
de solo sem vegetao. Nesses casos, de acordo com Sieverding (1991),
o nmero de esporos por unidade de massa ou volume de solo repre-
senta a extenso dos propgulos dos fungos no campo.
291
Entretanto, o nmero de esporos frequentemente usado para
quantificar a populao de FMAs durante os perodos de crescimento
das plantas, em reas normalmente vegetadas ou cultivadas. Embora
a densidade de esporos possa se correlacionar bem com o total de pro-
pgulos infectivos dos FMAs nos solos em certas situaes (TORO;
SIEVERDING, 1986; GAVITO, 1988, citado por SIEVERDING, 1991),
cuidados devem ser tomados ao interpretar esses dados como medi-
das efetivas do potencial de inculo, visto que a esporulao depende
do fungo propriamente dito, do hospedeiro, das caractersticas do
solo e das condies climticas. Assim, o potencial de inculo pode
ser subestimado, j que o miclio fngico uma importante fonte de
inculo que no quantificada pela contagem de esporos, bem como
as taxas de infeco radiculares, que constituem medidas indiretas da
infectividade da populao dos FMAs.
O nico mtodo que quantifica todos os propgulos infectivos dos
FMAs e estima a populao dos mesmos, fornecendo nmero de pro-
pgulos por unidade de volume ou massa de solo, inclusive com limi-
tes de intervalo de confiana, o mtodo do nmero mais provvel
(NMP), adaptado do mtodo de Porter (1979) para os estudos de FMAs.
Diluies seriadas do solo que se pretende estudar so feitas nesse
mesmo solo esterilizado, constituindo bioensaios com repeties e
sries de diluies recomendadas para situaes especficas. Nos reci-
pientes em que o substrato nas diversas diluies colocado (tube-
tes, em geral), planta-se uma espcie encontrada na rea em estudo,
ou uma planta teste padro, como Brachiaria decumbens, por exem-
plo (Figura 2). Aps 6 a 8 semanas, a infeco radicular dessas plan-
tas-teste verificada, estimando-se, por frmulas especficas, o poten-
cial de propgulos infectivos daquele solo, em termos de densidade e
efetividade das populaes.
Esse mtodo relativamente de fcil execuo, mas existem algu-
mas limitaes. Podem ocorrer subestimativas pela no colorao de
algumas micorrizas, conforme descreve Morton (1985). Outros auto-
res, como Miranda (2008), consideram-no trabalhoso para uso em
rotina de laboratrios de micorrizas, em face ao volume de amostras
decorrentes das sries de diluio e do nmero de repeties.
292
Figura 2. Ensaio de NMP, com tubetes contendo as diluies de solo e a
planta teste.
Embrapa Cerrados, setembro de 2009.
Glomalina
A estimativa da biomassa fngica pela determinao da produo
de hifas externas (SYLVIA, 1994), considerada difcil e morosa por
alguns autores (JAKOBSEN et al., 1992; MILLER et al., 1995; RILLIG
et al., 1999 citados por ROSIER et al., 2006), evoluiu para o uso de
marcadores bioqumicos como ergosterol, quitina e glomalina como
indicadores dos FMAs (NYLUND; WALLANDER, 1994; WRIGHT
et al., 1996). Posteriormente, verificou-se que vrios outros organis-
mos produzem ergosterol e quitina (FREY et al., 1994), bem como
que existem FMAs que no contm ergosterol (OLSSON et al., 2003).
Assim, a determinao da glomalina vem sendo usada para identi-
ficar a presena (WRIGHT et al., 1996) e estimar a biomassa desses
fungos (KRIVTSOV et al., 2004; LOVELOCK et al., 2004). Trata-se de
uma glicoprotena insolvel (WRIGHT; UPADHYAYA, 1996) pro-
duzida pelas hifas de todos os FMAs, mas no por outros grupos
de fungos do solo (WRIGHT et al., 1996), que atua efetivamente na
cementao das partculas do solo (WRIGHT; UPADHYAYA, 1998),
incrementando a estabilidade dos agregados, j promovida pelo efeito
F
o
t
o
:

C
c
e
r
o

D
o
n
i
z
e
t
i

P
e
r
e
i
r
a
293
fsico das redes de hifas fngicas extraradiculares que envolvem e
interligam as partculas do solo.
Na condio de glicoprotena, a glomalina possui quantidades
expressivas de carbono (C), representando elevada proporo do C
orgnico do solo e perfazendo quantidades muito superiores daquele
armazenado na biomassa microbiana (RILLIG et al., 2001), consti-
tuindo, portanto, um indicador sensvel das mudanas nos teores de
C dos solos advindas das prticas de manejo e uso das terras, estando
tambm envolvida no sequestro de C (RILLIG et al., 1999; RILLIG
et al., 2003).
A determinao da glomalina se d mais frequentemente pela extra-
o em citrato de sdio e anlise pelo reagente de Bradford ou por
Elisa (WRIGHT; UPADHYAYA, 1998; ROSIER et al., 2006; JANOS
et al., 2008).
Identificao e classificao e dos fungos
micorrzicos arbusculares (FMAs)
A base da taxonomia dos FMAs a formao dos esporos, seguida
de caractersticas dessas estruturas, tais como tamanho, cor e espe-
cificidades das paredes internas e externas, como nmero de cama-
das, ornamentao, reaes a corantes especficos entre outras.
Atualmente so conhecidas 5 famlias e 7 gneros de fungos micor-
rzicos, nas quais se distribuem aproximadamente 200 espcies des-
ses fungos, listados na pgina do Invam (http://invam.caf.wvu.edu).
Os fungos micorrzicos arbusculares pertencem ao filo
Glomeromycota, um filo monofiltico (SCHBLER et al., 2001). A
classificao atual, proposta por Morton e Redecker (2001), foi esta-
belecida a partir de consenso entre caractersticas morfolgicas dos
esporos e mtodos moleculares. Nessa nova classificao, foram incor-
poradas duas novas famlias com dois gneros: Archaeosporaceae
e Paraglomaceae, com os respectivos gneros Archaeospora e
Paraglomus. Essas novas famlias foram descritas com base em carac-
teres morfolgicos atpicos, distncias entre padres imunolgicos e
de cidos graxos e divergncias na sequncia 18S do DNA ribosso-
mal (INVAM, 2008).
294
As classificaes anteriores datam de 1974, estabelecida por
Gerdemann e Trappe (citados por MIRANDA, 2008), e 1990, pro-
posta por Morton e Benny. Essa se deu com nfase na filogenia, na
teoria do ancestral comum, destacando-se por remover os FMAs da
ordem Endogonales (vigente por mais de duas dcadas desde a propo-
sio na classificao de 1974), inserindo-os na nova ordem Glomales
e definindo duas subordens: Glomineae e Gigasporineae. A famlia
Gigasporaceae, com os gneros Gigaspora e Scutellospora, pertencem
subordem Gigasporineae e as famlias Glomaceae (com os gneros
Glomus e Sclerocystis) e Acaulosporaceae (com os gneros Acaulospora
e Entrophospora) pertencem subordem Glomineae. Na classificao
seguinte, de 2001, o gnero Sclerocystis foi extinto.
As principais caractersticas que diferenciam as subordens, seus
gneros e as respectivas espcies so sumarizadas no Tabela 1.
Tabela 1. Diferenas entre as subordens Glomineae e Gigasporineae.
Subordem Glomineae Subordem Gigasporineae
Arbsculos e vesculas dentro das razes
fungos micorrzicos vesculo arbusculares
Arbsculos fungos
micorrzicos arbusculares
Hifas cilndricas com ramificaes
perpendiculares
Clulas auxiliares
Esporos com camadas evanescentes
envolvendo a camada laminar da parede
Esporos em clula bulbo-suspensora;
com camadas permanentes envolvendo
a camada laminar da parede
Propgulos infectivos: esporos,
hifas e vesculas
Propgulos infectivos: esporos
As famlias da subordem Glomineae, com seus respectivos
gneros, Glomaceae (Glomus) (Figura 3); Acaulosporaceae (gne-
ros Acaulospora e Entrophsopora); Archaeosporaceae (Archaeospora)
(Figura 4); e Paraglomaceae (Paraglomus), possuem caractersticas
bastante peculiares que as diferenciam entre si e dos gneros da fam-
lia Gigasporaceae (Figura 5). Essas caractersticas so as seguintes:
295
Famlia Glomaceae
Gnero Glomus
a) Esporos desenvolvidos terminalmente na hifa, presena de
pedicelo.
b) Esporos menores, com maior nmero de camadas e em cores
variadas.
c) Esporos isolados, em agregados ou em esporocarpos, podendo
se formar dentro das razes.
d) Hifa contnua parede do esporo.
e) Ausncia de paredes germinativas.
f) Vesculas podem ou no se formar.
a
b
c
d
Figura 3. (a) e (b) Glomus clarum; (c) Glomus intraradices; e (d) Glomus
etunicatum.
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Famlia Acaulosporaceae
Paredes germinativas, formao de sculo esporfero antes do
desenvolvimento dos esporos, esporos formados na hifa do sculo
esporfero.
Gnero Acaulospora:
a) Esporos formados na lateral da hifa do sculo esporfero.
Gnero Entrophospora:
a) Esporos formados dentro da hifa do sculo esporfero.
a b
Figura 4. (a) Acaupospora denticulata e (b) Entrophopora colombiana.
Famlia Archaeosporaceae
Gnero Archaeospora
a) No formam vesculas.
b) Arbsculos se colorem muito pouco; distribuio irregular em
cereais e gramneas hospedeiras.
c) Formao de esporos glomo e acaulosporoides 3 modos:
sculo esporfero larteral, semelhante a Acaulospora; termi-
nalmente na hifa, como Glomus e com formao de pedicelo
no sculo esporfero que se desprende.
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Famlia Paraglomaceae
Gnero Paraglomus
a) Vesculas pobremente caracterizadas.
b) Arbsculos tambm no se colorem bem.
c) Formao de esporos semelhante ao gnero Glomus.
d) Duas espcies: P. occultum e P. brasilianum.
A famlia Gigasporaceae, da subordem Gigasporineae, possui dois
gneros, Gigaspora e Scutellospora. Essa famlia tem por caracters-
tica principal a formao de esporos em clula bulbo ou esporgena.
As peculiaridades que diferem os gneros dessa famlia so listadas
a seguir.
Famlia Gigasporaceae
Formao de esporos em clula bulbo ou esporgena
Gnero Gigaspora
a) Esporos gigantes.
b) Esporos sem ornamentao.
c) Tubo germinativo emerge a partir de camada fina e verrugosa
da parede laminar interna.
d) Paredes dos esporos possuem duas camadas.
e) Clulas auxilares com ornamentao equinulada.
Gnero Scutellospora
a) Esporos com escutelo, escudo ou placa de germinao
b) Placa de germinao persistente formada a partir da parede
interna, de onde emergem os tubos de germinao
c) Clulas auxiliares com ornamentao nodosa ou lobada
d) Paredes do esporo: camadas permanente e laminar (at 30)
e) Esporos com ou sem ornamentao
298
a b
Figura 5. (a) Gigaspora decipiens e(b) Scutellospora cerradensis.
Aplicao de mtodos moleculares em estudos
com fungos micorrzicos arbusculares
A identificao dos fungos micorrzicos arbusculares (FMAs)
essencial para pesquisas com esses organismos, sendo feita base-
ando-se na ontogenia e morfologia dos esporos. um processo com-
plexo, dependente da utilizao de chaves de identificao e altamente
dependente de profissionais especialistas e experientes em taxonomia.
Alguns autores consideram que a identificao por mtodos mor-
folgicos pode ser imprecisa devido grande homogeneidade morfo-
lgica e anatmica das estruturas desses fungos, ao fato de algumas
espcies formarem tipos muito similares de esporos, dificultando a
diferenciao de espcies, bem como pela ocorrncia de alteraes
morfolgicas em funo das condies ambientais a campo (CLAPP
et al., 1995; SALES; SOUZA, 1998; REDECKER et al., 2000; RENKER
et al., 2003; MA et al., 2005).
Assim, o emprego de mtodos moleculares em anlises de comu-
nidades de FMAs baseados na extrao, amplificao e caracterizao
de cidos nucleicos ganhou notoriedade nas ltimas dcadas, com-
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299
plementando os at ento utilizados extrao direta de esporos e cul-
tivo armadilha (GOI; SOUZA, 2006). A maioria das tcnicas molecu-
lares utilizadas na identificao de FMAs baseada na utilizao da
reao em cadeia da polimerase (PCR Polymerase Chain Reaction),
que tem como finalidade produzir uma quantidade efetiva de um
segmento especfico de DNA, a partir de uma quantidade mnima de
DNA molde associado a molculas iniciadoras (primers) de sequn-
cias especficas, s regies de DNA que se deseja amplificar.
A primeira sequncia de DNA de FMAs obtidas de razes infec-
tadas por esses fungos foi apresentada por Simon et al. (1992). Eles
afirmaram que a possibilidade de se amplificar sequncias da subu-
nidade menor do rRNA (SSU), regio codificadora 18S, fornecia
uma nova abordagem para a deteco rpida, identificao e quan-
tificao dos FMAs, alm de maior facilidade em estudos de filoge-
nia desses organismos. No ano seguinte, os estudos dessa regio
foram ampliados usando uma quantidade maior de primers espe-
cficos para FMAs associados tcnica Single Strand Conformation
Polymorphims (SSCP), para identificar diferenas nas sequncias
amplificadas (SIMON et al., 1993).
Utilizando a tcnica de Random Amplification of Polymorphic DNA
(RAPD) e como molde DNA genmico de FMAs, Wyss e Bonfante
(1993) identificaram polimorfismos entre espcies desses fungos,
sugerindo um possvel desenvolvimento de sondas especficas para
estudo de biodiversidade para espcies desse filo. Longato e Bonfante
(1997) compararam a tcnica de microsatlites com RAPD e verifi-
caram vantagens na utilizao de microsatlites, pois produziram
fingerprints nicos, mesmo em genomas heterogneos como os de
FMAs, quando comparados s amplificaes por RAPD. Entretanto,
genes que codificam para rDNA so os mais utilizados nesse tipo de
estudo por atenderem alguns critrios, entre os quais, a alta varie-
dade que possibilita o desenvolvimento de primers para inmeras
classes taxonmicas (BRUNS; GARDNES, 1993). Nesses genes, as
regies codificadoras (18S, 5,8S e 25S) so as mais conservadas, as
regies internas (ITS) mostram uma variao relativamente mediana
e as regies intergnicas (IGS) so as mais variveis (LANFRANCO,
1998; citado por NOVAIS, 2008).
300
Clapp et al (1995), utilizando a tcnica denominada enriqueci-
mento seletivo de DNA amplificado Selective Enrichment of
Amplified DNA (SEAD), identificaram FMAs a partir de DNA extrado
diretamente de razes. Nessa tcnica, o DNA foi amplificado com os
primers universais para eucariotos, SS38 e NS21, e, associando a um
mtodo baseado no princpio de hibridao subtrativa para a remo-
o de produtos amplificados de DNA de plantas pela PCR, selecio-
naram sequncias especficas para FMAs. Nesse mesmo estudo, os
autores comentam sobre a importncia de utilizao de mtodos que
possam revelar diretamente a taxa de colonizao de FMAs em razes,
de grande importncia na elucidao de biodiversidade e ecologia des-
ses. Apesar de outras tcnicas como o uso de isozimas (ROSENDAHL;
SEN, 1992) e mtodos imunolgicos (WRIGHT et al, 1987) terem sido
inicialmente aplicados nesses estudos, Clapp et al (1995) consideram
o PCR o mais promissor dos mtodos.
A amplificao de DNA de um nico esporo para estudar a diver-
sidade de FMAs em populaes naturais foi realizada por Sanders
et al. (1995). Nesse estudo, foram utilizados os primers ITS1 e ITS4
na PCR, tendo-se realizado a subsequente restrio do produto de
amplificao por enzimas de restrio. Essa tcnica, conhecida como
Restriction Fragment Length Polimorfism-PCR (RFLP-PCR), detec-
tou diferentes padres de bandeamento obtidos de diversos isolados.
A associao de caracteres morfolgicos a resultados molecula-
res, entretanto, deu-se pela primeira vez em um trabalho realizado
por Morton e Redecker (2001), que, na ocasio, propuseram duas
novas famlias na rvore filogentica dos FMAs: Archaeosporaceae e
Paraglomaceae. Posteriormente, estudos moleculares similares, base-
ados na regio 18S do rDNA, demonstraram a natureza monofil-
tica do grupo de espcies dos FMAs, incluindo-os em um novo filo:
Glomeromycota (SCHLER et al., 2001).
Tonin et al (2001) caracterizaram esporos de FMAs de solo rizosf-
rico e razes de Viola alaminaria, planta tolerante a metais pesados, por
meio de PCR para a regio 18S rDNA. O estudo da diversidade des-
ses e de outros fungos foi avaliada por Terminal-Restriction Fragment
Length Polymorphism (T-RFLP), utilizando as enzimas de restrio
HinfI, HaeIII. Os resultados confirmaram que a anlise por T-RFLP
301
uma ferramenta muito til para avaliao da diversidade microbiana
de comunidades complexas, inclusive, podendo ser utilizada para a
identificao de espcies de FMAs, quando primers universais forem
utilizadas para o filo glomeromicota. Anos mais tarde, em uma revi-
so de literatura, Dickie e Fitzjohn (2007) mostraram a ampla utiliza-
o desta tcnica em estudos da ecologia de FMAs, relatada em vrios
trabalhos sobre o assunto (TONIN et al, 2001; JOHNSON et al, 2003;
MUMMEY et al, 2005; RBERG et al, 2005).
Um nested PCR foi desenvolvido por Renker et al. (2003) para
amplificar espao interno de transcrito (ITS) de FMAs a partir de ra-
zes, possibilitando a identificao de espcies desse fungo por meio
de uma tcnica molecular. Essa tcnica e algumas variaes dela so
frequentemente usadas para anlises filogenticas entre espcies
estreitamente relacionadas e de populaes de uma mesma espcie
(MA et al, 2005; RENKER et al, 2005; RODRGUEZ-ECHEVERRA;
FREITA, 2006; WU et al, 2007; APPOLONI et al., 2008; NOVAIS,
2008; OLIVEIRA, 2009; ZHANG et al, 2010).
Cornejo et al (2004) utilizaram nested PCR associada tcnica
Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE) para
sequncias da regio codificadora 18S de FMAs. Essa tcnica usa
o mesmo princpio do Single Strand Conformation Polymorphism
(SSCP), permitindo a migrao diferenciada do segmento de DNA
de acordo com a sua sequncia de nucleotdeos, possibilitando, neste
estudo, a identificao de espcies de Glomus colonizando razes de
diferentes espcies de plantas.
A variao inter e intraespecfica da regio codificadora 18S do
gnero Gigaspora foi explorada por Souza et al. (2004). Um screening
sobre 48 isolados por PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
(PCR-DGGE) revelou que a regio V3-V4 do gene 18S contm variao
suficiente para discriminar diferentes espcies do gnero Gisgaspora.
Esses autores mostraram que a identificao via DGGE mais con-
fivel que a identificao morfolgica para algumas espcies desse
gnero, mas afirmaram que, apesar dos avanos em estudo molecula-
res, houve pouco progresso na identificao e caracterizao de esp-
cies, ainda muito dependentes de anlises morfolgicas.
Outros estudos foram conduzidos por Ma et al (2005), que descreve-
ram a PCR com primers especficos para a regio 18S associada a um
302
DGGE como uma ferramenta importante para se caracterizar comuni-
dades complexas de FMAs em agroecossistemas e por Appoloni et al
(2008), que, realizando sequenciamento dos produtos amplicados por
nested-PCR, determinaram diferenas entre comunidades de FMAs
em solos geotrmicos do Parque Nacional Yellowstone (EUA), iden-
tificando filotipos especficos para aquele tipo de solo.
Novais (2008) fez uma caracterizao molecular com base na dis-
criminao especfica da regio V9 da regio codificadora 18S, por
PCR-DGGE, que permitiram a diferenciao de espcies de FMAs
inclusive das espcies Gisgapora albida, G. margarita e G. gigantea,
pertencentes a um mesmo gnero, corroborando com a identificao
fenotpica. Zhang et al (2009) usaram essa mesma tcnica para estu-
dar a interao entre FMAs e bactrias na rizosfera de duas espcies
vegetais dominantes numa regio de Zhifanggou, noroeste da China.
Os resultados das anlises moleculares indicaram que as plantas tm
um efeito seletivo na estrutura da comunidade bacteriana, mas os
FMAs no tiveram estrita especificidade com a planta hospedeira.
Essa tcnica tambm foi usada com sucesso por Oliveira et al (2009),
na anlise da estrutura da comunidade de FMAs na rizosfera de gen-
tipos de milho contrastantes quanto a eficincia de fsforo.
Estabelecimento da associao micorrzica
O estabelecimento da associao micorrzica resulta de uma sequ-
ncia de eventos coordenados pelo fungo e pela planta e por suas inte-
raes. Na Figura 6, ilustram-se essas fases, de forma simplificada,
mostrando que a regulao do micotrofismo, ou seja, do fluxo de
nutrientes do fungo para as plantas o que determina a resposta das
mesmas colonizao, enquanto a regulao do biotrofismo (fluxo de
fotoassimilados das plantas para os fungos) controla o grau de coloni-
zao, produo de propgulos e sobrevivncia dos micosimbiontes.
Os esporos so unidades biolgicas em processo de quiescncia
que precisam ser ativados para desencadear os processos e funes
metablicas que sustentam a germinao e o crescimento da fase fila-
mentosa (das hifas) (MOREIRA; SIQUEIRA, 2002). No se conhece o
mecanismo exato da ativao, mas sabe-se que a germinao dessas
estruturas geralmente no requer a presena da raiz do hospedeiro,
303
sendo um estgio no simbitico (FORTIN et al., 2002). Entretanto,
apesar dos esporos dos FMAs serem capazes de germinar na ausn-
cia das plantas hospedeiras, esses microganismos so biotrficos
obrigatrios que dependem de um parceiro fotoautotrfico vivo para
completar seu ciclo de vida e produzir a prxima gerao de esporos
(PARNISKE, 2008).
Uma das possibilidades relatadas em Moreira e Siqueira (2002)
que o incio da germinao se d pela ativao de proteases at ento
inativas das membranas dos esporos, resultante da absoro de gua e
consequente aumento de volume. A partir dessa modificao nas con-
dies biofsicas da membrana, ocorre a ativao das enzimas proteo-
lticas armazenadas, hidrlise de protenas de reserva com o aumento
da concentrao de aminocidos livres, que, por sua vez, sintetizaro
novas protenas com funes enzimticas especficas, dependentes
do cdigo gentico do esporo, iniciando o processo de germinao.
Fungo Planta
Estabelecimento na raiz
Relao fungo-planta
Integrao morfolgica, fisiolgica,
bioqumica e funcional
Crescimento e diferenciao
do miclio (arbsculos)
Penetrao da raiz,
colonizao do crtex
Reconhecimento, aderncia
raiz, formao do apressrio
Germinao, crescimento micelial
Fotoassimilados Nutrientes
Produo de
propgulos
Resposta em
crescimento
Relao simbitica
Figura 6. Estabelecimento da relao simbitica.
Fonte: adaptado de Moreira e Siqueira (2002).
Ainda de acordo com Moreira e Siqueira (2002), que revisaram em
sua obra os estudos conduzidos nessa linha, o estabelecimento da
relao segue a partir da ativao e crescimento assimbitico no s
dos esporos, mas dos segmentos de razes infectados e das hifas do
solo, que constituem as demais formas de propgulo dos FMAs. A
etapa seguinte o crescimento micelial na rizosfera, com a propaga-
304
o das hifas infectivas e o contato destas com as razes. Nesse ponto,
forma-se o apressrio, uma diferenciao da hifa infectiva, que a
primeira e mais importante resposta fenotpica do reconhecimento
entre os hospedeiros. Plantas no-hospedeiras dos FMAs no formam
apressrios funcionais.
Em seguida, ocorrem a colonizao do crtex e a penetrao intra-
celular e o estabelecimento da micorriza, com a formao das ves-
culas e arbsculos, iniciando o mutualismo. Como comentado ante-
riormente, arbsculos so estruturas de troca e transferncia de
nutrientes e carbono (C), a partir dos quais os fungos acessam o supri-
mento de fotoassimilados das plantas. Surgem da diferenciao das
hifas e so efmeros, durando de 4 a 5 dias. J as vesculas ocorrem
apenas em membros da famlia Glomaceae e so estruturas globosas,
tambm resultantes da diferenciao de hifas, que possuem funo
de reserva, sendo ricas em lipdeos (MOREIRA; SIQUEIRA, 2002).
A penetrao decorre da presso mecnica e da degradao enzim-
tica parcial da parede do hospedeiro pela ao de pectinases, celula-
ses e hemicelulases do fungo. A quantidade de enzimas, entretanto,
muito menor que a produzida por fungos fitopatognicos. A menor
quantidade de enzimas produzidas localizadamente garante a inte-
gridade do tecido hospedeiro e evita a ativao do sistema de defesa
vegetal (MOREIRA; SIQUEIRA, 2002).
A partir das razes colonizadas, o miclio externo se expande for-
mando uma rede de hifas que ir garantir a absoro de nutrientes
e gua, bem como os eventos de colonizao secundria e formao
de novos esporos.
Para cada estdio, ocorrem estmulos, como a liberao de exudatos
radiculares (flavonoides, isoflavonoides, cidos fenlicos, hormnios
vegetais), respostas especficas e mecanismos de controle das plantas
(FORTIN et al., 2002; PARNISKE, 2008). Todas essas fases esto sobre
estrito controle gentico dos simbiontes. J em 1990, Toth e colabo-
radores afirmavam que o controle gentico, tanto nos vegetais como
nos fungos, era provavelmente a caracterstica mais importante na
determinao da condio micorrzica, sendo os fatores ambientais
de importncia secundria.
Atualmente sabe-se que ocorrem sucessivos ciclos de germinao
de esporos e retrao de ncleo e citoplasma, os quais podem ocorrer
305
nos FMAs, e tambm que o desenvolvimento das hifas se modifica
na presena de sinais derivados das plantas. Os efeitos estimulat-
rios dos exudatos radiculares so estudados h tempos, mas a iden-
tificao molecular dos chamados fatores de ramificao recente.
Entre esses, os hormnios vegetais estrigogalactonas. Os fungos tam-
bm possuem molculas sinalizadoras que induzem respostas espe-
cficas na raiz hospedeira, chamados genericamente de fatores Myc
(PARNISKE, 2008).
Principal efeito nutricional da simbiose
nas plantas absoro de fsforo
A colonizao pelos fungos micorrzicos arbusculares (MA) pro-
move a tolerncia a estresses biticos ou abiticos, aumentando o cres-
cimento e produtividade das plantas. Enquanto as plantas fornecem
ao fungo carboidratos, os fungos exploram gua e minerais do solo
mais eficientemente, e os fornece efetivamente s plantas, particu-
larmente sob condies de limitao de nutrientes (SMITH; SMITH,
1990; KOTHARI et al., 1990).
Os benefcios da associao simbitica das plantas com os fungos
micorrzicos na nutrio fosfatada, principalmente aumentando a efi-
cincia de aquisio do P, so extensivamente descritos na literatura.
Outros nutrientes ou formas menos mveis no solo tambm tm
sua aquisio potencializada pela associao micorrzica, como zinco
(Zn), cobre (Cu) (LIU et al., 2000) e nitrognio amoniacal (N-NH
4
+
)
(AMES et al., 1983; JOHANSEN et al., 1994; PEREIRA et al, 1996). A
rede de hifas fngicas, pela sua dimenso, chegando at a 100 m de
hifas/cm
3
(MILLER et al., 1995), est em posio ideal para absorver
eficientemente gua e nutrientes do solo. Os fungos possuem tam-
bm transportadores especficos envolvidos nesse processo, entre os
quais, os de P, NH
4
+ e Zn j foram identificados e at mesmo clona-
dos (PARNISKE, 2008).
De acordo com Smith e Read (1997), as possveis explicaes para
os benefcios na nutrio fosfatada so as seguintes: (a) as hifas dos
fungos micorrzicos so capazes de absorver o P da soluo do solo e
transloc-lo para as razes, em processo muito mais rpido que a difu-
so desse elemento pelo solo, sendo capazes de transpor as zonas de
306
depleo de P que se formam em volta das razes. A produo de hifas
envolve um menor consumo de carbono (C) por unidade de compri-
mento ou rea de absoro, e seu menor dimetro permite que elas
penetrem em poros do solo de dimetro menor que as razes, aumen-
tando assim o volume de solo explorado; (b) as hifas so mais efeti-
vas, em consequncia de seu tamanho e distribuio espacial, em
competir com os microrganismos de vida livre do solo pelo P recen-
temente mineralizado ou solubilizado; (c) a cintica de absoro de
P nas hifas difere da apresentada pelas razes, com valores mais bai-
xos de Km, possibilitando, portanto, absoro mais efetiva do P em
concentraes nas quais a aquisio pelas razes j tenha cessado; (d)
razes micorrizadas podem usar fontes de P que no estejam dispo-
nveis para as razes.
Em funo dessas caractersticas, a simbiose micorrzica constitui
um mecanismo adaptativo que permite maximizar a aquisio do P
de uma forma que dispende menos energia que a prpria produo
de razes (CHAPIN III, 1980).
A colonizao das razes pelos fungos micorrzicos aumenta quando
as concentraes de P do solo e das razes so baixas e a fertilizao
fosfatada afeta adversamente o desenvolvimento de arbsculos, ves-
culas, hifas externas e esporos (SYLVIA; NEAL, 1990), reduzindo os
benefcios e a dependncia micorrzica de uma planta, que certamente
esto relacionados com a fertilidade do solo (PLENCHETTE et al.,
1983). Atributos da planta, como comprimento e massa de razes e
relao raiz/parte area, tambm controlam a dependncia micor-
rzica, apresentando com essa ltima uma relao inversa (KOIDE
et al., 1988). Outros fatores ambientais podem influenciar a coloni-
zao como pesticidas, umidade do solo, pH e at mesmo a intensi-
dade de luz (AZCN; OCAMPO, 1981).
Avanos em pesquisas em fungos
micorrzicos na Embrapa Cerrados
A pesquisa em fungos micorrzicos na Embrapa Cerrados cen-
trou-se, principalmente, em micorrizas arbusculares, tendo-se ini-
ciado em 1977 com trabalhos sobre alternativas ao manejo da fer-
307
tilidade do solo e maior eficincia na utilizao dos fertilizantes
fosfatados. Esses estudos, conduzidos com diferentes espcies vege-
tais, demonstraram que as respostas das culturas a adubos fosfatados
podem ser maximizadas pela presena de fungos micorrzicos no solo,
dependendo das doses (MIRANDA, 1982; MIRANDA et al., 1984) e
fontes utilizadas (REIN; MIRANDA, 1995; MIRANDA; MIRANDA,
2003). Nessa linha, foram conduzidos estudos com fontes de fsforo
(P) de granulometria e solubilidade variadas. Em todas as reas de
pesquisa com FMAs na Embrapa Cerrados, os projetos pautaram em
duas linhas principais: o manejo dos fungos micorrzicos arbuscula-
res nativos nos sistemas de produo e o processo de sua inoculao.
O efeito dos fungos micorrzicos arbusculares (FMAs) no uso de
outros fertilizantes tambm foi estudado, verificando-se que a pre-
sena de micorriza potencializa, igualmente, a resposta aos adubos
potssicos solveis ou de rochas. Para as rochas potssicas modas, o
efeito seria consequncia da dissoluo das mesmas, acelerada pela
remoo de nutrientes e adio de cidos pela micorriza arbuscular
(ANDRADE et al., 2005).
Confirmou-se tambm que os fungos micorrzicos alteram a efi-
cincia de corretivos. Miranda e Miranda (1997) mostraram que a
presena dos (FMAs) maximiza a resposta das culturas ao calcrio,
e tambm que a condio micorrzica natural do solo pode interferir
diretamente na resposta das culturas calagem e alterar interpreta-
es e recomendaes quanto ao manejo do calcrio para a correo
da acidez do solo.
Estudando o efeito da calagem sobre a comunidade micorrzica do
solo, Miranda e Miranda (2003) tambm mostraram a variao quan-
titativa (nmero de esporos) em funo das doses de calcrio aplica-
das, com aumento gradativo da esporulao da comunidade micor-
rzica at a dose de 4 t/ha e decrscimo da populao a partir dessa
dose. Em outro importante estudo, Miranda et al. (2005) verificaram o
comportamento diferencial das espcies de FMAs Acaulospora scrobi-
culata, Glomus etunicatum e Glomus manihotis em funo da elevao
na saturao de bases proporcionada por diferentes nveis de calagem.
O efeito das micorrizas arbusculares no processo de fixao biol-
gica de nitrognio tambm foi estudado, verificando-se benefcios sob
308
condies de extrema deficincia de P (FARIA, 1998). Outros resulta-
dos interessantes nessa linha versam sobre a influncia da condio
micorrzica da planta na competio entre estirpes eficientes de riz-
bio pela ocupao dos ndulos nas razes (OLIVEIRA, 1998).
Os efeitos no crescimento de diferentes culturas e espcies forra-
geiras (sorgo, soja, mandioca, estilosantes, andropogon, entre outras)
e no aumento da produo de gros de cereais como milho, feijo e
soja pela inoculao das reas ou pelo aumento da comunidade nativa
dos FMAs por prticas de manejo especficas tambm foram descritos
em estudos conduzidos entre as dcadas de 1980 e 2000 (MIRANDA,
1982; 1992; MIRANDA; MIRANDA, 1997, 2000, 2002, 2004, 2007;
MIRANDA et al., 2001).
Outra importante linha de trabalho conduzida na Embrapa
Cerrados trata do efeito dos FMAs na produo de mudas. A maioria
das espcies arbreas tropicais, frutferas e florestais, nativas e ex-
ticas regio do Cerrado passa pela fase de formao de mudas em
canteiros ou viveiros antes de serem transplantadas para o campo. O
benefcio da associao micorrzica e da inoculao, bem como a com-
binao FMAs e planta hospedeira mais adequada, foram determina-
dos para diferentes espcies, tais como pequi, mangaba, buriti, gue-
roba, manga, graviola, maracuj, acerola, entre outras (MIRANDA;
MIRANDA, 2000; 2001).
Alguns estudos com FMAs foram conduzidos tambm nos temas
de recuperao reas degradadas e controle biolgico. A contribuio
determinante de fungos nativos no estabelecimento de uma gramnea
tambm nativa (Aristida setifolia) em reas degradadas no Cerrado foi
descrita, com efeitos altamente significativos no crescimento dessa
planta (MARTINS et al., 1999).
O efeito dos fungos como agentes de controle biolgico foi
demonstrado especificamente com o nematoide Meloidogyne java-
nica (DIEDERICHS, 1987), que parasita diversas plantas cultivadas
em solos de Cerrado, como soja, feijo, milho, mandioca e arroz,
entre outras. A ao dos FMAs como agentes de biocontrole, ame-
nizando os danos causados por fitopatgeno, pode ser pela melho-
ria do estado nutricional das plantas e (ou) pela maior resistncia do
sistema radicular.
309
Estudos valiosos para o manejo das populaes de FMAs foram rea-
lizados com identificao da dependncia micorrzica e capacidade
de multiplicao desses fungos por parte de vrias culturas anuais ou
perenes, entre gramneas e leguminosas em solos com baixa disponi-
bilidade de P (MIRANDA; MIRANDA, 2004). Estratgias de utilizao
de culturas multiplicadores desses fungos e dependentes da simbiose
so muito importantes em situaes onde se necessita aumentar as
populaes dos mesmos.
Nesse perodo, foram encontradas nos solos de Cerrado e descritas
duas novas espcies de fungos micorrzicos arbusculares: Scutellospora
cerradensis (SPAIN; MIRANDA, 1996a) e Paraglomus brasilianum
(SPAIN; MIRANDA, 1996b). Essas espcies esto depositadas e regis-
tradas na Coleo Internacional de Culturas de Fungos Micorrzicos
Arbusculares e Vesculo-Arbusculares, no Banco europeu de Glomales
e no Banco Ativo de Glomales da Embrapa Agrobiologia.
Outras importantes pesquisas realizadas e avanos alcanados nas
trs primeiras dcadas de micorrizologia da Embrapa Cerrados encon-
tram-se bem descritos e documentados em Miranda (2008).
As atividades de pesquisa atuais tm se concentrado em estudos de
ocorrncia de fungos micorrzicos arbusculares e avaliao do poten-
cial de inculo desses importantes microrganismos em sistemas de
produo agroecolgicos e de baixo uso de insumos externos e em
ecossistemas naturais em reas de agricultores familiares do estado de
Gois e no norte de Minas, em rea de transio dos biomas Cerrado
e Caatinga. Essas avaliaes esto sendo conduzidas em projetos em
andamento, considerando a grande contribuio dos FMAs na aqui-
sio de nutrientes em baixas concentraes ou em formas menos
disponveis para as plantas.
Paralelamente tem-se avaliado a ocorrncia de fungos micorrzi-
cos arbusculares e o potencial de inculo de reas de solos ultramfi-
cos com diferentes disponibilidades de nquel (Ni), colaborando em
projetos que objetivam estudar as relaes entre metais do solo e a
biodiversidade no Cerrado visando conservao ambiental e a recu-
perao de reas degradadas. Com esse estudo, pretende-se estimar
as diferenas quantitativas na populao de FMAs em reas distintas
quanto disponibilidade de Ni e sob o efeito de plantas hiperacumu-
310
ladoras ou no do metal, que ocorrem na regio. Os padres de colo-
nizao micorrzica dessas plantas tambm esto sendo avaliados.
Os estudos sobre o potencial desses fungos como agentes de con-
trole biolgico de nematoides ter continuidade, enfocando agora os
do gnero Pratylenchus. A determinao da glomalina em estudos de
parmetros bioindicadores de qualidade de solo ser iniciada em 2010
e pretende-se tambm incluir as tcnicas moleculares de forma com-
plementar s identificaes morfolgicas dos FMAs, enriquecendo
enormemente os estudos de ecologia desses organismos nos diferen-
tes agroecossistemas do Bioma Cerrado.
Consideraes finais
As pesquisas sobre fungos micorrzicos arbusculares e sua sim-
biose com as plantas terrestres tiveram incio h mais de um sculo
e se desenvolveram dentro das mais variadas vertentes das cincias
biolgicas e agrrias. As temticas no se esgotam e os fundamentos
e benefcios dessa associao seguem instigando os cientistas, apesar
das limitaes metodolgicas decorrentes do carter biotrfico obri-
gatrio da simbiose.
As biotecnologias, incluindo os mtodos enzimticos e molecula-
res, representam ferramentas importantes para o progresso das pes-
quisas em micorrizas, permitindo elucidar desde aspectos evolucio-
nrios e ecolgicos da simbiose, at a participao desses importantes
fungos na eficincia e sustentabilidade ambiental de sistemas de pro-
duo agroalimentares.
A identificao de genes e sinais envolvidos na infeco e estabele-
cimento da colonizao, a diversidade da populao dos FMAs asso-
ciados s diferentes espcies vegetais e os padres de colonizao
das plantas representam um universo enorme para as pesquisas em
ecologia, e estudos nessa linha vem sendo conduzidos em todo o
mundo. A funo dessa simbiose no aproveitamento dos fertilizantes
e nutrientes, bem como nos aspectos de conservao de solo e armaze-
namento de carbono pela glomalina, apresentam-se como estratgias
de manejo de agroecossistemas condizentes com as demandas atuais
da agricultura em aliar a produtividade com a conservao ambiental.
Nesse sentido, a potencializao dessa associao pelo uso de espcies
311
vegetais que a promovam e a combinao dessas com novas fontes de
nutrientes de inestimvel valor. Esses desafios e as aplicaes dessa
simbiose mantm as pesquisas em micorrizas bastante atuais e moti-
vadoras, pelo potencial de agregao das diferentes reas de conhe-
cimento e pelos importantes avanos que ainda se pode conseguir.
Referncias
ANDRADE, L. R. M.; MIRANDA, J. C. C.; FALEIRO, A. S. G.; NASCIMENTO,
M. T.; SOBRINHO, D. A.; SILVA, H. C. Efeitos de rochas potssicas e fungos
micorrzicos arbusculares no crescimento de plantas de soja. In: CONGRESSO
BRASILEIRO DE FISIOLOGIA VEGETAL, 10. ; CONGRESSO LATINO
AMERICANO DE FISIOLOGIA VEGETAL, 12., 2005, Recife. Anais... Recife:
SBFV, 2005. 1 CD-ROM.
AMES, R. N.; REID, C. P. P.; PORTER, L. K.; CAMBARDELLA, C. Hyphal uptake
and transport of nitrogen from two
15
N-labelled sources by Glomus mosseae,
a vesicular-arbuscular mycorrhizal fungus. New Phytologist, London, v. 95,
p. 381-396, 1983.
APPOLONI, S.; LEKBERK, Y; TERCEK, M. T.; ZABINSKI, C. A.; REDECKER,
D. Molecular community analysis of arbuscular mycorrhizal fungi in roots of
geothermal soils in Yellowstone National Park (USA). Microbial Ecology, New
York, v. 56, p. 649659, 2008.
AZCN, R.; OCAMPO, J. A. Factors affecting the vesicular : arbuscular infection
and mycorrhizal dependency of thirteen wheat cultivars. New Phytologist, London,
v. 87, p. 677-685, 1981.
BAGO, B.; PFEFFER, P. E.; SHACHAR-HILL, Y. Carbon metabolism and transport
in arbuscular mycorrhizas. Plant Physiology, Bethesda, v. 124, p. 949-958, 2000.
BEVER, J. D.; MORTON, J. B.; ANTONOVICS, J.; SCHULTZ, P. A.
Host-dependent sporulation and species diversity of arbuscular mycorrhizal fungi
in a mown grassland. Journal of Ecology, Oxford, v. 84, p. 71-82, 1996.
BRUNS, T. D.; GARDES, M. Molecular tools for indentification of ectomycorryzal
fungi-Taxon-specific oligonucleotide probes for suilloid fungi. Molecular Ecology,
Oxford, v. 2, p 1-10, 1993.
CHAPIN III, F. S. The mineral nutrition of wild plants. Annual Review of Ecology
and Systematics, Palo Alto, v. 11, p. 233-260, 1980.
CLAPP, B. J. P.; YOUNG, J. P. W.; MERRYWEATHER, J. W.; EITTER, A.
H. Diversity of fungal symbionts in arbuscular mycorrhizas from a natural
community. New Phytologist, Oxford, v. 130. p. 259-265, 1995.
312
COOLEN, W. R. Methods for the extraction of Meloydogine spp. and other
nematodes from roots and soil. In: LAMBERTI, F.; TAYOR, C. E. (Ed.). Root-knot
nematodes (meloidogyne species): systematics, ecology and control. London:
Academic Press, 1979. p. 317-329.
CORNEJO, P.; AZCN-AGUILAR, C.; BAREA, J. M.; FERROL, N. Temporal
temperature gradient gel electrophoresis (TTGE) as a tool for the characterization
of arbuscular mycorrhizal fungi. FEMS Microbiology Letters, Haren, v. 241,
p. 265270, 2004.
DICKIE, I. A.; FITZJOHN, R. G. Using terminal restriction fragment length
olymorphism (T-RFLP) to identify mycorrhizal fungi: a methods review.
Mycorrhiza, Berlin, v. 17, p. 259270, 2007.
DIEDERICHS, C. Interaction between five endomycorrhizal fungi and the
root-knot nematode Meloidogyne javanica on chickpea under tropical conditions.
Tropical Agriculture, Trinidad, v. 64, p. 353-355, 1987.
FARIA, F. C. Efeitos de associaes micorrzicas na eficincia e competitividade de
estirpes de rizbio no feijoeiro. 1998. 105 f. Dissertao (Mestrado). Universidade
de Braslia, Braslia, DF.
FORTIN, J. A.; BCARD, G.; DECLERCK, S.; DALP, Y.; ST-ARNAUD, M.;
COUGHLAN, A. P.; PICH, Y. Arbuscular mycorrhiza on root-organ cultures.
Canadian Journal of Botany, Ottawa, v. 80, p. 1-20, 2002.
FREY, B.; VILARINA, A.; SCHEPP, H.; ARINES, J. Chitin and ergosterol content
of extraradical and intraradical mycelium of the vesicular-arbuscular mycorrhizal
fungus glomus intraradices. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 26, p. 711-717,
1994.
GERDEMANN, J. W.; NICOLSON, T. H. Spores of mycorrhizal endogone species
extracted from soil by wet sieving and decanting. Transactions of the British
Mycological Society, London, v. 46, p. 235-244, 1963.
GIOVANNETTI, M.; MOSSE, B. An evaluation of techniques to measuring vesicular
arbuscular infection in roots. New Phytologist, Oxford, v. 84, p. 489-500, 1980.
GIOVANNETTI, M.; SBRANA, C.; AVIO, L.; STRANI, P. Patterns of belowground
plant interconnections established by means of arbuscular mycorrhizal networks.
New Phytologist, London, v. 164, p. 175-181, 2004.
GOI, S. R.; SOUZA, F. A.; Diversidade de microrganismos do solo. Floresta e
Ambiente, Rio de Janeiro, v. 13, n. 2, p. 46-65, 2006
HAYMAN, D. S. Influence of soils and fertility on activity and survival of vesicular-
arbuscular mycorrhizal fungi. Phytopatology, St. Paul, v. 72, p. 1119-1125, 1982.
HECKMAN, D. S.; GEISER, D. M.; EIDELL, B. R.; STAUFFER, R. L.; KARDOS,
N. L. HEDGES, S. B. Molecular evidence for the earlycolonization of land by fungi
and plants. Science, Washington, v. 293, p. 1129-1133, 2001.
313
VAN DER HEIDJEN, M. G. A.; BOLLER, T.; WIEMKEN, A.; SANDERS, I. R.
Different arbuscular mycorrhizal fungal species are potential determinants of
plant community structure. Ecology, Tempe, v. 79, p. 2082-2091, 1998.
HUSBAND, R.; HERRE, E. A.; TURNER, S. L.; GALLERY, R.; YOUNG, J. P.
W. Molecular diversity of arbuscular mycorrhizal fungi and patterns of host
association over time and space in a tropical forest. Molecular Ecology, New York,
v. 11, p. 2669-2678, 2002.
INVAM. International culture collection of arbuscular and vesicular-arbuscular
mycorrhizal fungi. Disponvel em: <http://invam.caf.wvu.edu/fungi/taxonomy/
classification.htm>. Acesso em 10 jul 2008.
JAKOBSEN, I.; ABBOTT, L. K.; ROBSON, A. D. External hyphae of
vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi associated with Trifolium subterraneum
L. : 1. spread of hyphae and phosphorus inflow into roots. New Phytologist, Oxford,
v. 120, p. 317-380, 1992.
JANOS, D. P.; GARAMSZEGI, S.; BELTRAN, B. Glomalin extraction and
measurement. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 40, p. 728-739, 2008.
JOHANSEN, A.; JAKOBSEN, I.; JENSEN, E. S. Hyphal N transport by a
vesicular-arbuscular mycorrhizal fungus associated with cucumber grown at three
nitrogen levels. Plant and Soil, Dordrecht, v. 160, p. 1-9, 1994.
JOHNSON, D.; VANDENKOORNHUYSE, P. J.; LEAKE, J. R.; GILBERT, L.;
BOOTH, R. E.; GRIME, J. P.; YOUNG, P. W.; READ, D. J. Plant communities
affect arbuscular mycorrhizal fungal diversity and community composition in
grassland microcosms. New Phytologist, Oxford, v. 161, p. 503515. 2003.
KOIDE, R. T; LI, M.; LEWIS, J.; IRBY, C. Role of mycorrhizal infection in the
growth and reproduction of wild vs. cultivated plants. I. Wild vs. cultivated oats.
Oecologia, Berlin, v. 77, p. 537-543, 1988.
KOSKE, R. E; GEMMA, J. N. A modified procedure for staining roots to detect VA
mycorrhizas. Mycological Research, Cambridge, v. 92, p. 488-505, 1989.
KOTHARI, S. K.; MARSCHNER, H.; RMHELD, V. Direct and indirect effects of
VAM fungi and rizosphere microorganisms on acquisition of mineral nutrients
by maize (Zea mays L.) in a calcareous soil. New Phytologist, London, v. 116,
p. 637-645,1990.
KRIVTSOV, V.; GRIFFITHS, B. S.; SALMOND, R.; LIDDELL, K.; GARSIDE,
A.; BEZGINOVA, T.; THOMPSON, J. A.; STAINES, H. J.; WATLING, R.;
PALFREYMAN, J. W. Some aspects of interrelations between fungi and other biota
in forest soil. Mycological Research, Cambridge, v. 108, p. 933-946, 2004.
LIU,A.; HAMEL, C.; HAMILTON, R. I.; MA, B. L.; SMITH, D. L. Acquistion of Cu,
Zn, Mn and Fe by mycorrhizal maize (Zea mays L.) grown in soil at different P and
micronutrient levels. Mycorrhiza, Berlin, v. 9, p. 331-336, 2000.
LONGATO, S.; BONFANTE, P. Molecular identification of mycorrhizal fungi by
direct amplification of microsatellite regions. Mycological Research, Cambridge,
v. 101, p.425432, 1997.
314
LOVELOCK, C. E.; WRIGHT, S. F.; NICHOLS, K. A. Using glomalin as an
indicator for arbuscular mycorrhizal hyphal growth: an example from a tropical
rain forest soil. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 36, p. 1009-1012, 2004.
MA, W. K.; SICILIANO, S. D.; GERMIDA, J. J. A PCR-DGGE method for detecting
arbuscular mycorrhizal fungi in cultivated soils. Soil Biology and Biochemistry,
Oxford, v. 37, p. 15891597, 2005.
MARTINS, C. R.; MIRANDA, J. C. C.; MIRANDA, L. N. Contribuio de fungos
micorrzicos arbusculares nativos no estabelecimento de Aristida setifolia kunth
em reas degradadas no cerrado. Pesquisa Agropecuria Brasileira, Braslia, v. 34,
p. 665-674, 1999.
MILLER, R. M.; REINHARDT, D. R.; JASTROW, J. D. External hyphal production
of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi in pasture and tallgrass prairie
communities. Oecologia, Berlin, v. 103, p. 17-23, 1995.
MIRANDA, J. C. C. Influncia de fungos endomicorrzicos inoculados a campo, na
cultura de sorgo e soja em um solo sob Cerrado. Revista Brasileira de Cincia do
Solo, Campinas, v. 6, p. 19-23, 1982.
MIRANDA, J. C. C. A endomicorriza na regio dos Cerrados: uma reviso.
Planaltina, DF: CPAC, 1992. 35 p. (Embrapa CPAC. Documentos, 42).
MIRANDA, J. C. C. Cerrado: micorriza arbuscular: ocorrncia e manejo.
Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2008. 169 p.
MIRANDA, J. C. C.; MIRANDA, L.N. Micorriza Arbuscular. In: VARGAS,
M.A.A; HUNGRIA, M. (Ed.). Biologia dos solos dos Cerrados. Planaltina, DF:
Embrapa-CPAC, 1997. p. 69-123.
MIRANDA, J. C. C.; MIRANDA, L. N. Introduo da tecnologia de inoculao com
fungos micorrzicos arbusculares na produo de mudas em viveiros. Planaltina,
DF: Embrapa Cerrados, 2000. 4 p. (Embrapa Cerrados. Comunicado Tcnico, 24).
MIRANDA, J. C. C.; MIRANDA, L. N. Seleo e recomendao de uso de espcies
de fungos micorrzicos arbusculares. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2001. 3
p. (Embrapa Cerrados. Comunicado Tcnico, 52).
MIRANDA, J. C. C.; MIRANDA, L. N. A importncia da micorriza arbuscular para
o cultivo da soja na regio dos Cerrados. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2002. 4
MIRANDA, J. C. C.; MIRANDA, L. N. Contribuio da micorriza arbuscular
na resposta das culturas calagem e adubao fosfatada em solos de cerrado.
Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2003. 4 p. (Embrapa Cerrados. Comunicado
Tcnico, 89).
MIRANDA, J. C. C.; MIRANDA, L. N. Dependncia micorrzica de diferentes
culturas anuais, adubos verdes e pastagens e solos de Cerrado. Planaltina, DF:
Embrapa Cerrados, 2004. 4 p. (Embrapa Cerrados. Comunicado Tcnico, 114).
315
MIRANDA, J. C. C.; MIRANDA, L. N. Contribuio da micorriza arbuscular
para a produtividade e sustentabilidade nos sistemas de produo com plantio
direto no Cerrado. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2007. (Embrapa Cerrados.
MIRANDA, J. C. C.; FIALHO, J. F.; MIRANDA, L. N. Importncia da micorriza
arbuscular para o cultivo da mandioca na regio do Cerrado. Planaltina, DF:
Embrapa Cerrados, 2005. 4 p. (Embrapa Cerrados. Comunicado Tcnico, 119).
MIRANDA, J. C. C.; MIRANDA, L. N. VILELA, L., VARGAS, M. A.; CARVALHO,
A. M. Manejo da micorriza arbuscular por meio da rotao de culturas nos
sistemas agrcolas do Cerrado. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2001. 3
MIRANDA, J. C. C.; SOUSA, D. M. G.; MIRANDA, L. N. Influncia de fungos
endomicorrzicos vesicular-arbusculares na absoro de fsforo e no rendimento
de matria seca de plantas de sorgo. Revista Brasileira de Cincia do Solo,
Campinas, v. 8, p. 31-36, 1984.
MIRANDA, J. C. C.; LOBATO, E.; MIRANDA, L. N. Dinmica e contribuio
da micorriza arbuscular na resposta de uma gramnea forrageira adubao
fosfatada. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE CINCIA DO SOLO, 29., 2003,
Ribeiro Preto. Resumos expandidos. Ribeiro Preto: Sociedade Brasileira de
Cincia do Solo: Universidade Estadual de So Paulo, 2003. 1 CD-ROM.
MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J. O. Microbiologia e bioqumica do solo. Lavras:
Editora UFLA, 2002. 626 p.
MORTON, J. B. Underestimation of most probable numbers of
vesicular-arbuscular endophytes because non-staining mycorrhizae. Soil Biology
and Biochemistry, Oxford, v. 17, p. 383-384, 1985.
MORTON, J. B.; BENNY, G. L. Revised classification of arbuscular mycorrhizal
fungi (Zygomycetes): a new order, Glomales, two new suborders, Glomineae and
Gigasporineae, and two new families, Acaulosporaceae and Gigasporaceae, with an
emendation of Glomaceae. Mycotaxon, Ithaca, v. 37, p. 471-491, 1990.
MORTON, J. B.; REDECKER, D. Two new families of glomales, archaeosporaceae
and paraglomaceae, with two new genera Archaeospora and Paraglomus, based on
concordant molecular and morphological characters. Mycologia, New York, v. 93,
p. 181-195, 2001.
MUMMEY, D. L., RILLIG, M. C., HOLBEN, W. E. Neighboring plant influences
on arbuscular mycorrhizal fungal community composition as assessed by T-RFLP
analysis. Plant and Soil, The Hague, v. 271, p. 8390, 2005.
NOVAIS, C. B. de. Colonizao, esporulao e caracterizao fenotpica e
molecular de fungos micorrzicos arbusculares mantidos em cultura. 2008. 73 f.
Dissertao (Mestrado). Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.
316
NYLUND, J. E.; WALLANDER, H. Ergosterol analysis as a means of quantifying
mycorrhizal biomass. In: NORRIS, J. R.; READ, D. J.; VARMA, A. K. Methods in
microbiology: techniques for mycorrhizal research. London: Academic Press, 1994.
p. 537-548.
OLIVEIRA, R. S. Alteraes na dinmica da competio entre estirpes de rizbio
pelos stios de nodulao nas razes de soja e suas consequncias no crescimento
da planta causadas por fungo micorrzico arbuscular. 1998. 75 f. Dissertao
(Mestrado). Universidade de Braslia, Braslia, DF.
OLIVEIRA, C. A.; SA, N. M. H; GOMES, E. A.; MARRIEL, I. E.; SCOTTI, M.
R.; GUIMARES, C. T.; SCHAFFERT, R. E.; ALVES, V. M. C. Assessment
of the mycorrhizal community in the rhizosphere of maize (Zea mays L.)
genotypes contrasting for phosphorus efficiency in the acid savannas of Brazil
using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Applied Soil Ecology,
Amsterdam, v. 41, p. 249 258, 2009.
OLSSON, P. A.; LARSSON, L.; BAGO, B.; WALLANDER, H.; VAN AARLE, I.
M. Ergosterol and fatty acid for biomass estimates of mycorrhizal fungi. New
Phytologist, Oxford, v. 159, p. 7-10, 2003.
PACIONI , G. Wet sieving and decanting techniques for the extraction of spores
of vesicular arbuscular fungi. In: NORRIS, J. R.; READ, D. J.; VARMA, A. K.
Methods in microbiology: techniques for mycorrhizal research. London: Academic
Press, 1994. p. 777-782.
PARNISKE, M. Arbuscular mycorrhiza: the mother of plant root endosymbioses.
Nature Rewiews, London, v. 6, p. 763-775, 2008.
PAULA, M. A.; SIQUEIRA, J. O.; OLIVEIRA, L. H.; OLIVEIRA, E. Efetividade
simbitica relativa em soja de populaes de fungos endomicorrzicos nativos e
de isolados de glomus macrocarpum e gigaspora margarita. Revista Brasileira de
Cincia do Solo, Campinas, v. 12, p. 25-31, 1988.
PEREIRA, E. G.; SIQUEIRA, J. O.; CURI, N.; MOREIRA, M. F. S.; PURCINO,
A. A. C. Efeitos da micorriza e do suprimento de fsforo na atividade enzimtica
e na resposta de espcies arbreas ao nitrognio. Revista Brasileira de Fisiologia
Vegetal, Braslia, v. 8, n. 1, p. 59-65, 1996.
PLENCHETTE, C.; FORTIN, J. A.; FURLAN, V. Growth responses of several plant
species to mycorrhizal in a soil of moderate P - fertility. I. Mycorrhizal dependency
under field conditions. Plant and Soil, Dordrecht, v. 70, p. 199-209, 1983a.
PHILLIPS, J. M.; HAYMAN, D. S. Improved procedures for clearing roots and
staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment
of infection. Transactions of the British Mycological Society, London, v. 55,
p. 158-161, 1970.
PORTER, W. M. The most probable number method for enumerating infective
propagules of vesicular arbuscular mycorrhizal fungi in soil. Ustralian Journal of
Soil Research, Victoria, v. 17, p. 515-519, 1979.
317
RABERG, G. U.; HGBERG, N. O. S.; LAND, C. J. Detection and species
discrimination using rDNA T-RFLP for identification of wood decay fungi.
Holzforschung, Berlin, v. 59, n. 6, p.696702, 2005.
REIN, T. A.; MIRANDA, J. C. C. Variao na resposta micorriza arbuscular em
funo da granulometria do fertilizante fosfatado. In: CONGRESSO BRASILEIRO
DE CINCIA DO SOLO, 25., 1995. Viosa. Resumos expandidos. Viosa:
Sociedade Brasileira de Cincia do Solo, 1995. v. 1, p. 415-417.
RENKER, C.; BLANKE, V.; BUSCOT, F. Diversity of arbuscular mycorrhizal
fungi in grassland spontaneously developed on area polluted by a fertilizer plant.
Environmental Pollution, Amsterdam, v. 135, p. 255266, 2005.
RENKER, C.; HEINRIDHS, J.; KALDORF, M.; BUSCOT, F. Combining nested
PCR and restriction digest of the internal transcribed spacer region to characterize
arbuscular mycorrhizal fungi on roots from the field. Mycorrhiza, Berlin, v. 13,
p. 191-198, 2003.
RILLIG, M. C.; FIELD, C. B.; ALLEN, M. F. Soil biota responses to long-term
atmospheric CO2 enrichment in two California annual grassland. Oecologia,
Berlin, v. 119, p. 572-577, 1999.
RILLIG, M. C.; WRIGHT, S. F., NICHOLS, K. A., SCHMIDT, W. F.; TORN, M. S.
Large contribution or arbuscular mycorrhizal fungi to soil carbon pools in tropical
forest soils. Plant and Soil, The Hague, v. 233, p. 167-177, 2001.
RILLIG, M. C.; RAMSEY, P. W.; MORRIS, S.; PAUL, E. A. Glomalin, an
arbuscular-mycorrhizal fungal soil protein, responds to land-use change. Plant and
Soil, The Hague, v. 253, p. 293-299, 2003.
RODRIGUEZ-ECHEVERRIA; FREITAS, H. Diversity of AMF associated to
ammophila arenaria ssp. arundinacea in portuguese sand dunes. Mycorrhiza,
Berlin, v. 16, p. 543-552, 2006.
ROSENDAHL S.; SEN, R. Isozyme analysis of mycorrhizal fungi and their
mycorrhiza. Methods in Microbiology, Amsterdam, v. 24, p. 169-194, 1992.
ROSIER, C. L.; HOYE, A. T.; RILLIG, M. C. Glomalin-related soil protein:
assessment of current detection and quantification tools. Soil Biology and
Biochemistry, Oxford, v. 38, p. 2205-2211, 2006.
SALLES, J. F.; SOUZA, F. A. Revises em micorriza I: tcnicas moleculares
aplicadas ao estudo dos fungos micorrzicos arbusculares. Seropdica: Embrapa
Agrobiologia, nov. 1998. 24 p. (Embrapa-CNPAB. Documentos, 68).
SANDERS, I. R.; FITTER, A. H. Evidence for differential responses between host
fungus combinations of vesicular mycorrhizas from a grassland. Mycological
Research, Lancaster, v. 96, p. 415-419, 1992.
SCHENCK, N. C. Methods and principles of mycorrhizal research. 2
nd
. ed. St. Paul:
The American Phytopathological Society, 1984. 244 p.
SCHLER A.; SCHWARZOTT D.; WALKER, C. A new fungal phylum, the
glomeromycota: phylogeny and evolution. Mycological Research, Cambridge,
v. 105, p. 14131421, 2001.
318
SIEVERDING, E. Vesicular-arbuscular mycorrhiza management in tropical
agrosystems. Eschborn: Deutsche Gesellschaft fr Technische Zusammenarbeit,
1991. 371 p.
SIMON, L.; LALONDE, M.; BRUNS, T. D. Specific amplification of 18S fungal
ribossomal genes from vesicular arbuscular endomycorrhizal fungi colonizing
roots. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 58, n. 1,
p. 291-295, 1992.
SIMON, L.; LVESQUE, R. C.; LALONDE, M. Identification of endomycorrhizal
fungi colonizing roots by fluorescent single-strand conformation
polymorphismpolymerase chain reaction. Applied Environmental Microbiology,
Washington, v. 58, n. 12, p. 4211-4215, 1993.
SMITH, S. E.; READ, D. J. Mycorrhizal Symbiosis. San Diego: Academic Press,
1997. 603 p.
SMITH, S. E.; SMITH, F. A. Structure and function of the interfaces in biotrophic
symbiosis as they relate to nutrient transport. New Phytologist, London, v. 114,
n. 1, p. 1-38, 1990.
SPAIN, J. L.; MIRANDA, J. C. C. Scutellospora cerradensis: an ornamented species
in the Gigsaporaceae (Glomales). Mycotaxon, Ithaca, v. 60, p. 129-136, 1996a.
SPAIN, J. L.; MIRANDA, J. C. C. Glomus brasilianum: an ornamented species in
the Gigsaporaceae. Mycotaxon, Ithaca, v. 60, p. 137-142, 1996b.
SOLAIMAN; M. D. Z; SAITO, M. Use of sugars by intraradical hyphae of
arbuscular mycorrhizal fungi revealed by radiorespirometry. New Phytologist,
London, v. 136, p. 533-538, 1997.
SOUZA, F. A. de; KOWALCHUK, G. A, LEEFLANG, P; VENN, J. A. ; SMIT, E. P. C.
R. Denaturing gradient gel electrophoresis profiling of inter- and intraspecies 18S
rRNA gene sequence heterogeneity is an accurate and sensitive method to assess
species diversity of arbuscular mycorrhizal fungi of the genus gigaspora. Applied
and Environmental Microbiology, Washington, v. 70, n. 3, p: 1413-1424. 2004.
STREITWOLF-ENGEL, R.; BOLER, T.; WIEMKEN, A.; SANDERS, I. R. Clonal
growth traits of two Prunella species are determined by occurring arbuscular
mycorrhizal fungi from a calcareous grassland. Journal of Ecology, Oxford, v. 85,
p. 181-191, 1997.
SYLVIA, D. M. Quantification of external hyphae of vesiculararbuscular
mycorrhizal fungi. In: NORRIS, J. R.; READ, D. J.; VARMA, A. K. Methods in
microbiology: techniques for mycorrhizal research. London: Academic Press, 1994.
p. 513-525.
SYLVIA, D. M.; NEAL, L. H. Nitrogen affects the phosphorus response of VA
mycorrhiza. New Phytologist, London, v. 115, p. 303-310, 1990.
TALUKDAR, N. C.; GERMIDA, J. J. Growth and yield of lentil and wheat
inoculated with 3 Glomus isolates from Saskatchewan soils. Mycorrhiza, Berlin,
v. 5, p. 145-152, 1994.
319
TOMMERUP, I.C. Methods for the study of the population biology of vesicular
arbuscular mycorrhizal fungi. In: NORRIS, J.R.; READ, D.J.; VARMA, A.K.
Methods in microbiology: techniques for mycorrhizal research. London: Academic
Press, 1994. p. 483-511.
TONIN C, VANDENKOORNHUYSE P, JONER EJ, STRACZEK J, LEYVAL C.
Assessment of arbuscular mycorrhizal fungi diversity in the rhizosphere of Viola
calaminaria and effect of these fungi on heavy metal uptake by clover. Mycorrhiza,
Berlin, v. 10, p.161168, 2001.
TORO, T.; SIEVERDING, E. Evaluacin cuantitativa y cualitativa de hongos
formadores de micorriza vesiculo arbuscular en la regin de Mondomo, Colmbia.
Suelos Ecuatoriales, Colombia, v. 16, n. 1, p. 122-129, 1986.
TOTH, R.; TOTH, D.; STARKE, D.; SMITH, D. R. Vesicular - arbuscular
mycorrhizar colonization in Zea mays affected by breeding for resistance to funghal
pathogens. Canadian Journal of Botany, Ottawa, v. 68, n. 5, p. 1039-1044, 1990.
WIDMER, F.; HARTMANN, M.; FREY, B.; KLLIKER, R. A novel strategy to
extract specific phylogenetic sequence information from community T-RFLP.
Journal of Microbiological Methods, Amsterdam, v. 66, p. 512529, 2006.
WRIGHT, S. F., MORTON, J. B., SWOROBUK, J. E. Identification of a
vesicular-arbuscular mycorrhizal fungus by using monoclonal antibodies in an
enzyme-linked immunosorbent assayt. Applied and Environmental Microbiology,
Washington, v. 53, n. 9, p. 2222-2225. 1987.
WRIGHT, S. F.; FRANKEE-SNYDER, M.; MORTON, J. B.; UPADHYAYA,
A. Timecourse study and parcial characterization of a protein on hyphae of
arbuscular mycorrizal fungi during active colonization of roots. Plant and Soil, The
Hague, v. 181, p. 193-203, 1996.
WRIGHT, S. F.; UPADHYAYA, A. Extraction of an abundant and unusual protein
from soil and comparison with hyphal protein of arbuscular mycorrhizal fungi.
Soil Science, Baltimore, v. 161, p. 1-12, 1996.
WRIGHT, S. F.; UPADHYAYA, A. A survey of soils for aggregate stability and
glomalin, a glycoprotein produced by hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi.
Plant and Soil, The Hague, v. 198, p. 97-107, 1998.
WU, B.; HOGETSU, T.; ISOBE, K.; ISHII, R. Community structure of arbuscular
mycorrhizal fungi in a primary successional volcanic desert on the southeast slope
of Mount Fuji. Mycorrhiza, Berlin, v. 17, p. 495506, 2007.
WYSS, P.; BONFANTE, P. Amplification of genomic DNA of arbuscular
mycorrhizal (AM) fungi by PCR using short arbitrary primers. Mycological
Research, Cambridge, v. 97, p. 1351-1357. 1993.
ZHANG, H.; TANG, M.; CHEN, H.; TIAN, Z.; XUE, Y.; FENG, Y. Communities
of arbuscular mycorrhizal fungi and bacteria in the rhizosphere of caragana
korshinkii and hippophae rhamnoides in zhifanggou watershed. Plant and Soil,
The Hague, v. 326, n. 1-2, 2010.
321
Biotecnologia aplicada
engenharia de alimentos
Sonia Maria Costa Celestino
Klecius Renato Silveira Celestino
Introduo
A tecnologia da fermentao est concernida com a conduo de
processos biolgicos em escala industrial, fazendo a ligao entre a
biologia, a microbiologia, a engenharia qumica e a engenharia de ali-
mentos. Os processos na tecnologia de fermentao so catalisados
ou por clulas vivas, ou por seus substratos.
O uso da microbiologia para a obteno de alimentos antecede a Era
Crist; e h milhares de anos, sem saber da existncia dos microrganis-
mos, fabricava-se po, vinho, cerveja, leite fermentado, queijos e outros.
A tecnologia da fermentao iniciou-se com Pasteur, em 1857. Esse
descobriu que certas doenas eram causadas por microrganismos e
que fermentaes alcolicas tambm ocorriam na presena deles.
Em 1921, o primeiro antibitico foi fabricado por Piocianases; em
1928, ocorreu a descoberta da penicilina por Fleming; e, na Segunda
Guerra Mundial, houve grande avano na rea de biotecnologia, como
a fabricao de antibiticos e solventes por meio da conduo de pro-
cessos microbiolgicos.
H cerca de 50 anos, poucos produtos, como bebidas alcolicas e
lcool etlico, eram produzidos em escala industrial, hoje essa produ-
o abrange reas mais amplas como tratamento de resduos, obten-
o de alimentos e raes, protenas, enzimas, vitaminas, hormnios,
antibiticos, solventes orgnicos, cidos, polmeros, soros e vacinas.
Engenharia bioqumica
A engenharia bioqumica o ramo da engenharia que se concentra
na conduo de processos biolgicos em escala industrial, utilizando
conhecimentos de microbiologia, bioqumica, termodinmica, fen-
menos de transporte e operaes unitrias.
322
O objetivo da engenharia bioqumica a aplicao dos conheci-
mentos at aqui adquiridos na soluo de problemas que se apresen-
tam na implantao de processos biotecnolgicos em larga escala, e
em sua otimizao.
O incio da engenharia bioqumica se deu aps a Segunda Guerra
Mundial, quando ocorreu o desenvolvimento em larga escala de pro-
cessos de produo de alimentos e medicamentos de origem biotec-
nolgica.
Microrganismos e meios de cultura
para utilizao industrial
Neste tpico, descrevem-se as caractersticas gerais que microrga-
nismos e meios de cultura devem apresentar, para que seja possvel
utiliz-los em processos de larga escala, ou seja, em biorreatores de
grande volume.
O sucesso de um processo biotecnolgico depende da combinao
de quatro elementos/operaes importantes (Figura 1):
a) Microrganismo.
b) Meio de cultura.
c) Conduo do processo.
d) Recuperao do produto.
Sucesso do Processo
Fermentativo
M
i
c
r
o
r
g
a
n
i
s
m
o
M
e
i
o

d
e

c
u
l
t
u
r
a
C
o
n
d
u
o

d
o

p
r
o
c
e
s
s
o
R
e
c
u
p
e
r
a
o

d
o

p
r
o
d
u
t
o
Figura 1. Os pilares do sucesso da tecnologia da fermentao.
323
Captulo 11 Biotecnologia aplicada engenharia de alimentos
O microrganismo ter preferencialmente de apresentar as seguin-
tes caractersticas:
1) Ser capaz de produzir o produto desejvel e com cintica rpida.
2) Converter altas concentraes de produto.
3) Produzir poucos subprodutos.
4) Ter a possibilidade de ser reutilizvel e de uma forma barata.
5) Poder ser estocado em condies no extremas.
6) Trabalhar em condies de fcil conduo.
7) Suportar situaes de estresse.
8) No ser patognico.
9) No exigir meios de culturas dispendiosos.
As combinaes desses fatores devem ser levadas em considera-
o na escolha do melhor microrganismo para o seu processo bio-
tecnolgico.
Microrganismos que possam ter interesse industrial podem ser
obtidos basicamente das seguintes formas:
1) Isolamento a partir de fontes naturais.
2) Compra em colees de culturas.
3) Obteno de mutantes naturais.
4) Obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais.
5) Obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de
engenharia gentica.
J o meio de cultura tem de ter as seguintes caractersticas:
1) Atender s necessidades nutricionais do microrganismo.
2) Ser o mais barato possvel.
3) No provocar problemas de recuperao do produto.
4) Auxiliar no controle do processo.
5) Os componentes devem permitir algum tempo de armazena-
gem, a fim de estarem disponveis todo o tempo.
6) Ter composio razoavelmente fixa.
7) No causar dificuldades no tratamento do efluente.
Todas essas caractersticas so importantes, enfatizando-se o custo,
que deve ser o menor possvel, de forma a atender as necessidades
nutricionais do microrganismo.
324
Na Figura 2, apresenta-se a sequncia de desenvolvimento de um
processo fermentativo, desde a adaptao do microrganismo, at a
fermentao em larga escala no biorreator industrial.
Microrganismo
selecionado
Preparo do inculo:
etapa de laboratrio
Preparo do inculo:
etapa industrial
(germinadores)
Ar
Compressor Esterilizao
do ar
Biorreator
industrial
Esterilizao
Meio de cultura selecionado
Matrias-primas
Figura 2. Desenvolvimento de um processo fermentativo.
Estequiometria e cintica microbiana e enzimtica
O estudo cintico de um processo fermentativo consiste inicial-
mente na anlise da evoluo dos valores de concentrao de um ou
mais componentes do sistema de cultivo, em funo do tempo de fer-
mentao. Entendem-se como componentes o microrganismo (ou
biomassa), os produtos do metabolismo (ou metablitos) e os nutrien-
tes ou substratos que compem o meio de cultura.
325
Esses valores experimentais de concentrao (X, P e S, respectiva-
mente), quando representados em funo do tempo, permitiro os
traados das curvas de ajuste, conforme ilustrados na Figura 3.
P
(
p
r
o
d
u
t
o
)
S

(
s
u
b
s
t
r
a
t
o
)
X

(
n

d
e

c
l
u
l
a
s
/
m
L
)
0:00 2:00 4:00 6:00 8:00 10:00
Tempo (h)
Figura 3. Curvas de ajuste dos resultados de uma experincia idealizada de
fermentao (X, P e S so as concentraes do microrganismo, do produto
e do substrato residual no meio, respectivamente).
326
Cintica das fermentaes
Microrganismos crescem em um largo espectro de ambientes fsi-
cos e qumicos; seu crescimento e outras atividades fisiolgicas so
de fato uma resposta ao seu ambiente fsico-qumico. A cintica das
fermentaes descreve o crescimento e a formao de produtos por
microrganismos, e no somente o crescimento de clulas ativas, mas
tambm as atividades de clulas em repouso, j que muitos produtos
de fermentao de interesse comercial so produzidos aps o cresci-
mento ter parado.
Crescimento microbiano
O crescimento microbiano usualmente caracterizado pelo tempo
requerido para duplicar massa celular ou nmero de clulas. Tempo
de duplicao de massa difere do de duplicao de clulas, pois a
massa celular pode aumentar sem um acrscimo no nmero de clu-
las. Todavia, se, em dado ambiente, o intervalo entre duplicaes de
massa celular ou do nmero de clulas constante com o tempo, o
microrganismo est crescendo a uma velocidade exponencial.
Nessas condies, o crescimento dado por:
Em que:
X = concentrao celular em g/L.
N = concentrao celular em clulas/L.
t = tempo.
= velocidade especfica do crescimento em h
-1
.
n
= velocidade especfica de crescimento em h
-1
.
Na maioria das circunstncias, crescimento medido pelo aumento
de massa. O valor .X a taxa de crescimento volumtrico (produti-
vidade volumtrica) em g/L.h.
327
Integrando:
Considerando constante, temos o seguinte resultado:
Quando t = t
d
, isto , o tempo requerido para que x
2
=2x
1
, cha-
mado de tempo de gerao ou tempo de duplicao, temos a seguinte
expresso;
Crescimento bacteriano
Bactrias se dividem por fisso ou diviso simples; durante o cresci-
mento, a clula duplica a sua massa e a quantidade de todos os cons-
tituintes da mesma. Algumas bactrias, em dadas condies, divi-
dem-se em 15 a 20 minutos, porm os tempos de duplicao tpicos
so de 45 a 60 minutos.
Crescimento de leveduras
Normalmente as leveduras se multiplicam por brotamento, algu-
mas, por exceo, crescem (multiplicam) por fisso ou por formao
de hifas.
Em condies maximizadas, leveduras podem se dividir a cada 45
minutos, porm os tempos de 90 a 120 minutos so os mais tpicos.
Descrio qumica do crescimento microbiano
O crescimento de microrganismos pode ser visto como uma srie
de reaes qumicas, levando sntese da massa celular. A estequio-
328
metria generalizada para o crescimento celular pode ser descrita de
acordo com a reao abaixo:
Em que A, B, D, M, P e Q so os moles dos respectivos compostos;
C
a
H
b
O
c
uma fonte de carbono genrica; o M o nmero de moles
de uma unidade de clula CHON. Por exemplo, uma levedura
tpica pode ser representada por C
6
H
11
NO
3
. Assim a frao orgnica
da clula tem um peso molecular unitrio de 145. Se a clula 90%
orgnica e 10% cinzas, o peso molecular global de uma clula unit-
ria 145/0,9 = 161.
A partir dessa relao estequiomtrica, pode-se ver que a relao
de massa celular formada pela massa de substrato consumido (M/A),
referido como rendimento celular, dependente da eficincia da uti-
lizao da fonte de carbono para a incorporao na massa celular e
para a combusto a CO
2
e H
2
O, na obteno de energia para o cresci-
mento (multiplicao).
Exemplo:
Numa fermentao sobre n-tetradecano com vistas produo de
massa celular, uma levedura, Cndida lipolytica M12, apresentou os
seguintes valores mdios dos principais elementos de sua composi-
o celular:
C - 43,76%
H - 6,63%
N - 8,26%
P - 2,25%
O - 33,22%
Calcule a frmula bruta do microrganismo, considerando que a sua
massa molecular igual a 100.
Resoluo:
Para uma unidade de clula CHON
, temos de calcular a nova

composio celular em funo de C, H, O e N.
329
Composio celular em relao ao carbono:
Composio celular em relao ao Hidrognio:
Composio celular em relao ao oxignio:
Composio celular em relao ao nitrognio:
Ento a formula bruta do microrganismo : C
4
H
7
O
2
N
Cintica do crescimento microbiano
Aps a inoculao de um meio de cultura favorvel ao desenvol-
vimento do microrganismo em estudo, sob condies adequadas,
observa-se um comportamento nos valores da concentrao celular
(crescimento celular), que caracterizado por um acrscimo de massa
e (ou) nmero de clulas.
Uma curva de crescimento descontnuo tpico, para um microrga-
nismo que cresceu em um meio quimicamente definido, mostrado
na Figura 4.
330
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
X0
Xi
Xc
Xd
Xm
X

-

C
o
n
c
.

c
e
l
u
l
a
r

(
n
l
u
l
a
s
/
m
L
)
Tempo
Figura 4. Curva de crescimento do microrganismo em cultivo descontnuo.
As seguintes fases no crescimento so observadas:
Fase 1 (Intervalo de tempo entre 0 e 1 Figura 4): conhecida como
fase lag ou de latncia, que segue imediatamente aps a inoculao
do meio com microrganismo em questo. Trata-se de um perodo de
adaptao durante o qual a clula sintetiza as enzimas necessrias ao
metabolismo dos componentes presentes no meio.
Durante essa primeira fase, no h reproduo celular e, assim,
X=X
0
=constante. A durao dessa fase varia principalmente com a con-
centrao do inculo (e, portanto, com o valor de X
0
), com a idade do
microrganismo (tempo de pr-cultivo) e com o seu estado fisiolgico.
Quando uma cultura microbiana mudada de um ambiente a
outro, necessrio reorganizar ambos os seus constituintes, micro
e macromoleculares; isso pode envolver a sntese ou represso de
enzimas ou constituintes. A fase lag, como consequncia, pode ser
muito curta ou mais extensa. Pode haver uma aparente ou pseudo
fase lag quando o inoculo pequeno ou tem baixa viabilidade, j
que crescimento somente pode ser registrado acima do nvel de sen-
sibilidade do mtodo de anlise.
331
A durao da fase lag bastante difcil de estimar, sendo mais fcil
sua determinao experimental. O objetivo geral de um bom processo
seria minimizar a fase lag.
Fase 2 - (Intervalo de tempo entre 1 e 5 Figura 4): conhecida como
fase logartmica ou exponencial.
Uma vez completadas as alteraes necessrias, termina o perodo
de adaptao e as clulas comeam a crescer, normalmente em cres-
cimento exponencial ou logartmico.
A fase exponencial caracterizada por uma linha reta em um gr-
fico semilog de ln X por tempo. Esse um perodo de crescimento em
estado estacionrio, durante o qual a velocidade de crescimento espe-
cfico constante. Durante a fermentao, a composio qumica
do meio est variando, j que os nutrientes esto sendo consumidos
e os produtos formados. Como consequncia, o ambiente no est
em estado estacionrio. Num intervalo de concentrao de nutrien-
tes, a taxa de crescimento independente da concentrao. Tambm,
durante a fase log, a composio macromolecular da clula perma-
nece constante (Figura 5).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Reta da fase log I
n

(
X
)
Figura 5. Fase exponencial caracterizada por uma linha reta em um grfico
semilog (crescimento de microrganismo por tempo em cultivo descontnuo).
332
Na fase exponencial, podemos aplicar a equao abaixo descrita:
Fase 3 (Intervalo de tempo entre 5 e 8 Figura 4): fase estacio-
nria. Em algum momento, a velocidade de crescimento comea a
diminuir, ou devido ao desaparecimento de um nutriente essencial ou
devido ao acmulo de um produto inibidor. A clula passa por uma
transio at que a velocidade de crescimento seja zero.
Essa fase estacionria ocorre quando todas as clulas alcanaram
equilbrio com clulas mortas, isto , com a velocidade de morte.
Durante a fase estacionria e de morte, ou de declnio, algumas clu-
las esto se dividindo, enquanto outras morrem. Frequentemente
as clulas mortas sofrem autlise, e os carboidratos, aminocidos e
outros componentes liberados da clula rompida so ento usados
como nutrientes pelas clulas remanescentes da populao. Esses
eventos canibalsticos ajudam a manter a populao durante a fase
estacionria. Devido falta de nutrientes e presena de produtos txi-
cos, a populao no pode sustentar-se e a fase de morte se inicia.
Relativamente, poucos estudos tm sido feitos sobre a fase de morte
de culturas de clulas, talvez porque a maioria dos processos micro-
biolgicos descontnuos industriais terminada antes da fase de
morte comear.
Velocidade de crescimento versus
concentrao de nutrientes
Durante a maioria das fermentaes descontnuas, a velocidade
especfica de crescimento () constante e independente da concen-
trao de nutrientes que est variando. Porm, a velocidade de cres-
cimento, como uma velocidade de reao qumica, uma concen-
trao de produtos qumicos. Os produtos qumicos nesse caso so
nutrientes essenciais ou substratos para crescimento. A forma de
relao entre velocidade de crescimento e concentrao de substrato
foi observada em 1949 por Monod. O modelo de Monod tem a forma:
333
Em que:
= velocidade especfica de crescimento.
m
= velocidade especfica de crescimento mximo.
S = concentrao do substrato.
K
S
= constante, igual a S quando = 0,5.
m
Na Figura 6, est representado graficamente em funo de S; e, na
Figura 7, o grfico de Lineweaver-Burk correspondente, utilizando
para a determinao dos parmetros cinticos de
m
e K
S
.
S (concentrao de substrato)
m
(
v
e
l
o
c
i
d
a
d
e

e
s
p
e
c
f
i
c
a
)
m
max
2
K
s
m
max
Figura 6. Representao grfica do modelo de Monod.
Grfico de Lineweaver-Burk
0
2
4
6
8
10
12
14
16
-10 -5 0 5 10 15 20 25
1/S
K
S
/ m
m
1
/
m
-1/K
s
1/ m
m
Figura 7. Representao grfica da equao:

m m
S
S
K

1 1 1
+ =
.
334
Na Tabela 1, apresentam-se valores de K
S
do modelo de Monod para
o crescimento de microrganismos no substrato glicose.
Tabela 1. Alguns valores de K
S
do modelo de Monod para crescimento.
Substrato KS (mg/L) Microrganismo
Glicose 1,0 Enterobacter aerogenes
Glicose 2,0 4,0 Escherichia coli
Glicose 25,0 Saccharomyces cerevisiae
Observaes:
a) Os valores de Ks so muito pequenos em relao concentra-
o do substrato nas fermentaes industriais.
b)
m
, quando S>10.K
S
.
c) Para S<10.K
S
, uma forte funo da concentrao de substrato.
d) Durante a fase exponencial, =constante.
Muitos outros modelos tm sido propostos para relacionar veloci-
dade de crescimento com concentrao de substrato, mas o modelo
de Monod mais comumente usado.
Exerccios:
1) Foi verificado em laboratrio que um certo microrganismo a
25 C e tendo como substrato a maltotriose segue a cintica de
Monod, determine os parmetros cinticos K
S
e
m
a partir da
tabela abaixo.
(h-1) S de maltotriose(g/L)
0,05 2,04
0,10 4,50
0,15 7,50
0,20 11,25
0,25 16,07
0,30 22,50
0,35 31,50
0,40 45,00
0,45 67,50
0,50 112,50
0,55 247,50
335
2) O mesmo microrganismo do item anterior, fermentando nas
mesmas condies, porm utilizando a maltose. Determine os
parmetros cinticos K
S
e
m
a partir da tabela abaixo.
(h-1) S de maltose (g/L)
0,05 2,00
0,10 4,50
0,15 7,70
0,20 12,00
0,25 18,00
0,30 27,00
0,35 42,00
0,40 72,00
0,45 162,00
O microrganismo tem afinidade maior pela maltotriose ou mal-
tose? Explique a sua resposta.
Aerao e agitao
A velocidade de agitao e a taxa de aerao so importantes para
o suprimento de oxignio ao microrganismo no processo fermenta-
tivo, sendo o oxignio normalmente suprido cultura microbiana na
forma de ar. Entre os processos biotecnolgicos de interesse indus-
trial, envolvendo culturas de clulas microbianas, os de aerobiose
encontram-se em maior destaque: produo de antibiticos, enzimas,
vitaminas, tratamento biolgico de resduos, etc; assim um adequado
dimensionamento do sistema de transferncia de oxignio necess-
rio para uma alta produo da biomolcula de interesse.
Transferncia de oxignio
O objetivo central de um sistema de aerao e agitao o forneci-
mento de oxignio para a manuteno de uma dada atividade respira-
tria de um certo conjunto de clulas. Assim o que se visa transferir
o oxignio da fase gasosa (bolha de ar) para o lquido, fazer com que
336
esse oxignio dissolvido chegue s clulas suspensas e, finalmente,
seja consumido.
Nesse caminho a ser percorrido pelo oxignio, existem muitas
resistncias, porm devemos considerar a resistncia de uma pel-
cula lquida (meio de cultura) ao redor da bolha de ar. A taxa de trans-
ferncia de oxignio pode ser descrita pela equao abaixo:
dC = K
L
.a (C
s
-C)
dt
Em que:
C = concentrao de O
2
dissolvido no meio de cultura.
C
s
= concentrao de saturao de O
2
dissolvido no meio de cultura.
K
L
.a = coeficiente de transferncia de massa.
= variao da concentrao de O
2
dissolvido no meio de cul-
tura com o tempo durante a aerao.
O parmetro K
L
.a deve ser determinado experimentalmente, e
usado para avaliar a capacidade de aerao de um fermentador.
Para a determinao de K
L
.a, deve-se obter dados sobre a concen-
trao de O
2
dissolvido no meio de cultura ao longo do tempo at a
saturao. O sinal de resposta de um eletrodo especfico para a medi-
o de oxignio dissolvido uma tcnica muito utilizada. Consiste
em inicialmente borbulhar nitrognio no lquido (meio de cultura),
a fim de retirar todo o O
2
dissolvido, at que a sonda indique zero. A
seguir, inicia-se a aerao e a agitao do meio lquido nas condies
em que se pretende obter K
L
.a, passando ento a registrar o sinal da
sonda. Esse sinal sair do valor zero, aumentando at atingir a con-
centrao de saturao C
s
. Na Figura 8, a concentrao de saturao
(8 ppm) atingida aps 25 minutos.
337
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 10 20 30 40 50
Tempo (min)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
o

d
e

O
x
i
g
n
i
o
(
p
p
m
)
Figura 8. Valores de concentrao de oxignio ao longo do tempo em um
processo de aerao.
Integrando a equao anterior com as condies iniciais de t=0 e C=0:
Ln(1-C/Cs) = -K
L
.a.t
Graficando-se Ln(1-C/C
s
) versus tempo t, tem-se uma reta cujo coe-
ficiente angular K
L
.a.
Biorreatores e sistemas para suprimento de oxignio
O valor de K
L
.a depender de variveis como taxa de aerao, velo-
cidade de agitao e configurao das ps do agitador.
A taxa de aerao fornecida ao fermentador dada em VVM [volume
de ar/ (volume de meio de cultura x minuto]. Antes da entrada do ar
no fermentador, medidores de vazo registram o volume de ar/minuto
e ocorre a esterilizao por meio de filtros que apresentam material
filtrante com poros de dimenses menores do que os microorganis-
mos a serem retidos. Normalmente, utilizam-se membranas com
poros de 0,2 m a 0,22 m.
A agitao incrementa o valor de K
L
.a por diminuir a resistncia de
transferncia entre as bolhas de ar e o meio de cultura, entretanto a
mesma causa tenses de cisalhamento que podem destruir os micro-
organismos.
338
O detalhe A na Figura 9 um biorreator agitado e aerado (Stirred
Tank Reactor STR), constituindo 93% das aplicaes na indstria
de alimentos. Os tanques agitados e aerados so projetados com as
seguintes relaes: a altura do lquido igual ao dimetro do tanque; e o
agitador do tipo turbina constitudo por seis ps planas (detalhe C da
Figura 10), apresentando um dimetro igual a um tero do dimetro do
tanque. Usa-se um sistema de quatro chicanas, para evitar a formao
do vrtice, diametralmente opostas, apresentando cada uma largura
de 1/10 ou 1/12 do dimetro do tanque. Os detalhes B e C na Figura 9
sugerem a possibilidade de se transferir oxignio apenas por borbu-
lhamento de ar. No detalhe B (coluna de bolhas), so instalados distri-
buidores de bolhas de ar comprimido no fundo do biorreator de modo
que possam ser distribudas uniformemente em todo meio de cultura.
No detalhe C (air lift), o ar introduzido no biorreator atravs de uma
coluna material cermico sintetizado de pequenos poros, ocorrendo a
difuso das bolhas de ar do interior da coluna para o meio de cultura.
As vantagens dos sistemas exclusivamente de borbulhamento so:
menor cisalhamento das clulas; economia de energia por no neces-
sitar de agitao mecnica; construo do reator ser facilitada. As des-
vantagens so as vazes de aerao elevadas par um bom nvel de agi-
tao e gastos de energia na compresso do ar.
A B C
Figura 9. Tipos de biorreatores: (A) Stirred Tank Reactor (STR); (B) coluna
de bolhas; (C) air- lift.
339
A B C
Figura 10. Principais tipos de agitadores: (A) tipo hlice marinha (propeller);
(B) tipo lmina (paddle) verticail; (C) turbina com seis ps.
Tenso cisalhante na agitao
A tenso de cisalhamento funo da geometria das ps do agitador
e de sua velocidade rotacional. Na Figura 10, so apresentados alguns
modelos de ps de agitadores mais utilizados.
Os agitadores promovem um turbilhonamento axial e (ou) radial.
Os agitadores do tipo propeller so de escoamento axial, usados para
agitar meios de baixa viscosidade; opera a velocidades elevadas e so
tambm de menores dimenses (geralmente < 50 cm). As paddles
operam a velocidades baixas ou moderadas (20-150 rpm) e o seu di-
metro da ordem de 50% a 80% do dimetro do tanque do fermen-
tador; o escoamento radial, se as lminas forem verticais, ou axiais,
se as lminas forem inclinadas. Os agitadores tipo turbina com seis
ps so os mais utilizados.
A tenso de cisalhamento mdia em um tanque agitado pode ser
calculada pelas seguintes equaes:
= kN
=
Em que:
: viscosidade dinmica do meio de cultura (Pa.s).
N: velocidade rotacional do agitador (rps).
k: constante que depende da geometria do sistema (k=15 para agita-
dor tipo turbina com 6 ps e k=11 para agitador tipo hlice marinha).
: tenso cisalhante mdia (Pa).
: taxa de deformao.
340
Para o crescimento de microrganismos aerbios e a produo do
metablito de interesse, no somente o suprimento apropriado de oxi-
gnio importante, mas tambm o grau de cisalhamento na agitao,
que pode ser determinante para o sucesso do processo fermentativo.
Produo de alimentos e aditivos por fermentao
Fermentao ltica de frutas e hortalias
A fermentao ltica utilizada na conservao de alimentos por
meio do preparo de picles. Alm do pepino, outras matrias-primas
podem ser utilizadas, como cebola, cenoura, couve-flor, brcoli, chu-
chu, pssego, figo, pra, morango e outras. A fermentao representa
economia de energia, pois no so necessrias operaes como refri-
gerao ou pasteurizao para a conservao do alimento.
A microbiologia da fermentao composta por bactrias lti-
cas, enterobactrias e leveduras. Os dois ltimos so indesejveis,
pois so as primeiras as responsveis pela produo do cido ltico
e pelas caractersticas desejveis do produto. Durante a fermenta-
o, com a produo de cido ltico, o pH diminui e o desenvolvi-
mento das enterobactrias inibido a partir de pH 4,5. O pH cido
no inibe o desenvolvimento de leveduras, as quais formam pelculas
na superfcie das hortalias em fermentao, consomem cido ltico,
aumentando o pH, e permitindo que outros microrganismos cresam.
Amolecimento, mudanas de cor e aparecimento de manchas bran-
cas em hortalias so consequncias do crescimento de leveduras.
A microbiota da fermentao est presente na superfcie das horta-
lias, assim como bactrias aerbias indesejveis. As condies da fer-
mentao na ausncia de ar e na presena de sal (cloreto de sdio) so
desfavorveis s bactrias aerbias e favorveis s bactrias lticas. A
concentrao de sal no incio da fermentao deve ser de 12 Brix. A
temperatura ideal de fermentao para as bactrias lticas est entre
18 C e 20 C. A relao entre salmoura e hortalia deve ser de 1,8:1.
No final da fermentao, os valores de pH e acidez total apresentam-se
praticamente constantes, e os tecidos das hortalias tornam-se transl-
341
cidos, com colorao de tonalidade mais clara. A fermentao requer
de 4 a 6 semanas. As bactrias lticas produzem compostos antimi-
crobianos (bacteriocinas), garantindo a inocuidade e extenso da vida
de prateleira dos produtos fermentados.
Em vez da fermentao natural, pode-se utilizar fermentos lticos
inoculados na salmoura. Nesse caso, permitido um tratamento tr-
mico do vegetal (branqueamento) antes da fermentao para a mini-
mizao da carga de microrganismos indesejveis. O branqueamento
pode ser feito pela imerso do vegetal em gua a 90
o
C por 5 minutos,
ou tratamento com vapor. Esse procedimento tambm auxilia na pre-
veno do escurecimento enzimtico do vegetal.
Os picles fermentados, antes de serem consumidos, devem ser lava-
dos com gua morna (45 C a 50 C) por algumas horas, podendo
tambm ser matrias-primas para o picles em vinagre. A maioria das
agroindstrias produtoras de picles no utiliza a fermentao ltica, o
produto obtido com a imerso da matria-prima em vinagre condi-
mentado; no entanto o picles preparado com matria-prima fermen-
tada possui sabor agradvel e possui qualidades fsicas de cor e tex-
tura superiores ao tradicional picles em vinagre.
Produo de vinho
No contexto geral, pode-se destacar que o vinho uma bebida ela-
borada a partir da fermentao alcolica dos acares de frutas ss e
maduras, estimuladas pela ao de leveduras, que so responsveis
diretas pela transformao dos acares (glicose e frutose) em lcool e
gs carbnico. Ao referir-se a bebida como apenas vinho, prediz-se que
a matria-prima uva, logo vinhos elaborados de outras frutas devem
ser rotulados com a denominao vinho acompanhado do nome da
fruta que lhe deu origem: vinho de laranja, vinho de pera, vinho de
manga, etc. A composio do vinho no s se origina em funo da
variedade e qualidade da matria-prima, mas tambm de outros fato-
res do produto acabado, como sua idade, safra e conservao. Porm
todos os compostos que o constituem so desenvolvidos pelo processo
fermentativo, em que h uma decomposio parcial de cidos diver-
342
sos, lcool, vitaminas, glicerol, composto fenlico, substncias aro-
mticas, sais minerais e taninos.
O teor de acar das frutas (glicose, frutose, sacarose) varia em fun-
o de vrios fatores, tais como o estgio de maturao, o clima, o solo
e a variedade. Os vinhos sempre apresentam uma frao de frutose
e um pouco de glicose. A sacarose hidrolisada em glicose e frutose
pela enzima invertase produzida pelas leveduras. Nos vinhos, a gli-
cose provm tambm da hidrlise de certos glicdios durante a con-
servao. O lcool etlico o constituinte mais importante do vinho
depois da gua, que representa cerca de 85% a 90%. O grau alcolico
dos vinhos varia entre 9
o
GL e 15
o
GL; existem, entretanto, vinhos de
mais baixo teor e os com concentrao alcolica que chega a 18
o
GL
(vinhos licorosos).
Os principais cidos orgnicos de vinhos so: o cido mlico, tart-
rico e ctrico, provenientes das prprias frutas; e os provenientes da
fermentao: succinico, ltico e actico. A maior parte dos cidos org-
nicos encontra-se nos vinhos na forma livre e constitui a acidez total.
Os compostos fenlicos so denominados matrias corantes ou
matrias tnicas. Apresentam uma importncia muito grande, pois
conferem aos vinhos a colorao e grande parte do sabor. Os gostos de
vinhos de uva tintos e brancos so diferentes pela presena de com-
postos fenlicos em propores mais elevadas nos primeiros. Os com-
postos fenlicos so constitudos de cinco grupos qumicos: antociani-
nas, flavonas, fenis-cidos, taninos condensados, taninos catequicos.
Os steres so normalmente formados durante a fermentao pelas
leveduras, bactrias lcticas e acticas, durante o envelhecimento na
madeira ou na garrafa. Em baixa concentrao, considerado como
constituinte favorvel ao aroma do vinho.
Em geral, entre a colheita do fruto e expedio do vinho engarra-
fado, h um conjunto de etapas. Na Figura 11, apresenta um fluxo-
grama ilustrativo do processo de produo de vinho.
343
Recepo e Seleo
Extrao da polpa
Chaptalizao da polpa
Fermentao tumultuosa
Trafega
Fermentao Lenta
Afinamento
Inculo
Figura 11. Processo de obteno do vinho.
Classificao dos frutos (ou seleo dos frutos )
As frutas devem ser selecionadas de acordo com grau de matura-
o; fase em que se eliminaram, observando-se a aparncia dos fru-
tos, aqueles mais defeituosos, estragados, inclusive os que apresen-
taram algum estgio de fermentao.
Extrao da polpa
A extrao do suco a partir da parte comestvel da fruta pode ser
efetuado em despolpador munido de peneiras, importante principal-
mente para frutas com polpa fibrosa, como manga e abacaxi, visto que
as fibras insolveis prejudicam a fase de fermentao, e dificultam as
etapas de filtrao. No caso de uva, deve-se romper as bagas por com-
presso em uma esmagadeira que separa as sementes, as cascas e o
344
suco para a fermentao e elimina os engaos, os quais podem con-
ferir caractersticas indesejveis ao vinho.
Chaptalizao da polpa
Uma correo (chaptalizao) do teor de acar da polpa pode ser
realizada a partir da adio de sacarose, para se obter uma bebida com
graduao alcolica entre aproximadamente 9% e 15% (V/V). A adio
de sacarose permitida at que o Brix duplique seu valor em relao
ao medido na polpa in natura.
Inoculao de leveduras (inculo )
O mosto pode ser inoculado com leveduras selecionadas, que domi-
nam rapidamente os microrganismos selvagens que esto presentes
nas superfcies das frutas, se for utilizado um meio preparado previa-
mente com anidrido sulfuroso, o qual protege o mosto da oxidao
e exerce uma funo inibidora sobre os microrganismos selvagens.
Fermentao tumultuosa, trafega e fermentao lenta
A fase tumultuosa ocorre no incio do processo fermentativo, apre-
sentando acentuadas variaes das propriedades do mosto. Quando
a temperatura se eleva para acima de 33
o
C, necessria a refrigera-
o do mosto pra preservao das leveduras. Um dispositivo simples
para a refrigerao o mosto circular no interior de um tubo met-
lico disposto em forma de serpentina, mergulhado dentro de uma
cuba com gua fria.
Aps a fermentao tumultuosa, realiza-se a trafega do vinho, o
qual passa por um processo de eliminao de resduos, ou seja, par-
tes slidas com fermentos, a partir de um filtro. O filtrado pode ser
transferido a uma nova dorna iniciando-se assim a fermentao lenta.
Durante as fases de fermentao, realiza-se o acompanhamento de
parmetros fsico-qumicos: temperatura, grau Brix, acidez, pH e den-
sidade fatores importantes para determinar o padro de identidade
e qualidade do novo produto.
345
No decorrer da fermentao, o Brix, a densidade e o pH diminuem,
enquanto a acidez e a temperatura aumentam.
Afinamento
Aps o fim do processo fermentativo, centrifuga-se o vinho para
eliminar todos os resduos, o que facilita o processo de filtrao. Em
todo processo de fabricao de vinho, ele deve passar por um estgio
de filtrao, pois, ao trmino da fermentao, a sua caracterstica com
relao aparncia turva.
Produo de cido ctrico
O cido ctrico um dos aditivos de alimentos produzidos por
microorganismos. O cido ctrico responsvel pelo sabor azedo de
frutas ctricas. Poderia ser obtido delas, mas necessitaria de milhares
de frutos para produzir a quantidade de cido ctrico atualmente feita
pela fermentao de melado com o fungo Aspergillus niger.
Ao contrrio das principais fermentaes de alimentos e de bebi-
das cujas origens remontam antiguidade, os processos de produo
desse cido s comearam a ser desenvolvidos nos ltimos 100 anos.
Cerca de 70% da produo utilizada pela indstria de alimentos e
bebidas; 12% pela indstria farmacutica; e 18% por outras indstrias.
Na indstria de alimentos, usa-se em larga escala como acidulante e
antioxidante por apresentar sabor agradvel, baixssima toxicidade e
alta solubilidade. usado em refrigerantes, sobremesas, conservas,
vinhos, refrescos em p e doces. Alm disso, esse cido tem capaci-
dade de complexao com metais pesados como o ferro e o cobre. Essa
propriedade tem conduzido a crescente utilizao como estabilizante
de leos e gorduras para reduzir a sua oxidao catalisada por esses
metais. Tambm, essa propriedade, aliada ao baixo grau de corrosivi-
dade a certos metais, tem permitido seu uso na limpeza de caldeiras
e instalaes especiais.
O principal processo fermentativo utilizado na produo de cido
ctrico por cultura submersa: o fungo se desenvolve inteiramente
submerso no meio de cultura lquido sobre agitao (que serve para
346
assegurar a homogeneidade tanto da distribuio dos microorganis-
mos quanto dos nutrientes).
Fontes de carboidratos para a produo de cido ctrico
Maltose (dois monmeros de glicose), sacarose, manose, gli-
cose e frutose so os acares mais apropriados para a produ-
o de cido.
Na prtica, o cido ctrico produzido a partir de carboidrato
purificado (sacarose) ou da fonte de carboidrato bruto, de preo
mais conveniente, como melao de cana de acar, melao de
beterraba, sacarose bruta, caldo de cana e hidrolisado de amido.
Estudos apresentam o resduo bagao de mandioca como fonte
de carboidrato previamente tratado com enzimas amilolticas.
Glicerina tambm um susbtrato adequado para a produo de
cido ctrico por Yarrowia lipolytic. Esse fermento produziu at
35 g/L de cido ctrico quando uma concentrao inicial alta de
glicerol foi usada no mdio de cultura. Parmetros de produo
cidos ctricos em glicerol foram semelhantes aos obtidos com
glicose como susbtrato.
Bioqumica da fermentao do cido ctrico
Essencialmente a glicose transformada em piruvato pela via glico-
ltica. O piruvato transformado em acetil CoA, que entrar no ciclo
de Krebs para a formao do citrato.
Separao do produto
O meio fermentativo dever ser filtrado. O citrato precipitado da
soluo por adio de suspenso de hidrxido de clcio (que deve ter
um baixo teor de magnsio para no haver formao de citrato de
magnsio, que solvel em gua). Em seguida, o citrato de clcio
filtrado e a massa, transferida para um tanque, onde ela vai ser tra-
tada com cido sulfrico para precipitar o sulfato de clcio. O sobrena-
dante contendo cido ctrico purificado por tratamento com carvo
ativado e desmineralizado (retirada de ons) por sucessivas passagens
347
atravs de colunas com resina de troca inica, e a soluo purificada
ento cristalizada por evaporao, sendo os cristais removidos por
centrifugao.
Produo de carotenoides
Microorganismos produzem pigmentos como carotenoides, mela-
ninas, flavonas, quinonas, etc. Os carotenoides so pigmentos (coran-
tes) e apresentam-se na cor amarelo, laranja, vermelho. Possuem
a funo de antioxidantes, protegendo as clulas contra os radi-
cais livres; so precursores de vitamina A (-caroteno, -caroteno e
-criptoxantina); e esto presentes como aditivos em diversos alimen-
tos como manteigas, queijos, compotas e cereais.
Os corantes carotenoides podem ter preparao sinttica, extrao
de fontes naturais (extrato de pimento, tomate, cenoura) ou obten-
o por processo fermentativo.
O uso de corante sinttico em alimentos altamente controverso
devido sua avaliao negativa, mas permitido pela legislao. Um
substituto natural (biocorante) mais bem aceito devido ao apelo de
vida saudvel. Plantas e microorganismos so fontes dessas subs-
tncias, no entanto, no que se refere produo por fermentao,
ainda so necessrios estudos sobre a segurana do uso alimentar.
Os carotenoides licopeno e -caroteno provenientes de fontes vege-
tais esto disponveis no mercado como suplementos na forma far-
macutica. Os principais microrganismos produtores desses carote-
noides so algas unicelulares e fungos: Blakeslea trispora (-caroteno)
e Erwinia uredovora e Fusarium sporotrichioides (licopeno). Em adio
a isso, outros microrganismos, incluindo Serratia e Streptomyces, pro-
duzem outros carotenoides em grande quantidade.
A biotecnologia poder permitir uma produo eficiente e massiva
de corantes alimentcios, mas o sucesso de qualquer pigmento pro-
duzido por fermentao depende de sua aceitabilidade no mercado,
aprovao pela legislao e o investimento requerido para o desenvol-
vimento da produo contnua.
348
Produo e purificao de extratos enzimticos
A produo de enzimas microbianas em escala industrial ocorre
prioritariamente por fermentao submersa. Poucos so os proces-
sos prvios fermentao e um dos mais importantes o preparo do
inculo. Pode-se partir de um cultivo em frasco agitado, inoculado
com a cultura estoque. Quando em fase de crescimento exponen-
cial, esse cultivo pode ser inoculado em fermentador de escala piloto
de 100 L a 500 L de capacidade, que contm meio de cultivo similar
ao da escala de laboratrio. Decorrido um tempo conveniente, essa
cultura inoculada no fermentador principal, que em geral tem de
10.000 L a 100.000 L de capacidade e so em geral operados em bate-
lada. Esses fermentadores so encamisados ou possuem serpenti-
nas internas para as necessidades de aquecimento e refrigerao e de
sistemas de medidas (sensores de pH, temperatura, oxignio dissol-
vido). O parmetro de controle mais representativo para determinar
o trmino da fermentao a atividade enzimtica. No entanto, algu-
mas vezes a sua determinao demorada; acarretando tempos de
resposta longos. Nesse caso, a variao de outros parmetros de pro-
cesso, como pH e oxignio dissolvido, pode ser usada para caracteri-
zar o fim do processo.
Os meios de cultura so formulados pela utilizao de compostos
quimicamente conhecidos ou de matrias-primas naturais. Para a
escala industrial, os compostos qumicos so onerosos e a opo geral-
mente feita por meios que contenham apreciveis quantidades de
matrias-primas provenientes da agricultura (Tabela 2) por serem de
baixo custo.
Tabela 2. Resduos agrcolas utilizados como substrato para a produ-
o de enzimas.
Microrganismo Substrato (resduo agrcola) Enzima produzida
Penicillium simplicissimum farelo de soja lipase
Thermoascus auranticus palha de trigo celulase
Trichoderma reesei gro de trigo celulase
Trichoderma harzianum bagao de frutas
endo ou exopoligalacturonase
(pectinase)
Humicola grisea var. thermoidea engao de bananeira xilanase (hemicelulase)
349
As operaes que seguem ao processo fermentativo dependem da
localizao da enzima de interesse (intra ou extracelular). Enzimas
extracelulares so recuperadas do caldo fermentativo e etapas de sepa-
rao e purificao so utilizadas. A purificao de enzimas intrace-
lulares mais complexa, pois envolve as etapas de ruptura celular e
posterior separao dos constituintes intracelulares.
No caso de enzimas extracelulares, ao trmino do processo fermen-
tativo, o caldo (extrato bruto) resfriado a cerca de 5 C para assegu-
rar as condies de estabilidade do produto e evitar o crescimento de
microrganismos contaminantes. O pH geralmente ajustado para o
valor timo de atuao da enzima produzida.
A separao das clulas pode ser feita por centrifugao ou filtra-
o. Fungos filamentosos podem ser separados por centrifugao,
no entanto bactrias e leveduras podem necessitar de uma prvia flo-
culao com sulfato de alumnio ou polieletrlitos. A filtrao uma
alternativa para a centrifugao, sendo, em geral, conduzida em fil-
tros-prensa ou filtros rotativos a vcuo. O extrato bruto deve ser con-
centrado em mdulos de ultrafiltrao que utilizam membranas de 2
a 300 kDa. A soluo concentrada, uma vez diluda a nveis convenien-
tes, pode ser embalada para ser comercializada com grau comercial
ou tcnico, ou, por diversas razes (aplicao, transporte, estocagem),
torna-se uma opo vivel a obteno de um preparado enzimtico
bruto na forma slida. A secagem ocorre a vcuo, por liofilizao, ou
por atomizao em equipamento conhecido como spray dryer, onde
a soluo enzimtica injetada atravs de bico atomizador como got-
culas e entra em contato com ar em contracorrente.
Os preparados enzimticos com grau comercial so utilizados em
indstria alimentcia, txtil, papel, etc; mas, se for para uso analtico
ou farmacutico, processos mais sofisticados de purificao, como
o caso das separaes cromatogrficas (troca inica, filtrao em gel),
devem ser utilizados. Assim o grau de purificao exigido est asso-
ciado aplicao do produto.
Aplicao de enzimas na produo de alimentos
leos de citrus ou azeite de oliva podem ser extrados mais facil-
mente, e com maior rendimento, utilizando-se pectinases em substi-
350
tuio aos solventes. O uso da amostra enzimtica com atividade de
pectinase resulta em uma melhor qualidade organolptica dos leos,
pois a extrao de polifenis, o-fenis e de outras substncias de sabo-
res aromticos tambm incrementada, contribuindo para a estabi-
lidade oxidante do leo.
O despolpamento de gro de caf envolve a remoo da casca da
cereja, que obtida por processos mecnicos. Aps o despolpamento,
ocorre a mucilagem, que se constitui no processo pelo qual o meso-
carpo mucilaginoso aderente ao gro, rico em pectina, degradado
por enzimas (preparaes de pectinases, celulases e hemicelulases). A
mucilagem do caf alcana dois objetivos importantes: remove a ade-
rente camada mucilaginosa, permitindo a rpida secagem dos gros,
e melhora a torrefao, o que refletido na qualidade da bebida.
A mucilagem por ao enzimtica substitui a remoo qumica que
pode ser feita pelo uso de lcalis, cidos ou gua morna. Hidrxido
de sdio um dos lcalis sugeridos. As desvantagens do uso de soda
ou cidos referem-se ao uso cuidadoso e descarte dos produtos que
podem afetar o meio ambiente. A utilizao de enzimas substitui tam-
bm a remoo mecnica, em que so utilizadas mquinas desenvolvi-
das para esse processo, no entanto apresentam a desvantagem de alto
consumo de gua e de energia. H tambm possibilidade de danos
fsicos nos gros e possveis efeitos na qualidade da bebida.
Os oligogalacturondeos so conhecidos como ingredientes de ali-
mentos bioativos. Essas molculas, provenientes da ao de endo
e exo-polimetilgalacturonases sobre pectina, so no-digestveis e
podem, dessa maneira, ser usados como componentes na nutrio
humana e animal, em analogia s molculas de fruto-oligossacar-
deos (inulina). A inulina quando ingerida chega ao intestino grosso
quase integralmente. Ela no hidrolisada nas suas unidades monos-
sacardicas na parte superior do intestino, como consequncia, no
aumenta a glicemia e nem os nveis de insulina no sangue, sendo
ideal para diabticos.
Um preparado enzimtico com atividade de pectinase e -glucanase
utilizado pela indstria do vinho para decompor seletivamente os
glucanos e as substncias pcticas no mosto, e melhorar o envelhe-
cimento e a filtrao dos vinhos jovens. Para uma melhor liberao
351
dos valiosos compostos de aroma e cor contidos nas cascas das uvas
e no engao, estes, aps a macerao, sofrem um tratamento enzi-
mtico com um complexo de pectinases, celulases e hemicelulases.
O resultado um vinho tinto de melhor qualidade e mais apreciado
pelo mercado.
Consideraes finais
Os processos fermentativos na indstria de alimentos represen-
tam mtodos de conservao, obteno de alimentos mais saborosos
e aditivos cada vez mais necessrios a outros processos industriais. A
biotecnologia aplicada Engenharia de Alimentos tem por finalidade,
alm da obteno de produto, o desenvolvimento de processos indus-
triais, com a determinao de parmetros que permitam clculos e
dimensionamentos. Trata-se de um campo de trabalho multidiscipli-
nar, que necessita da colaborao em diversas reas do conhecimento
(bioqumica, microbiologia, gentica, engenharia). Com o envolvi-
mento de tantos ramos da cincia, a biotecnologia em alimentos apre-
senta constante agregao de profissionais atuantes e inovaes.
Referncias
AIBA, S.; HUMPHREY, A. E.; MILLINS, N. F. Biochemical engineering, 2
nd
ed.,
Tokyo: University of Tokyo Press, 1973.
BAILEY, J. E.; OLLIS, D. F. Biochemical engineering fundamentals, 2
nd
ed. Rio de
Janeiro: McGraw-Hill, 1986.
BORZANI, W.; SCHMIDELL, W.; LIMA, U. A., AQUARONE, E. Fundamentos.
So Paulo: Edgard Blucher Lt, 2001. (Biotecnologia industrial, v. 1).
BORZANI, W.; SCHMIDELL, W.; LIMA, U. A., AQUARONE, E. Engenharia
bioqumica. So Paulo: Editora Edgard Blucher Ltda, 2001. (Biotecnologia
industrial, v. 2).
BORZANI, W.; SCHMIDELL, W.; LIMA, U. A.; AQUARONE, E. Processos
fermentativos e enzimticos. So Paulo: Editora Edgard Blucher Ltd, 2001.
(Biotecnologia industrial, v. 3).
DEMAIN, A. L.; SOLOMON, N. A. Manual of industrial microbiology and
biotechnology. Washington: ASM, 1986.
352
GOLDINI, J. S. Fermentao ltica de hortalias e azeitonas. In: BORZANI, W.;
SCHMIDELL, W.; LIMA, U. A., AQUARONE, E. Biotecnologia na produo de
alimentos. So Paulo: Edgard Blucher Ltd, 2001. (Biotecnologia industrial, v. 4).
HASHIZUME, T. Tecnologia do vinho. In: BORZANI, W.; SCHMIDELL, W.;
LIMA, U. A.; AQUARONE, E. Biotecnologia na produo de alimentos. So Paulo:
Edgard Blucher Ltd, 2001. (Biotecnologia industrial, v. 4).
STANBURY, P. F. Principles of fermentation technology. 2
nd
ed. Berkshire:
ButterWorth Heinemann, 1995.
VOGEL, H. C. Fermentation and biochemical engineering handbook. 2
nd
ed.,
Berkshire: Noyes Publications,1996.
FROST, G. M. Industrial enzyme applications: technical note, Inglaterra: Jonh& E.
Sturge, 1984.
9.0 Bibliografia Recomendada
ALKORTA I.; LLAMA M. J.; SERRA J. L. Industrial applications of pectic enzymes:
a review. Process Biochemistry, v. 33, p. 21-28, 1998.
CASTRO, A. G. A Qumica e a reologia no processamento de alimentos: cincia e
tcnica. Lisboa: Instituto Piaget, 2003.
DHARMARAJ, S.; ASHOKKUMAR. Food-grade pigments from Streptomyces sp.
isolated from the marine sponge Callyspongia diffusa, Food Research International,
p. 487-492, 2009.
GOKSUNGUR, F.; MANTZOURIDOU, T.; ROUKAS, O. Optimization of the
production of -carotene from molasses by Blakeslea trispora: a statistical approach.
Journal of Chemistry Technology and. Biotechnology. v. 77, p. 933943, 2002.
PIMENTA C. J.; CHAGAS S. J. R.; COSTA L., Pectinas e enzimas pectinolticas
em caf (Coffea arabica L.) colhido em quatro estgios de maturao. Cincia e
Agrotecnologia, v. 4, 2000.
PRAVE, P.; FAUST, U.; SITTING, W.; SUKATSCH, D. A. Fundamentals of
biotechnology. German: VCH, 1987.
ROUKAS, T.; ALICHANIDIS, E. Citric acid production from beet molasses by
cell recycle of Aspergillus niger, Journal Industrial Microbiology, v. 7, n. 1, p. 71-74,
1991.
SILVA, G. P.; MACK, M.; CANTIERO, J. Glycerol: a promising and abundant
carbon source for industrial microbiology. Biotechnology Advances, v. 27, n. 1,
30-39, 2009.
355
Interaes moleculares
planta-patgeno
Magnlia de Arajo Campos
Mrio Lcio Vilela de Resende
Marilia Santos Silva
Introduo
A evoluo de plantas na terra tem sido compartilhada por intera-
es moleculares com microrganismos simbiticos e patognicos,
sendo estas constantemente expostas a eles. A interao entre plantas
e seus patgenos fruto de relacionamento coevolucionrio entre eles
e a resistncia da planta, logo a patogenicidade do patgeno resul-
tado dessa interao. Portanto, a interao entre plantas e seus pat-
genos ntima (gentica, gene a gene), complexa (ativao de reaes
bioqumicas em cascatas, acmulo de protenas de defesa e mudan-
as citolgicas e morfolgicas na planta) e antiga (desde a evoluo
das plantas na terra). Numa batalha coevolutiva, plantas respondem
ao ataque de patgenos e pragas, fazendo uso de mecanismos efeti-
vos de resistncia a doenas.
Frente ao ataque de patgenos, esses mecanismos so acionados no
momento em que elas reconhecem a agresso. Se o reconhecimento
for rpido, uma resistncia eficiente contra doenas e ferimentos pode
ser induzida, impedindo o seu alastramento e alertando a planta sobre
agresses posteriores. Um reconhecimento tardio pode conduzir a
uma resistncia induzida atrasada, quando o patgeno j se insta-
lou, mas que pode, ainda, prevenir a planta contra futuras infeces.
Este captulo apresenta uma sntese da viso global emergente
de descobertas importantes sobre as interaes entre plantas e seus
patgenos, numa abordagem que envolve terminologia e eventos
envolvidos, tais como barreiras pr-formadas, o reconhecimento dos
patgenos e as diferentes respostas imunes inatas de hospedeiras e
no-hospedeiras eliciadas por eles.
356
Bases para o entendimento do
relacionamento planta-patgeno
Os termos plantas no-hospedeiras e plantas hospedeiras refe-
rem-se ao fato de que patgenos tm um limitado espectro de plan-
tas sobre as quais eles conseguem causar doenas (THORDAL-
HRISTENSEN, 2003). A resistncia de no-hospedeira a mais comum
e durvel forma de resistncia a doenas exibida por plantas contra a
maioria de microrganismos potencialmente patognicos. Essa resis-
tncia descreve a imunidade de todos os membros de uma espcie de
planta contra todos os variantes genticos de uma espcie de parasita
ou patgeno especfico, no adaptado (Figura 1).
Doena Doena Doena
Patgeno
Hospedeira
Susceptibilidade
Resistncia
raa-especfica
(RV)
Resistncia
raa-no especfica
(RH)
Raas
X
Cultivares
Espcie
X
Espcie
No hospedeira
Resistncia de no hospedeira (imune)
No patgeno
Resistncia de hospedeira (susceptvel ou resistente)
Imunidade inata
Doena
Figura 1. Viso geral do resultado da interao planta-patgeno. A interao
denominada compatvel quando resulta em doena e incompatvel quando
resulta em resistncia.
A patognese de patgenos fngicos no-adaptados, por exemplo,
termina muitas vezes com a tentativa de penetrao deles dentro das
clulas de plantas no-hospedeiras, tambm referidas como hospe-
deiras em potencial. Um patgeno que no pode causar doena numa
planta no-hospedeira referido como um potencial patgeno de
no-hospedeira ou no-patgeno. Somente aps um longo perodo de
coevoluo que uma raa ou espcie de um patgeno tem a possibili-
dade de adaptar-se a certas plantas no-hospedeiras, fazendo com que
357
Captulo 12 Interaes moleculares planta-patgeno
elas se tornem hospedeiras especficas e que os genes alvos de patoge-
nicidade delas evoluam fenmeno chamado compatibilidade bsica
(MYSORE; RYU, 2004; OH et al., 2006; THORDAL-CHRISTENSEN,
2003).
Compatibilidade bsica , portanto, uma adaptao evolucion-
ria especializada, e a evoluo de hospedeiras e de patgenos acon-
tece acompanhada por mudanas na expresso de genes de defesa.
Quando a compatibilidade bsica existe, o patgeno deve ser capaz
de: (1) crescer eficientemente dentro do ambiente da hospedeira; e
(2) superar ou burlar as defesas da hospedeira. Entretanto, patgenos
de uma espcie vegetal esto bem adaptados s defesas da hospedeira
especfica, mas no s defesas de outras plantas. Ento, alteraes na
hospedeira criam condies insustentveis (fenmeno resistncia
especfica de hospedeira) para o patgeno. Da mesma forma, altera-
es no patgeno podem levar a quebra dessa resistncia (suscetibili-
dade). No caso da resistncia de no-hospedeiras, que uma resistn-
cia multignica, a inativao de qualquer um dos seus componentes
pode no ser suficiente para levar a uma planta suscetvel.
Patgenos bem-sucedidos evoluram estratgias especializadas para
suprimir as respostas de defesa da planta e induzir susceptibilidade
doena em hospedeiras resistentes por vias diferentes. No entanto,
o que se observa que alguns gentipos da planta apresentam uma
imunidade raa-especfica, agora referida como Imunidade Disparada
por Efetores (IDE), tambm conhecida como resistncia de hospedeira.
Essa resistncia especfica de uma cultivar, ou um acesso, de uma
espcie de planta a uma raa de uma determinada espcie de patgeno
(Figura 1), por isso essa resistncia especfica de hospedeira tambm
conhecida como resistncia vertical. Alm disso, diferentes nveis
de resistncia podem ser observados em diferentes cultivares de uma
mesma espcie de planta em resposta aos diferentes nveis de viru-
lncia de diferentes raas de um patgeno. Porm, quando se trata da
resistncia referida como resistncia horizontal ou quantitativa, uma
mesma cultivar responde igualmente aos diferentes nveis de viruln-
cia de diferentes raas de um patgeno (Figura 1).
Nesse contexto, entende-se por resistncia a capacidade da planta
em evitar ou atrasar a entrada e (ou) subsequente atividade de um
358
patgeno. Na natureza, a resistncia a regra. Por outro lado, a colo-
nizao de patgenos dentro de tecidos vegetais, assim como fatores
ambientais adversos, causa alteraes prejudiciais no estado fisiol-
gico normal da planta, as quais caracterizam doena em plantas. As
anormalidades detectveis ou visveis denominam-se sintomas. A
essa habilidade de os patgenos interferirem com uma ou mais fun-
es essenciais da planta, dita hospedeira suscetvel, e causarem doena
denomina-se patogenicidade.
Como patgenos atacam plantas?
Patgenos atacam plantas porque, durante a evoluo de seu desen-
volvimento, eles adquiriram a habilidade de viver das substncias pro-
duzidas pelas plantas hospedeiras. Como muitas substncias esto
contidas no protoplasma das clulas vegetais, para acess-las os pat-
genos primeiro precisam transpor as barreiras estruturais externas
da planta, a cutcula e a parede celular(AGRIOS, 1997).
A maioria dos patgenos tem acesso ao interior das plantas direta-
mente, via penetrao da superfcie foliar (ex.: fungos) ou radicular
(ex.: nematoides), por meio de ferimentos (ex.: fungos, vrus, bactrias
e nematoides) ou por meio de aberturas naturais, tais como estma-
tos e hidatdios (ex.: fungos, bactrias e vrus). Os fungos geralmente
secretam um coquetel de enzimas hidrolticas, incluindo cutinase,
celulase, pectinase, poligalacturonase e proteases, e alternativamente,
ou em combinao, tambm formam um rgo de penetrao na
ponta de seu tubo germinativo, denominado apressrio (KNOGGE,
1996). Alm desses, j foi relatada a produo de inibidores de prote-
nas PR do tipo inibidores de quitinase, inibidores de glucanase e inibi-
dores de proteinases, em resposta ao relacionamento coevolucionrio.
Uma vez que o interior da planta tenha sido violado, microrga-
nismos precisam vencer o prximo obstculo, que a parede celu-
lar, rgida, baseada em celulose, ao redor de todas as clulas. Seja por
meio de enzimas, toxinas ou hormnios, patgenos bem-sucedidos
conseguem penetrar a parede celular e o interior das clulas vegetais.
Entretanto, j na membrana plasmtica, o microrganismo encontra
os receptores de superfcie extracelular capazes de reconhecer mol-
culas especficas de micrbios.
359
Como plantas se defendem de patgenos ?
Plantas se defendem de patgenos por meio de mecanismos de
defesa constitutivos e induzidos. A resistncia gentica, dentro do
conceito de fisiologia do parasitismo, pode ser definida como a habi-
lidade da hospedeira em prevenir ou retardar o estabelecimento do
patgeno em seus tecidos, num processo altamente dinmico, coorde-
nado e dependente da existncia de mecanismos constitutivos e (ou)
ps-formados. A ativao dos genes ou fatores responsveis pela indu-
o de sistemas de defesa ps-formados no momento, local e magni-
tude adequados, aps o reconhecimento do patgeno pela hospedeira,
constitui-se num sistema de mltiplos componentes em que seu nvel
de expresso resultado do somatrio das contribuies individuais
de diferentes mecanismos de defesa e o nvel de resistncia a soma
das contribuies de um nmero desses mecanismos de resistncia.
Mecanismos de defesa pr-formados ou constitutivos
Algumas defesas esto presentes na planta antes mesmo do con-
tato com o patgeno, e certas estruturas determinaro o avano ou
no desse microrganismo na planta. Teoricamente, existem duas
amplas categorias de defesa: a estrutural, morfolgica ou anatmica
e a bioqumica ou fisiolgica. Os mecanismos ou fatores estruturais
da planta atuam como barreiras fsicas, impedindo a entrada do pat-
geno e a colonizao dos tecidos, enquanto as reaes qumicas que
ocorrem nesses tecidos produzem substncias que se mostram txi-
cas ao patgeno ou criam condies adversas ao crescimento deste no
interior da hospedeira (PASCHOLATI; LEITE, 1994). O grau de envol-
vimento dos mecanismos estruturais e bioqumicos, pr ou ps-for-
mados, nas respostas de resistncia varia de acordo com a interao
patgeno-hospedeira e, numa mesma interao, em funo da idade
da planta, do rgo ou tecido afetado, do estado nutricional e das
demais condies ambientais (Figura 2).
360
Estruturais (Fsicos)
Atraso na penetrao
Ps-formados
- Halos
- Papilas
- Lignificao
- Camadas de cortia
- Camada de absciso
- Tiloses
Pr-formados
- Cutcula
- Estmatos
- Pilosidade
- Vasos condutores
- Fenis
- Alcaloides
- Lactonas insaturadas
- Glicosdeos fenlicos
- Glicosdeos cianognicos
- Fitotoxinas
Pr-formados
- Fitoalexinas
- Protenas PR
( ) Pathogenesis-Related
- Espcies reativas
de oxignio
- Outros
Ps-formados
Bioqumicos
Inibio do crescimento
Condies adversas para a sobrevivncia
Figura 2. Representao esquemtica de mecanismos de defesa estruturais
e bioqumicos pr-existentes em plantas e ps-formados durante interaes
com patgenos.
Mecanismos de defesa ps-formados ou induzidos
As respostas de defesa induzidas podem ser localizadas ou sistmi-
cas e so mais sofisticadas, pois envolvem o reconhecimento do pat-
geno pela planta hospedeira, a transduo de sinais e a expresso de
vrios genes de defesa (MONTESINOS et al., 2002), etapas bsicas do
processo de sinalizao desenvolvido pelas clulas vegetais para per-
ceber e responder a estmulos intrnsecos e (ou) extrnsecos ao orga-
nismo vegetal.
A ativao dos genes ou fatores responsveis pela induo de sis-
temas de defesa ps-formados no momento, local e magnitude ade-
quados, aps o reconhecimento do patgeno pela hospedeira, consti-
tui-se num sistema de componentes mltiplos cujo nvel de expresso
resultado do somatrio das contribuies individuais de diferentes
mecanismos de defesa (Figura 2). O processo de sinalizao desen-
volvido pelas clulas vegetais para perceber e responder aos estmu-
los intrnsecos e (ou) extrnsecos apresenta certa analogia com o dos
animais, embora possua caractersticas estruturais e funcionais pecu-
liares, e pode ser dividido em trs etapas bsicas: (1) o reconhecimento
ou percepo do sinal, realizado por receptores celulares especficos
ou inespecficos que reconhecem um determinado sinal (nesse caso,
361
molcula de origem do patgeno); (2) a transduo do sinal, que con-
siste na transmisso do mesmo para seu stio de ao dentro da clula,
podendo ser feita de forma direta ou indireta (via mensageiros secun-
drios, alteraes na fosforilao de protenas e atravs de protenas-G;
e (3) a traduo do sinal, que consiste na converso do sinal em res-
postas celulares especficas (CT et al., 1995), como, por exemplo,
a ativao de genes que induzem a sntese de protenas relacionadas
patognese (protenas-PR) e de certas enzimas regulatrias do pro-
cesso de produo de fitoalexinas (Figura 3).
Reconhecimento ou
Percepo do Sinal
Transduo do Sinal
Traduo do Sinal
Deteco do Patgeno:
receptores de PAMPs/MAMPs
Efetores, Eliciadores
Sinalizao:
MAP Cinases (MAPKs),
Fatores de Transcrio,
cido Saliclico (SA),
cido Jasmnico (JA),
Etileno (ET)
Resposta:
Espcies Ativas de Oxignio (AOS),
Resistncia Sistmica (SAR, ISR),
Transcrio de Genes relacionados
a Defesa (Protenas PR)
Hypersensitive Response (HR),
M
e
m
b
ra
n
a
P
la
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tic
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M
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Figura 3. Viso geral das etapas envolvidas na resistncia de plantas a pat-
genos.
Cronologicamente, a transduo de sinais para respostas de defesa
em plantas pode assim ser resumida, aps o reconhecimento do(s)
eliciador(es) pelo(s) receptor(es): abertura de canais de ons acidi-
ficao do citoplasma ativao de quinases no citoplasma ativa-
o do complexo NADPH-oxidase produo de espcies ativas de
oxignio ativao de outros mensageiros secundrios (cido sali-
clico, cido jasmnico e etileno) ativao de fatores de transcrio
transcrio de genes de defesa (protenas PR, enzimas de fitoalexi-
nas, lignificao de tecidos, calose e outros reforos da parede celular)
resistncia local (reao de hipersensibilidade) e, subsequentemente,
imunidade sistmica (resistncia sistmica adquirida ou resistncia
sistmica induzida) (GRANT; LAMB, 2006) (Figura 4).
362
Figura 4. Panorama geral das rotas de transduo de sinais ativando e coor-
denando as respostas de defesa da planta. ACC oxidase: cido 1-aminoci-
clopropano-1-carboxlico oxidase; BAG: glucosdio do cido benzico; cido
benzico; BA-2H: cido benzico-2-hidrolase; CA: cido cinmico; cGMP:
guanosina 5-monofosfato cclica; CHS: chalcona sintetase; EFE: enzima for-
madora de etileno; GP: glutationa peroxidase; GST: glutationa S-transferase;
HMGR: 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA redutase; HO
2
: radical hidroperoxil;
HPDase: hidroxiperxido dehidrase; interao de sinais; MAP: protena ati-
vada por mitgeno; NO: xido ntrico; OGA e OGA-R: fragmentos de oliga-
lacturondeos e respectivos receptores; OH
: radical hidroxil; PAL: fenilala-

nina amnia-liase; PGases: poligalacturonases; PM: membrana plasmtica;
SA: radical cido saliclico; SAG: glucosdio do cido saliclico; SIPK: pro-
tena cinase induzida pelo cido saliclico; WIPK: protena cinase induzida
por ferimento.
Fonte: Hammond-Kosack, K. & Jones, J. D. G. Chapter 21, Responses to Plant Pathogens. Pagina
1143. Editores. Buchanan, B.; Gruissem, W.; Jones, R. Titulo do livro: Biochemistry & Molecular
Biology of Plants, 1367 paginas, ano 2000.
363
Com base nessa Figura 4, protenas receptoras da planta (Rp) inter-
ceptam sinais derivados do patgeno ou dependentes de interao.
Esses sinais incluem produtos diretos ou indiretos dos genes Avr, con-
tato fsico e componentes gerais de cada organismo, tais como qui-
tina, enzimas e fragmentos da parede celular das plantas. Protenas
receptoras da planta podem ser ou no produtos dos genes R. Os even-
tos de sinalizao mais prximos do downstream no so conheci-
dos, mas envolvem quinases, fosfatases, protenas-G e fluxos de ons.
Vrios resultados distintos e rapidamente ativados so reconhecidos,
incluindo a produo de espcies reativas de oxignio (ROS) e xido
ntrico e a induo indireta da transcrio de genes de defesa (ou pos-
sivelmente genes de apoptose). A amplificao da resposta inicial de
defesa ocorre atravs da gerao de molculas sinalizadoras adicio-
nais, que so outras ROS, perxidos de lipdeos, cido benzico (BA),
cido saliclico (SA), cido jasmnico (JA) e etileno. Estes, por sua
vez, induzem outros genes relacionados defesa e modificam pro-
tenas de defesa e enzimas. Alteraes simultneas do estado redox
das clulas ou danos celulares ativam mecanismos pr-formados
para a proteo da clula (por exemplo, o ciclo de Halliwell-Asada,
a enzima superxido dismutase [SOD] localizada no plastdio e a
enzima catalase) e induzem genes que codificam vrios protetores
celulares. Estresses relacionados defesa tambm podem induzir a
morte celular. A comunicao entre as vrias rotas induzidas parece
coordenar as respostas. Em todos os processos de preparo das res-
postas de defesa, os mensageiros secundrios tm um papel funda-
mental. Os fitohormnios cido saliclico (AS), cido jasmnico (AJ) e
etileno (ET) esto envolvidos em uma rede de defesa refinada, eventu-
almente, levando a um timo portflio de respostas contra invasores.
Outros mensageiros secundrios importantes a serem abordados na
presente reviso so: protenas-G, inositol-1,4,5-trifosfato (IP
3
), cido
diacilglicerol (DAG), clcio (Ca
2+
), perxido de hidrognio (H
2
O
2
) e
xido ntrico (NO).
Como parte do resultado dessas estratgias, clulas de plantas sob
invaso muitas vezes desenvolvem uma resposta de hipersensibili-
dade (HR, hypersensitive response), que uma morte celular rpida loca-
lizada no stio de infeco; uma aumentada expresso de genes rela-
364
cionados com a defesa, p. ex.: genes PR (PR, pathogenesis-related), e a
exploso oxidativa (VAN LOON et al., 2006). Na resistncia de hospe-
deira, as respostas de defesa so, em geral, governadas por genes de
resistncia (R) nicos, cujos produtos cognatos reconhecem e inte-
ragem direta ou indiretamente com eliciadores especficos produzi-
dos por genes de avirulncia (Avr) de raas de patgenos especficos
(FLOR, 1971; MARTIM, 1999; HEATH, 2000).
Ao contrrio da resistncia de hospedeira, a qual tem sido bem estu-
dada, a resistncia de no-hospedeira opera sob mecanismos ainda
no bem entendidos, apesar dos enormes progressos nas cincias de
plantas. No est claro por que um patgeno altamente virulento sob
uma espcie de planta no-patognico em outras.
Alguns dos mecanismos j conhecidos que contribuem com a resis-
tncia de no-hospedeira so: (1) mecanismos de defesa passivos ou
pr-formados, os quais funcionam como uma barreira pr-formada,
presente na planta antes da tentativa de penetrao do patgeno; e (2)
mecanismos de defesa induzveis; (3) componentes de sinalizao de
defesa e (4) genes de resistncia de amplo espectro (MYSORE; RYU,
2004). O citoesqueleto de plantas possui papel significativo durante a
resistncia de no-hospedeira. J foi demonstrado que microfilamen-
tos de actina de plantas atuam na defesa contra a penetrao de fun-
gos e sua inativao levou a perda da resistncia de no-hospedeira a
inmeros fungos (KOBAYASHI et al., 1992; YUN et al., 2003). Alm
do citoesqueleto, metablitos secundrios e protenas antimicrobia-
nas tambm so partes da defesa pr-formada (MYSORE; RYU, 2004).
Resistncia de no-hospedeira a bactrias, fungos e oomicetos pode
ser de dois tipos: o Tipo I, que no apresenta qualquer sintoma visvel
(necrose do tipo HR), e o Tipo II, que est sempre associado a uma
necrose do tipo HR. O tipo de resistncia de no-hospedeira que pode
ser disparado contra um dado patgeno depende de ambas as espcies
que esto interagindo, da planta e do patgeno, de tal forma que uma
determinada espcie de planta no-hospedeira pode responder com a
resistncia Tipo I contra uma espcie de patgeno e com a do Tipo II
contra outra espcie. Por exemplo, Nicotiana benthamiana exibe uma
resistncia de no-hospedeira Tipo I contra Xantomonas campestris pv.
campestris e Tipo II contra P. syringae pv. tomato (PEART et al., 2002;
365
MYSORE; RYU, 2004; OH et al., 2006). Existem fortes similaridades
entre as respostas de resistncia de hospedeira e a de no-hospedeira,
no entanto ainda no est claro se o mesmo mecanismo est envolvido
na gerao dessas respostas de resistncia (Revisados por Mysore &
Ryu, 2004; Oh et al., 2006). Entretanto, por ser uma resistncia alta-
mente eficiente e durvel, tem sido sugerido que os mecanismos de
resistncia de no-hospedeira poderiam ser explorados para gerar
resistncia em plantas agriculturveis.
O sistema imune de plantas
Plantas, assim como animais, possuem mecanismos de defesa ina-
tos para resistirem infeco causada por micrbios. Uma resistncia
de planta eficiente est baseada em duas formas evolucionariamente
ligadas de Imunidade Inata. A primeira resposta imune de plantas
referida como Imunidade Disparada por PAMPs/MAMPs (IDP). Nela,
as plantas evoluram protenas PRRs (receptores de reconhecimento
especfico de padres) para reconhecer estruturas microbianas inva-
riantes conhecidas como eliciadores gerais, atualmente denominadas
padres moleculares associados patgenos (PAMPs) ou a micrbios
(MAMPs), j que todos os micrbios possuem PAMPs e no apenas
patgenos, os quais esto ausentes em seus hospedeiros eucariti-
cos. Alm desses, padres moleculares tambm tm sido associados
a herbvoros (HAMPs) em respostas de defesa disparadas por herb-
voros. Ainda, tecidos danificados liberam eliciadores endgenos de
plantas, atualmente referidos como DAMPs. Esses padres molecu-
lares associados a danos mediam respostas de defesa a herbvoros e
patgenos e, assim como os PAMPs/MAMPs, so reconhecidos por
PRRs localizados na membrana plasmtica.
Por outro lado, durante a coevoluo, fitopatgenos bem-sucedidos
adquiriram a habilidade de direcionar protenas efetoras para den-
tro das clulas da planta, as quais contribuem para sua virulncia e
podem mascarar/suprimir essa imunidade primria IDP, permitindo
o seu crescimento e o aparecimento de doena. Em contrapartida, cul-
tivares (individuais) de espcies de plantas adquiriram protenas R
(receptores de resistncia especfica) que reconhecem determinados
efetores, codificados por genes de avirulncia (Avr) de patgenos e
366
ditos fatores de virulncia, para restaurar a resistncia a doena. Esse
tipo de mecanismo mais especializado de defesa de plantas para detec-
tar patgenos referido como Imunidade Disparada por Efetores (IDE).
Reconhecimento de PAMPs e Imunidade Disparada por
PAMPs (IDP )
A imunidade disparada por PAMPs, imunidade basal, iniciada
aps o reconhecimento de estruturas microbianas conservadas pelos
receptores de superfcie celular de plantas (PRRs), e sua induo est
associada com sinalizao de MAP cinases, induo transcricional
de genes responsivos a patgenos, produo de espcies reativas de
oxignio e deposio de calose para fortalecer a parede celular no
stio de infeco, todos contribuindo para impedir o crescimento do
microrganismo tanto em plantas hospedeiras quanto no-hospedei-
ras (Figura 5).
De acordo com a demonstrao esquemtica da Figura 5, o reconhe-
cimento de PAMPs por PRRs dispara prontamente a imunidade basal,
que requer sinalizao por meio de cascata de MAPKs e reprograma-
o transcricional mediada por fatores de transcrio do tipo WRKY.
Patgenos secretam protenas efetoras, que so introduzidas por
algum mecanismo no citosol da planta, as quais tm como alvo mlti-
plas protenas hospedeiras para suprimir a resposta imune basal, per-
mitindo o crescimento do patgeno no apoplasto. Protenas de resis-
tncia de plantas, representadas pelos domnios NB-LRR, reconhecem
a atividade de efetores e restauram a resistncia por meio de uma res-
posta imune disparada por efetores. Um limitado acmulo de pat-
geno pode ocorrer antes das respostas imunes disparadas por efetores.
367
IDP
IDE
SUSCETIBILIDADE
Patgeno
Resposta
Imune
disparada
por PAMPs
PAMPs
Efetor
Protena R
(NB-LRR)
RESISTNCIA
MAPK
Cascata de
MAPKs
disparada
Ativao
de Genes
PRR
MAPK
Cascata de
MAPKs
disparada
Ativao
de Genes
Receptor
Membrana
Plasmtica
Membrana
Nuclear
Resposta
Imune
disparada
por Efetor
MAPK
Cascata de
MAPKs
disparada
Ativao
de Genes
RESISTNCIA
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SDE
Figura 5. Modelo para a evoluo do sistema imune de plantas. IDP: imuni-
dade disparada por PAMPs; PAMPs: padres moleculares associados a pat-
genos; PRR: receptores de reconhecimento de padres moleculares; MAPKs:
protenas ativadas por mitgenos (MAP) cinases; SDE: suscetibilidade dis-
parada por efetores; IDE: imunidade disparada por efetores; NB-LRR: dom-
nios de ligao a nucleotdeos (NB) e de repeties ricas em leucina (LRR ).
Adaptado do modelo descrito por Chisholm et al. 2006 e Bent e Mackey 2007
para resistncia a bactrias.
Muitos PAMPs tm sido identificados como essenciais para o meta-
bolismo ou para a penetrao e invaso de uma clula hospedeira e
so, portanto, amplamente conservados entre as diversas espcies de
patgenos (Tabela 1) (PARKER, 2003). Entre eles esto includos polis-
sacardeos de bactrias Gram-negativas, peptdeoglucanas de bactrias
Gram-positivas, flagelinas eubacteriais, bem como glucanas, quitinas
e protenas derivadas de parede celular de fungos (NRNBERGER;
BRUNNER, 2002).
A deteco de PAMPs pode ser extracelular ou intracelular e parece
ser um importante componente da resistncia de no-hospedeira e
serve como a primeira linha de defesa contra a presena de patgenos
em potencial. Diferentes PAMPs so muitas vezes percebidos pelos
distintos receptores de reconhecimento padro de superfcie celu-
368
lar e ativam convergentes vias de sinalizao intracelular em clulas
de plantas para obteno de imunidade de amplo espectro, tambm
conhecida como resistncia basal.
Tabela 1. Padres moleculares associados patgenos (PAMPs) e suas
atividades na induo de defesa em plantas.
PAMP Patgeno
Estrutura mnima
requerida para
ativao de defesa
Resposta biolgica
LPS
Xanthomonas
Pseudomonas
Lipdeo A?
Exploso oxidativa, produo
de enzimas antimicrobianas
em pimenta, fumo, aumento
do potencial de defesa da
planta infeco bacteriana.
Flagelina
Bactrias Gram
negativas
flg22 (fragmento
do amino terminal
da flagelina)
Induo das respostas de
defesa em Arabidopsis,
arroz e solanceas.
Fator de
elongao
(EF-Tu)
Bactrias Gram
negativas
Efl18 (fragmento
amino terminal
N-acetilado
do EF-Tu)
Induo das respostas
de defesa em Arabidopsis
e outras brssicas.
Harpina (HrpZ)
Pseudomonas
Erwinia
Indefinido
HR, induo de resposta de
defesa em vrias plantas,
resistncia sistmica adquirida.
Protena indutora
de necrose
Bacillus spp.
Fusarium spp.
Phytophthora spp.
Pythium spp.
Indefinido
defesa em vrias dicotiledneas.
Transglutaminase Phytophthora spp.
Motivo Pep-13
(epitopo exposto da
transglutaminase)
Induo de resposta de
defesa em salsa e batata.
Elicitinas
Phytophthora spp.
Pythium spp.
Indefinido
defesa em fumo e resistncia
sistmica adquirida.
Xylanase Trichoderma spp.
Pentapeptdeo
TKLGE (epitopo
exposto da xilanase)
HR, produo de etileno
em fumo e tomate.
Invertase Fermento
Peptdeo
N-manosilado
(fragmento da
invertase)
Ativao da rota dos
fenilpropanoides e produo
de etileno em tomate.
Continua
369
PAMP Patgeno
Estrutura mnima
requerida para
ativao de defesa
Resposta biolgica
-glucanas
Pyricularia oryzae
Phytophthora spp.
Algas marrons
Tetraglicosil glucitol,
hepta- -glucosdeo
ramificado, oligo-
-glucosdeo linear
Induo de resposta de defesa
em legumes, fumo e arroz.
Fucanas
sulfatados
Algas marrons
Oligossacarideos
de fucanas
Induo de resposta
de defesa em tomate
e resistncia sistmica
adquirida infeco viral.
Quitina Vrios fungos
Oligossacardeos
de quitina (grau de
polimerizao > 3)
Induo de resposta de defesa
em tomate, Arabidopsis,
arroz, trigo e cevada.
Ergosterol Vrios fungos Indefinido
Induo de fluxo de
ons em tomate.
Cerobrosdios
A,C
Magnaporthe spp. Base esfingoide
Produo de fitoalexinas
em arroz.
Glicoprotenas
fngicas
Vrios fungos N-acetil-glicosamina
Induo de resposta de
defesa em salsa.
Adaptado de Nrnberger e Lipka, 2005.
Embora um crescente nmero de componentes do tipo PAMPs
tenha sido identificado, os receptores em potencial para a maioria
deles ainda so desconhecidos. Entre os receptores de PAMPs de
plantas publicados, citam-se o receptor de flagelina em Arabidopsis
(AtFLS2), a protena de ligao -glucana (GnGBP) e o receptor de
xilanase (LeEIX) em arroz (KUNZE, 2005).
Reconhecimento de efetores e Imunidade Disparada por
Efetores (IDE )
A imunidade disparada por efetores envolve o reconhecimento
direto ou indireto por protenas R das muitas protenas microbia-
nas usadas para subverter IDP (Figura 5). Esse reconhecimento de
um efetor pelas protenas NB-LRR pode ser direto, explicado pelo sis-
tema gene-a gene, em que protenas R reconhecem diretamente pro-
dutos de genes AVR, ou indireto, explicado pela Hiptese Guarda,
em que protenas R estariam guardando, como um sensor, impactos
370
sobre outras protenas para responder (JONES; TAKEMOTO, 2004).
No reconhecimento indireto, protenas R reconhecem efetores liga-
dos a protenas de planta chamadas alvos de efetores de patgenos.
A ativao de resistncia mediada por protena R tambm suprime
o crescimento do patgeno, mas no antes que o invasor tenha tido
uma oportunidade para proliferao limitada. No surpreendente
que patgenos tenham adaptado efetores para interferirem com a
Imunidade Disparada por Efetores, fenmeno bem conhecido sob
condies de campo como quebra da resistncia.
Os efetores secretados por patgenos so introduzidos no citosol da
planta hospedeira por algum sistema de secreo, tal como o sistema
de secreo Tipo III, a exemplo de algumas bactrias (CHISHOLM et
al., 2005), ou sistema de secreo baseado em motivos presentes na
sequencia primria do efetor, a exemplo dos motivos RXLR-EER de
Phytophthora spp. (KAMOUN, 2006). Na Tabela 2, contm uma com-
pilao de efetores caracterizados bioquimicamente e suas protenas
R correspondentes.
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Tabela 2. Atividade enzimtica de efetores caracterizados bioquimicamente e eliciadores selecionados .
Efetores Organismo Funo Bioqumica Alvo na planta Gene R Fentipo Referncia
AvrRpt2 Pseudomonas syringae Protease* RIN4 RPS2
Quebra RIN4, interfere na defesa
mediada por genes R, inibe a
defesa basal, e manipula a rota
do cido jasmnico (AJ)
1
AvrB Pseudomonas syringae RIN4 RPM1
Fosforilao do RIN4, manipula a rota do
AJ
1
AvrRpm1 Pseudomonas syringae RIN4 RPM1 Fosforilao do RIN4, inibe a defesa basal 1
HopPtoD2 Pseudomonas syringae Fosfatase* Suprime a HR e a expresso de PRP** 1
AvrPphB Pseudomonas syringae Protease* PBS1 RPS5 Quebra a PBS1, manipula a rota do AJ 1
AvrPtoB Pseudomonas syringae
E3 ligase, uma enzima
conjugada a ubiquitina
Pto 2
XopD Xanthomonas campestris Cistena protease* SUMO 1
AvrXv4 Xanthomonas campestris Cistena protease SUMO XV4 1
AvrBsT Xanthomonas campestris Cistena protease SUMO 1
Avr2 Cladosporium fulvum Inibidor de Protease Rcr3 Cf-2 Inibe a atividade de RCR3 3
Avr4 Cladosporium fulvum Ligao quitina* Chitinase Cf-4 4
Avr9 Cladosporium fulvum Cf-9 5
EPI10 Phytophthora infestans
Inibidor de protease
Kazal-like*
Subtilisina A,
P69B subtilase
Interage e interfere na PRP**
P69B de tomate e subtilisina A
6
EPI1 Phytophthora infestans
Inibidor de protease
Kazal-like*
P69B subtilase
Interage e interfere na
PRP P69B de tomate
7
Ecp2 Cladosporium fulvum Cf-ECP2 5
PWL1 e
PWL2
Magnaporthe grisea 8
Continua
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Efetores Organismo Funo Bioqumica Alvo na planta Gene R Fentipo Referncia
AVR2-YAMO Magnaporthe grisea 8
AvrM Melampsora lini M 9
AvrP4 Melampsora lini P4 9
AvrP123 Melampsora lini
P1, P2,
P3
9
Nip1 Phynchosporium secalis Rrs1 8
AvrL567 Melampsora lini
L5, L6,
L7
10
ATR1
NdWsB
Hyaloperonospora
parasitica
RPP1 11
ATR13
Hyaloperonospora
parasitica
12
Avr3a Phytophthora infestans R3a 13
Avr1b Phytophthora infestans Rps1b 14
Avr-Pita Magnaporthe grisea Metaloprotease Pi-ta 15
*Funo bioqumica demonstrada in vitro; **PRP: protena relacionada patognese. ***Referncias: (1) Revisado por Mudgett (2005): (2) Janjusevic
et al., 2005: (3) Rooney et al., 2005: (4) Van den Burg et al., 2003: (5) Revisado por Rivas & Thomas (2005): (6) Tian et al., 2005: (7) Tian et al., 2004:
(8) Revisado por Lauge & De Wit (1998): (9) Catanzariti et al, 2005: (10) Dodds et al., 2004: (11) Rehmany et al., 2005: (12) Allen et al., 2004: (13)
Armstrong et al., 2005: (14) Shan et al., 2004: (15) Jia et al., 2000.
Fonte: Resende et al., 2007, adaptado de Chisholm et al., 2006.
373
Jones e Dangl (2006) e Bent e Mackey (2007) representaram a evo-
luo do sistema imune de plantas em quatro etapas (Figura 6). Na
primeira fase, PAMPs/MAMPs so reconhecidos por PRRs, resul-
tando na IDP que pode impedir futura colonizao. Na segunda fase,
patgenos bem-sucedidos secretam efetores que contribuem para a
virulncia do patgeno e podem interferir com a IDP. Isso resulta na
suscetibilidade disparada por efetor (SDE). Na terceira fase, um dado
efetor especificamente reconhecido direta ou indiretamente por uma
das protenas R contendo domnios NB-LRR (nucleotide binding-leucin
rich repeat), resultando na imunidade disparada pelo efetor (IDE). A IDE
uma resposta de IDP amplificada e acelerada, resultando em uma
resistncia a doena e, normalmente, uma resposta de morte celu-
lar hipersensitiva (HR) no stio da infeco. Na quarta fase, a seleo
natural direciona patgenos para se esquivarem da IDE por meio de
mudana ou diversificao do gene efetor reconhecido por uma pro-
tena R, ou pela aquisio de efetores adicionais capazes de suprimir
a IDE. A seleo natural resulta em novas especificidades de modo
que a IDE possa ser eliciada novamente.
PAMPs
Efetores do
Patgeno Efetores do
Patgeno
Avr-R Avr-R
Limiar para HR
Limiar para
Resistncia Efetiva
SDE SDE IDE IDE Alta IDP
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D
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Baixa
Figura 6. Modelo em ziguezague do rendimento quantitativo da evoluo do
sistema imune de plantas, proposto por Jones e Dangl (2006).
374
No esquema mostrado na Figura 6, a amplitude mxima de resis-
tncia e suscetibilidade proporcional a [IDP SDE + IDE], e a IDE
ultrapassa o limiar de induo da morte celular hipersensitiva (HR).
Os isolados do patgeno so selecionados para aqueles que perderam
o efetor (rseo) que levou a primeira IDE, e talvez tenham ganhado
novos efetores atravs de fluxo gnico horizontal (em verde) os quais
podem ajudar patgenos a suprimir a IDE. A seleo favorece novos
alelos NB-LRR em plantas que podem reconhecer um dos efetores
recm-adquiridos, resultando novamente em IDE.
Nesse contexto, a resistncia basal pode ser definida como aquela
ativada por patgenos virulentos sobre plantas suscetveis. con-
siderada a Imunidade Disparada por PAMPs menos os efeitos da
Suscetibilidade Disparada por Efetores, ou pode ser ainda uma SDE
fraca eliciada pelo fraco reconhecimento de efetores. Portanto, uma
definio mais acurada poderia ser resistncia basal = IDP + fraca
IDE SDE (JONES; DANGL, 2006).
Dessa forma, possvel notar que plantas, apesar de no possurem
clulas mveis para se defenderem, nem um sistema imune adapta-
tivo, de memria, como ocorre em animais, elas contam com a imu-
nidade inata de cada clula e com sinais sistmicos que emanam de
stios de infeces.
Consideraes finais
Nos ltimos anos, foi possvel observar um incremento em nossos
conhecimentos a cerca da natureza, elicitao e regulao de defesas
de plantas a micrbios, e muitas descobertas so aplicveis ao nosso
entendimento da resistncia de no-hospedeira. Entretanto, a identi-
ficao inequvoca de caractersticas que realmente impedem o desen-
volvimento de patgenos em uma determinada planta no-hospedeira
ainda rara, assim como para plantas hospedeiras. Portanto, novas
questes esto sempre surgindo na elucidao do Dogma Central
da resistncia de plantas a doenas e sobre quais seriam as estratgias
mais eficientes para se obter visando resistncia durvel e de amplo
espectro contra micrbios em espcies economicamente importantes.
Em virtude da conhecida durabilidade da resistncia de no-hospe-
deiras ao longo dos tempos, comumente especula-se que essa resis-
375
tncia possa ser explorada por melhoristas de plantas para aumen-
tar a resistncia a doenas em espcies hospedeiras. Por engenharia
gentica, estudos tm focalizado o uso de genes R ou genes de defesa
oriundos de espcies heterlogas, ou combinaes deles. Ou seria
melhor o uso de genes de origem do patgeno? A superexpresso de
individuais componentes de defesa no especficos em plantas trans-
gnicas tem sido testada com vrios graus de sucesso, incluindo pept-
deos antimicrobianos nativos ou engenheirados. Entre as novas estra-
tgias para se obter resistncia a doena de amplo espectro est o uso
de genes de eliciadores no especficos de origem de patgenos sob
comando de promotores induzveis por patgenos.
De qualquer forma, a elucidao de mecanismos que controlam a
evoluo de interaes planta-micrbios ser enormemente impac-
tada pelas novas tecnologias, que incluem sequenciamento rpido de
genomas e o desenvolvimento de mtodos computacionais para ana-
lisar a riqueza e a abundncia de informao genmica. Por fim, um
completo entendimento da base molecular da resistncia de plantas
a doenas permitir a aplicao dessas novas descobertas para cons-
truir plantas que contenham novas combinaes de vias de resistn-
cia a doenas que sejam durveis e reconheam um amplo espec-
tro de patgenos. Estudos concomitantes que empregam tecnologias
ps-genmicas, incluindo estratgias de sistemas biolgicos, iro per-
mitir o entendimento da expresso de todos os genes e protenas em
uma planta que so simultaneamente expressos durante a expresso
de resistncia. Essas tecnologias iro permitir nosso entendimento
sobre as interaes complexas que ocorrem entre vias mltiplas que
so expressas durante a resistncia.
Referncias
AGRIOS, G. N. Plant Pathology. 4
th
ed. California: Academic Press, 1997. 635 p.
ALLEN, R. L.; BITTNER-EDDY, P. D.; GRENVILLE-BRIGGS, L. J.; MEITZ, J.
C.; REHMANY, A. P.; ROSE, L. E.; BEYNON, J. L. Host-parasite coevolutionary
conflict between Arabidopsis and downy mildew. Science, v. 306, p. 1957-60, 2004.
376
ARMSTRONG, M. R.; WHISSON, S. C.; PRITCHARD, L.; BOS, J.I .; VENTER, E.;
AVROVA, A. O.; REHMANY, A. P.; BOHME, U.; BROOKS, K.; CHEREVACH, I.
An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding
a protein that is recognized in the host cytoplasm. Proceedings of the National
Academy of Science of USA, v. 102, p. 7766-71, 2005.
BENT, A. F.; MACKEY, D. Elicitors, effectors and r genes. Annual Review of
Phytopathology, v. 45, p. 399-436. 2007.
CATANZARITI, A. M.; DODDS, P. N.; LAWRENCE, G. J.; AYLIFFE, M. A.; ELLIS,
J. G. Haustorially expressed secreted proteins from flax rust are highly enriched for
avirulence elicitors. Plant Cell, v. 18, p. 243-56. 2005.
CHISHOLM, S. T.; DAHLBECK, D.; KRISHNAMURTHY, N.; DAY, B.;
SJOLANDER, K.; STASKAWICZ, B. J. Molecular characterization of proteolytic
cleavage sites of the Pseudomonas syringae effector AvrRpt2. Proceedings of the
National Academy of Science of USA, v. 102, p. 2087-92, 2005.
CT, F.; CHEOG, J. J.; ALBA, R.; HAHN, M. G. Characterization of binding
proteins that recognize oligoglucoside eliciadors of phytoalexins in soybean.
Physiologia Plantarum, v. 93, p. 401-10. 1995.
DODDS, P. N.; LAWRENCE, G. J.; CATANZARITI, A. M.; AYLIFFE, M. A.; ELLIS,
J. G. The Melampsora lini AvrL567 avirulence genes are expressed in haustoria and
their products are recognized inside plant cells. Plant Cell, v. 16, p. 755-68, 2004.
FLOR, H. Current status of the gene-for-gene concept. Annual Review of
Phytopathology, v. 9, p. 275-96, 1971.
GRANT, M.; LAMB, C. Systemic immunity. Current Opinion in Plant Biology v. 9,
p. 414-20. 2006.
HAMMOND-KOSACK, K. E.; JONES, J. D. G. Responses to plant pathogens.
In: BUCHANAM, B. B.; GRUISSEM, W.; JONES, R. L. (Ed.). Biochemistry and
molecular biology of plants. Rockville, Maryland: APS Press, 2000 p. 1102-56
HEATH, M. C. Nonhost resistance and nonspecific plant defenses. Current
Opinion in Plant Biology, v. 3, p. 315319, 2000.
JANJUSEVIC, R.; ABRAMOVITCH, R. B.; MARTIN, G. B.; STREBBINS, C.
E. 2005. A bacterial inhibitor of host programmed cell death defenses is an E3
ubiquitin ligase. Science, v. 311, p. 222-6.
JONES, D. A.; TAKEMOTO, D. Plant innate immunity: direct and indirect
recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Current
Opinion in Immunology, v. 16, p. 4862, 2004.
JONES, J. D. G.; DANG, L. J. L. The plant immune system. Nature, v. 444 n. 16, p.
323-329. 2006.
JONES, J. D. G.; DANGL, J. L. The plant immune system. Nature, v. 444, n. 16,
232-239, 2006.
377
KAMOUN, S. A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes.
Annual Review Phytopathology, v. 44, p. 41-60. 2006.
KNOGGE W. Fungal infection of plants. Plant Cell, v. 8, p. 1711-1722, 1996.
KOBAYASHI, et al. Recognition of a pathogen and a nonpathogen by barley
coleoptile cells: III: responses of microtubules and actin filaments in barley
coleoptile cells to penetration attempts. Canadian Journal of Botany, v. 70, p. 1815-
1825, 1992.
KUNZE, G. U. Characterization of a novel bacterial PAMP: elongation factor tu
- and its role in Arabidopsis thaliana defense and immunity. 2005. 168 f. (Ph.D.
Thesis). Univerity of Basel, Sua.
LAUGE, R.; DE WIT, P. J. G. M. Fungal avirulence genes: structure and possible
functions. Fungal Genetic and Biology, v. 24, p. 285-97, 1998.
MARTIN, G. B., Functional analysis of plant disease genes and their downstream
effectors. Current Opinion in Plant Biology, v. 2, p. 273279, 1999.
MONTESINOS, E.; BONATERRA A.; BADOSA, E.; FRANCES, J. ALEMANY
J.; LLORENTE I.; MORAGREGA, C. Plant-microbe interactions and the new
biotechnological methods of plant disease control. International Microbiology, v. 5,
p. 169175. 2002.
MUDGETT, M. B. New insights to the function of phytopathogenic bacterial type
III effectors in plants. Annual Review of Plant Biology, v. 56, p. 509-31, 2005.
MYSORE, K. S.; RYU, C. Nonhost resistance: how much do we know? TRENDS in
Plant Science, v. 9 n. 2, p. 97-104, 2004.
NMBERGER, T.; LIPKA, V. Non-host resistance in plants: new insights into an
old phenomenon. Molecular Plant Pathology, v. 6, p. 335345. 2005.
NRNBERGER, T.; BRUNNER, F. Innate immunity in plants and animals:
emerging parallels between the recognition of general elicitors and pathogen
associated molecular patterns. Current Opinion in Plant Biology, v. 5, p. 318-24,
2002.
OH, S.; LEE, S.; CHUNG, E.; PARK, J.; MEE; Y., SEUNG, H.; RYU, C.; CHOI, D.
Insight into types I and II nonhost resistance using expression patterns of defense-
related genes in tobacco. Planta, v. 223, n. 5, p. 1101-1107, 2006.
PARKER, J. E. Plant recognition of microbial patterns. Trends in Plant Science, v.
8, p. 245-7, 2003.
PASCHOLATI, S. F.; LEITE, B. Mecanismos bioqumicos de resistncia s
doenas. Reviso Anual de Patologia de Plantas, n. 2, p. 1-51. 1994.
PEART, J. R.; LU, R; SADANANDOM, A. et al. Ubiquitin ligase-associated protein
SGT1 is requerid for host and non-host disease resistance in plants. Proceedings of
the National Academy of Sciences, v. 99, p. 10865-10869. 2002.
378
REHMANY, A. P.; GORDON, A.; ROSE, L. E.; ALLEN, R. L.; ARMSTRONG, M.
R.; WHISSON, S. C.; KAMOUN, S.; TYLER, B. M.; BIRCH, P. R. J.; BEYNON, J. L.
Differential recognition of highly divergent downy mildew avirulence gene alleles
by RPP1 resistance genes from two Arabidopsis lines. Plant Cell, v. 17, p. 1839
1850, 2005.
RIVAS, S.; THOMAS, C.M. Molecular interactions between tomato and the leaf
mold pathogen Cladosporium fulvum. Annual Review of Phytopathology v.43, p.395-
436. 2005.
ROONEY, H. C.; VANT KLOOSTER, J. W.; VAN DER HOORN, R. A.; JOOSTEN,
M. H.; JONES, J. D.; DE WIT, P. J. G. M. Cladosporium Avr2 inhibits tomato Rcr3
protease required for Cf-2-dependent disease resistance. Science, v.308, p. 1783-6.
2005.
SHAN, W.; CAO, M.; LEUNG, D.; TYLER, B. M. The Avr1b locus of Phytophthora
sojae encodes an elicitor and a regulator required for avirulence on soybean plants
carrying resistance gene Rps1b. Molecular Plant-Microbe Interactions, v. 17, p.
394-403. 2004.
THORDAL-CHRISTENSEN H. Fresh insights into processes of nonhost
resistance. Current Opinion in Plant Biology, n. 6, v. 4, p. 351-7, 2003.
TIAN, M.; BENEDETTI, B.; KAMOUN, S. A Second kazal-like protease
inhibitor from Phytophthora infestans inhibits and interacts with the apoplastic
pathogenesis-related protease P69B of tomato. Plant Physiology, v. 138, p. 1785
1793, 2005.
TIAN, M.; HUITEMA, E.; DA CUNHA, L.; TORTO-ALALIBO, T.; KAMOUN, S.
A Kazal-like extracellular serine protease inhibitor from Phytophthora infestans
targets the tomato pathogenesis-related protease P69B. Journal Biology Chemistry,
v. 279, p. 2637026377, 2004.
VAN DEN BURG, H. A.; WESTERINK, N.; FRANCOIJS, K. J.; ROTH, R.;
WOESTENENK, E.; BOEREN, S.; DE WIT, P. J. G. M.; JOOSTEN, M. H.;
VERVOORT, J. Natural disulfide bond-disrupted mutants of AVR4 of the tomato
pathogen Cladosporium fulvum are sensitive to proteolysis, circumvent Cf-4-
mediated resistance, but retain their chitin binding ability. Journal of Biological
Chemistry, v. 278, p. 27340-6. 2003.
VAN LOON, L. C.; REP, M.; Pieterse, C. M. J. Significance of Inducible Defense-
related Proteins in Infected Plants. Annual Review Phytopathology, v. 44, p. 135-
162, 2006.
YUN et al. Loss of actin cytoeskeletal function and EDS1 activity, in combination,
severely compromises non-host resistance in Arabidopsis against wheat powdery
mildew. Plant Journal, v. 34, p. 768-777. 2003.
381
Controle biolgico de
insetos-praga
Roberto Teixeira Alves
Introduo
De uma maneira geral, segundo Gallo et al. (2002), os meios de con-
trole de insetos-praga so os seguintes:
Mtodos legislativos: quarentena, medidas obrigatrias, fiscali-
zao do comrcio.
Mtodos mecnicos: barreiras, esmagamento, sulcos armadi-
lha, frasco caa-mosca, etc.
Mtodos culturais: rotao, arao, poca de plantio, destruio
de restos de cultura, cultura no limpo, adubao, poda, irriga-
o, plantio direto.
Mtodos de controle fsico: fogo, drenagem, inundao, som,
temperatura, armadilhas luminosas, radiao, etc.
Resistncia de plantas: no preferncia ou antixenose, antibiose
e tolerncia.
Mtodos de controle por comportamento: atraentes, repelen-
tes e feromonas.
Mtodo qumico: inseticidas, fungicidas, nematicidas e herbi-
cidas.
Mtodos de controle biolgico: patgenos, parasitoides e pre-
dadores.
Como se observa, o controle biolgico um dos vrios mtodos
existentes de controle de insetos-praga.
importante entender bem o conceito de controle biolgico e que
existem vrias formas de conceitu-lo; no entanto, neste captulo, ele
ser conceituado como o mtodo que consiste no controle de pragas
por meio de inimigos naturais, que so os organismos que mantm
os nveis de populao dessas pragas em equilbrio. O controle bio-
lgico deve ser considerado como um componente de programas de
382
Manejo Integrado de Pragas (MIP), ao lado de outros mtodos de con-
trole de insetos e caros (GALLO et al., 2002) citados anteriormente.
Como exemplos de organismos denominados inimigos naturais,
podem-se citar os vrus, bactrias, fungos, nematoides, caros, ara-
nhas, insetos, peixes, anfbios, rpteis, aves e mamferos, em que se
inclui o homem.
Alguns organismos possuem maior potencial para o controle bio-
lgico de pragas, como os fungos, bactrias, vrus, alguns predadores
e insetos parasitoides, por ser possvel multiplic-los em maior escala
em laboratrios e ser fcil aplic-los ou liber-los no campo.
Pode-se entender como predadores os organismos benficos, ini-
migos naturais, que geralmente consomem mais de uma presa para
completarem seu desenvolvimento, podendo atacar uma grande varie-
dade de insetos-praga. O predador pode mudar sua preferncia ali-
mentar de acordo com a abundncia populacional da praga (GALLO
et al., 2002; VAN DRIESCHE; BELLOWS, 1996). So exemplos: ara-
nhas, peixes, anfbios, rpteis, aves, mamferos e insetos predado-
res como Cycloneda sanguinea, Nabis spp., Calosoma granulatum, etc.
J os parasitoides so insetos que necessitam, na maioria das vezes,
de apenas um indivduo do hospedeiro para completar o seu desen-
volvimento. Eles matam seu hospedeiro. Geralmente so mais espe-
cficos que os predadores (GALLO et al., 2002; VAN DRIESCHE;
BELLOWS, 1996). So exemplos: Cotesia flavipes, Trissolcus basalis,
Neodusmetia sangwanis, Trichogramma pretiosum, etc.
Os patgenos so microorganismos causadores de doenas em
insetos; neles se desenvolvem com certa rapidez, terminando por
causar a morte da praga. Alguns patgenos so facultativos e outros
so obrigatrios. Os facultativos se desenvolvem tanto no inseto-hos-
pedeiro como em meio de cultura artificial. So exemplos: fungos
como Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, Nomuraea rileyi,
bactria como Bacillus thuringiensis, etc. Os obrigatrios, por sua vez,
s se desenvolvem no inseto-hospedeiro, como o Baculovrus anticar-
sia e o B. erinnys (ALVES, 1986).
Segundo Gallo et al. (2002), sempre que se trabalha com controle
biolgico de insetos-praga, deve-se adotar os seguintes procedimen-
tos: introduo, conservao e multiplicao dos inimigos naturais no
383
Captulo 13 Controle biolgico de insetos-praga
ambiente. Cada um desses procedimentos representar um tipo de
controle biolgico: o controle biolgico clssico, o natural e o aplicado.
O controle biolgico clssico consiste na importao e colonizao
de parasitoides ou predadores, visando ao controle de pragas exticas
ou nativas. As liberaes desses inimigos naturais eram ou so ino-
culativas, em pequeno nmero de insetos, como medida de controle
no longo prazo mais utilizada em culturas perenes ou semiperenes
(GALLO et al., 2002; VAN DRIESCHE; BELLOWS, 1996). Os ento-
mopatgenos tambm podem ser introduzidos em pequena escala,
dentro de um programa de controle biolgico clssico.
O controle biolgico natural refere-se populao de inimigos natu-
rais que ocorre naturalmente. Visa a uma conservao dos inimigos
naturais que devem ser preservados e at aumentados por meio de
manipulao do seu ambiente de alguma forma favorvel como o
uso de inseticidas seletivos, uso de doses reduzidas de agrotxicos,
manuteno do habitat e de fontes de alimentao para esses inimigos
naturais (GALLO et al., 2002; VAN DRIESCHE; BELLOWS, 1996). Os
entomopatgenos tambm podem ser conservados por meio da mani-
pulao adequada do ambiente, conforme explicado anteriormente.
O controle biolgico aplicado trata de liberaes de parasitoides ou
predadores, aps sua produo massal em laboratrio, visando redu-
o rpida da populao da praga para seu nvel de equilbrio (GALLO
et al., 2002; VAN DRIESCHE; BELLOWS, 1996). nele que se encai-
xam, com maior intensidade, os patgenos mais utilizados como pro-
dutos microbianos no controle de pragas.
Somente os patgenos e os parasitos sero enfatizados neste cap-
tulo, por serem mais fceis de ser multiplicados e utilizados em maior
escala no Brasil.
Vantagens e desvantagens do controle
biolgico de insetos-praga
Segundo Alves (1986) e Gallo et al. (2002), existem vantagens e des-
vantagens em se utilizar o controle biolgico, assim como acontece ao
se utilizar outros mtodos de controle, como o qumico.
384
Vantagens
Apresenta especificidade na maioria das vezes, isto , controla ape-
nas a praga visada sem afetar outros insetos e inimigos naturais.
Apresenta capacidade de multiplicao e disperso natural no
campo.
Os patgenos provocam efeitos secundrios benficos: dimi-
nuem a oviposio e a viabilidade dos ovos e aumentam a sen-
sibilidade da populao da praga a outros agentes biolgicos e
qumicos.
Controle mais duradouro.
Liberao simples no campo ou aplicao com equipamento
convencional.
No causa poluio ou toxicidade.
Pode ser utilizado em cultivos orgnicos, que produzem alimen-
tos mais saudveis e um mercado que est em franca expanso.
Os insetos-praga dificilmente podero se tornar resistentes aos
patgenos ou ao ataque de predadores e de parasitos.
Normalmente so mais baratos que os produtos qumicos.
Desvantagens
A especificidade no permite que o inimigo natural tenha um
largo espectro de ao sobre diferentes pragas ao mesmo tempo.
Determinados patgenos necessitam de condies climticas
favorveis.
Exigem maiores cuidados no armazenamento.
Exige certo grau de conhecimento de tecnologia, s vezes de dif-
cil implementao, por causa do nvel cultural de alguns agri-
cultores.
Entomopatgenos
Os entomopatgenos so os microrganismos causadores de doenas
em insetos e alguns deles podem ser multiplicados em laboratrio e
aplicados racionalmente no campo ou em casas de vegetao, visando
baixar a populao de insetos-praga a nveis economicamente no pre-
385
judiciais (ALVES, 1986). Vale lembrar que eles devem sempre ser uti-
lizados como parte de um programa de manejo integrado de pragas.
Entomopatgenos a base de fungos, bactrias e vrus so os mais
utilizados no Brasil e sero comentados neste captulo.
Desenvolvimento da doena no inseto-praga
Alguns conceitos e informaes so necessrios para uma com-
preenso maior de como os entomopatgenos agem sobre as pragas
e como os fatores ambientais e fatores biticos afetam o desenvolvi-
mento da doena sobre a praga visada.
Pode-se conceituar epizootia como a ocorrncia de uma doena, de
forma generalizada, na populao de uma ou mais espcie de inseto
em um determinado ambiente.
A epizootiologia, segundo Alves (1986), envolve os estudos dos fato-
res que determinam e controlam a dinmica de doenas em popula-
es de insetos.
O desenvolvimento de uma doena em uma populao de insetos
pode ser demonstrado por uma curva denominada curva epizotica
(TANADA, 1963). Segundo o mesmo autor, a fase pr-epizotica se
caracteriza por um baixo nmero de hospedeiros doentes. A fase epi-
zotica se caracteriza por elevado ndice de doena em consequncia
da multiplicao e disseminao do inculo produzido nos focos pri-
mrios, e a ps-epizotica se caracteriza pela diminuio do nmero
de insetos atacados em relao fase anterior, conforme a Figura 1,
adaptada de Alves (1986).
386
60
50
40
(%)
30
20
10
M
o
r
t
a
l
i
d
a
d
e
Abr. Jun. Ago. Out. Dez. Fev.
Acme de
Adultos
Epizotica
Pr-epizotica
Ps-
epizotica
Adultos
Ninfas
Figura 1. Nmero de adultos e ninfas de Mahanarva posticata contaminadas
por Metarhizium anisopliae nas condies do Nordeste do Brasil, mostrando
as diferentes fases da doena .
Fonte: Alves (1986).
Segundo Tanada (1963), os fatores que determinam a ocorrncia
ou no de uma epizootia podem ser classificados como biticos ou
abiticos.
Fatores biticos
a) Condies do hospedeiro: quanto maior a densidade, a capa-
cidade de migrao e a predisposio do hospedeiro mais fcil
ser a ocorrncia de epizootias.
b) Condies dos patgenos: alta virulncia, alta capacidade de
reproduo, alta capacidade de sobrevivncia e de dissemina-
o no ambiente so caractersticas importantes que o pat-
geno necessita apresentar para que ocorram epizootias.
387
c) As vias de infeco de alguns patgenos, segundo Alves (1998),
so as seguintes:
Fungos normalmente penetram no inseto atravs do tegu-
mento, com atuao enzimtica ou atravs da presso mec-
nica exercida pelo tubo germinativo e apressrio.
Bactrias normalmente penetram via oral, com o inseto
as ingerindo juntamente com o alimento.
Vrus normalmente penetram via oral, com o inseto os
ingerindo juntamente com o alimento.
d) Potencial de inculo: o nmero de propgulos viveis sobre
os rgos suscetveis dos hospedeiros capaz de iniciar o pro-
cesso-doena (ALVES, 1998).
Na Tabela 1 (MOSCARDI; CORSO, 1980), pode-se observar como
a dose do patgeno influencia na mortalidade e no tempo necess-
rio para matar a praga. Quanto maior a dose, maior a mortalidade e
menor o tempo necessrio para que isso ocorra, porm deve-se ava-
liar a dose que seja eficiente e mais econmica para baratear a produ-
o e o valor do produto final, a fim de que seja economicamente vi-
vel e utilizado em grande escala pelo produtor rural.
Tabela 1. Mortalidade de Anticarsia gemmatalis em relao a diferen-
tes doses de Baculovirus anticarsia aplicadas a campo. Embrapa Soja.
Londrina, PR. 1980.
Dose de vrus
(1)
(LE/ha) Mortalidade
(2,3)
(%) Tempo letal mdio (dias)
0,0 2,60 e -
10 72,40 d 8,13
20 79,30 cd 7,57
40 84,60 c 7,23
80 93,10 b 6,67
160 98,90 a 6,68
320 100,00 a 6,59
1
1LE = 1 lagarta grande (> 2,5 cm) morta pelo vrus ou cerca de 1,3 x 10
9
poliedros do vrus.
2
Mdia de 3 repeties = 30 lagartas (3 - 4 nstar)/repetio.
3
Mdias seguidas pela mesma letra no diferem estatisticamente entre si (Duncan a 5%).
Fonte: Moscardi e Corso (1980)
Ao se analisar a Tabela 1, pode-se dizer que a dose de 80 LE/ha
bastante eficiente e mata a lagarta da soja em 6,67 dias, que se asse-
388
melha ao resultado obtido na dose mais alta. Por isso, pode ser a dose
escolhida para uso em maior escala.
Fatores abiticos
a) Temperatura: um dos fatores de grande importncia e atua
sobre os patgenos afetando principalmente a estabilidade e,
subsequentemente, sua aplicao e eficincia no campo.
Pode-se observar na Figura 2 a faixa mdia de temperatura favor-
vel aos patgenos.
Faixa favorvel
aos insetos
Desfavorvel
Hibernao
permanente
Hibernao
temporria
Desfavorvel
Favorvel a
preservao
Favorvel aos
patgenos
Fungos e Vrus
Bactrias
Desfavorvel Letais
Estivao
temporria
Estivao
permanente
I
n
s
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t
o
I
n
s
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t
o
P
a
t
g
e
n
o
P
a
t
g
e
n
o
Desfavorvel
-20 0 10 15 20 25 28 30 38 48 52 C
Figura 2. Escala de temperatura para insetos e patgenos.
Fonte: Alves (1986)
Existe uma faixa de temperatura entre 20 C e 30 C que favor-
vel ao desenvolvimento dos insetos e, ao mesmo tempo, tambm
favorvel ao desenvolvimento dos patgenos. Observa-se que tempe-
raturas acima de 30 C so desfavorveis ao desenvolvimento desses
entomopatgenos e essa uma das vrias razes de eles no serem
patgenos dos seres humanos.
b) Umidade: afeta pouco os vrus (Baculovirus anticarsia e outros),
afeta pouco as bactrias esporulantes (Bacillus thuringiensis e
outros), os quais podem ser armazenados por mais de trs anos
a 30% de umidade e continuam viveis. Com relao aos fun-
gos, afeta tanto no armazenamento como no desenvolvimento
em campo, porm a umidade, para ser favorvel ou desfavor-
vel, vai depender de sua associao com a temperatura.
389
Com base no trabalho de Alves (1986), utilizando climogramas
sobre um tringulo contendo condies favorveis de temperatura e
umidade para uma alta produo de condios viveis determinadas
em laboratrio, observa-se na Figura 3 que, na regio de Belm, PA,
durante os 12 meses do ano, pode-se aplicar o fungo M. anisopliae
que a probabilidade de ocorrer epizootia maior do que na regio de
Cuiab, MT, e bem maior que na regio de Quixad, CE. Em Cuiab,
os meses favorveis vo de novembro a julho do ano seguinte (Figura
4), pois esto dentro da zona favorvel (tringulo) e, em Quixad,
todos os meses do ano esto fora do tringulo (Figura 5).
A condio mais comum no Brasil, onde ocorrem ataques de cigar-
rinhas na cana-de-acar e em pastagens, semelhante ao que ocorre
na regio de Cuiab, isto , uma parte dos meses dentro da zona cli-
mtica favorvel e outra parte fora.
45 50 60 70 80 90 100
Umidade relativa do ar (%)
32
31
30
29
28
27
26
25
24
23
22
21
T
e
m
p
e
r
a
t
u
r
a

(
C
)
Zona
favorvel
11
12
5
4
2
3
1
6 9
7
8
10
Figura 3. Climograma comparativo entre a regio de Belm, PA, e a zona
favorvel a uma alta produo de condios viveis dos isolados E
9
, PL-27 e
PL-43 de M. anisopliae.
390
90 100
Zona
favorvel
45 50 60 70 80
32
31
30
29
28
27
26
25
24
23
22
21
T
e
m
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(
C
)
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Figura 4. Climograma comparativo entre a regio de Cuiab, MT, e a zona
9
, PL-27 e
90 100
Zona
favorvel
45 50 60 70 80
32
31
30
29
28
27
26
25
24
23
22
21
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e
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(
C
)
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Figura 5. Climograma comparativo entre a regio de Quixad, CE, e a zona
9
, PL-27 e
391
c) Radiao: a radiao ultravioleta afeta as partculas de vrus, o
complexo cristal-esporos das bactrias esporulantes e a germi-
nao de condios de fungos. O efeito prejudicial da radiao
pode ser amenizado com uma formulao adequada e horrio
de aplicao adequado.
Alves et al. (1998) avaliaram a capacidade de proteo de diferen-
tes formulaes aos condios de M. anisopliae contra os efeitos dele-
trios da radiao ultravioleta, e obtiveram resultados positivos com
algumas formulaes em leos minerais e vegetais puros e em leos
emulsionveis minerais e vegetais.
Os efeitos negativos da radiao sobre entomopatgenos podem
ser bastante amenizados com o emprego de formulaes apropriadas
para cada tipo de patgeno a ser utilizado no campo em maior escala.
d) Outros fatores: algumas substncias qumicas na folhagem
ou no solo podem ser txicas aos patgenos, como fungicidas,
por exemplo.
Fungos entomopatognicos
Modo de ao
Conforme pode ser visto na Figura 6 (ALVES, 1986), primei-
ramente, ocorre a adeso dos condios do fungo no tegumento do
inseto e, logo em seguida, inicia-se a germinao desses condios (12
horas em temperaturas entre 23 C e 30 C). O processo de penetra-
o se d com atuao enzimtica (lipases, proteases, amilases, etc)
ou pela presso mecnica exercida pelo tubo germinativo e apressrio
sobre o tegumento do inseto. A colonizao tem incio com a pene-
trao das hifas que engrossam e se ramificam inicialmente no tegu-
mento do inseto e depois no hemocele. A reproduo pode ser sexu-
ada ou assexuada. Os condios assexuais so os principais propgulos
de Deuteromycotina, em que se incluem os gneros Metarhizium,
Beauveria e Nomuraea. A disseminao a ltima fase, quando os pro-
pgulos infectivos, como os condios de M. anisopliae, dispersam-se
no ambiente com o auxlio do vento, chuva, homem e outros animais
(ALVES, 1998).
392
epicutcula
prcuticula
epiderme
vento
chuva
animais
insetos
homem
Traqueias
Msculos
distrbios
fisiolgicos
morte
Corpos
gordurosos
hemolinfa
Histlise
(enzimas)
Produo de
Micotoxinas
Sistema nervoso central
Tubos de
Malpighi
Bloqueio
Mecnico
Aparelho
Digestivo
Grampo de
Penetrao
Apressrio
Tubo
Germinativo
Esporo
D
I
S
S
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M
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G
ER
M
IN
AO
P
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N
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R
A
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Figura 6. Esquema do ciclo das relaes patgeno-hospedeiro (M. anisopliae
x cigarrinha).
Utilizao de fungos no controle de insetos-praga no Brasil
a) Metarhizium anisopliae para o controle da cigarrinha-da-
folha-da-cana-de-acar, Mahanarva posticata, no Nordeste;
e da cigarrinha-da-raiz-da-cana, M. fimbriolata, no Sudeste e
Centro-Oeste do Brasil. Esse controle j vem sendo utilizado
393
em grande escala desde a dcada de 1970 e est sendo cada vez
mais aperfeioado e eficiente ao longo do tempo (Figura 7).
Praticamente todas as reas de produo de cana orgnica uti-
lizam esse tipo de controle.
Figura 7. (A) Espumas provocadas pela suco da seiva da cana pelas nin-
fas da cigarrinha-da-raiz-da-cana, M. fimbriolata.; (B) ninfa da cigarri-
nha-da-raiz-da-cana; (C) adultos da cigarrinha-da-raiz-da-cana.
b) M. anisopliae para controle de cigarrinha-das-pastagens dos
gneros Deois, Notozulia e Mahanarva nas regies Norte,
Centro-Oeste e Sudeste do Brasil (Figura 8). bastante utili-
zado por alguns pecuaristas que no necessitam retirar o gado
da pastagem durante a aplicao e que produzem carne de qua-
lidade, sem resduos de agrotxicos.
F
o
t
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s
:

J
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b
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(
2
0
0
5
)
394
Figura 8. (A) Pastagem seca provocada pela suco da seiva pelas ninfas e
adultos da cigarrinha-da-raiz, Mahanarva spectabilis; (B) Adulto da cigar-
rinha-da-raiz, M. spectabilis, saindo da espuma; (C) Adulto da cigarri-
nha-da-raiz, M. spectabilis, sugando folha de Brachiaria; (D) Espumas de
cigarrinha-das-pastagens, Deois flavopicta em Brachiaria; (E) Adulto da cigar-
rinha-das-pastagens, D. flavopicta, sugando folha de Brachiaria; (F) Adultos
da cigarrinha D. flavopicta, mortos pelo fungo M. anisopliae.
F
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(
A
,

B

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M
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A
.

N
a
v
e
s
395
c) M. anisopliae var. acridum para controle de gafanhotos no Mato
Grosso e no Nordeste do Brasil (Figura 9). utilizado em reas
protegidas como reservas indgenas onde no se pode aplicar
produtos qumicos (MAGALHES; LECOQ, 2007).
Figura 9. (A) Ninfas do gafanhoto Rhammatocerus schistocercoides; (B) Adulto
do gafanhoto R. schistocercoides mortos pelo fungo M. anisopliae var. acridum .
d) Sporothrix insectorum para controle do percevejo-de-renda-da-
seringueira, Leptopharsa heveae, no Sudeste e Centro-Oeste
do Brasil (Figura 10). Possui uma grande eficincia con-
forme demonstrado por Alves et al. (2003), pois a cultura da
seringueira proporciona um microclima altamente favor-
vel ao desenvolvimento de epizootias do fungo sobre o perce-
vejo-de-renda.
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396
e) Beauveria bassiana no controle do moleque-da-bananeira,
Cosmopolites sordidus, com iscas de pseudocaule pulverizadas
com fungo, no Sudeste e Sul do Brasil (Figura 11).
Figura 11. Adultos do besouro moleque-da-bananeira, C. sordidus, mortos
pelo fungo B. bassiana .
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Figura 10. (A) Ninfas e adulto
do percevejo-de-renda-da-serin-
gueira, L. heveae; (B) Ninfas do
percevejo-de-renda-da-seringueira
mortas pelo fungo S. insectorum;
(C) Adulto do percevejo-de-renda
parasitado pelo fungo .
397
f) O fungo B. bassiana utilizado no controle de algumas pra-
gas do coqueiro (Figura 12) como Rhinostomus barbirostris
(broca-do-estipe-do-coqueiro), Rhynchophorus palmarum
(broca-olho-do-coqueiro), Homalinotus coriaceus (broca-do-pedn-
culo-floral) e Brassolis sophorae (lagarta-das-folhas-do-coqueiro).
Figura 12. (A) Adulto do besouro R. barbirostris, morto pelo fungo B. bassiana.
(B) Adulto do besouro R. palmarum, morto pelo fungo B. bassiana; (C) Adulto
do besouro H. coriaceus, morto pelo fungo B. bassiana; (D) Lagartas de
B. sophorae contaminadas pelo fungo B. bassiana .
g) Nomuraea rileyi controla a lagarta-da-soja, Anticarsia gemmata-
lis, naturalmente com grande eficincia, quando o clima est
favorvel, no Sul, Sudeste e Centro-Oeste do Brasil (Figura 13).
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Figura 13. Lagarta-da-soja, A. gemmatalis, morta pelo fungo N. rileyi.
Aplicao em campo
h) Via area: avio equipado com barra pulverizadora com volume
de aplicao entre 20 L/ha e 30 L/ha com doses entre 1 e 5 x
10
12
condios viveis/ha (Figura 14).
Figura 14. Avio agrcola equipado com barras pulverizadoras e bicos hidru-
licos .
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i) Via terrestre: pulverizadores costais manuais ou motorizados,
trator equipado com atomisador ou barra pulverizadora com
doses entre 1 e 5 x 10
12
condios viveis/ha (Figura 15).
Figura 15. Tipos de pulverizadores. (A) Costal manual; (B) Costal motori-
zado; (C) Atomisador tratorizado; (D) Pulverizador de barras tratorizado .
Obs.: deve-se colocar espalhante adesivo a 0,1% do volume total de
gua para formulaes tipo p molhvel.
Bactrias entomopatognicas
Entre as bactrias, a espcie Bacillus thuringiensis se destaca como
a mais utilizada para o controle de pragas, principalmente da Ordem
Lepidoptera.
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400
As diferentes variedades de B. thuringiensis produzem toxinas com
as quais afetam o inseto durante o processo da doena. As principais
toxinas so:
delta endotoxina (B. thuringiensis var. kurstaki)
beta exotoxina (B. thuringiensis var. israelensis)
Reproduo vegetativa
1 2 3 4 5 6 7
S
E
E
CP
Dissoluo (pH 9,5 a 10,5)
Ingesto
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CB
CB
E
Formao do esporo e cristal
CP
Figura 16. Ciclo evolutivo do B. thuringiensis em uma lagarta; CB, clula bac-
teriana; E, esporo; CP, cristal proteico.
Fonte: Alves, 1986.
Aps a ingesto dos esporos da bactria, esses esporos germinam
e as formas vegetativas se multiplicam no intestino, passando poste-
riormente cavidade geral do hospedeiro, onde se multiplicam outra
401
vez, produzindo uma septicemia e posteriormente causando a morte
do mesmo.
Utilizao de Bacillus thuringiensis no controle de pragas
a) B. thuringiensis var. kurstaki utilizada no controle de lagartas
desfolhadoras de grandes culturas e reflorestamentos.
b) B. thuringiensis var. israelensis para controle de larvas de perni-
longos e borrachudos.
Existem vrios produtos a base de B. thuringiensis var. kurstaki
venda no Brasil como: Agree, Bac-Control, Bactur WP, Dipel SC,
Dipel WG, Dipel WP, Ecotech Pro, Thuricide e Xentari.
Na sade pblica, existem alguns biolarvicidas a base de B.
thuringiensis var. israelensis para o controle de pernilongos e borrachu-
dos como: Aquabac XT, Bactivec, Bt-horus SC, Teknar HPD, Vectobac
AS, Vectobac CG e Vectobac WDG.
Existem tambm biolarvicidas que utilizam a bactria Bacillus sphae-
ricus, e tm-se no mercado brasileiro os produtos Grislesf, o Sphaerus
SC e o Spherico SC e Vectolex CG.
No Brasil, o B. thuringiensis pode ser utilizado em vrias culturas
no controle de diversas pragas, conforme a Tabela 2.
Tabela 2. Utilizao do Bacillus thuringiensis var. kurstaki em vrias cul-
turas para controle de diferentes insetos-praga.
Culturas Insetos-praga
Soja
Lagarta-da-soja
Lagarta-falsa-medideira
Algodo
Lagarta-das-mas
Curuquer
Gramneas (pastagens, milho, cana, arroz)
Lagarta-dos-capinzais
Lagarta-militar
Crucferas (couve, couve-flor, repolho, brcolis)
Curuquer-da-couve
Lagarta-mede-palmo
Traa-das-crucferas
Tomate
Broca-grande
Lagarta-mede-palmo
Fumo Lagarta-verde
Mandioca Mandarov
Caf Lagarta-magnfica
Eucaliptus Lagarta-dos-eucaliptus
Continua
402
Culturas Insetos-praga
Alfafa
Lagarta-da-alfafa
Lagarta-militar
Curuquer-dos-capinzais
Citrus Automeris
Maracuj Lagarta-do-maracuj
Seringueira Mandarov
Abacaxi Broca-do-fruto
Amendoim
Lagarta-da-soja
Lagarta-dos-capinzais
Coqueiros Lagarta-das-palmeiras
Cucurbitceas (abbora, pepino, melo, melancia) Broca-das-cucurbitceas
Vrus entomopatognicos
Existem estudos que demonstram a existncia de mais de 700 viro-
ses que atacam insetos e caros, porm s as mais promissoras so
utilizadas no controle de pragas (Figura 17).
Estrutura de um vrus entomopatognico
Virion Granulina
Poliedrina
Diversos nucleocapsdeos
por envelope (MEV)
(b)
DNA + Protena
Capsdeo
Nucleocapsdeo
Envelope ou
Membrana
(a)
Nucleocapsdeo
individualizado
em 1 envelope
(SEV)
0
,
5

a

1
5

m
0
,
5

m
Figura 17. Corpos de incluso de Baculovirus: (a) Cpsula de granulose; (b)
Vrus da poliedrose nuclear.
Fonte: Alves (1986)
403
Modo de ao e disseminao
O vrus s atua sobre as lagartas quando ingerido, isto , via oral.
Segundo Moscardi (1983), os poliedros localizados sobre as folhas de
soja, ao serem ingeridos, atingem o intestino do inseto e ali so dis-
solvidos, propiciando a liberao das partculas de vrus, os virions
(Figura 18). Estes penetram na membrana da parede do intestino e
atingem a hemolinfa, multiplicando-se no ncleo das clulas de dife-
rentes tecidos, inicialmente no tecido gorduroso e epiderme; depois
na epiderme da traqueia e nos rgos reprodutivos.
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Virion
Virion
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Insetos
Parasitos
Adsoro, Penetrao
12 a 24h
Vento
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Insetos
Folhas
Homem
Solo
Poliedro
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Sntese de
Partculas
Colonizao
Ncleo (NPV)
Disseminao
Liberao de
Partculas
Figura 18. Ciclo das relaes de Baculovirus com o inseto hospedeiro.
O processo, desde a infeco at a morte da lagarta, dura em mdia
sete dias.
Os sintomas so descolorao da parte ventral do corpo (3 e 4 dia)
e depois em todo o corpo. Aps o quarto dia, a lagarta infectada tem
pouca mobilidade e praticamente cessa sua alimentao, indo para
404
a parte superior da planta, onde morre pendurada pelas patas abdo-
minais.
A lagarta, nessa fase, possui uma colorao amarelo-esbranquiada,
no se rompendo com facilidade, mas posteriormente torna-se preta
e se rompe facilmente.
Utilizao de viroses no controle biolgico de pragas
Baculovirus anticarsia no controle da lagarta-da-soja
Baculovirus spodoptera no controle da lagarta-do-cartucho-do-milho
Baculovirus erinnys no controle de mandarov-da-mandioca
Atualmente existem vrios produtos biolgicos a base de Baculovirus
no Brasil (Figura 19), como: Baculovirus AEE, Baculovirus Nitral,
Coopervrus PM e Protege. A maioria das biofbricas est localizada
no Paran e Rio Grande do Sul.
Figura 19. (A) Potes contendo dose de lagartas mortas por vrus para um
hectare; (B) B. anticarsia formulado como p molhvel; (C) Lagarta-da-soja
morta por Baculovirus.
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Parasitoides
Microhimenpteros
Cotesia flavipes
O microhimenptero Cotesia flavipes (Hymenoptera: Braconidae)
utilizado no controle da broca-da-cana-de-acar, onde parasita na
fase de lagarta de piraldeos e noctudeos. A fmea oviposita seus ovos
no interior do corpo da lagarta, onde se desenvolvero as larvas e se
empupam em forma de casulo na parte externa do corpo do hospe-
deiro, de onde sairo novos adultos. O seu ciclo dura, em mdia, 23
dias na temperatura de 25 C. utilizado em larga escala na regio
canavieira do Estado do So Paulo.
Trichogramma sp.
Trichogramma sp. (Hymenoptera: Trichogrammatidae): um para-
sita de ovos de lepidpteros que possui grande potencial para as con-
dies de nosso pas.
Segundo Parra et al. (1987), esto sendo utilizados em liberaes
inundativas na Rssia (10 milhes de hectares), China, Taiwan,
Mxico, EUA, Europa Ocidental, ndia, frica e Amrica do Sul
(Colmbia e Peru).
No Brasil, j est se utilizando o Trichogramma em larga escala
para o controle biolgico de Diatraea saccharalis, Alabama argillacea e
Heliothis virescens. O ciclo de vida do Trichogramma sp. pode ser visto
na Figura 20.
406
A B
C D
E F
Oviposio
do parasito
Ovo do
parasito
Larva do
parasito
Pupa do
parasito
Emergncia
do parasito
Larva do
parasito
Ovo do
inseto-praga
Figura 20. Ciclo de vida do Trichogramma sp.
Fonte: De Bach; Rosen (1991)
Trissolcus basalis (Hymenoptera: Scelionidae)
So parasitos de ovos de percevejos-da-soja, tambm com grande
potencial para as condies do Brasil (Figura 21).
407

Figura 21. (A) Adulto do percevejo-verde-da-soja, Nezara viridula. (B) Adultos
da vespinha T. basalis parasitando ovos de N. viridula.
Dpteros
Moscas taquindeas Metagonistylum minense (mosca-do-Amazo-
nas) e Paratheresia claripalpis: so parasitos da broca-da-cana-de-a-
car. Os adultos so liberados no campo, onde procuraro ovipositar
na broca-da-cana. As larvas se desenvolvem no interior do corpo do
hospedeiro e empupam no orifcio feito pela broca, de onde sairo
os adultos.
Consideraes finais
Com base nas informaes contidas neste captulo, observa-se que o
controle biolgico de insetos-praga j vem sendo utilizado no Brasil h
vrios anos em diferentes culturas agrcolas e na pecuria e que apre-
senta um potencial enorme para ser cada vez mais utilizado, pois novos
resultados de pesquisa tm ajudado a aperfeioar tcnicas de produo
e liberao de predadores e parasitos e principalmente de patgenos,
onde envolve novas tcnicas de produo em larga escala, formula-
o, armazenamento e de aplicao no campo visando a um aumento
da eficincia desses inimigos naturais contra diferentes pragas.
Apesar deste captulo visar, apenas, dar uma viso geral e resumida
da utilizao dos principais inimigos naturais utilizados no controle
biolgico de insetos-praga no Brasil, espera-se que o leitor possa com-
preender um pouco mais sobre esse mtodo e sobre os diferentes
inimigos naturais, seus modos de ao e que seja mais um colabora-
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408
dor na difuso de informaes tcnicas sobre o assunto, colaborando
assim para o aumento do uso adequado do controle biolgico de inse-
tos-praga, o que evitar resduos qumicos nos alimentos, contamina-
o dos recursos naturais e haver menos intoxicaes dos trabalha-
dores rurais brasileiros.
Referncias
ALVES, R. T. Determinao das exigncias trmicas e hdricas do fungo
Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin, 1883. 1986. 131 f. Tese (Mestrado)
ESALQ/USP, Piracicaba.
ALVES, R. T.; BATEMAN, R. P.; PRIOR, C.; LEATHER, S. R. Effects of simulated
solar radiation on conidial germination of Metarhizium anisopliae in different
formulations. Crop Protection, v. 17, p. 675-679, 1998.
ALVES, R. T.; SILVA, E. A. F.; SOUSA, K. M.; OLIVEIRA, M. A. S.; PEREIRA, A.
V.; PEREIRA, E. B. C.; JUNQUEIRA, N. T. V.; ICUMA, I. M. Controle biolgico
do percevejo-de-renda da seringueira com o uso de microinseticida formulado
em leo emulsionvel. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2003. 22 p. (Embrapa
Cerrados. Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento, 113).
ALVES, S. B. Controle biolgico de pragas de pastagens. In: SIMPSIO SOBRE
MANEJO DE PRAGAS DAS PASTAGENS, 7., Piracicaba. Anais... Piracicaba,
FEALQ, 1985. p. 169-208.
ALVES, S. B. Controle microbiano de insetos. Piracicaba: FEALQ, 1998. 1163 p.
ALVES, S. B. Controle microbiano de insetos. So Paulo: Manole Ltda, 1986. 407 p.
DE BACH, P.; ROSEN, D. Biological control by natural enemies. Cambridge
University Press, 1991. 440 p.
GALLO, D.; O. NAKANO, O.; SILVEIRA NETO, S.; CARVALHO, R. P. L.;
BATISTA, G. C.; BERTI FILHO, E.; PARRA, J. R. P.; ZUCCHI, R. A.; ALVES, S. B.;
VENDRAMIM, J. D.; MARCHINI, L. C.; LOPES, J. R. S.; OMOTO, C. Entomologia
agrcola. Piracicaba, FEALQ, 2002. 920 p.
MAGALHES, B. P.; LECOQ, M. Bioinseticidas e gafanhotos-praga. Braslia, DF:
Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia. 2007. 123 p.
MOSCARDI, F. Utilizao de Baculovirus anticarsia para o controle de lagarta
da soja, Anticarsia gemmatalis. Londrina, PR: CNPS, 1983 (Embrapa Soja.
Comunicado Tcnico, 23). 21 p.
409
MOSCARDI, F.; CORSO, I. C. Efeito de diferentes doses de Baculovirus
anticarsia sobre Nomuraea rileyi. In: EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA
AGROPECURIA. Centro Nacional de Pesquisa de Soja, Londrina, PR. Resultados
de Pesquisa de Soja 1979/80. Londrina, 1980. p. 156-8.
PARRA, J. R. P., ZUCCHI, R. A.; SILVEIRA NETO, S. A importncia de
Trichogramma no controle de pragas na agricultura. Agrotcnica CIBA-GEIGY, v. 1,
p. 12-15, 1987.
TANADA, Y. Epizootiology of Infectious Diseases. In: STEINHAUS, E. A.(Ed.)
Insect pathology: an advanced treatise. Academic Press, v. 2, p. 423-75, 1963.
VAN DRIESCH, R. G.; BELLOWS JUNIOR., T. S. Biological control. New York,
Chapman & Hall, 1996. 539 p.
Literatura recomendada
ALVES, S. B. Controle microbiano de insetos. Piracicaba, FEALQ, 1998. 1163 p.
DE BACH, P.; ROSEN, D. Biological control by natural enemies. Cambridge
University Press, 1991. 440 p.
GALLO, D.; O. NAKANO, O.; SILVEIRA NETO, S.; CARVALHO, R. P. L.;
BATISTA, G. C.; BERTI FILHO, E.; PARRA, J. R. P.; ZUCCHI, R. A.; ALVES, S. B.;
VENDRAMIM, J. D.; MARCHINI, L. C.; LOPES, J. R. S.; OMOTO, C. Entomologia
agrcola. Piracicaba: FEALQ, 2002. 920 p.
OLIVEIRA-FILHO, E. C.; MONNERAT, R. G. Fundamentos para a regulao
de semioqumicos, inimigos naturais e agentes microbiolgicos de controle de
pragas. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2006. 352 p.
VAN DRIESCH, R. G.; BELLOWS JUNIOR, T. S. Biological control. New York,
Chapman & Hall., 1996. 539 p.
411
Cultura de tecidos vegetais:
princpios e aplicaes
Sebastio Pedro da Silva Neto
Introduo
O termo cultura de tecidos vegetais utilizado para definir a cul-
tura assptica in vitro de clulas, tecidos, rgos e seus componen-
tes sob condies fsicas e qumicas definidas. A cultura de tecidos
constitui uma importante ferramenta para estudos bsicos, como a
compreenso dos fatores responsveis pelo crescimento, metabo-
lismo, diferenciao e morfognese das clulas vegetais, bem como
para estudos aplicados, como micropropagao, produo de com-
postos secundrios, transformao gentica, manuteno de germo-
plasma in vitro e limpeza clonal (SMITH, 2000). O desenvolvimento
da tcnica tem uma longa histria. Os esforos iniciais se concentra-
ram na compreenso dos vrios aspectos do crescimento, desenvol-
vimento e diferenciao vegetal, do papel dos reguladores de cresci-
mento, dos tipos de nutrientes necessrios, entre outros fatores. To
logo os princpios e mtodos bsicos foram estabelecidos (primeiro
quarto do sculo XX), verificou-se o valor prtico para a agricultura e
para a indstria da propagao de plantas, bem como na conservao
de germoplasma (RAZDAN, 2003). Atualmente, a cultura de tecidos
desempenha papel importante nos mtodos moleculares utilizados
em biotecnologia. A base fundamental da cultura de tecidos a capa-
cidade de clulas, tecidos ou rgos se desenvolverem e regenera-
rem plantas completas, idnticas planta-me. A disponibilidade de
mtodos adequados de cultura de tecidos para um crescente nmero
de espcies vegetais permite ampliar o leque de aplicaes da biotec-
nologia vegetal.
412
Princpios da cultura de tecidos
O termo in vitro um termo latino que significa dentro do
vidro. Dessa forma, em condies de assepsia, dentro de recipien-
tes de vidro, sob o efeito de fatores qumicos (meio de cultura) e fsi-
cos (luz e temperatura), um ambiente artificial criado, visando pro-
porcionar condies adequadas para o processo de desenvolvimento
de clulas, tecidos e rgos de plantas, previamente extrados de uma
planta completa (matriz). O efeito dessas intervenes pode induzir
diferenciao e multiplicao de rgos a partir de meristemas ou
desdiferenciao de tecidos determinados e induo de formao
de pr-meristemas (GAHAN; GEORGE, 2008).
O cultivo in vitro baseia-se nos seguintes princpios: totipotncia e
competncia celular. A totipotncia se refere ao potencial das clulas
vegetais de reproduzirem um organismo inteiro uma vez submetidas
a estmulo apropriado (HARBERLANDT, 1902). No entanto, para as
clulas vegetais reagirem a esse estmulo, precisam apresentar com-
petncia celular, que se refere capacidade das clulas em reagir a
sinais especficos de desenvolvimento, ou seja, expressar o potencial
inerente sua carga gentica.
A cultura de tecidos comumente usada para descrever todos os
tipos de cultura in vitro de plantas. Didaticamente, George et al. (2008)
a separa em duas categorias de acordo com a organizao do cresci-
mento in vitro: (a) cultivos com crescimento organizado e (b) cultivos
com crescimento no organizado.
a) Cultivos com crescimento organizado:
Cultura de meristemas: cultura de pices caulinares muito
pequenos, consistindo do domo meristemtico apical com ou
sem primrdios foliares, com tamanho entre 0,1 mm e 0,3 mm,
dependendo da espcie. Originam eixos caulinares unipolares.
Cultura de pices caulinares ou gemas: inicia-se a partir de
gemas ou brotos de tamanho maior que os meristemas, con-
tendo vrios primrdios foliares, que so conduzidos de forma
a produzir mltiplas brotaes ou multigemas.
Cultura de segmentos nodais: inicia-se a partir de gemas laterais
existentes nos ns da planta, cada um tendo anexo um pequeno
413
Captulo 14 Cultura de tecidos vegetais: princpios e aplicaes
pedao de tecido do ramo. Entrens contendo uma ou vrias
gemas podem ser cultivados.
Cultura de razes isoladas: cultura de razes desconectadas da
parte area, resultando na produo de um sistema de razes
ramificadas.
Cultura de embries (resgate): embries zigticos so excisados
e cultivados para dar origem a plntulas.
b) Cultivos com crescimento no organizado:
Cultura de calos: induo do crescimento e manuteno de uma
massa de clulas desorganizada, a partir do crescimento desco-
ordenado de pequenos rgos, pedaos de tecidos ou de clulas
previamente cultivadas.
Culturas em suspenso: cultura de populaes de clulas indivi-
duais e pequenos grupos de clulas, dispersas em meio lquido
sob agitao e aerao.
Cultura de protoplastos: cultura de clulas vegetais, sem parede
celular.
Cultura de anteras e plen: cultura de anteras completas con-
tendo micrsporos imaturos, com o objetivo de formar embri-
es somticos diretamente sobre o plen, ou algumas vezes por
organognese passando pela fase de calo.
Cultura de plen: culturas iniciadas de gros de plen que foram
removidos das anteras.
O processo de desenvolvimento de uma nova plntula pode ocorrer
via organognese ou embriognese somtica. Os fatores que influen-
ciam na determinao da rota morfogentica so: o tipo de explante
escolhido, estdio fisiolgico da planta e o ambiente do meio de cul-
tura (reguladores de crescimento, nutrientes, luz, etc). A organog-
nese o processo de formao de uma nova plntula, a partir de um
explante, j, na embriognese somtica, ocorre a formao de embri-
es a partir de clulas somticas, sem a fecundao zigtica. Ambas
as rotas podem ocorrer de forma direta ou indireta. O processo de
organognese/embriognese direta ocorre quando as plntulas/
embries surgem a partir de meristemas pr-existentes nos tecidos
414
do explante, enquanto pela via indireta, ocorre primeiro a formao
de calos, seguida da formao de meristemoides e finalmente pln-
tulas/embries (ANDRADE, 2002). O esquema simplificado da cul-
tura de tecidos pode ser visto na Figura 1.
Explante meteristemtico
Explantes maduros
Desinfestao
Explante meteristemtico
Meio de cultura
Explante
Calo
Razes
Embries
Somticos
Planta
Enraizamento
Suspenso
celular
Brotos
Matriz
Figura 1. Etapas da cultura de tecidos .
Fonte: Kerbauy, 1997.
Aplicaes da cultura de tecidos
Baseado na disponibilidade das vrias tcnicas in vitro j citadas,
a partir de meados da dcada de 1960 houve um significativo cresci-
mento das aplicaes da cultura de tecidos em pesquisas nos campos
da biologia, agricultura e engenharia florestal. As aplicaes na agro-
pecuria podem ser divididas em cinco reas: (a) melhoramento gen-
tico; (b) limpeza clonal; (c) conservao de germoplasma; (d) propaga-
o clonal; e (e) produtos do metabolismo secundrio.
Melhoramento gentico
O papel da cultura de tecidos no melhoramento gentico de plan-
tas tem sido reconhecido de forma crescente. Variaes herdveis
podem ser observadas nas colnias de clulas ou em plantas regene-
radas in vitro, as quais podem posteriormente se expressar por meio
415
de reproduo vegetativa ou sexual. Mtodos in vitro tm sido usa-
dos de forma crescente em associao com os mtodos tradicionais
de melhoramento de plantas. As principais aplicaes da cultura de
tecidos so destacados abaixo.
Gerao de variabilidade gentica
Pesquisas pioneiras sobre cultura de tecidos mostraram que clu-
las cultivadas in vitro durante longos perodos podem apresentar
variaes genticas inditas. Muitos pesquisadores tm confirmado
que um tecido um mosaico de diferentes tipos de clulas. Algumas
delas, quando cultivadas separadamente, produzem colnias orga-
nizadas, enquanto outras regeneram plantas frequentemente afeta-
das por variaes morfolgicas. Em virtude disso, as culturas in vitro
so fontes diretas de variabilidade gentica. Estudos citogenticos de
clulas cultivadas in vitro revelaram mitose anormal, o que uma das
causas da variabilidade. Nmeros de cromossomos instveis resul-
tam em variabilidade na cultura de tecidos, possibilitando a seleo
de variantes (RAZDAN, 2003).
A cultura de clulas tem desempenhado papel importante no
melhoramento de plantas, uma vez que permite o isolamento de
variantes somaclonais (FLICH, 1983). Embora a produo de varian-
tes por cultura de tecidos seja conhecida desde longa data, foi somente
nos anos 1970 que passou a ser utilizada no melhoramento de plantas.
A variao somaclonal dependente da variao natural que ocorre
numa populao de clulas, podendo ser pr-existente ou induzida
pela cultura in vitro, e usualmente observada nas plantas regenera-
das (LARKIN; SCOWCROFT, 1981). A variao pode ser gentica ou
epigentica, sendo complexa quanto origem (LARKIN et al., 1985;
SCOWCROFT et al., 1987). As variaes observadas nas plntulas
regeneradas podem ter importncia agrcola. tambm possvel pro-
duzir um amplo espectro de clulas mutantes em cultura (JACOBS
et al., 1987), nas quais incluem-se clulas apresentando diferenas
bioqumicas, algumas conferindo caractersticas teis do ponto de
vista econmico como resistncia a herbicidas, antibiticos e estres-
ses. A seleo in vitro, mediante a aplicao de um agente seletivo na
presena do mutante, permite a seleo de plantas com sistemas de
416
desenvolvimento alterados, podendo manisfestar resistncia a sais,
produtos qumicos e toxinas. Entretanto, somente em poucos casos,
tem sido possvel regenerar plantas com as caractersticas desejveis,
por exemplo, plantas de fumo resistentes a herbicidas e Datura inno-
xia resistente ao metil-triptofano (SMITH, 2000).
Polinizao in vitro
A tcnica da polinizao controlada in vitro tem sido utilizada na
produo de hbridos interespecficos e intergenricos, superando
a autoincompatibilidade sexual (YEUNG et al., 1981; ZENKTELER,
1984). A tcnica foi desenvolvida por Kanta e colaboradores (1962), e
envolve o cultivo de vulos e gros de plen no mesmo meio de cul-
tura, facilitando assim a germinao do gro de plen e a fertilizao
do vulo sob condies in vitro. Por meio da aplicao dessa tcnica,
as barreiras de incompatibilidade sexual existentes, especialmente
aquelas em que a reao ocorre no estilo ou no estigma, podem ser
superadas. Esse mtodo tem sido utilizado com sucesso na superao
da autoincompatibilidade em Petunia axillaris. Similarmente, hbri-
dos interespecficos (Melandrium album x M. rubrum) e intergenricos
(M. album x Silene schafta) foram obtidos. A obteno de embries ger-
minveis, desenvolvidos in vitro, a partir da fuso dos gametas mas-
culino e feminino, tem sido a marca dessa tcnica (RAZDAN, 2003).
Culturas de embries, ovrios e vulos tm sido utilizadas para
superar problemas como a inviabilidade do embrio, produo de
monoploides, dormncia de sementes e outros problemas relaciona-
dos (RAGHAVAN, 1980; YEUNG et al., 1981). De forma particular, o
resgate de embries tem desempenhado um papel muito importante
na produo de hbridos interespecficos e intergenricos (COLLINS;
GROSSER, 1984).
Induo de haploidia
A aplicao da cultura de tecidos na produo de haploides tem
chamado a ateno pelo seu potencial de uso no melhoramento de
plantas. Normalmente, as clulas somticas de plantas superiores
tm nmero de cromossomos diploide, enquanto clulas reprodu-
tivas (gametas) so haploides. Guha e Maheswari (1966) cultivaram
417
anteras imaturas de Datura innoxia (Solanaceae) e foram capazes de
gerar embrioides e plntulas. Essas plntulas tornaram-se haplides.
Aparentemente elas surgiram a partir de micrsporos dentro das ante-
ras; isso abriu o caminho para a andrognese. Bourgin e Nitsch (1967)
confirmaram a totipotncia dos gros de plen conseguindo regene-
rar plantas haploides completas de tabaco, arroz e trigo. De acordo
com Hu e Guo (1999), a obteno de haploides por cultura de ante-
ras foi relatada em 247 espcies, pertencentes a 34 famlias vegetais.
Evidncias experimentais indicam que as populaes de plen so pra-
ticamente dimrficas e que somente aqueles gros de menor tamanho
so capazes de formar haploides. Esses tipos de gros de plen ocor-
rem em baixa frequncia e aparentemente so diferentes da maioria
daqueles destinados a formao de gametas (GEORGE et al., 2008).
A induo de plantas haploides a partir de ovrios e vulos no
polinizados (ginognese) outro avano na cultura de tecidos. San e
Gelebart (1986) relataram seu primeiro resultado em cultura in vitro
de ovrio isolado de Hordeum vulgare e, subsequentemente, mui-
tos outros pesquisadores obtiveram plantas haploides ginognicas
de ovrios e vulos cultivados in vitro de tabaco, trigo, arroz, lrio,
milho e outras plantas (THOMAS et al., 1999). Isso demonstra que
no somente o micrsporo, mas tambm o megsporo ou gametfito
feminino de angiospermas, podem ser cultivados in vitro at o desen-
volvimento esporoftico, abrindo uma via alternativa para o melhora-
mento de plantas por meio de haploides (SMITH, 2000).
O valor dos haploides grande nos programas de melhoramento,
uma vez que eles podem ser utilizados para detectar mutaes e para
recuperar combinaes genticas nicas, tendo em vista que, por
meio dos haploides duplicados, regeneram-se plantas completamente
homozigotas, onde se visualiza a expresso de alelos recessivos, o que
tem grande aplicao nos estudos genmicos. Alm disso, a produ-
o de duplos haploides tem permitido a produo de hbridos e sua
integrao em programas de melhoramento.
Hibridao somtica
Isolamento, regenerao e fuso de protoplastos (clulas cuja
parede celular foram digeridas) de plantas in vitro so tecnologias
418
com potencial para manipulao gentica. A hibridao somtica,
uma hibridao assexual que utiliza protoplastos somticos isolados
(Figura 2), uma ferramenta a mais no melhoramento de plantas
(RAZDAN, 2003). O produto da fuso de dois protoplastos (hetero-
carion) pode ser cultivado para regenerar um hbrido somtico com
o gentipo desejado. Novas variaes genticas podem tambm ser
introduzidas com consequncias nas interaes citoplasmticas
durante o processo de fuso nos protoplastos. A tcnica de hibrida-
o somtica evoluiu tremendamente aps se ter demonstrado a via-
bilidade de isolar um largo nmero de protoplastos por meio da incu-
bao de uma pequena quantidade de tecido com a enzima celulase.
Protoplastos isolados entram em processo de diviso celular e rege-
neram plantas (NAGATA; TAKEBE, 1971), comprovando a totipotn-
cia em protoplastos. Centenas de espcies de angiospermas podem
ser regeneradas a partir de protoplastos (BINDING, 1986). A possibi-
lidade de fundir protoplastos de plantas por mtodos qumicos (por
exemplo, PEG) e fsicos (por exemplo, eletrofuso) permite a produ-
o de hbridos somticos. Carlson et al. (1972) obtiveram o primeiro
hibrido somtico interespecifico por fuso de protoplastos isolados de
Nicotiana glauca com N. langsdorffii. No Brasil, Matsumoto et al. (2001)
conseguiram a hibridao interespecfica de bananeira (Musa spp.)
por meio de hibridao somtica (Figura 3). A fuso de protoplastos
comprovou ser uma forma de se obter hbridos somticos entre plan-
tas sexualmente incompatveis. O maior gargalo na tcnica de fuso
de protoplastos a regenerao de plantas a partir das clulas hibri-
das (EVANS et al., 1984; SCHIEDER; KOHN, 1986).
A fuso de protoplastos tem sido utilizada para produzir combi-
naes ncleo-citoplasma nicas. Como exemplo, pode-se citar a
combinao de cloroplastos de Brassica campestris que codificam
para resistncia atrazina (obtida de protoplastos) com protoplas-
tos de Brassica napus possuindo citoplasma de Raphanus sativus
(que confere macho esterilidade a partir de sua mitocndria). As
plantas selecionadas continham ncleo de B. napus, cloroplastos de
B. campestris e mitocndria de R. sativus; tinham as caractersticas
desejadas em um fentipo de B. napus; e so atualmente utiliza-
das para a produo de sementes hbridas (CHETRIT et al., 1985).
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Figura 2. Protoplastos de bananeira .
Figura 3. Fuso de protoplastos de bananeira.
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Transformao gentica
A atual importncia da transformao gentica de clulas por meio
da introduo de DNA exgeno tem gerado enorme interesse pelas
tcnicas de regenerao oferecidas pela cultura de tecidos. A trans-
formao gentica consiste basicamente de quatro passos: insero,
integrao, expresso e replicao do DNA exgeno dentro da clula
hospedeira (TORRES et al., 1998).
O princpio da transformao baseado no mecanismo de infec-
o por vrus. Desde 1976, muitos trabalhos tm relatado que vrios
genes eucariticos introduzidos em bactria so capazes de expres-
sar sua atividade especfica no hospedeiro e que isso possibilita obter
uma transformao similar de clulas eucariticas. Na natureza,
Agrobacterium tumefaciens pode transferir informao gentica para
clulas de plantas na forma de um plasmdeo que promove forma-
o tumoral (galha). Usando a tecnologia do DNA recombinante, foi
possvel introduzir o gene para resistncia kanamicina no DNA do
plasmdeo do A. tumefasciens, e o plasmdeo modificado foi poste-
riormente incorporado em protoplastos de tabaco. Plantas do tabaco
transformado expressaram resistncia kanamicina. Atualmente
tem-se obtido xito em modificar geneticamente plantas por meio da
introduo de outros genes teis, como resistncia a insetos, ervas
daninhas, herbicidas, doenas, ou para estudos do mecanismo da
ao gnica (Figura 4).
Plantas geneticamente modificadas podem ser obtidas por mto-
dos vetores-dependentes (transformao indireta) ou vetores-indepen-
dentes (transformao direta). A transformao gentica de plantas
por transferncia direta de DNA por meio de mtodos vetores-inde-
pendentes pode ser utilizada para transformar protoplastos e clulas
bacterianas, e incluem eletroporao (POTRYKUS et al., 1985), fuso
de liposoma (DESHAYES et al., 1985), microinjeo (CROSSWAY
et al., 1986), bem como bombardeamento de micro partculas (biols-
tica) (KLEIN et al., 1987). O mtodo da biolstica pode ser executado
com clulas, tecidos e rgos.
421
Figura 4. Calo geneticamente modificado .
Na transferncia de genes mediada por vetor, os genes de inte-
resse so inseridos em vetores de expresso binria em orienta-
o senso e antissenso e essas construes gnicas inseridas na
Agrobacterium para transformao de clulas, tecidos, culturas de
rgos, ou partes de plantas. O uso de Agrobacterium em transfe-
rncias mediadas por vetores tem progredido muito rapidamente
desde os primeiros relatos de transformao estvel (DEBLOCK
et al., 1984; HORSCH et al., 1984). Grande parte da atividade de
pesquisa que utiliza essas ferramentas tem focalizado o desen-
volvimento de importantes caractersticas agronmicas como o
controle de insetos, plantas daninhas e doenas, resultando em
plantas transgnicas com crescente uso na agricultura.
Limpeza clonal
A habilidade de eliminar vrus, bactrias e fungos de plantas por
cultura de meristemas tem sido utilizada desde a dcada de 1960
(Figura 5). A tcnica comeou quando White (1934) observou que
subcultivos de razes infectadas com vrus frequentemente resulta-
vam em culturas que eram isentas do vrus. Isso mostrou que, mesmo
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em plantas infectadas, as clulas das extremidades meristemticas ou
so livres do vrus ou possuem uma concentrao muito pequena do
mesmo. Fato que se d porque os tecidos meristemticos no sendo
vascularizados dificultam o acesso do vrus, que necessita dos vasos
para se movimentar de forma sistmica na planta. A tcnica particu-
larmente importante para espcies de propagao vegetativa e quando
o material vegetal est infectado por vrus (BHOJWANI; RAZDAN,
1983). A cultura de meristemas frequentemente associada com ter-
moterapia ou quimioterapia para a erradicao de vrus na limpeza
clonal (RAZDAN, 2003).
Figura 5. Meristema de maracuj na ponta de uma agulha .
Conservao de germoplasma
Tradicionalmente, os germoplasmas de plantas cultivadas tm sido
mantidos na forma de materiais propagativos como sementes, tubr-
culos, razes, bulbos, rizomas, gemas, estacas, etc. Canteiros, estufas
e casas de vegetao so outras formas de se manter os germoplas-
mas ou bancos genticos. Entretanto, algumas dificuldades podem ser
encontradas na utilizao dessas formas de conservao. Entre elas,
est o fato de que importantes espcies produzem sementes recalci-
trantes, com degenerao rpida do embrio (SMITH, 2000). Alm
disso, a manuteno de colees a campo pode ser cara e ter como
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desvantagem o fato de as plantas serem vulnerveis a insetos, patge-
nos e variaes do clima. Milhares de espcies de plantas superiores
so consideradas ameaadas de extino e necessitam ser mantidas
em bancos de germoplasmas visando preservao e utilizao de
fontes de genes para futuros projetos de melhoramento gentico. A
habilidade de regenerar plantas completas a partir de clulas embrio-
nrias e gamticas, e pices caulinares, tem levado ao seu uso na con-
servao de germoplasma (RAZDAN, 2003) (Figura 6).
Figura 6. Conservao in vitro de mandioca .
Trs tcnicas in vitro tm sido desenvolvidas a partir do uso de
componentes que retardam o crescimento (por exemplo: hidrazida
malica, B995, e ABA; Dodds, 1989), baixas temperaturas (1 C a 9 C;
RAZDAN, 2003), e criopreservao (KARTHA, 1981). Nessa ltima
tcnica, suspenses celulares, pices caulinares, embries assexuais e
plntulas jovens, aps o tratamento com um crioprotetor, so conge-
lados e conservados em baixas temperaturas (-196 C), em nitrognio
lquido (KARTHA, 1981; WITHERS, 1985). A cultura de tecidos con-
siderada como uma forma efetiva de conservao de germoplasma,
desde que a manuteno do germoplasma in vitro seja vivel econo-
micamente em relao s demais alternativas.
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Propagao clonal (micropropagao )
O uso da cultura de tecidos para propagao vegetativa de plantas
a mais largamente utilizada aplicao dessa tecnologia. Ademais,
tem sido bem sucedida em todas as classes de plantas (GEORGE et al.,
2008). H trs formas por meio das quais a micropropagao pode
ser realizada. Essas so: (i) a intensificao da quebra de dormncia
de gemas axilares; (ii) produo de gemas adventcias diretamente
ou indiretamente sobre calos; e (iii) embriognese somtica direta ou
indireta sobre explantes (MURASHIGE, 1974, 1978). O princpio da
tcnica usada para propagao in vitro baseada na multiproliferao
e crescimento de gemas axilares, que normalmente permanecem dor-
mentes na presena da gema terminal por causa da dominncia api-
cal. O uso exgeno de citocininas no meio de cultura libera as gemas
da dominncia apical tanto no ramo original, como nos subsequen-
tes ramos laterais que so formados. Consequentemente numerosas
brotaes so formadas (Figura 7).
Figura 7. Micropropagao de bananeira .
Aps sucessivos subcultivos sob efeito do adequado balano de
reguladores de crescimento para multiplicao in vitro, os explantes
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so enraizados e aclimatados, dando origem a plantas completas que
so utilizadas como material propagativo de qualidade superior por
serem livres de patgenos, serem geneticamente uniformes e fisio-
logimente mais ativas (Figura 8).
Figura 8. Mudas micropropagadas de abacaxi em aclimatao .
Esse mtodo de propagao explorado intensivamente na hor-
ticultura e na indstria de mudas para a propagao clonal de mui-
tas espcies dicotiledneas, monocotiledneas e gimnospermas. A
micropropagao tem sido crescentemente utilizada na produo de
material propagativo de espcies ornamentais (SANTOS, 2009), fru-
teiras, como a bananeira (MATSUMOTO; SILVA NETO, 2003), e flo-
restais, como eucaliptus e pinus (ARENHART; ZAFFARI, 2008). A
limitao de uma aplicao mais ampla da micropropagao reside
no custo de produo, que ainda se apresenta alto para algumas esp-
cies. Os itens que mais oneram os custos so a necessidade do uso
intensivo de mo-de-obra para as repicagens e as perdas por contami-
nao, que podem ser muito altas dependendo da espcie e da infra-
estrutura laboratorial disponvel.
Com vistas a superar problemas de custo e a falta de adaptao de
algumas espcies, sobretudo as lenhosas, s metodologias de organo-
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gnese anteriormente relatadas, a embriognese somtica tem sido
utilizada em sistemas direcionados propagao massal de plantas
(NOMURA; KOMAMINE, 1985). A rpida multiplicao de embri-
es somticos (Figura 9) possvel em bioreatores automatizados,
diminuindo sensivelmente o custo de produo de plantas clona-
das in vitro devido ao efeito escala e reduo de custo em mo-de-
-obra (TEIXEIRA, 2002). Esses embries somticos podem, ainda, ser
encapsulados individualmente para uso como sementes sintticas
(TEIXEIRA; TORRES, 1999). Diferentes tipos de bioreatores tm sido
testados e usados com sucesso para aumentar a escala da embriog-
nese (GEORGE et al., 2008).
Figura 9. Embries somticos de caf (Coffea arbica ).
Por meio de gemas axilares, alcana-se o menor nmero de pln-
tulas, mas elas so geralmente geneticamente mais padronizadas,
enquanto a embriognese somtica tem o potencial para produzir
quantidade infinitamente superior de plntulas, mas comparativa-
mente vivel em menor nmero de espcies. Comercialmente,
numerosas espcies so produzidas, principalmente via cultivo
de gemas axilares (MURASHIGE, 1990; MATSUMOTO; SILVA
NETO, 2003). Existem protocolos de larga escala para outras clas-
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ses de plantas, incluindo culturas agrcolas e florestais, mas o custo
de produo o fator limitante para a ampliao do seu uso comer-
cial (ZIMMERMAN, 1986). A evoluo dos estudos de embriog-
nese somtica associados e seu cultivo em bioreatores para um maior
nmero de espcies tender a viabilizar comercialmente a micropro-
pagao em larga escala (Figura 10).
Figura 10. Explantes de bananeira (Musa spp.) sendo cultivados em bioreator.
Produo de metablitos secundrios
As plantas superiores produzem uma grande quantidade de subs-
tncias qumicas, as quais podem ser de interesse farmacutico e
industrial. A primeira tentativa de cultivar clulas em larga escala para
a produo de frmacos foi na dcada de 1950 na companhia Pfizer,
com pouco sucesso inicialmente. Entretanto as pesquisas permitiram
que a partir de 1978 a tcnica fosse considerada vivel, com base em
pesquisas feitas na Alemanha e Japo, principalmente (ZENK, 1978).
Em 1987 havia 30 sistemas de cultura estabelecidos que foram consi-
derados melhores produtores de metabolitos secundrios que as res-
pectivas plantas (SMITH, 2000).
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Muitos dos produtos qumicos vegetais considerados impor-
tantes tm possibilidade de serem formados em cultura de clu-
las vegetais. Diferentes metodologias tm sido desenvolvidas
para melhorar a produtividade de metabolitos secundrios. Estes
incluem a clonagem de clulas e seleo repetida de linhagens
altamente produtivas a partir de populaes de clulas hetero-
gneas (ZENK, 1978; DOUGALL, 1987) e pelo uso de Elisa e
tcnicas de radioimunoensaio (KEMP; MORGAN, 1987). Outra
metodologia envolve a seleo de linhas mutantes de clulas
superprodutoras do produto desejvel (WIDHOLM, 1987). Da
mesma forma que fatores abiticos, como radiao UV, expo-
sio ao calor ou frio, e sais de metais pesados e estimulantes
de natureza vegetal ou microbiolgica tm sido utilizados para
melhorar a produtividade de produtos secundrios (EILERT, 1987;
KURZ, 1988).
O fator principal para o sucesso da produo em escala comer-
cial de substncias biologicamente ativas a capacidade de cres-
cer clulas em larga escala. Isso tem sido conseguido com o uso
de bioreatores sob agitao e vrios tipos de bioreatores com sis-
temas de ar forado (FOWLER, 1987). Para muitos sistemas, o
processo de cultivo em dois estgios (ou duas fases) tem sido tes-
tado (BEIDERBECK; KNOOP, 1987; FOWLER, 1987). No pri-
meiro estgio, rpido crescimento de clulas e acumulao de
biomassa enfatizado, enquanto, no segundo estgio, focaliza-
-se a sntese de produto com mnima diviso celular. Fujita e
Tabata (1987) relataram a produo comercial em larga escala do
metablito secundrio shikonina, que um derivado da nafto-
quinona com ao similar da insulina, por cultura de clulas.
As pesquisas continuam sendo realizadas com novas espcies
vegetais e outras tecnologias, e podem ser viabilizadas medida
que as pesquisas avancem.
Consideraes finais
A ferramenta biotecnolgica da cultura de tecidos vegetais tem
papel relevante em vrias linhas de pesquisa de natureza bsica e
aplicada, e seu uso tem sido largamente empregado na indstria da
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propagao de plantas. Isso confere ao sistema produtivo de muitas
espcies agrcolas e florestais vantagens qualitativas do ponto de vista
gentico e fitopatolgico, resultando em maior produtividade com
menor demanda por defensivos, refletindo nos custos e na susten-
tabilidade econmica e ambiental do sistema produtivo. As tcnicas
de melhoramento gentico por transgenia tm na cultura de tecidos
uma ferramenta bsica, sem a qual no se alcana a regenerao da
planta transgnica completa e funcional a partir da clula genetica-
mente modificada. Muitas outras metodologias importantes no campo
da cultura de tecidos vegetais tm sido diariamente implementadas
e tem trazido novas possibilidades para o desenvolvimento e aplica-
o da biotecnologia na agropecuria. A intensificao das pesquisas
no campo da cultura de tecidos possibilitar a aplicao dos benef-
cios acima mencionados em um maior nmero de espcies vegetais,
incluindo muitas das espcies nativas brasileiras, que at o momento
foram pouco estudadas.
Referncias
AMMIRATO, P. V. Embryogenesis. In: EVANS, D. A.; SHARP, W. R.;
AMMIRATO, P. V.; YAMADA, Y. Handbook of plant cell culture. New York:
MacMillan. 1983. v.1. p. 82-123.
ANDRADE, S. R. M. Princpios da cultura de tecidos vegetais. Planaltina,DF:
ARENHART, R. A.; ZAFFARI, G. R. Otimizao do protocolo de micropropagao
por organognese indireta de Eucalyptus grandis. Revista de Cincias
Agroveterinrias,, v. 7, n. 1, 2008.
BEIDERBECK, R.; KNOOP, B. Two-phase culture. In: CONSTABEL, F.; VASIL, I.
K. Cell culture and somatic cell genetics of plants. New York: Academic Press 1987.
v. 4. p. 255-266.
BHOJWANI, S. S.; RAZDAN, M. K. Plant tissue culture: theory and practice -
Developments in crop science. Amsterdam: Elsevier, 1983.
BINDING, H. Regeneration from protoplasts. In: VASIL, I. K. Cell culture and
somatic genetics of plants. New York: Academic Press, 1986. v.1. p. 259-274.
BOURGIN, J. P.; NITCH, J. P. Obtention de nicotiana haploides a partir
detamines cultives in vitro. Annales de Physialagie Vg tale, v. 9. p. 377-382, 1967.
430
CARLSON, P. S.; SMITH, H. H.; DEARING, R. D. Parasexual inter specific plant
hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., v. 69.
p. 2292-2294, 1972.
CHETRIT, P.; MATHIEU, C.; VEDEL, E.; PELLETIER, G.; PRIMARD, C.;
PELLETIER, G. Mitochondrial DNA polymorphism induced by protoplast fusion
in Cruciferae. Theoretical and Applied Genetics, v. 69, p. 361-366, 1985.
COLLINS, G. B.; GROSSER, J. W. Culture of embryos. In: VASIL, I. K. Cell culture
and somatic cell genetics of plants. New York: Academic Press, 1984. v. 1, p. 241-257.
CONSTABEL, E.; VASIL, I. K. Cell culture and somatic cell genetics of plants. New
York: Academic Press. 1988. v. 5.
CROSSWAY, A.; OAKES, J. V.; IRVINE, J. M.; WARD, B.; KNAUF, V. C.;
SHOEMAKER, C. R. Integration of foreign DNA following microinjection of
tobacco mesophyll protoplasts. Molecular and General Genetics n. , 202, p. 179-
185. 1986.
D AMATO, E. Chromosome number variation in cultured cells and regenerated
plants. In: THORPE, A. Frontiers of plant tissue culture. Univ. of Calgary:
International Association of Plant Tissue Culture. 1978. p. 287-295.
DAUGALL, D. K. Primary metabolism and its regulation. In: GREEN, E.;
SOMERS, D. A.; HACKETT, W. P.; BIESBOER, D. D. Plant tissue and cell culture.
New York: A R Liss, 1987. p. 97-117.
DAUGALL, D. K. Primary metabolism and its regulation. In: GRENN, E.;
SOMERS, D. A.; HACKET, W. P.; BIESBOER, D. D. (Ed.). Plant tissue and cell
culture. New York: A R Liss, 1987. p. 97-117.
DEBLOCK, M.; HERRERA-ESTRELLA, L.; VAN MONTAGUE, M.; SCHELL, J.;
ZAMBRYSKI, P. Expression of foreign genes in regenerated plants and in their
progeny. EMBO Journal, v. 3, p. 1681-1689. 1984.
DESHAYES, A.; HERRERA-ESTRELLA, L.; CABOCHE, M. Lposome mediated
transfarmation of tobacco mesophyll protoplasts by an Escherichia coli plasmid.
EMBO Journal, v. 4, p. 2731-2739. 1985
DODDS, J. Tissue culture for germplasm management and dis tribution. In:
COHEN, J. I. Strengthening collaboration in bio technology: International
agricultural research and the private sector. Washington, D.c.: Bureau of Science
and Technology, AID. 1989. p. 109-128.
EILERT, U. Elicitation: methodology and aspects of application. In: CONSTABEL,
F.; VASIL, I. K. (Ed.). Cell culture and somatic cell genetics of plants. New York:
Academic Press. 1987. p. 153-196. v. 4.
EVANS, D. A.; SHARP, W. R.; BRAVO, J. E. Cell culture methods for crop
improvement. In: SHARP, W. R.; EVANS, D. A.; AMMIRATO, P. V.; YAMADA, Y.,
Handbook of plant cell culture. New York: Macmillan. 1984 v. 2. p. 47-68.
431
FLICH, C. E. Isolation of mutants from cell culture. In: EVANS, D. A.; SHARP,
W. R.; AMMIRATO, P. V.; YAMADA, Y. (Ed.). Handbook of plant cell culture. New
York: Macmillan. p. 393-444. 1983. v. 1.
FOWLER, M. W. Process systems and approaches for large scale plant cell culture.
In: GREEN, C. E.; SOMERS, D. A.; HACKETT, W. P.; BIESBOER, D. D. (Ed.).
Plant tissue and cell culture. New York: A R. Liss. 1987. p. 459-471.
GAHAN, P. B.; GEORGE, E. F. Adventitious regeneration. In: GEORGE, E. F.;
HALL, M. A.; DE KLERK, G. -J. Plant propagation by tissue culture. Dordrech, The
Netherlands: Springer , 2008. p. 355-402. v. 1.
GEORGE, E. F. Plant tissue culture procedure: background. In: GEORGE, E.
V.; HALL, M. A.; DE KLERK, G -J. Plant propagation by tissue culture. Springer,
Dordrech, The Netherlands. 2008. p. 1-28. v. 1.
GUHA, S.; MAHESWARI, S. C. Cell division and differentia tion of embryos in the
pollen grains of datura in vitro. Nature, v. 212, p. 97-98, 1996.
HABERLANDT, G. Kulturversuche mit isolierten pflanzenzellen. Sitzungsber.
Akad. Wiss. Wien., Math.-Naturwiss. K. L. Abt, v. 1, 111. p. 69-92, 1902.
HU, H.; GUO, X. In vitro induced haploids in plant genetics and breeding. In:
SOH, W. Y.; BHOJWANI, S. S, (Ed.). Morphogenesis in plant tissue cultures.
Dordrecht: Kluwer, 1999 p. 329-361.
JACOBS, M.; NEGRUITIU, L.; DIRKS, R.; CAMMAERTS, D. Selection
programmes for isolation and analysis of mutants in plant cell cultures. In: GREE,
C. E.; SOMERS, D. A. HACKETT, W. P.; BIESBOER, D. D. Biesboer (Ed.), Plant
tissue and cell culture. New York: A R Liss. 1987. p. 243-264.
KANTA, K.; RANGASWAMY, N. S.; MAHESHWARI, P. Test-tube fertilization in
flowering plants. Nature, 194. 1962. p. 1214-1217.
KARTHA, K. K. Meristem culture and cryopreservation meth ods and applications.
In: THORPE, T. A. (Ed.). Plant tissue culture: methods and applications in
agriculture. New York: Academic Press. 1981. p. 181-211.
KEMP, H. A.; MORGAN, M. R A. Use of immunoassays in the detection of pIant
cell products. In: CONSTABEL, F.; VASIL, K. (Ed.). Cell culture and somatic cell
genetics of plants. New York: Academic Press. 1987. p. 287-302. v. 4.
KERBAUY, G.B. Clonagem de plantas in vitro: uma realidade. Biotecnologia.
Cincia e Desenvolvimento, v. 1. 1997. p. 30-33.
KLEIN, T. M.; WOLF, E. D.; WU, R.; SANFORD, J. C. High-velocity microprojectiles
for delivering nucleic acids into living cells. Nature, 327. 1987. p. 70-73.
KURZ, W, G. W. Semicontinuous metabolite production through repeated
elicitation of plant cell cultures: A novel pro cess. In: MABRY, T. J. (Ed.). Plant
biotechnology. Austin, TX: IC2 Institute. 1988. p. 93-103.
432
LARKIN, P. J.; SCOWCROFT, W. R. Somaclonal variation-a novel source of
variability from cell culture for plant improve ment. Theoretical and Applied
Genetics, v. 60. p. 197-214. 1981.
LARKIN, P. J.; BRETTELL, R. L S.; RYAN, S. A.; DAVIES, P. A.; PALLOTTA, M. A.;
SCOWCROFT, W. R. Somaclonal variation: Impact on plant biology and breeding
strategies. In: DAY, P.; ZAITLIN, M.; HOLLAENDER, A. (Ed.). Biotechnology in
plant science. New York: Academic Press. p. 83-100. 1987.
MATSUMOTO, K. ; LIMA, F. A. ; MORAIS, L. S. ; SILVA NETO, S. P. ; SOUZA,
A. S. Na casa de vegetao e em campo: estudo preliminar dos hbridos somaticos
de bananeria obtidos da fusao de protoplastos, em respeito ao comportamento. In:
ENCONTRO LATINO-AMERICANO DE BIOTECNOLOGIA, 4., 2001, Goinia,
GO. Anais... Goinia, GO : REDBIOA/FAO, 2001.
MATSUMOTO, K.; SILVA NETO, S. P. Micropropagation of bananas. In: JAIN,
S. M.; Ishii, K. (Org.). Micropropagation of woody trees and fruits. Netherlands:
Kluwer Academic Publishers, 2003, p. 353-380.
MURASHIGE, T. Plant propagation by tissue culture: practice with unrealized
potentiaI. In: AMMIRATO, P. V.; EVANS, D. A.; SHARP, W. R.; BAJAJ, Y. P. S.
Handbook of plant cell culture. New York: McGraw-HilI. 1990. v. 5, p. 3-9.
MURASHIGE, T. Plant propagation through tissue culture. An nual Review of
Plant Physiology, v. 25, p. 135-166, 1974.
MURASHIGE, T. The impact of plant tissue culture on agricul ture. In: THORPE,
T. A. Frontiers of plant tissue culture 1978. Calgary: International Association of
Plant Tissue Culture. 1978. p. 15-26, 518-524.
NAGATA, T.; TAKEBE, I. Planting of isolated tobacco mesophyll protoplasts on
agar medium. Planta, v. 99, 1971. p. 12-20.
NOMURA, K.; KOMAMINE, A. Identification and isolation of single cells that
produce somatic embryos at a high frequency in a carrot suspension culture. Plant
Physiology, v. 79, p. 988-991. 1985.
NOMURA, K.; KOMAMINE, A. Physiological and biochemical aspects of somatic
embryogenesis. In: THORPE, T. A. In vitro embryogenesis in plants Oordrecht.
The Netherlands: Kluwer. 1995. p. 249-265.
POTRYKUS, L.; SHILLITO, R.O.; SAUL, M.; PASZKOWSKI, J. Direct gene
transfer: State of the art and future potential. Plant Molecular Biology Report, v. 3,
p. 117-128, 1985.
RAGHAVAN, V. Embryo culture. International Review of Cytology,
Supplement,11B, p. 209-240. 1980.
RANCH, J. R.; RICH, S.; BROTHERTON, J.E.; WIDHOM, J. Ex pression of
5-methyltryptophan resistance in plants regenerated from resistant cell lines of
Datura innoxia. Plant Physiology, v. 71, p. 136-140, 1983.
433
RAZDAN, M. K. Introduction to plant tissue culture. Science Publishers, Inc.
Enfield, NH, USA, 2003. 375 p.
SAN, L. H.; GELEBART, P. Production of gynogenetichaploids. In: VASIL, I. K.
Cell culture and somatic cell genetics of plants. New York: Academic Press. 1986.
p. 305-322. v. 3.
SANTOS, D. S. Micropropagao da bromelia ornamental acanthostachys
strobilacea (Schultz F.) klotzsch e a influencia do etileno. 2009. 121 f. Dissertao
(Mestrado). Universidade de So Paulo. Instituto de Botnica.
SCHELL, J. S. Progress in plant sciences is our best hope to achieve an
economically rewarding, sustainable and environ mentally stable agriculture. Plant
Tissue Culture Biotechnology, v. 1,p. 10-12, 1995.
SCHIEDER, O.; KOHN, H. Protoplast fusion and generation of somatic hybrids.
In: VASIL, I. K., Cell culture and somatic cell genetics of plants. New York:
Academic Press. 1986, p. 569-588. v. 3.
SCOWCROFT, W. R.; BRETTELL, R. I. S.; RYAN, S. A.; DAVIES, P. A.;
PALLOTTA, M. A. Somaclonal variation and genomic flux. In: GREEN, C. E.;
SOMERS, D. A.; HACKETT, W. P.; BIESBOER, D. D. Plant tissue and cell culture.
New York: A. R. Liss. 1987. p. 275-286.
SILVA NETO, S. P. Propagao por biotecnologia. In: RUGGIERO, C.(Org.).
Bananicultura. Jaboticabal SP: FUNEP, 2001, p. 128-149.
SKOOG, E.; MILLER, C. Chemical regulation of growth and organ formation in
plant tissue cultures in vitro. Symposium of the Society of Experimental Biology,
v. 11, p. 118-131, 1957.
SMITH, R. H. Plant tissue culture: techniques and experiments. San Diego,
California: Academic Press, 2000. 231 p.
TEIXEIRA, J. B. Biorreatores. Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento, v. 4,
n. 24, p. 36-41, 2002.
TEIXEIRA, J. B.; TORRES, A. C. Embriognese Somtica e sementes sintticas. In:
TORRES, A. C.; CALDAS, L. S. (Org.). Cultura de tecidos e transformao gentica
de plantas. Braslia: Embrapa-SPI, 1999, p. 568-568. v. 2.
THOMAS, D.; BHATNAGAR, A. K.; RAZDAN, M. K.; BHOJWANI, S. S. A
reproducible protocol for the production of gynogenic haploids of mulberry, Morus
Alba L. Euphytica, v. 110, p.169-173, 1999.
THORPE, T. A. In vitro somatic embryogenesis. ISI Atlas of Sci ence: animal and
plant science, p. 81-88, 1988.
THORPE, T. A. The current status of plant tissue culture. In: BHOJWANI, S. S.,
Plant tissue culture: applications and limitations. Amsterdam: Elsevier, 1990. p. 1-33.
434
WHITE, P. R. Multiplication of the viruses of tobacco and Aucuba mosaics in
growing excised tomato root tips. Phytopathol ogy, v. 24, p. 1003-1011, 1934.
WITHERS, L. A. Cryopreservation of cultured cells and meri stems. In: VASIL, I. K.
(Ed.). Cell culture and somatic cell genetics of plants. New York: Academie Press,
1985. p. 253-316.
WIDHOLM, J. M. Selection of mutants which accumulate desir able secondary
products. In: CONSTABEL, F.; VASIL, I. K. Cell culture and somatic cell genetics
of plants. New York: Academic Press. 1987. p. 125-137. v. 4.
WINK, M. Physiology of the accumulation of secondary me tabolites with special
reference to alkaloids. In: CONSTABEL, F.; VASIL, I.K. Cell culture and somatic
cell genetics of plants. New York: Academic Press. 1987. v. 4, p. 17-42.
WITHERS, L. A. Cryopreservation of cultured cells and meri stems. In: VASIL,
I. K., Cell culture and somatic cell genetics of plants. New York: Academie Press,
1985, p. 253-316. v. 2.
YEUNG, E. C.; THORPE, T. A.; JENSEN, C. J. In vitro fertilization and embryo
culture. In: THORPE, T. A. Plant tissue culture: methods and applications in
agricuIture. New York: Academic Press. 1981. p. 253-271.
ZENK, M. H. The impact of plant cell culture on industry. In: THORPE, T. A.
Frontiers of plant tissue culture. Univ. of Calgary: International Association of
Plant Tissue Culture, 1978. p. 1-13.
ZENKTELER, M. In vitro pollination and fertilization. In: VASIL, I. K. Cell culture
and somatic cell genetics of plants. New York: Academic Press. 1984. p. 269- 275. v. 1.
ZIMMERMAN, R. H. Regeneration in woody ornamentals and fruit trees. In:
VASIL, I. K., Cell culture and somatic cell genetics of plants. New York: Academic
Press. 1986. p. 243-258. v. 3.
ANDRADE, S. R. M. Princpios da cultura de tecidos vegetais. Planaltina, DF:
TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformao
gentica de plantas. Braslia, DF: Embrapa SPI: Embrapa CNPH, 1998. 864 p. 2 v.
GEORGE, E. F.; HALL, M. A.; DE KLERK, G. -J. Plant propagation by tissue
culture. Dordrech, The Netherlands: Springer, 2008. 501 p.
437
Engenharia gentica: princpios
cientficos e aplicaes
Fbio Gelape Faleiro
Introduo
O melhoramento gentico iniciou entre 8 e 10 mil anos atrs, basi-
camente com a mudana de comportamento do homem, que deixou
de ser nmade e se xou em locais mais protegidos e com maior faci-
lidade de coleta de alimentos. Esse comportamento gerou a necessi-
dade de plantar espcies vegetais a partir da identicao e seleo de
indivduos mais saborosos, saudveis, produtivos, resistentes e teis.
Durante esse processo, domesticamos grande parte das espcies, sele-
cionando empiricamente os indivduos que apresentavam caracte-
rsticas agronmicas reproduzveis, maior uniformidade e produti-
vidade (ORGANIZATION FOR ECONOMIC COOPERATION AND
DEVELOPMENT, 1993). Entretanto, no incio do sculo XX, aps a
redescoberta das leis de Mendel, do desenvolvimento dos estudos
bsicos da hereditariedade e do uso de estatstica para seleo e cru-
zamento de indivduos, esses estudos passaram a ser realizados com
base cientca, aumentando-se a ecincia do melhoramento gen-
tico (ANDRADE; FALEIRO, 2009; ARAGO, 2009).
O melhoramento gentico vegetal visa obteno de plantas mais
produtivas, adaptadas a diferentes agroecossistemas, resistentes a
doenas e pragas e com maior qualidade nutricional. O grande desa-
o atual produzir alimentos em quantidade e qualidade e ao mesmo
tempo minimizar o impacto ambiental e reduzir o uso de defensivos
agrcolas. Grandes avanos foram obtidos pelo melhoramento gen-
tico no sentido de aumentar a produtividade das culturas e consequen-
temente diminuir o preo dos alimentos.
Esses resultados de produtividade foram obtidos devido pes-
quisa agrcola, nas reas de melhoramento gentico vegetal e tam-
bm melhoramento ambiental com o desenvolvimento de tcnicas
de manejo das culturas. No entanto, apesar dos grandes avanos
438
obtidos, o melhoramento convencional apresenta algumas limita-
es, como, por exemplo, a ligao gnica entre genes de interesse e
genes indesejveis e a incompatibilidade interespecca. Para elimi-
nar essas limitaes, a engenharia gentica surgiu como uma ferra-
menta extremamente til, pois permite a identicao de genes de
interesse, manipulao desses genes, a construo e introduo de um
nico gene de interesse diretamente em cultivares elite e a seleo das
plantas que possuem esse gene. O gene a ser introduzido pode ser
oriundo da mesma espcie ou de outras espcies, permitindo assim
a quebra das barreiras impostas pela incompatibilidade sexual entre
as diferentes espcies, alm de eliminar o efeito das ligaes gnicas
indesejadas (ANDRADE, 2003).
Neste captulo, so apresentados os princpios cientcos da enge-
nharia gentica como aspectos conceituais e histricos, enfocando a
transformao gentica e suas diferentes etapas. Aspectos tecnolgi-
cos e aplicados da engenharia gentica envolvendo a obteno de orga-
nismos geneticamente modicados tambm so discutidos e exem-
plicados neste captulo.
Conceito de engenharia gentica
Para entender melhor o assunto discutido neste captulo, preciso
diferenciar a engenharia gentica da biotecnologia. muito comum
tratar biotecnologia como sinnimo de engenharia gentica. Os con-
ceitos relatados abaixo ajudam a entender que a engenharia gentica
um conjunto de tcnicas ligado biotecnologia.
1) Engenharia gentica refere-se ao conjunto de tcnicas de biolo-
gia e gentica molecular que resulta na construo de molcu-
las de DNA quimricas ou recombinantes.
2) O DNA recombinante o resultado da ligao, em laboratrio,
de fragmentos de DNA oriundos de diferentes vetores, clu-
las, organismos ou espcies.
3) Transformao gentica a introduo e integrao de DNA em
uma clula hospedeira; processo usual em laboratrios aps o
desenvolvimento da engenharia gentica.
4) Biotecnologia um conjunto de tcnicas que gera produtos e
processos de origem biolgica sendo a engenharia gentica
439
Captulo 15 Engenharia gentica: princpios cientficos e aplicaes
um exemplo dessas tcnicas (Conselho de Informaes sobre
Biotecnologia, 2009). Existe tambm o conceito de biotecnolo-
gia moderna, a qual est mais relacionada engenharia gen-
tica (conra Cap. 1, desta obra).
A histria da engenharia gentica
A engenharia gentica surgiu em 1972 com a associao de Stanley
Cohen da Universidade de Stanford e Hebert Boyer da Universidade
da Califrnia. Cohen e colaboradores (1972) haviam obtido a transfe-
rncia e clonagem de plasmdios contendo genes de resistncia ml-
tipla a antibiticos para a bactria Escherichia coli. Boyer havia desco-
berto enzimas de restrio que cortavam DNA em regies especcas
produzindo nais coesivos que permitiam a ligao com outras sequ-
ncias de DNA. Jackson e colaboradores (1972) criaram uma mol-
cula hbrida de DNA contendo o genoma completo do Vrus Simian 40
e um segmento de DNA responsvel pelo metabolismo da galactose
em Escherichia coli C600 (ANDRADE; FALEIRO, 2009; ARAGO,
2009). Esse trabalho foi o pioneiro da tecnologia do DNA recombi-
nante, surgindo como importante ferramenta para analisar a estru-
tura e funo de genes de mamferos, sendo a base para o recebimento
do prmio Nobel em Qumica de 1980 (BERG, 2004), juntamente
com Walter Gilbert (EUA) e Frederick Sanger (Inglaterra) (Figura 1).
Figura 1. Ganhadores do Prmio Nobel de Qumica em 1980: (A) Paul Berg;
(B) Walter Gilbert; (C) Frederick Sanger.
Fonte: Wikipedia, 2009.
440
Com base nesses trabalhos pioneiros, foram desenvolvidos e otimi-
zados protocolos para extrao, restrio, ligao, clonagem e recom-
binao de fragmentos de DNA. Essa engenharia gentica resultou
no desenvolvimento de uma importante ferramenta cientca e tecno-
logia: a transformao gentica. Por meio da transformao gentica,
est sendo possvel a obteno dos chamados organismos genetica-
mente modicados ou organismos transgnicos. O primeiro orga-
nismo transgnico foi a bactria Escherichia coli contendo sequncia
do anfbio Xenopus laevis e o primeiro organismo comercial geneti-
camente modicado foi uma bactria expressando gene da insulina
humana (ARAGO, 2009).
Transformao gentica
A transformao gentica a introduo controlada de cidos
nucleicos utilizando ferramentas de engenharia gentica. Um dos
objetivos da transformao gentica a obteno dos organismos
geneticamente modicados. Para efeito didtico, podemos dividir a
transformao gentica em cinco etapas:
1) Identicao, isolamento e caracterizao do gene de interesse.
2) Construo de um cassete de expresso e clonagem.
3) Transformao propriamente dita.
4) Regenerao e seleo das clulas transformadas.
5) Testes dos organismos transformados.
Na Figura 2, ilustram-se as principais etapas envolvidas na obten-
o de organismos geneticamente modicados. Essas etapas so dis-
cutidas a seguir.
441
Identificao
do gene
de interesse
Isolamento
Clonagem
Enzimas de
restrio
Insero do
gene
Multiplicao
do gene
Transformao
Testes finais
Bactria incubada
com clulas vegetais
Transferncia do
gene para o
genoma da planta
insero do gene
no plasmdio Ti
DNA adsorvido em
Micropartculas
Clulas bombardeadas
e insero do gene
no genoma da planta
Clulas selecionadas
para o transgene
Clulas transformadas
selecionadas por
um marcador
Anlises
moleculares
Anlise
da prognie
Planta transgnica
regenerada de um a
clula transformada
Replicao do
gene
Agrobacterium
A
Bombardeamento
B
Seleo das clulas
contendo o
transgene
C
Gene de interresse
Testes em casa de
vegetao e no campo
1 2 3 4 5 6 7 8
Figura 2. Etapas da transformao: identicao dos genes, isolamento, clo-
nagem, transformao gentica e avaliao da transformao.
Fonte: Andrade, 2003.
442
Identificao, isolamento e caracterizao do gene de interesse
A identicao (prospeco), localizao e isolamento dos genes de
interesse so os procedimentos iniciais do processo de transforma-
o gentica. Os genes podem ser prospectados em microrganismos,
plantas e animais. Existem diversos processos para identicao de
genes, sendo a extrao de RNA mensageiro (mRNA) e formao de
bibliotecas de DNA complementar (cDNA) o mtodo mais utilizado.
No entanto, tambm pode-se prospectar genes em Bibliotecas consti-
tudas com o genoma completo (bibliotecas de DNA) e por diagnstico
utilizando sondas de protenas (CORDEIRO, 2003). Aps o sequen-
ciamento dos cidos nucleicos ou protenas, procuram-se homologias
em bancos na Internet (ARAGO, 2009). Informaes mais aprofun-
dadas sobres os mtodos podem ser obtidas nos captulos Prospeco
Gnica e Bioinformtica (conra Cap. 4, desta obra) e Biotecnologia e
Diagnsticos Moleculares (conra Cap. 7, desta obra).
Os principais genes procurados para transformao gentica
so aqueles associados a caractersticas de produtividade, resis-
tncia a estresses biticos e abiticos e qualidade nutricional. A
identicao, isolamento e caracterizao desses genes ainda
so grandes gargalos da engenharia gentica, pois, alm do
longo tempo necessrio para essa etapa, tambm existem ques-
tes relacionadas propriedade intelectual de vetores, promo-
tores, mtodo de transformao e do prprio gene. Programas
de sequenciamento de genomas de diversas espcies vegetais,
animais e microorganismos tm sido realizados em todo o
mundo com o intuito de identic-los. No entanto, notamos a
diculdade desse processo pela baixa disponibilidade de genes
caractersticos de interesse econmico, como os citados acima
nos bancos de genes mundiais (ANDRADE, 2003; FERREIRA;
FALEIRO; 2008).
Construo do cassete de expresso e clonagem
Nessa fase, aps a identicao e caracterizao do gene de inte-
resse, ele passa por uma srie de modicaes antes que seja utilizado
443
na transformao propriamente dita. Nesse processo, empregam-se
enzimas de restries e DNA ligases para manipular o DNA e cons-
truir o cassete de expresso (ANDRADE, 2003).
Enzimas de restrio so endonucleases que cortam o DNA origi-
nando fragmentos de tamanho idntico e formando pontas adesivas
(Figura 3). Esses cortes geralmente ocorrem em regies palindrmi-
cas, ou seja, mesma sequncia em ambos os sentidos. Existe uma
especicidade das enzimas de restrio, pois o DNA sempre cor-
tado em locais precisos, em uma determinada sequncia com 4 a 6
pares de bases nitrogenadas, chamados stios de restrio (Tabela 1).
Essas enzimas existem naturalmente em bactrias e esto relaciona-
das ao sistema de proteo, no entanto podem reconhecer o stio de
corte no DNA de qualquer espcie, tanto vrus, bactrias, plantas ou
animais. A descoberta dessas enzimas foi crucial para o desenvolvi-
mento da engenharia gentica.
MOLCULA A MOLCULA B
3'------ C C T A G G -------- 5'
5'------ G G A T C C -------- 3'
3'------ C C T A G G -------- 5'
: :
5'------ G --- G A T C C -------- 3'
Enzima de restrio
Pontas
adesivas
Mix
3'------ C C T A G --- G -------- 5'
5'------ G G A T C C --------- 3'
3'------ C C T A G G --------- 5'
DNA Ligase
DNA Recombinante :
5'------ G G A T C C -------- 3'
: : : : : : : : : :
: : : : :
5'------ G
3'------ C C T A G
:
:
G ---- 5'
G A T C C 3' ----
:
: : : : :
Figura 3. Esquema da sntese de uma molcula de DNA recombinante
demonstrando a atuao da enzima de restrio cortando o DNA nas regies
palindrmicas e formando as pontas adesivas seguida da atuao da DNA
ligase colando uma ponta outra.
444
Tabela 1. Principais enzimas de restrio utilizadas na Engenharia
Gentica. As setas vermelhas indicam os stios de restrio, e as
regies sublinhas indicam as pontas adesivas.
Enzimas Organismo fonte Stio de restrio
EcoRI Escherichia coli
5'-G-A-A-T-T-C-
-C-T-T-A-A-G-5'
PstI Providencia stuartii
5'-C-T-G-C-A-G-
-G-A-C-G-T-C-5'
SmaI Serratia marcescens
5'-C-C-C-G-G-G-
-G-G-G-C-C-C 5'
HaeIII Haemophilus aegyptius
5'-G-G-C-C
-C-C-G-G- 5'
HpaII Haemophilus parainfluenzae
5'-C-C-G-G-
-G-G-C-C-5'
Outro grupo de enzimas importantes para a engenharia gentica

so as DNAs ligases. Essas enzimas promovem a unio de molculas
de DNA pela formao de pontes de hidrognio entre os pares de base
e de uma ligao covalente (fosfodister) entre a extremidade 3-OH e
outra 5-PO (Figura 3). Esse processo ocorre facilmente quando exis-
tem fragmentos coesivos (pontas adesivas). Na ausncia desses frag-
mentos, a ecincia dessa ligao diminuda. Nesses casos, pode-se
utilizar um dos seguintes mtodos:
a) Adio de polidesoxi (A) na extremidade 3 do fragmento de
DNA e polidesoxi (T) na extremidade 3 do outro fragmento de
445
DNA, utilizando a DNA transferase, uma enzima incomum
que adiciona nucleotdeos extremidade de fragmentos ta
simples proeminente de uma cadeia de DNA.
b) Adio de oligonucleotdeos sintticos e complementares que
contm stios de clivagem para uma ou mais enzimas de res-
trio. Eles so unidos ao DNA com o auxlio da DNA ligase.
O cassete de DNA obtido deve conter pelo menos uma sequncia
promotora, o gene de interesse, uma sequncia terminadora e um
gene marcador de seleo ou reprter (Figura 4). A sequncia promo-
tora necessria para a correta expresso do gene, pois as enzimas
responsveis pela transcrio do gene reconhecem essa regio e se
acoplam a ela para que ocorra o processo. A sequncia terminadora
necessria para nalizar o processo de transcrio do gene. Por m,
para seleo das clulas transformadas, necessrio um gene repr-
ter como o GUS (- glucoronidase) ou o Green Fluorescent Protein
(GFP), ou um gene de seleo como resistncia a antibiticos, herbi-
cidas (ANDRADE, 2003; SOUZA JNIOR et al., 2001).
P1 Gene de interesse T1 T1 P2
Gene de seleo
T1 P3 Gene reprter
T1 = regio promotora = regio terminadora
Gene de interesse X gene de seleo X gene reprter
P1 P2 P3
Figura 4. Cassete de expresso contendo o gene de interesse, contendo
regies promotoras, terminadoras e genes de seleo .
Antes de ser utilizado para a transformao gentica propriamente
dita, o cassete de expresso precisa ser multiplicado, assim, so utili-
zados vetores para a clonagem. O vetor uma pequena molcula de
DNA que pode ser usada para introduzir o cassete de expresso em
uma clula hospedeira (CONSELHO DE INFORMAES SOBRE
BIOTECNOLOGIA, 2009). Esses vetores precisam ter algumas carac-
tersticas: (i) devem ter origem de replicao; (ii) conter stios de clo-
446
nagem para a insero do DNA exgeno; (iii) habilidade de se dupli-
car na clula hospedeira; (iv) marca gentica para selecionar a clula
contendo o vetor (resistncia a drogas ou marcas auxotrcas). Os
vetores mais utilizados so: plasmdios, bacterifagos (fagos), cos-
mdios, cromossomos articiais de levedura (YAC), vetores especiais
para plantas, clulas de insetos e mamferos. Uma vez multiplicados
pelas clulas hospedeiras, o DNA clonado pode ser utilizado para a
transformao gentica.
Transformao gentica propriamente dita
A transformao gentica ocorre em dois estgios: (i) a transfern-
cia do DNA e (ii) a integrao do DNA no genoma. A integrao um
processo com menor ecincia que a transferncia, assim, somente
uma parte das clulas que receberam o DNA obtm uma transforma-
o estvel (ALTPETER et al., 2005). As demais clulas apresentam
somente uma expresso transiente, ou seja, o DNA transferido, mas
no integrado e nalmente degradado por nucleases. Embora no
ocorra a integrao do DNA nem transformao estvel, clulas com
expresso transiente so estudadas para avaliar a ecincia da trans-
formao e a funcionalidade do cassete de expresso (SANTARM,
2000; ALTPETER et al., 2005).
Existem diversos mtodos de transformao, sendo que a esco-
lha depende da espcie a ser transformada, do tipo de explante utili-
zado (clula, tecido, protoplastos), da capacidade de regenerao do
explante e da disponibilidade de materiais. Os mtodos de transfor-
mao podem ser agrupados em duas categorias (Figura 5): (i) transfe-
rncia indireta, que tem como principal metodologia a transformao
mediada por Agrobacterium; e (ii) transferncia direta, que pode utili-
zar a transformao por biobalstica (bombardeamento de micropar-
tculas), eletroporao ou microinjeo (ANDRADE, 2003). Embora
todos os mtodos tenham suas vantagens e desvantagens, atualmente
a biobalstica e o Agrobacterium so os mais conhecidos e utilizados
para a transformao gentica de plantas (RAO et al., 2009).
447
Bactria incubada
com clulas vegetais
Transferncia do
gene para o
genoma da planta
Insero do gene
no plasmdio Ti
DNA adsorvido em
Micropartculas
Clulas bombardeadas
e insero do gene
no genoma da planta
Clulas selecionadas
para o transgene
Clulas transformadas
selecionadas por
um marcador
Planta transgnica
regenerada de uma
clula transformada
Replicao do
gene
Agrobacterium Bombardeamento
Seleo das clulas
contendo o
transgene
INDIRETA DIRETA
A B
C
Gene de interresse
Figura 5. Modelo esquemtico de transformao direta (bombardeamento)
e indireta (Agrobacterium).
Adaptado de: http://www.kicsforum.net/docsweb/images/Basics-Genetic-Modication-2.jpg
Transformao indireta
a transformao por meio de um vetor biolgico para intermediar
a transferncia do DNA. O mtodo mais eciente a transformao
mediada por Agrobacterium tumefaciens, mas tambm se pode utili-
zar A. rhizogenes e vrus vegetais com capacidade de transferncia de
DNA (SANTARM, 2000; RAO et al., 2009).
As bactrias do gnero Agrobacterium so topatgenos e possuem
a capacidade natural de transferir DNA para algumas espcies de
dicotiledneas, induzindo a formao de um tumor conhecido como
galha-da-coroa (crown gall) ou a sndrome-da-raiz-em-cabeleira (hairy
root) (Figura 6). A infeco ocorre em algum tipo de ferimento da
planta, onde a agrobactria reconhece o mesmo, acopla-se a planta e
inicia a transferncia do DNA (Figura 7). Estudos demonstraram que,
mesmo aps a desinfeco das plantas, os sintomas permaneciam,
sugerindo a presena de um fator determinante nas plantas infecta-
das. Mais tarde, foi identicado que a agrobactria transferia um frag-
448
mento do DNA, denominado T-DNA ou DNA de transferncia. Esse
fragmento era integrado ao genoma vegetal e se expressava de maneira
estvel. Assim, atravs de manipulao gentica do T-DNA, foi desen-
volvido o primeiro mtodo de transformao gentica de plantas
(PERMYOKOVA et al., 2009; ANDRADE, 2003; BRASILEIRO, 1993).
Figura 6. Evidncias de infeco por Agrobacterium: (A) galha-da-coroa; (B)
sndrome-da-raiz-em-cabeleira.
Fonte: Wikipedia, 2009.
Figura 7. Infeco por Agrobacterium: (A) Agrobacterium em ssura de folha
de feijo (M.E.); (B) Detalhe da infeco por Agrobacterium em folha de fei-
jo (M.O.). Seta indica local da ssura.
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O mtodo possui as vantagens de ser natural, apresentar alta pro-
babilidade de integrao do gene e a transferncia de um pequeno
nmero de transgenes. Por ser um mtodo muito conveniente, tem
sido bastante estudado e aprimorado. Foi demonstrado que o T-DNA
coberto por protenas Vir antes de ser transferido, para evitar a degra-
dao do DNA por endonucleases da planta (CYTOVSKY et al., 2007).
Pesquisas recentes tm demonstrado que ocorre transferncia no
somente do T-DNA, mas tambm das regies limites da esquerda e
direita deste T-DNA. Segundo Permyiakova e colaboradores (2009),
esse cuidado estaria ligado ao reconhecimento da rea de replicao
do T-DNA, proteo deste T-DNA contra endonucleases da planta e
ao processo integrao do T-DNA ao genoma da planta.
A desvantagem da transformao indireta que ela dependente da
suscetibilidade do vegetal infeco por Agrobacterium. No entanto,
com o avano no conhecimento dos mecanismos de transfern-
cia, j possvel obter em laboratrio a transferncia de genes para
vrias espcies de dicotiledneas, fungos e at para clulas huma-
nas (CYTOVSKY et al., 2007; PERMYAKOVA et al., 2009). Segundo
Permyakova e colaboradores (2009), atualmente a integrao do
T-DNA em monocotiledneas varia de 26% a 62%.
Transformao direta
a transformao por mtodos que no utilizam bactrias como
mediadoras. Esses mtodos foram desenvolvidos com o intuito de
obter a introduo de DNA em clulas de qualquer espcie ou reino
(vegetal, animal ou microrganismo), utilizando meios qumicos ou
fsicos. Nesse caso, o cassete de expresso introduzido nas clu-
las-alvo atravs de modicaes nas paredes e membranas celulares.
Atualmente, as principais metodologias utilizadas so a biobalstica
(bombardeamento ou acelerao de micropartculas), eletroporao
de protoplastos (choques eltricos), politileneglicol PEG ou fosfato
de clcio (agentes permeabilizantes) e microbras de carboneto de
silcio (processos fsicos) (ANDRADE, 2003; SANTARM, 2000; RAO
et al., 2009; ALTPETER et al., 2005). Entre esses mtodos, a transfor-
mao por bombardeamento de micropartculas a mais eciente e
de maior sucesso. Os demais mtodos apresentam baixa ecincia ou
450
no so reproduzveis em vrias espcies e situaes (SANTARM,
2000; ALTPETER et al., 2005).
Biobalstica ou bombardeamento de micropartculas
O mtodo foi desenvolvido por Sanford e colaboradores (SANFORD
et al., 1987) e consiste em bombardear clulas ou tecidos com micro-
partculas de tungstnio ou ouro carregando o DNA exgeno, lana-
das a partir de um acelerador que produz uma onda de choque atra-
vs de uma cmara especial em condio de vcuo (Figura 8). Os
sistemas que utilizam gs hlio sob alta presso e descarga eltrica
tm demonstrado maior ecincia na obteno dos transformantes
(RECH; ARAGO, 1998; LACORTE et al., 1999).
Figura 8. Transformao por bombardeamento de micropartculas.
(A) Aparelho de bombardeamento de micropartculas por presso de gs
(BioRad); (B) Desenho esquemtico do processo de interno do aparelho de
bombardeamento por presso de gs.
Fonte: http://depts.washington.edu/genomelb/BiolisticBombardment&MiscV3.html
A grande vantagem da biobalstica que permite a transformao
de clulas, tecidos e espcies de forma direta, simples e rpida, sendo
aplicvel para transferncia de genes a espcies nas quais os outros
mtodos so falhos. a nica tcnica que permite a transformao de
451
plastdios e mitocndrias, embora os mtodos ainda estejam sendo
aprimorados. , tambm, uma tcnica til na introduo e expresso
de genes em animais in vivo, e na induo da resposta imune utili-
zando DNA, atravs do processo denominado imunizao gentica
(ANDRADE, 2003; ALTPETER et al., 2005; RECH; ARAGO, 1998;
LACORTE et al., 1999).
Outra vantagem do bombardeamento de micropartculas que ele
facilita a transferncia mltipla de genes, pois permite a cotransfor-
mao pela mistura de diferentes construes de DNA, o que evita
estratgias complexas de clonagem (ALTPETER et al., 2005). No
entanto, apresenta a desvantagem de haver integrao de mltiplas
cpias, que, em geral, esto fortemente ligadas. Alm disso, as cpias
podem estar fragmentadas com os genes e vetores em diferentes posi-
es no genoma, podendo alterar ou silenciar a expresso dos genes
exgenos (ANDRADE, 2003; SANFORD, 1990; De BLOCK, 1993).
Inicialmente, a ecincia de obteno de transformantes estveis
cerca de 1% a 5%, com o aprimoramento da tcnica foram obti-
dos at 18% de ecincia em arroz (DANILOVA, 2007; SANFORD,
1990; POTRYKUS, 1990). O explante bombardeado tem que ser cri-
teriosamente selecionado. Para isso, utiliza-se um gene reprter que
possa ser facilmente detectado. Esse cuidado deve ser tomado, pois,
em geral, so obtidas quimeras dos genes introduzidos por causa do
bombardeamento randmico de um pequeno nmero de clulas num
sistema mltiplo (SANFORD, 1990).
Eletroporao
A tcnica foi desenvolvida inicialmente para transformao de pro-
toplastos, posteriormente foi aprimorada para tecidos organizados
como plen, micrsporos, fragmentos de folhas, embries somti-
cos, callus, sementes e gemas (RAO et al., 2009). O objetivo inicial
era obter a transformao de cereais, como alternativa transforma-
o via Agrobacterium, entretanto, posteriormente, a metodologia foi
estendida s outras espcies vegetais.
A tcnica consiste no emprego de pulsos eltricos curtos de alta vol-
tagem para uma alterao reversvel da estrutura da membrana plas-
mtica, induzindo a formao de poros ao longo de sua superfcie.
452
Dessa maneira, possvel aumentar a permeabilidade da membrana,
possibilitando a entrada macromolculas (Figura 9). Na eletropora-
o, pode-se introduzir molculas de vrios tamanhos em protoplas-
tos ou clulas intactas, como, por exemplo, DNA e RNA. Alm disso,
essa tcnica, pode ser utilizada para a extrao de metablitos secun-
drios de uma suspenso celular (ANDRADE, 2002; SANTARM,
2000; RAO et al., 2009; POTRYKUS, 1990).
Figura 9. Transformao por Eletroporao. (A) Desenho esquemtico da for-
mao dos poros na membrana plasmtica; (B) Aparelho de eletroporao.
A principal limitao da tcnica a regenerao do protoplasto, e
mesmo quando obtida a regenerao, as plntulas apresentam pro-
blemas (ALTPETER et al., 2005; SANTARM, 2000). Alm disso, a
ecincia da tcnica pode ser afetada pelo tampo de transferncia,
pH do meio, presso osmtica, digesto da parede celular e a sobre-
vivncia do protoplasto (ALTPETER et al., 2005; SANTARM, 2000;
ANDRADE, 2002). A parede celular, embora no impea a permea-
bilidade da membrana, uma barreira para molculas maiores que
5 kb (LINDSEY; JONES, 1990). No entanto, os mtodos esto sendo
aprimorados para transformao de clulas intactas, ou digeridas par-
cialmente. Com isso, tem sido reportado a transformao de tabaco,
trigo e milho. Entretanto, apesar de ser simples e eciente, no tem
sido largamente utilizada para transformao gentica (ALTPETER
et al., 2005; SANTARM, 2000).
Microinjeo
um processo preciso e especco para a introduo de macromo-
lculas no citoplasma, ncleo ou outro compartimento-alvo da clula.
453
A operao utiliza um micromanipulador acoplado a um microscoc-
pio e, por meio de uma micropipeta de vidro, dentro de uma cmara
assptica que no sofra vibraes e com temperatura e umidade rela-
tiva controlada, pode-se inserir macromolculas na clula de maneira
no letal (Figura 10). As clulas podem estar intactas, ou desprovidas
parcial ou totalmente de suas paredes celulares (ANDRADE, 2003;
ALTPETER et al., 2005).
As principais vantagens da tcnica so: a introduo de macromo-
lculas dentro da clula ou de um compartimento celular de maneira
precisa; a possibilidade de controlar o volume introduzido na clula
e a alta frequncia de transformao (15% a 26%). A desvantagem
do mtodo ser trabalhoso, requerer instrumentos caros e grande
habilidade de manuseio. um mtodo que consome muito tempo,
no sendo indicado quando desejado um grande nmero de trans-
formantes. Em razo disso, a microinjeo pouco utilizada para
transformao vegetal, porm uma importante metodologia para
a transformao de clulas animais (ANDRADE, 2003; ALTPETER
et al., 2005).
Figura 10. Microinjeo de clulas. (A) Etapas da microinjeo de macromo-
lculas em clulas; (B) Aparelho de microinjeo.
fonte: http://sols.asu.edu/labs/bioimaging_facility/keck_lab/equip.php
Microfibras de carboneto de silcio (SCMT)
a metodologia de transformao mais simples desenvolvida.
Consiste da adio de microbras de carboneto de silcio a uma sus-
penso de tecidos vegetais (clulas, embries imaturos, callus) e
DNA, seguida da agitao por vortex ou agitadores. Com isso, so
criadas pequenas ssuras na parede celular e membranas permitindo
454
a entrada do DNA. Embora a metodologia seja simples e barata, a e-
cincia de transformao ainda baixa e os danos causados s clulas
diminuem a viabilidade das mesmas e consequentemente a regenera-
o da planta. No entanto, existem relatos de obteno de vrias esp-
cies transformadas por essa metodologia, que pode ser uma boa alter-
nativa para espcies recalcitrantes ao Agrobacterium e na ausncia de
um aparato de bombardeamento de partculas (ALTPETER et al., 2005).
Seleo e regenerao das clulas transformadas
Essa etapa fundamental para a obteno de organismos transg-
nicos, sendo a regenerao das clulas transgnicas uma das prin-
cipais etapas limitantes para a transformao de protoplastos e de
alguns cultivares comerciais (LAMB et al., 2001). Estudos demons-
traram que, embora em muitos casos seja possvel a transformao
estvel das clulas-alvo, se no houver um mtodo criterioso de sele-
o e um protocolo completo de regenerao dessas clulas, no ser
possvel obter uma planta transgnica (SANTARM, 2000). O pro-
cesso de seleo depender do gene reprter ou de seleo utilizado
no cassete de expresso.
O gene de seleo, em geral, induz uma vantagem seletiva, que
permitir s clulas transgnicas crescerem de forma rpida, elimi-
nando as clulas no transgnicas. O mtodo de seleo dos transge-
nes pode utilizar estratgias diferenciadas que so conhecidas como
seleo positiva ou negativa. A seleo positiva permite a identicao
e o desenvolvimento das clulas transgnicas sem eliminar as clulas
no transgnicas, pela introduo de um gene que permite o meta-
bolismo de substncias que so inseridas no meio de crescimento.
Como exemplo, podemos citar o sistema manA/manose, que confere
s plantas a capacidade de metabolizar manose como fonte de acar.
Um sistema similar utiliza xylA/xylose. Por m, o uso do gene gus,
que mais utilizado como gene reprter, mas que tambm confere
clula transgnica capacidade de produzir citocinina e se desenvolver
mais rapidamente que as no transgnicas. Embora no sejam os sis-
temas mais comuns, existem relatos de sucesso na obteno de trans-
gnicos utilizando essas estratgias (ARAGO; BRASILEIRO, 2002).
455
A seleo negativa realizada com a utilizao genes que conferem
resistncia a algum produto, como herbicidas ou antibiticos, permi-
tindo a regenerao da clula transgnica e eliminando a no-transg-
nica. Essa a principal estratgia utilizada para a seleo de transge-
nes, sendo os mtodos mais comuns o nptII/canamicina ou geneticina
e o bar/herbicida imidazolinona. Existe muita controvrsia quanto
ao uso de antibiticos para selecionar clulas transgnicas, assim,
o uso de herbicidas tem sido o mtodo mais utilizado. Importante
salientar que, para cada protocolo de regenerao de transgnicos,
necessrio determinar a dose adequada do agente seletivo que seja
mais adaptada para a espcie e tipo celular usados (Figura 11). Uma
dosagem muito alta pode provocar a morte de todas as clulas, inclu-
sive as transgnicas, e uma subdosagem pode levar ao aparecimento
de escapes, isto , o desenvolvimento de plantas no transformadas.
Figura 11. Explantes de feijo cv. Olathe Pinto submetidos ao teste de sobre-
vivncia geneticina (Gen) ou canamicina (Kan), aps 30 dias de exposi-
o ao agente seletivo.
O domnio das tcnicas de regenerao de plantas inteiras a par-
tir de uma nica clula condio sine qua non para o sucesso na
obteno de plantas transgnicas. Como cada espcie de planta tem
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diferentes exigncias hormonais, nutricionais e ambientais para a
regenerao, essa etapa ainda representa o maior gargalo na criao
de plantas transgnicas, embora essa tcnica j esteja estabelecida
para inmeras plantas de interesse (ANDRADE, 2002; GANDER;
MARCELLINO, 1997).
Conforme visto no Captulo 14, Cultura de Tecidos Vegetais: princpios
e aplicaes, deste livro, o processo de regenerao e desenvolvimento
de uma nova plntula pode ocorrer via organognese ou embriog-
nese somtica. Os fatores que inuenciam na determinao da rota
morfogentica so: o tipo de explante escolhido, estdio siolgico da
planta e o ambiente do meio de cultura (reguladores de crescimento,
nutrientes, luz, etc). A regenerao de plantas transgnicas inclui a
integrao da tcnica de transformao com um sistema funcional
de regenerao para uma dada espcie ou cultivar, e um sistema de
seleo (Figura 12). Porm, nem todas as tcnicas de transformao
so compatveis com os sistemas de regenerao, pois o processo de
regenerao geralmente espcie-especco e frequentemente culti-
var especco. Ento, ter o sistema de regenerao estabelecido para
a espcie, mas no para a cultivar a ser transformada, ou uma tcnica
de transformao para um tipo de explante, mas que no tem processo
de regenerao estabelecido, no garantir o sucesso da regenerao
e da obteno da planta transgnica (RITCHIE; HODGES, 1993).
Assim, antes de iniciar um processo de transformao de uma esp-
cie, necessrio o entendimento de muitos mecanismos bsicos ine-
rentes aos processos de desenvolvimento da planta a ser transfor-
mada. O correto entendimento desses mecanismos essencial para
o desenvolvimento de uma metodologia de regenerao do transg-
nico, e para o sucesso de obteno da planta transgnica, uma vez que
a maioria das metodologias de transformao necessita de uma fase
de cultura in vitro (ANDRADE, 2002).
457
Clulas alvo
Calo
Organogenese
Alongamento
Seleo
Enraizamento
Aclimatao
Transgnico

Figura 12. Esquema das etapas de seleo e regenerao de plantas transg-
nicas. A seta amarela indica o momento da transformao.
Testes dos organismos transformados
Trata-se da ltima etapa do processo de transformao gentica.
Aps o processo de seleo e regenerao in vitro, as plantas obti-
das so transferidas para casa de vegetao. Em seguida, so subme-
tidas avaliao molecular para conrmao da transformao, por
meio de amplicao por Polymerase Chain Reaction (PCR), para
isso utilizam-se primers especcos para o cassete de expresso uti-
lizado (Figura 13). Uma vez conrmada a presena do transgene nas
plantas regeneradas, essas so multiplicadas, e a progenie subme-
tida a diversas anlises agronmicas e de biossegurana alimentar e
ambiental. Antes da liberao e utilizao comercial do organismo
geneticamente modicado, importante conhecer e certicar a sua
biossegurana. No Captulo 16, deste livro, discute-se a biossegurana
e os diferentes testes aos quais so submetidos os organismos gene-
ticamente modicados.
458
Anlises moleculares
Anlise
de prognie
Avaliaes em casa de vegetao
e campo experimental
1 2 3 4 5 6 7 8
Figura 13. Etapas da seleo e identicao das plantas regeneradas.
Aplicaes de plantas transgnicas
A transformao gentica abriu inmeras possibilidades tanto para
a pesquisa bsica como aplicada. Os transgnicos podem ser utiliza-
dos para o melhoramento gentico vegetal, melhoria da qualidade
nutricional dos alimentos, desenvolvimento e produo de medica-
mentos e vacinas comestveis, produo em larga escala de molculas
secundrias, estudos da funo e expresso de genes e promotores e
outros (ANDRADE, 2003; FALEIRO; ANDRADE, 2007). Acreditava-se
que, com o desenvolvimento e com os avanos do uso da tecnologia
do DNA recombinante, a disponibilizao de organismos transgni-
cos ocorreria em ondas primeiro transgnicos com caractersticas
de interesse agronmico, seguido modicaes na qualidade de ali-
mentos, produo de frmacos e outros (Figura 14). A engenharia
gentica tem tido muito sucesso na obteno de plantas expressando
caractersticas qualitativas controladas por apenas um gene. Entre
essas, as caractersticas de interesse agronmico, como resistncia a
herbicidas e tolerncia a insetos, dominam o mercado de transgni-
459
cos desde o incio de sua produo. Considera-se que a grande adoo
dessas tecnologias pelos produtores ocorreu principalmente porque
os produtos tecnolgicos lanados facilitam sobremaneira o manejo
das culturas, diminuindo os custos de produo (ANDRADE, 2003;
FERREIRA; FALEIRO, 2008).
Novos produtos
1995 2000 2005 2010
Tratos Agronmicos
Qualidade de alimentos
Farmacuticos
Qumicos especiais
Figura 14. Probabilidade de liberao de organismos transgnicos com o
passar dos anos.
O desenvolvimento de transgnicos expressando outras caracte-
rsticas, alm de agronmicas, est um pouco atrasado em relao
ao previsto. Os motivos para isso so diversos, entre eles o pequeno
pool de genes disponvel, questes de regulamentao e biossegu-
rana, bem como de propriedade intelectual de vetores, promoto-
res (FERREIRA; FALEIRO, 2008). No entanto, espera-se para 2012
o lanamento comercial do arroz dourado, com maior quantidade de
caroteno, e do milho tolerante seca. Existem estudos para o desen-
volvimento de vacinas comestveis e outros tipos de frmacos, mas
ainda precisa avanar nos estudos de biossegurana e regulamenta-
o da liberao comercial desses produtos (FERREIRA; FALEIRO,
2008; JAMES, 2008).
Os principais pases produtores dos produtos biotecnolgicos e cul-
turas plantadas esto descritos na Tabela 2 e na Figura 15.
460
Tabela 2. rea global das culturas biotecnolgicas em 2008: por pas
(milhes de hectares)
Posio Pas rea (milhes/ha Culturas biotecnolgicas
*1* EUA* 62,5
Soja, milho, algodo, canola, abbora,
papaia, alfafa, beterraba
*2* Argentina* 21,0 Soja, milho, algodo
*3* Brasil* 15,8 Soja, milho, algodo
*4* ndia* 7,6 Algodo
*5* Canad* 7,6 Canola, milho, soja, beterraba
*6* China* 3,8
Algodo, tomate, lamo, petnia,
papaia, pimento
*7* Paraguai* 2,7 Soja
*8* frica do Sul * 1,8 Milho, soja, algodo
*9* Uruguai* 0,7 Soja, milho
10* Bolvia* 0,6 Soja
11* Filipinas* 0,4 Milho
12* Austrlia* 0,2 Algodo, canola, cravo
13* Mxico* 0,1 Algodo, soja
14** Espanha* 0,1 Milho
15* Chile <0,1 Milho, soja, canola
16* Colmbia <0,1 Algodo, cravo
17* Honduras <0,1 Milho
18* Burkina Faso <0,1 Algodo
19*
Repblica
Tcheca
<0,1 Milho
20* Romnia <0,1 Milho
21* Portugal <0,1 Milho
22* Alemanha <0,1 Milho
23* Polnia <0,1 Milho
24* Eslovquia <0,1 Milho
25* Egito <0,1 Milho
* 14 mega-pases biotecnolgicos produzindo 50.000 hectares, ou mais de culturas biotecno-
lgicas
Fonte: James (2008).
461
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
Indstria
Desenvolvimento 25 Cultura biotecnolgica
Caracterstica
Total
Figura 15. Crescimento da rea global de plantio das culturas biotecnolgi-
cas, de 1996 a 2008 (Milhes de hectares).
Transformao gentica de animais
O processo de transformao gentica de animais ocorreu de forma
mais lenta que a transformao de plantas. A tcnica foi desenvolvida
no nal da dcada de 1970, para estudos sobre cncer que utilizavam
camundongos, mas os primeiros resultados pareceram no incio da
dcada de 1980, com o desenvolvimento da microinjeo pronuclear
de zigotos (BRESSAN et al., 2008).
Existem diversos mtodos para a transformao de animais: bom-
bardeamento de vulos micropartculas contendo DNA, microinje-
o pronuclear de DNA exgeno em zigotos, fertilizao in vitro por
espermatozoide modicados, transferncia de DNA para clulas ou
embries mediada por lipossomos, eletroporao de DNA em esper-
matozoides, zigotos ou embries, injeo de clulas embrionrias
previamente modicadas em blastoceles e a transferncia nuclear de
clulas somticas ou embrionrias tambm previamente genetica-
462
mente modicadas. Os principais mtodos utilizados so: (i) microin-
jeo pronuclear de genes em vulos fertilizados; (ii) injeo de clu-
las embrionrias previamente modicadas em blastoceles (Figura 16)
(PEREIRA, 2008).
Pr ncleos
Gene de
interesse
Clulas tronco
embrionrias
DNA
Acasalamento dos heterozigotos para a
formao de linhagem homozigota
Teste da prognie para a presena do gene
Seleo das
clulas
expressando o
DNA desejado
Implante no
tero
Implante no
tero
Clulas da
camada
interna
Blastocisto
Injeo das clulas
transformadas na
camada interna da
massa celular
Fmea
parideira
fertilizados
vulos
Transformao das clulas tronco
Microinjeo pronuclear
Figura 16. Desenho esquemtico dos mtodos de transformao de animais.
O primeiro animal transgnico foi obtido em 1982, pela microinje-
o do gene do promotor de crescimento de ratos em vulos fecunda-
dos de camundongo, produzindo o supercamundongo (PALMITER
et al., 1982). Esse trabalho foi um marco para a transgenia animal, por
demonstrar a possibilidade de produo de grandes quantidades de
protenas por um animal, e um futuro uso dos mesmos como biorea-
tores (Figura 17). Em 2001, o segundo marco foi obtido pelo Oregon
Regional Primate Ressearch Center, que desenvolveram o primeiro
primata transgnico. Nomeado como ANDi, o macaco Rhesus foi
obtido pela injeo de um gene uorescente de medusa em vulo
maduros, posteriormente fecundados e implantados em teros de
uma receptora (CHAN et al., 2001). Esse estudo abriu espao para o
463
uso da transformao gentica para estudos e, talvez, a cura de doen-
as humanas, como, por exemplo, Alzeimer.
Figura 17. (A) Supercamundongo obtido 1982 pela expresso do gene de
crescimento de ratos; (B) ANDi, macaco Rhesus contendo gene de medusa.
Fonte: (A) Palmiter et al., 1982; (B) Chan et al., 2001.
464
No Brasil, em 2001, nasceu Christian, o primeiro camundongo
transgnico, desenvolvido no Laboratrio de Gentica Molecular do
Instituto de Biocincia da USP. O projeto liderado pela Dra. Lygia
Pereira tinha objetivo de obter animais mutantes para estudo da
Sndrome de Marfan a partir de linhagens de clulas tronco utili-
zando a tcnica de nocaute. No mesmo ano, tambm nasceu Vitor,
obtido por microinjeo pronuclear, em projeto liderado pelo Dr.
Joo Bosco Pesquero, no Laboratrio de Animais Transgnicos do
Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais em Medicina e
Biologia (Cedeme) da Unifesp (PESQUERO et al., 2002; PESQUERO,
2007; PEREIRA, 2008).
As principais aplicaes de animais transgnicos so: (i) estudo
de doenas; (ii) desenvolvimento de rgo para transplante (xeno-
transplantes); (iii) produo de protenas e hormnios de interesse
humano; (iv) animais ornamentais; (v) melhoria da qualidade nutri-
cional; (vi) alteraes siolgicas diversas.
Consideraes finais
O vasto conhecimento sobre as tecnologias de engenharia gentica
adquirido durante as quatro ltimas dcadas trouxe grandes avanos
para a medicina, e agropecuria, alm signicativos impactos econ-
micos e sociais para diferentes setores da sociedade. Ainda existe um
amplo campo a ser estudado, considerando todas as potencialidades
que a engenharia gentica pode oferecer. Nesse sentido, estratgico
o investimento em cincia e tecnologia e na formao de recursos
humanos para atender crescente demanda do mercado.
Referncias
Altpeter, F.; Baisakh, N.; Beachy, R.; Bock, R.; Capell, T.; Christou, P.; Daniell,
H.; Datta, K.; Datta, S.; Dix, P. J.; Fauquet, C.; Huang, N.; Kohli, A.; Mooibroek,
H.; Nicholson, L.; Nguyen, T. T.; Nugent, G.; Raemakers, C. J. J. M.; Romano,
A.; Somers, D. A.; Stoger, E.; Taylor, N.; Visser, R. G. F. Particle bombardment
and the genetic enhancement of crops: myths and realities. Molecular Breeding,
v. 15, p. 305 327, 2005.
ANDRADE, S. R. M. Princpios da cultura de tecidos vegetais. Planaltina, DF:
465
ANDRADE, S. R. M. Transformao de plantas. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados,
2003. 28 p. (Embrapa Cerrados. Documentos, 102).
ANDRADE, S. R. M.; FALEIRO, F. G. Breve histrico da Biossegurana de
Transgnicos. In: FALEIRO, F. G.; ANDRADE, S. R. M. (Ed.). Biotecnologia,
transgnicos e biossegurana. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2009. p. 49-59.
ARAGAO, F. J. L.; BRASILEIRO, A. C. M. Positive, negative and marker-free
strategies for transgenic plant selection. Brazilian Journal of Plant Physiology,
v. 14, p. 01-10, 2002.
ARAGO, F. J. L. Engenharia gentica: estado da arte. In: FALEIRO, F. G.;
ANDRADE, S. R. M. (Ed.). Biotecnologia, transgnicos e biossegurana. Planaltina,
DF: Embrapa Cerrados, 2009. p 31-48.
BERG, P. Paul Berg, The Nobel Prize in Chemistry 1980. Autobiography. 2004.
Disponvel em: <http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1980/
berg-autobio.html>. Acesso em: 10 ago. 2009.
BRASILEIRO, A. C. M. Biologia de Agrobacterium sp. ABCP Notcias, Braslia,
v. 20, p. 2-6. 1993.
BRESSAN, F. F.; MIRANDA, M. S.; DE BEM, T. H. C.; PEREIRA, F. T. V.;
BINELLI, M.; MEIRELLES, F. V. Produo de animais transgnicos por
transferncia nuclear como modelo de estudo biolgico. Revista Brasileria de
Reproduo Animal, v. 32, p. 240-250, 2008.
CHAN, A. W. S.; CHONG, K. Y.; MARTINOVICH, C.; SIMERLY, C.; SCHATTEN,
G. Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes.
Science, v. 291, p. 309-321, 2001.
Citovsky, V.; Kozlovsky, S. V.; Lacroix, B.; Zaltsman, A.; Dafni, M.; Vyas, S.;
Tovkach, A.; Tzra, T. Biological systems of the host cell involved in Agrobacterium
infection. Cellular Microbiology, v. 9, p. 920, 2007.
COHEN, S. N.; CHANG, A. C. Y.; HSU, L. Nonchromosomal antibiotic
resistance in bacteria. Genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA.
Proceedings of the National Academic Science USA, v. 69, p. 2110-2114, 1972.
CONSELHO DE INFORMAES SOBRE BIOTECNOLOGIA. Glossrio. 2009.
Disponvel em: <http://www.cib.org.br/glossario.php>. Acesso em: 10 ago. 2009.
CORDEIRO, M. C. R. Engenharia Gentica: conceitos bsicos, ferramentas e
aplicaes. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2003. 43 p. (Embrapa Cerrados,
Documentos, 86).
DANILOVA, S. A. The Technologies for Genetic Transformation of Cereals.
Russian Journal of Plant Physiology, v. 54, p. 569-581, 2007.
466
DE BLOCK, M. The cell biology of plant transformation: Current state, problems,
prospects and the implications for the plant breeding. Euphytica, Wagnigen,
v. 17, p. 1-14, 1993.
FALEIRO, F. G.; ANDRADE, S. R. M. Biotecnologia, transgnicos e biossegurana.
In: FALEIRO, F. G.; SOUZA, E. S. Pesquisa, desenvolvimento e inovao para o
cerrado. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2007. p. 123-127.
melhoramento gentico vegetal. In: FALEIRO, F.; FARIAS NETO, A. (Ed.).
GANDER, E. S.; MARCELLINO, L.H. Plantas Transgnicas. Biotecnologia Cincia
e Desenvolvimento, v. 1, p. 34-37, 1997.
JACKSON, D. A.; SYMONS, R. H.; BERG, P. Biochemical method for inserting
new genetic information into DNA of simian virus 40: cirular SV40 DNA
molecules containing lambda phage genes and galactose operon of Escherichia coli.
Proceedings of the National Academy of Sciences USA, v. 69, p. 2904-2909, 1972.
JAMES, C. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2008. Ithaca, NY:
ISAAA, 2008. (ISAAA Brief, No. 39).
LACORTE, C.; ARAGO, F. J. L.; VAINSTEIN, M. H.; RECH, E. L.
Biobalstica. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. (Ed.). Cultura de
Tecidos e Transformao Gentica de Plantas. Braslia, DF: EMBRAPA-SPI/
EMBRAPA-CNPH, 1999. v. 2. p. 761-781.
LAMB, C. R. C.; MILACH, S. C. K.; PASQUALI, G.; BARRO, R. S. Regenerao
de plantas a partir de segmentos de base de folhas em aveia. Cincia Rural,
v. 31, p. 751-755, 2001.
LINDSEY, K.; JONES, M. G. K. Electroporation of cells. Physiologia Plantarum,
v. 79, p. 168-172, 1990.
ORGANIZATION FOR ECONOMIC COOPERATION AND DEVELOPMENT.
Safety evaluation of foods produced by modern biotechnology: Concepts and
principles. 1993. Disponvel em: <http://www.oecd.org/dataoecd/57/3/1946129.
pdf>. Acesso em: 30 maio 2005.
PALMITER, R. D.; BRINSTER, R. L.; HAMMER, R. E; TRUMBAUER, M. E.;
ROSENFELD, M. G.; BINBERG, N. C.; EVANS, R. M. Dramatic growth of mice
that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone
fusion genes. Nature, v. 300, p. 611-615, 1982.
PEREIRA, L. V. Animais transgnicos: nova fronteira do saber. Cincia e Cultura.
So Paulo, v. 60, n. 2, 2008 . Disponvel em: <http://cienciaecultura.bvs.br/scielo.
php?script=sci_arttext&pid=S0009-67252008000200017&lng=en&nrm=iso>.
Acesso em: 25 jan. 2010.
467
Permyakova, N.; Shumnyi, V.; Deineko, E. Agrobacterium - mediated
transformation of plants: Transfer of vector DNA fragments in the plant genome.
Russian Journal of Genetics, v. 45, p. 266-275, 2009.
PESQUERO, J. B.; BAPTISTA, H. A.; MOTTA, F. L. T.; OLIVEIRA, S. M. Aplicao
dos animais transgnicos. Scientific American Brasil, v. 56, 2007. Disponvel
em: <http://www2.uol.com.br/sciam/reportagens/aplicacees_dos_animais_
transgenicos.html>. Acesso em: 25 jan. 2010.
PESQUERO, J. B.; MAGALHES, L. E.; BAPTISTA, H. A.; SABATINI, R. A.
Animais transgnicos. Biotecnologia Cincia e Desenvolvimento, v. 27, p. 52-58,
2002.
POTRYKUS, I. Gene transfer to plants: assessment and perspectives. Physiologia
Plantarum, Copenhagen, v. 79, p. 125-134, 1990.
Rao, A. Q.; Bakhsh, A.; Kiani, S.; Shahzad, K; Shahid, A. A.; Husnain, T.;
Riazuddin, S. The myth of plant transformation. Biotechnology Advances,
v. 27, p. 753-763, 2009.
RECH, E. L.; ARAGO, F. J. L. Biolstica. In: BRASILEIRO, A. C. M.; CARNEIRO,
V. T. (Ed.). Manual de transformao gentica de plantas. Braslia, DF:
Embrapa-SPI, 1998. p. 51-64.
RITCHIE, S. W.; HODGES, T. K. Cell culture and regeneration of transgenic
plants. In: KUNG, S.; WU, R. (Ed.). Transgenic plants. San Diego: Academic Press,
1993.
v.1, p. 147-178.
SANFORD, J. C. Biolistic plant transformation. Physiologia Plantarum,
Copenhagen, v. 79, p. 206-209, 1990.
SANFORD, J. C.; KLEIN, T. M.; WOLF, E. D.; ALLEN, N. Dellivery of substances
into cells tissues using a particle bombardment process. Particulate Science
Technology, v. 5, p. 27-37, 1987.
SANTARM, E. R. Mtodos ecientes para transformao gentica de plantas.
Revista de Cincia e Tecnologia, v. 15, p. 81-90, 2000.
SOUZA JNIOR, M. T.; VENTUROLLI, M. F.; COELHO, M. C. F.; RECH FILHO,
E. L. Anlise de sistemas gene marcador/agente seletivo alternativos para a seleo
positiva de embries somticos transgnicos de mamoeiro. Revista Brasileira de
Fisiologia Vegetal, Jaboticabal, v. 13, p. 365-372, 2001.
WIKIPEDIA. 2009. Disponvel em: <http://pt.wikipedia.org/wiki/P%C3%A1gina_
principal>. Acesso em: 19 out. 2009.
468
ANDRADE, S. R. M. Transformao de plantas. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados
2003. 28 p. (Embrapa Cerrados. Documentos, 102).
BRASILEIRO, A. C. M.; CARNEIRO, V. T. C. (Ed.). Manual de transformao
gentica de plantas. Braslia, DF: Embrapa SPI/Embrapa Cenargen, 1998. 309 p.
FALEIRO, F. G.; ANDRADE, S. R. M. (Ed.). Biotecnologia, transgnicos e
biossegurana. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2009. 169 p.
TORRES, A. C.; CALDAS, L. S. BUSO, J. A. (Ed.). Cultura de tecidos e
transformao gentica de plantas. Braslia, DF: Embrapa SPI/Embrapa CNPH,
1999. v. 2. 354 p.
471
Biossegurana ambiental
e alimentar de OGMs
Fbio Gelape Faleiro
Introduo
A preocupao com a biossegurana de organismos geneticamente
modicados (OGMs) surgiu na dcada de 1970, aps a divulgao dos
primeiros trabalhos sobre a construo de genes (JACKSON et al.,
1972) e a transferncia de genes entre espcies diferentes via engenha-
ria gentica (COHEN et al., 1972). Nesse momento, acendeu o sinal
de alerta na comunidade cientca em relao s possibilidades ilimi-
tadas que as novas ferramentas estavam trazendo e seus imprevisveis
impactos na sade humana e ambiental. Assim, de maneira volun-
tria, houve mobilizao da comunidade cientca para estabelecer
um sistema legal com fundamentao cientca para normatizar os
assuntos referentes biossegurana (ANDRADE; FALEIRO; 2009a).
Resumidamente, a biossegurana de OGMs compreende as nor-
mas necessrias para minimizar os impactos das tecnologias gera-
das pela biotecnologia por meio de leis, procedimentos e diretivas
discutidas mundialmente, porm aplicadas de modo especco em
cada pas. Essas normas e regulamentaes so importantes para o
desenvolvimento e utilizao das tcnicas de biotecnologia (FALEIRO;
ANDRADE, 2009; JESUS et al., 2006).
Neste captulo, so abordados aspectos histricos, conceituais e tc-
nicos sobre a biossegurana de OGMs. Os principais riscos e anli-
ses de OGMs relacionados biossegurana ambiental e alimentar so
discutidos e exemplicados.
Um pouco da histria da biossegurana
A biossegurana de OGMs surgiu juntamente com a engenharia
gentica, considerando as potencialidades da tecnologia na gerao de
produtos tecnolgicos, mais os riscos ambientais e alimentares que
472
esses produtos poderiam apresentar. Para discutir esses riscos, foi
realizado um primeiro encontro da comunidade cientca em 1974,
chamado de Conferncia de Asilomar sobre as Molculas de DNA
Recombinante. Nessa reunio, foram discutidos os critrios de segu-
rana, principalmente barreiras biolgicas e fsicas, para os experi-
mentos com OGMs, bem como os critrios ticos para regular esses
experimentos, alm de recomendaes para o controle de descartes
de material e padronizao da metodologia. Esse foi o incio de diver-
sas discusses mundiais a respeito das regras de biossegurana, como
fundamento bsico para assegurar o avano dos processos tecnol-
gicos e proteger a sade humana, animal e ambiental (ANDRADE;
FALEIRO, 2009a; BERG, 2004).
Em 1992, na Conveno de Diversidade Biolgica (CBD), que
cou conhecida como ECO-92, foi reconhecida a soberania de cada
pas sobre seus recursos genticos. Tambm foi raticado que deve-
ria haver uma diviso justa e equitativa dos benefcios gerados pelo
uso dos recursos genticos (BRAUN, AMMAN, 2002; ANDRADE,
FALEIRO; 2009a; MINAR, 2005). Na Carta da Terra, o Princpio
15, tambm conhecido como Princpio da Precauo, diz o seguinte:
Com o fim de proteger o meio ambiente, o princpio da precauo dever
ser amplamente observado pelos Estados, de acordo com suas capacidades.
Quando houver ameaa de danos graves ou irreversveis, a ausncia de cer-
teza cientfica absoluta no ser utilizada como razo para o adiamento
de medidas economicamente viveis para prevenir a degradao ambien-
tal, traduzindo, melhor prevenir do que remediar (UNITED
NATIONS, 1992; BORM, 2005; ANDRADE; FALEIRO, 2009a).
Assim, a preocupao em manter o risco ambiental dentro de
um grau de segurana aceitvel levou a comunidade internacional
a adotar o Princpio da Precauo como princpio tico orientador e
jurdico motivador da ao humana. Nesses casos, os pases devem
seguir procedimentos para prevenir e evitar esses danos. Isto , deter-
minar o nvel de risco aceitvel por meio de avaliaes cientcas e
polticas, caso a caso e por cada pas (MINAR, 2005; BORM 2005;
ANDRADE; FALEIRO, 2009a).
Em 2000, na Venezuela, foram estabelecidas as bases para a nor-
matizao internacional do desenvolvimento dos OGMs, principal-
mente no que tange transferncia desses organismos entre pases,
473
Captulo 16 Biossegurana ambiental e alimentar de OGMs
bem como a manipulao e utilizao dos mesmos. O Protocolo de
Cartagena sobre Biossegurana em Biotecnologia, como cou conhe-
cido, regulamenta a transferncia, manipulao e uso de OGMs que
podem ter efeito na biodiversidade e sade humana e, fazendo refe-
rncia explicita ao princpio da precauo, considera-o como princ-
pio guia para transferncia de OGMs em situaes consideradas de
potencial risco de reduo ou perda da biodiversidade (UNEP, 2003).
O protocolo foi raticado por 103 pases e est em vigor desde 11 de
setembro de 2003. O Brasil raticou sua participao em 24 de novem-
bro de 2003, e o Protocolo passou a vigorar no pas em 22 de fevereiro
de 2004 (JESUS et al., 2006).
Com isso, diversas instituies internacionais discutiram e
desenvolveram mtodos para avaliao de riscos de Organismos
Geneticamente Modicados referentes s avaliaes dos possveis
impactos sobre a sade humana, animal e ambiental (ILSI, 2001; IFT,
2000; FAO/WHO, 1996, 2000, 2001; WHO, 2000). Existem alguns
Acordos Internacionais para a Regulamentao da Biossegurana que
do suporte a cada pas para desenvolver OGMs, desde que respeitem
esses acordos. Alm da Carta da Terra e do Protocolo de Cartagena,
tambm existem:
1) Organizao para a Cooperao e o Desenvolvimento
Econmico (OECD): os pases membros desenvolveram
Documentos de Consenso que so utilizados como ferramen-
tas tcnicas para a tomada de decises baseadas na avaliao
de inocuidade de maneira cientca.
2) Compromisso Internacional sobre Recursos Fitogenticos da
FAO: aprovado em Conferncia da FAO, em 1983, o primeiro
documento que se refere utilizao de recursos togenticos
para agricultura e alimentao. Como instrumento de harmo-
nizao, tem o objetivo de garantir que os recursos fitogenticos
de interesse social e/ou econmico, particularmente para a agricul-
tura, sejam explorados, preservados, avaliados e se tornem acessveis
para a criao de novas variedades e para a pesquisa.
3) Codex Alimentarius: como a maior autoridade internacional
em inocuidade alimentar, em 1989 decidiu avaliar as aplica-
es da biotecnologia ao sistema existente do Codex. O Codex
atua em diversas reas de avaliaes, sendo que recentemente
474
foi criado um Grupo especial em Biotecnologia com o objetivo
de estabelecer modelos de segurana de alimentos derivados
da biotecnologia, e tambm regulamentar a rotulagem desses
alimentos (JESUS et al., 2006).
Alguns conceitos importantes
Para facilitar a leitura, introduzimos abaixo alguns conceitos impor-
tantes que sero citados neste captulo:
Anlise de risco: procedimento realizado para analisar a natu-
reza e os efeitos adversos sade humana e animal ou ao
ambiente. Consiste de trs etapas: avaliao do risco, adminis-
trao do risco e comunicao do risco.
Avaliao de risco: combinao de procedimentos ou mtodos,
por meio dos quais se avaliam, caso a caso, os potenciais efei-
tos da liberao planejada do OGM e seus derivados sobre o
ambiente e a sade humana e animal.
Biossegurana: matria que estuda os riscos potenciais da bio-
tecnologia para a sade humana e animal, bem como para o
ambiente. s Comisses de Biossegurana compete regulamen-
tar e monitorar esses riscos.
Conteno: em Biossegurana, conjunto de medidas e protoco-
los aplicados para minimizar o risco de organismos genetica-
mente modicados ao ambiente ou sade humana e animal.
Derivado de OGM de origem vegetal: produto obtido de OGM de
origem vegetal e que no possua capacidade autnoma de repli-
cao ou que no contenha forma vivel de OGM.
Fluxo gnico horizontal: quando a troca de informao gentica
se d entre indivduos de espcies diferentes, distantes geneti-
camente.
Fluxo gnico vertical: quando a passagem da informao gen-
tica ocorre entre indivduos da mesma espcie, produzindo des-
cendentes frteis e viveis.
Liberao controlada: no contexto da Biotecnologia, a libera-
o intencional de organismos geneticamente modicados no
meio ambiente.
475
Liberao planejada: liberao no meio ambiente de OGM de
origem vegetal ou seus derivados, para avaliaes experimentais
sob monitoramento, de acordo com as disposies da Resoluo
Normativa n 6, de 6 de novembro de 2008.
Organismo Geneticamente Modificado de origem vegetal: vege-
tal cujo material gentico (ADN/ARN) tenha sido modicado
por qualquer tcnica de engenharia gentica.
Perigo: agente nocivo capaz de causar algum efeito adverso.
Poluio gentica: disperso descontrolada de genes para esp-
cies ou indivduos nos quais esses genes no estavam presentes.
Conceito associado a escape gnico a partir de OGMs.
Princpio da precauo: estratgia pela qual qualquer possvel
risco associado com a introduo de uma tecnologia nova evi-
tado, at a completa compreenso do seu efeito sade e ao
ambiente.
Protocolo de biossegurana: conjunto de procedimentos aceitos
internacionalmente para proteger a sade humana e animal e o
ambiente de potenciais riscos do uso da biotecnologia e de seus
produtos; Protocolo de Cartagena.
Requerente: qualquer pessoa jurdica com Certificado de
Qualidade em Biossegurana CQB que se proponha a efetuar
liberao planejada, de acordo com a Resoluo Normativa n
6, de 6 de novembro de 2008.
Responsvel Legal: indivduo sobre o qual recai a responsabi-
lidade pela conduo da liberao planejada, conforme as nor-
mas da CTNBio.
Risco: probabilidade de ocorrncia de efeito adverso.
Segurana alimentar: signica garantir, a todos, condies de
acesso a alimentos bsicos de qualidade, em quantidade su-
ciente, de modo permanente e sem comprometer o acesso a
outras necessidades essenciais, com base em prticas alimenta-
res saudveis, contribuindo, assim, para uma existncia digna,
em um contexto de desenvolvimento integral da pessoa humana
(Conselho de Informaes Sobre Biotecnologia; Comisso
Tcnica Nacional de Biossegurana).
476
Anlise de risco
A anlise de risco um processo reproduzvel que envolve vrias
etapas de avaliao prvia visando obteno de resultados com um
nvel aceitvel de incerteza, pois a certeza absoluta ou risco zero em
uma avaliao de segurana nunca possvel. Assim, a incerteza
um aspecto incontornvel de todos os processos de avaliao e gesto
de riscos, sendo que o nvel de incerteza aceitvel depende de fatores
sociais, econmicos e polticos. O processo geralmente consiste de um
conjunto prescrito e pr-planejado de avaliaes de risco de dados e
de recursos. Por exemplo, quando certo potencial de efeito adverso
considerado em uma avaliao de risco, necessrio apresentar uma
descrio do cenrio aceitvel dentro de uma cadeia causal de even-
tos por meio da qual o efeito especco pode ocorrer, bem como uma
avaliao do estado de conhecimento sobre a plausibilidade de cada
etapa acontecer, e, nalmente, uma deciso sobre a aceitabilidade das
consequncias (CRAIG et al., 2008).
A anlise de risco de OGMs composta das seguintes etapas: (i) a
avaliao do risco; (ii) o gerenciamento do risco; e (iii) a comunicao
do risco (LAJOLO; NUTTI, 2003). Essa anlise baseada em metodo-
logias cientcas que buscam a sistematizao das informaes sobre
um determinado perigo e auxiliam no processo de avaliao de risco
e na adoo de medidas para minimiz-lo ou elimin-lo (LAJOLO;
NUTTI, 2003). Ela realizada tanto para biossegurana ambiental
quanto alimentar.
O processo se inicia com a identicao do possvel efeito adverso
ou perigo que o OGM possa causar ao ambiente ou sade animal e
humana, seguido das consequncias potenciais e, por m, da deter-
minao da probabilidade que isso ocorra. O risco dessa caracters-
tica especca do OGM pode ento ser estimado, e, assim, subsidiar a
tomada de decises necessrias para evit-lo ou minimiz-lo (CRAIG
et al., 2008).
Biossegurana ambiental de OGMs
Nos anos 1980, existia um consenso de que, com a liberao de
organismos transgnicos, havia um risco potencial ao ambiente.
477
Considerando que esto sendo produzidos animais, vegetais e micror-
ganismos transgnicos expressando genes com diferentes caracters-
ticas, desde agronmicas, passando por ornamentais at medicinais,
a liberao desses organismos no ambiente requeria cautela e cui-
dados de avaliao de risco. As avaliaes risco deveriam ser realiza-
das caso a caso, considerando o transgene, o organismo receptor, a
inteno de liberao no ambiente, a frequncia e escala da introdu-
o. Essa discusso envolveu ecologistas, bilogos, epidemiologistas,
geneticistas e outros (ANDOW; ZWAHLEN, 2006; JESUS et al., 2006;
ANDRADE; FALEIRO, 2009b).
Desde 1990, vm ocorrendo graduais, porm substanciais, altera-
es no processo de avaliao de risco de liberao de um organismo
transgnico no ambiente. As avaliaes de risco atualmente seguem
quatro etapas: (i) identicao do perigo; (ii) avaliao da exposio ao
perigo; (iii) avaliao dos possveis efeitos da exposio e (iv) caracte-
rizao do risco. Essas quatro etapas providenciaram uma estrutura
conveniente para relacionar os avanos cientcos dos anos 1990 e os
possveis riscos ao ambiente (ANDOW; ZWAHLEN, 2006).
Segundo Craig e colaboradores (2008), dois tipos de riscos podem
ocorrer em consequncia da liberao de OGMs no ambiente: (1) efei-
tos inesperados na populao-alvo, como, por exemplo, a evoluo da
resistncia em pragas-alvo/populaes do patgeno quando o trans-
gene confere resistncia a uma praga ou patgeno; e (2) efeitos inespe-
rados, em populaes no-alvo, por exemplo, alteraes na biodiversi-
dade local associada direta ou indiretamente com a planta transgnica,
ou aqueles associados com a integrao e posterior expresso do trans-
gene individual em um organismo diferente (uxo gnico).
Quando se considera o risco ambiental, as ferramentas utilizadas
devem ser capazes de avaliar as caractersticas agronmicas do trans-
gnico, sua estabilidade no ambiente, as caractersticas ecolgicas do
ambiente no qual ele ser inserido, incluindo os possveis efeitos no
intencionais resultantes da insero do gene, e o risco potencial ao
ambiente, podendo utilizar, caso necessrio, o Princpio da precau-
o. (ANDRADE; FALEIRO, 2009b).
As avaliaes ocorrem caso a caso e, no momento, as preocupaes
sobre o impacto de OGMs no ambiente se referem principalmente s
plantas que contm as tecnologias Bt (resistncia a insetos) e HT (tole-
478
rncia a herbicidas). Esses materiais tiveram grande aceitao pelos
produtores desde o incio e tm sido largamente utilizados (Figura 1).
As plantas expressando tolerncia a herbicida so as mais utilizadas,
respondendo por 63% da rea de produo biotecnolgica, seguidas
das plantas contendo os genes combinando ambas as caractersticas,
com 22%, e, por m, plantas expressando somente resistncia a inse-
tos, com 15% (JAMES, 2008).
Tolerncia a herbicida (HT)
Resistncia a insetos (Bt)
Tolerncia a herbicida /
Resistncia a insetos
1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
Ha Acres
222 90
198 80
173 70
148 60
124 50
99 40
74 30
49 20
25 10
0 0
Figura 1. rea global de produo de culturas biotecnolgicas de 1996 a 2008:
trato cultural (milhes hectares, milhes acres ).
Fonte: adaptado de James, 2008.
Segundo Carpenter e colaboradores (2002), so nove as principais
consideraes a respeito dos possveis impactos ambientais das lavou-
ras de soja, milho e algodo transgnicos: (a) risco da variedade cul-
tivada ou silvestre transformada tornar-se uma espcie daninha
invasora; (b) desenvolvimento de resistncia pelo uso macio da tec-
nologia; (c) possibilidade de escape gnico (transferncia vertical e
horizontal); (d) alteraes na populao de pragas e plantas daninhas;
(e) efeito adverso sobre espcies no-alvo e bencas; (f) impactos
nos sistemas de produo vegetal; (g) alterao no padro de uso de
pesticidas; (h) manejo e conservao do solo; e (i) impactos sobre a
sade humana.
479
J Sanvido e colaboradores (2006) consideram que os efeitos dos
transgnicos no ambiente podem ser divididos em diretos ou indi-
retos. O efeito direto aquele resultante da ao do transgene, isto ,
da consequncia da transformao gentica no gentipo e fentipo
do organismo modicado. Os efeitos indiretos seriam decorrncia
de efeitos em organismos que no eram alvos iniciais do organismo
transgnico (Figura 2).
Fluxo gnico
para parentes
silvestres
Disperso das
culturas OGMs
Impacto ambiental
dos produtos
transgnicos
Efeito em
organismos no
alvo
Desenvolvimento
de resistncia
Transferncia de plen
para parentes silvestres
e formao de hbridos
Sobrevivnci a
fora das reas
cultivadas
Persistncia,degradao
e disperso dos
produtos transgnicos
Absoro direta ou
indireta de produtos
transgnicos pel a
alimentao
Desenvolvimento de
resistnci a
Sobrevivncia e
reproduo dos
hbridos
Reproduo
fora das reas
cultivadas
Acmulo dos
produtos
transgnicos do solo
Efeito nos
organismos no alvo
Efeitos indiretos
Populao transgnica (hbridos/culturas)
com aumento do aptido comparado
populao silvestre
Lixiviao dos
produtos
transgnicos do solo
Efeito na
dinmica da
populao
Disperso e persistncia das plantas
transgnicas (hbridos/culturas) fora
da rea cultivada
Emisso dos
produtos transgnicos
para a gua
Efeito na funo dos
ecossistemas
Efeitos ambientais
Efeitos diretos
Efeitos indiretos
Desenvolvimento de resistnci a Efeito nos sistemas produtivos e mtodos agrcolas
Desenvolvimento
de resistncia nas
pragas e doenas
alvo
Seleo de
plantas silvestres
tolerantes a herbicidas
Alterao nas
prticas de cultivo
Alterao nos
intervalos e reas
de cultivo
Alterao no
uso dos recursos
Perda da eficci a
do produto transgnico
Reduo da eficcia
do herbicida especfico
Alterao nos tipos de
pragas, doenas e
organismos benficos
Alteraes nas
caractersticas fsicas, qumicas
e biolgicas dos solos
Alteraes nas estratgias de controle de pragas e doenas
Depreciao da
qualidade do sol o
Efeito na biodiversidade
Efeitos econmicos Efeitos ambientai s
Figura 2. Efeitos potenciais diretos e indiretos dos organismos geneticamente
modicados no ambiente.
Fonte: adaptado de Sanvido et al., 2006
480
A seguir, discutiremos alguns pontos-chave desse impacto poten-
cial dos OGMs ao ambiente.
Fluxo gnico e recombinao
O uxo gnico ou introgresso a transferncia de um gene ou
genes de uma planta doadora para outra sexualmente compatvel e
genotipicamente diferente por meio da polinizao, seguida de cru-
zamentos entre o hbrido dentro da populao at a estabilidade do
gene na populao. Essa introgresso pode ocorrer entre espcies,
variedades ou bitipos diferentes, desde que sejam compatveis sexu-
almente. um processo natural que ocorre desde o incio da agricul-
tura, no entanto o advento da transgenia suscitou preocupaes adi-
cionais, pois o uxo entre a planta transformada geneticamente e as
espcies silvestres, ou mesmo as cultivares convencionais, poderia
trazer alguma vantagem seletiva ou contaminar uma produo no
transgnica (ANDRADE; FALEIRO; 2009b; SILVA et al., 2007).
No entanto, o uxo gnico vai ocorrer se as plantas doadoras e
receptoras crescerem perto o suciente para haver a troca de plen,
pois, embora o plen possa viajar longas distncias, seja por meio do
vento, insetos ou por outros animais polinizadores, sua viabilidade
decresce com o tempo e as condies ambientais. Alm disso, para
ocorrer o uxo gnico, necessrio que ambas as espcies/variedades
estejam na poca de orao e os estigmas estejam receptivos para
o plen (CERDEIRA; DUKE; 2006; ANDRADE; FALEIRO, 2009b).
Segundo Sanvido e colaboradores (2006), existe um consenso den-
tro da comunidade cientca de que pode haver uxo gnico entre as
variedades transgnicas e as espcies selvagens compatveis sexual-
mente. Estudos no Canad com canola demonstraram essa hiptese,
porm tambm vericaram que o uxo gnico ocorre na mesma pro-
poro apresentada pelas cultivares no transgnicas. A inquietao
que surge saber se esse transgene poderia causar um impacto rele-
vante na populao selvagem. No caso da canola resistente a herbicida,
cultivada h anos no Canad, no foram encontradas evidncias de
que esse cultivo tenha espalhado resistncia na populao selvagem
de canola. No caso especco de resistncia a herbicidas, no espe-
rado que a introgresso dessa caracterstica conra algum benefcio
481
de seleo, pois dicilmente esses genes teriam caractersticas sele-
tivas dentro do ambiente natural. No entanto, a resistncia a insetos
poderia aumentar a adaptao s pragas naturais da populao sel-
vagem. Entretanto, em ambientes naturais, aps mais de 10 anos de
plantio de OGMs, no foi observado nem a introgresso expressiva
dentro das espcies silvestres compatveis, nem a extino de esp-
cies selvagens pela introgresso de resistncia de transgenes dentro
da populao (SANVIDO et al., 2006; ANDRADE; FALEIRO; 2009b).
Independente de o uxo gnico causar ou no uma vantagem sele-
tiva para espcies silvestres, pesquisas tm sido realizadas no sen-
tido de desenvolver mecanismos para impedir ou minimizar esse
risco. So elas: (i) a restrio geogrca dos cultivos transgnicos;
(ii) a construo de plantas transgnicas com genes letais ativados
por um agente qumico ou pelo ambiente para evitar a disperso de
transgenes (terminator); (iii) a transformao de organelas (mitocn-
drias e cloroplastos) ou de linhagens macho-estreis; (iv) o desenvol-
vimento de bionanomolculas que permitem o biomonitoramento
in vivo do uxo gnico em tempo real; e (v) o manejo para coexistn-
cia entre cultivos transgnicos e no transgnicos (SILVA et al., 2007;
CHAPMAN; BURKE; 2006). Muitas dessas tecnologias ainda esto
em estudo, entre elas, as bionanomolculas e a transformao de
organelas e linhas macho-estreis; outras causam muita controvr-
sia, como o uso de genes terminadores, ou suicidas. No entanto, algu-
mas j esto em uso e apresentando bons resultados, permitindo, em
alguns casos, a liberao de OGMs para plantios comerciais no Brasil
e no mundo, os quais sero discutidos abaixo.
Algodo resistente a inseto
No Brasil podem ser encontradas trs espcies de algodo:
Gossypium hirsutum L., Gossypium barbadense L. e Gossypium muste-
linum Miers ex Watt. Todas so sexualmente compatveis e os cruza-
mentos so mediados por insetos polinizadores. A introduo de cul-
tivares transgnicas, resistentes a insetos, trouxe preocupaes, pois
o uxo gnico a partir de cultivares transgnicas, assim como con-
vencionais, pode afetar a estrutura gentica das demais populaes.
Alm disso, o algodo no apresenta barreiras sexuais completas, ou
482
seja, pode haver cruzamento entre diferentes espcies de um mesmo
gnero. Assim, o isolamento geogrco entre cultivares e as popula-
es que se deseja proteger pode ser utilizado para reduzir a proba-
bilidade de cruzamentos. Nos Estados Unidos e na Austrlia, essa
estratgia foi adotada para evitar a ocorrncia de uxo gnico entre
populaes transgnicas e selvagens. Nos EUA, apenas G. tormento-
sum, uma planta daninha, compatvel com G. hirsutum, porm s
cresce no Hava. Existem populaes de G. hirsutum na Flrida, Ilhas
Virgnia e Porto Rico, e G. barbadense, em Porto Rico. Assim, por
medidas de precauo, essas so reas de restrio para o plantio de
algodo transgnico experimental ou comercial (WOZNIACK, 2002;
BARROSO et al., 2005).
No Brasil, o Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
(MAPA) deniu as reas de excluso de algodo transgnico, na
Portaria 21 de 2005. Essa portaria foi baseada no Comunicado Tcnico
242 da Embrapa (BARROSO et al., 2005), e nos Pareceres Tcnicos
Prvios Conclusivos n 480, de 2004, e n 513, de 2005, da Comisso
Tcnica Nacional de Biossegurana (CTNBio). Esses estudos levaram
em considerao a distribuio das espcies de Gossypium, a impor-
tncia biolgica das populaes e o zoneamento agrcola. Com base
nessas informaes, foram identicadas quatro grandes reas que
compem a zona de excluso (Figura 3). Nas zonas de excluso, alm
da proibio do plantio de algodoeiros transgnicos, tambm dever
ser impedida a circulao de sementes, gros, algodo em caroo e
outras partes propagativas, salvo excees analisadas pela autoridade
competente (BARROSO et al., 2005).
483
No restrio ao GM
Zona de excluso ao GM
Figura 3. Localizao das reas propostas como zonas de excluso para o
plantio de cultivares de algodoeiro geneticamente modicado no Brasil.
Fonte: Barroso et al., 2005.
Alm desses cuidados, o CTNBio, no Comunicado 04 de 24 de
junho de 2008, visando a aumentar a segurana, determinou, para
pesquisa, as seguintes condies de isolamento para concesso de
autorizao de liberao planejada no meio ambiente de algodoeiro
geneticamente modicado:
a) Manter distncia mnima de 800 m de quaisquer outras esp-
cies de algodoeiro caso haja algodoeiros silvestres ou varieda-
des locais nas proximidades.
b) Manter distncia mnima de 250 m de qualquer algodoeiro e
implantar bordaduras de conteno de trinta linhas de algodo-
eiro convencional e de dez linhas de milho ao redor das par-
celas experimentais na ausncia de plantas silvestres ou varie-
dades locais.
484
As bordaduras so barreiras fsicas que visam diminuir a pos-
sibilidade de o gro de plen alcanar uma cultivar convencional
ou um indivduo da populao silvestre. No entanto, nos EUA, o
USDA-APHIS demanda uma distncia de isolamento de 12 m entre o
cultivar de algodo transgnico e os cultivares no transgnicos e esp-
cies selvagens (MNSTER; WIECZOREK, 2007). Estudos demonstra-
ram existir 1% de polinizao cruzada nas linhas com 7 m de distncia
do plantio transgnico, e abaixo de 1% a 25 m (UMBECK et al., 1991).
Soja tolerante a herbicida
O Brasil o segundo maior produtor mundial de soja, e, como
no resto do mundo, a soja resistente a herbicida teve tima aceita-
o pelos produtores. Essa rpida adoo e crescimento do plantio
trouxeram questionamentos sobre a possibilidade da coexistncia
entre a soja transgnica e no transgnica, principalmente a orgnica.
Existiam dvidas sobre a possibilidade de haver uxo gnico das cul-
tivares transgnicas para as demais, gerando contaminao dos diver-
sos sistemas de produo de soja (ANDRADE; FALEIRO; 2009b).
A soja uma planta autgama, isto , reproduz-se preferencial-
mente por autofecundao, apresentando um mecanismo chamado
de cleistogamia, no qual a fecundao ocorre antes da abertura da
or. Apesar desse mecanismo, pode ocorrer a polinizao cruzada
em soja, a qual est em torno de 1%, podendo chegar a 2,5% em algu-
mas cultivares. Em razo dessa caracterstica, nos EUA, as Agncias
Reguladoras no exigem distncia mnima para o plantio de soja
transgnica e no transgnica, devido ao baixo ndice de transfe-
rncia de genes entre as cultivares (CARPENTER et al., 2002). At
o momento, no foram vericados ou comprovados maiores proble-
mas com a ocorrncia de fecundao cruzada entre a soja genetica-
mente modicada e a soja no transgnica nos plantios comerciais
do Brasil e do mundo.
No Brasil, no existe exigncia mnima para o plantio comercial de
soja. Entretanto, a Lei n 11.460, de 21 de maro de 2007, estabelece
que a distncia mnima de plantio de OGMs ser estabelecida caso a
caso, e est proibido o plantio de qualquer OGM em reas indgenas
e unidades de conservao, exceto em reas de proteo ambiental
485
(APA) com plano de manejo para regulamentar o plantio do OGM.
Assim, o plantio comercial ou para pesquisa da soja transgnica deve
seguir essa regulamentao.
Pesquisadores da Embrapa realizaram estudos para avaliar o uxo
gnico da soja transgnica e demonstraram que a maior frequncia
de disseminao de plen transgnico foi de 0,45%, nas linhas com
0,5 m distncia do cultivo transgnico (ABUD et al., 2003). Essa fre-
quncia foi reduzida para no mximo 0,14% na distncia de 1 m, atin-
gindo 0% aos 6,5 m do cultivo transgnico (Figura 4). Esses resulta-
dos foram corroborados em um novo experimento realizado na regio
do Cerrado, o qual demonstrou que a polinizao cruzada em soja
tende a zero em distncias maiores que 8 m. Assim, os autores suge-
riram uma distncia de isolamento de 10 m para garantir a pureza
das sementes (ABUD et al., 2007).
Nordeste
Sudoeste
Distncia (metro)
E
v
e
n
t
o
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p
o
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a
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s
g
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n
e
s
30
25
20
15
10
5
0
0,5 1,5 1 2 2,5 4 5,5 6,5 7,5 3 3,5 4,5 5 6 7 8
Figura 4. Distribuio dos eventos de fecundao entre plantas transgnicas
da parcela central e no transgnicas na direo nordeste e sudoeste.
Fonte: adaptado de Abud et al., 2003.
486
Milho resistente a insetos
O problema do uxo gnico maior em plantas algamas, ou
seja, que apresentam fecundao cruzada, como no caso do milho.
No Brasil, houve muita controvrsia principalmente a esse respeito
desde que a empresa Monsanto entrou na CTNBio, em 1999, com
um pedido para a liberao comercial do plantio do milho resistente
a insetos da ordem lepidptera (Milho Gardian, MON810). O pare-
cer tcnico conclusivo favorvel ao plantio comercial s foi publicado
em 2007. No Parecer Tcnico N 1.100/2007 de 16 de agosto de 2007,
a CTNBio se refere da seguinte maneira ao uxo gnico:
Estudos sobre disperso de plen de milho tm sido condu-
zidos, sendo que alguns deles mostram que o plen de milho
pode deslocar-se a longas distncias. Porm, a maioria do
plen liberado depositada prxima cultura, com taxa de
translocao muito baixa fora da cultura fonte. O agente
de polinizao predominante no milho o vento e a distn-
cia que o plen vivel pode percorrer depende dos padres de
vento, umidade e temperatura... Os resultados indicam que
a viabilidade do plen mantida por 2 h e que a poliniza-
o cruzada no foi observada em distncias de 300 metros
da fonte de plen. Comparando-se as concentraes a 1 m da
cultura fonte sob ventos baixos a moderados estimou-se que,
aproximadamente, 2% de plen so anotados a 60 m, 1,1%
a 200 m e 0,75-0,5% a 500 m de distncia. A 10 m de um
campo, em mdia, o nmero de gros de plen por unidade
de rea dez vezes menor que o observado a 1 m da borda.
Portanto, se as distncias estabelecidas de separao desen-
volvidas para produo de sementes de milho so observadas,
espera-se que a transferncia de plen s variedades adjacen-
tes seja minimizada, sendo improvvel a presena de mate-
riais genticos com resistncia a insetos (CTNBio).
A Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (Anvisa) e o Instituto
Bra si leiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis
(Ibama) entraram com recurso no Conselho Nacional de Biossegu-
rana (CMBS) contestando o parecer da CTNBio. No entanto, na Reso-
487
lu o CBSN n 3, de maro de 2008, considerou-se improcedente o
recurso impetrado e raticou-se o parecer 1.100/2007 da CTNBio.
Por m, para regulamentar os plantios comerciais, a CTNBio, na
Resoluo Normativa n 4 de 16 de agosto de 2007, estabelece que,
para haver a coexistncia de plantios comerciais de milho transgni-
cos e no transgnicos, o agricultor deve respeitar a distncia mnima
de 100 m entre os plantios. Tambm existe a possibilidade de uma
distncia de 20 m, desde que haja uma bordadura de no mnino 10 m
de milho convencional de porte e ciclo vegetativo similar ao genetica-
mente modicado. Em relao a estudos experimentais em campo, o
Comunicado 01, de 9 de agosto de 2006, determinou que
as instituies ou entidades interessadas em obter autoriza-
o de liberao planejada no meio ambiente de milho gene-
ticamente modificado devero adotar, pelo menos, uma das
duas alternativas abaixo estipuladas:
a) Isolamento espacial: estabelecer bordadura de conten-
o com dez linhas de milho no geneticamente modi-
ficado ao redor das parcelas experimentais e manter
distncia de 400 metros de outros plantios com milho.
b) Isolamento temporal: estabelecer bordadura de con-
teno com vinte linhas de milho no geneticamente
modificado ao redor das parcelas experimentais, man-
tendo distncia de 10 metros de outros plantios de
milho, e respeitar perodo mnimo de 40 dias entre
datas de florescimento de outros plantios de milho.
Nos casos de cultivo de variedades crioulas de milho nas pro-
ximidades da rea experimental, as instituies ou entida-
des interessadas devero estabelecer, ao redor das parcelas
experimentais, bordadura de conteno com dez linhas de
milho no geneticamente modificado, manter distncia de
400 metros de outros plantios com milho (isolamento espa-
cial) e respeitar perodo mnimo de 40 dias entre datas de flo-
rescimento de outros plantios de milho (isolamento tempo-
ral) (CTNBio, Comunicado 21, 2006).
488
Nos EUA, Goggi e colaboradores (2006) realizaram um experi-
mento para determinar o potencial de uxo gnico de um campo de
produo transgnico quando rodeado por campos de produo con-
vencional (no transgnicos), em duas safras 2003 e 2004. Os resulta-
dos demonstraram que a percentagem de polinizao cruzada entre
variedades de milho transgnicas e no transgnicas decresciam expo-
nencialmente em distncias de 1 m, 10 m, 35 m, 100 m, 150 m, 200 m
e 250 m, chegando a 0,05% a 100 m e 0,002% a 250 m. No entanto,
houve variao da frequncia de polinizao em funo dos anos de
plantio e no houve zero por cento de polinizao mesmo a 250 m.
Os autores sugerem que, para haver coexistncia entre transgni-
cos e no transgnicos, necessrio haver uma separao temporal
de semeadura ou o plantio de uma barreira de no transgnico com
alta densidade de produo de plen ao redor do cultivo transgnico.
Luna e colaboradores (2001) avaliaram a durao da viabilidade do
plen e a distncia efetiva de isolamento em estudos realizados no
Mxico. Os resultados demonstraram que a polinizao cruzada ocorre
a uma distncia mxima de 200 m e nenhuma polinizao cruzada
aconteceu em distncias iguais ou superiores a 300 m em relao s
fontes de plen. Tambm demonstraram que, nas condies de poten-
cial hdrico atmosfrico, o plen perdia sua viabilidade ps 2 horas
de coleta. Esses resultados so importantes, pois o Mxico o cen-
tro de origem de vrias espcies de milho e relativos, e existem muita
discusso e dvidas a respeito do uxo gnico das cultivares trans-
gnicas para as espcies nativas e crioulas do pas (DALTON, 2008).
No Brasil, entende-se que o uxo gnico s ocorrer dentro da
mesma espcie independente de ser crioula ou cultivada, pois aqui
no ocorrem outras espcies que cruzam com o milho. Assim, a
Embrapa considera que possvel a coexistncia entre as varieda-
des Bt e no transgnicas, desde que seja mantido um espaamento
espacial e temporal. A Embrapa tambm sugere a criao de zonas
de excluso para aumentar as possibilidades da coexistncia de milho
transgnico e no transgnico (EMBRAPA, 2006).
489
Efeito em espcies no alvo e benficas
O efeito de plantas transgnicas sobre espcies no-alvo tem sido
bastante debatido, existindo uma controvrsia sobre se devemos
avaliar o efeito no ecossistema ou apenas selecionar algumas esp-
cies-chave ou indicadoras (ARPAIA et al., 2007). Espcies no-alvo
so denidas como as espcies que no so propsito direto do uso
de um pesticida particular (SANVIDO et al., 2006). Assim, um grupo
de estudos formado por 403 pesquisadores de diferentes instituies,
formaes e pases desenvolveu um projeto visando denir as dire-
trizes de como realizar uma anlise de risco referente ao efeito de
OGMs sobre o ambiente (GMO-ERA, 2008). Esse estudo ocorreu em
duas fases de 2002 a 2007, e, para avaliaes de risco sobre espcies
no-alvo, foi proposta uma metodologia em quatro etapas (Figura 5).
Existem muitas espcies com potencial de serem afetadas pelos
OGMs. Em razo disso, era essencial avaliar, ranquear e selecionar
as espcies e os processos ecolgicos para identicar os mais afetados
pelo OGM para futura anlise de risco. As quatro etapas da metodo-
logia de anlise de risco de OGMs em espcies no alvo ilustrado na
Figura 5 so explicadas abaixo:
1 Etapa Identicao dos grupos ecolgicos funcionais: espcies
e processos ecolgicos podem ser divididos em grupos ecolgicos e
funcionais que so relacionados a possveis danos ambientais. Grupos
de alta prioridade podem ser identicados e selecionados, por exem-
plo, predadores, polinizadores e decompositores.
2 Etapa Associao com a cultura-alvo e signicncia: ranquear
em importncia todas as espcies relevantes associadas ao OGM den-
tro de cada grupo funcional selecionado na 1 etapa e avaliar:
Qual o grau de associao entre a espcie ou processo ecol-
gico e o OGM? Caso a espcie ou processo seja afetado negati-
vamente, qual o grau de signicncia das consequncias negati-
vas; caso a espcies seja benca, poderia se tornar praga futura
ou causar problemas na sade do produtor?
490
Grupo Funcional
Associao
com a cultura
Importncia funcional
no sistema agrcola
Espcies ou processos prioritrios
O que exposto ao
produto do transgene?
Qual os outros
impactos ecolgicos?
Espcie ou processo
prioritrio
Vias de
efeitos
trficos
mediados
Via de
outros
efeitos
ecolgicos
Hipteses
Experimentos
Hipteses podem
ser descartadas
Deciso baseada
em dados
Hipteses podem
ser confirmadas
1 etapa
2 etapa
3 etapa
4 etapa
Figura 5. Metodologia de anlise de risco do efeito de um OGM sobre esp-
cies no-alvo.
Fonte: adaptado de GMO-ERA, 2008..
491
3 Etapa Vias de exposio e de efeitos adversos: avaliao preli-
minar e hipteses de risco: (i) para espcies e processos ecolgicos
mantidos na etapa 2, avaliar quo prximo o contato entre eles e o
produto do OGM; (ii) na ocorrncia de exposio, quais so os pos-
sveis impactos negativos, incluindo impactos devido alterao do
manejo da cultura; e (iii) elaborao da hiptese de risco das vias de
exposio e efeitos adversos, priorizao baseada na probabilidade,
reversibilidade, escala espacial e magnitude.
Essas etapas analisam e sintetizam a informao existente, uti-
lizando o conhecimento local. Isso ajuda a identicar e priorizar
falhas de conhecimento chaves na biodiversidade da regio ou pas
de estudo.
4 Etapa Espcies e processos prioritrios podem ser testados para
avaliar o efeito real. importante utilizar mtodos que so relevantes
ao ambiente local (GMO-ERA, 2008).
As principais preocupaes do efeito de OGMs em espcies no-alvo
so referentes s cultivares Bt. A resistncia a insetos, caracterstica
introduzida nas plantas Bt, expressa pelas protenas Cry do Bacillus
thuringiensis (Bt), e tem como alvo lagartas da ordem lepidptera. No
entanto, existem algumas dvidas se o uso indiscriminado e prolon-
gado de cultivares Bt poderia afetar direta ou indiretamente esp-
cies no-alvo, principalmente inimigos naturais das pragas. Porm,
no caso especco de toxidez de organismos no-alvo, necessria a
ingesto da protena expressa pelas plantas Bt, seja pela alimentao
com amostras das plantas Bt, seja pela ingesto de insetos-alvo ou
de resduos vegetais (SANVIDO et al., 2006; ANDRADE; FALEIRO,
2009b ).
Segundo Frizza e Oliveira (2006), os potenciais efeitos diretos das
cultivares Bt na dinmica populacional das pragas dependem de diver-
sos fatores, como, por exemplo: (i) o nvel de resistncia da planta; (ii)
a especicidade da protena expressa; (iii) em quais tecidos o trans-
gene expresso e por quanto tempo; (iv) a presena de outras plan-
tas suscetveis prximas e (v) o manejo da cultura. Alm dos efeitos
diretos sobre a biologia e comportamento do inimigo natural devido
expresso de substncias qumicas, existem os efeitos indiretos, ou
seja, efeito da planta sobre o inimigo natural da praga, ou seja, sobre
espcies no-alvo (FRIZZAS; OLIVEIRA; 2006).
492
Resultados de vrios estudos realizados nos ltimos anos no
demonstraram evidncias de efeitos provenientes da toxidez direta
da protena Cry, expressa em plantas Bt sobre os inimigos naturais
no-alvo em campos experimentais (SANVIDO et al., 2006). Segundo
os autores, existem mais evidncias de que as plantas Bt so mais
alvo especco e apresentam menor efeito colateral sobre espcies
no-alvo que os inseticidas utilizados atualmente (SANVIDO et al.,
2006). Efeitos indiretos sobre os inimigos naturais (predadores) nos
plantios de milho Bt ocorreram pela diminuio da disponibilidade
dos herbvoros alvos da tecnologia. No entanto, a maioria dos preda-
dores naturais se alimenta de vrias espcies, e, no campo, buscam
outras espcies para se alimentarem quando h uma diminuio de
uma espcie particular. Assim, a ocorrncia de efeito indireto no est
somente relacionada ao plantio do OGM, mas a qualquer manejo para
controle da praga, pois todos reduzem a disponibilidade dos inse-
tos-alvo e consequentemente afetam a populao de inimigos naturais.
O parecer tcnico do CTNBio referente ao Milho Bt (MON810),
com base em estudos realizados no departamento de Entomologia
da Esalq, concluiu que:
1) A protena txica somente para os insetos-alvo citados,
especificamente para lepidpteros (lagartas) que possuem,
exclusivamente, em seus intestinos, receptores especficos
para essa protena. Os mamferos no possuem esses recep-
tores ou stios de ligao e, portanto, os seres humanos, os
animais e outros organismos no-alvo no so afetados
pela protena Bt, incluindo outros artrpodes e tambm
inimigos naturais das pragas-alvo...
2) Estudos de campo realizados no Brasil, sobre as popula-
es de insetos presentes em plantaes de milho transg-
nico derivado da linhagem MON810, mostraram que a
presena de inimigos naturais e de insetos no-alvo, nes-
tes campos, semelhante. Os ensaios de campo feitos para
a avaliao da dinmica populacional de insetos como
tesourinhas, joaninhas (Coleoptera), sirfdeos (Diptera),
percevejos (Hemiptera) no demonstraram impactos sig-
nificativos na entomofauna das regies estudadas.
493
3) O milho MON810 no apresentou efeito sobre a din-
mica populacional das espcies predominantes de ara-
nhas e insetos benficos de diferentes guildas trficas,
incluindo pragas no-alvo e insetos benficos (Carabidae,
Coccinellidae, Chrysopidae, Hemerobiidae, Syrphidae,
Tachinidae e Apidae). A populao de abelhas, A. melli-
fera, foi maior nas reas avaliadas. Esse resultado pode
assim ser explicado: (1) a protena Cry1Ab no age no
aparelho digestivo das abelhas por ser especfico somente
para algumas espcies de lepidpteros; (2) as abelhas se
alimentam livremente de plen pelo menor uso de insetici-
das nas plantaes de milho MON810 (CTNBIO, 2007).
Em relao ao Algodo WideStrike , que tambm expressa a prote-
na Bt, o CTNBio conclui:
1) Numerosos experimentos com protenas Bt demonstram
a ausncia de toxicidade ao homem e aos animais verte-
brados, ausncia de efeitos adversos a organismos no-alvo
e ao ambiente.
2) Com relao aos artrpodes no-alvo, no foram observa-
dos efeitos na sobrevivncia mdia de abelhas expostas a 2
mg de plen do evento expressando Cry1F ou 1,98 g/ml
de protena Cry1F em combinao com a protena Cry1Ac.
A CL50 em dieta para larvas de crispa (Chryosperia car-
nea) expostas protena Cry1F, pura ou em combinao
com a protena Cry1Ac, foi investigada em uma srie de
estudos com a protena microbiana administrada em uma
dieta de ovos de mariposa.
3) A ausncia de efeitos em testes de ecotoxidez em organis-
mos no-alvo mostra largas margens de segurana relati-
vas s concentraes ambientais de exposio projetadas,
de maneira conservadora e essas observaes so corrobo-
radas com monitoramento de campo da abundncia de
espcies.
4) O uso de tecnologia como o algodo Bt resistentes a insetos
pode impactar positivamente a preservao de populaes
de organismos no-alvo e insetos benficos, facilitando o
manejo integrado de pragas da lavoura (CTNBio, 2009).
494
As plantas tolerantes a herbicida so consideradas sem efeito direto
em espcies no-alvo, pois a tolerncia a herbicida uma caracters-
tica normalmente expressa em plantas e conhecidas por no terem
propriedades txicas. Entretanto, apresentam impactos ambientais
indiretos em virtude de alteraes nas prticas culturais (SANVIDO
et al., 2006). Um estudo da Farm Scale Evaluations (FSE) realizado na
Inglaterra demonstrou que houve uma queda da biomassa de plan-
tas daninhas nos campos de beterraba e canola resistentes a herbici-
das e, consequentemente, uma diminuio da densidade de insetos
que, por sua vez, afetaram negativamente a populao de pssaros
da regio. As concluses desse estudo consideram que o uso de plan-
tas resistentes a herbicida afeta a biodiversidade das regies rurais
(SQUIRE et al., 2003; CHAMPION et al., 2003). No entanto, embora
o manejo de plantas resistentes a herbicidas permita um maior con-
trole das plantas daninhas, qualquer sistema de manejo dessas pragas,
quando bem aplicados, tambm ter a mesma consequncia. Assim,
os resultados so devidos a um efetivo sistema de controle das plan-
tas daninhas, podendo ocorrer com outros tipos ecientes de manejo
(SANVIDO et al., 2006).
Hawes e colaboradores (2009) realizaram um estudo com 20 esp-
cies vegetais, tolerantes a herbicidas e suas cultivares convencionais,
e avaliaram seu efeito em 36 grupos funcionais de invertebrados. Eles
concluram que ocorrem alteraes nos grupos funcionais em funo
da cultura, poca de plantio e do sistema de manejo, e que essas alte-
raes afetam a abundncia, a biomassa e a relao entre os diversos
nveis trcos. Por m, concluram que o tipo de sistema de pro-
duo que determina essas alteraes; ademais, propem que um
modelo de estudo poderia ser utilizado para desenvolver padres e
critrios de avaliao dos impactos ambientais da introduo de uma
nova cultivar, transgnica ou no.
Persistncia do gene aps a colheita da cultura
A preocupao de o transgene permanecer intacto aps a colheita
e degradao dos restos culturais existe em razo da possibilidade
de esse transgene ser incorporado por outros organismos, principal-
mente microrganismos. Isso conhecido como transferncia hori-
495
zontal, ou seja, a transferncia no sexual de material gentico para
organismos da mesma espcie ou espcie diferente. A possibilidade
de transferncia gentica entre espcies um processo conhecido e
possvel, embora raro, com exceo de bactrias e fungos. Esse pro-
cesso faz parte da evoluo das espcies, contudo o fenmeno no
ocorre de maneira corriqueira, sendo necessria uma srie de fato-
res para que ele acontea. Entre os fatores esto, a permanncia da
viabilidade do DNA intacto no solo em quantidade suciente para a
transformao dos microrganismos; a presena de bactrias/fungos
competentes para a transferncia e sequncias homlogas entre o
microrganismo e o transgene para a integrao do DNA no genoma;
e uma vantagem seletiva que essa nova sequncia de DNA poderia
conferir ao microrganismo para que seja transmitido para as prxi-
mas geraes (AZEVEDO; ARAJO, 2003; CRAIG et al., 2008). Com
isso, Keese (2008) conclui que a transferncia horizontal de um OGM
para outras espcies no motivo de maiores preocupaes, porque
so eventos raros e tem pequena chance de trazer uma caracterstica
vantajosa para o organismo receptor.
Nielsen e colaboradores (2008) determinaram que fragmentos de
DNA persistem no solo aps prolongados perodos de tempo, no
entanto os autores concluem que somente isso no causa impacto no
ambiente, pois so necessrios outros fatores para a transferncia hori-
zontal. Assim, eles sugerem estudos aprofundados dos demais eventos
necessrios para a ocorrncia de transferncia horizontal, bem como
o desenvolvimento de mtodos mais adequados para essas avaliaes.
Outros aspectos importantes dos possveis impactos ambientais de
OGMs so discutidos por Andrade e Faleiro (2009b). Um ponto discu-
tido pelos autores a reduo do uso de pesticidas em plantios comer-
ciais de transgnicos. Segundo Brookes e Barfoot (2005), as lavou-
ras OGM contriburam para uma signicativa reduo no impacto
ambiental global da produo agrcola.
Biossegurana alimentar de OGMs
O termo Segurana Alimentar (Food Security) surgiu na Europa,
a partir da 1 Guerra Mundial, em razo da necessidade de formao
de estoques estratgicos de alimentos. Na 2 Guerra Mundial, foi agre-
496
gada a noo do direito humano alimentao. Com o tempo, foram
agregadas as preocupaes com a qualidade do alimento, no que se
referia segurana dos aditivos alimentares, dos resduos de agrot-
xicos e da irradiao de alimentos. Iniciou-se ento um processo de
desenvolvimento e padronizao de mtodos rpidos e ecientes para
deteco e quanticao de agentes biolgicos e qumicos, ou seja, a
inocuidade dos alimentos (Food Safety). Atualmente, a preocupao
se refere tambm segurana dos produtos transgnicos (Biosafety)
(ANDRADE; FALEIRO, 2009c; LAJOLO; NUTTI, 2002).
As avaliaes de produtos geneticamente modicados so reali-
zadas por diferentes grupos, publicadas e submetidas anlise dos
pares. O processo bastante similar ao que ocorre com produtos far-
macuticos. Isto , assim como ocorre com as fbricas de frmacos
que produzem os dados de segurana do produto e os submetem
s agncias reguladoras para reviso, as empresas que desenvolvem
um OGM devem repassar todos os dados para as agncias que regu-
lam a liberao de produtos transgnicos. No caso do Brasil, as agn-
cias reguladoras so a CTNBio, e, em algumas situaes, a Anvisa e
o Ibama (LEMAUX, 2008).
Segundo a FAO/WHO (1996), as consideraes em relao segu-
rana alimentar de OGMs incluem:
1) As consequncias diretas de alterao nos nveis de expresso
de genes existentes pela introduo do novo gene ou modi-
cao genticas causadas por ele.
2) As consequncias diretas (por exemplo, efeitos antinutricio-
nais, txicos ou alergnicos) da presena nos alimentos da pro-
tena codicada pelo gene introduzido.
3) As consequncias indiretas dos efeitos de qualquer novo(s)
produto(s), ou nveis alterados de produto(s) j existentes, no
metabolismo do organismo levando presena de novos com-
postos ou nveis alterados de compostos j existentes.
4) As consequncias das mutaes causadas no processo de
introduo gentica no organismo, tais como a interrupo de
sequncias codantes ou controle ou ativao de genes latentes,
levando presena de novos componentes ou nveis alterados
de componentes existentes.
497
5) As consequncias da transferncia do gene para a ora gas-
trointestinal pela ingesto do alimento geneticamente modi-
cado (AGM) e (ou) alimentos derivados deles.
6) Potencial efeito adverso na sade associado ao microrganismo
geneticamente modicado pelo alimento.
Equivalncia substancial (ES )
O Princpio da Equivalncia Substancial considera que os orga-
nismos existentes e seus produtos derivados podem ser utilizados
como parmetro comparativo na avaliao de segurana de OGMs,
uma vez que considera-se que esses alimentos so seguros. Isto ,
todo alimento utilizado presumivelmente seguro a no ser que um
perigo signicativo tenha sido identicado. Baseado nesse conceito,
avaliam-se similaridades e diferenas entre os alimentos transgni-
cos em comparao aos seus anlogos considerados saudveis (OECD,
1993; WHO, 2000). O objetivo garantir que os alimentos transgni-
cos sejam to seguros quanto os anlogos convencionais (ANDRADE;
FALEIRO, 2009c). Essa comparao se refere equivalncia qualita-
tiva e quantitativa de protenas, gorduras, amido, aminocidos, vita-
minas, minerais e composio nutricional.
Entretanto, a ES apenas uma anlise preliminar que no garante a
segurana, mas auxilia na identicao de similaridades e diferenas
entre o alimento convencional e o OGM, que posteriormente sub-
metido a anlises toxicolgicas adicionais. Essas anlises so impor-
tantes porque podem ocorrer efeitos no intencionais que alteram a
composio e o valor nutricional do alimento, tambm podem ocor-
rer efeitos antinutricionais ou txicos. Assim, todo alimento transg-
nico submetido a um processo de anlise de risco antes de ser libe-
rado para o consumo humano ou animal. A liberao de um alimento
geneticamente modicado ocorre caso a caso e para isso o alimento
em questo precisa ser analisado por meio da avaliao preliminar
de perigo, na qual se analisa, alm da Equivalncia Substancial (ES),
o aspecto nutricional e toxicolgico (ANDRADE; FALEIRO, 2009c;
WHO, 2000; WATANABE; NUTTI., 2002).
498
Consequncias diretas de OGMs na alimentao humana
A Organizao Mundial de Sade (WHO-World Health
Organization) juntamente com a Food and Agriculture Organization
(FAO) deniram perigo como a presena de um agente nocivo capaz de
causar algum efeito prejudicial; e risco como a probabilidade de ocor-
rncia do agente. Com relao a OGMs, podemos considerar que a
introduo de uma sequncia nova no genoma de um organismo pode
causar efeitos intencionais e no intencionais, previsveis ou no, pois
a incorporao do DNA no genoma pode interferir na expresso de
outros genes, podendo alterar o metabolismo da planta. Alm disso,
o produto da expresso do DNA uma protena que pode ter efeito
txico, alergnico, antinutricional ou mesmo alterar o valor nutricio-
nal do alimento (ANDRADE; FALEIRO; 2009c).
Considerando que DNA constitudo de nucleotdeos que apre-
sentam uma base nitrogenada (adenina, guanina, citosina e timina),
um acar (pentose) e um radical fosfato e que o DNA recombinante
inserido nos alimentos no difere quimicamente do DNA constituinte
dos alimentos que ingerimos diariamente, conclui-se que a degrada-
o do DNA recombinante no difere do DNA normalmente ingerido
atravs dos alimentos no transgnicos. Assim a FAO e Organizao
Mundial de Sade consideram que a simples ingesto do DNA recom-
binante no perigosa, pois ingerimos DNA diariamente em nossa
dieta (FAO/WHO, 1996).
Consequncias indiretas de OGMs na alimentao humana
A introduo de um gene no genoma de um organismo pode alte-
rar a expresso de genes constitutivos e afetar no intencionalmente a
expresso de algumas caractersticas. O transgene ao integrar dentro
ou em regies adjacentes dos genes de um organismo pode pertur-
bar sua expresso, aumentando ou diminuindo a mesma. O seu rear-
ranjo tambm pode criar novas sequncias abertas de leitura (Open
reading frames ORFs) alteradas que permitem ao transgene sinte-
tizar produtos no intencionais (HALLSBERG, 2005).
Efeitos no intencionais podem ser a elevao dos nveis de consti-
tuintes antinutricionais ou txicos em alimentos. Mas tambm podem
499
ser genticos, com usos para o melhoramento ou epigenticos, que
so alteraes induzidas pelo transgene que podem afetar a expresso
de outro gene, sem mudar a sequncia de DNA, e por m algumas
instabilidades, como o silenciamento de genes. Esses efeitos podem
aumentar a probabilidade de efeitos pleiotrpicos, isto , efeitos de
um mesmo gene em mais de uma caracterstica fenotpica, assim
como de efeitos epistticos, que a interao do gene inserido com
os outros genes (FAO, 2000).
Os efeitos no intencionais podem ser consequncia da posio de
insero do gene de interesse, ou esto associados com a interao
entre os produtos expressos do gene introduzido e as protenas end-
genas e metablitos. Mtodos adequados para a avaliao de efeitos
no intencionais precisam ser estudados caso a caso, considerando
fatores txicos e antinutricionais no intencionais, por meio de uma
anlise dos constituintes e de caractersticas GM. No entanto, por
mais rigorosos que sejam os mtodos para validao das variedades
transgnicas, no fcil distinguir alteraes no desejveis no meta-
bolismo e a atividade de vrias protenas, pois existe grande variao
no nvel de expresso das protenas em funo da cultivar, ambiente,
poca de colheita e outros. Assim, para essas avaliaes, tem-se o cui-
dado de comparar o transgnico com diversas cultivares da espcie
estudada.
Diversos estudos com animais, tanto com alimentos transgnicos
como com seus produtos, esto demonstrando ausncia de efeitos
no intencionais entre os alimentos transgnicos e sua contraparte
no transgnica. No foi encontrado efeito na composio, digestibi-
lidade, sade animal e performance, apoiando a equivalncia subs-
tancial desses alimentos (LEMAUX, 2008).
Alergenicidade
A alergia a um alimento uma reao adversa a algum componente
do mesmo que envolve uma resposta anormal do sistema imunol-
gico do corpo. O tipo mais comum de alergia a alimentos o mediado
pela produo de anticorpos especcos, as imunoglobulinas E espe-
ccas (IgE). Em uma resposta alrgica mediada por IgE, os primei-
ros sintomas ocorrem alguns minutos ou horas aps a ingesto do
500
alimento e exposio do corpo ao agente alergnico. Algumas alergias
comuns mediadas por IgE so as induzidas por plen, esporos, pelos
de animais, picadas de insetos e alguns tipos de alimentos. Existem
tambm respostas alergnicas mediadas por reaes celulares que,
em geral, ocorrem cerca de 8 horas aps a ingesto do alimento, por
exemplo, a alergia ao glten (ANDRADE; FALEIRO, 2009c; FAO/
WHO, 2001).
Um ponto importante que quase todos os alergnicos alimen-
tares so protenas, as quais podem estar distribudas em diferen-
tes partes da planta e serem inuenciadas por fatores ambientais.
No entanto, no existe uma propriedade nica que caracterize um
alergnico potencial, embora a maioria dos alergnicos possua uma
srie de caractersticas comuns. So elas: (1) resistncia a digesto;
(2) resistncia ao processamento; (3) peso molecular de 10 a 70 kDa;
(4) presena no alimento em concentraes acima de 1%; e (5) sequ-
ncia de aminocidos com homologia a outros alergnicos conheci-
dos (ANDRADE;FALEIRO, 2009c).
Em funo da preocupao referente capacidade de um alimento
transgnico causar uma reao alrgica a um indivduo, o Conselho
Internacional de Biotecnologia de Alimentos e o International Life
Science Institute (ILSI) desenvolveram uma rvore de decises sobre o
potencial alergnico de um OGM, que tem sido adotada pelas empre-
sas que desenvolvem OGMs. Os critrios relevantes na utilizao da
arvore de deciso so:
1) Fonte do gene transferido: ateno particular no caso da fonte
do gene conter alergnicos conhecidos.
2) Homologia da sequncia: a sequncia de aminocidos de mui-
tas protenas alergnicas facilmente acessada.
3) Imunoreatividade da nova protena: caso a protena seja deri-
vada de uma fonte alergnica conhecida ou tenha homologia
de sequncia com algum alergnico, ento a reatividade ao
IgE do soro sanguneo de indivduos alrgicos ao alimento
determinada.
4) Efeito do pH e (ou) digesto: a maioria dos alergnicos resis-
tente ao suco gstrico e a proteases digestivas.
501
5) Estabilidade ao processamento ou aquecimento: alergnicos
de alimentos susceptveis ao calor ou processamento so con-
siderados menos preocupantes (FAO/WHO 2000).
Transferncia Horizontal no trato gastrointestinal
A Organizao Mundial de Sade em um Workshop sobre Aspectos
relacionados sade dos genes marcadores de plantas geneticamente
modicadas, ocorrido em 1993, concluiu, com base na complexidade
de etapas necessrias para a transferncia horizontal, que no exis-
tiam evidncias de transferncia de genes de plantas para microrga-
nismos no trato gastrointestinal. Para suceder essa transferncia, seria
necessria a ocorrncia das seguintes etapas:
1) O DNA vegetal teria que ser liberado da clula/tecido vegetal e
no ser degradado (sobreviver) no ambiente gastrointestinal,
exposto ao cido gstrico e s nucleases.
2) O microrganismo receptor teria que estar competente para a
transformao.
3) O microrganismo receptor teria que se ligar ao DNA a ser
transferido.
4) O DNA teria que penetrar a parede celular e translocar-se atra-
vs da membrana celular do microrganismo.
5) O DNA teria que continuar ntegro ao sistema de restrio/
modicao desenvolvido pelo microrganismo para degradar
o DNA estranho.
6) O DNA teria que ser integrado ao genoma ou plasmdios do
hospedeiro, o que requer a homologia de pelo menos 20 pares
de base em ambas as extremidades do DNA a ser transferido,
possibilitando a recombinao gentica.
Assim, improvvel que o DNA exgeno se integre ao genoma
humano, pois a molcula de DNA desintegrada durante o processo
digestivo e dicilmente caria intacta para ser aproveitada pelas clu-
las do corpo humano ou animal. Em 1996, um Conselho da FAO/
WHO corroborou essa deciso. No entanto, considerou que, embora a
transferncia do DNA para as bactrias do trato intestinal seja remota,
em caso de genes que poderiam afetar a sade humana ou animal,
como o caso da resistncia a antibiticos, estes no deveriam ser
502
utilizados em plantas geneticamente modicadas para o uso comer-
cial. Estudos recentes comprovaram que a transferncia horizontal de
genes para o trato gastrointestinal ou microrganismos no motivo de
maiores preocupaes (ANDRADE; FALEIRO, 2009c; KEESE, 2008).
Com relao biossegurana alimentar, j foram emitidos alguns
pareceres conclusivos do CTNBio em relao ao milho e algodo Bt
e soja RR.
Milho Bt
Segundo a CTNBio, o milho Bt (MON810) no apresenta risco
sade humana no que se refere composio nutricional:
A introduo do gene cry1Ab no resultou em aparente alte-
rao de importncia nutricional, pois os perfis dos principais
nutrientes foram similares queles normalmente observados
em outras variedades ou sob distintas condies de cultivo.
Assim, os resultados sobre composio qumica e centesi-
mal do milho MON810 esto de acordo com o Princpio da
Equivalncia Substancial.
Alm disso, um efeito secundrio benco foi encontrado em rela-
o ao milho Bt, pois:
em razo da menor infestao por insetos em relao s
variedades tradicionais de milho, h menor crescimento de
fungos associados, produtores de micotoxinas de importn-
cia patolgica para seres humanos e animais e reduzindo, em
consequncia, de forma considervel, a contaminao e a pre-
sena dessas toxinas, contribuindo para melhorar a qualidade
e o nvel de segurana alimentar dos gros (CTNBio, 2009).
A sequncia da protena foi comparada com bancos de dados de
protenas com propriedades alergnicas, no tendo sido demonstrada
homologia biologicamente signicativa entre a protena Cry1Ab com-
pleta e sequncias de protenas com essas propriedades. Em virtude
das caractersticas de digestibilidade da protena Cry1Ab nos uidos
gstrico e intestinal, a probabilidade de que ela apresente ao aler-
gnica extremamente baixa (CTNBio, 2009).
503
Algodo Bt
No parecer conclusivo do CTNBio n 513-2005, referente ao Algodo
Bolgard, o relator pondera que:
A exposio de organismos vivos s protenas Cry produzi-
das pelo B. thuringiensis um evento que ocorre abundante-
mente na natureza e o modo de ao dessa protena j bem
conhecido. A Agncia de Proteo Ambiental dos Estados
Unidos (EPA), em 1998, concluiu a partir do grande volume
de dados de toxicologia submetidos que as subespcies de
B. thuringiensis no so txicas ou patognicas para mamfe-
ros, incluindo seres humanos. Recentemente, a Organizao
Mundial da Sade (OMS) revisou os extensos bancos de
dados de segurana e concluiu que o Bt no causa efeitos
adversos na sade humana quando presente na gua pot-
vel ou nos alimentos.
Baseado em avaliaes da equivalncia nutricional:
os estudos realizados no mostraram alteraes nos prin-
cipais componentes e nos antinutrientes naturais presentes
no algodo. A segurana dos produtos alimentares do algo-
do Bollgard evento 531 foi determinada pela equivaln-
cia na composio de macro e micronutrientes em estudos
de salubridade com animais e concluiu-se que este produto,
como componente de rao animal e as protenas Cry1Ac e
NPTII expressas nos tecidos da planta, mostrou-se seguro e
com valor nutritivo equivalente para o consumo humano e
animal. Aps o processamento das fibras e do caroo, as pro-
tenas expressas pela planta no so detectadas. Como o leo
e as fibras processadas so os nicos produtos do algodo usa-
dos na alimentao humana e como vesturio, respectiva-
mente, o consumo das protenas no esperado.
Diante do exposto, a Comisso Tcnica Nacional de
Biossegurana CTNBio aps a anlise de biosse-
gurana do algodo Bollgard evento 531, processo
01200.001471/2003-01, delibera favoravelmente sua libe-
rao para plantio comercial e consumo humano e animal.
504
Soja RR
No Comunicado 54 de 1998, o CTNBio declarou que:
a introduo do transgene no altera as caractersticas da
composio qumica da soja, com exceo da acumulao da
protena transgnica CP4 EPSPS. Esta concluso de equi-
valncia de composio qumica baseada em avaliaes
realizadas atravs de metodologia cientfica, publicadas em
revistas cientficas indexadas e de circulao internacional.
A segurana da protena CP4 EPSPS, quanto aos aspectos
de toxicidade e alergenicidade, tambm, foi comprovada.
importante registrar que, aps a utilizao da soja geneti-
camente modificada e de seus derivados na Amrica do Sul,
Central e do Norte, na Europa e na sia, no foi verificado
um s caso de desenvolvimento de reaes alrgicas em huma-
nos que no fossem previamente alrgicos soja convencional.
Adicionalmente, importante registrar que indivduos sens-
veis soja convencional continuaro sensveis soja transg-
nica e, portanto, no devero fazer uso deste produto.
A anlise dos resultados descritos na literatura no confirmou
um possvel aumento, na soja geneticamente modificada, da
concentrao de protenas que reagem com uma combina-
o de soros de pacientes alrgicos soja convencional. De
fato, os artigos cientficos disponveis e citados sobre a mat-
ria mostraram que a expresso do transgene no resultou
no aumento dos nveis de protenas reativas, especialmente
daquelas de peso molecular prximo a 30 kilodltons, a uma
combinao de soro de indivduos sensveis soja comer-
cial (BURKS and FUCHS, 1995, Journal of Allergy and
Clinical Immunology, 96: 1008-1010). Os autores do artigo
cientfico acima mencionado afirmaram que nossos estudos
demonstram que a introduo do gene codificador da prote-
na EPSPS, que confere tolerncia a Glifosate, no causou
modificao discernvel, qualitativa ou quantitativamente,
na composio de protenas alergnicas endgenas de soja
em qualquer dos cultivares resistentes a Glifosate analisados.
505
Consideraes finais
A engenharia gentica, o desenvolvimento de OGMs e o cultivo
comercial desses organismos geram preocupaes referentes bios-
segurana ambiental e alimentar. Essas preocupaes esto sendo
alvo de trabalhos cientcos que tm subsidiado a tomada de decises
sobre a liberao ou no do cultivo e utilizao comercial dos OGMs,
ponderando-se os riscos potenciais com os benefcios e efeitos posi-
tivos da tecnologia.
Pode-se dizer que existem diversos estudos que geraram dados
substanciais a respeito do impacto ambiental de OGMs. Embora exis-
tam alguns dados controversos, os resultados obtidos at o momento
no demonstram evidncia cientca de efeito no ambiente. Do ponto
de vista alimentar, o nvel de segurana de AGMs muito alto, uma
vez que esses alimentos so submetidos a uma bateria de testes rela-
cionados caracterizao da protena expressada, testes de digestibi-
lidade in vitro, avaliao de toxicidade aguda oral em camundongos,
avaliao de homologia estrutural da protena com toxinas proteicas
conhecidas, avaliao do potencial alergnico e equivalncia nutri-
cional. Com base nesses testes, pode-se dizer que o risco que um ali-
mento transgnico oferece pode ser considerado menor que o de outro
tipo de alimento liberado para consumo humano que no passou por
uma bateria de testes to rigorosa.
importante salientar que as anlises caso a caso dos OGMs quanto
biossegurana ambiental e alimentar devem continuar sendo fei-
tas com todo critrio tcnico e cientco. Nesse contexto, as aes de
pesquisa e desenvolvimento assumem importncia estratgica, uma
vez que essas aes tm assumido uma importncia cada vez maior
nas tomadas de deciso sobre todos os assuntos relativos a transgni-
cos, principalmente gerando informaes para subsidiar a liberao
comercial ou no dos OGMs.
506
Referncias
ABUD, S. ; SOUZA, P. I. M.; VIANNA, G. R.; LEONARDECZ, E.; MOREIRA,
C. T.; FALEIRO, F. G.; JNIOR, J. V.; MONTEIRO, P. M. F. O.; RECH, E. L.;
ARAGO, F. J. L. Gene ow transgenic to nontransgenic soybean plants in the
cerrado region of Brazil. Genetics and Molecular Research, v. 6, p. 445-452, 2007.
ABUD, S.; SOUZA, P. I. M.; MOREIRA, C. T.; ANDRADE, S. R. M.; ULBRICH,
A. V.; VIANNA, G. R.; RECH, E. L.; ARAGO, F. J. L. Disperso de plen
de soja transgnica na regio do Cerrado. Pesquisa Agropecuria Brasileira,
v. 10, p. 1299-1235, 2003.
ANDOW, D. A.; ZWAHLEN, C. Assessing environmental risks of transgenic
plants. Ecology Letters, v. 9, PP 196-214, 2006.
ANDRADE, S. R. M. de; FALEIRO, F. G. Biossegurana ambiental. In: FALEIRO,
F. G.;ANDRADE, S. R. M. (Org.). Biotecnologia, transgnicos e biossegurana. 1
ed. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2009b, v. 1, p. 61-76.
ANDRADE, S. R. M. Transformao de plantas. Planaltina-DF; Embrapa Cerrados,
2003. 27p. (Embrapa Cerrados. Documentos, 102).
ANDRADE, S. R. M.; FALEIRO, F. G. Biossegurana alimentar. In: FALEIRO, F.
G.; Andrade, S. R. M. (Org.). Biotecnologia, transgnicos e biossegurana. 1 ed.
Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2009c, v. 1, p. 77-88.
ANDRADE, S.R.M. de ; FALEIRO, F. G. . Breve histrico da biossegurana.
In: Faleiro, F.G.; Andrade, S.R.M.. (Org.). Biotecnologia, transgnicos e
Biossegurana.. 1 ed. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2009a, v. 1, p. 49-59.
Arpaia S.; Di Leo, G. M.; Fiore, M. C, Schmidt J.; Scardi, M. Composition of
arthropod species assemblages in Bt-expressing and near isogenic eggplants in
experimental elds. Environmental Entomology, v. 361, p. 213227, 2007.
AZEVEDO, J. L.; ARAJO, W. L. Genetically modied crops: environmental and
human concerns. Mutation Research, v. 544, p. 223-233, 2003.
BARROSO, P. A., FREIRE, E. C.; AMARAL, J. A. B., SILVA, M. T. Zonas de
excluso de algodoeiro transgnico para preservao de espcies de Gossypium
nativas ou naturalizadas. Campina Grande, MT: Embrapa Algodo, 2005. (Embrapa
Algodo. Comunicado Tcnico, 242). 7 p.
BERG, P. Asilomar and recombinat DNA. Disponvel em: <http://nobelprize.org/
nobel_prizes/chemistry/articles/berg/index.html,>. Acesso em: 10 Nov. 2006.
BERG, P.; BALTIMORE, D.; BRENNER, S.; ROBLIN III, R. O; SINGER, M. F.
Summary statement of the asilomar conference on recombinat DNA molecules.
Proceedings of the National Academic Science USA, v. 72, p. 1981-1984 , 1975.
507
BORM, A. Impactos da biotecnologia na biodiversidade. Biotecnologia Cincia &
Desenvolvimento, v. 34, p. 22-28. 2005.
BRAUN, R.; AMMAN, K. Biodiversity: the impact of biotechnology. Encyclopedia
of Life Support Systems, p. 1-17, 2002.
BROOKES, G.; BARFOOT, P. GM Crops: the global economic and environmental
impact: the rst nine years 1996-2004. AgBioForum, v. 8, p. 187-196. 2005.
CARPENTER, J.; GOODE, T.; HAMMIG, M.; ONSTAD, D. SANKULA, S.
Comparative environmental impacts of biotechnology derived and traditional
soybean, corns, and cotton crops. Indianapolis, USA: Council for Agriculture
Science and Technology, 2002. 42 p.
CERDEIRA, A. L.; DUKE, S. O. The current status and environmental impacts
of glyphosate-resistance crops: a review. Journal of Environmental Quality,
v. 35, p. 1633-1658. 2006.
CHAMPION, G. T.; MAY, M. J.; BENNET, S.; BROOKS, D. R.; CLARK, S. J.;
DANIEIS, R. E.; FIRBANK, L. G.; HAUGHTON, A. J.; HAWES, C.; HEARD, M.
S.; PERRY, J. N.; RANDLE, Z.; ROSSAL, M. J.; ROTHERY, P. SKELLERN, M. P.;
SCOTT, R. J. SQUIRE, G. R.; THOMAS, M. R. Crop management and agronomic
context of the Farm Scale Evaluations of genetically modied herbicice-tolerant
crops. Philosophical Transactions of the Royal Society of London, Series
B-Biological, v. 358, p. 1801-1818, 2003.
COHEN, S. N.; CHANG, A. C. Y.; HSU, L. Nonchromosomal antibiotic resistance
in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proceedings
of the National Academic Science USA, v. 69, p. 2110-2114 , 1972.
Comisso Tcnica de Biossegurana CTNbio Disponvel em: <http://www.
ctnbio.gov.br/>. Acesso em: jun. 2009.
CONSELHO DE INFORMAES SOBRE BIOTECNOLOGIA CIB Glossrio.
Disponvel em:< http://www.cib.org.br/glossario.php>. Acesso em: jun. 2009.
CRAIG, W.; TEPFER, M.; DEGRASI, G.; RIPANDELLI, D. An overview of
general features of risk assessments of genetically modied crops. Euphytica,
v. 164, p. 853880, 2008.
Dalton, R. Modied genes spread to local maize. Nature, v. 456, p. 149, 2008.
EMBRAPA Milho e Sorgo. Posio da Embrapa com relao ao cultivo dos milhos
transgnicos aprovados pela CTNBio no Brasil. Sete Lagoas, MG: Embrapa Milho e
Sorgo, 2008. (Embrapa Milho e Sorgo. Circular Tcnica, 102).
FALEIRO, F. G.; ANDRADE, S. R. M. Biotecnologia e transgnicos. In: FALEIRO,
F. G.; ANDRADE, S. R. M. (Org.). Biotecnologia, transgnicos e Biossegurana. 1
ed. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2009, v. 1, p. 15-29.
508
FALEIRO, F. G.; ANDRADE, Solange Rocha M. de (Org.). Biotecnologia,
transgnicos e biossegurana. 1. ed. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2009.
v. 1000, 183 p.
FAO/WHO. Biotechnology and food safety: report of a Joint. FAO/WHO
Consultation. Rome, 1996. 31 p. (FAO Food Nutrition Paper, 61). Disponvel em:
<ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/biotechnology.pdf>. Acesso em: 16 maio 2005.
FAO/WHO. Evaluation of Allergenicity of Genetically modied foods. FAO/WHO
Consultation Rome, 2001. 27 p. (Report of a joint FAO/WHO Expert Consultation
on Allergenicity of Foods Derived from Biotechnology). Disponvel em: <http://
www.fao.org/es/ESN/food/pdf/allergygm.pdf.> Acesso em: 16 maio 2005.
FAO/WHO. Safety aspects of genetically modied foods of plant origin. Geneva,
FAO/WHO Consultation, 2000. 36 p. (Report of a joint FAO/WHO Expert
Consultation on Foods Derived from Biotechnology). Disponvel em: <http://www.
fao.org/es/ESN/food/pdf/gmreport.pdf>. Acesso em: 12 dez. 2004.
FRIZZAS, M. R.; OLIVEIRA, C. M. Plantas transgnicas resistentes a insetos e
organismos no alvo: predadores, parasitides e polinizadores. Cincia e Sade,
v. 4, p. 63-82, 2006.
GMO-ERA PROJECT. Final report: phase II. Disponvel em: <www.gmoera.umn.
edu>. Acesso em: maio 2010.
Goggi, A. S.; Lopez-Sanchez, H.; Caragea, P.; Westgate, M.; Arritt, R.; Clark, C. A.
Statistical analysis of outcrossing between adjacent maize grain production elds.
Field Crop Research, v. 99, p. 147157, 2006.
Haslberger A. G. Need for an integrated safety assessment of GMOs, linking
food safety and environmental considerations. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, v. 54, n. 9, p. 3173-3180, 2006.
Hawes C.; Haughton A J.; Bohan D. A.; Squire G. R. Functional approaches for
assessing plant and invertebrate abundance patterns in arable systems. Basic and
Applied Ecology, v. 10, p. 34-42, 2009.
IFT. Expert report on biotechnology food: backgrounder, safety assessment
of biotech foods. Disponvel em: < http://www.ift.org/pdfs/expert/biotech/
iftbiotechsafety-b.pdf>. Acesso em: 10 maio 2005.
ILSI. Method development in the relationship to regulatory requirements for the
detection of GMOs in the food chain, Belgium. Brussels, 2001. Disponvel em:
<http://www.gmsciencedebate.org.uk/topics/forum/pdf/0080f.pdf> Acesso em: 10
maio 2005.
JACKSON, D. A.; SYMONS, R. H.; BERG, P. Biochemical method for inserting
new genetic information into DNA of simian virus 40: cirular SV40 DNA
molecules containing lambda phage genes and galactose operon of Escherichia coli.
Proceedings of the National Academy of Sciences USA, v. 69, p. 2904-2909, 1972.
509
JAMES, C. Executive summary of global status of commercialized biotech/GM
Crops: 2008. ISAAA Briefs, v. 39. Ithaca, USA, 2008. 20 p.
JESUS, K. R. E.; LANNA, A. C.; VIEIRA, F. D.; ABREU, A. L.; LIMA, D. U. A
proposed risk assessment method for genetically modied plants. Journal of
Applied Biosafety, v. 11, p. 127-137, 2006.
KEESE, P. Risks from GMOs due to horizontal gene transfer. Environmental
Biosafety Research, v. 7, p. 123-149, 2008.
KOVACH, J.; PETZOLDT, C.; DEGNI, J.; TETTE, J. A method to mesure the
environmental impact of pesticides: New Yorks food and life sciences Bulletin.
Geneva, NY. Disponvel em: <http://www.nysaes.cornell.edu/pubs/s/
OCRPDF/139.pdf>. Acesso em:17 nov. 2006.
LAJOLO, F. M.; NUTTI, M. R. Transgnicos: bases cientcas da sua segurana.
So Paulo: SBAN, 2003. 112 p.
LEMAUX, P. G. Genetically engineered plants and foods: a scientists analysis of
the Issues (part I). Annual Review of Plant Biology, v. 59, p. 771-812, 2008.
Luna, V. S.; FIGUEROA, J. M.; BALTAZAR, M. B.; GOMEZ L. R.; Gomez, R. T.;
SCHOPER, J. B. Maize pollen longevity and distance isolation requirement for
effective pollen control. Crop Science, v. 41, p.15511557, 2001.
MINAR, R. L. O Princpio da precauo. Biotecnologia Cincia &
Desenvolvimento, v. 34, p. 65-66, 2005.
MNSTER, P.; WIECZOREK, A. M. Potential gene ow fram agrcultural
crops to native plant relatives in Hawaian Islands. Agriculture, Ecosystems and
Environment, v. 119, p. 1 10, 2007.
Nielsen, K. M.; johbsen, p. j.; BENSASSON, D.; DAFFONCHIO, D. Release and
persistence of extracellular DNA in the environment. Environmental Biosafety
Research, v. 6, p. 37-53, 2007.
OECD. 1993. Safety evaluation of foods produced by modern biotechnology:
concepts and principles. Disponvel em: <http://www.oecd.org/
dataoecd/57/3/1946129.pdf>. Organization for Economic Cooperation and
Development, Paris, France. Acesso em 30 maio 2005.
SANVIDO, O.; STARK, M.; ROMEIS, J.; BIGLER, F. Ecological impacts of
genetically modified crops: experiences from ten years of experimental eld
research and commercial cultivation. Agroscope Reckenholz-Tnikon Research
Station ART, Zurich, p. 108, 2006. Disponvel em: <http://www.art.admin.ch/dms_
les/03017_de.pdf>. Acesso em: 30 maio 2005.
Silva, A. L. L.; Walter, J. M.; Horbach, M. A.; Quoirin, M. Conteno do uxo
gnico de plantas geneticamente modicadas. Caderno de Pesquisa Srie Biologia,
v. 19, n. 1, 2007, p. 19-26.
510
SILVA, A. L. L.; WALTER, J. M.; HORBACH, M. A.; QUOIRIN, M. Conteno do
uxo gnico de plantas geneticamente modicadas. Caderno de Pesquisa, srie
Biologia, v. 19, p. 18-26, 2007.
SQUIRE, G. R.; BROOKS, D. R.; BOHAR, D. A.; CHAMPION, G. T.; DANIEIS,
R. E.; HAUGHTON, A. J.; HAWES, C.; HEARDS, M. S.; HILL, M. O.; MAY, M.
J.; OSBORN, J. L.; PERRY, J. N.; ROY, D. B.; WOIWOD, I. P.; FIRBANK, L. G. On
rationale and interpretation of the farm scale evaluations of genetically modied
herbicide-tolerant crops. Philosophical Transactions of the Royal Society of
London, Series B-Biological, v. 358, p. 1779-1799, 2003.
UMBECK, P. F.; BARTON, K. A.; NORDHEIM, E. V.; McCARTY, J. C.; PARROT,
W. L.; JENKINS, J. N. Degree of pollen dispersal by insects from a eld test of
genetically engineered cotton. Journal of Economic Entomology, v. 84, n. 6,
p. 1943-1950, 1991.
UNEP United Nations Environments Programme. Highligts of some of the basic
requirements of the Cartagena Protocol on biosafety. 2003 Disponvel em: <www.
biodiv.org/doc/notications/2003/ntf-2003-127-cop-en.pdf>. Acesso em: 16 nov.
2004.
UNITED NATIONS. Rio declaration on Environment and Development.
UN.DocA/Conf. 151/26/Ver.1, United Nations, New York, 1992. Disponvel em;
<http://www.un.org/documents/ga/conf151/aconf15126-1annex1.htm.> Acesso
em: 12 fev. 2010.
WATANABE, E.; NUTTI, M. R. Alimentos geneticamente modicados: avaliao
de segurana e melhorias de qualidade em desenvolvimento. Revista Brasileira de
Milho e Sorgo, v. 1, n. 1, p. 1-14, 2002.
WHO, 2000. Safety aspects of genetically modified foods of plant origin.
Disponvel em: <http://www.fao.org/es/ESN/food/pdf/gmreport.pdf>. Acesso em:
30 jun. 2006.
WOSNIAK, C. A. Gene ow assessment for plant-incorporated protectants by
the biopesticide and pollution prevention, US EPA. Proceedings... Gene Flow
Workshop, p. 153-168, 2002.
ANDRADE, S. R. M. Biossegurana de alimentos transgnicos. Planaltina-DF;
ANDRADE, S. R. M. Biossegurana ambiental de OGMs. Planaltina-DF; Embrapa
Cerrados, 2006, 32 p. (Embrapa Cerrados. Documentos, 168).
FALEIRO, F. G.; ANDRADE, S. R. M. de (Org.). Biotecnologia, transgnicos e
biossegurana. 1. ed. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2009. v. 1000. 183 p.
513
Recursos genticos: conservao,
caracterizao e uso
Fbio Gelape Faleiro
Nilton Tadeu Vilela Junqueira
Introduo
Quando pensamos na biotecnologia aplicada, a capacidade de con-
servar, caracterizar e utilizar recursos genticos vegetais, animais e
microbianos para avanos tecnolgicos na agropecuria e na inds-
tria assume importncia estratgica. Nesse sentido, as atividades rela-
cionadas conservao, caracterizao e uso de recursos genticos
esto entre as mais relevantes da pesquisa agropecuria brasileira e
mundial.
A variabilidade gentica a essncia da vida, sendo o fator bsico
para a evoluo das espcies. A existncia da variabilidade gentica
permitiu a obteno, via melhoramento gentico, de variedades e
animais produtivos, resistentes a pragas e doenas e adaptados aos
mais diferentes ambientes. No caso dos vegetais, existem aproxima-
damente 250 mil espcies de plantas superiores identicadas e 40%
delas podem ter importncia para a agricultura, considerando as esp-
cies cultivadas e espcies relacionadas. Quando pensamos nos recur-
sos genticos animais e microbianos, a variabilidade gentica tambm
riqussima, assim como sua utilizao atual e potencial nos mais
variados campos da atividade humana.
Atualmente, existe uma grande preocupao com a signicativa
reduo da variabilidade gentica de plantas e animais, a qual repre-
senta um srio risco para a sustentabilidade da agropecuria. Essa
perda de variabilidade gentica, tambm chamada eroso gentica,
signica a perda de genes ou combinaes gnicas de plantas ou
animais que possuem valor atual ou potencial para a agropecuria.
Entre as causas da eroso gentica, pode-se citar a perda do habi-
tat dessas plantas e animais (desmatamento, deserticao, expan-
so urbana, modernizao da agropecuria), distrbios no habitat
514
(construo de rodovias e outras aes do homem), desastres naturais
(seca, enchente), substituio de variedades ou animais locais ou tra-
dicionais por novas variedades e animais melhorados, mudanas nas
prticas culturais, etc. Embora o fenmeno da eroso gentica possa
ser irreversvel, aes devem ser tomadas para prevenir ou minimi-
zar as suas causas. Uma das aes a conservao da variabilidade
gentica via formao de bancos de germoplasma (SILVA et al., 2007;
FALEIRO, 2010a; FALEIRO 2010b).
Paralelamente ao esforo de conservar os recursos genticos, ati-
vidades de caracterizao so fundamentais para que a variabilidade
gentica conservada seja utilizada e aproveitada de forma prtica nos
sistemas de produo vegetal e animal. Diferentes grupos de carac-
tersticas so utilizados na caracterizao de acessos conservados em
bancos de germoplasma, destacando-se as caractersticas ecolgicas,
morfolgicas, agronmicas e moleculares. Essa caracterizao vai
subsidiar a utilizao desses acessos, fornecendo genes de interesse
para programas de melhoramento gentico e ou subsidiando seu uso
per se como alternativas para diversicao dos sistemas de produo
agropecuria e industrial.
Neste captulo, as principais estratgias de conservao, caracteri-
zao e uso de recursos genticos so discutidas, bem como a situa-
o atual no Brasil e no mundo. Experincias da Embrapa Cerrados
com as espcies nativas do Cerrado e, mais especicamente, com o
maracujazeiro, so apresentadas como estudo de caso.
A preocupao mundial com a conservao
e uso de recursos genticos
A conservao de recursos genticos essencial para o futuro da
sociedade, sendo uma preocupao mundial. Esses recursos so a
base da cadeia alimentar do homem e dos animais domsticos, alm
de atender outras necessidades relacionadas bioenergia, vesturio,
medicamentos e habitao. Considerando as mais variadas atividades
agropecurias, existe uma interdependncia mundial dos recursos
genticos, de modo que a conservao desses recursos em condies
515
Captulo 17 Recursos genticos: conservao, caracterizao e uso
ideais, mantendo sua integridade fsica e gentica, uma obrigao
de todos os pases.
Nos ltimos 15 anos, o desenvolvimento de acordos, convenes
e tratados internacionais tem inuenciado de modo marcante a con-
servao e uso dos recursos genticos. Merecem destaque a elabora-
o de um marco legal internacional, com destaque para a Conveno
sobre Diversidade Biolgica (CDB), e o Tratado Internacional sobre
os Recursos Fitogenticos para Alimentao e Agricultura (TIRFAA).
Internamente, o Brasil editou importantes normas para regular o
tema, dentre elas a Medida Provisria 2186-16/01 e os Decretos
3.945/01 e 5.459/05.
A CDB um instrumento internacional que tem trs objetivos prin-
cipais: (i) a conservao da diversidade biolgica; (ii) o uso sustentvel
de seus componentes; e (iii) a repartio equitativa dos benefcios deri-
vados do uso dos recursos genticos. O TIRFAA reconhece os direi-
tos soberanos dos Estados sobre seus prprios recursos togenticos
para a alimentao e a agricultura, contudo estabelece um sistema
multilateral, almejando que seja eciente, ecaz e transparente tanto
para facilitar o acesso aos recursos togenticos para a alimentao e
a agricultura quanto para repartir, de forma justa e eqitativa, os bene-
fcios derivados da utilizao desses recursos, em base complementar
e de fortalecimento mtuo. O marco legal brasileiro envolveu a cria-
o de uma autoridade nacional, o Conselho de Gesto do Patrimnio
Gentico (CGEN), responsvel pelas autorizaes de acesso a recur-
sos genticos e ao conhecimento tradicional associado e pela coorde-
nao da implementao de polticas para a gesto destes recursos.
A partir da vigncia desses acordos, tratados e marcos legais, a pes-
quisa brasileira relacionada conservao, caracterizao e uso de
recursos genticos que utiliza biodiversidade nativa e ou conhecimen-
tos tradicionais associados est sendo induzida a profundas modi-
caes. Tanto as pesquisas que envolvem acesso a recursos genticos,
quanto aquelas que remetem material para o exterior com esta nali-
dade, necessitam de uma autorizao governamental, a ser concedida
por uma autoridade nacional. Tambm o acesso ao conhecimento tra-
dicional associado, bem como a sua disponibilizao, so regulados,
envolvendo a necessidade de anuncia prvia por parte dos detento-
516
res e autorizao governamental. Embora o princpio envolvido nos
acordos e tratados seja nobre, existe uma grande preocupao com a
excessiva burocratizao de todas atividades de acesso, conservao
e uso de recursos genticos, principalmente quando isso envolve as
estratgicas e essenciais atividades de pesquisa cientca e tecnol-
gica. Segundo Silva e Viccini (2009) preciso tomar cuidado para que
a produo cientca no seja desestimulada face s exigncias da lei.
Alm das legislaes muito restritivas ou burocrticas para o acesso
a recursos genticos, outras preocupaes cientcas mundiais esto
relacionadas manuteno e situao atual dos bancos de germo-
plasma como a existncia de colees inapropriadas (muito grandes e
pouco representativas da variabilidade gentica), problemas de dupli-
cao (estimada em 33%), baixa qualidade das sementes conservadas
(baixo vigor, baixa germinao e presena de pragas e doenas), baixo
estoque de sementes por acesso, existncia de processos inadequados
de regenerao e multiplicao, problemas de infraestrutura (equipa-
mentos falhos e ausncia de manuteno), falta de dados de caracte-
rizao, falta de base de dados e documentao dos acessos, recursos
nanceiros escassos, descontinuidade de polticas pblicas e institu-
cionais relacionadas a recursos genticos e falta de viso estratgica
da importncia dos recursos genticos para o futuro da agricultura e
da sociedade.
Estratgias para a conservao
de recursos genticos
Os recursos genticos so conservados nos chamados bancos de
germoplasma, os quais so unidades conservadoras de material gen-
tico de uso imediato ou com potencial de uso futuro. Nos bancos de
germoplasma, so conservadas as chamadas colees base e as cole-
es ativas. As primeiras so colees abrangentes de acessos con-
servadas a longo prazo. A coleo base ideal deve conter amostras
representativas dos estoques domesticados da cultura e suas formas
parentais silvestres. A coleo base vista como uma estratgia de
segurana, abrigando em seu acervo a coleo ativa duplicada, e com
seus materiais no sendo utilizados para intercmbio. As colees
517
base existentes so todas compostas de sementes ortodoxas, ou seja,
sementes que no perdem sua viabilidade quando conservadas em
baixa umidade (4% a 6%) e baixas temperaturas (-15 C a -18 C). As
colees ativas so aquelas conservadas no curto e mdio prazos, roti-
neiramente usadas para propsitos de pesquisa, caracterizao, avalia-
o e utilizao de materiais. A coleo ativa multiplicada de acordo
com a demanda e regenerada periodicamente. Normalmente possui
menor tamanho que a coleo base. A coleo ativa, geralmente, fun-
ciona em dois ciclos: plantas vivas crescendo no campo e sementes
armazenadas para regenerao ou multiplicao de materiais. A cole-
o ativa normalmente corresponde a um subconjunto da coleo base
localizado prximo ao pesquisador.
Existem, basicamente, trs estratgias de conservao de germo-
plasma: in situ, ex situ e on farm. Na conservao in situ, as plantas e
animais so conservados em suas comunidades naturais. Para reali-
zar esse tipo de conservao, existem as chamadas unidades opera-
cionais, destacando-se parques nacionais, reservas biolgicas, reser-
vas genticas, estaes ecolgicas, santurios de vida silvestre etc. Na
conservao ex situ, a variao gentica das espcies conservada fora
de suas comunidades naturais. Desdobra-se em vrias modalidades,
entre as quais conservao in vitro, em colees a campo, em cmaras
frias, em nitrognio lquido etc. J a conservao on farm uma estra-
tgia complementar conservao in situ, sendo uma das formas para
a conservao da agrobiodiversidade. Apresenta como particularidade
o fato de envolver recursos genticos cultivados pelas comunidades
locais e populaes indgenas, detentoras de grande diversidade de
recursos genticos e de um amplo conhecimento sobre eles. A con-
servao on farm envolve, portanto, recursos nativos e exticos adap-
tados s condies locais, que esto em contnuo processo de seleo
e de melhoramento pelas comunidades locais e populaes indgenas.
Conservao in situ
Com aproximadamente 50 mil espcies de plantas superiores (18%
do total mundial), o Brasil possui uma das mais diversas oras do
mundo (NASS et al., 2009). Na tentativa de conservar parte dessas
espcies em seu habitat, tm sido criadas e estabelecidas reas de pro-
518
teo, chamadas Unidades de Conservao (UC). A UC o nome dado
pela legislao brasileira s reas protegidas, fazendo parte do sistema
brasileiro de proteo ao meio ambiente, e so controladas pelo rgo
federal Instituto Chico Mendes de Conservao da Biodiversidade
(ICMBio), compondo o Sistema Nacional de Unidades de Conservao
da Natureza (SNUC). As unidades de conservao integrantes divi-
dem-se em dois grupos: (i) Unidades de Proteo Integral (UPI), cujo
objetivo preservar a natureza, onde a interferncia humana limi-
tada, sendo admitido apenas o uso indireto dos seus recursos natu-
rais, com exceo dos casos previstos na Lei. (ii) Unidades de Uso
Sustentvel (UUS), cujo objetivo bsico compatibilizar a conserva-
o da natureza com o uso sustentvel de parcela dos seus recursos
naturais, de modo que diferentes graus de interferncia humana so
permitidos (FREITAS et al., 2009).
O grupo das Unidades de Proteo Integral composto pelas
seguintes categorias de unidades de conservao: (i) Estao Ecolgica;
(ii) Reserva Biolgica; (iii) Parque Nacional; (iv) Monumento Natural;
(v) Refgio da Vida Silvestre. Por sua vez, o grupo das Unidades de Uso
Sustentvel composto por: (i) rea de Proteo Ambiental; (ii) rea
de Relevante Interesse Ecolgico; (iii) Floresta Nacional; (iv) Reserva
Extrativista; (v) Reserva de Fauna; (vi) Reserva de Desenvolvimento
Sustentvel; e (vii) Reserva Particular do Patrimnio Natural.
O Brasil possui um total de 1.343 reas protegidas ou Unidades
de Conservao, das quais, 292 so federais, 308 so estaduais e
743 so particulares. As reas particulares so designadas Reservas
Particulares do Patrimnio Natural (RPPN), sendo sua criao um
ato voluntrio do proprietrio de uma rea, que decide transformar
toda ou parte desta em uma RPPN, sem que isso ocasione a perda do
direito de propriedade. Esse tipo de reserva tem o objetivo de promo-
ver a educao ambiental. Em termos de rea, as unidades federais
cobrem, aproximadamente, 8,2% do territrio nacional (3,9% com
UPI e 4,3% com UUS); as unidades estaduais cobrem 3,5% (1,0%
com UPI e 2,5% com UUS) e as unidades particulares (RPPN) 0,06%.
Dessa forma, aproximadamente, 11,7% do territrio brasileiro ou
100 milhes de hectares so dedicados a Unidades de Conservao
(FREITAS et al., 2009). O Bioma Amaznia o que apresenta maior
519
porcentagem de reas protegidas (~ 10%), seguida da Mata Atlntica
(~2%), e os demais biomas apresentam menos de 1% de reas prote-
gidas (Figura 1).
Figura 1. Porcentagem do territrio dos biomas brasileiros sob proteo em
Unidades de Conservao .
Quando pensamos em reas para conservao da biodiversi-
dade, devemos considerar, tambm, as reas de povos indgenas.
Atualmente existem 611 reservas de povos indgenas, cobrindo uma
rea total de, aproximadamente, 106 milhes de hectares o que cor-
responde a 12,4% do territrio nacional. Segundo Freitas et al. (2009),
as reas de povos indgenas apresentam grande importncia para a
conservao in situ, porque, nestas terras, a populao indgena pre-
serva suas tradies, incluindo o cultivo de vrios recursos genticos
vegetais e, alm disso, essas terras servem como unidades de manejo
in situ, onde recursos naturais tendem a ser manejados de forma mais
sustentvel.
A conservao in situ apresenta algumas vantagens, tais como:
(i) permitir que as espcies continuem seus processos evolutivos;
520
(ii) favorecer a proteo e a manuteno da vida silvestre; (iii) apre-
sentar melhores condies para a conservao de espcies silvestres,
especialmente vegetais e animais; (iv) oferecer maior segurana na
conservao de espcies com sementes recalcitrantes; e (v) conser-
var os polinizadores e dispersores de sementes das espcies vegetais.
Deve-se considerar, entretanto, que esse mtodo oneroso, pois, por
ser dependente de eciente e constante manejo e monitoramento,
pode exigir grandes reas, o que nem sempre possvel; alm disso,
a conservao de uma espcie em um ou poucos locais de ocorrncia
no signica, necessariamente, a conservao de toda a sua variabili-
dade gentica (BRASIL, 2010).
Conservao ex situ
A conservao ex situ envolve a manuteno, fora do habitat, de
uma representatividade da biodiversidade, de importncia cientca
ou econmico-social, inclusive para o desenvolvimento de programas
de pesquisa e desenvolvimento, particularmente aqueles relaciona-
dos ao melhoramento gentico. A conservao ex situ considerada
complementar conservao in situ, servindo tanto para conserva-
o de espcies silvestres como para espcies cultivadas. Os princi-
pais objetivos da conservao ex situ so: (i) permitir que, em apenas
um local, sejam reunidos recursos genticos de muitas procedncias,
facilitando as aes de pesquisa e desenvolvimento, especialmente o
trabalho do melhoramento gentico; (ii) assegurar a conservao e a
disponibilidade contnua e imediata de recursos genticos; (iii) pre-
servar espcies que ocorrem em habitat ameaado; (iv) diminuir a
eroso gentica das espcies; (v) garantir melhor proteo diversi-
dade intraespecca, especialmente de espcies de ampla distribuio
geogrca; (vi) conservar, no curto, mdio e longo prazos, recursos
gentico com importncia atual ou potencial, garantindo a sustenta-
bilidade dos trabalhos de melhoramento gentico e, em consequn-
cia, o futuro da sociedade.
Existem diferentes estratgias ou metodologias utilizadas para a
conservao ex situ, podendo-se citar: (i) conservao de sementes,
no longo prazo, em cmaras frias a -20 C; (ii) conservao de semen-
tes, no curto e mdio prazos, em cmaras frias a 5 C; (iii) conser-
521
vao in vitro, via cultura de tecidos; (iv) criopreservao (-150 C a
-196 C); (v) conservao a campo; (vi) conservao em laboratrios,
principalmente no caso de microorganismos; (vii) jardins botnicos;
(viii) ncleos de conservao, para o caso de espcies animais. Na
Figura 2, ilustram-se esses principais mtodos de conservao.
Figura 2. Principais mtodos de conservao ex situ: (A) cmaras frias; (B)
conservao in vitro; (C) criopreservao; (D) conservao a campo; (E) con-
servao em laboratrios; e (F) jardins botnicos.
Por um lado a conservao ex situ apresenta algumas vantagens:
(i) mantm os recursos genticos em um espao pequeno sob cuidado
intensivo; (ii) facilita a caracterizao e utilizao dos recursos gen-
ticos em aes de pesquisa e desenvolvimento; (iii) garante a sobre-
vivncia e a segurana dos recursos genticos por longos perodos;
(iv) garante a sobrevivncia e a segurana dos recursos genticos em
ambientes mais protegidos no sujeitos a ao antrpica e condies
adversas do meio ambiente; (v) disponibiliza a diversidade mxima
do germoplasma de espcies de importncia atual e potencial; (vi) em
alguns mtodos de conservao, mantm material indexado e livre de
patgenos, dispensando a quarentena na sua entrada ou sada do pas
ou da regio (ROSA, 2004; NASS et al.; 2001).
Por outro lado , dependendo da estratgia ou metodologia, a con-
servao ex situ apresenta algumas desvantagens: (i) interrupo da
evoluo quando usadas tcnicas que reduzem drasticamente as ativi-
dades vitais do germoplasma por longos perodos; (ii) risco de instabi-
lidade gentica nas colees de sementes ortodoxas e in vitro; (iii) alto
custo de algumas tcnicas, como a regenerao no campo de colees
de sementes ortodoxas ou aquelas que requerem mo-de-obra espe-
cializada; (iv) alto consumo de eletricidade e equipamentos sostica-
dos ou o uso de grandes reas de campo de boa fertilidade por lon-
gos perodos; (v) risco de perda de variabilidade gentica dos acessos
522
conservados em virtude da deriva gentica (perda aleatria de genes
devido amostragem ou multiplicao de amostras muito peque-
nas) ou presso de seleo (material geralmente multiplicado em
reas com condies edafoclimticas distintas do seu local de coleta)
(ROSA, 2004; NASS et al., 2001).
Praticamente, todas as espcies podem ser conservadas ex situ,
desde que seja possvel multiplic-las, posteriormente. Geralmente,
so conservadas ex situ: espcies de plantas cultivadas e seus paren-
tes silvestres; espcies que representam amplo e variado espectro de
genes que podem ser teis em programas de melhoramento ou outras
atividades tecnolgicas importantes para o homem, como as espcies
teis na alimentao e agricultura, incluindo variedades locais de cul-
tura tradicional e variedades, cultivares, linhagens e materiais sint-
ticos obtidos por programas de melhoramento gentico ou pela bio-
tecnologia e engenharia gentica.
Entre os mtodos de conservao ex situ, o armazenamento de
sementes em cmaras frias merece um destaque especial, conside-
rando a possibilidade de conservao de grande nmero de acessos
em um pequeno espao por um perodo de tempo praticamente ili-
mitado. Para a conservao de sementes em longo prazo, necess-
rio manter a atividade respiratria em nveis baixos, atravs da redu-
o da temperatura ambiente e do grau de umidade das sementes.
As sementes so acondicionadas em embalagens hermticas e arma-
zenadas em cmaras frias a -20C (conservao a longo prazo) ou a
+5 C (conservao no curto e mdio prazos). Somente as sementes
ortodoxas (por suportarem reduo da umidade a 4% e 6% e exposi-
o prolongada a temperatura subzero, -10 C a -20 C) podem ser con-
servadas no longo prazo. No caso de espcies que possuem sementes
recalcitrantes ou intermedirias, outras estratgias, como a conser-
vao a campo, devem ser utilizadas. Alm do caso das espcies com
sementes recalcitrantes e intermedirias, a conservao em campo
tambm indicada para a conservao de espcies de propagao vege-
tativa, arbreas, silvestres, semidomesticadas, heterozigotas, alm
daquelas que produzem quantidades reduzidas de sementes como
as forrageiras (ROSA, 2004).
523
Segundo Silva et al. (2007), medidas efetivas visando conserva-
o ex situ de recursos genticos iniciaram h aproximadamente 40
anos, quando a Organizao das Naes Unidas para a Agricultura e
Alimentao (FAO) reconheceu que a variabilidade de muitas esp-
cies, especialmente cereais, estavam sob risco de perda. Estimativas
da FAO indicam que aproximadamente 6 milhes de acessos de
germoplasma so conservados em todo mundo e apenas 14% des-
ses acessos so conservados no longo prazo. Os Estados Unidos e
a China so os pases que detm o maior nmero de acessos con-
servados no longo prazo, com aproximadamente 450 mil e 300 mil,
respectivamente (WETZEL, 2006). Esses pases tambm apresen-
tam a maior capacidade para armazenamento de sementes no longo
prazo, sendo 2 milhes e 1 milho, respectivamente (SILVA et al.,
2007). Recentemente, essa capacidade mundial de armazenamento de
sementes no longo prazo aumentou consideravelmente com a cons-
truo do Banco Global de Sementes de Svalbard com capacidade para
quatro milhes e quinhentas mil amostras de sementes. O conjunto
arquitetnico conta com trs cmaras de segurana mxima situadas
ao nal de um tnel de 125 metros dentro de uma montanha em uma
pequena ilha norueguesa do arquiplago de Svalbard, prximo ao Plo
Norte (Figura 3). Essa localizao estratgica assegura as baixas tem-
peraturas, mesmo se houver falha no suprimento de energia eltrica.
Figura 3. Banco Global de Sementes de Svalbard.
Fotos: Global Crop Diversity Trust.
No Brasil, a criao da Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
e a consolidao do Sistema Nacional de Pesquisa Agropecuria
(SNPA) nos anos 1970 (CABRAL, 2005) foi importante para organi-
524
zar os esforos voltados para a conservao, caracterizao e uso de
recursos genticos (GOEDERT, 2007). O SNPA formado em parte
pela Embrapa, com suas mais de 40 unidades de pesquisa, alm de
instituies federais e estaduais de pesquisa agrcola, universidades
e empresas pblicas ou privadas, direta ou indiretamente vinculadas
pesquisa agrcola. A maioria das iniciativas para a conservao de
recursos genticos vegetais, animais e de microorganismos no Brasil
foram integradas recentemente Plataforma Nacional de Recursos
Genticos, liderada pela Embrapa com a participao da grande maio-
ria das outras instituies do SNPA localizadas em vrios estados
brasileiros (Figura 4). Com a participao de todas essas instituies,
383 Bancos Ativos de Germoplasma Vegetal so mantidos no Brasil,
sendo 140 nas unidades da Embrapa e 243 em outras instituies do
SNPA (VALLS et al., 2009). De todos os bancos, 52% conservam ape-
nas espcies exticas, mostrando a importncia dessas espcies para
a alimentao e agricultura no Brasil. Valls et al. (2009) realizaram
um levantamento de todas as espcies e seus respectivos nmeros
de acessos conservados no Brasil no longo prazo (coleo base) e no
mdio e curto prazos (bancos ativos). Com base nesse levantamento,
aproximadamente 170 mil acessos vegetais, incluindo duplicatas, so
conservados no Brasil, dos quais 107 mil so conservados no longo
prazo (VALLS et al., 2009).
A Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia possui a infraes-
trutura responsvel pela conservao no longo prazo de sementes
de espcies de interesse agronmico, incluindo espcies cultivadas
e seus parentes silvestres. Essa coleo de base composta atual-
mente por 212 gneros de 661 espcies diferentes, com um total de
107.249 acessos, sendo, dessa forma, o 6 maior banco de germo-
plasma conservado em longo prazo do mundo. As culturas com maior
nmero de acessos conservados em longo prazo so a cevada (29.227),
feijo (14.069), arroz (9.989) e soja (9.177). Todo o acervo das cole-
es ex-situ gerenciado pelo Sistema Brasileiro de Informao de
Recursos Genticos (Sibrargen), que integra, compatibiliza, organiza
e disponibiliza dados e conhecimentos sobre recursos genticos estra-
tgicos para o sistema de inovao agropecuria no pas (CAJUEIRO
et al., 2000).
525
animal
vegetal
microrganismo
Porto Velho
Manaus
Rio Preto da Eva
Boa Vista
Macap
Soure
Belm
Sobral
Teresina
So Joo do Piau
Petrolina
Pacajus
Pedro Avelino
Joo Pessoa
Aracaju
Cruz das Almas
Conceio do Almeida
Braslia
Goinia
Sete Lagoas
Juiz de Fora
Niteri
Itaguai
Vitria
Campo Grande
Corumb
Campina Grande
Campinas
Londrina
Curitiba
Florianpolis
Porto Alegre
Pelotas
Bag
Passo Fundo
Bento Gonalves
Figura 4. Plataforma Nacional de Recursos Genticos no Brasil.
Fonte: Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia.
Conservao on farm
A conservao on farm uma estratgia semelhante conservao
in situ, uma vez que tambm permite que as espcies continuem o
seu processo evolutivo, sendo permanentemente submetidas a dife-
rentes condies edafoclimticas. A conservao on farm uma das
formas para a conservao da agrobiodiversidade, que um termo
usado para referir diversidade de seres vivos, de ambiente terres-
tres ou aquticos, cultivados em diferentes estgios de domesticao.
Apresenta como particularidade o fato de envolver recursos genti-
cos, principalmente variedades crioulas, cultivados por agricultores
(pequenos agricultores de comunidades locais, tradicionais e popu-
laes indgenas) detentores de grande diversidade de recursos gen-
ticos e de um amplo conhecimento sobre eles.
526
A conservao on farm envolve, portanto, recursos nativos e exti-
cos adaptados s condies locais, que esto em contnuo processo
de seleo e de melhoramento gentico realizado pelos agricultores.
Esses recursos genticos so de grande importncia para a segurana
alimentar desses agricultores. Entre os principais recursos genti-
cos mantidos a campo pelos pequenos agricultores brasileiros esto
a mandioca, o milho, o feijo, alm de uma srie de fruteiras nativas,
plantas medicinais e aromticas e raas locais de animais domestica-
dos (sunos, caprinos e aves, entre outros). Na conservao on farm, a
estratgia consiste em monitorar e proteger diferentes acessos e dife-
rentes espcies cultivadas em um agroecossistema (FALEIRO, 2010b),
podendo ser agrcola, hortcula, orestal, pastoril ou associaes entre
eles, como no sistema agrosilvopastoril. Acredita-se que, ainda hoje, a
maioria dos recursos genticos nativos do Brasil conservada on farm,
ou seja, esto nas propriedades dos agricultores e no nos bancos de
germoplasma (CLEMENT et al., 2007).
Assim como a conservao in situ e ex situ, a conservao on farm
tambm apresenta vantagens e desvantagens (BRUSH, 2000; JARVIS
et al., 2000; CLEMENT et al., 2007). A principal vantagem est rela-
cionada ao envolvimento dos agricultores no processo de conservao
de recursos genticos. Esse envolvimento vai gerar um comprome-
timento e interesse dos agricultores, incluindo os jovens que, desde
cedo, passaro a se sentir responsveis pela conservao (CARVALHO
et al., 2001). Esse envolvimento e ao dos agricultores faro com que
a coleo on farm seja constantemente enriquecida com novos recur-
sos genticos via a evoluo em seu meio natural e a domesticao em
seu meio social (CLEMENT et al., 2007). Outra vantagem dessa estra-
tgia de conservao permitir que os recursos genticos conservados
na propriedade rural constituam uma fonte de renda e melhore a qua-
lidade de vida do agricultor com a diversicao da produo e de sua
base alimentar. Esses recursos genticos estaro, assim, sendo con-
servados com maior interesse e segurana ao longo do tempo, dimi-
nuindo a dependncia de recursos nanceiros limitados e inseguros
que, h muito tempo, esto ameaando todas iniciativas e esforos
relacionados conservao ex situ. Como principal desvantagem da
conservao on farm, podemos citar a sua natureza complexa e din-
527
mica, o que faz com que sejam altos os riscos de eroso gentica e
perda de acessos (LOUETTE, 2001). A falta de controle sobre os recur-
sos genticos relacionada ao dos agricultores e condies adversas
do meio ambiente tambm um alto risco manuteno da variabili-
dade gentica das colees. Essas desvantagens fazem com que a con-
servao on farm seja uma estratgia para complementar e no subs-
tituir a conservao in situ e ex situ.
Algumas aes de instituies governamentais e sociais podem ser
implementadas para promover a conservao on farm. Freitas et al.
(2009) relatam algumas dessas aes implementadas no Brasil nos
ltimos anos: (i) melhoramento participativo uma metodologia
que preconiza a participao efetiva dos agricultores, extensionistas
e pesquisadores na seleo de variedades melhoradas para determi-
nada regio (VIEIRA et al., 2008); nesse mtodo, vrios acessos desen-
volvidos pela pesquisa e cultivados localmente pelos agricultores so
testados e conservados na propriedade; (ii) feira de sementes so
eventos onde pequenos agricultores de comunidades locais, tradi-
cionais e populaes indgenas apresentam experincias com dife-
rentes recursos genticos e trocam sementes e material propagativo;
(iii) Centros Irradiadores de Manejo da Agrobiodiversidade so ins-
tituies implantadas em vrios estados do Brasil por iniciativa do
governo federal, em parceria com movimentos sociais e organizaes
no-governamentais. Esses centros possuem como linhas temticas
a produo de sementes crioulas pelas prprias comunidades, o uso
de plantas medicinais e aromticas, a implantao de sistemas agro-
orestais e agroextrativistas e o manejo animal alternativo, visando
proporcionar a segurana alimentar, a gerao de renda e a conserva-
o da agrobiodiversidade; (iv) reconhecimento ocial de populaes
tradicionais esse reconhecimento ocial tem como objetivo pro-
mover o desenvolvimento sustentvel dos povos e comunidades tra-
dicionais com nfase no reconhecimento, fortalecimento e garantia
dos seus direitos territoriais, sociais, ambientais, econmicos e cul-
turais. Entre outras expectativas, espera-se, com tal reconhecimento,
aumentar a demanda pela conservao de recursos genticos de cul-
tivo local com vistas produo sustentvel.
528
Caracterizao de recursos genticos
Para que a variabilidade gentica de recursos genticos de esp-
cies cultivadas e silvestres conservada nos bancos de germoplasma
seja utilizada e aproveitada de forma prtica, atividades de caracte-
rizao e avaliao so essenciais, sendo uma importante demanda
para a pesquisa cientca. A falta de dados de caracterizao e avalia-
o dos recursos genticos conservados em bancos de germoplasma
uma das principais causas do baixo uso desses materiais genticos
(SLOTEN, 1987; VALLS, 2007). Estimativas de Holden (1984) mos-
traram que 65% dos acessos no apresentavam dados de passaporte,
80% no apresentavam caracterizao morfolgica e 95% no apre-
sentavam avaliao agronmica. Segundo Valls (2007), a falta de dados
pode ser contornada pela organizao da informao j disponvel,
pela tomada disciplinada de observaes de maior interesse dos usu-
rios e pela divulgao adequada dessa informao.
Diferentes grupos de caractersticas so utilizados na caracteriza-
o e avaliao de recursos genticos, destacando-se as caractersticas
ecolgicas, morfolgicas, agronmicas e moleculares.
As caractersticas ecolgicas referem-se quelas obtidas com base
no local de coleta de determinado acesso. Dados de passaporte podem
conter importantes caractersticas ecolgicas de cada material gen-
tico. O conhecimento das condies ecogeogrcas dos locais de
coleta do germoplasma fornece um indicativo do processo de adapta-
o a que o acesso foi submetido, e do seu possvel comportamento
agronmico e biolgico (HAWTIN et al. 1996). A idia de se utilizar
esse tipo de informao relativamente nova e os descritores obti-
dos por essa via tem sido denominados, genericamente, de descrito-
res ecolgicos (STEINER; GREENE, 1996). Com base no Sistema de
Informao Geogrca, quando as coordenadas do local de coleta so
disponveis, possvel inferir sobre as informaes ecogeogrcas dos
acessos, pela possibilidade de associar os locais de coleta com dados de
clima, vegetao, solo, pluviometria local, entre outros dados geogr-
cos disponveis em forma de mapas que podem ser sobrepostos aos
locais de coleta (COSTA et al., 2005). Na Figura 5, ilustra-se o procedi-
mento de obteno de descritores ecolgicos com base na sobreposi-
o de mapas de informaes geogrcas ao ponto de coleta do acesso.
529
Figura 5. Exemplos de mapas do Sistema de Informao Geogrca do Brasil
utilizados para obteno de descritores ecolgicos baseados no ponto de
coleta: (A) tipos de vegetao; (B) solos; (C) bacias hidrogrcas; e (D) plu-
viometria.
As caractersticas morfolgicas so aquelas relacionadas aos carac-
teres botnicos de alta herdabilidade, facilmente visveis ou mensu-
rveis e que se expressam consistentemente em todos os ambien-
tes (WILLIAMS, 1984). Existe uma grande variabilidade morfolgica
entre as espcies e entre acessos da mesma espcie, considerando
o porte da planta e as caractersticas das razes, folhas, ores e fru-
tos. Muitas vezes, caractersticas morfolgicas podem subsidiar o uso
prtico de determinado acesso ou espcie. Por exemplo, a beleza e a
natureza extica de uma or pode dar uma boa ideia do seu poten-
cial ornamental, a colorao mais intensa da polpa do fruto pode dar
530
uma ideia do potencial funcional daquele material gentico e a forma
e tamanho do fruto pode dar uma ideia do seu potencial agronmico
para consumo in natura. Na Figura 6, ilustra-se uma pequena parte
da variabilidade gentica do gnero Passiflora, com base na morfolo-
gia das ores e dos frutos.
Figura 6. Exemplos de caractersticas morfolgicas de ores e frutos do
gnero Passiflora.
As caractersticas agronmicas compreendem aquelas que forne-
cem informaes sobre o desempenho agronmico de uma espcie
ou de um acesso. Por exemplo, um acesso pode possuir maior desem-
penho agronmico que outro porque mais resistente a vrias doen-
as ou a vrias raas do patgeno causador daquela doena. Alm da
resistncia a doenas, outras caractersticas agronmicas apresentam
grande importncia como as relacionadas ao vigor vegetativo, produti-
vidade, pocas de orescimento e sensibilidade ao fotoperodo, adap-
tabilidade a diferentes ecossistemas, tamanho do fruto, rendimento
e caractersticas qumicas da polpa, resistncia e tolerncia a inse-
tos-praga, entre outras. Geralmente, as caractersticas agronmicas
so quantitativas, governadas por um conjunto de genes e fortemente
531
inuenciadas pelas condies ambientais. Nesse sentido, a monta-
gem de experimentos com repeties, em diferentes ambientes, uti-
lizando delineamentos para o controle ambiental, de grande impor-
tncia no processo de caracterizao e avaliao do recurso gentico.
Muitas vezes, a importncia prtica dos recursos genticos depende
de uma adequada caracterizao e avaliao das caractersticas agro-
nmicas. Na Figura 7, ilustram-se algumas caractersticas agronmi-
cas de acessos de maracujazeiro.
Figura 7. Avaliao de caractersticas agronmicas do maracujazeiro.
As caractersticas moleculares pertencem a um grupo de carac-
tersticas que teve um grande desenvolvimento nos ltimos anos.
Tecnologias modernas de anlise molecular permitem a gerao de
marcadores gentico-moleculares diretamente no DNA. Entre as van-
tagens dos marcadores moleculares, pode-se citar a obteno de um
nmero praticamente ilimitado de polimorsmos genticos, a iden-
ticao direta do gentipo sem inuncia do ambiente, a possibili-
dade de deteco em qualquer estdio do desenvolvimento da planta
ou a partir de cultura de clulas ou tecidos e a possibilidade de gerar
532
maior quantidade de informao gentica por loco no caso de marca-
dores co-dominantes. Com base nas caractersticas moleculares gera-
das pelos polimorsmos do DNA dos diferentes acessos ou espcies
do banco de germoplasma, vrias informaes podem ser obtidas
(FALEIRO, 2007). Na Figura 8, ilustram-se alguns marcadores molecu-
lares e informaes geradas com base em caractersticas moleculares.
Figura 8. Obteno de polimorsmos e informaes baseadas em marcado-
res moleculares do DNA.
Alm dos marcadores moleculares do DNA, tambm podem ser
includas no grupo das caractersticas moleculares, aquelas obtidas
com base na caracterizao citogentica como as anlises de cari-
tipo, bandeamento cromossmico e hibridizao in situ (PEALOZA;
POZZOBON, 2007) e aquelas obtidas com base na caracterizao qu-
mica e bioqumica como compostos fenlicos, terpenoides, alcaloi-
des, entre outros metablitos secundrios e substncias bioativas com
potencial econmico (VIEIRA; AGOSTINI-COSTA, 2007).
533
Os diferentes grupos e as diferentes caractersticas so utiliza-
dos nas diferentes etapas do processo de caracterizao e avaliao.
Segundo Valls (2007), esse processo passa por cinco etapas subse-
quentes, correlatas e complementares:
a) Identicao botnica: dependendo da espcie, essa etapa
mais difcil do que geralmente considerada, uma vez que
a taxonomia das plantas , muitas vezes, confusa e exige alta
especializao, principalmente quando o germoplasma inclui
vrias espcies silvestres com diferentes taxa e variedades bot-
nicas (VALLS, 2007).
b) Elaborao do cadastro de acessos disponveis: nessa etapa,
so obtidos os chamados descritores de passaporte para cada
acesso, os quais so baseados nas informaes de origem
(nome, procedncia, cdigos etc.) e local de coleta (coletor,
coordenadas geogrcas, caractersticas ecolgicas etc.).
c) Caracterizao: consiste na obteno das caractersticas mor-
folgicas ou da lista de descritores. Existe, na literatura mun-
dial, um grande nmero de listas e de descritores para as mais
diferentes espcies. A ecincia dessas listas na diferencia-
o dos acessos e sua importncia na atribuio de valor pr-
tico ao germoplasma tm sido discutida (ONYILAGHA, 1986;
FRANKEL; BROWN, 1984; VALLS, 2007).
d) Avaliao preliminar: nessa etapa, inicia-se a obteno de carac-
tersticas agronmicas, principalmente aquelas que podem ser
obtidas para maior nmero de acessos em determinada condi-
o ambiental. A caracterizao reprodutiva da espcie (ocor-
rncia de autogamia, alogamia, cleistogamia, apomixia etc.)
um exemplo. A caracterizao da fenologia ou das fenofases
da espcie (perodo de germinao, brotao, orescimento,
desfolhao, maturao etc.) tambm pode ser iniciada nessa
etapa e nalizada na etapa seguinte.
e) Avaliao aprofundada ou complementar: nessa etapa, so obti-
das as demais caractersticas agronmicas ou no, relacionadas
a caractersticas adaptativas e de desempenho agronmico alta-
mente inuenciadas pelo ambiente. Nesse caso, so necess-
rios experimentos de avaliao com delineamentos estatsticos,
534
repeties, em vrios ambientes e em vrios anos, de modo que
o nmero de acessos a serem avaliados reduzido. As infor-
maes obtidas nessa ltima etapa so mais caras e difceis de
serem obtidas, entretanto so aquelas que mais facilitam ou
do subsdios para a utilizao prtica dos recursos genticos.
Uso dos recursos genticos
Segundo Guimares (2006), a Organizao das Naes Unidas para
a Alimentao e a Agricultura (FAO) est realizando um levantamento
mundial das capacidades dos pases em utilizar recursos togenti-
cos para a agricultura e alimentao. O resultado desse levantamento
no Brasil relatado por Albuquerque e Nass (2009). Segundo esses
autores, o uso de acessos disponveis em bancos de germoplasma
limitado em todo mundo, incluindo o Brasil, especialmente consi-
derando a ampla diversidade disponvel. As principais causas dessa
baixa utilizao so a falta de adequada documentao e descrio das
colees, a falta de informao til aos programas de melhoramento
gentico, falta de atividades de avaliao preliminar e aprofundada dos
acessos, limitada adaptao dos acessos, nmero limitado de melho-
ristas principalmente em pases em desenvolvimento, baixa quanti-
dade e qualidade de sementes disponveis devido a inadequados sis-
temas de regenerao e multiplicao, troca de germoplasma entre os
melhoristas, que, geralmente, utilizam apenas a variabilidade gentica
encontrada em materiais elite, diculdade de identicao de genes
potencialmente teis em acessos silvestres e diculdade de transfe-
rncia desses genes para acessos elite em razo da falta de compati-
bilidade gentica e necessidade de grande nmero de ciclos de sele-
o e recombinao para recuperao do genoma elite, mantendo-se
o gene de interesse.
Essas ltimas causas da baixa utilizao de recursos genticos tm
sido amenizadas com as chamadas atividades de pr-melhoramento.
A palavra pr-melhoramento foi traduzida a partir de termos vindos
do ingls como pre-breeding, introgression breeding, genetic base broade-
ning ou germplasm enhancement (FVERO et al., 2008). Pode-se de-
nir pr-melhoramento como sendo atividades que visam identica-
o de genes e caractersticas de interesse em germoplasma extico
535
ou em populaes que no foram submetidas a qualquer processo
de melhoramento (parentes silvestres e raas locais), e sua posterior
incorporao em materiais elites agronomicamente adaptados (NASS;
PATERNIANI, 2000). Pode-se dizer ento que o pr-melhoramento
a ponte entre as atividades de recursos genticos e os programas
de melhoramento (NASS et al., 2001). usado para denir a fase do
desenvolvimento do germoplasma em materiais mais atrativos aos
melhoristas (FVERO et al., 2008).
Alm da importncia como elo entre os recursos genticos vege-
tais e o melhoramento gentico, as atividades de pr-melhoramento
podem identicar genes e caractersticas para composio de bancos
de caracteres e funes biolgicas (LOPES et al., 2007; NASS et al.,
2007). Esses bancos podem alimentar programas biotecnolgicos,
como aqueles baseados em genmica funcional, manipulao gnica
e transgenia e, tambm, alimentar programas envolvendo a diversi-
cao e agregao de valor agricultura, na forma de novos alimen-
tos, de bras, de aromas, de biomateriais e de novas variedades com
valor ornamental, funcional e medicinal.
O sucesso do pr-melhoramento envolve, pelo menos, duas fases a
primeira, o conhecimento de genes ou caractersticas potencialmente
teis de espcies silvestres, germoplasma extico ou de populaes
no-melhoradas; e a segunda, a sua utilizao prtica com a incorpo-
rao em materiais-elite agronomicamente adaptados com caracters-
ticas comerciais prontamente utilizadas na agricultura. Faleiro et al.
(2008) relatam, de forma sinttica, algumas experincias de sucesso
do pr-melhoramento de plantas, tendo como base os resultados apre-
sentados no I Curso Internacional de Pr-melhoramento de Plantas
(LOPES et al., 2006) e nas experincias do Programa de Melhoramento
do Maracujazeiro, cujas atividades tm contribudo de forma decisiva
para o lanamento de novas variedades e hbridos. Alm da experin-
cia com o maracujazeiro, exemplos de sucesso so relatados com o
milho, caf, arroz, amendoim, mandioca, hortalias, citrus e fruteiras
nativas (FALEIRO et al., 2008). Importantes estudos de caso envol-
vendo o uso de recursos genticos tambm so relatados no levanta-
mento de Albuquerque e Nass (2009) para a soja (OLIVEIRA et al.,
2009), espcies do gnero Prunus (RASEIRA et al., 2009), maracuja-
536
zeiro (FALEIRO; JUNQUEIRA, 2009); pupunha (CLEMENT, 2009),
curcubitceas (QUEIROZ, 2009), arroz (PEREIRA, 2009; RANGEL
et al., 2009), mandioca (ALVES, 2009; FUKUDA, 2009; BRANCO,
2009) e fruteiras arbreas do Sul do Brasil (CASTRO et al., 2009).
Considerando os vrios exemplos de sucesso citados acima, existe
uma grande variabilidade gentica com utilidade atual e potencial para
programas de melhoramento gentico provenientes de acessos elite
e silvestres. Vrias caractersticas de interesse so encontradas nos
recursos genticos conservados em bancos de germoplasma como
resistncia a pragas e doenas; adaptao a baixas latitudes, colheita
mecanizada, diferentes sistemas de cultivo e condies edafoclimti-
cas; arquitetura e porte da planta; cor, forma, sabor de frutos e gros;
ecincia na absoro e utilizao de nutrientes; qualidade nutricio-
nal e funcional; qualidade e teor de protenas, leo e vitaminas; tole-
rncia seca e ao alumnio; qualidade ps-colheita; maiores produ-
tividades etc.
Essa rica base gentica disponvel a munio para os programas
de melhoramento, os quais so de grande importncia para o agrone-
gcio brasileiro e mundial. Queiroz e Lopes (2007) relatam os impor-
tantes impactos da pesquisa em recursos genticos e melhoramento
vegetal na evoluo da agricultura brasileira nos ltimos 50 anos com
o desenvolvimento de cultivares e grande diversidade de plantas adap-
tadas s condies tropicais, citando vrios exemplos em vrias cultu-
ras como o milho, soja, feijo, olercolas, fruteiras temperadas e tro-
picais, caf, eucalipto entre outras.
Experincias na Embrapa Cerrados com
a conservao, caracterizao e uso de
recursos genticos: estudo de caso
Na Embrapa Cerrados, existem vrias colees de germoplasma,
envolvendo colees ativas, colees nucleares e colees de trabalho.
Na Figura 9, ilustram-se alguns dos principais produtos cujos recur-
sos genticos so conservados, caracterizados, avaliados e utilizados
na Embrapa Cerrados.
537
Figura 9. Principais recursos genticos conservados, caracterizados, avalia-
dos e utilizados na Embrapa Cerrados, envolvendo materiais exticos ou nati-
vos de outras regies do Brasil [(A) mandioca; (B) manga; (C) feijo guandu;
(D) capim colonio; (E) capim elefante; (F) brachiaria; (G) trigo; (H) soja;
(I) cevada; (J) amaranto; (K) quinoa; e (L) seringueira (L)] e nativas do Cerrado
[(M) pequi; (N) mangaba; (O) araticum; (P) baru; (Q) cagaita; (R) pitaya; (S)
estilosantes; (T) amendoim forrageiro; (U) macaba; (V) faveira; (X) barba-
timo; e (Y) maracujs silvestres].
A utilizao dos recursos genticos ilustrados na Figura 9 est rela-
cionada diversicao dos sistemas de produo com espcies exti-
cas (amaranto, quinoa, entre outras) e com espcies da rica biodiversi-
dade do Cerrado como as fruteiras nativas (pequi, mangaba, araticum,
baru, cagaita, pitaya, entre outras), como novas opes de forrageiras
(estilosantes, amendoim forrageiro, entre outras), como fontes alter-
nativas para produo de bioenergia (macaba, entre outras), como
plantas medicinais (barbatimo, faveira, maracujazeiro silvestre, entre
outras), como plantas ornamentais (maracujazeiro silvestre, entre
outras). Alguns recursos genticos estudados na Embrapa Cerrados
so importantes para programas de melhoramento como vrios aces-
sos de mandioca, manga, gramneas e leguminosas forrageiras, trigo,
cevada, soja, seringueira e maracuj.
538
No caso das espcies nativas do Cerrado, a utilizao dos recursos
genticos est passando, primeiramente, por um processo de domes-
ticao e ajustes de sistemas de produo (JUNQUEIRA et al., 2008b).
No caso do maracujazeiro, a utilizao dos recursos genticos envol-
vendo a variabilidade gentica interespecca e intraespecca tem o
objetivo de diversicar sistemas de produo e fornecer genes impor-
tantes para programas de melhoramento gentico, considerando a
uso diversicado do maracuj (FALEIRO et al., 2005; FALEIRO et al.,
2006; FALEIRO et al., 2008) (Figura 10).
Figura 10. Uso diversicado do maracujazeiro.
Para que a variabilidade gentica de espcies silvestres seja utilizada
e aproveitada em programas de melhoramento, torna-se necessrio
a realizao de hibridaes intraespeccas ou o uso da biotecnologia
moderna na obteno de hbridos somticos ou na utilizao da tec-
nologia do DNA recombinante e engenharia gentica. No programa
539
de melhoramento gentico do maracujazeiro realizado na Embrapa
Cerrados, hbridos interespeccos de P. edulis com P. setacea, P.
coccinea e P. caerulea, entre outras, tm sido obtidos com sucesso
(JUNQUEIRA et al., 2005; JUNQUEIRA et al., 2008a).
Avaliaes agronmicas de germoplasma silvestre de Passiflora tm
mostrado o potencial das espcies P. actinia, P. setacea e P. coccinea
para resistncia a viroses (Figura 11A), das espcies P. odontophylla,
P. gibertii, P. caerulea, P. serrato-digitata, P. actinia, P. mucronata e
alguns acessos de P. edulis e P. nitida para resistncia bacteriose e
das espcies P. serrato-digitata, P. gibertii, P. coccinea, P. actinia, P. seta-
cea, P. nitida, P. caerulea e alguns acessos de P. edulis para resistncia
antracnose. Alm da resistncia a doenas e a algumas pragas, h
espcies autocompatveis como a P. tenuifila, P. elegans, P. capsularis,
P. villosa, P. suberosa, P. morifolia e P. foetida. H espcies como a P.
setacea e P. coccinea que, nas condies da regio Central do Brasil,
comportam-se como planta de dias curtos, pois orescem e fruti-
cam durante o perodo de dias curtos do ano, e a colheita ocorre de
agosto a outubro, poca da entressafra do maracuj-azedo comercial.
A tolerncia ao frio vericada em P. caerulea e P. incarnata tambm
uma caracterstica de grande interesse para o melhoramento gentico
do maracujazeiro. Outra caracterstica observada em algumas esp-
cies silvestres, relatada por Junqueira et al. (2006a), a presena de
androginforo mais curto, que reduz a altura dos estigmas em rela-
o coroa, facilitando a polinizao por insetos menores. Em alguns
acessos de maracuj roxo silvestre e P. odontophylla, no momento de
mxima curvatura do estilete, os estigmas chegam a tocar na coroa
(Figura 11B), podendo, dessa forma, serem polinizados por abelhas
que so consideradas pragas importantes por transportarem todo o
plen e no fazerem a polinizao de forma ecaz. Espcies silvestres
tambm podem ser utilizadas quando se deseja melhorar caracters-
ticas fsicas, qumicas ou sensoriais da polpa do maracuj para novas
opes de mercado, seja como fruta extica ou para incrementar pro-
priedades funcionais. Nesse sentido, a P. caerulea e acessos silvestres
de P. edulis tm apresentado potencial para deixar mais avermelhada
a polpa do maracujazeiro-azedo comercial, melhorando suas proprie-
dades funcionais (Figura 11C).
540
Figura 11. Caractersticas de espcies silvestres de maracujazeiro teis para
o melhoramento gentico: (A) resistncia a doenas; (B) androginforo mais
curto que reduz a altura dos estames e estigmas em relao coroa, facili-
tando a polinizao por pequenos insetos; e (C) colorao vermelha da polpa
contendo maior quantidade de vitaminas e substncias antioxidantes.
Em pesquisas realizadas na Embrapa Cerrados, estudos sobre com-
patibilidade gentica, ndices de cruzabilidade, perodo da antese,
perodo da viabilidade de plen e da receptividade do estigma tm
permitido, por meio de cruzamentos articiais, a obteno de vrios
hbridos interespeccos frteis e promissores para o programa de
melhoramento gentico (JUNQUEIRA et al., 2008a). Hbridos envol-
vendo trs ou mais espcies tambm tm sido obtidos com o objetivo
de piramidar diferentes genes de resistncia a doenas, sendo exem-
plos o hbrido P. coccinea X P. setacea X P. edulis e o hbrido P. setacea
X P. coccinea X P. mucronata X P. edulis. Aps a obteno do hbrido
interespecco, trabalhos de melhoramento gentico tm sido realiza-
dos para recuperar as caractersticas comerciais mantendo-se os genes
de resistncia. O mtodo dos retrocruzamentos auxiliados por marca-
dores moleculares do DNA tem sido utilizado (FALEIRO et al., 2007;
FONSECA et al., 2009). Na Figura 12, ilustra a recuperao do genoma
recorrente a partir do cruzamento base entre P. edulis e P. setacea.
541
Figura 12. Plantas RC do cruzamento inicial entre P. edulis e P. setacea, ilus-
trando a recuperao do genoma recorrente.
Entre os hbridos interespeccos que esto sendo obtidos, desta-
que especial deve ser dado ao hbrido P. coccinea X P. setacea. Esse
hbrido foi lanado como o primeiro hbrido ornamental de mara-
cujazeiro no Brasil, BRS Estrela do Cerrado. Trabalhos de seleo
em populaes RC obtidas do retrocruzamento desse hbrido com
P. coccinea e P. setacea permitiram a obteno de mais dois hbridos
ornamentais de maracuj, BRS Rubiora e BRS Roseora, respec-
tivamente (Figura 13). Outros produtos tecnolgicos obtidos a par-
tir do trabalho bsico de pr-melhoramento do maracujazeiro so
os hbridos BRS Sol do Cerrado, BRS Gigante Amarelo e BRS Ouro
Vermelho. A utilizao de acessos silvestres de P. edulis na base dos
cruzamentos permitiu a obteno de materiais genticos com a colo-
rao de polpa mais avermelhada e menos dependentes da poliniza-
o articial. Outro hbrido muito promissor obtido pelo programa
de melhoramento realizado na Embrapa Cerrados envolve as esp-
cies P. caerulea e P. edulis. A partir do cruzamento base, trabalhos de
retrocruzamentos e seleo para colorao avermelhada da polpa esto
sendo feitos. Plantas RC tm apresentado a colorao da polpa mais
avermelhada e bons nveis de produtividade.
542
Figura 13. Capa dos folderes tcnicos dos hbridos de maracujazeiro-orna-
mental lanados em 2007 e hbridos de maracujazeiro azedo lanados em
2008.
Tambm merecem um destaque os hbridos interespeccos envol-
vendo as espcies P. nitida, P. setacea e P. coccinea. O potencial des-
ses materiais est relacionado sua utilizao como porta-enxertos.
Esses porta-enxertos podem ser obtidos por estaquia ou sementes.
Junqueira et al. (2006b) observaram aumentos de produtividade do
maracujazeiro-azedo enxertados em P. nitida. Alm da utilidade dos
hbridos, algumas espcies silvestres tm potencial para consumo
in natura, considerando suas propriedades como alimento funcio-
nal. Dentro dessa linha, o programa de melhoramento realizado na
543
Embrapa Cerrados tem trabalhado com seleo de populaes de P.
alata, P. setacea e de P. nitida (Figura 14), objetivando o aumento do
tamanho do fruto para o mercado de frutas frescas (maracuj doce) e
para produo de matria-prima para produo de doces e sorvetes.
Figura 14. Espcies de maracujs doce: (A) Passiflora alata; (B) Passiflora seta-
cea; e (C)Passiflora nitida.
A explorao de todo potencial das espcies silvestres de maracuja-
zeiro envolve trabalhos de pesquisa bsica nas reas de conservao,
caracterizao e avaliao dos recursos genticos e pesquisa aplicada
voltada para o melhoramento gentico. A integrao entre as ativida-
des relacionadas conservao e caracterizao de recursos genti-
cos, atividades de pr-melhoramento e tambm atividades de melho-
ramento e ps-melhoramento esto permitindo a utilizao prtica
dos recursos genticos, contribuindo efetivamente para o desenvolvi-
mento variedades, hbridos e outros produtos tecnolgicos.
Consideraes finais
As atividades relacionadas conservao, caracterizao e uso de
recursos genticos so estratgicas para a soberania nacional e para
toda humanidade, sendo um grande desao para a pesquisa bsica e
aplicada, considerando a complexidade e o grande potencial dos recur-
sos genticos para ampliar a base da cadeia alimentar do homem e dos
animais domsticos, alm de atender outras necessidades relaciona-
544
das bioenergia, vesturio, medicamentos, ornamentao, habitao
entre outras utilidades, muitas das quais subestimadas. Para o sucesso
das atividades relacionadas aos recursos genticos, essencial o forta-
lecimento e a consolidao de redes de pesquisas transdisciplinares e
multinstitucionais para formao de recursos humanos, articulao
de parcerias, otimizao dos recursos nanceiros e humanos e para
facilitar e intensicar o intercmbio de germoplasma e informaes.
Referncias
ALBUQUERQUE, A. C. S.; NASS, L. L. The state of use. In: MARIANTE,
A. S.; SAMPAIO, M. J. A.; INGLIS, M. C. V. (Ed.). The state of Brazils plant
genetic resources: second national report: conservation and sustainable
utilization for food and agriculture. Braslia, DF: Embrapa Technological
Information, 2009. p. 81-129.
ALVES, A. A. C. Preservation and use of wild Manihot species. In:
MARIANTE, A.S.; SAMPAIO, M. J. A.; INGLIS, M. C. V. (Ed.). The state
of Brazils plant genetic resources: second national report: conservation
and sustainable utilization for food and agriculture. Braslia, DF: Embrapa
Technological Information, 2009. p. 114-115.
BRANCO, L. C. C. Utilization of spontaneous mutations in Manihot esculenta
for the improvement of nutritional quality of cassava roots. In: MARIANTE,
A. S.; SAMPAIO, M. J. A.; INGLIS, M. C. V. (Ed.). The state of Brazils plant
BRASIL. Ministrio do Meio Ambiente. Secretaria de Biodiversidade e
Florestas. Conservao in situ, ex situ e on farm. Disponvel em: http://www.
mma.gov.br/sitio/ index.php?ido=conteudo.monta&idEstrutura=89&idConte
udo=8142 Acesso em: 30 jan. 2010.
BRUSH, S. B. (Ed.). Genes in the field: on-farm conservation of crop diversity.
Boca Raton: F. L. Lewis Publ.,International Development Research Centre,
International Plant Genetic Resources Institute, 2000. 288 p.
CABRAL, J. I. O sol da manh: memria da Embrapa. Braslia, DF: UNESCO,
2005, 344 p.
CAJUEIRO, E. V. M.; COSTA, I. R. S.; MONTEIRO, J. S. Sistema Brasileiro
de Informao de Recursos Genticos Sibrargen. In: CAVALCANTI, T.
B.; WALTER, B. M. T. (Org.). Tpicos atuais em botnica. Braslia, DF: SBB:
Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, 2000. p. 129-132.
545
CARVALHO, P. C. L. de; SOARES-FILHO; W. dos S.; RITZINGER, R.;
CARVALHO, J. A. B. S. Conservao de germoplasma de frutferas tropicais
com a participao do agricultor. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 23, n.
3, p. 730-734, 2001.
CASTRO, M. C.; RASEIRA, M. C. B.; VIZZOTO, M.; KROLOW, A. C. The
use of native Southern Brazilian fruit tree genetic resources. In: MARIANTE,
A. S.; SAMPAIO, M. J. A.; INGLIS, M. C. V. (Ed.) The state of Brazils plant
utilization for food and agriculture.Braslia, DF: Embrapa Technological
CLEMENT, C. R.; ROCHA, S. F. R.; COLE, D. M.; VIVAN, J. L. Conservao
on farm. In: NASS, L. L. (Ed.) Recursos genticos vegetais. Braslia, DF:
Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, 2007. p. 511-544.
CLEMENT, C. R. The use of native genetic resources and conventional
knowledge in peach-palm breeding (Bactris gasipaes, Palmae). In: MARIANTE,
A. S.; SAMPAIO, M. J. A.; INGLIS, M. C. V. (Ed.) The state of Brazils plant
COSTA, A. M.; FALEIRO, F. G.; KARIA, C. T.; SHIRATSUCHI, L. S.;
ANDRADE, R. P.; LOPES, G. K. B. Variabilidade gentica e ecolgica
de Stylosanthes macrocephala determinadas por RAPD e SIG. Pesquisa
Agropecuria Brasileira, v. 40, n. 9, p. 899-909. 2005.
conservao e uso de recursos genticos. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados,
2007. 102 p.
FALEIRO, F. G.; JUNQUEIRA, N. T. V.; BRAGA, M. F. Germoplasma
e melhoramento gentico do maracujazeiro desaos da pesquisa. In:
FALEIRO, F. G.; JUNQUEIRA, N. T. V.; BRAGA, M. F. (Ed.). Maracuj:
germoplasma e melhoramento gentico. Planaltina,DF: Embrapa Cerrados,
2005. p. 187-210.
FALEIRO, F. G.; JUNQUEIRA, N. T. V.; BRAGA, M. F. Maracuj: demandas
para a pesquisa. Planaltina,DF: Embrapa Cerrados, 2006. 54 p.
FALEIRO, F. G.; JUNQUEIRA, N. T. V.; BRAGA, M. F.; JUNQUEIRA,
K. P.; BELLON, G.; FONSECA, K. G.; PEIXOTO, J. R. Cruzamentos
inter-especcos e retrocruzamentos visando resistncia do maracujazeiro
a doenas. In:CONGRESSO BRASILEIRO DE MELHORAMENTO DE
PLANTAS, 4., 2007, So Loureno. Anais... So Loureno: Sociedade
Brasileira de Melhoramento de Plantas, 2007. 1 CD-ROM. 4 p.
546
FALEIRO, F. G.; JUNQUEIRA, N. T. V. Passion fruit (Passiflora spp.)
improvement using wild species. In: MARIANTE, A. S.; SAMPAIO, M.
J. A.; INGLIS, M. C. V. (Ed.). The state of Brazils plant genetic resources:
second national report: conservation and sustainable utilization for
food and agriculture. Braslia, DF: Embrapa Technological Information,
2009. p. 101-106.
FALEIRO, F. G.; JUNQUEIRA, N. T. V.; FVERO, A. P.; LOPES, M. A.
Pr-melhoramento de plantas: experincias de sucesso. In: FALEIRO, F.
G.; FARIAS NETO, A. L.; RIBEIRO JNIOR, W. Q. Pr-melhoramento,
melhoramento e ps-melhoramento: estratgias e desaos. Planaltina,DF:
Embrapa Cerrados, 2008. p. 43-62.
FALEIRO, F. G. Banco de germoplasma flor da paixo. Portal Toda Fruta,
2010a. (Artigo tcnico). Disponvel em:< http://www.todafruta.com.br/
todafruta/mostra_conteudo.asp?conteudo=17091>. Acesso em: 30 jan. 2010.
FALEIRO, F. G. Preservao da variabilidade gentica de plantas: um grande
desafio. Boletim Pecurio. 2010b. (Artigo Tcnico). Disponvel em: <.> Acesso
em: 30 de jan. 2010.
FAVERO, A. P.; LOPES, M. A.; FALEIRO, F. G. Estado da arte do pr-
melhoramento de espcies vegetais. In: FALEIRO, F. G.; FARIAS NETO,
A. L.; RIBEIRO JUNIOR, W. Q. Pr-melhoramento, melhoramento e ps-
melhoramento: estratgias e desafios. Planaltina,DF: Embrapa Cerrados,
2008. p. 29-42.
FONSECA, K. G.; FALEIRO, F. G.; JUNQUEIRA, N. T. V.; PEIXOTO, J. R.;
BELLON, G.; JUNQUEIRA, K.P.; SANTOS, E. C. Anlise da recuperao do
genoma recorrente em maracujazeiro-azedo com base em marcadores RAPD.
Revista Brasileira de Fruticultura, v. 31, n. 1, p. 145-153. 2009.
FRANKEL, O.; BROWN, A.H.D. Plant genetic resources today: a critical
reappraisal. In: Holden, J.H.W.; Williams, J.T. (Eds.) Crop genetic resources:
conservation and evaluation. London: G. Allen & Unwin, 1984. p. 249-257.
FREITAS, F. O.; MEDEIROS, M. B.; CLEMENT, C. R. In situ management of
plant genetic resources. In: MARIANTE, A. S.; SAMPAIO, M. J. A.; INGLIS,
M. C. V. (Ed.). The state of Brazils plant genetic resources: second national
report: conservation and sustainable utilization for food and agriculture.
Braslia, DF: Embrapa Technological Information, 2009. p. 51-64.
FUKUDA, W. M. G. Use of Brazilian genetic diversity in cassava breeding
program. In: MARIANTE, A. S.; SAMPAIO, M. J. A.; INGLIS, M. C. V.
(Ed.) The state of Brazils plant genetic resources: second national report:
conservation and sustainable utilization for food and agriculture. Braslia, DF:
Embrapa Technological Information, 2009. p. 116-119.
547
GOEDERT, C. O. Histrico e avanos em recursos genticos no Brasil. In:
NASS, L.L. (Ed.) Recursos genticos vegetais. Braslia, DF: Embrapa Recursos
Genticos e Biotecnologia: Braslia, DF. 2007. p. 23-60.
GUIMARES, E. P. Iniciativas globais de capacitao em pr-melhoramento
e melhoramento vegetal e aes da FAO para promoo do uso de recursos
genticos para alimentao e agricultura. In: LOPES, M. A.; FVERO, A.
P.; FERREIRA, M. A. J. F.; FALEIRO, F. G. (Ed.) Curso Internacional de
pr-melhoramento de plantas. Braslia, DF: Embrapa Recursos Genticos e
Biotecnologia, 2006. p. 27-29. (Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia.
Documentos, 185).
HAWTIN, G.; IWANAGA, M.; HODGKIN, T. Genetic resource in breeding
for adaptation. Euphytica, v. 92, p. 255-266, 1996.
HOLDEN, J. H. W. The second ten years. In: HOLDEN, J. H. W.; WILLIAMS,
J. T. (Ed.) Crop genetic resources: conservation and evaluation. London: G.
Allen & Unwin, 1984. p. 277-285.
JARVIS, D. I.; MYER, L.; KLEMICK, H.; GUARINO, L.; SMALE, M.;
BROWN, A. H. D.; SADIKI, M.; STHAPIT, B.; HODGKIN, T. A training
guide for in situ conservation on-farm: version 1. Rome, Italy: International
Plant Genetic Resources Institute, 2000. 161p.
JUNQUEIRA, N. T. V.; BRAGA, M. F.; FALEIRO, F. G.; PEIXOTO, J. R.;
BERNACCI, L. C. Potencial de espcies silvestres de maracujazeiro como
fonte de resistncia a doenas. In: FALEIRO, F. G.; JUNQUEIRA, N. T. V.;
BRAGA, M. F. (Ed.). Maracuj: germoplasma e melhoramento gentico.
Planaltina,DF: Embrapa Cerrados, 2005. p. 81-108.
JUNQUEIRA, N. T. V.; FALEIRO, F. G.; BRAGA, M. F.; PEIXOTO, J. R. Uso
de espcies silvestres de Passiflora no pr-melhoramento do maracujazeiro. In:
LOPES, M. A.; FVERO, A. P.; FERREIRA, M. A. J. F.; FALEIRO, F. G. (Ed.).
Curso Internacional de pr-melhoramento de plantas. Braslia, DF: Embrapa,
2006a. p. 133-137.
JUNQUEIRA, N. T. V.; LAGE, D. A. C.; BRAGA, M. F.; PEIXOTO, J. R.;
BORGES, T. A.; ANDRADE, S. R. M. Reao a doenas e produtividade de um
clone de maracujazeiro-azedo propagado por estaquia e enxertia em estacas de
passiora silvestre. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 28, n. 1, 2006b.
JUNQUEIRA, K.P.; FALEIRO, F. G.; JUNQUEIRA, N. T. V.; BELLON, G.;
RAMOS, J. D.; BRAGA, M. F.; SOUZA, L. S. Conrmao de hbridos
interespeccos articiais no gnero Passiflora por meio de marcadores RAPD.
Revista Brasileira de Fruticultura, v. 30, n. 1, p. 191-196. 2008a.
548
JUNQUEIRA, N. T. V.; FALEIRO, F. G.; BRAGA, M. F.; PEIXOTO, J. R.
Domesticao de espcies da ora nativa do Cerrado. In: PARRON, L. M.;
AGUIAR, L. M. S.; DUBOC, E.; OLIVEIRA FILHO, E. C.; CAMARGO,
A. J. A.; AQUINO, F. G. (Ed.). Cerrado: desaos e oportunidades para
o desenvolvimento sustentvel. Planaltina,DF: Embrapa Cerrados,
2008b. p. 125-163.
LOPES, M. A. L. O sistema brasileiro de pesquisa em recursos genticos. In:
Curso internacional de pr-melhoramento de plantas. Braslia, DF: Embrapa
Recursos Genticos e Biotecnologia, 2006. p. 30-36. (Embrapa Recursos
Genticos e Biotecnologia. Documentos, 185).
LOPES, M. A.; NASS, L. L.; MELO, I. S. Bioprospeco. In: BORM, A.;
GIUDICE, M. del (Ed.). Biotecnologia e meio ambiente. Viosa: Suprema,
2007. p. 77-106.
LOUETTE, D. Traditional management of seed and genetic diversity: what is
a landrace?. In: BRUSH, S.B. (Ed.) Genes in the field: on-farm conservation
of crop diversity. Boca Raton: F. L. Lewis Publ.,International Development
Research Centre, International Plant Genetic Resources Institute,
2000. p. 109-142.
NASS, L. L.; PATERNIANI, E. Pre-breeding: a link between genetic resources
and maize breeding. Scientia Agricola, v. 57, p. 581-587, 2000.
NASS, L. L.; VALOIS, A. C. C.; MELO, I. S. de; VALADARES-INGLIS, M.
C., (Ed.). Recursos genticos e melhoramento: plantas. Rondonpolis, MT:
Fundao MT, 2001.
NASS, L. L.; NISHIKAWA, M. A. N.; FVERO, A. P.; LOPES, M. A.
Pr-melhoramento de germoplasma vegetal. In: NASS, L. L. (Ed.). Recursos
genticos vegetais. Braslia, DF: Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia,
2007. p. 683-716.
NASS, L. L.; WALTER, B. M. T.; CORADIN, L.; CIAMPI, A. Y. The state of
diversity. In: MARIANTE, A.S.; SAMPAIO, M.J.A.; INGLIS, M.C.V. (Ed.). The
state of Brazils plant genetic resources: second national report: conservation
and sustainable utilization for food and agriculture.Braslia, DF: Embrapa
OLIVEIRA, M. F.; ARIAS, C. A.; TOLEDO, J. F. F. The importance of the
introduction of germplasm for soybean (Glycine max) improvement. In:
MARIANTE, A. S.; SAMPAIO, M. J. A.; INGLIS, M. C. V. (Ed.). The state
549
ONYILAGHA, J. C.; Numerical analysis of variation among Nigerian
Dioscorea rotunda accessions. Euphytica, v. 35, p. 413-419, 1986.
PEALOZA, A. P. S.; POZZOBON, M. T. Caracterizao citogentica de
germoplasma vegetal. In: NASS, L.L. (Ed.) Recursos genticos vegetais.
Braslia, DF: Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, 2007. p. 307-342.
PEREIRA, J. A. Using red rice genetic, cultural and food heritage (Oryza
sativa). In: MARIANTE, A. S.; SAMPAIO, M. J. A.; INGLIS, M. C. V.
(Ed.). The state of Brazils plant genetic resources: second national report:
conservation and sustainable utilization for food and agriculture. Braslia, DF:
Embrapa Technological Information, 2009. p. 112-114.
QUEIROZ, M.A. Recovering conventional agriculture genetic resources
and improving cucurbits in Northeastern Brazil. In: MARIANTE, A. S.;
SAMPAIO, M. J. A.; INGLIS, M. C. V. (Ed.). The state of Brazils plant genetic
resources: second national report: conservation and sustainable utilization
for food and agriculture. Braslia, DF: Embrapa Technological Information,
2009. p. 110-112.
QUEIROZ, M. A.; LOPES, M. A. Importncia dos recursos genticos vegetais
para o agronegcio. In: NASS, L. L. (Ed.) Recursos genticos vegetais. Braslia,
DF: Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, 2007. p. 61-119.
RANGEL, P. N.; RANGEL, P. H. N.; FERREIRA, M. E. Introgression of Oryza
glumaepatula genes of economic interes tinto elite lineages of Oriza sativa
breeding program. In: MARIANTE, A.S.; SAMPAIO, M.J.A.; INGLIS, M.C.V.
(Eds.) The state of Brazils plant genetic resources. Second National Report.
Conservation and Sustainable Utilization for food and agriculture. Embrapa
Technological Information: Braslia, DF. 2009. p. 124-129.
RASEIRA, M. C. B.; CASTRO, C. M.; UENO, B. Passion fruit (Passiflora
spp.) improvement using wild species. In: MARIANTE, A. S.; SAMPAIO,
M. J. A.; INGLIS, M. C. V. (Ed.). The state of Brazils plant genetic resources:
second national report: conservation and Sustainable Utilization for
food and agriculture. Braslia, DF: Embrapa Technological Information,
2009. p. 99-101.
ROSA, M. F. M. Conservao de recursos genticos vegetais. 2004 52 f.
(Monograa). So Joo da Boa Vista, SP. Centro Universitrio da Fundao de
Ensino Octvio Bastos.
SILVA, D. J. H.; VICCINI, L. F. Acesso ao patrimnio gentico brasileiro e
bioprospeco: aspectos legais e cientcos. In: BORM, A.; LOPES, M. T.
G.; CLEMENT, C. R. Domesticao e melhoramento: espcies amaznicas.
Viosa, MG: Suprema Editora Ltda, 2009. p. 53-66.
550
SILVA, D.B.; WETZEL, M.M.V.S; SALOMO, A.N.; FAIAD, M.G.R.
Conservao de germoplasma semente em longo prazo. In: NASS, L.L. (Ed.)
Recursos genticos vegetais. Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia:
Braslia, DF. 2007. p. 441-471.
VAN SLOTEN, D. H. The use of curators, breeders anda other users of
germplasm in characterization and evaluation of crop genetic resources.
Rome: IBPGR/SEAN, 1987. p. 3-8. Special Issue.
STEINER, J. J.; GREENE, S. L. Proposed ecological descriptors and their
utility for plan germplasm collections. Crop Science, v. 36, p. 439-451, 1996.
VALLS, J. F. M.; VEIGA, R. F. A.; BARBIERI, R. L.; RAMOS, S. R. R.;
BUSTAMANTE, P. G. Ex situ management of plant genetic resources. In:
MARIANTE, A. S.; SAMPAIO, M. J. A.; INGLIS, M. C. V. (Ed.) The state
VALLS, J. F. M. Caracterizao de recursos genticos vegetais. In: NASS, L. L.
(Ed.) Recursos genticos vegetais. Braslia, DF: Embrapa Recursos Genticos
e Biotecnologia, 2007. p. 281-305.
VIEIRA, R. F.; AGOSTINI-COSTA, T. S. Caracterizao qumica de
metablitos secundrios em germoplasma vegetal. In: NASS, L. L. (Ed.)
Recursos genticos vegetais. Braslia, DF: Embrapa Recursos Genticos e
Biotecnologia, 2007. p. 343-376.
VIEIRA, E. A.; FIALHO, J. F.; SILVA, M. S. Estado da arte e estratgias
do melhoramento participativo: o exemplo da mandioca no Cerrado.
In: FALEIRO, F. G.; FARIAS NETO, A. L.; RIBEIRO JNIOR, W. Q.
Pr-melhoramento, melhoramento e ps-melhoramento: estratgias e
desafios. Planaltina,DF: Embrapa Cerrados, 2008. p. 109-124.
WETZEL, M. M. V. S. Manuteno da variabilidade dos recursos genticos
para o pr-melhoramento vegetal. In: LOPES, M. A.; FVERO, A. P.;
FERREIRA, M. A. J. F.; FALEIRO, F. G. (Ed.). Curso Internacional de
pr-melhoramento de plantas. Braslia: Embrapa Recursos Genticos e
Biotecnologia, 2006. p. 41-44. (Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia.
Documentos, 185).
WILLIAMS, J. T. A decade of crop genetic resources research. In: HOLDEN,
J. H. W.; WILLIAMS, J. T. (Ed.). Crop genetic resources: conservation and
evaluation. London: G. Allen & Unwin, 1984. p. 1-17.
551
Curso Internacional de pr-melhoramento de plantas. Braslia: Embrapa,
2006. 184 p. (Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia. Documentos, 185).
MARIANTE, A. S.; SAMPAIO, M. J. A.; INGLIS, M. C. V. (Ed.) The state
Technological Information, 2009. 236 p.
NASS, L. L. (Ed.) Recursos genticos vegetais. Braslia, DF: Embrapa Recursos
Genticos e Biotecnologia, 2007. 858 p.
VALOIS, A. C. C.; SALOMO, A. N.; ALLEM. A. C. (Ed.). Glossrio de
recursos genticos. Braslia, DF: EMBRAPA-SPI, 1996. 62 p.
553
Melhoramento gentico de
plantas e biotecnologia
Fbio Gelape Faleiro
Walter Quadros Ribeiro Jnior
Austeclnio Lopes de Farias Neto
Introduo
Segundo seu conceito amplo, a biotecnologia o uso de conheci-
mentos sobre os processos biolgicos e sobre as propriedades dos
seres vivos, com o m de resolver problemas e criar produtos de uti-
lidade. Conceitualmente, o melhoramento de plantas no deixa de ser
uma biotecnologia, como cincia que visa modicao gentica das
plantas para torn-las mais teis ao homem.
O melhoramento de plantas pode ser denido de forma clssica
como a cincia e ou a arte de modicar as plantas para o benefcio
humano (BORM, 1998; BERNARDO, 2002). Trata-se de uma cincia
multidicisplinar que aplica os princpios da gentica para o desenvol-
vimento de cultivares melhoradas para utilizao humana e animal,
utilizando-se de conhecimentos de agronomia, botnica, gentica,
gentica molecular, citogentica, siologia, patologia, entomologia,
bioqumica e estatstica

(SCHLEGEL, 2003).
Aps a descoberta da hereditariedade por Gregor Mendel em 1865,
novas e grandes descobertas como a heterose, a mutagnese, a gentica
quantitativa, avanos na siologia e bioqumica, a cultura de tecidos,
a bioinformtica e os avanos na gentica e biologia molecular tive-
ram inuncia direta e muito positiva no melhoramento de plantas.
Nas ltimas dcadas, surgiram inmeras tecnologias baseadas em
anlises do DNA e na sua manipulao controlada e intencional por
meio das tcnicas de engenharia gentica. Essas tecnologias abriram
novas possibilidades para o melhoramento gentico por romperem a
barreira de cruzamentos entre diferentes espcies estabelecidas pela
compatibilidade sexual. Mediante a engenharia gentica, possvel
transferir, para plantas, genes isolados de plantas de outras espcies
554
ou mesmo de microrganismos e animais, aumentando o conjunto
gnico disponvel para cada programa de melhoramento.
Neste captulo, apresentado um pouco da histria e da importn-
cia do melhoramento gentico vegetal para a humanidade, abordando
aspectos gerais e exemplos do melhoramento clssico e do melhora-
mento baseado em tcnicas da biotecnologia moderna relacionadas
engenharia gentica.
Histria do melhoramento gentico de plantas
Podemos dizer que o melhoramento de plantas nasceu com o incio
da agricultura, h aproximadamente 10.000 anos. A agricultura incen-
tivou a prtica emprica do melhoramento de plantas pelos primeiros
agricultores, os quais selecionavam sementes das melhores plantas
para estabelecer novos plantios com melhor qualidade e maior pro-
dutividade. Esse processo possibilitou a domesticao de vrias esp-
cies de plantas pelo homem (Figura 1).

Figura 1. Ilustraes da origem do melhoramento gentico, do processo de
domesticao das plantas e de alteraes no tamanho da espiga e da arquite-
tura da planta do milho e do tamanho do fruto do maracuj decorrentes do
melhoramento gentico.
Como cincia, o melhoramento de plantas comeou logo aps a
redescoberta das leis de Mendel no comeo do sculo XX. Desde
ento, vem evoluindo em diferentes reas, permitindo aos melho-
ristas aumentarem a ecincia na seleo e explorarem mais racio-
nalmente os recursos genticos. Dos primrdios da agricultura at
hoje, o melhoramento passou por muitas modicaes no exerccio
da sua prtica, mas poucas mudanas foram observadas, nos ltimos
50 anos, em seus princpios fundamentais de gerao de variabilidade
(BORM; MILACH, 1999).
555
Captulo 18 Melhoramento gentico de plantas e biotecnologia
Borm e Milach (1999) relatam alguns avanos importantes na rea
do melhoramento gentico de plantas que ocorreram no sculo XX, o
qual foi marcado por grandes descobertas ou desenvolvimentos que
tiveram profundo impacto na maneira de se fazer o melhoramento de
plantas (Figura 2). A redescoberta das leis de Mendel e do princpio
da hereditariedade foi a base cientca para a descoberta da heterose
(1910), para o desenvolvimento dos mtodos clssicos de melhora-
mento (1920), para a descoberta da mutagnese (1930), para a utiliza-
o de mtodos estatsticos e da gentica quantitativa (1940), siologia
(1950), bioqumica (1960), cultura de tecidos (1970), engenharia gen-
tica e biologia molecular (1980), bioinformtica (1990) e interaes
das reas genmicas, protemicas e metabolmicas em alta escala e
de forma rotineira (2000).

Figura 2. Ilustraes de avanos na cincia do melhoramento de plantas,
tendo como base os primeiros experimentos de Mendel, passando pelo
desenvolvimento dos mtodos clssicos de melhoramento, ferramentas
moleculares e engenharia gentica.
Com o avano da cincia, o melhoramento de plantas passou a
possibilitar aos melhoristas a criao de novos tipos de plantas, pela
modicao dirigida e controlada dos caracteres hereditrios de inte-
resse. Hoje, vrias cultivares de vrias espcies so desenvolvidas a
cada ano com caractersticas de alta produtividade, qualidade, resistn-
cia a estresses biticos e abiticos, adaptabilidade, etc. Logicamente,
os altos rendimentos das culturas atualmente utilizadas na produo
agrcola mundial somente foram possveis com a ajuda do melhora-
mento do ambiente para as plantas, sendo exemplos a correo da
acidez e fertilidade dos solos, a irrigao, o controle tossanitrio
e das plantas invasoras entre outras prticas de manejo totcnico.
Estima-se que a contribuio do melhoramento de plantas ao nvel
556
mundial responde por cerca de 50% dos aumentos em produtividade
nas espcies cultivadas (FEHR, 1984).
O melhoramento gentico convencional
O melhoramento gentico clssico possibilita a criao de novas
combinaes de genes por diferentes mtodos, desenvolvidos e aper-
feioados no ltimo sculo (BORM, 1997), utilizando-se o cruza-
mento sexual entre plantas da mesma espcie e, quando possvel,
entre plantas de espcies prximas geneticamente. Por meio desse
cruzamento, possvel combinar caractersticas desejveis presentes
em diferentes plantas. As atividades de melhoramento envolvendo
a combinao de caractersticas e a xao dos genes de interesse
em novas cultivares so feitas em sucessivas geraes envolvendo a
recombinao e seleo gnica baseada no fentipo. Esse processo de
desenvolvimento de uma nova variedade ou cultivar um processo
lento que pode demorar uma dcada ou mais. Nas primeiras gera-
es de melhoramento, milhares de plantas so obtidas por meio de
cruzamentos; testadas e ao longo das geraes, as plantas com carac-
tersticas desejveis (produtividade, resistncia a doenas, adaptabi-
lidade, etc.) so selecionadas, culminando com o lanamento de uma
nova cultivar (Figura 3). Essas atividades possibilitaram um notvel
avano do melhoramento gentico de plantas nos ltimos 100 anos.
Ferreira e Faleiro (2008) ilustram esse notvel avano com os resul-
tados da to discutida Revoluo Verde, responsvel pelo aumento na
produo de cereais na segunda metade do sculo XX. A utilizao de
cultivares semians de trigo e de arroz pelo melhoramento clssico
resultou em grande aumento de produtividade dessas culturas, solu-
cionando ou equacionando a escassez de alimentos e potencial fome
em escala que se intensicavam em vrios pases do mundo aps a
Segunda Grande Guerra (BORLAUG, 1969).
Conforme mencionado, as cultivares de plantas de diferentes esp-
cies cultivadas foram desenvolvidas, em sua grande maioria, com base
na seleo fenotpica de caractersticas de interesse econmico. Essa
tarefa torna-se complexa e menos eciente quando a caracterstica de
interesse controlada por vrios genes (caracterstica quantitativa),
geralmente com pequeno efeito e signicativa inuncia ambien-
557
tal. No obstante, os programas de melhoramento gentico tm tido
sucesso no desenvolvimento de cultivares superiores para caracte-
rsticas qualitativas e quantitativas. Esse sucesso pode ser atribudo,
entre outros fatores, combinao de mtodos clssicos de melhora-
mento gentico, avaliao do fentipo em diferentes anos e ambien-
tes, e a sistemas sosticados de experimentao, totecnia, estatstica
e estratgias de seleo (FERREIRA; FALEIRO, 2008).
Cruzamentos
Prognies
Avaliao - Seleo - Recombinao
Gerao 1
Gerao n
Produo de
semente gentica
Nova cultivar
Gerao 1
Figura 3. Ilustraes do processo de avaliao, seleo e recombinao de
plantas com caractersticas desejveis ao longo de sucessivas geraes de
melhoramento, culminando com o lanamento de uma nova cultivar.
Fonte: adaptado de Souza et al. (2009).
558
O melhoramento auxiliado pela biotecnologia
De um modo geral, as tcnicas relacionadas biotecnologia como a
cultura de tecidos, marcadores moleculares, anlises do DNA e enge-
nharia gentica, alm de aumentarem a disponibilidade de genes
desejveis, tm auxiliado o melhoramento gentico das plantas, tor-
nando o processo mais rpido, preciso e eciente.
A cultura de tecidos, por meio das tcnicas de micropropagao,
produo de di-haploides, cultura de anteras e cruzamentos interes-
peccos pela fuso de protoplastos, tem sido uma ferramenta inte-
ressante. As tcnicas de melhoramento gentico por engenharia gen-
tica tm na cultura de tecidos uma ferramenta bsica, sem a qual no
se alcana a regenerao da planta transgnica completa e funcional
a partir da clula geneticamente modicada. Muitas outras metodo-
logias importantes no campo da cultura de tecidos vegetais tm sido
diariamente implantadas e tm trazido novas possibilidades como fer-
ramenta auxiliar para o melhoramento gentico. No captulo 14, deste
livro, so relatadas algumas dessas metodologias.
Marcadores moleculares e anlises do DNA esto, a cada dia, sendo
utilizados de maneira rotineira nos programas de melhoramento
gentico, auxiliando nas diferentes fases do programa, desde a caracte-
rizao da variabilidade gentica do germoplasma, passando por dife-
rentes atividades de pr-melhoramento, melhoramento e ps-melho-
ramento. No captulo 3, nesta obra, so apresentadas as principais
aplicaes dos marcadores moleculares como ferramenta auxiliar em
programas melhoramento gentico vegetal.
A engenharia gentica tem aberto novas possibilidades para o
melhoramento gentico, sendo exemplos o desenvolvimento de cul-
tivares de feijoeiro resistentes ao vrus-do-mosaico dourado, cultiva-
res de mamoeiro resistentes ao vrus-da-mancha-anelar, cultivares de
milho, soja e algodo resistentes a insetos, cultivares resistentes a her-
bicidas para reduzir custos e facilitar o manejo da cultura, cultivares
tolerantes a condies adversas como seca, frio, geada, alcalinidade e
acidez do solo, cultivares de alimentos com melhor qualidade nutri-
cional, etc. Com a engenharia gentica, o conjunto gnico disponvel
para o melhorista foi ampliado. Essa possibilidade traz a esperana de
equacionar problemas de certas culturas, os quais no teriam soluo
559
utilizando apenas a variabilidade gentica limitada pela compatibili-
dade sexual intraespecca ou entre espcies relacionadas. No cap-
tulo 15, deste livro, so discutidos os princpios cientcos da enge-
nharia gentica e os aspectos tecnolgicos envolvendo a obteno de
plantas transgnicas geneticamente melhoradas.
Planejamento de programas de melhoramento
O planejamento e as decises sobre as estratgias a serem utiliza-
das em programas de melhoramento so to importantes quanto a
sua execuo propriamente dita. As principais etapas do planejamento
de programas de melhoramento de plantas so descritas por Borm
(1998); e Ribeiro Jnior et al. (2008) fazem uma discusso dessas eta-
pas, incluindo um estudo de caso sobre melhoramento gentico do
trigo (RIBEIRO JNIOR et al. 2006). O primeiro passo estratgico de
um programa de melhoramento a identicao de demandas e em
funo delas, a denio dos objetivos.
Para a identicao das demandas, costuma-se considerar somente
o mercado com sua cadeia produtiva e a possibilidade de lucro, o que
uma viso reducionista e limitada. Para uma viso sistmica, deve-se
considerar tambm impactos scios econmicos e ambientais de uma
possvel cultivar a ser gerada, que, em outras palavras, signica sus-
tentabilidade. Em funo desse ponto de vista mais amplo, deve-se
denir as demandas, objetivos e metas do programa. importante
que as demandas, objetivos e metas sejam coerentes e exequveis
porque projetos muito ambiciosos podem fracassar. Deve-se consi-
derar de forma realista a relao custo e benefcio das novas cultiva-
res a serem obtidas.
Para a obteno das novas cultivares, a variabilidade gentica da
espcie alvo a mais importante ferramenta a ser utilizada. Essa varia-
bilidade pode ser buscada no somente em cultivares modernas, mas
tambm em acessos obsoletos, raas locais, espcies selvagens de
gneros relacionados espcie-alvo, entre outros. Quando se con-
sidera a espcie e seu sistema produtivo, pode-se prever os garga-
los a serem enfrentados, ou seja, quais caractersticas de interesse
esto ausentes nas atuais cultivares comerciais. Nessa fase do pla-
nejamento, possvel denir se haver necessidade de atividades de
560
pr-melhoramento, envolvendo a identicao de genes de interesse
em espcies silvestres e sua transferncia para acessos mais adapta-
dos. As atividades de pr-melhoramento so de grande importncia
para subsidiar a utilizao prtica dos recursos genticos e ampliar
a base gentica dos programas de melhoramento (DUVICK, 1990;
NASS; PATERNIANI, 2000), sendo vrias experincias de sucesso
relatadas por Faleiro et al. (2008a). A impossibilidade de atingir os
objetivos com a variabilidade gentica existente no pool gnico da
espcie ou de espcies relacionadas pode levar deciso de se utili-
zar tcnicas biotecnolgicas, incluindo a transgenia.
As atividades do melhoramento propriamente dito envolvem basi-
camente metodologias de avaliao, seleo e novas recombinaes
a cada gerao. Caso no se domine essas metodologias para a esp-
cie-alvo, um estudo prvio deve ser conduzido inicialmente antes do
melhoramento propriamente dito. O conhecimento prvio da forma
de reproduo e multiplicao da espcie-alvo imprescindvel para
se decidir a estratgia apropriada do melhoramento. Espcies autga-
mas ou algamas, com reproduo via sementes ou assexuada, reque-
rem metodologias distintas de melhoramento. Finalmente, as limita-
es de manejo da espcie na regio-alvo, como por exemplo, doenas
e problemas de adaptao s condies climticas, assim como neces-
sidade de irrigao nas diferentes pocas de plantio, so determinan-
tes no planejamento dos experimentos. O conhecimento das exign-
cias do mercado auxilia na busca de produtos tecnolgicos com maior
valor agregado.
O programa de melhoramento no termina com a obteno da cul-
tivar. Para atingir seu objetivo central, essa cultivar deve ser utilizada
pelos produtores e atingir o mercado com benefcios para toda cadeia
produtiva, envolvendo a indstria e os consumidores. Para isso, ati-
vidades de ps-melhoramento so essenciais. Essas atividades envol-
vem a elaborao de planos de marketing, logstica de produo e
comercializao de sementes e difuso da tecnologia. A divulgao dos
ganhos no somente econmicos, mas tambm sociais e ambientais
podem ser importantes para a adoo das novas cultivares.
Para realizao de todas atividades de pr-melhoramento, melho-
ramento e ps-melhoramento (FALEIRO et al., 2008b), o trabalho em
561
equipe envolvendo prossionais com vrias especialidades (gentica,
tossanidade, totecnia, siologia vegetal, bioqumica, estatstica,
etc.) assume grande importncia. Toda equipe, por mais qualicada
que seja, possui limitaes e lacunas de conhecimento e, nesse sen-
tido, parcerias multidisciplinares e interinstitucionais devem ser cri-
teriosamente estabelecidas, aproveitando-se as reas de maior dom-
nio ou de maior experincia de cada instituio ou equipe parceira.
Importncia e exemplos do
desenvolvimento de novas cultivares
O melhoramento clssico tem contribudo de forma signicativa
para o aumento da produo brasileira de plantas cultivadas, assim
como para a reduo dos custos de produo dessas culturas e para
a incorporao de novas reas de produo (RAMALHO, 2004). O
melhoramento de plantas de diversas espcies produtoras de gros,
bras, frutos e energia foi fundamental para a ocupao agrcola
da regio, por meio da criao de cultivares adaptadas regio do
Cerrado. Hoje, essa regio responde por quantidades signicativas da
produo nacional de carne, soja, milho, feijo, algodo, arroz, caf,
entre outras culturas.
O melhoramento baseado na biotecnologia e engenharia gentica
tambm tem contribudo signicativamente na produo de alimen-
tos no mundo, com um nmero crescente de pases que cultivam
plantas geneticamente modicadas e considervel aumento de reas
cultivadas com estas plantas. Um total de 25 pases cultiva plantas
geneticamente modicadas em aproximadamente 134 milhes de
hectares, dos quais 15 tem a rea cultivada superior a 50 mil hecta-
res (Figura 4) (JAMES, 2009). Os pases com maiores reas cultivadas
com plantas geneticamente modicadas so EUA, Brasil e Argentina
com 64; 21,4 e 21,3 milhes de hectares, respectivamente.
562
5
8.2 milhes/ha
Canola, milho, soja
beterraba
Canad
1
64.0 milhes/ha
Soja, milho, algodo
canola, abbora,
papaia,alfafa,
beterraba
EUA
15
0.1 milho/ha
Algodo, soja
Mxico
18
0.05 milho/ha
Milho
Honduras
23
0.05 milho/ha
Algodo, soja
Costa Rica
17
0.05 milho/ha
Algodo
Colmbia
10
0.8 milho/ha
Soja
Bolvia
20
0.05 milho/ha
Milho
Portugal
14
0.1 milho/ha
Milho
Espanha
19
0.05 milho/ha
Milho
Repblica Tcheca
22
0.05 milho/ha
Milho
Polnia
25
0.05 milho/ha
Milho
Eslovquia
21
0.05 milho/ha
Milho
Romnia
6
3.7 milho/ha
Algodo, tomate,
papaia, pimento
China
4
8.4 milho/ha
Milho
ndia
11
0.5 milho/ha
Milho
Filipinas
24
0.05 milho/ha
Milho
Egito
12
0.2 milho/ha
Algodo, canola
Austrlia
13
0.1 milho/ha
Algodo
Burkina Faso
8
2.1 milho/ha
Milho, soja, algodo
frica do Sul
2
21.4 milho/ha
Soja, milho, algodo
Brasil
7
2.2 milhes/ha
Soja
Paraguai
9
0.8 milho/ha
Soja, milho
Uruguai
3
21.3 milhes/ha
Soja, milho, algodo
Argentina
16
0.05 milho/ha
Milho, soja, canola
Chile
Figura 4. Pases que cultivam plantas geneticamente modicadas e respec-
tivas reas de cultivo.
De acordo com o Servio Internacional para Aquisio de Aplicaes
em Agrobiotecnologia (ISAAA), o Brasil plantou 21,4 milhes de hec-
tares com culturas geneticamente modicadas em 2009, um cresci-
mento de 35,4% em relao a 2008 (equivalente a 5,6 milhes de hec-
tares). Segundo o ISAAA, trata-se do maior ndice de crescimento
entre os 25 pases produtores de transgnicos, especialmente em
razo da rpida adoo do milho geneticamente modicado. Do total
da rea cultivada com transgnicos no Brasil, 16,2 milhes de hecta-
res correspondem soja tolerante a herbicidas, o que equivale a 71%
do total da cultura; 5,0 milhes de hectares correspondem ao milho
Bt em ambas as safras, de vero e inverno, o que corresponde a 31%
do total da cultura; e 0,15 milho de hectares de algodo Bt e tolerante
a herbicida, o que corresponde a 16% do total da cultura.
O melhoramento gentico convencional ou baseado na engenha-
ria gentica um processo contnuo e vibrante com capacidade de
se reinventar, absorvendo novas tcnicas cientcas e metodologias
modernas, na busca do desenvolvimento de cultivares que contribuam
563
para uma agricultura sustentvel combinado produtividade, qualidade
nutricional, adaptao a estresses biticos e abiticos, manejo de solo
e manejo integrado de pragas, entre outros. So vrios os exemplos
de cultivares desenvolvidas, com inmeros benefcios econmicos,
sociais e ambientais.
Perspectivas do melhoramento de plantas
A cada ano surgem novos desaos e demandas para o desenvolvi-
mento de novas cultivares, fazendo com que os programas de melho-
ramento gentico convencional e baseado na engenharia gentica
tenham uma natureza dinmica e importncia estratgica atual
e futura. O grande potencial de uso da biotecnologia moderna no
melhoramento de plantas inegvel. Os resultados obtidos at o pre-
sente momento reetem as contribuies atuais da biotecnologia
moderna e, para o futuro, certamente, novos produtos tecnolgicos
sero gerados.
Vrias oportunidades so citadas para gerao de produtos com o
auxlio da biotecnologia (NAS, National Academy of Sciences, 2010).
Entre elas, o aumento da produtividade de plantas cultivadas, atravs
de maior resistncia e tolerncia a estresses biticos (pragas, doen-
as, ervas daninhas) e estresses abiticos (altas temperaturas, seca,
maior ecincia no uso de nutrientes); aumento do valor nutricional
das plantas, atravs do aumento da concentrao de vitaminas, mine-
rais e protenas em plantas; gerao de plantas biofbricas, para pro-
duo de vacinas e protenas teraputicas; aumento da segurana de
produtos, por intermdio da gerao de plantas com maior durabili-
dade ps-colheita; uso da biotecnologia com o objetivo da preserva-
o da biodiversidade e na conservao dos recursos naturais e pro-
duo de energia renovvel.
Entretanto, necessrio que sejam considerados pontos essen-
ciais para o desenvolvimento de novos produtos como a identica-
o das demandas e prioridades de cada regio e dos diferentes sis-
temas de produo existentes, tendo em vista que eles so diversos
entre regies e mesmo dentro de uma regio. James (2009) cita como
fator importante o fornecimento de tecnologias relevantes para satis-
fazer as necessidades de pases em desenvolvimento na sia, Amrica
564
Latina e frica. Tambm devem ser considerados fatores relaciona-
dos denio clara dos benecirios dos produtos a serem gerados
e o impacto que os mesmos iro causar e as questes de protocolos de
testes de campo necessrios para novos eventos tendo em vista as dife-
renas ambientais, por exemplo, as regies temperadas e as regies
tropicais (PERSLEY, 1999). Da mesma forma, devem ser considera-
dos os protocolos para regulao e liberao de novos produtos e o
engajamento da indstria de processamento e do consumidor, consi-
derando que o sucesso de novos produtos geneticamente modicados
tambm depende da aceitao por parte do consumidor.
Consideraes finais
inquestionvel a grande importncia do melhoramento gentico
vegetal para a humanidade. So inmeros os exemplos de sucesso no
desenvolvimento de cultivares de plantas melhoradas geneticamente
que trouxeram grandes benefcios para o agronegcio, garantindo a
sustentabilidade econmica e ambiental da agricultura. Os exemplos
vo desde as primeiras atividades de domesticao de gentipos selva-
gens, passando pelas inmeras cultivares desenvolvidas pelo melho-
ramento clssico, at o uso de tecnologias avanadas de engenharia
gentica para o desenvolvimento de novas cultivares. Certamente,
essas tecnologias modernas podem beneciar diferentes culturas e
programas de melhoramento gentico em algumas situaes, em
que o melhorista teria diculdades utilizando apenas metodologias
convencionais de melhoramento. Logicamente, as novas tecnologias
como ferramentas auxiliares ao melhoramento gentico nunca iro
substituir as prticas essenciais do melhoramento como a avaliao
fenotpica das plantas contabilizando os efeitos ambientais e das inte-
raes gentipo x ambiente.
Referncias
BERNARDO, R. Breeding for quantitative traits in plants. Stemma Press:
Minneapolis, MN, 2002. 369 p.
BORM, A. Melhoramento de plantas. 2. ed. Viosa: Editora UFV, 1998, 453 p.
565
BORM A; Milach S. C. K. Melhoramento de plantas: o melhoramento de plantas
na virada do milnio. Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento, v. 7, p. 68-72.
1999.
BORLAUG, N. E. A Green Revolution yields a golden harvest. Columbia Journal of
World Business, p. 9-19, 1969.
DUVICK, D. N. Genetic enhancement and plant breeding. In: JANICK, J.; SIMON,
J. E. (Ed.). Advances in new crops. Portland :Timber Press, 1990. p. 90-96.
FALEIRO, F. G.; JUNQUEIRA M. T. V.; FAVERO, A. P.; LOPES, M. A.
Pr-melhoramento de plantas: experincias de sucesso. In: FALEIRO, F. G.;
FARIAS NETO, A. L.; RIBEIRO JNIOR, W. Q. (Ed.) Pr-melhoramento,
melhoramento e ps-melhoramento: estratgias e desaos. Planaltina, DF:
Embrapa Cerrados, 2008a. p. 45-62.
FALEIRO, F. G.; FARIAS NETO, A. L.; RIBEIRO JNIOR, W. Q.
Planaltina,DF: Embrapa Cerrados, 2008b. 184 p.
FEHR, W. R. Genetic contributions to yield gains of five major crop plants.
Madison : Crop Science Society of America, 1984. 101 p.
recursos naturais. Planaltina,DF: Embrapa Cerrados, 2008. p. 765-792.
JAMES, C. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2008. Ithaca, NY:
ISAAA, 2008. (ISAAA Brief, n. 39).
JAMES, C. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2009. the rst
fourteen years, 1996 to 2009 Ithaca, NY: ISAAA, 2009. (ISAAA Brief, n. 41-2009).
Disponvel em: <http://www.isaaa.org/resources/publications/briefs/41/
executivesummary/default.asp.> Acesso em: 02 ago 2009
NAS, National Academy of Sciences. Global Challenges and Directions for
Agricultural Biotechnology: Workshop Report Disponvel em: <http://www.nap.
edu/catalog/12216.html>. 74 p. Acesso em: 02 ago 2010.
NASS, L. L.; PATERNIANI, E. Pre-breeding: a link between genetic resources and
maize breeding. Scientia Agricola, v. 57, p.581-587, 2000.
PERSLEY, G. L. Agricultural Biotechnology and the Poor: Promethean Science.
1999. Disponvel em:< http://www.cgiar.org/biotech/rep0100/persley.pdf>. Acesso
em: 02 ago. 2010.
RAMALHO, M. P. Genetic Improvement and agribusiness in Brazil. Crop
breeding and applied biotechnology, v. 4, p. 127-134, 2004.
566
RIBEIRO JNIOR, W. Q., MORAES, A. F.; RAMOS, M. L. G.; AMABILE, R.
F.; SCHEEREN, P. L.; CAIERO, E. Objetivos e estratgias de melhoramento
de plantas em projetos de pesquisa. In: FALEIRO, F.G.; FARIAS NETO,
A.L.; RIBEIRO JNIOR, W. Q. (Ed.) Pr-melhoramento, melhoramento e
ps-melhoramento: estratgias e desaos. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados,
2008. p. 93-106.
RIBEIRO JNIOR, W. Q.; RAMOS, M. L. G.; VASCONCELOS, U.;
TRINDADE, M. da G.; FERREIRA, F. M.; SIQUEIRA, M. M. H.; SILVA, H. L.
M. da; RODRIGUES, G. C.; GUERRA, A. F.; ROCHA, O. C.; AMBILE, R. F.;
ALBUQUERQUE, A. C.; S E SILVA, M.; ALBRECHT, J. C.; DURES, F. O. M.
Fenotipagem para tolerncia seca visando o melhoramento gentico do trigo no
cerrado. Passo Fundo: Embrapa Trigo, 2006. 24 p. (Embrapa Trigo. Circular tcnica
Online, 21). Disponvel em: <http://www.cnpt.embrapa.br/biblio/ci/p_ci21.htm>.
Acesso em: 02 ago. 2010
SCHLEGEL, R. H. J. Encyclopedic dictionary of plant breeding and related
subjects. New York: Haworth Press , 2003. 177 p.
SOUZA, P. I. M.; SILVA, S. A.; MOREIRA, C. T.; FARIAS NETO, A. L.; SILVA,
N. S.; TOLEDO, J. F. F.; ARANTES, N. E. O programa de melhoramento gentico
da soja transgnica para o Cerrado. In: FALEIRO, F. G.; ANDRADE, S. R. M.
Biotecnologia, transgnicos e biossegurana. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados,
2009. p. 169-183.
BORM, A. Melhoramento de plantas. 2. ed. Viosa: Editora UFV, 1998, 453 p.
FALEIRO, F. G.; FARIAS NETO, A. L.; RIBEIRO JNIOR, W. Q.
Planaltina,DF: Embrapa Cerrados, 2008. 184 p.
SASSON, A. Plant and agricultural biotechnology: achievements, prospects and
perceptions. Monterrey, UNU-IAS/ Coordination of Science and Technology of the
State of Nuevo Len, 2006, 444 p.
569
Anlise genmica aplicada
a produo animal
Introduo
O genoma bovino consiste de 30 pares cromossmicos homlogos,
dos quais 29 so autossmicos e 1 sexual. O genoma de machos
heterogamtico XY e o de fmeas homogamtico XX, com aproxi-
madamente 3.000 cM no total. Os cromossomos so classicados de
acordo com a posio do centrmero como metacntricos, submeta-
cntricos ou acrocntricos, e numerados segundo o tamanho. O seg-
mento curto do cromossomo denominado p e o longo q. Por
meio de colorao com Ginsa, possvel visualizar os cromossomos
com um padro de bandas caracterstico, que so ento numerados
(Banda-G). Um determinado loci em um cromossomo pode ser loca-
lizado no genoma pelo nmero do cromossomo, o segmento (p ou q)
e nmero da banda-G (FRIES et al., 1993) (Figura 1). Dessa forma, o
gene do hormnio do crescimento est localizado no 19q17, o gene da
Beta-lactoglobulina no 11q28 e o da kapa-casena no 6q26.
A partir da dcada de 1980, a genmica bovina progrediu de mapea-
mento sintnico de genes codicadores de protenas ao sequencia-
mento completo do genoma. O genoma bovino serve como um prot-
tipo para estudos em outros bovdeos como cabras, ovelhas e bfalos,
que possuem os genomas altamente conservados em nvel citoge-
ntico (WOMACK, 2006; DALRYMPLE, 2006), e ainda mais impor-
tante para o entendimento da evoluo e funcionamento dos geno-
mas de mamferos, especialmente o humano (GIBBS et al., 2002;
ADELSON, 2008).
570
Figura 1. Caritipo de bovinos. Fotograa dos cromossomos colorados com
Ginsa. So 60 cromossomos, metade herdado do pai e metade da me. Os cro-
mossomos so arranjados em pares (um de cada progenitor), 1 a 29 e os X e Y.
Fonte: Adaptado de Kayser, 2001.
Para tanto, o genoma bovino foi sequenciado, possuindo, em 2009,
uma cobertura de aproximadamente 7,5X, objetivando melhorar a
compreenso da biologia e a evoluo dos mamferos. Ele possui um
total de aproximadamente 2,86 x10
9
pares de base, pelo menos 22.000
genes, sendo 14.345 ortlogos em sete espcies de mamferos, dos
quais 1.217 esto ausentes em genomas de no-Euterianos (marsupial
ou monotremata). Alteraes cromossmicas especcas de bovinos
como duplicaes e enriquecimento com elementos repetitivos, assim
como SNPs espcie-especcos, podem ser encontrados em maior
densidade em genes relacionados lactao e ao sistema imune.
Genes envolvidos com metabolismo so geralmente mais conserva-
dos, apesar de que cinco genes metablicos ortlogos a humanos esto
ausentes ou divergiram signicativamente (ADELSON, 2008; BURT,
2009; CONNELLY et al., 2009; ELSIK et al., 2009; LEMAY et al., 2009;
LIU et al., 2009; TELLAM et al. 2009; ZIMIN et al., 2009) (Figura 2).
571
Captulo 19 Anlise genmica aplicada a produo animal
Placentrios
Marsupiais
Monotremados
Bovinos
Co
Cavalo
Morcego
Camundongo
Rato
Humanos
Preguia
Elefante
Gamb
Ornitorrinco
Cangur
Figura 2. rvore Filogentica simplicada ilustrando espcies de mamfe-
ros existentes. Estimativas em milhes de anos atrs (MYA). As duas sepa-
raes iniciais estabeleceram os monotrematas (166.2 MYA), e marsupiais
e placentrios (147.7 MYA). Por aproximadamente 50 milhes no foi origi-
nado nenhum grupo com descendentes vivos, ento as quatro superordens
de mamferos surgiram em somente 2,4 milhes de anos.
Neste captulo, sero abordados os recentes avanos das anlises
genmicas no entendimento da evoluo e funcionamento do genoma
bovino e suas aplicaes ligadas ao aumento da produo animal com
nfase no melhoramento gentico. A utilizao de anlises genmicas
na seleo assistida e em estudos logenticos e populacionais com
implicaes na conservao e manejo de recursos genticos tambm
ser discutida.
Sequenciamento genmico
Com o incio do projeto genoma humano, no incio dos anos 1990,
as sequncias do DNA do genoma humano e de diversas espcies
experimentais foram determinadas. Desde ento, os projetos de
sequenciamento incluram tambm animais domsticos de impor-
572
tncia para a agropecuria. O genoma de galinha foi completado em
2004 (WALLIS et al., 2004), o de bovinos em 2006 (GAO et al., 2007),
e o de sunos est em progresso (Tabela 1).
Tabela 1. Status dos projetos genomas de animais domsticos at 2007.
Espcie
Mapa Gentico
Projeto
BAC FPC
Mapa RH Seq. Genmica ESTs UniGene
Marcadores
Nome do
Mapa
Galinha 2110 WUR, NCBI
Cobertura
de 20X
ChickRH6 6.6X 625.790 33.713
Porco 1283
USDA-MARC,
NCBI
Cobertura
de 15,3X
INRA-UMN,
UNR, UIUC
Desenvolvimento 887.593 38.782
Vaca 3925
USDA-MARC,
NCBI
6604
contigs
SUNbRH,
TXAM_RH,
COMRAD
7.7X 1.506.587 41.891
Ovelha 1411
Sheepmap4.7,
NCBI
Cobertura
de 5,4X
USUoRH500 Planejamento 187.701 12.142
Pato 155 CAU NA Planejamento NA 2.990 NA
Coelho 745 INRA NA NA NA 49.300 6.413
Fonte: Adaptado de Hu et al., 2009. http://www.ncbi.nlm.gov/Genomes/
A primeira verso da sequncia do genoma bovino foi publicada
em banco de dados pblico em 2004. A segunda verso, Btau_2.0,
com uma cobertura de 6,2X, foi gerada pela montagem de sequn-
cias ShotGun. Em 2006, a terceira verso Btau_3.1, com cobertura
7,15X montado a partir da combinao de sequncias geradas por
ShotGun e Bac library, foi publicado pela NCBI (http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/genome/guide/cow/) (GAO et al., 2007).
A sequncia do genoma bovino est disponvel ao pblico on line no
web site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/cow/, http://
www.ensembl.org/Bos_taurus/index.html, http://genome.ucsc.edu/
e http://bovinegenome.org/, onde est conectada a banco de dados
com informaes relacionadas estrutura dos genes (localizao,
regies codicadoras e regulatrias) e funo (bioqumica, biolgica,
regulatria e interaes com outros genes) (Gene Ontology GO),
QTL para as diferentes caractersticas, famlias de protenas, o mapa
integrado e outros recursos.
573
A ltima montagem Btau_3.1 possui 2,87 10x
9
pb gerados a partir
de 26 milhes de sequncias shotgun e BAClibrary. Mais do que
1 milho de Expressed Sequence Tags (ESTs) podem ser posiciona-
dos no genoma, o que indica a qualidade da montagem. No web site
citada anteriormente, esto descritos aproximadamente 23.800 genes
e 24.800 modelos gnicos (WHEELER et al., 2007) e podem ser visu-
alizados no site http://bovinegenome.org/. Caractersticas adicionais
e anotaes (GENE ONTOLOGY CONSORTIUM, 2006) associadas
sequncia de DNA, transcritos no-codicadores, famlias de pro-
tenas, ESTs, regies repetitivas, polimorsmos e QTL tambm esto
disponveis (Figura 3) (GENE ONTOLOGY CONSORTIUM, 2006;
UNIPROT CONSORTIUM, 2007; ADELSON, 2008).
A informao gerada pelos projetos genomas (sequncia completa
de DNA do genoma de diferentes indivduos das diversas espcies)
pode agora ser mais bem utilizada em investigao cientca em gen-
tica/genmica com a disponibilidade, em abundncia, de sequncia
de DNA, anotao estrutural e funcional, mapas de SNPs (polimor-
smos pontuais de DNA) (SNPs chip) e sondas de oligonucleotdeos
(expresso gnica, microarray), respectivamente, para se melhorar o
entendimento da contribuio dos componentes genticos, ambien-
tais e suas interaes na determinao das caractersticas de herana
complexa (Figura 4). A genmica aplicada ao melhoramento gentico
permitir avaliar o efeito da seleo natural e articial sobre as popu-
laes de animais domsticos, inferir a variabilidade gentica entre
indivduos ou raas, com implicaes sobre o controle de endogamia
e conservao de diversidade gentica, diagnstico e controle de doen-
as genticas, assim como obter ganho gentico superior por seleo
auxiliada por marcadores (Figura 5).
574
Figura 3. Informaes disponveis para uma regio de 1x10
6
pb do cromos-
somo bovino 1. Vrios recursos e anotaes so visveis, inclusive mode-
los de gene, regies repetitivas, polimorsmos de nucleotdeo nico (SNP),
sequence tagged sites (STS) (principalmente microssatlites) e de loci de
caractersticas quantitativas (QTL). Outros recursos no esto exibidos
ara melhor visualizao. Note que variantes splicing de expressed sequence
tags ESTs so altamente informativos ao se decidir qual modelo gnico uti-
lizar para continuao do estudo.
Fonte: Adaptado de Adelson, 2008.
575
Figura 4. Anlise genmica aplicada a produo animal .
Genmica para melhoristas
Avaliao da variabilidade gentica entre indivduos, raas ou espcies
(controle de endogamia e conservao de diversidade).
Estudos evolucionrios (taxonomia, seleo natural e artificial).
Controle de pedigree, teste de paternidade
(Matriz de ParentescoBLUP).
Diagnstico e controle de doenas genticas.
Ganho gentico superior por GAS, MAS e GS.
Figura 5. Aplicaes da genmica para melhoristas.
Mapas de SNPs, Expresso Gnica e QTL
Em razo da frequncia e importncia dos SNPs, a segunda fase
do projeto genoma bovino o projeto HapMap (KAPPES et al., 2006).
Esse projeto tem por objetivo a identicao de centenas de milha-
res de SNPs, a partir dos quais podem ser selecionados aproximada-
576
mente 60.000 SNPs para desenvolvimento de plataformas de geno-
tipagem de alta escala. At o presente, existem aproximadamente
1.728.285 SNPs no genoma bovino. O projeto HapMap bovino vem
validando uma coleo de SNPs para propsitos de genotipagem, de
maneira que a disponibilidade de marcadores no mais uma limi-
tao. Apesar dos custos ainda serem elevados e da ausncia de con-
senso a respeito do nmero de indivduos necessrios para estudos
de associao (WANG et al., 2005), essa tecnologia j se mostrou e-
ciente em mapear diversas caractersticas em humanos (BILLARS
et al., 2007; GARCIA-CLOSAS et al., 2007; GUDBJARTSSON
et al., 2007; GUDMUNDSSON et al., 2007; HELGADOTTIR et al.,
2007; LIU et al., 2007; SCHYMICK et al., 2007; STEER et al., 2007;
STEINTHORSDOTTIR et al., 2007), sugerindo sua aplicabilidade
para outras espcies.
Um microarray Illumina BovineSNP50 Beadchip foi desenvol-
vido e avaliado por Wiggans et al. (2009) contendo aproximadamente
57.000 SNPs. Aps genotipagem de 12.591 touros e vacas, diversos
SNPs foram excludos por serem monomrcos (6.572), problemas de
genotipagem (3.213), frequncia allica inferior a 2% (3.649) e outros
660 por diversas razes, restando 40.874 SNPs. Aps vericao de
parentesco entre diversos indivduos, e o compartilhamento de ale-
los, a concordncia estimada atingiu 99,96% a 100% dos gentipos.
A acurcia obtida para as genotipagens com o microarray Illumina
BeadChip fornece a base para avaliaes genmicas como estudos
de associao com caractersticas de importncia econmica em gado
de corte e leite (WIGGANS et al., 2009).
Apesar de experimentos visando caracterizar a expresso gnica
empregando microarrays de cDNA e oligonucleotdeos de primeira
gerao terem sido conduzidos (SMITH et al., 2005; CORCORAN
et al., 2006; EL-SAYED et al., 2006; SOMERS et al., 2006), a dispo-
nibilidade de microarrays mais abrangentes e melhor anotados cer-
tamente prover informao adicional para se entender o programa
normal de controle da expresso gnica durante o desenvolvimento
embrionrio de bovinos. Alm dos impactos esperados na agricultura,
como clonagem, produo e transferncia de embries e seleo auxi-
liada por marcadores (MAS), tambm aumentar o valor de bovinos
577
e ovinos como modelos biomdicos para desenvolvimento, uma vez
que estes fornecero estrutura conceitual para a construo de redes
regulatrias de expresso gnica, que so bastante conservados entre
mamferos (ADELSON, 2008; BURT, 2009; ELSIK et al., 2009; LEMAY
et al., 2009; LIU et al., 2009; TELLAM et al., 2009; ZIMIN et al., 2009).
Mapeamento gentico
Quando diferentes genes esto localizados prximos no mesmo
cromossomo, diz-se que esses loci esto em ligao. O processo da
recombinao ou permuta, que ocorre durante a meiose, respons-
vel pela troca de segmentos cromossmicos entre homlogos. A fre-
quncia de recombinao proporcional distncia entre os loci. As
distncias so medidas em funo da frequncia de recombinao na
prognie e expressas em centiMorgan (cM). Um centiMorgan equi-
vale a aproximadamente 10
6
pares de base (EMERY; MALCON, 1995).
O mapa gentico construdo a partir da frequncia de recombina-
o gnica na prognie (FRIES, 1993) estimada por meio da anlise de
segregao de polimorsmos genticos em famlias informativas, em
que um parental heterozigoto para os dois loci (populao refern-
cia) (WELLER et al., 1990) (Figura 6). O mapeamento gentico tam-
bm pode ser efetuado pela anlise de espermatozoides, avaliando a
frequncia de recombinao diretamente nos gametas, com impacto,
especialmente, em espcies que possuem intervalo entre geraes
muito longo ou outras restries gerao de famlias estruturadas
(ARNHEIN et al., 1994).
578
- m3
m5
m9
m11
m14
- M1
- M2
- M4
- M6
- M7
- M8
- M10
- M12
- M13
- M15
- M3
M5
M9
M11
M14
- m1
- m2
- m4
- m6
- m7
- m8
- m10
- m12
- m13
- m15
Linhagem M
F1
M1M1
M2M2 X
m1m1
m2m2
M1m1
M2m2
Gametas M1M2 parental
M1m2 recombinante
M1M2 recombinante
m1m2 parental
F1
F2
Parental
Linhagem m
Distncias genticas estimadas
a partir das taxas de recombinao
entre marcadores.
Quanto maior a distncia maior a
taxa de recombinao.
Figura 6. Anlise de ligao entre marcadores (Mapa Gentico).
Um mapa gentico ilustra a ordem dos genes ou marcadores gen-
ticos em um cromossomo, assim como a distncia relativa entre os
mesmos. Esse mapa consiste de marcadores altamente polimrcos,
distantes, no mximo, 40 cM um do outro, de modo que qualquer
locus possua uma distncia inferior a 20 , cm do marcador (LANDER;
BOTSTEIN, 1989). Trs marcadores por cromossomo (90 marcado-
res no total) seria um nmero inicial suciente para cobrir, com baixa
densidade, todo o genoma bovino (FRIES et al., 1989).
Uma vez que a localizao um locus em um mapa gentico depende
da segregao de marcadores, os mapas genticos possuem preponde-
rncia de marcadores polimrcos, e foram inicialmente construdos
primariamente com marcadores microssatlites. Os Microssatlites
apresentam, em geral, ampla distribuio e frequncia no genoma,
alto nvel de polimorsmo, alm da facilidade de deteco atravs de
PCR. Essas caractersticas zeram dos microssatlites os marca-
dores escolhidos para construo de mapas de ligao (LITT; LUTY,
1989; TAUTZ, 1989; WEBER; MAY, 1989; BECKMANN; SOLLER,
1990; LUTY et al.,1990).
O contedo de polimorsmo informativo, conhecido por PIC para
um determinado marcador, refere-se poro da prognie em que
possvel determinar exatamente a transmisso dos alelos parentais.
579
O PIC dependente no nmero de alelos por locus e das frequncias
dos alelos (BOTSTEIN et al., 1980). O polimorsmo encontrado em
populaes endogmicas geralmente menor do que em populaes
no endogmicas (COWAN et al., 1990). Entretanto, a variao encon-
trada em diversas raas bovinas suciente para o mapeamento gen-
tico (SOLLER, 1990; GEORGES; MASSEY, 1991).
O primeiro mapa gentico publicado para animais domsticos foi o
de galinha (Gallus gallus) (BUMSTEAD; PALYGA, 1992; GROENEN
et al., 1998, 2000), e posteriormente para diversas espcies como de
bovinos (Bos taurus) por Bishop et al. (1994) com 306 marcadores
genticos, dos quais 290 microssatlites, e Barendse et al. (1994) com
mais de 200 loci descritos, cobrindo praticamente todo o genoma;
sunos (Sus scrofa) (ROHRER et al., 1994; ROHRER et al., 1996); ovi-
nos (Ovis aries) (CRAWFORD et al., 1995; MAURCIO et al., 1998;
MADDOX et al., 2001); caprinos (Capra hircus) (VAIMAN et al., 1996);
coelhos (CHANTRY-DARMON et al., 2006) e patos (Anas platyrhyn-
chos) (HUANG et al., 2006).
Em virtude dos avanos obtidos em genmica e automatizao,
mapas genticos de alta densidade esto disponveis para diversas
espcies. A disponibilidade de mapas genticos pode fornecer infor-
maes importantes a respeito da organizao e localizao de genes
clonados, assim como estrutura para identicao de regies cromos-
smicas que interferem em caractersticas de importncia econmica
QTL (CRITTENDEN et al., 1993).
Identificao de loci que influenciam
caractersticas quantitativas QTL
Caractersticas quantitativas so aquelas sob controle polignico,
e frequentemente apresentam variao fenotpica entre e dentro de
populaes. Essas caractersticas so determinadas por vrios genes,
assim como fatores ambientais, sendo que cada gene contribui com
uma pequena poro da variao gentica (FALCONER; MACKAY,
1996).
O principal objetivo da aplicao da gentica molecular ao melho-
ramento gentico animal consiste em identicar e mapear os genes
580
que interferem na expresso de caractersticas quantitativas de impor-
tncia econmica, visando melhorar a compreenso do controle gen-
tico de caractersticas complexas como desenvolvimento ponderal,
idade ao primeiro parto, ganho de peso ps-desmama, rendimento e
qualidade de carcaa, resistncia a doenas, adaptao e longevidade.
Os dois principais procedimentos utilizados com o propsito de
mapeamento de polimorsmos genticos associados variao feno-
tpica em caractersticas quantitativas so o do Gene Candidato ou do
Scan Genmico, com base em mapa gentico ou ligao (SCHWERIN
et al., 1995, ANDERSSON, 2001; HU et al., 2009). Os resultados obti-
dos das pesquisas em genmica e mapeamento de QTL foram com-
pilados por Rocha et al. (2002) e Khatkar et al. (2004) para bovinos;
Rothschild (2003, 2004), Buske et al. (2006), Chen et al. (2007) e Otto
et al. (2007) para sunos; e Abasht et al. (2006) e De Koning et al. (2007)
para galinhas.
Abordagem do gene candidato
O procedimento do gene candidato refere-se ao estudo da relao
entre polimorsmos em genes relacionados a protenas-chave de vias
metablicas de importantes processos siolgicos e diferenas no
desempenho animal, visando gerao de marcadores tipo I, ou seja,
polimorsmos determinantes de variao fenotpica (ANDERSSON,
2001) (Figura 7). A implementao da abordagem do gene candi-
dato consiste nas seguintes fases: (1) coleta ou gerao de populao
referncia; (2) coleta de dados fenotpicos de interesse; (3) seleo de
genes candidatos; (4) genotipagem dos animais e (5) anlise dos dados
fenotpicos e genotpicos (KADARMIDEEN et al., 2006). Apesar do
progresso alcanado pelo uso dessa abordagem (MACLENNAN et al.,
1990; TAYLOR et al., 1998; LIU; LAMONT, 2003; WANG et al., 2005;
GUYONNET-DUPERAT et al., 2006), suas limitaes so evidentes.
581
Abordagens para desenvolvimento de ferramentas para MAS
Genes candidatos
para bovinos
Polimofismos genticos
causativos de variao
Crescimento - Eixo Hipotalmico-hipofisrio do hormnio do crescimento
(GH, RGH, SST, IGF-1, IGF-1R, IGF-2 e PIT1).
Qualidade de carcaa - GH, Esterides, Calpaina, Calpastatina e Miostatina,
Tiroglobulina, Leptina (Gene Star Quality Gradee Tenderness, Igenity Tender Gene).
Produo de leite Ccomponentes - GH, KpCn, B-LGB, Albumina, DGAT.
Fertilidade - GnRH, FSH, LH, ESR, PRL, PRLR, PMSG, Leptina.
Doenas genticas - BLAD, Dumps, Citrulinemia, Weaver...
Doenas infecciosas - MHC (Bola), Imunoglobulinas.
Figura 7. Genes candidatos para bovinos.
Essa abordagem requer conhecimento da siologia da caracters-
tica de interesse, que pode no estar disponvel ou estar incompleto
na maioria das vezes. Em geral, existem diversos genes candidatos
para todas as caractersticas quantitativas, e pode ser difcil a seleo
dos candidatos para estudos. Alm disso, genes que no so parte de
importantes processos siolgicos conhecidos podem ter efeito sig-
nicativo sobre a expresso das caractersticas. Por outro lado, a abor-
dagem do gene candidato eciente somente quando ele apresenta a
variao gentica causativa de variao fenotpica. Os resultados devem
ser interpretados com cautela, uma vez que associaes signicativas
podem ser obtidas por desequilbrio de ligao Linkage disequili-
brium (LD) com genes causativos adjacentes (ANDERSSON, 2001).
Antes da disponibilidade da sequncia completa do genoma das
diversas espcies, genes candidatos eram selecionados por Anlise
Comparativa entre espcies, com srias limitaes, as quais se acen-
tuam quanto maior a distncia logentica entre as mesmas. Com a
disponibilizao de informao genmica, especialmente mapas de
SNPs, muitas dessas limitaes sero suplantadas (HU et al., 2009).
Desenvolvimento ponderal e qualidade da carne
O desenvolvimento ponderal, a ecincia alimentar, a maciez da
carne e a marmorizao so algumas das principais caractersticas
582
avaliadas. Os avanos da Gentica Molecular permitem avaliar com
maior profundidade os genes e sistemas genticos envolvidos nas
vias metablicas relacionadas ao crescimento animal e repartio de
nutrientes para os diferentes tecidos (SCHWERIN et al., 1995).
Os animais com hipertroa muscular (musculatura dupla) apre-
sentam baixo contedo de gordura na carcaa e elevao da ecin-
cia alimentar. Essa caracterstica determinada por um locus autos-
smico com herana parcialmente recessiva (HANSET; MICHAUX,
1985). Georges et al. (1988) identificaram uma banda de DNA
Fingerprinting correlacionada com o fentipo da hipertroa.
O hormnio do crescimento GH, por intermdio do IGF-I, desem-
penha importante funo na regulao do crescimento (SCHLEE
et al., 1994). O gene PIT-I codica para fator ativador da pituitria
necessrio para secreo do GH. A somatostatina, potente inibidor
do GH, tambm pode ser considerada um gene candidato (THUE;
SCHMUTZ, 1994). Os genes Kapa-casena, Beta-lactoglobulina so
expressos nos leite, podendo afetar o potencial de produo de leite,
expresso como habilidade materna em gado de corte, alm de carac-
tersticas organolpticas do queijo (MOODY et al., 1996).
Beever et al. (1990) avaliaram o efeito de grupos sanguneos B, C e F,
transferrina srica e protena carreadora de vitamina D, alm de mar-
cadores genticos antgeno leucocitrio bovino -A BoLA-A em carac-
tersticas de carcaa (n=146) na raa Aberdeen Angus. Efeitos signi-
cativos entre grupo sanguneo B e peso ajustado para 205 dias, aos 365
dias, ganho dirio pr-desmama e espessura da camada de gordura,
alm de Bola e rea de olho de lombo, foram obtidos pelos autores.
O efeito dos genes GH, hormnio paratireoidiano, prolactina, oste-
onectina e keratina foram avaliados em caractersticas de desempe-
nho ponderal e conformao em 677 animais puros e cruzados entre
as raas Aberdeen Angus, Brahman, Hereford, Holands e Jersey. Os
resultados evidenciaram uma associao entre alelos B, C e D do GH
e decrscimo do peso ao nascimento de 1,0 desvios-padro nas raas
Brahman, cruzados Angus-Brahman e Brahman-Hereford e associa-
es signicativas entre hormnio paratireoidiano e peso a desmama
e tamanho corporal. Os autores sugerem que outros estudos deve-
riam ser conduzidos com um nmero maior de animais para validar
os resultados.
583
Associaes entre polimorfismos dos genes Kapa-casena,
Beta-lactoglobulina, GH, receptor do GH, PIT-I, IGF-I e prolactina
PRL com caractersticas de crescimento e habilidade materna em
bovinos da raa Hereford foram avaliadas por Moody et al. (1996).
Os resultados obtidos indicaram efeito da K-casena no peso ao nas-
cimento e ganho de peso pr-desmama, representando 15% e 8% da
variao total para essas caractersticas respectivamente.
A qualidade da carne inuenciada por diversos fatores genti-
cos e ambientais, alm da idade e sexo do animal e processamento
post-mortem. A maturao do msculo em carne ocorre por ao de
sistemas enzimticos proteolticos. A enzima calpana afeta a prote-
lise post-mortem determinando aumento na maciez nal da carne.
A regulao da atividade da protease calpana efetuada pelo inibi-
dor de protease calpastatina, protena endgena que coexiste em todas
as clulas, congurando outro gene candidato para qualidade de car-
caa. O efeito de polimorsmos do gene calpastatina sobre fora de
cisalhamento foi avaliado por Green et al. (1994), o que gerou resul-
tados signicativos.
Produo e qualidade do leite
As casenas principais protenas do leite , albuminas, lactoglobu-
linas e tambm protenas sricas so consideradas genes candidatos
para produo de leite, seus componentes e, consequentemente, tam-
bm para caractersticas de habilidade materna como peso desmama.
A casena dos bovinos subdividida em quatro grupos: Alfa,
Beta1, Beta2 e Kapa- casenas (FLORES; RICHARDSON, 1988). A
Kapa-casena responsvel pela estabilidade dos micelos, importante
determinante das propriedades organolpticas dos produtos lcteos
(KEMENES, 1996). O alelo B da Kapa-casena est relacionado a ren-
dimento e qualidade do queijo, provavelmente como resultado de
maior velocidade de coagulao produzindo cogulos mais rmes e
evitando perda de gordura (RAMPILLI et al., 1988). Est associado
maior concentrao de protena e reduo na produo total de leite
(BOVENHUIS et al., 1992). Os alelos A e B possuem frequncia 0,92 e
0,08, respectivamente, na raa Nelore (KEMENES, 1996; DEL LAMA,
1996).
584
A Beta-lactoglobulina representa outra fonte de aminocidos para
os lactantes, possuindo dois alelos principais (A e B) (KEMENES,
1996). Efeitos positivos do gentipo BB na concentrao de gordura
e negativos na concentrao de protena e quantidade total de leite
foram encontradas por Bovenhuis et al. (1992). Esses autores demons-
traram que o alelo B est associado a uma maior concentrao de
Kapa-casena. Kemenes (1996) e Del Lama (1996) encontraram as fre-
quncias semelhantes tambm para Beta-lactoglobulina, 0,33 para o
alelo 1 (A) e 0,77 para o 2 (B) na raa Nelore.
Os resultados encontrados na literatura nem sempre so consisten-
tes, podendo ser contraditrios. Efeito signicativo na produo de
leite, protena e gordura somente para interao entre os loci em gado
holands de Israel foi observado por Ron et al. (1993). Velmala et al.
(1995) no encontraram associao signicativa entre hapltipos de
casena com nenhuma caracterstica de produo.
O efeito de substituio do polimorsmo obtido por restrio do
gene GH com a enzima de restrio Alu I em diversas raas de gado
de leite foi estudado por Lucy et al. (1993). Os resultados indicaram
indicao de superioridade do gentipo LL na produo de leite em
gado Holands, entretanto, na raa Jersey, o gentipo VV estava asso-
ciado a uma maior produo. Schlee et al. (1994) encontraram frequ-
ncia 0,8 e 0,71 do alelo L (leucina) em gado Holands e Simental res-
pectivamente. Frequncias de 1,0, 0,93, 0,92 e 0,56 foram obtidas em
Pardo-Susso, Holands, Guernsey e Jersey respectivamente (LUCY
et al., 1993).
Polimorsmo de conformao de ta simples SSCP foi utilizada
para identicar variantes do GH encontrados em animais da raa
Holandesa criada em Israel, alm de animais de diversas raas zebu-
nas e taurinas, e testar associaes com produo de leite e seus com-
ponentes (LAGSIEL et al., 1996). Um dos hapltipos encontrados, de
origem zebuna, apresentou efeito signicativo na concentrao de
protena.
O gene DGAT1 (acylCoA:diacylglycerol Oacyltransferase) codi-
ca uma enzima cataltica responsvel pela produo de triglicer-
dios. Seu potencial como gene candidato cou evidente em estudos
com camundongos decientes (Knockout) nas duas cpias do gene
585
DGAT1 (SMITH et al., 2000). DGAT1 foi recentemente identicado
em um QTL para produo de leite em bovinos, e diversas mutaes
j foram identicadas em diferentes posies do gene, sendo que a
substituio, lisina/alanina na posio 232 da protena (K232A) pos-
sui efeito signicativo na produo e composio do leite (GRISART
et al., 2002). Diversos estudos indicaram forte associao entre K232A
e aumento na porcentagem de gordura do leite e reduo da produo
de leite (WINTER et al., 2002; SPELMAN et al., 2002; HORI-OSHIMA;
BARRERAS-SERRANO, 2003; KOMIZAREK et al., 2004).
Outro gene candidato para produo de leite o gene Pit-1, em
razo de sua funo em mecanismos siolgicos relacionados com
crescimento. Esse responsvel pela regulao da expresso do gene
GH, e sua decincia determina uma reduo da proliferao das
cluas produtoras de GH (MCCORMICK et al., 1990). Uma mutao
(A/G) no exon VI, auterando o stio de restrio da HinfI, foi obser-
vada gerando dois alelos (WOOLLARD et al., 1994). Renaville et al.
(1997) observou associao entre esse polimorsmo e produo de
leite, assim como Hori-Oshima e Barreras-Serrano (2003), que obser-
varam efeito signicativo em produo de leite, alm de iterao com
gentipos de DGAT.
Fertilidade
O melhoramento gentico para fertilidade especialmente impor-
tante em bovinos por possurem baixa prolicidade e alto custo de
manuteno das vacas em relao ao custo total do sistema produ-
tivo. No entanto, o ganho gentico anual esperado menor do que
para caractersticas de desenvolvimento ponderal, rendimento de car-
caa ou produo de leite devido, entre outros fatores, expresso limi-
tada ao sexo, baixa herdabilidade e correlao negativa com outras
caractersticas. A seleo para fertilidade, normalmente, efetuada
objetivando a reduo da idade da vaca ao primeiro parto e intervalo
entre partos, alm de caractersticas conformacionais (tipo), como, por
exemplo, distncia entre squios e bere para vacas e aprumos para
touros, e ausncia de doenas reprodutivas (SCHWERIN et al., 1995).
A abordagem do gene candidato para estudos de fertilidade tem
sido utilizada para identicao de marcadores genticos. Os princi-
586
pais genes selecionados para estudos de associao so os hormnios
do eixo hipotalmico-hiposrio como: hormnio liberador de gona-
dotropinas GnRH, prolactina, fator inibidor da prolactina PIF,
hormnio folculo estimulante FSH, hormnio luteinizante LH,
ocitocina, gonadotrona srica de gua prenhe PMSG, seus respec-
tivos receptores e enzimas das vias de biossntese (HAFEZ, 1988).
Bindon e Piper (1986) descreveram o fentipo conhecido por
Boroola em ovinos associado a um aumento no ndice de fertili-
dade de aproximadamente 20%. Associao entre polimorsmo do
gene receptor de estrognio ESR e tamanho de leitegada foi eviden-
ciado em sunos com efeito de substituio de 0,8-1,0 leites por lei-
tegada (ROTHSCHILD et al., 1994).
A associao entre antgenos do complexo principal de histocompa-
tibilidade MHC e fertilidade de bovinos da Noruega foi estudada por
Mejdell et al. (1994). Os autores obtiveram efeito signicativo de alelos
BoLA-A no aparecimento de cio. Os autores sugerem que esse efeito
devido a desequilbrio de ligao entre MHC e a enzima 21-hidro-
xilase, relacionada com a biossntese de glicocorticoides e mineralo-
corticoides a partir de progesterona.
Doenas hereditrias
A utilizao de tcnicas de biologia molecular est aumentando
o entendimento da contribuio gentica em doenas hereditrias
de diversas espcies de animais. O procedimento do gene candidato
para uma doena tem por objetivo clonar e sequenciar para identi-
car variantes genticas que a determina, e, quando no estiverem dis-
ponveis genes candidatos, as mutaes podem ser mapeadas utili-
zando-se de marcadores como os microssatlites (HOLMES, 1994).
A identicao de animais portadores de doenas genticas possvel
antes da produo de descendentes, evitando assim que o gene dele-
trio seja transmitido s prximas geraes.
Associao entre produo de leite e a doena mieloencefalopatia
degenerativa progressiva Weaver disease, caracterizada em bovinos
da raa Pardo-suio por paresia progressiva dos membros plvicos
e ataxia, foi descrita por Hoeschele e Meinert (1990). Georges et al.
(1994) mapearam esse gene prximo ao microssatlite TGLA-116, o
587
que possibilitar avaliar se essa associao devido pleiotropia ou
ligao gentica.
A decincia na adeso de leuccitos em bovinos BLAD resul-
tado da substituio de uma glicina por um cido asprtico na posio
128 da regio extracelular da Integrina-Beta-2. Pode ser diagnosticada
por meio de PCR-RFLP utilizando iniciadores especcos e enzima
de restrio Taq-I. A frequncia gnica supera os 15%, em popula-
es de gado holands, ocasionando perdas da ordem de 5 milhes
de dlares nos EUA (SHUSTER et al., 1992; HEALY; DENNIS, 1994,
KEHRLI et al., 1994).
A glicogenlise generalizada, conhecida por Pompes disease,
uma doena autossmica recessiva causada por uma insucincia
da enzima Beta-glucosidase cida, levando a um acmulo de glicog-
nio nos tecidos. Essa doena foi citada primeiramente em humanos
e posteriormente em bovinos da raa Brahman por Jolly et al. (1977).
A doena se manifesta, geralmente, ao redor dos 6 meses de idade
com aumento progressivo de fraqueza muscular e falta de coordena-
o e morte ocorrendo aos 9-12 meses (REICHMANN et al., 1994).
Outras doenas hereditrias mapeadas so: (1) Citrulinemia ine-
cincia da argininasuccinato sintetase (DENNIS et al., 1989), mani-
festa-se pelo aumento da concentrao de amnia e diminuio de
arginina no plasma sanguneo ao redor de 24 horas aps o nasci-
mento, com morte at uma semana de vida. A frequncia gnica
observada na raa australiana Friesien foi F(g) = 0,10 (SHANKS
et al., 1995); (2) Deficincia da Uridina Monofosfato Sintetase,
Dumps, descrita por Schwenger et al. (1993), resultado de uma
mutao pontual gerando um cdon terminal; (3) Decincia na
coagulao sangnea devido a uma deleo de 20 pares de base no
gene Fator XI mapeado no cromossomo 17 (OVERTON et al., 1996).
Resistncia a doenas infecciosas
O Complexo Principal de Histocompatibilidade MHC -Major
Histocompatibility Complex, tambm conhecido por Antgenos
Leucocitrios BoLA -Bovine Leukocyte Antigen em bovinos ou por
HLA -Human Leukocyte Antigen em humanos, desempenha impor-
tante papel no sistema imunolgico de vertebrados, incluindo mam-
588
feros, aves, rpteis, anfbios e peixes. Atuam no reconhecimento de
molculas ou microrganismos estranhos ao organismo. A sua funo
se ligar a peptdeos derivados do metabolismo proteico extracelular
e apresent-los aos linfcitos T, desencadeando a resposta imunol-
gica (ANDERSON, 1994).
Os antgenos MHC de bovinos, constitudos por 105 genes conti-
dos em 4.000 Kb, so, geralmente, subdivididos em Classe I, apre-
sentando 45 loci expressos em praticamente todos os tecidos; Classe
II expressos em clulas do sistema imune (macrfagos e clulas B);
Classe III, envolvidos com comunicao intercelular e biossntese de
esteroides; e Classe IV, presente em aves (KAUFMAN et al., 1990).
O polimorsmo nesses loci, aparentemente, deve ser mantido por
seleo balanceada balancing selection, uma vez que so observadas:
(1) frequncias allicas melhor distribudas do que o esperado para
alelos neutros; (2) frequncia relativa de substituies no sinnimas
(com alterao da sequncia de aminocidos da protena) superior s
substituies sinnimas (HUGHES; NEI, 1988, 1989); e (3) tempo de
persistncia dos alelos MHC, excede o esperado para alelos seletiva-
mente neutros (TAKAHATA; NEI, 1990).
O balanceamento das frequncias allicas pode ser determinado
por interaes com patgenos. Dois mecanismos so utilizados por
Andersson (1994) para explicar esse tipo de seleo: (1) sobredomi-
nncia, a frequncia de heterozigotos superior ao esperado; (2) valor
adaptativo dependente das frequncias allicas (vantagem seletiva
inversamente proporcional a frequncia allica populacional); e (3)
acasalamento preferencial, evitando o cruzamento entre indivduos
aparentados.
Andersson (1994) publicou uma reviso sobre polimorsmos de
MHC e associao com resistncia a doenas infecciosas, em que os
hapltipos Classe I esto frequentemente associados a um aumento
na resistncia, e os Classe II a uma maior resposta vacinao.
Associao entre polimorsmo do BoLA-A e valor gentico estimado
para resistncia a mastite e ketose em gado da Noruega foi avaliada
por Mejdell et al. (1994). Associao entre o hapltipo 1 de DRB e mas-
tite por Staphylococcus aureus foi observada por Berryere et al. (1994).
589
Associao entre suscetibilidade a linfocitose persistente e Bola-DRB3
foi apresentada por Xu et al. (1993).
O aumento do valor gentico para resistncia a diversas doenas
simultaneamente, por meio da seleo de alelos especcos MHC,
improvvel, uma vez que a superioridade relativa de um determinado
gentipo varia entre famlias e raas, assim como entre cepas dos pat-
genos. Alm disso, a seleo de determinados alelos poder aumentar
a resistncia a uma doena em particular, podendo acarretar em dimi-
nuio da resistncia para outras, e a perda de diversidade de MHC
necessitaria de milhes de anos para ser restaurada. Esses argumen-
tos demonstram a importncia de se conservar a diversidade do MHC
(ANDERSSON, 1994; MEJDELL et al., 1994). A melhor compreenso
da funo e mecanismos dos BoLA permitir o desenvolvimento de
vacinas mais ecientes (ANDERSSON, 1994).
Associao entre uma banda de 16 Kb do agrupamento gentico da
lisozima e sua atividade enzimtica em bovinos da Noruega foi iden-
ticada por Olsaker et al. (1993). Essa enzima est presente no soro
sanguneo e colostro e possui ao bactericida uma vez que degrada
a camada peptidoglicana da parede celular bacteriana estimulando a
resposta imunolgica (JOLLS; JOLLS, 1984).
Abordagem do scan genmico
No procedimento baseado em mapa gentico, ou de ligao, diver-
sos marcadores moleculares polimrcos (geralmente considera-
dos seletivamente neutros) so empregados para identicar loci que
interferem em caractersticas quantitativas, conhecidos por QTL
(Quantitative Trait Loci), ou ainda Economic Traits Loci (ETL). Em
outras palavras, a abordagem do scan genmico analisa a relao entre
a varincia de uma caracterstica fenotpica e a segregao de mar-
cadores selecionados devido s suas posies ao longo do genoma
(ANDERSSON, 2001) e permitir localizar no mapa gentico loci que
afetam a expresso da caracterstica.
Esses so chamados de marcadores tipo II, ou seja, polimorsmos
em ligao com marcadores tipo I (OBRIEN, 1991). A primeira publi-
cao de mapeamento de QTL utilizando marcadores moleculares dis-
tribudos ao longo de todo o genoma foi publicado por Paterson et al.
590
(1988). Posteriormente, um mapeamento por intervalo para popu-
laes experimentais foi desenvolvido por Lander e Botstein (1989).
A implementao da abordagem do scan genmico consiste nas
seguintes fases: (1) coleta ou gerao de populao referncia; (2)
coleta de dados fenotpicos de interesse; (3) seleo de marcadores;
(4) genotipagem dos animais; (5) construo de mapas de ligao;
e (6) anlise dos dados fenotpicos e genotpicos (KADARMIDEEN
et al., 2006).
Uma populao referncia uma populao gerada para realizao
de investigao cientca com dados fenotpicos e suciente quanti-
dade de DNA para genotipagem. Geralmente so geradas pelo cru-
zamento entre linhagens contrastantes ou por possurem alguma
caracterstica interessante com variao gentica. Alternativamente,
populaes em programas de melhoramento gentico que empregam
inseminao articial em larga escala, como o caso de bovinos leitei-
ros, geram delineamentos experimentais conhecidos por delineamen-
tos de netas e delineamento de lhas (Daughter e Grand-Daughter
designs), interessantes para aproveitar dados fenotpicos na identi-
cao de QTL.
Uma vez que o intercruzamento de linhagens contrastantes o
desenho experimental mais poderoso na identicao de QTL, este
tem sido amplamente utilizado para gerar populaes referncia,
como, por exemplo: sunos Large White e javalis (KNOTT et al., 1998;
JEON et al., 1999; NII et al., 2005, 2006), raas asiticas e europeias
de sunos (JUNGERIUS et al., 2004; STRATIL et al., 2006) e bovi-
nos Angus (Bos taurus) e Brahman (Bos indicus) (JEON et al., 2003).
Mtodos ecientes e robustos que empregam regresso linear ml-
tipla foram desenvolvidos para o mapeamento de QTL em pedigrees
simples ou complexos (HALEY; KNOTT, 1992; HALEY et al., 1994;
VISSCHER et al., 1996; SEATON et al., 2002).
O banco de dados de QTL de animais Animal Quantitative Trait
Loci (QTL) database (AnimalQTLdb) contm toda a informao, dis-
ponvel ao pblico, de animais de importncia agropecuria da ltima
dcada, relacionada a localizao do QTL, marcadores adjacentes, tes-
tes estatsticos, magnitude de efeito do QTL e caractersticas associa-
das. At maio de 2007, havia 846 QTLs de 55 publicaes represen-
591
tando 91 diferentes caractersticas de bovinos (Tabela 2), 1.675 QTL
de 110 publicaes representando 281 diferentes caractersticas de
sunos e 657 QTL de 45 publicaes sobre 112 diferentes caractersti-
cas de galinha (http://www.animalgenome.org/QTLdb/) (HU et al.,
2007). Uma observao interessante que QTL identicados para por-
centagem de gordura no leite em bovinos leiteiros esto localizados
nas mesmas regies que os QTL identicados para gordura corporal
em bovinos de corte (Figura 8). Isso no de forma alguma inespe-
rado, e acentua a ideia de que a arquitetura gentica controla a expres-
so das caractersticas e interfere em diversos processos siolgicos.
Tabela 2. Nmero de QTL para algumas caractersticas de bovinos.
Caracterstica QTL Caracterstica QTL
Score de marmoreio 33 Peso vivo 9
Rendimento em carne 16 Gordura ajustada 4
Peso da carcaa quente 23 Gordura do rim, pelvis e corao 7
Ganho ps-desmama 1 Caracterstica Leiteira 1
Maciez da carne 5 Qualidade de aprumos e pernas 4
Expessura de gordura 2 Qualidade do bere 1
Rendimento de carcaa 14 Angularidade 2
rea de olho de lombo 5 Ligamentos posteriores do bere 4
Ganho pr-desmama 13 Ligamentos anteriores do bere 3
Peso a um ano 12 Estatura 3
Rendimento em leite 71 Tamanho de tetas 6
Rendimento de gordura no leite 59 Colocao de tetas 4
Rendimento de protena no leite 55 Profundidade do bere 4
Porcentagem de gordura no leite 58 Velocidade de ordenha 5
Porcentagem de protena no leite 62 Temperamento 4
Durao d evida produtiva 2 Taxa de gmeos 9
Score de clulas somticas 20 Peso ao abate 7
Peso ao nascimento 37 Resistencia a tripanossonomiase 3
Taxa de ovulao 6 Distocia (Efeito direto) 3
Maciez da carne 3 Taxa de no retorno aos 90 dias 2
B
I
O
T
E
C
N
O
L
O
G
I
A

e
s
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a
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d
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s

n
a

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g
r
o
p
e
c
u
r
i
a
5
9
2
Figura 8. Resultado de QTL para bovinos de leite e corte relacionados a produo de gordura. Note que, na maioria
dos casos, QTL para carcaa e leite se sobrepem.
593
Diversos pesquisadores vm buscando identicar marcadores tipo
I e tipo II, resultantes da aplicao das abordagens do gene candidato
e scan genmico, em caractersticas como produo de leite, desen-
volvimento ponderal, rendimento de carcaa, marmorizao e maciez
da carne, idade ao primeiro parto, intervalo entre partos, resistncia
a doenas e estresse, entre outras. Apesar de o mapeamento de QTL
ter identicado centenas de regies cromossmicas contendo genes
causadores de doenas genticas ou que afetam diversas caracters-
ticas de herana simples em animais domsticos, o nmero de poli-
morsmos genticos determinantes de variao fenotpica (muta-
es causais) em caractersticas quantitativas detectados permanece
bastante reduzido, alm de explicar apenas uma frao pequena da
variao gentica (Tabela 3). Um scan genmico pode detectar QTL
para a caracterstica de interesse, se possuir marcadores distribudos
ao longo de todo o genoma, mas ainda bastante difcil detectar loci
com efeitos pequenos ou separar os efeitos de genes em desequilbrio
de ligao forte (GODDARD; HAYES, 2009; HU et al., 2009).
Tabela 3. Lista de QTL com mutao causal conhecida em animais
domsticos.
Gene Espcie Caracterstica Mutao
KIT Porco Branco dominante Duplicao
RYR1 Porco Gene do alotano R614C
PRKAG3 Porco RN
-
R200Q
IGF2 Porco Desenvolvimento e composio de carcaa Transio G/A
DGAT Vaca Porcentagem de gordura no leite K232A
MSTN Vaca Musculatura dupla Diversas
CLPG Ovelha Musculatura dupla Substituio A/G
IGF1 Cachorro Tamanho corporal Diversas
MITF Cachorro Colorao de pelagem Insero SINE
CBD103 Cachorro Colorao negra Deleo de 3pb
PMEL17 Galinha Branco dominante Insero/deleo de 9-15pb
MC1R Galinha Colorao de pluamagem E92K
SLC45A2 Galinha Colorao de pluamagem 106delT
Fonte: Adaptado de Hu et al., 2009.
594
Anlise de associao genome-wide
Anlise de Associao com cobertura ampla do Genoma
Genome-wide association analysis (GWA) uma abordagem que
utiliza alta densidade de marcadores localizados ao longo de todo
o genoma para a identicao de regies cromossmicas associa-
das com um determinado fentipo, sem conhecimento da muta-
o causal da variao gentica. GWA est baseada na suposio
de que uma mutao causativa para um determinado fentipo est
em desequilbrio de ligao com marcadores adjacentes nas diver-
sas famlias de uma populao, mesmo aps diversas geraes de
recombinao. Para se capturar todos os segmentos cromossmi-
cos em LD fraco e (ou) com pequeno efeito, faz-se necessrio um
mapa de alta densidade, isto , grande nmero de marcadores loca-
lizados a pequenas distncias. Entretanto, esses marcadores esto
hoje disponveis, tornando GWA possvel. Apesar de GWA ter sido
desenvolvida h pouco tempo, diversos estudos j foram publi-
cados (DUERR et al., 2006; SAXENA et al., 2007; SCOTT et al.,
2007, VAN TASSELL et al., 2008; GODDARD; HAYES, 2009).
GWA pode contribuir para abrir novas fronteiras no entendimento
de caractersticas de herana complexa (HIRSCHHORN; DALY, 2005),
uma vez que existam populaes com grande nmero de indivduos e
muitas geraes de recombinao que permitem o mapeamento no
de QTL empregando SNPs para gerar um mapa gentico de altssima
densidade (KARLSSON et al., 2007; ADELSON et al., 2009).
Predies genmicas combinam dados genotpicos, fenotpicos e
pedigree com o intuito de aumentar a acurcia de seleo. A avalia-
o gentica tradicional emprega somente dados fenotpicos e proba-
bilidades de compartilhamento de genes idnticos por descendncia
IBD gerados a partir do pedigree. Marcadores espaados ao longo
do genoma com baixa densidade permitiam a identicao somente
de regies cromossmicas muito longas que podem conter dezenas
de genes ou famlias de genes, mas no permitiam a deteco de
genes de pequeno efeito, muito menos separa os efeitos individu-
ais dos diversos loci dentro do segmento cromossmico. Marcadores
genotipados para milhares de loci ao longo de todos os cromossomos,
utilizando platafomas de genotipagem de alta densidade de SNPs
desenvolvidas recentemente, podem gerar estimativas mais preci-
595
sas (MEUWISSEN, 2007; VAN TASSELL et al., 2008; GODDARD;
HAYES, 2009).
A abordagem GWA foi empregada em bovinos leiteiros dos EUA
e Canad por Van Raden et al. (2009) para se avaliar o ganho em acu-
rcia em predies genticas em comparao a avaliao tradicional
gentico-quatitativa. Os autores utilizaram gentipos para 38.416 mar-
cadores e avaliaes genticas de Janeiro de 2003 de 3.576 touros (tou-
ros preditores) Holandeses nascidos antes de 1999 para efetuar a an-
lise de associao. Os efeitos dos segmentos genmicos estimados nos
touros preditores foram testados em touros nascidos de 1999 a 2002
(touros preditos). A informao obtida foi utilizada para se predizer os
valores genticos genmicos de animais nascidos em Janeiro de 2008,
lhos(as) do touros preditos, e comparar com a acurcia estimada
como a mdia dos valores genticos dos progenitores, isto , valor gen-
tico estimado sem incorporao de dados fenotpicos de descendentes.
O DNA foi obtido a partir de smen coletado e estocado ao longo
dos anos, e fornecido por centrais de inseminao dos EUA e
Canad, alm do Centro Nacional de Preservao de Germoplasma
dos EUA. Os gentipos foram gerados com a utilizao do microar-
ray de SNPs Illumina BovineSNP50 BeadChip. As predies gen-
ticas para 5 caractersticas de produo, 5 de adaptao e 16 carac-
tersticas conformacionais; alm do mrito total, foram calculadas
empregando modelo no-linear e distribuio a priori heavy tai-
led para considerar a presena de genes principais major genes.
As predies genticas obtidas com a utilizao de informao
genmica foram mais acuradas do que a avaliao tradicional para
todas as 27 caractersticas. Os coecientes de determinao (R2)
foram de 0,05 a 0,38 superiores com predies genmicas no-line-
ares, com uma mdia de 23%. O ganho em acurcia foi equivalente
incorporao de dados relativos a 11 prognies. Os maiores bene-
fcios entre as predies genmicas ocorreram para porcentagem de
gordura no leite devido ao conhecimento de um gene principal. As
acurcias aumentaram mais pela adio de indivduos do que pela
incorporao de marcadores. Os autores concluem que as acur-
cias das predies genticas foram superiores devido ao acompanha-
mento da segregao de alelos durante a herana de genes, mesmo
dos de pequeno efeito e recomendam o incio da utilizao de GS
para tourinhos e novilhas a partir de 2009 (VAN RADEN et al., 2009).
596
Seleo auxiliada por marcadores moleculares MAS
O melhoramento gentico de bovinos de corte tem sido realizado
para caractersticas de importncia econmica como desenvolvimento
ponderal, fertilidade, rendimento e qualidade de carcaa, utilizando
avaliao fenotpica detalhada e princpios de gentica quantitativa. A
teoria dos ndices de seleo, com nfase em seleo dentro de reba-
nhos em sua grande maioria, foi empregada at meados de 1980.
Posteriormente, a estimao do valor gentico dos animais, expresso
em termos de Diferena Esperada Na Prognie (DEP), ou Estimated
Breeding Value (EBV), utilizando a metodologia dos modelos mistos,
comeou a ganhar grande destaque (HENDERSON, 1988; QUASS;
POLLAK, 1980).
Entretanto, apesar dos resultados positivos, que podem ser obser-
vados na conformao e desempenho dos touros campees nacio-
nais dos EUA em 1960 e 1990 (Figura 9), algumas restries limi-
tam o ganho gentico anual em diversas caractersticas. A ecincia
de seleo bastante baixa em caractersticas de baixa herdabilidade
(fertilidade), de difcil mensurao ou que no podem ser diretamente
mensuradas (resistncia a doenas, rendimento de carcaa e ecin-
cia alimentar), ou que apresentam correlaes genticas negativas
(ganho de peso ps-desmama e idade ao primeiro parto) (Figura 10).
Progresso gentico obtido em Angus
1960 1990
Melhoramento tradicional
Avaliao da variao fenotpica para
predizer o valor gentico (DEPs - diferena
esperada na progenie).
Figura 9. Melhoramento gentico tradicional.
597
MAS Vantagens para bovinos de corte
Interessante para caractersticas de:
Mdia-baixa herdabilidade (ex.: fertilidade).
Limitadas ao sexo (ex.: produo de leite).
Avaliao tardia (ex.: intervalo entre partos).
Avaliao Post-Morten (ex.: qualidade e rendimento de carcaa).
Avaliao difcil/cara (resistncia a doenas, eficincia alimentar).
Figura 10. Caractersticas interessantes para aplicao de MAS.
A aplicao da gentica molecular poder contribuir para suplan-
tar algumas dessas limitaes. A capacidade de dissecar caracters-
ticas complexas em entidades mendelianas e estimar os efeitos des-
ses segmentos cromossmicos (QTL), ou genes mapeados, permitir
aumentar a ecincia de seleo pela utilizao dessas informaes
em programas de Seleo Assistida por Marcadores MAS (Marked
Assisted Selection) na predio do valor gentico (Figura 11).
Fentipos
Variao em caracteres
de importncia econmica
Genes
Marcadores
Caixa Preta
Seleo Auxiliada por Marcadores
Para se utilizar MAS necessrio identificar variao genotpica
determinante ou associada a variao fenotpica em
caractersticas de importncia econmica.
Figura 11. Seleo auxiliada por marcadores.
O ganho gentico anual poderia ser elevado tanto pelo aumento da
acurcia quanto pela reduo do intervalo de gerao (Figura 12). A
598
acurcia dos valores gentico preditos poderia ser incrementada pelo
ao aumento na quantidade e qualidade de informao, especialmente
para o caso de irmos completos gerados por transferncia de embri-
es, enquanto o intervalo poderia ser reduzido pela seleo precoce
dos animais ou at de embries (Figura 13).
j
H
j
IH
j
j
j
j
L
ir
L
R
G
= Ganho gentico anual G
Seleo Auxiliada por Marcadores
r = Acurcia de seleo (informao)
L = Intervalo de gerao (pr-seleo ou seleo em idade jovem)
Figura 12. Incremento no ganho gentico anual pelo aumento da acurcia
ou reduo do intervalo entre geraes.
MAS - Vantagens para bovinos de corte
Aumento da acurcia (mais informao) especialmente para animais jovens sem
dados de desempenho prprio ou prognie.
Pre-seleo para reduo do intervalo de gerao e (ou) reduo de custos.
Seleo de tourinhos jovens para teste de prognie.
Novilhas (pr-puberes) para FIV.
Embries (bipsia, genotipagem e transplante).
Irmos completos (sunos, aves, FIV, TE).
Figura 13. Aplicao de MAS para aumentar ganho gentico anual.
599
Novas possibilidades para seleo concomitante para caractersti-
cas correlacionadas, implementao de sistemas de acasalamento para
otimizar componentes genticos no-aditivos (dominncia e epista-
sia), introgresso de genes desejveis a partir de outras raas ou ban-
cos de germoplasma (SOLLER; BECKMANN, 1983; BEEVER et al.,
1990; ROCHA et al., 1992; BINK; ARENDONK, 1994), utilizao de
marcadores genticos em gado de corte (RUSSO; KLEIN, 2007) e sele-
o genmica em gado de leite (WIGGANS et al., 2009) esto sendo
avaliadas por diversos pesquisadores.
O termo Iluso Aditiva foi utilizado por Rocha et al. (1994) ao se
referir a um otimismo exagerado com relao possibilidade de utili-
zao de MAS. Esses autores armam que os fenmenos biolgicos,
na maioria das vezes, no so aditivos, ou seja, genes no devem ser
classicados como bons ou ruins. Somente o gentipo pode ser clas-
sicado dessa forma e, ainda assim, somente em relao determi-
nada condio ambiental. A inconsistncia de resultados obtidos de
associao entre caractersticas importncia econmica d suporte a
esse ponto de vista.
A utilizao de marcadores moleculares deve ser avaliada distin-
guindo os tipos I e os II. A seleo de polimorsmos genticos com
efeito direto na caracterstica de interesse (marcadores tipo I), gera-
dos pela utilizao do procedimento do gene candidato, conhecida
por seleo auxiliada por genes (GAS). Esta possui potencial maior
de aplicao em relao aos marcadores tipo II, conhecido por MAS
verdadeira, com efeito indireto devido ligao entre o marcador e
o QTL (NOTTER, 1995).
Algumas limitaes ao uso de MAS verdadeira so:
1) Complexi dade das metodologias estatsticas;
2) A associao entre um alelo marcador e o QTL pode variar
entre e dentro de populaes, e, por essa razo, a MAS verda-
deira deve ser empregada primordialmente dentro de famlia
em que a associao foi avaliada (NOTTER, 1995);
3) O marcador deve estar distante do QTL entre 1 cM e 2 cM,
para evitar indivduos recombinantes. Quanto mais distante o
marcador, maior a necessidade de vericao da associao a
cada gerao (SMITH; SMITH, 1993);
600
4) As caractersticas de importncia econmica possuem herana
polignica, ou seja, so controladas por um grande nmero de
QTL, de pequeno efeito cada. Entretanto, uma quantidade
considervel da variabilidade gentica pode ser determinada
por um nmero relativamente pequeno de QTL de grande
efeito, tambm conhecidos por Major Genes. Exemplos
incluem o gene Miostatina causativo da musculatura dupla
(hipertrofia muscular) em algumas raas bovinas (NOTT;
ROLLINS, 1979), gene DGAT para componentes do leite e gene
boroola em ovinos (PIPER; BINDON, 1988).
Apesar das limitaes, GAS est sendo empregada para identi-
car gentipos superiores e detectar portadores de doenas heredit-
rias, como a Sndrome do Estresse em Sunos PSS (RASMUNSEN;
CHRISTIAN, 1976), Decincia de Adeso Leucocitria BLAD
(SHUSTER et al., 1992), resistncia a doenas infecciosas, como tripa-
nossonomase (DELESPAUX et al., 2003) em bovinos. Caractersticas
de herana simples, determinadas por um nmero pequeno de loci,
como presena de chifres e colorao de pelagem, tambm vm
sendo avaliadas por meio de marcadores (GEORGES et al., 1993 a, b;
SCHMUTZ et al., 1995), assim como para caractersticas de herana
complexa de importncia econmica em que GAS j comea a ser uti-
lizada em sunos com a disponibilizao de marcadores como RyR1
receptor do alotano, RN Rendement Napole, ESR receptor de estr-
geno, MCR4 receptor da melanocortina 4 e HFABP protena do
tipo cardaco acopladora de cido graxo (Tabela 4) (MATHUR, 2003);
em bovinos com a disponibilizao de marcadores, como, por exem-
plo Miostatina (MSTN), Calpastatina (CALP) e Tiroglobulina para
melhoramento da maciez e marmorizao da carne (BROBET et al.,
1997, 1998; RUSSO; KLEIN, 2007) DGAT para componentes do leite
(GROBET et al., 1998, 1997) e GS para 27 caractersticas de interesse
em bovinos leiteiros (VANRADEN et al., 2009).
Tabela 4. Marcadores para sunos.
RYR1 (Alotano) 6 Qualidade de carne (magra e PSS)
RN (Rendement Napole) 15 Glicognio, pH, perda de gua cozimento
ESR (Rec. de Estrgeno) 1 Tamanho de leitegada
PRLR (Rec. de Prolactina) 16 Tamanho de leitegada, habilidade materna
Retino Binding Prot. 14 Tamanho de leitegada
Continua...
601
RYR1 (Alotano) 6 Qualidade de carne (magra e PSS)
MC4R (Rec. Melanocortina 4) 1 Apetite e deposio de gordura
IGF-2 2 Leitegada e rendimento de carcaa
HFABP 6 Gordura intramuscular
C-KIT rec. 8 Colorao de pelagem
Fonte: Mathur et al., 2003.
Seleo genmica
Seleo Genmica (Genomic SelectionGS) se refere seleo
de reprodutores com base somente em valores genticos genmi-
cos (Genomic Estimated Breeding Values GEBV) e est revolucio-
nando o melhoramento de gado de leite. Os GEBVs so calculados
como a soma dos efeitos dos marcadores, ou hapltipos desses mar-
cadores, distribudos ao longo do genoma com altssima densidade,
e, dessa forma, permite, teoricamente, a captura de todos os QTL,
contribuindo para a varincia gentica de uma caracterstica. Os efei-
tos dos QTL, inferidos a partir dos marcadores ou hapltipos, so pri-
meiramente estimados em grandes populaes referncia com dados
fenotpicos e genotpicos coletados. Somente dados genotpicos so
necessrios para as geraes subsequentes. As acurcias dos GEBVs
preditos por GWA foram avaliadas em experimentos nos EUA, Nova
Zelndia, Austrlia e Holanda utilizando populaes referncia de
650 a 4.500 touros com teste de prognie e gentipos de aproxima-
damente 50.000 marcadores. Os resultados indicam acurcias para
GEBV para tourinhos jovens, sem teste de prognie, variando de 20%
a 67% e so dependentes das herdabilidades das caractersticas, do
nmero de touros na populao referncia e do mtodo estatstico.
As acurcias dos GEBV foram signicativamente superiores a valores
genticos estimados como a mdia dos EBVs dos progenitores, que
o critrio utilizado para seleo de tourinhos para entrar em teste
de prognie, gerando uma expectativa que a utilizao de GS poder
aumentar ganho gentico anual em mais de 100%.
Mtodos tradicionais de seleo, como as predies Best Linear
Unbiased Prediction (Blup) a partir de meio-irmos e irmos comple-
tos, que aumentam o ganho gentico pelo aumento da acurcia, leva-
602
ram tambm a um aumento na taxa de endogamia por gerao. Esse
no necessariamente o caso para a GS, que tambm aumenta o pro-
gresso gentico pelo aumento da acurcia. A GS gera acurcias mais
elevadas para os valores genticos a partir de melhores predies dos
componentes mendelianos (segmentos cromossmicos segregando
nas diversas prognies da populao) dos valores genticos. Com isso
h um aumento na capacidade de diferenciao entre irmos e, con-
sequentemente, reduo na cosseleo desses e no aumento da taxa
de endogamia por gerao. A alta acurcia da GS deve reduzir a vari-
ncia entre famlias e re-ponderar os valores genticos dos indivduos
em direo a segregao dos componentes mendelianos. Alm disso,
as correlaes intraclasse de irmos induzida pela estimao devem
ser menores em GS levando a uma maior reduo da cosseleo de
irmos quando comparada a seleo com Blup. Os autores concluem
que a predio de GEBV permite um ganho gentico mais elevado e ao
mesmo tempo reduzem o aumento na taxa de endogamia por gerao,
quando comparada seleo com Blup (DAETWYLER et al., 2007).
Diversos desaos da GS e sua implementao continuam presen-
tes, incluindo o aumento das acurcias das GEBV, integrao das
informaes genmicas e aumento da populao referncia, planeja-
mento de ganho gentico no longo prazo e integrao com biotecno-
logias da reproduo para se maximizar o ganho proveniente da sua
utilizao (HAYES et al., 2009; GODDARD; HAYES, 2009).
Introgresso gentica e velogentica
Marcadores moleculares podem ser utilizados para realizar intro-
gresso gentica, reduzindo o nmero de geraes necessrias para
isolar o gene exgeno de interesse no genoma que se deseja melho-
rar, alm do intervalo entre geraes (TANKSLEY; RICK, 1980;
COUTINHO; REGITANO, 1995). Introgresso gentica foi proposto
por Hillel et al. (1990), empregando DNA- ngerprinting com son-
das minissatlite, retrocruzamentos e seleo dos reprodutores que
possuam mxima semelhana no padro de bandas para a linhagem
receptora.
Introgresso Auxiliada por Marcadores, Marker Assisted Introgression
(MAI) foi conduzida por Koudand et al. (2003) para se transferir trs
603
QTL para tolerncia a tripanossonomase de uma linhagem doadora
de ratos (C57BL/6) em uma linhagem recipiente (A/J) e avaliar a eci-
ncia do mtodo no tempo de sobrevivncia dos animais. Uma popula-
o F2 foi gerada por retrocruzamento por quatro geraes para o QTL
da linhagem doadora. Aps essa fase, indivduos portadores dos QTL
de interesse foram acasalados por intercruzamentos para a seleo de
homozigotos tolerantes. Posteriormente, os animais foram agrupa-
dos de acordo com os gentipos dos QTL nos cromossomos 1, 5 e 17 e
desaados com Trypanosoma congolens. Animais que possuam os QTL
favorveis apresentaram melhor tempo de sobrevivncia em compara-
o linhagem receptora, mas nenhuma delas atingiu o nvel de tole-
rncia da linhagem doadora. Os efeitos estimados para os QTL aps
introgresso foram aproximadamente 30% inferiores que a popula-
o original em que as associaes foram estimadas (Figuras 14 e 15).
Programa de introgresso de QTL
Populao receptora melhorada QQ*
QQ
Populao
doadora
qq
Populao
receptora
Qq F1
qqR
qqR
IC 1
Qq RCn-1
Qq RCn Qq RCn
IC 1
IC 2
IC 2
X
X
X
X
X
X
Qq RC1
qqR
X
Retrocruzamentos
-Recuperar genoma - R
-Manter QTL - D
Intercruzamentos
-Fixar o QTL - QQ
Alelo Q= Resistncia
tripanossonomase
Zebu Africano Europeu
MAS LD
Figura 14. Programa de introgresso de QTL.
Fonte: Adaptado de Koudand et al., 2003.
604
Programa de introgresso de QTL
Gentipos Gentipos
Cruzamento Prognie Prognie Freq. Q Selecionados % Genoma R
D X R F1 Qq 0,5 Qq 50
F1 X R BC1 Qq/qq 0,5 Qq 75
BC1 x R BC2 Qq/qq 0,5 Qq 87,5
BCn X BCn IC1 QQ/Qq/qq 0,5 QQ(+Qq) 99,?
IC1 x IC1 IC2 QQ/Qq/qq >0,5 QQ(+Qq) 99,?
ICk X ICk ICk+1 QQ/Qq/qq >0,5 QQ(+Qq) 99,?
Populao receptora melhorada QQ*
Figura 15. Cruzamentos, frequncia do QTL e porcentagem do genoma da
linhagem doadora.
Fonte: Adaptado de Koudand et al., 2003.
A introgresso, seja por MAS ou GAS, assim como a GS, podem
ser acelerada ainda mais com a aplicao de velogentica (MASSEY;
GEORGES, 1992), em que embries obtidos a partir de fetos, com
aproximadamente 180-200 dias, podem ser avaliados por intermdio
de tcnicas de MAS, GAS ou GS, seus ovcitos coletados, maturados,
fertilizados in vitro e transferidos para se repetir o ciclo. Outra possi-
bilidade a whizzogentica em que a avaliao genmica se d em
embries que so selecionados para produo in vitro de gametas.
Nesse caso, embries selecionados por MAS, GAS ou GS so estimu-
lados, em cultivo in vitro, para entrar em meiose e gerar gametas, que
so ento fertilizados e os novos embries produzidos so novamente
selecionados empregando somente informao genmica. O processo
conhecido por Whizzogentica pode ser repetido at a obteno do
gentipo desejado quando se realiza clonagem para gerar embries
para implantao e permite a reduo do intervalo entre geraes ao
extremo de 7 dias (Figuras 16, 17 e 18) (HARLEY; VISSCHER, 1998).
605
Figura 16. Cultivo celular e seleo auxiliada por marcadores. (a) Velogentica:
novilhas so selecionadas in tero por MAS, ovcitos coletados, maturados e
implantados e repete-se o ciclo; (b) Velogentica nuclear: embries so culti-
vados in vitro e selecionados por MAS, clonados, transferidos, ovcitos cole-
tados in tero, maturados, fertilizados e implantados para repetir ciclo; (c)
Whizzogentica: embries cultivados in vitro, selecionados por MAS, cultivos
estimulados para entrar em meiose, gametas so ento fertilizados e embri-
es selecionados por MAS. O processo repetido at a obteno do gentipo
desejado quando se realiza clonagem para gerar embries para implantao.
Fonte: Adaptado de Harley e Vischer, 1998.
606
Velogentica e Whizzogentica
Estimar efeito de marcadores, hapltipos, ou Segmentos Genmicos.
1
a
gerao:
1 - Genotipar Embries
2 - Selecionar Embries Superiores
3 - Induzir MeioseOcitos e espermatozoides
4 - Fertilizao in vitro
5 - Maturao in vitro,
2
a
gerao:
Genotipagem, Seleo, Meiose, Fertilizao, entre outros.
Quantas Geraes? Linkage e Acurcia.
Repetir estimao de efeitos de marcadores, hapltpos ou segmentos
genmicos (densidade do mapa de SNPs, nmero de animais e
geraes na famlia referncia).
Figura 17. MAS empregando velogentica ou whizzogentica.
Reduo do intervalo entre geraes
Monta natural L = mnimo 2,5 anos (> 4-5anos)
Velogentica L = 3 a 6 meses
Whizzogentica L < 1 semana!!!
Figura 18. Intervalo entre geraes em bovinos em monta natural, empre-
gando velogentica ou whizzogentica.
Estudos filogenticos e populacionais
O conhecimento e ferramentas gerados com o progresso da gen-
tica molecular tm se mostrado muito ecientes em estudos logen-
ticos e populacionais, aumentando a capacidade de identicar novas
espcies, caracterizar a biodiversidade dos variados ecossistemas,
assim como inferir a variabilidade gentica intra e interpopulacional
de animais domsticos de importncia econmica, assim como de
animais silvestres. Adicionalmente, esse conhecimento e ferramentas
podem auxiliar no controle sobre os nveis de endogamia em deter-
minada populao. O controle da endogamia de suma importncia
no planejamento de programas de conservao de espcies ou raas
adaptadas, ou em programas de melhoramento gentico animal que
visem tambm ao ganho gentico no longo prazo.
607
A anlise de variao gentica empregando mtodos de gentica
molecular , em muitos casos, mais eciente na discriminao de
subdivises populacionais intraespeccos do que a biometria mor-
folgica. Genes mitocondriais e Y-especco, por possurem herana
exclusivamente materna e paterna respectivamente (so transmitidos
somente por fmeas ou machos), alm de apresentarem padro de
herana no Mendeliana (sofrerem eventos de recombinao), cons-
tituem interessantes marcadores genticos em estudos logenticos.
Esses marcadores podem fornecer informao necessria para veri-
cao da taxonomia, estimativas de distncias genticas, discrimina-
o de subpopulaes, identicao de linhagens maternas e paternas,
assim como para investigar a histria biogeogrca de determinado
txon ou populao. Por outro lado, marcadores nucleares microssa-
tlites, em razo da alta frequncia, distribuio e polimorsmo, so
muito ecientes na estimao de distncias genticas, discriminao
de subpopulaes, mas, sobretudo, em estudos que envolvem segre-
gao de alelos, como teste de paternidade e identicao individual
(ERIKSSON et al., 2006; GARRIGAN; HAMMER, 2006).
O uso combinado das diversas categorias de marcadores e sostica-
das metodologias estatsticas tem se mostrado bastante ecientes na
identicao de espcies, discriminao de subespcies, subpopula-
es ou raas, estimao de distncia gentica entre populaes, esti-
mao de relaes parentesco entre indivduos mantidos em cativeiro
ou em vida livre, estudos evolucionrios de biogeograa e padres
de migrao (LOFTUS et al., 1994; ZHIVOTOVSKY; GOODMAN,
1998; JOHNS; AVISE, 1998; ARBOGAST, 1999; SEIESTAD et al.,
1999; HAMMER et al., 2001; SPRINGER et al., 2001; TOZAKI et al.,
2001; ICHIKAWA et al., 2001; LANDRY et al., 2002, YU; PENG, 2002;
CAVALI-SFORZA; FELDMAN, 2003; DENISE et al., 2003; FOKIDIS
et al., 2003; WILDER et al., 2004a; WILDER et al., 2004b; GARRIGAN;
HAMMER, 2006; TORO et al., 2009).
Marcadores mitocondriais
Mitocndrias so organelas citoplasmticas encontradas na grande
maioria dos organismos eucariotos. Elas so usualmente descritas
como casa de fora celular, visto que so responsveis pela produ-
o de ATP via fosforilao oxidativa. Os eucariotos surgiram da inte-
608
rao de comunidades de clulas, de maneira que essa organela pode
ter surgido a partir da captura e incorporao de uma protobact-
ria endossimbionte por um hospedeiro eucaritico com ncleo, com
semelhana a um protista (LANG et al., 1997; GRAY et al., 1999).
O DNA mitocondrial (mtDNA) de mamferos um genoma cito-
plasmtico (extra nuclear), que contm, basicamente, alguns dos
genes essenciais ao processo celular de fosforilao oxidativa. Os
genes mitocondriais apresentam uma taxa de xao de mutaes
(modicaes) quatro vezes superior, quando comparados aos nucle-
ares, alm de estarem presente em quase todos os eucariotos e possu-
rem herana exclusivamente materna, e, por essas razes, tornaram-se
comuns em estudos logenticos e evolucionrios (MARGULIS,
1996; AVISE, 2000; GRAY et al., 2004; BULLERWELL; GRAY, 2004).
A regio controle, que inclui D-loop e a sequncia hipervarivel
(HVS), e os genes citocromo B (CytB) e citocromo C oxidase I (COI)
tm sido os mais empregados na identicao de espcies, discrimi-
nao de subespcies, estudos de evoluo e domesticao, caracteri-
zao de raas e alteraes demogrcas recentes em bovinos, sunos,
aves e ovinos, entre outras espcies animais (LOFTUS et al., 1994;
GIUFFRA et al., 2000; HIENDLEDER et al., 2002; LEONARD et al.,
2002; BRUFORD et al., 2003; WU et al., 2003; JOSHI et al., 2004;
MEADOWS et al., 2005).
Um projeto internacional conhecido DNA Barcoding of Live
(http://www.barcoding.si.edu/DNABarCoding.htm) foi implantado
recentemente com o objetivo de sequenciar 648 pb do gene citocromo
C oxidase, subunidade 1 (COI) como ferramenta de auxlio na cata-
logao da biodiversidade e em taxonomia. Os cdigos de barra
baseados em sequncias COI so ecientes na identicao de esp-
cies, uma vez que esse gene est presente em praticamente todos
os organismos eucariotos, bastante conservado entre organismos
dos mais diversos txons, e sucientemente diferenciado entre esp-
cies para apresentam padro de sequncia barcode espcie-espe-
ccos (TAUTZ et al., 2003; WILSON, 2003; BLAXTER et al., 2005;
SCHINDEL et al., 2005; RUBINOFF et al., 2006).
Por esses motivos, alm de ferramenta para a catalogao de esp-
cies, os cdigos de barra de DNA podem ser teis na identicao de
609
espcies em qualquer estgio de desenvolvimento e na separao de
espcies crpticas ou com taxonomias complexas ou pouco estuda-
das (HEBERT et al., 2003b; MONAGHAN et al., 2005; SAVOLAINEN
et al., 2005; WITT et al., 2006, FOUQUET et al., 2007; TAVARES;
BAKER, 2008), como possivelmente o caso do veado mateiro
(Mazama americana) e do caititu (Pecari tajacu) (GROVES; GRUBB,
1993; GONGORA et al., 2006; DUARTE et al., 2008).
O desenvolvimento tecnolgico, por outro lado, possibilitou tam-
bm um incremento signicativo na escala de gerao de dados, com
a avaliao de um nmero maior de amostras com reduo de cus-
tos e tempo, possibilitando avano importante em estudos de din-
mica populacional em resposta a diversos estmulos ambientais. Os
cdigos de barras vm sendo utilizados inclusive para avaliar a din-
mica populacional de peixes, insetos bentnicos, minhocas e crus-
tceos, entre outros, em resposta contaminao do solo e gua por
resduos de herbicidas, fungicidas e minerao, com o objetivo de
identicao de bioindicadores para monitoramento ambiental, por
exemplo (GASTON; ONEIL, 2004; MARKMANN; TAUTZ, 2005;
MONAGHAN et al., 2005; HERRERA et al., 2007; FICETOLA et al.,
2008; BERKOV, 2009; OTOMO et al., 2009; VALENTINI et al., 2009).
A anlise da sequncia completa dos genomas mitocondriais de bovi-
nos taurinos e zebunos permitiu a identicao de 237 polimorsmos
e estimao de um tempo de divergncia de aproximadamente 1,7
2,0 milhes de anos entre essas espcies (HIENDLEDER et al., 2008).
Quatro linhagens maternas de bovinos foram identicadas a partir
da anlise combinada de 248 sequncias D-loop de diversas raas,
alm de 32 exemplares arqueolgicos do bovino primitivo auroque
(Bos primigenius). Diversos eventos de domesticao e um status de
subespcie para as raas taurinas (Bos primigenius taurus) e raas
indianas (Bos primigenius indicus) foram inferidas a partir das distn-
cias genticas estimadas.
Marcadores de mtDNA foram utilizados por Meireles et al. (1999)
para analisar a contribuio de gado taurino na formao das raas
zebunas Gir, Nelore e Brahman. Participao majoritria de matriar-
cas de origem taurina na formao do Zebu PO americano foi
demonstrada pelos autores, uma vez que 79% dos animais Nelore,
610
73% Gir e 100% Brahman analisados apresentaram mtDNA de ori-
gem taurina. Os resultados so condizentes com a raa ter sido for-
mada por cruzamentos absorventes mediados por machos zebunos
acasalados com fmeas de origem Ibrica. O mesmo no se pode
dizer dos resultados de 26% e 25% de mtDNA taurino obtidos para
animais Nelore e Gir POI, respectivamente, raas supostamente de
origem exclusivamente zebuna.
Comparao de sequncias de mtDNA foi aplicada a pratica-
mente todas as principais espcies domsticas de produo (ex.:
FERNNDEZ et al., 2006; LARSON et al., 2007; MEADOW et al.,
2007; KANGINAKUDRU et al., 2008; NADERI et al., 2008). Foram
identicados cinco agrupamentos de hapltipos maternos (A, B, C,
D e E) em ovinos. Hapltipos A foram identicados, sobretudo, em
raas asiticas, hapltipos B predominantemente em europeias e
os haplogrupos restantes em menor frequncia no continente asi-
tico (HIENDLEDER et al., 2002; WU et al., 2003; GUO et al., 2005;
MEADOWS et al., 2005; PEDROSA et al., 2005 e MEADOWS et al.,
2007), apesar de que alto nvel de migrao ser observado entre as
raas de diversas regies (MEADOWS et al., 2005).
Trs linhagens principais de ovinos (A, B e C), j descritas anterior-
mente, foram identicadas pela Anlise do mtDNA, D-loop e HVS,
de 48 raas, e, alm dessas, foi identicada uma quarta linhagem
D (TAPIO et al., 2006). Paiva et al. (2005) observaram a presena
das quatro linhagens maternas principais no Cucaso, trs (A, B e C)
na sia central, duas (A e B) na Europa ocidental. Os autores pude-
ram concluir que a linhagem A foi a primeira a ser domesticada no
oriente mdio, migrando posteriormente para todas as outras regies.
A expanso do hapltipo B envolveu populaes da Europa ocidental
aproximadamente 3.000 anos aps domesticao de A. A distribui-
o de A indica que o Oriente Mdio foi a origem de domesticao
dos ovinos. Hapltipos B podem ser observados em ovinos selva-
gens europeus mouon, sugerindo domesticao independente ou
sua introgresso em populaes domsticas. Os haplogrupos C e
D, provavelmente, foram introduzidos posteriormente, mas uma
amostragem maior necessria para se inferir a origem geogrca.
611
Cromossomo Y
Os cromossomos sexuais dos mamferos so bastante divergentes e
heteromrcos. O cromossomo X mais longo e denso em genes em
comparao com o cromossomo Y, que curto e degenerado. A teoria
atualmente mais aceita que o Y descende de um protocromossomo
Y, homlogo ao X. A falta de recombinao entre estes considerada o
fator determinante da perda de genes pelo cromossomo Y (degenera-
o) (GVOZDEV et al., 2005; ELLIS; AFFARA, 2006; GRAVES, 2006).
O cromossomo Y consideravelmente menor do que os outros cro-
mossomos (60Kb) e contm 178 genes em humanos (SKALETSKY
et al., 2003), sendo 45 destes codicadores de protenas, em que a
maioria controla funes macho-especcas como espermatognese,
e vrios pseudogenes (LAHN; PAGE, 1997). Ele possui sequncia de
DNA altamente repetitiva, mltiplas cpias do mesmo gene arranja-
dos em sequncia (in tandem) e regies palindrmicas (TOURE et al.,
2005; BACHTROG, 2006; GRAVES, 2006). Segmentos sequencia-
dos em diversos mamferos apresentaram baixo nvel de diversidade
nucleotdica (HELLBORG; ELLEGREN, 2004; MEADOWS et al., 2004;
MEADOWS et al., 2006).
A identicao de linhagens paternas, estudos de dinmica popu-
lacional e biogeograa so facilitados, entre outros fatores, pela ava-
liao do estado haploide dos alelos e na ausncia de recombinao
X-Y. Marcadores Y-especfcos se mostraram eciente em estudos glo-
bais de expanso e disperso de populaes humanas (DENG et al.,
2004). Anlise de mtDNA e cromossomo Y foi utilizada por Eriksson
et al. (2006) para avaliar a magnitude da disperso efetiva de machos e
fmeas e investigar a histria demogrca de bonobos. Foi observada
uma diferenciao maior do cromossomo Y em relao ao mtDNA,
o que esperado para espcies em que a disperso mediada princi-
palmente por fmeas.
A investigao de linhagens paternas tambm importante em
espcies domsticas, uma vez que a taxa reprodutiva muito mais
elevada em machos, e j revelou aspectos fascinantes relacionados
domesticao dos animais. Sondas Y-especco desenvolvidas por
Bradley et al. (1994) permitiram a discriminao entre raas bovinas
zebunas e taurinas. Microssatlites localizados no cromossomo Y que
612
apresentam alelos especcos para zebu, e consequentemente apro-
priados para estudos evolutivos em gado e espcies relacionadas foram
desenvolvidos por Edwards et al. (2000). A utilizao desses marca-
dores evidenciou padres de introgresso mediadas por machos em
populaes de gado da frica (MACHUGH et al., 1997; HANOTTE
et al., 2000; FREEMAN et al., 2004). Mannen et al. (2004) tambm
observaram padro similar de introgresso mediada por machos na
formao de vrias raas Japonesas, Coreanas e da Monglia.
Marcadores microssatlites
Microssatlites, tambm conhecidos por STRs- short tandem
repeats ou VNTRs- variable number of tandem repeats, so regies
do genoma extremamente repetitivas e polimrcas (MIESFELD
et al., 1981; HAMADA et al., 1982; JEFFREYS et al., 1985a; JEFFREYS
et al., 1985b; GEORGES et al., 1988). Microssatlites autossmicos,
por causa de sua heterozigosidade, disperso no genoma e facilidade
de genotipagem por PCR, foram muito empregados em estudos que
envolvem a anlise da transmisso de alelos de marcadores ou hapl-
tipos. Mapas genticos contendo milhares de marcadores j esto
disponveis para diversas espcies, incluindo ovinos (VAIMAN et al.,
1996; MADDOX et al., 2001; BERALDI et al., 2006), bovinos (BISHOP
et al., 1994; BARENDSE et al., 1997; KAPPES et al., 1997) e sunos
(ARCHIBALD et al., 1995; ROHRER et al., 1996; GUO et al., 2009).
Esses marcadores moleculares continuam sendo extensivamente
utilizados em estudos de diversidade gentica, na identicao/ ras-
treabilidade, testes de paternidade, assim como no mapeamento de
caracteres quantitativos de importncia econmica (ARRANZ et al.,
1998; DIEZ-TASCON et al., 2000; ARRANZ et al., 2001; COLTMAN
et al., 2001; MCRAE et al., 2002; DENISE et al., 2003; ALVAREZ et al.,
2004; BARRILET et al., 2005; TAPIO et al., 2005; ALVAREZ et al.,
2006; UZUN et al., 2006).
O polimorsmo de 14 marcadores microssatlites foi avaliado, em
238 animais, para inferir as relaes histricas e as contribuies exis-
tentes entre seis raas de ovinos do norte da Espanha (ALVAREZ et al.,
2004). Os autores observaram uma populao bastante estruturada
em razo da origem ancestral distinta e da pequena taxa de migrao
recente. As raas Black-faced, Latxa e Churra, independentemente da
613
similaridade fenotpica, apresentaram pers genticos caractersti-
cos, indicando origem ancestral independente. As raas Blonde-faced
Latxa, Rubia Del Molar e Xalda, provavelmente mais relacionadas,
apresentaram coecientes admixture negativos, indicando origem
comum e divergncia recente.
Microssatlites foram utilizados por Tapio et al. (2005) para ava-
liar a contribuio de populaes nativas para a diversidade gentica,
diversidade de alelos e distncia gentica entre raas de ovinos do
norte da Europa, assim como o efeito da endogamia na contribuio
de cada raa para a variabilidade gentica total. Os resultados indica-
ram uma populao fundadora fragmentada em populaes isola-
das e um tamanho efetivo populacional (Ne) decrescente ao logo do
tempo especialmente para as raas Grey Finnish Landrace e Ruhnu.
Os autores sugeriram que poro considervel das raas com contri-
buio para diversidade gentica acima da mdia so raas locais e
perifricas com tamanho mximo de 1.000 ovelhas. Esse resultado
indica que a conservao dessas raas seria a maneira mais eciente
de se manter a diversidade gentica total.
As relaes genticas entre cinco raas de ovinos da Turquia foram
avaliadas por Uzun et al. (2006) a partir do polimorsmo observado em
225 animais. Os autores observaram alta variabilidade inter e intrarra-
cial com separao evidente das raas fat tail Tuj, Morkaraman (Red
Karaman) e Akkaraman (White Karaman) em relao s outras raas
estudadas. Outra interessante inferncia foi proporcionada pela an-
lise conjunta do mtDNA obtida de outros experimentos e microssa-
tlites. As raas Morkaraman e Akkaraman apresentaram hapltipos
de mtDNA distintos, mas perl de microssatlites muito similares.
A raa Akkaraman, nativa da Turquia, apresentou predominncia do
hapltipo C, enquanto, na Morkaraman, prevaleceu o hapltipo
mtDNA A (hapltipo asitico). Esses resultados indicam uma popu-
lao fundadora distinta (origem materna), e cruzamentos posteriores
mediados por machos. As raas Tuj e Hemsin, por outro lado, dife-
riram com relao s frequncias dos microssatlites, mas apresen-
taram hapltipos de mtDNA semelhantes. A origem materna deve
ser similar, o que est de acordo com a localizao geogrca, mas a
raa Tuj deve ter recebido considervel introgresso de outras raas
fat tail, alm de raas caucasianas, por cruzamentos mediados por
614
machos. Os autores concluem que os microssatlites e mtDNA for-
necem informaes complementares e, quando utilizados em combi-
nao, podem ajudar na correta avaliao da origem e relaes gen-
ticas entre as raas modernas de ovinos.
Mariante et al. (2009) avaliaram diversas raas brasileiras de esp-
cies domsticas de produo e pode observar uma alta variabilidade
gentica das raas naturalizadas em relao s raas comerciais/espe-
cializadas, alm de endogamia superior para as espcies sunas e equi-
nas, quando comparadas as demais (Tabela 5).
Tabela 5. Diversidade Gentica observada em cinco estudos com raas
naturalizadas e comerciais brasileiras a partir de marcadores micros-
satlites.
Espcie N N
o
raas (raas naturalizadas) N
o
Locos He AM FIS Amova (%)
Bubalinos 382 05 14 0.686 10.07 0.224 11.91*
Bovinos 915 10 (8) 22 0.816 13.18 0.086 11.87
Eqinos 328 07 (05) 11 0.875 14.36 0.204 12.37*
Ovinos 383 10 (05) 19 0.775 10.84 0.015 11.76*
Sunos 182 05 (03) 24 0.702 10.00 0.114 15.73*
* p<0.001.
N= nmero indivduos; He= heterozigosidade esperada; AM= nmero mdio de alelos; FIS=
coeciente de endogamia intrapopulacional; Amova (%)= Anlise varincia molecular, porcen-
tagem de variao entre as raas analisadas em cada espcie.
Fonte: Adaptado de Mariante et al. (2009).
SNPs
Variaes pontuais na cadeia de nucleotdeo (SNPs) so polimor-
smos considerados muito promissores para estudos evolucion-
rios, ecolgicos ou de conservao, uma vez que informao sobre a
sequn cia genmica se torne disponvel para um nmero maior de
espcies (SEDDON et al., 2005; MARRIS et al., 2009).
Por serem marcadores geralmente bi-allicos, SNPs so menos poli-
mrcos do que microssatlites, entretanto SNPs so extremamente
freqentes e, consequentemente, existe um aumento substancial no
nmero de loci disponveis para as diversas espcies (BRUMFIELD et al.,
2003). Alm disto, a dinmica mutacional mais simples dos SNPs gera
uma taxa menor de homoplasia, e, por outro lado, podem ser geno-
615
tipados a baixo custo e em larga escala (SYVNEN, 2001; VIGNAL
et al., 2002; BRUMFIELD et al., 2003; CHEN; SULLIVAN, 2003;
SCHLTTERER, 2004).
O estudo de SNPs em populaes de organismos no modelo, como
animais silvestres, relativamente recente e pouco frequente (MORIN
et al., 2004). Apesar de alguns estudos terem avaliado o potencial te-
rico de SNPs na inferncia da histria biogeogrca e relaes entre
indivduos (KUHNER et al., 2000; GLAUBITZ et al., 2003), a aplica-
o dos SNPs em estudos ecolgicos ou de conservao est limitado
a poucos exemplos com poucos loci marcadores (BENSCH et al., 2002;
BELFIORE et al., 2003). Entretanto, o recente desenvolvimento de pro-
gramas de sequenciamento gentico que utilizam equipamentos de
segunda gerao vem aumentando signicativamente a velocidade
de sequenciamento de genomas a um custo signicativamente mais
baixo, o que pode levar a superao desse gargalo.
Os resultados apresentados na literatura evidenciam que mar-
cadores moleculares diversos (microssatlites, SNPs, mtDNA e
Y-especco) geram dados distintos e complementares que podem
ser utilizados para inferir diferentes aspectos da evoluo e funcio-
namento dos genomas. Esses podem ser utilizados para inferir a ori-
gem, identicar espcies, diferenciar subespcies ou raas, identicar
linhagens paternas e maternas, alm de permitir inferir variabilidade
gentica entre e intrapopulacional de animais domsticos adaptados
e tambm em vida livre.
Conservao e manejo de recursos genticos
A conservao de raas ou espcies ameaadas dependente pri-
mordialmente da obteno de taxa reprodutiva adequada, e pode ser
maximizada pelo correto acasalamento entre indivduos, dentro de
subespcie ou raa, objetivando maximizar a diversidade total da esp-
cie, e, ao mesmo tempo, minimizar o parentesco entre os mesmos
e consequentemente, a endogamia nos descendentes (FAO, 1998a;
RICHARDSON et al., 2004; RUSSELLO; AMATO, 2004; CSILLERY
et al., 2006; PEMBERTON, 2008; TORO et al., 2009). Diversas biotec-
nologias reprodutivas foram desenvolvidas e aperfeioadas em huma-
nos e animais domsticos, e vm sendo aplicadas ao melhoramento
616
gentico e conservao de recursos genticos. Exemplos incluem
inseminao articial, fertilizao in vitro, transferncia de embri-
es, monitoramento hormonal no invasivo, clonagem, formao
de bancos de germoplasma, entre outras (FAO, 1998b; POPE, 2000;
PUKAZHENTHI; WILDT, 2004 e PUKAZHENTHI et al., 2006).
No obstante a tecnologia reprodutiva adotada, o correto manejo
reprodutivo visando ao controle da endogamia crucial na manuten-
o da diversidade gentica e conservao do germoplasma no longo
prazo. Este deve, necessariamente, considerar a estrutura caracte-
rstica de cada raa ou populao e sua diversidade gentica (TORO;
CABALLERO, 2005; FERNANDEZ et al., 2008; TORO et al., 2009).
Os recentes avanos da gentica molecular geraram ferramentas
para estudos populacionais e avaliao da variabilidade gentica inter
e intrapopulacional. Mtodos moleculares utilizados para anlise de
variao gentica so mais ecientes na discriminao de subdivises
populacionais intraespeccos, do que a biometria morfolgica tra-
dicional. Genes mitocondriais e Y-especco, que possuem herana
exclusivamente materna e paterna respectivamente (so transmiti-
dos somente por fmeas ou machos), alm de padro de herana
no Mendeliana (no sofrer eventos de recombinao), podem ser-
vir como marcadores genticos, fornecendo informao necessria
para discriminao de subpopulaes, estimao de distncias gen-
ticas, assim como identicao de linhagens maternas e paternas.
Por outro lado, marcadores microssatlites, em razo da alta frequn-
cia, distribuio no genoma e polimorsmo, so muito interessantes
para estimao de distncias genticas, discriminao de subpopula-
es, mas, sobretudo, em estudos que envolvem segregao de ale-
los, identicao individual e teste de paternidade (ERIKSSON et al.,
2006; GARRIGAN; HAMMER, 2006).
O uso combinado desses marcadores associado s sosticadas
metodologias estatsticas tem se mostrado bastante eciente para
estimar variabilidade gentica, discriminar subpopulaes, inferir
distncia gentica entre populaes, inferir parentesco (corrigir ou
reconstruir pedigree) entre indivduos mantidos em cativeiro ou em
vida livre, estudos de biogeograa e padres de migrao (LOFTUS
et al., 1994; ZHIVOTOVSKY; GOODMAN, 1998; JOHNS; AVISE,
617
1998; ARBOGAST, 1999; SEIESLTAD et al., 1999; HAMMER et al.,
2001; SPRINGER et al., 2001; TOZAKI et al., 2001; ICHIKAWA et al.,
2001; LANDRY et al. 2002; YU; PENG, 2002; CAVALI-SFORZA;
FELDMAN, 2003; DENISE et al., 2003; FOKIDIS et al., 2003; WILDER
et al., 2004a; WILDER et al., 2004b; GARRIGAN; HAMMER, 2006;
TORO et al., 2009).
Teste de paternidade
O parentesco inequvoco entre os indivduos de uma popula-
o pr-condio para um programa de melhoramento gen-
tico eficiente (VAN VLECK, 1970; GELDERMANN et al., 1986;
GLOWATSKI-MULLIS et al., 1995). A estimao dos parmetros gen-
ticos populacionais e a predio do valor gentico dos indivduos so
dependentes de genealogia indubitvel (RON et al., 1995), uma vez
que dados de desempenho de animais aparentados so utilizados para
solucionar um modelo misto gerando valores genticos com proprie-
dades (Best Linear Unbiased Prediction Blup), alm dos efeitos pre-
judiciais no controle da endogamia.
Testes de paternidade em gado bovino, usando grupos sanguneos
e protenas do leite, evidenciaram uma alta frequncia de paterni-
dade incorreta em pases como Israel (5%), Alemanha (4% a 23%),
Dinamarca (8% a 30%), Holanda (8%) e Irlanda (20%), justicando a sua
utilizao em programas de melhoramento gentico (GELDERMANN
et al., 1986; BEECHINOR; KELLY, 1987; RON et al., 1995).
Erros de identicao geram estimativas tendenciosas de parme-
tros genticos populacionais (VAN VLECK, 1970). Por outro lado,
Geldermann et al. (1986) estimaram uma perda de 8,7% a 16,9% no
ganho gentico anual em bovinos de leite com 15% de erro de iden-
ticao. Ron et al. (1995) sugerem que um aumento de aproxima-
damente 5% no ganho gentico anual poderia ser obtido ao realizar
teste de paternidade na prognie dos 50 touros testados anualmente
em Israel.
As relaes de parentesco podem ser examinadas utilizando diver-
sas categorias de marcadores genticos. Se o gentipo de um prov-
vel touro for incompatvel com o gentipo da prognie, este exclu-
do de paternidade, ou seja, a prognie deve apresentar um dos alelos
618
paternais. Por outro lado, se os gentipos forem compatveis existem
duas possibilidades: (1) o touro o genitor biolgico; (2) o touro pos-
sui gentipo compatvel por acaso. A probabilidade de se encontrar
um gentipo incompatvel denominada probabilidade de excluso
(PE). Em outras palavras, a PE a probabilidade de um touro selecio-
nado aleatoriamente ser excludo de paternidade de uma prognie
tambm escolhida ao acaso (DODDS et al., 1996). A Probabilidade
de Excluso utilizando marcadores codominantes autossmicos foi
primeiramente calculada por Jamielson (1965) e posteriormente por
diversos autores (CHAKRABORTY et al., 1974; CRAWFORD et al.,
1993; JAMIELSON, 1994).
Diversos marcadores moleculares vm sendo aplicados com o
intuito de se inferir probabilidade de paternidade, cada um com suas
vantagens e desvantagens. Os RFLPs fornecem baixo contedo de
polimorsmo informativo e baixa heterozigose (LITT; LUTY, 1989).
Impresses Digitais do DNA DNA ngerprinting geradas pelo uso
de sondas minissatlites multilocais so geralmente bastante infor-
mativas, sendo, entretanto, de difcil interpretao por apresenta-
rem dominncia e, alm disso, alguns casos apresentam bandas de
diferentes loci com peso molecular semelhante e consequentemente
comigrao (JEFFREYS et al., 1991; PENA; CHAKRABORTY, 1994).
O parentesco avaliado pela utilizao de microssatlites locus espec-
co suplanta muitas das diculdades inerentes a outros tipos de mar-
cadores. Esses marcadores geralmente apresentam uma heterozigose
superior fornecida por RFLPs, sendo de interpretao mais simples
do que os padres de bandas geradas impresses digitais de DNA por
minissatlites multilocais (JAMIELSON, 1994; USHA et al., 1995). As
vantagens associadas aos microssatlites so codominncia, alto poli-
morsmo, boa distribuio, alm de facilidade de serem genotipados
por PCR, o que facilita a padronizao de protocolos entre os diversos
laboratrios (GLOWATZKI- MULLIS et al., 1995).
A abordagem locus especfico com microssatlites vem sendo
empregada na maior parte dos laboratrios que realizam teste de
paternidade em humanos nos EUA (PENA; CHAKRABORTY, 1994).
Microssatlites so utilizados para esse m em animais domsticos
como bovinos (GLOWATZKI-MULLIS et al., 1995; USHA et al., 1995;
619
VANKAN et al., 1994), sunos (HOHENHRST et al., 1994), caninos
(DOSTL; STRATIL, 1994 ), caprinos (AMIGUES et al., 1994) e ovi-
nos (ROSA et al., 2011).
Paternidade, empregando marcadores moleculares, pode ser ava-
liada a partir do ndice de paternidade (PI), que calculado pelo
mtodo de inferncia estatstica da razo de verossimilhana entre as
hipteses: (1) Ho: O candidato o pai verdadeiro e (2) H1: o pai ver-
dadeiro um macho no relacionado da mesma populao, consi-
derando a herana dos alelos marcadores, descrito em humanos por
Pena e Chakraborty (1994). O PI pode ser calculado para indivduos
com gentipo materno conhecido (BRENNER, 1997), e tambm para
indivduos com gentipo materno desconhecido (BRENNER, 1993;
MARSHALL et al., 1998; KALINOWSKI et al., 2007).
Perspectivas
Diversas abordagens genmicas, que incluem Genmica Estru-
tural (sequenciamento genmico e mapas de SNPs), Funcional
(Transcriptmica, Protemica, Glicmica e Metabolmica e outras
micas) e Comparativa (Comparao de Sequncia de DNA, RNA,
Protena, Metablitos, etc.), devem ser utilizadas, de forma sistem-
tica e integradas, para se elucidar os mecanismos genticos contro-
lando a expresso de caractersticas de importncia econmica, uma
vez que podem ser reguladas em qualquer dos nveis de um sistema
biolgico (Figura 19). Esse conhecimento servir de base ou con-
tribuir para o desenvolvimento de diversas reas de pesquisa, das
quais se destacam: Estudos de Fertilidade/Reproduo, Nutrio/
Alimentao, Comportamento/Manejo e Adaptao/Rusticidade
de animais domsticos e silvestres, caracterizao da biodiversi-
dade e diversidade gentica, assim como em estudos de Taxonomia,
Evoluo, Desenvolvimento, Simbiose e Ecologia.
620
Genmica
Glicmica
Metabolmica
Glicosilao
de protenas
Concentrao
de metablitos
Regulao
ps-traduo
mRNA
Network
Fenmica
Fisionmica
Biologia
Evolucionria
epigenmica
I
n
t
e
g
r
a
o

d
a
s

o
m
i
c
a
s

Transcriptmica
Turnover
protico
Traduo
mRNA no-codificadores
Regulao
ps-transcrio
Predio da
estrutura gnica
Sequenciamento
genmico
Coleo
de RNAs
Protemica
Clula Tecido rgo Organismo Populao Ecossistema
Figura 19. Abordagens genmicas (sistemticas e integradas) para melho-
rar o conhecimento da base gentica dos fentipos, nos diversos nveis de
um sistema biolgico.
Fonte: Adaptado de Hu et al., 2009.
Estudos avanados em Genmica Comparativa, Metagenmica e
Biologia de Sistemas podero auxiliar, por exemplo, no melhor enten-
dimento da evoluo do sistema digestivo de artiodtilos, seu desen-
volvimento embrionrio e funcionamento, assim como das complexas
interaes entre a microbiota do sistema digestivo e hospedeiro; e evo-
luo da glndula mamria em mamferos, desenvolvimento embrio-
nrio, siologia da lactao e resistncia a doenas como mastite. O
genoma bovino serve, portanto, como modelo animal para o enten-
dimento da evoluo de mamferos assim como fornece subsdios
para o aumento da produtividade de leite e carne (WOMACK, 2006;
ADELSON, 2008; ELSIK et al., 2009; TELLAM et al., 2009).
As investigaes cientcas devem ser integradas e sistemticas
para se acessar, renar e estender o conhecimento dos mecanismos
moleculares, controlando a formao, desenvolvimento e funciona-
mento do organismo como um todo, integrado a um sistema produ-
tivo ou ecossistema no caso de organismos silvestres. A viso inte-
grada/holstica da Biologia de Sistemas auxiliar no aprofundamento
621
do entendimento de caractersticas complexas como desenvolvimento
ponderal, qualidade de carcaa, produo de leite, reproduo e resis-
tncia a doenas.
Essas tecnologias genmicas empregadas como ferramentas suple-
mentares no melhoramento abriram grandes oportunidades para se
aumentar signicativamente o ganho gentico pelo aumento da acu-
rcia e, alm disso, permitem um melhor controle sobre os nveis de
endogamia e consequentemente mantm o potencial de ganho gen-
tico assim como a capacidade de adaptao. Por outro lado, infor-
mao genmica pode ser empregada para predizer o fentipo que
um determinado gentipo produzir com implicaes em prticas
de manejo que visem desenvolver ou aumentar a ecincia produ-
tiva e sustentabilidade dos sistemas produtivos existentes (Figura 20).
Melhoramento
gentico
Base genmica da diversidade biolgica
Sistemas integrados
de produo (ILPe ILPS)
Consorciamento e
rotao de culturas
Controle biolgico
de pragas
Tratamento e/ou
reciclagem de
resduos e gua
Desenvolvimento
de vacinas
Desenvolvimento
sustentvel
Biodiversidade = Qualidade de vida!!!
Seleo de
linhagens para
cruzamentos
Novos produtos,
melhoramento
qualitativo
por trasgnie
Clonagem de animais
altamente produtivos
Figura 20. Biotecnologia e desenvolvimento sustentvel.
Como resultados dos esforos internacionais, genes ou marcadores
em associao com efeito em caractersticas importantes vm sendo
identicados e utilizados em programas de melhoramento que empre-
gam MAS para genes como MC4R, DGAT, CAST. Mais recentemente,
os progressos obtidos a partir do sequenciamento do genoma bovino,
anlise de associao Genome Wide e seleo genmica em bovinos
622
de leite fazem jus s enormes esperanas depositadas na Genmica
e apontam perspectivas associadas a outras biotecnologias extrema-
mente promissoras no somente no Melhoramento Gentico, mas
tambm em Biotecnologias da Reproduo (Figura 21), em alimen-
tao com a Nutrigenmica e no manejo proltico e sanitrio com a
Farmacogenmica (Figura 22).
Aplicaes associadas outras biotecnologias
FIV-TE (maturao de ocitos, cultivo e congelamento de
embries, etc) e clonagem.
Seleo e multiplicao de indivduos jovens (tourinhos, novilhas pr-pberes
ou ainda mais jovem velogenetics e WhizzoGenetics!!!!).
Cruzamentos (otimizao de herana no aditiva, seleo de
linhagens para cruzamentos).
Figura 21. Biotecnologias da reproduo e MAS.

MAS Seleo auxiliada por marcadores.
Nutrigenmica (efeito dos alimentos sobre o genoma).
Farmacogenmica (produo de vacinas para carrapato, desenvolvimento
defarmacuticos no antibiticos e outros).
Pr e probiticos, microorganismos metanognicos e outros.
Promotores decrescimento (hormnios, b-agonistas e outros).
Identificao de patgenos (antibiograma molecular);
Fertilidade/reproduo (foliculognese, oognese: taxa de ovulao,
sincronizao, FIV, clonagem e outros).
Identificao individual/rastreabilidade.
Transgnicos (biofbricas - imunoglobulinas e outros).
Genmica animal aplicada produo animal

Figura 22. Genmica animal aplicada produo animal.
623
Referncias
ABASHT, B.; DEKKERS, J. C.; LAMONT, S. J. Review of quantitative trait loci
identified in the chicken. Poultry Science, v. 85, p. 20792096, 2006.
ADELSON, D. L. Insights and applications from sequencing the bovine genome.
Reproduction, Fertility and Development, v. 20, p. 5460, 2008.
ALVAREZ, I.; ROYO, L. J.; FERNANDEZ, I.; GUTIERREZ, J. P.; GOMEZ, E.;
GOYACHE, F. Genetic relationships and admixture among sheep breeds from
Northern Spain assessed using microsatellites. Journal of Animal Science, v. 82, n.
8, p. 2246-52, 2004.
ALVAREZ, L.; GUTIERREZ-GIL, B.; SAN PRIMITIVO, F.; DE LA FUENTE, L. F.;
ARRANZ, J. J. Inuence of prion protein genotypes on milk production traits in
Spanish Churra sheep. Journal Dairy Science, v. 89, n. 5, p. 1784-91, 2006.
AMIGUES, Y.; BRATHWAITE.; LEPIN, L.; et al. Use of microsatellites as an
alternative to blood typing in goat parentage control. In: CONFERENCE OF THE
INTERNATIONAL SOCIETY FOR ANIMAL GENETICS, 24., 1994. Proceedings
v. 25, n. 2, p. 27.
ANDERSSON, L. Genetic dissection of phenotypic diversity in farm animals.
Nature Reviews Genetics, v. 2, p. 130138, 2001. doi:10.1038/35052563
ANDERSSON, L. The role of MHC polymorphism in disease/parasite resistance.
Proccedings of the 5th World Congress on Genetics Applied to Livestock
Production, 21, p. 177-182, 1994.
ARBOGAST, B. S. Mitochondrial DNA phylogeography of the new word ying
squirrel (Glaucomys): Implications for pleistocene biogeography. Journal of
Mammalogy, v. 80, n. 1, p. 142-156, 1999.
ARCHIBALD, A. L.; HALEY, C. S.; BROWN, J. F. et al. The PiGMaP consortium
linkage map of the pig (Sus scrofa). Mammalian Genome, v. 6, p. 15775, 1995.
ARNEHEIN, N.; LI, H.; CUI, X. Genetic mapping by single sperm typing.
Proceedings of the 24th Conference of the International Society for Animal
Genetics, v. 25, n. 2, p. 105-124, 1994.
ARRANZ, J. J.; BAYON, Y.; SAN PRIMITIVO, F. Differentiation among Spanish
sheep breeds using microsatellites. Genetics Selection Evolution, v. 33, n.
5, p. 529-42, 2001.
ARRANZ, J. J.; BAYON, Y.; SAN PRIMITIVO, F. Genetic relationships among
Spanish sheep using microsatellites. Animal Genetics, v. 29, n. 6, p. 435-40, 1998.
AVISE, J. C. Phylogeography: the History and Formation of Species. Cambridge:
Harvard, 2000. 447 p.
624
BACHTROG, D. A dynamic view of sex chromosome evolution. Current Opinion
in Genetics and Development, v. 16, p. 578585, 2006.
BARENDSE, W.; ARMITAGE, S. M.; KOSSAREK, L. M.; SHALOM, A.;
KIRKPATRICK, B. W.; RYAN, A. M.; CLAYTON, D.; LI, L.; NEIBERGS, H. L.;
ZHANG, N.; GROSSE, W. M.; WEISS, J.; CREIGHTON, P.; MCCARTHY, F.;
RON, M.; TEALE, A. J.; FRIES, R.; MCGRAW, R. A.; MOORE, S. S.; GEORGES,
M.; SOLLER, M.; WOMACK, J. E.; HETZEL, D. J. S. A genetic linkage map of the
bovine genome. Nature Genetics, v. 6, p. 227- 235, 1994.
BARENDSE, W.; VAIMAN, D.; KEMP, S. J. A medium-density genetic linkage map
of the bovine genome. Mammalian Genome, v. 8, n. 1, p. 21-28, 1997.
BARRILET, F.; ARRANZ, J. J.; CARTA, A. Mapping quantitative trait loci for milk
production and genetic polymorphisms of milk proteins in dairy sheep. Genetics
Selection Evolution, v. 37, p. S109S123 S109, 2005. Supplement 1.
BECKMAN, J. S.; SOLLER, M. Toward a unied approach to genetic mapping
of eukarotes based on sequence tagged microsatellites sites. Biotechnology,
v. 8, p. 930- 932, 1990.
BEECHINOR, J. G.; KELLY, E. P. Errors of identication amongst cattle presented
of some bulls used in the articial insemination service in Ireland. Irish Veterinary
Journal, v. 41, p. 348, 1987.
BEEVER, J. E.; GEORGE, P. D.; FERNANDO, R. L.; Stormont, C. J.; Lewin, H. A.
Associations between genetic markers and growth and carcass traits in a paternal
half-sig family of Angus cattle. Journal of Animal Science, v. 68, p. 337-344, 1990.
BELFIORE, N. M.; HOFFMAN, F. G.; BAKER, R. J.; DEWOODY, J. A. The use of
nuclear and mitochondrial single nucleotide polymorphisms to identify cryptic
species. Molecular Ecology, v. 12, p. 20112017, 2003.
BENSCH, S.; KESSON, S.; IRWIN, D. E. The use of AFLP to nd an informative
SNP: genetic differences across a migratory divide in willow warblers. Molecular
Ecology, v. 11, p. 23592366, 2002.
BERALDI, D.; MCRAE, A. F.; GRATTEN, J.; SLATE, J.; VISSCHER, P. M.;
PEMBERTON, J. M. Development of a linkage map and mapping of phenotypic
polymorphisms in a free-living population of Soay sheep (Ovis aries). Genetics,
v. 173, n. 3, p. 1521-37, 2006.
BERKOV, A. The impact of redened species limits in Palame (Coleoptera:
Cerambycidae: Lamiinae: Acanthocinini) on assessments of host, seasonal, and
stratum specicity. Biological Journal of the Linnean Society, v. 76, n. 2, p. 195-209,
2009.
625
BERRYERE, T. G.; MUGGLI-COCKETT, N.; ROBBINS, J. W.; SCHMUTZ, S.
Molecular studies of DRB relative to Staphylococcus aureus mastitis. In: WORLD
CONGRESS ON GENETICS APPLIED TO LIVESTOCK PRODUCTION, 5., 1994,
Ontario. Proccedings Ontario: University of Guelph, 1994. v. 21, p. 187-190.
BILLARS, L.; HICKS, A.; BLIWISE, D.; SIGMUNDSSON, T.; SIGURDSSON, A.;
KRISTJANSSON, K.; GULCHER, J.; STEFANSSON, K.; RYE, D. Hypertension
risk and PLMS in restless legs syndrome. Sleep, v. 30, p. A297A298, 2007.
Suplement.
BINDON, B. M.; PIPER, L. R. Boorola (F) gene: major gene affecting ovine ovarian
function. In: EVANS, J. W.; HOLLAENDER, A. (Ed.). Genetic Engeneering of
Animals: an Agriculture Perspective. New York: Plenum Press, 1986. p. 678-693.
BINK, C. A. M.; VAN ARENDONK, J. A. M. Marker-assisted prediction of breeding
values in dairy cattle populations. In: WORLD CONGRESS ON GENETICS
APPLIED TO LIVESTOCK PRODUCTION, 5., 1994, Ontario. Proccedings
Ontario: University of Guelph, 1994. v. 21, p. 233-236.
BISHOP, M. D.; KAPPES, S. M.; KEELE, J. W.; STONE, R. T.; SUNDEN, S. L.;
HAWKINS, G. A.; TOLDO, S. S.; FRIES, R.; GROSZ, M. D.; YOO, J. A genetic
linkage map for cattle. Genetics, v. 136, n. 2, p. 619-39, 1994.
BLAXTER, M.; MANN, J.; CHAPMAN, T.; THOMAS, F.; WHITTON, C.; FLOYD,
R.; ABEBE, E. 2005. Dening operational taxonomic units using DNA barcode
data. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B,
Biological Science, v. 360, n. 1462, p. 1935-43, 2005.
BOTSTEIN, D.; WHITE, R. L.; SKOLNICK, M.; DAVIS, R. W. Construction of
genetic linkage maps in man using restriction fragment length polymorphism.
The American Journal of Human Genetics, v. 32, p. 314331, 1980.
BOVENHUIS, H.; ARENDONK, J. A. M.; KORVER, S. Associations between
milk protein polymorphism and production traits. Journal of Dairy Science,
v. 75, p. 2549-2559, 1992.
BRADLEY, D. G.; MACHUGH, D. E.; LOFTUS, R.; SOW, R. S.; HOSTE, C.
H.; CUNNINGHAM, E. P. Zebu-taurine variation in Y chromosomal DNA: a
sensitive assay for genetic introgression in Western African tyranotolerant cattle
populations. Animal Genetics, v. 15, p. 712, 1994.
BRAGA, M. L. de S. As polticas desenvolvimentistas e ambientais brasileiras e
seus impactos na regio dos cerrados. In: DUARTE, M. L. G.; BRAGA, M. L. de
S. (Org.). Tristes cerrados: sociedade e biodiversidade. Braslia, DF: Paralelo 5,
1998. p. 93-123.
BRENNER, C. H. A note on paternity computation in cases lacking a mother.
Transfusion, v. 33, n. 1, p. 51-54, 1993.
BRENNER, C. H. Symbolic kinship program. Genetics, v. 145, p. 535542, 1997.
626
BRUFORD, M. W.; BRADLEY, D. G.; LUIKART, G. DNA markers reveal
the complexity of livestock domestication. Nature Reviews Genetics, v. 4, n.
11, p. 900-10, 2003.
BRUMFIELD, R. T.; BEERLI, P.; NICKERSON, D. A.; EDWARDS, S. V. The utility
of single nucleotide polymorphisms in inferences of population history. Trends in
Ecology and Evolution, v. 18, p. 249256, 2003.
BULLERWELL, C. E.; GRAY, M. W. Evolution of the mitochondrial genome: protist
connections to animals, fungi and plants. Current Opinion in Microbiology, v. 7, n.
5, p. 528-34, Oct. 2004.
BUMSTEAD, N.; PALYGA, J. A preliminary linkagee map of the chicken genome.
Genomics, v. 13, p. 690697, 1992. doi:10.1016/0888-7543 (92)90143-G
BURT, D. W. The cattle genome reveals its secrets. Journal of Biology, v. 8, n. 36,
2009. DOI:10.1186/JBIOL137.
BUSKE, B.; STERNSTEIN, I.; BROCKMANN, G. QTL and candidate genes for
fecundity in sows. Animal Reproduction Science, v. 95, p. 167183, 2006. doi:
10.1016/j.anireprosci.2005.12.015
CARDENAS, M.; HIGGINBOTHAM, J.; CARTER, J.; MCGRANE, R.; GAIGE,
T.; MEAD, K.; WALKER, J.; ALBRACHT, D.; DAVITO, J.; YANG, S-P.; LEONG,
S.; CHINWALLA, A.; SEKHON, M.; WYLIE, K.; DODGSON, J.; ROMANOV, M.
N.; CHENG, H.; DE JONG, P. J.; OSOEGAWA, K.; NEFEDOV, M.; ZHANG, H.;
MCPHERSON, J. D.; KRZYWINSKI, M.; SCHEIN, J.; HILLIER, L.; MARDIS,
E. R.; WILSON, R. K.; WARREN, W. C. A physical map of the chicken genome.
Nature, v. 432, p. 761764, 2004. doi:10.1038/nature03030
CAVALI-SFORZA, L. L.; FELDMAN M. W. The application of molecular genetic
approaches to the study of human evolution. Nature Genetics, v. 33, p. 5266-5275,
2003.
CEPICA, S.; WOLF, J.; HOJN, J.; Vackov, I.; Schrffel JUNIOR, J. Relations
between genetic distance of parental pig breeds and heterozygosity of their F1
crosses measured by genetic markers. Animal Genetics, v. 26, p. 135- 140, 1995.
CHAKRABORTY, R.; SHAW, M.; SCHULL, W. J. Exclusion of paternity: The
current state of the art. American Journal of Human Genetics, v. 26, p. 477-488,
1974.
CHANTRY-DARMON, C.; URIEN, C.; DE ROCHAMBEAU, H.; ALLAIN, D.;
PENA, B.; HAYES, H.; GROHS, C.; CRIBIU, E. P.; DERETZ-PICOULET, S.;
LARZUL, C.; SAVE, J. C.; NEAU, A.; CHARDON, P.; ROGEL-GAILLARD, C. A
rstgeneration microsatellite-based integrated genetic and cytogenetic map for the
European rabbit (Oryctolagus cuniculus) and localization of angora and albino.
Animal Genetics, v. 37, p. 335341, 2006. doi: 10.1111/j.1365-2052.2006.01462.x
627
CHEN, K.; BAXTER, T.; MUIR, W. M.; GROENEN, M. A.; SCHOOK, L. B. Genetic
resources, genome mapping and evolutionary genomics of the pig (Sus scrofa).
International Journal of Biological Science, v. 3, p. 153165, 2007.
CHEN, X.; SULLIVAN, P. F. Single nucleotide polymorphism genotyping:
biochemistry, protocol, cost and throughput. Pharmacogenomics Journal,
v. 3, p. 7796, 2003.
COLTMAN, D. W.; WILSON, K.; PILKINGTON, J. G.; STEAR, M. J.;
PEMBERTON, J. M. A microsatellite polymorphism in the gamma interferon
gene is associated with resistance to gastrointestinal nematodes in a
naturally-parasitized population of Soay sheep. Parasitology, v. 122, p. 571-582,
2001.
Connelly, t.; Aerts, J.; Law, A.; Morrison, W. I. Genomic analysis reveals extensive
duplication within the bovine TRB lcus. BMC Genomics, v. 10, p. 192, 2009.
CORCORAN, D.; FAIR, T.; PARK, S.; RIZOS, D.; PATEL, O. V.; Suppressed
expression of genes involved in transcription and translation in in vitro compared
with in vivo cultured bovine embryos. Reproduction, v. 131, p. 651 660, 2006.
doi:10.1530/REP.1.01015
COUTINHO, L. L.; REGITANO, L. C. A. O uso de marcadores moleculares na
indstria animal. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE REPRODUO ANIMAL,
11., 1995, Belo Horizonte. Anais... Belo Horizonte: CBRA, 1995. v. 1, p. 195-205.
COWAN, C. M.; DENTINE, M. R.; AX, R. L.; Schuler, L. A. Structural variation
around prolactin gene linked to quantitative traits in elite Hostein sire family.
Theoretical and Applied Genetics, v. 79, p. 566-582, 1990.
CRAWFORD, A. M.; DODDS, K. G.; EDE, A. J.; PIERSON, C. A.; MONTGOMERY,
G. W.; GARMONSWAY, H. G.; BEATTIE, A. E.; DAVIES, K.; MADDOX, J. F.;
KAPPES, S. W.; STONE, R. T.; NGUYEN, T. C.; PENTY, J. M.; LORD, E. A.;
BROOM, J. E.; BUITKAMP, J.; SCHWAIGER, W.; EPPLEN, J. T.; MATTHEW, P.;
MATTHEWS, M. E.; HULME, D. J.; BEH, K. J.; MCGRAW, R. A.; BEATTIE, C. W.
An autosomal genetic linkage map of the sheep genome. Genetics, v. 140, p. 703
724, 1995.
CRAWFORD, A. M.; TATE, M. L.; MCEWAN, M. L.; Kumaramanickavel, G.;
McEwan, K. M.; Dodds, K. G.; Swarbrick, P. A.; Thompson, P. How reliable are
sheep pedigrees? Proceedings of the New Zealand Society of Animal Production,
v. 53, p. 363- 366, 1993.
CRITTENDEN, L. B.; PROVENCHER, L.; SANTANGELO, L.; LEVIN,
I.; ABPLANALP, H.; BRILES, R.W.; BRILES, W. E.; DODGSON, J. B.
Characterization of a red jungle fowl by white leghorn backcross reference
population for molecular mapping of the chicken genome. Poultry Science,
v. 72, p. 334 348, 1993.
628
CSILLERY, K.; JOHNSON, T.; BERALDI, D.; CLUTTON-BROCK, T.; COLTMAN,
D.; HANSSON, B.; SPONG, G.; PEMBERTON, J. M Performance of Marker-Based
relatedness estimators in natural populations of outbred vertebrates. Genetics,
v. 173, p. 2091- 2101, 2006.
DALRYMPLE, B. Virtual Sheep Genome. 2006. Disponvel em: <http://www.
livestockgenomics.csiro.au/sheep/vsheep.php>. Acesso em: 1 ago. 2007.
DE KONING, D. J.; CABRERA, C. P.; HALEY, C. S. Genetical genomics:
combining gene expression with marker genotypes in poultry. Poultry Science,
v. 86, p. 15011509, 2007.
DEL LAMA, S. N.; ZAGO, M. A. Identication of the Kapa-casein and
Beta-lactoglobulin genotypes in Brasilian Bos indicus and Bubalus bubalis
populations. Brasilian Journal of Genetics, v. 19, p. 73-77, 1996.
DELESPAUX, V.; AYRAL, F.; GEYSEN, D.; GEERTS, S. PCR-RFLP using
Ssu-rDNA amplication: applicability for the diagnosis of mixed infections
with different trypanosome species in cattle. Veterinary Parasitology, v. 117, n.
3, p. 185-193, 2003.
DENG, W.; SHI, B.; HE, X.; ZHANG, Z.; XU, J.; LI, B.; YANG, J.; LING, L.; DAI,
C.; QIANG, B.; SHEN, Y.; CHEN, R. Evolution and migration history of the
Chinese population inferred from Chinese Y-chromosome evidence. Journal of
Human Genetics, v. 49, p. 339348, 2004.
DENISE, S.; JOHNSTON, E.; HALVERSON, J.; MARSHALL, K.; ROSENFELD,
D.; MCKENNA, S.; SHARP, T.; EDWARDS, J. Power of exclusion for parentage
verication and probability of match for identity in American kennel club breeds
using 17 canine microsatellite markers. Animal Genetics, v. 35, p. 14- 17, 2003.
DENNIS, J. A.; HEALY, P. J.; BEAUDET, A. L.; OBrien, W. E. Molecular denition
of bovine arginiosuccinate synthetase deciency. Proceedings of the National
Academy of Science-USA, v. 86, p. 7947-7951, 1989.
DIEZ-TASCON, C.; LITTLEJOHN, R. P.; ALMEIDA, P. A.; CRAWFORD, A.
M. Genetic variation within the Merino sheep breed: analysis of closely related
populations using microsatellites. Animal Genetics, v. 31, n. 4, p. 243-51, 2000.
DOSTL, J.; STRATIL, A. Polymorphic markers as tolls for paterity control in
dogs. In: CONFERENCE OF THE INTERNATIONAL SOCIETY FOR ANIMAL
GENETICS, 24., Prague, 1994. Proceedings... Animal Genetics, 1994. v. 25, p.13.
DUARTE, J. M. B.; GONZLEZ, S.; MALDONADO, J. E. The surprising
evolutionary history of South American deer. Molecular Phylogenetics and
Evolution, v. 49, p. 1722, 2008.
629
DUERR, R. H.; TAYLOR, K. D.; BRANT, S. R.; RIOUX, J. D.; SILVERBERG, M. S.;
DALY, M. J.; STEINHART, A. H.; ABRAHAM, C.; REGUEIRO, M.; GRIFFITHS,
A.; DASSOPOULOS, T.; BITTON, A.; YANG, H.; TARGAN, S.; DATTA, L. W.;
KISTNER, E. O.; SCHUMM, L. P.; LEE, A. T.; GREGERSEN, P. K.; BARMADA, M.
M.; ROTTER, J. I.; NICOLAE, D. L.; CHO, J. H. A genome-wide association study
identies IL23R as an inammatory bowel disease gene. Science, v. 314, p. 1461
1463, 2006. doi:10.1126/science.1135245
EDWARDS, C. J.; GAILLARD, C.; BRADLEY, D. G.; MACHUGH, D. E. Y-specic
microsatellites polymorphisms in a range of bovid species. Animal Genetics,
v. 31, p. 127-130, 2000.
ELLIS; P. J.; AFFARA, N. A. Spermatogenesis and sex chromosome gene
content: an evolutionary perspective. Human fertility (Cambridge, England),
v. 9, p. 1, p. 1-7, 2006.
EL-SAYED, A.; HOELKER, M.; RINGS, F.; SALILEW, D.; JENNEN, D.; THOLEN,
E.; SIRARD, M. A.; SCHELLANDER, K.; TESFAYE, D. Large-scale transcriptional
analysis of bovine embryo biopsies in relation to pregnancy success after
transfer to recipients. Physiological Genomics, v. 28, p. 8496, 2006. doi:10.1152/
PHYSIOLGENOMICS.00111.2006
ELSIK, C. G.; TELLAM, R. L.; WORLEY, K. C.; GIBBS, R. A.; The Bovine Genome
Sequencing and Analysis Consortium. The Genome Sequence of Taurine Cattle: A
Window to Ruminant Biology and Evolution. Science, v. 324, p. 522-528, 2009.
EMERY, A. E. H.; MALCON, S. An introduction to recombinant DNA in medicine.
Hoboken: John Willey, 1995.
ERIKSSON, J.; SIEDEL, H.; LUKAS, D.; KAYSER, M.; ERLER, A.; HASHIMOTO,
C.; HOHMANN, G.; BOESCH, C.; VIGILANT, L. Y-chromosome analysis conrms
highly sex-biased dispersal and suggests a low male effective population size in
bonobos (Pan paniscus). Molecular Ecology, v. 15, n. 4, p. 939-949, 2006.
FALCONER, D. S.; MACKAY, T. F. C. Introduction to quantitative genetics. 4
th
. ed.
Harlow: Longmans Green, 1996.
FAO. New developments in biotechnology and their implications for the
conservation of farm animal genetic resources: reversible DNA quiescence and
somatic cell cloning. Report on a joint workshop of FAO and Istituto Sperimentale
per la Zootechnia Monterotondo. Rome, 1998b.
FAO. Secondary Guidelines for Development of National Farm Animal Genetic
Resources Management Plans. Management of Small Populations at Risk. Rome,
1998a.
630
FERNNDEZ, H.; HUGHES, S.; VIGNE, J.-D.; HELMER, D.; HODGINS, G.;
MIQUEL, C.; HNNI, C.; LUIKART, G.; TABERLET, P. Divergent mtDNA
lineages of goats in an Early Neolithic site, far from the initial domestication areas.
Proceedings of the National Academy of Sciences-USA, v. 103, p. 1537515379,
2000.
FERNANDEZ, J.; TORO, M. A.; CABALLERO, A. Management of Subdivided
Populations in Conservation Programs: Development of a Novel Dynamic System.
Genetics, v. 179, p. 683692, 2008.
FICETOLA, G. F.; MIAUD, C.; POMPANON, F.; TABERLET, P. Species detection
using environmental DNA from water samples. Biology Letters, v. 4, p. 423-425,
2008.
FLORES, R.; RICHARDSON, T. Genetic engineering o the caseins to modify
the behavior of milk during processing a review. Journal of Dairy Science,
v. 71, p. 2640-2654, 1988.
FOKIDIS, H. B.; SCHABLE, N. A.; HAGEN, C.; GLENN, T. C.; RISCH, T. S.
Characterization of microsatellite DNA loci for the southern ying squirrel
(Glaucomys volans). Molecular Ecology Notes, v. 3, p. 616- 618, 2003.
FOUQUET, A.; GILLES, A.; VENCES, M.; MARTY, C.; BLANC, M.; GEMMELL,
N.J. Underestimation of species richness in neotropical frogs revealed by mtDNA
analyses. PLoS One, v. 2, n. 10, p. e1109, 2007.
FRANZ LANG, B.; BURGER, G.; OKELLY, C. J.; CEDERGREN, R.; GOLDING,
G. B.; LEMIEUX, C.; SANKOFF, D.; TURMEL, M.; GRAY, M. W. An ancestral
mitochondrial DNA resembling a eubacterial genome in miniature. Nature,
v. 387, p. 493 497, 1997.
FREEMAN, A. R.; MEGHEN, C. M.; MACHUGH, D. E.; LOFTUS, R. T.;
ACHUKWI, M. D.; BADO, A.; SAUVEROCHE, B.; BRADLEY, D. G. Admixture
and diversity in West African cattle populations. Molecular Ecology, v. 13, n.
11, p. 3477-87, 2004.
FRIES, R.; EGGEN, A.; WOMACK, J. E. The bovine genome map. Mammalian
Genome, v. 4, p. 405-428, 1993.
FRIES, G.; BECKMANN, J. S.; GEORGES, M.; SOLLERO, M.; WOMACK, J. The
bovine gene map. Animal Genetics, v. 20, n. 2, p. 3-29, 1989.
FRIES, R. Mapping the bovine genome: Methodological aspects and strategy.
Animal Genetics, v. 24, p. 111-116, 1993.
GAO, Y.; ZHANG, R.; HU, X. X.; LI, N. Application of genomic technologies to the
improvement of meat quality of farm animals. Meat Science, v. 77, p. 3645, 2007.
doi:10.1016/j.meatsci.2007.03.026
631
GARCIA-CLOSAS, M.; MALATS, N.; REAL, F. X.; YEAGER, M.; WELCH,
R.; SILVERMAN, D.; KOGEVINAS, M.; DOSEMECI, M.; FIGUEROA, J.;
CHATTERJEE, N.; TARDN, A.; SERRA, C.; CARRATO, A.; GARCA-CLOSAS,
R.; MURTA-NASCIMENTO, C.; ROTHMAN, N.; CHANOCK, S. J. Large-scale
evaluation of candidate genes identies associations between VEGF
polymorphisms and bladder cancer risk. PLoS Genetics, v. 3, p. 287293, 2007.
doi:10.1371/JOURNAL.PGEN.0030029
GARRIGAN, D.; HAMMER; M. F. Reconstructing human origins in the genomic
era. Nature Reviews Genetics, v. 7, p. 669-690, 2006.
GASTON, K. J.; ONEILL, M. A. Automated species identication: why not?
Philosophical Transactions of the Royal Society of London, v. 359, p. 655-667, 2004.
GELDERMANN, H.; PIEPER, U.; WEBER, W. E. Effect of misidentication on the
estimation of breeding value and heritability in cattle. Journal of Animal Science,
v. 63, p. 1759- 1768, 1986.
GENE ONTOLOGY CONSORTIUM. The Gene Ontology (GO) project in 2006.
Nucleic Acids Research, v. 34, p. D322D326, 2006. doi:10.1093/NAR/GKJ021
GEORGES, M.; DIETZ, A. B.; MISHRA, A.; Nielsen, D. L.; Sargeant, S.; Sorensen,
A.; Steele, M. R.; Zhao, X.; Leipold, H.; Womack, J. E. Microsatellite mapping
of the gene causing weaver disease in cattle will allow the study of an associated
quantitative triat locus. Proceedings of the National Academy of Science-USA,
v. 90, p. 1058-1062, 1993a.
GEORGES, M.; DRINKWATER, R.; KING, T.; Mishra, A.; Moore, S. S.; Nielsen, D.;
Sargeant, L. S.; Sorensen, A.; Steele, M. R.; Zhao, X. Microsatellite mapping of the
gene affecting horn development in Bos taurus. Nature Genetic, v. 4, p. 206-208,
1993b.
GEORGES, M.; LATHOROP, M.; BOUQUET, Y.; Hilbert, P.; Marcotte, A.;
Schwers, A.; Roupain, J.; Vassart, G.; Hanset, R. Linkage relationships among 20
genetics markers in cattle. Evidence for linkage between two pairs of blood group
systems: B-Z and S-F/V respectively. Animal Genetics, v. 21, p. 95-105, 1990.
GEORGES, M.; LEQUARRE, A. S.; CASTELLI, M.; Hanset, R.; Vassart, G. DNA
ngerprinting in domestical animals using four diferent minisatellite probes.
Cytogenetics and Cell Genetics, v. 47, p. 127-131, 1988.
GEORGES, M.; LEQUARRE, A. S.; CASTELLI, M.; HANSET, R.; VASSART, G.
DNA ngerprinting in domestical animals using four diferent minisatellite probes.
Cytogenetics and Cell Genetics, v. 47, p. 127-131, 1988.
GEORGES, M.; MASSEY, J. M. Velogenetics, or the synergistic use of marker
assisted selection and germ-line manipulation. Theriogenology, v. 35, p. 151-159,
1991.
632
GEORGES, M.; NIELSEN, D.; MACHINNON, M.; A. MISHRA, R.; OKIMOTO,
A. T.; PASQUINO, L. S.; SARGEANT, A.; SORENSEN, M. R.; STEELE, X.;
ZHAO, J. E.; WOMACK; HOESCHELE, I. Mapping quantitative trait loci
controling milk production in dairy cattle by exploiting progeny testing. Genetics,
v. 139, p. 907-920, 1995.
GIBBS, R.; WEINSTOCK, G.; KAPPES, S.; SCHOOK, L.; SKOW, L.; WOMACK,
J. E. Bovine genomic sequencing initiative: cattleizing the human genome. 2002.
Available at http://www.genome.gov/Pages/Research/Sequencing/SeqProposals/
BovineSEQ.pdf [Veried 1 August 2007].
GIUFFRA, E.; KIJAS, J. M.; AMARGER, V.; CARLBORG, O.; JEON, J. T.;
ANDERSSON, L. The origin of the domestic pig: independent domestication and
subsequent introgression. Genetics, v. 154, n. 4, p. 1785-1791, 2000.
GJERTSON, D. W.; MORRIS, J. W. Assessing probability of paternity and the
product rule in the DNA systems. Genetica, v. 96, p. 89-98, 1995.
GLAUBITZ, J. C.; RHODES JUNIOR, O. E.; DEWOODY, J. A. Prospects for
inferring pairwise relationships with single nucleotide polymorphisms. Molecular
Ecology, v. 12, p. 10391047, 2003.
GLOWATSKI-MULLIS, M. L.; GAILLARD, C.; WIGGER, G.; FRIES, R.
Microsatellite-based parentage control in cattle. Animal Genetics, v. 26, n.
1, p. 7-12, 1995.
GODDARD, M. E.; HAYES, B. J. Mapping genes for complex traits in domestic
animals and their use in breeding programmes. Nature Reviews Genetics,
v. 10, p. 381 -391, 2009.
GONGORA, J.; MORALES, S.; BERNAL, J. E.; MORAN, C. Phylogenetic divisions
among Collared peccaries (Pecari tajacu) detected using mitochondrial and nuclear
sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution, v. 41, p. 111, 2006.
GOODMAN, S. J. Patterns of extensive genetic differentiation and variation among
European harbor seals (Phoca vitulina vitulina) revealed using microsatellite DNA
polymorphisms. Molecular Genetics and Evolution, v. 15, n. 2, p. 104- 118, 1998.
GRAVES, J. A. Sex chromosome specialization and degeneration in mammals.
Cell, v. 124, n. 5, p. 901-14, 2006.
GRAY, M. W.; BURGER, G.; FRANZ LANG, B. Mitochondrial Evolution. Science,
v. 283, p. 1476-1481, 1999.
GRAY, M. W.; LANG, B. F.; BURGER, G. Mitochondria of protists. Annual Review
of Genetics, v. 38, p. 477-524, 2004.
GREEN, R. D.; COCKETT, N. E.; MILLER, M. F.; Hancock, D. L.; Bidwell, C.;
Barrett, L. S.; Morgan, J. B.; Tatum, J. D. Characterization of Taq I polymorphisms
in the bovine calpastatin gene. In: WORLD CONGRESS ON GENETICS APPLIED
TO LIVESTOCK PRODUCTION, 5., 1994. Proccedings p. 450-453.
633
Grisart, B.; Coppieters, W.; Farnir, F.; Karim, L.; Ford, C.; Berzi, P.; Cambisano,
N.; Mni, M.; Reid, S.; Simon, P.; Spelman, R.; Georges, M.; Snell, R. Positional
candidate cloning of a QTL in dairy cattle: Identication of a missense mutation in
the bovine DGAT1 gene with major effect on milk yield and composition. Genome
Research, v. 12, p. 222- 231, 2002.
GROBET, L.; MARTIN, L. J.; PONCELET, D.; PIROTTIN, D.; BROUWERS,
B.; RIQUET, J.; SCHOEBERLEIN, A.; DUNNER, S.; MENISSIER, F.;
MASSABANDA, J.; FRIES, R.; HANSET, R.; GEORGES, M. A deletion in the
bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle. Nature
Genetics, v. 17, p. 7174, 1997.
GROBET, L.; PONCELET, D.; ROYO, L. J.; BROUWERS, B.; PIROTTIN, D.;
MICHAUX, C.; MENISSIER, F.; ZANOTTI, M.; DUNNER, S.; GEORGES, M.
Molecular denition of an allelic series of mutations disrupting the myostatin
function and causing double-muscling in cattle. Mammalian Genome, v. 9, p. 210
213, 1998.
GROENEN, M. A. M.; CHENG, H. H.; BUMSTEAD, N.; BENKEL, B. F.; BRILES,
W. E.; BURKE, T.; BURT, D. W.; CRITTENDEN, L. B.; DODGSON, J.; HILLEL,
J.; LAMONT, S.; DE LEON, A. P.; SOLLER, M.; TAKAHASHI, H.; VIGNAL, A. A
consensus linkage map of the chicken genome. Genome Research, v. 10, p. 137
147, 2000.
GROENEN, M. A. M.; CROOIJMANS, R. P. M. A.; VEENENDAAL, A.; CHENG,
H. H.; SIWEK, M,; VAN DER POEL, J. J. A comprehensive microsatellite linkage
map of the chicken genome. Genomics, v. 49, p. 265274, 1998. doi: 10.1006/
geno.1998.5225
GROVES, C. P.; GRUBB, P. The suborder Suiformes. In: OLIVER, W. L. R.
(Ed.). Pigs, Peccaries and Hippos IUCN. Gland: The World Conservation Union,
1993. p. 14.
GUDBJARTSSON, D. F.; ARNAR, D. O.; HELGADOTTIR, A.; GRETARSDOTTIR,
S.; HOLM, H.; Sigurdsson, A., Jonasdottir, A.; Baker, A.; Thorleifsson, G.;
Kristjansson, K.; Palsson, A. Variants conferring risk of atrial brillation on
chromosome 4q25. Nature, v. 448, p. 353357, 2007. doi:10.1038/NATURE06007
GUDMUNDSSON, J.; SULEM, P.; MANOLESCU, A.; AMUNDADOTTIR, L. T.;
GUDBJARTSSON, D.; Helgason, A.; Rafnar, T.; Bergthorsson, J. T.; Agnarsson, B.
A.; Baker, A. Genome-wide association study identies a second prostate cancer
susceptibility variant at 8q24. Nature Genetics, v. 39, p. 631637, 2007. doi:10.1038/
NG1999
GUO, J.; DU, L. X.; MA; Y. H.; GUAN, W. J.; LI, H. B.; ZHAO, Q. J.; LI, X.; RAO, S.
Q. A novel maternal lineage revealed in sheep (Ovis aries). Animal Genetics, v. 36,
n. 4, p 331-336, 2005.
634
GUO, Y.; MAO, H.; REN, J.; YAN, X., DUAN, Y., YANG, G., REN, D., ZHANG,
Z., YANG, B., OUYANG, J., BRENIG, B., HALEY, C., HUANG, L. A linkage map
of the porcine genome from a large-scale White Duroc X Erhualian resource
population and evaluation of factors affecting recombination rates. Animal
Genetics, v. 40, p. 4752, 2009.
GUYONNET-DUPERAT, V.; GEVERINK, N.; PLASTOW, G. S.; EVANS, G.;
OUSOVA, O.; CROISETIERE, C.; FOURY, A.; RICHARD, E.; MORMEDE,
P.; MOISAN,M. P. Functional implication of an Arg307Gly substitution in
corticosteroid-binding globulin, a candidate gene for a quantitative traitlocus
associated with cortisol variability and obesity in pig. Genetics, v. 173, p. 2143
2149, 2006. doi:10.1534/genetics.105.053983
GVOZDEV, V. A.; KOGAN, G. L.; USAKIN, L. A. The Y chromosome as a target
for acquired and amplied genetic material in evolution. Bioessays, v. 27, n.
12, p. 1256-62, 2005.
HABERFELD A.; DUNNINGTON, E. A.; SIEGEL, P. B.; HILLEL J. Heterosis and
DNA ngerprinting in chickens. Poultry Science, v. 75, p. 951- 953, 1996
HAFEZ, I. S. E. Reproduo animal. 4. ed. So Paulo: Manole, 1988. 720 p.
HAIG S.M. Molecular Contributions to Conservation. Ecology, v. 79, p. 413-425,
1998.
HALEY, C. S.; KNOTT, S. A. A simple regression method for mapping quantitative
trait loci in line crosses using anking markers. Heredity, v. 69, p. 315332, 1992.
HALEY, C. S.; KNOTT, S. A.; ELSEN, J. M. Mapping quantitative trait loci in crosses
between outbred lines using least squares. Genetics, v. 136, p. 11951207, 1994.
HALEY, C. S.; VlSSCHER, P. M. Strategies to Utilize Marker-Quantitative Trait Loci
Associations. Journal of Dairy Science, v. 81, n. 2, p. 85-97, 1998.
HAMADA, H.; PETRINO, M.; KAKUNAGA, T. A novel repeated element with
Z-DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 79, p. 6465-6469,
1982.
HAMMER, M. F.; KARAFET, T. M.; REDD, A. J.; JARJANAZI, H.;
SANTACHIARA-BENERECETTI, S.; SOODYALL, H.; ZEGURA, S. L. Hierarchical
patterns of global human Y-chromosome diversity. Molecular Biology and
Evolution, v. 18, n. 7, p. 1189-203, 2001.
HANOTTE, O.; TAWAH, C. L.; BRADLEY, D. G.; OKOMO, M.; VERJEE, Y.;
OCHIENG, J.; REGE, J. E. Geographic distribution and frequency of a taurine Bos
taurus and an indicine Bos indicus Y specic allele amongst sub-saharan African
cattle breeds. Molecular Ecology, v. 9, n. 4, p. 387-396, 2000.
HANSET, R.; MICHAUX, C. On the genetic determinism of muscular hypertophy
in the Belgian White and Blue cattle breed. Il. Population data. Genetics Selection
and Evolution, v. 17, p.3, n. 269-386, 1985.
635
HAYES, B. J.; BOWMAN, P. J.; CHAMBERLAIN, A. C.; GODDARD, M. E.
Genomic selection in dairy cattle: Progress and challenges. Journal of Dairy
Science, v. 92, p. 433443, 2009.
HEALY, P. J.; DENNIS, J. A. Inherited diseases in beef cattle in Australia. WORLD
CONGRESS ON GENETICS APPLIED TO LIVESTOCK PRODUCTION, 5., 1994.
Proccedings v. 21, p. 183-184.
HEBERT, P. D. N.; RATNASINGHAM, S.; DE WAARD, J. R. Barcoding animal
life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species.
Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, v. 270, p. S96S99, 2003b.
HELGADOTTIR, A.; THORLEIFSSON, G.; MANOLESCU, A.;
GRETARSDOTTIR, S.; BLONDAL, T.; Jonasdottir, A.; Jonasdottir, A.; Sigurdsson,
A.; Baker, A.; Palsson, a.; A common variant on chromosome 9p21 affects the
risk of myocardial infarction. Science, v. 316, p. 14911493, 2007. doi:10.1126/
SCIENCE.1142842
HELLBORG, L.; ELLEGREN, H. Low levels of nucleotide diversity in mammalian
Y chromosomes. Molecular Biology and Evolution, v. 21, n. 1, p. 158-163, 2004.
HENDERSON, C. R. Use of an average numerator relationship matrix for multiple
sire joining. Journal of Animal Science, v. 66, p. 1614-1621, 1988.
HERRERA, A.; HRY, M.; STACH, J. E. M.; JAFFR, T.; NORMAND, P.;
NAVARRO, E. Species richness and phylogenetic diversity comparisons of soil
microbial communities affected by nickel-mining and revegetation efforts in New
Caledonia. European Journal of Soil Biology, v. 43, p. 130-139, 2007.
HIENDLEDER, S.; KAUPE, B.; WASSMUTH, R.; JANKE, A. Molecular analysis of
wild and domestic sheep questions current nomenclature and provides evidence
for domestication from two different subspecies. Proceedings of the Royal Society
B: Biological Sciences, v. 269, n. 1494, p. 893-904, 2002.
HIENDLEDER, S.; LEWALSKI, H.; JANKE, A. Complete mitochondrial genomes
of Bos taurus and Bos indicus provide new insights into intra-species variation,
taxonomy and domestication. Cytogenet. Genome Research, v. 120, n. 1-2, p. 150-6,
2008.
HILLEL, J.; SCHAAP, T.; HABERFIELD, A.; JEFFREYS, A. J.; PLOTZKY, Y.;
CAHANER, A.; DNA ngerprints applied to genome introgression in breeding
programes. Genetics, v. 124, p. 783-789, 1990.
HIRSCHHORN, J. N.; DALY, M. J. Genome-wide association studies for common
diseases and complex traits. Nature Reviews Genetics, v. 6, p. 95108, 2005.
doi:10.1038/nrg1521
HOESCHELE, I.; MEINERT, T.R. Association of genetic defects with yield and type
traits: the weaver locus effect on yield. Journal of Dairy Science, v. 73, p. 2503-2515,
1990.
636
HOHENHRST, J.; FRIES, R.; VGELI, E.; Stranzinger, G. Use of microsatellites
for parentage control in pigs. In: CONFERENCE OF THE INTERNATIONAL
SOCIETY FOR ANIMAL GENETICS, 24., Prague, 1994. Proceedings Animal
Genetics, v. 25, n. 2, p. 33, 1994.
HOLMES, N. G. Microsatellite markers and the analysis of genetic disease. British
Veterinary Journal, v. 150, p. 411-421, 1994.
Hori-Oshima, S.; Barreras-Serrano, A. Relationship between DGAT1 and Pit-1
genes polymorphism and Milk yield in holstein cattle. Journal Animal Science,
v. 81, p. 253, 2003. Supplement 1. Disponvel em: <http://www.asas.org/
western03/data/1000757.pdf>. Acesso em: 16 jul. 2009. Proceedings, Western
Section, American Society of Animal Science, v. 54, 2003.
HU, X.; GAO, Y.; FENG, C.; LIU, Q.; WANG, X.; DU, Z.; WANG, Q.; LI, N.
Advanced technologies for genomic analysis in farm animals and its application for
QTL mapping. Genetica, v. 136, p. 371386, 2009. DOI 10.1007/s10709-008-9338-7
HU, Z. L.; FRITZ, E. R.; REECY, J. M. AnimalQTLdb: a livestock QTL database tool
set for positional QTL information mining and beyond. Nucleic Acids Research,
v. 35, p. D604D609, 2007. doi:10.1093/nar/gkl946
HUANG, Y.; ZHAO, Y.; HALEY, C. S.; HU; HAO, J.; WU, C.; LI, N. A genetic and
cytogenetic map for the duck (Anas platyrhynchos). Genetics, v. 173, p. 287296,
2006. doi:10.1534/genetics.105.053256
HUGHES, A. L.; NEI, M. Nucleotide substitution at major histocompatibility
complex class II loci: evidence for overdominance selection. Proceedings of the
National Academy of Science-USA, v. 86, p. 958-962, 1989.
HUGHES, A. L.; NEI, M. Pattern of nucleotide substitution at major
histocompatibility complex class I loci reveals overdominant selection. Nature,
v. 335, p. 167-170, 1988.
ICHIKAWA, Y.; TAKAGI, K.; TSUMAGARI, S.; ISHIHAMA, K.; MORITA, M.;
KANEMAKI, M.; TAKEISHI, M.; TAKAHASHI, H. Canine parentage testing
based on microsatellite polymorphisms. Journal of Veterinary Medical Science,
v. 63, n. 11, p. 1209- 1213, 2001.
JAMIELSON, A. The effectiveness of using co-dominant polymorphic allelic series
for (1) checking pedigrees and (2) distinguishing full-sib pair members. Animal
Genetics, v. 25, p. 37-44, supl 1, 1994.
JAMIESON, A. The genetics of transferrins in cattle. Heredity, v. 20, p. 419-441,
1965.
JEFFREYS, A. J.; TURNER, M.; DEBENHAN, P. The efciency of multilocus
DNA ngerpriting probes for individualization and establishment of family
relationships, determinaed from extensive casework. Americam Journal of Human
Genetics, v. 48, p. 824-840, 1991.
637
JEFFREYS, A. J.; WILSON, V.; THEIN S. L. Hypervariable minisatellite regions in
the human DNA. Nature, v. 314, p. 67-73, 1985a.
JEFFREYS, A. J.; WILSON, V.; THEIN, S. L. Individual specic ngerprints of
human DNA. Nature, v. 316, p. 76- 79, 1985b.
JEON, J. T.; CARLBORG, O.; TORNSTEN, A.; GIUFFRA, E.; AMARGER, V.;
CHARDON, P.; ANDERSSON-EKLUND, L.; ANDERSSON, K.; HANSSON,
I.; LUNDSTROM, K.; ANDERSSON, L. A paternally expressed QTL affecting
skeletal and cardiac muscle mass in pigs maps to the IGF2 locus. Nature Genetics,
v. 21, p. 157158, 1999. doi:10.1038/5938
JEON, J. T.; PARK, E. W.; JEON, H. J.; KIM, T. H.; LEE, K. T.; CHEONG, I. C. A
large-insert porcine library with sevenfold genome coverage: a tool for positional
cloning of candidate genes for major quantitative traits. Molecules and Cells,
v. 16, p. 113116, 2003.
JOHNS, G. C.; AVISE, J. C. A comparative summary of genetic distances in the
vertebrates from the mitochondrial cytochrome b gene. Molecular Genetics and
Evolution, v. 15, n. 11, p. 1481- 1490, 1998.
JOLLS, P.; JOLLS, J. Whats new in lysozyme research? Always a model sistem,
today as yesterday. Molecular and Cellular Bioquemistry, v. 63, p. 165-189, 1984.
JOLLY, R.D.; VAN-DE-WATER, N.S.; RICHARDS, R.B.; DORLING P.R.
Generalised glycogenesis in beef shorthorn cattle- heterozygote detection.
Australian Veterinary Journal, v. 57, p. 227-229, 1977.
JOSHI, M. B.; ROUT, P. K.; MANDAL, A. K.; TYLER-SMITH, C.; SINGH, L.;
THANGARAJ, K. Phylogeography and origin of Indian domestic goats. Molecular
Biology and Evolution, v. 21, n. 3, p. 454-462, 2004.
JUNGERIUS, B. J.; VAN LAERE, A. S. T. E.; PAS, M. F.; VAN OOST, B. A.;
ANDERSSON, L.; GROENEN, M. A. The IGF2-intron3-G3072A substitution
explains a major imprinted QTL effect on backfat thickness in a Meishan
9 European white pig intercross. Genetics Research, v. 84, p. 95101, 2004.
doi:10.1017/S0016672304007098
KADARMIDEEN, H. N.; VON ROHR, P.; JANSS, L. L. From genetical genomics
to systems genetics: potential applications in quantitative genomics and
animal breeding. Mammalian Genome, v. 17, p. 548 564, 2006. doi:10.1007/
s00335-005-0169-x
KALINOWSKI, S. T.; TAPER, M. L.; MARSHALL, T. C. Revising how the computer
program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity
assignment. Molecular Ecology, v. 16, p. 10991106, 2007.
KANGINAKUDRU, S.; METTA, M.; JAKATI, R. D.; NAGARAJU, J. Genetic
evidence from Indian red jungle fowl corroborates multiple domestication of
modern day chicken. BMC Evolutionary Biology, v. 10, n. 8, p. 174, 2008.
638
KAPPES, S. M.; KEELE, J. W.; STONE, R. T.; McGraw, R. A.; Sonstegard, T. S.;
Smith, T. P. L.; Lopez-Corrales, N. L.; Beattie, c. W. A second-generation linkage
map of the bovine genome. Genome Research, v. 7, n. 3, p. 235-249, 1997.
KARLSSON, E.; BARANOWSKA, I.; WADE, C.; SALMON HILLBERTZ, N.;
ZODY, M.; ANDERSON, N.; BIAGI, T.; PATTERSON, N.; PIELBERG, G.;
KULBOKAS, E. J.; COMSTOCK, K.; KELLER, E.; MESIROV, J.; VON EULER, H.;
KAMPE, O.; HEDHAMMAR, A.; LANDER, E.; ANDERSSON, G.; ANDERSSON,
L.; LINDBLAD- TOH, K. Efcient mapping of mendelian traits in dogs through
genome-wide association. Nature Genetics, v. 39, p. 13211328, 2007. doi:10.1038/
ng.2007.10
KAUFMAN, J.; SKJODT, K.; SALOMONSEN, A.; SIMONSEN, M.; DU
PASQUIER, L.; PARISOT, R.; RIEGERT, P. MHC like molecules in some
nonmammalian vertebrates can be detected by someee cross-reactive xenoantisera.
The Journal of Immunology, v. 144, p. 2258-2272, mar. 1990.
KAYSER, L. Gene hunting on horseback: A trip through the wild world of
molecular genetics! Cowboy Genetics, May/June/July, 2006. Disponvel em:
<http://www.bovine-elite.com/CowboyGenetics.pdf>.
KEHRLI, M. E. J.; ACKERMANN, M. R.; SHUSTER, D. E.; Bovine leukocyte
adhesion deciency. WORLD CONGRESS ON GENETICS APPLIED TO
LIVESTOCK PRODUCTION, 5., 1994. Proccedings v. 21, p. 157-164.
KEMENES, P. A. A quanticao das frequncias dos alelos A e B dos
genes Kapa-casena e Beta-lactoglobulina em algumas raas bovinas. 1996. 85
f. Dissertao (Mestrado) - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz,
Universidade de So Paulo, Piracicaba.
KHATKAR, M. S.; THOMSON, P. C.; TAMMEN, I.; RAADSMA, H. W.
Quantitative trait loci mapping in dairy cattle: review and meta-analysis. Genetics
Selection Evolution, v. 36, p. 163190, 2004. doi:10.1051/gse:200 3057
KNOTT, S. A.; MARKLUND, L.; HALEY, C. S.; ANDERSSON, K.; DAVIES, W.;
ELLEGREN, H.; FREDHOLM, M. HANSSON, I.; HOYHEIM, B.; LUNDSTROM,
K.; MOLLER, M.; ANDERSSON, L. Multiple marker mapping of quantitative
trait loci in a cross between outbred wild boar and large White pigs. Genetics,
v. 149, p. 10691080, 1998.
Komisarek, J.; Wakowicz, K.; Michalak, A.; Dorynek, Z. Effects of DGAT1 variants
on milk production traits in Jersey cattle. Animal Science Papers and Reports, v. 22,
n. 3, p. 307- 313, 2004.
KOUDAND, O. D.; VAN ARENDONK, J. A. M.; IRAQI, F. Marker-Assited
Introgression of Trypanotolerance QTL in Mice. Mammalian Genome, v. 16, n.
2, p. 112-119, 2003.
639
KUHNER, M. K.; BEERLI, P.; YAMATO, J.; FELSENSTEIN, J. Usefulness of single
nucleotide polymorphism data for estimating population parameters. Genetics,
v. 156, p. 439447, 2000.
LAGSIEL, A.; LIPKIN, E.; SOLLER, M. Association between SSCP haplotypes
at the bovine growth hormone gene and milk protein percentage. Genetics,
v. 142, p. 945- 951, 1996.
LAHN, B.; PAGE, D. C. Functional coherence of the human Y chromosome.
Science, v. 278, p. 675680, 1997.
LANDER, E. S.; BOTSTEIN, D. Mapping mendelian factors underlying
quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics, 121: 185-199, 1989.
LANDER, E.S.; BOTSTEIN, D. Mapping mendelian factors underlying quantitative
traits using RFLP linkage maps. Genetics, v. 121, p. 185 199, 1989.
LANDRY, P. A.; KOSKINEN, M. T.; PRIMMER, C. R. Deriving evolutionary
relationships among populations using microsatellites and ()2: All loci are equal,
but some are more equalk than others. Genetics, v. 161, p. 1339- 1347, 2002.
LANG, B. F.; GRAY, M. W.; BURGER, G. Mitochondrial genome evolution and the
origin of eukaryotes. Annual Review of Genetics, v. 33, p. 351-397, 1999.
LARSON, G.; ALBARELLA, U.; DOBNEY, K.; ROWLEY-CONWY, P.; SCHIBLER,
J.; TRESSET, A.; VIGNE, J. D.; EDWARDS, C. J.; SCHLUMBAUM, A.; DINU,
A.; BALASESCU, A.; DOLMAN, G.; TAGLIACOZZO, A.; MANASERYAN, N.;
MIRACLE, P.; VAN WIJNGAARDEN-BAKKER, L.; MASSETI, M.; BRADLEY, D.
G.; COOPER, A. Ancient DNA, pig domestication, and the spread of the Neolithic
into Europe. Proceedings of the National Academy of Sciences-USA, v. 104, n.
39, p. 15276-15281, Sep. 2007.
LEMAY D. G.; LYNN, D. J.; MARTIN, W. F.; NEVILLE, M. C.; CASEY, T.
M.; RINCON, G.; KRIVENTSEVA, E. V.; BARRIS, W. C.; HINRICHS, A. S.;
MOLENAAR, A. J.; POLLARD, K. S.; MAQBOOL, N. J.; SINGH, K.; MURNEY, R.;
ZDOBNOV, E. M.; TELLAM, R. L.; MEDRANO, J. F.; GERMAN, J. B.; RIJNKELS,
M. The bovine lactation genome: insights into the evolution of mammalian milk.
Genome Biology, 2009. Disponvel em: <http://genomebiology.com/2009/10/4/
R43>. Acesso em: 12 set. 2009.
LEONARD, J. A.; WAYNE, R. K.; WHEELER, J.; VALADEZ, R.; GUILLEN, S.;
VILA, C. Ancient DNA evidence for Old World origin of New World dogs. Science,
v. 298, n. 5598, p. 1613-1616, 2002.
LITT, M; LUTY, J. A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro
amplication of a dinucleotide within the cardiac muscle actin gene. American
Jounal of Human Genetics, v. 44, p. 397-401, 1989.
640
LIU, Y.; QIN, X.; SONG, X. Z.; JIANG, H.; SHEN, Y.; DURBIN, K. J.; LIEN, S.;
KENT, M. P.; SODELAND, M.; REN, Y.; ZHANG, L.; SODERGREN, E.; HAVLAK,
P.; WORLEY, K. C.; WEINSTOCK, G. M.; GIBBS, R. A. Bos taurus genome
assembly. BMC Genomics, v. 24, n. 10, p. 180, 2009.
LIU, P.; VIKIS, H.; LU, Y.; AND YOU, M. Large scale in silico mapping of complex
quantitiative traits in inbred mice. PLoS ONE, v. 2, n. 7, jul. 2007. doi:10.1371/
JOURNAL.PONE.0000651
LIU, W.; LAMONT, S. J. Candidate gene approach: potentional association of
caspase-1, inhibitor of apoptosis protein-1, and prosaposin gene polymorphisms
with response to Salmonella enteritidis challenge or vaccination in young chicks.
Animal Biotechnology, v. 14, p. 6176, 2003. doi:10.1081/ABIO-120022136
LOFTUS, R. T.; MACHUGH, D. E.; NGERE, L. O.; BALAIN, D. S.; BADI, A.
M.; BRADLEY, D. G.; CUNNINGHAM, E. P. Mitochondrial genetic variation
in European, African and Indian cattle populations. Animal Genetics, v. 25, n.
4, p. 265-271, 1994.
LUCY, M. C.; HAUSER, S. D.; EPPARD, P. J.; Krivi, G. G.; Clark, J. H.; Bauman, D.
E.; Collier, R. J. Variants os somatotropin in cattle: gene frequences in major dayri
breeds and associated milk production. Domesticated Animals Endocrinology,
v. 10, p. 325-333, 1993.
LUTY, J. A.; GUO, Z.; WILLARD H. F.; Ledbetter, D. H.; Ledbetter, S.; Litt, M.
Five polynorphic microsatellite VNTRs on the human X chrmossome. American
Journal of Human Genetics, v. 46, p. 776, 1990.
MACHUGH, D. E.; SHRIVER, M. D.; LOFTUS, R. T.; CUNNINGHAM, P.;
BRADLEY, D. G. Microsatellite DNA variation and the evolution, domestication
and phylogeography of taurine and zebu cattle (Bos taurus and Bos indicus).
Genetics, v. 146, p. 10711086, 1997.
MACLENNAN, D. H.; DUFF, C.; ZORZATO, F.; FUJII, J.; PHILLIPS, M.;
KORNELUK, R. G.; FRODIS, W.; BRITT, B. A.; WORTON, R. G. Ryanodine
receptor gene is a candidate for predisposition to malignant hyperthermia. Nature,
v. 343, p. 559561, 1990. doi:10.1038/343559a0
MADDOX, J. F.; DAVIES, K. P.; CRAWFORD, A. M.; HULME, D. J.; VAIMAN,
D.; CRIBIU, E. P.; FREKING, B. A.; BEH, K. J.; COCKETT, N. E.; KANG, N.;
RIFFKIN, C. D.; DRINKWATER, R.; MOORE, S. S.; DODDS, K. G.; LUMSDEN, J.
M.; VAN STIJN, T. C.; PHUA, S. H.; ADELSON, D. L.; BURKIN, H. R.; BROOM, J.
E.; BUITKAMP, J.; CAMBRIDGE, L.; CUSHWA, W. T.; GERARD, E.; GALLOWAY,
S. M.; HARRISON, B.; HAWKEN, R. J.; HIENDLEDER, S.; HENRY, H. M.;
MEDRANO, J. F.; PATERSON, K. A.; SCHIBLER, L.; STONE, R. T.; VAN HEST. B.
An enhanced linkage map of the sheep genome comprising more than 1000 loci.
Genome Research, v. 11, p. 12751289, 2001. doi:10.1101/gr.GR-1350R
641
MANNEN, H.; KOHNO; M.; NAGATA, Y.; TSUJI, S.; BRADLEY, D. G.; YEO, J. S.;
NYAMSAMBA, D.; ZAGDSUREN, Y.; YOKOHAMA, M.; NOMURA, K.; AMANO,
T. Independent mitochondrial origin and historical genetic differentiation in North
Eastern Asian cattle. Molecular phylogenetics and evolution, v. 32, n. 2, p. 539-544,
2004.
MARGULIS, L. Archaeal-eubacterial mergers in the origin of Eukarya:
phylogenetic classication of life. Proceedings of the National Academy of
Sciences-USA, v. 93, n. 3, p. 1071-1076, 1996.
MARIANTE, A. da S.; ALBUQUERQUE, M. S. M.; EGITO, A. A.; MCMANUS, C.;
LOPES, M. A.; PAIVA, S. R. PRESENT STATUS OF THE CONSERVATION OF
LIVESTOCK GENETIC RESOURCES. Livestock Science, v. 120, n. 3, p. 204-212,
2009.
MARKMANN, M.; TAUTZ, D. Reverse taxonomy: an approach towards
determining the diversity of meio benthic organisms based on ribosomal RNA
signature sequences. Philosophical Transactions of the Royal Society of London.
Series B, Biological Science, v. 360, p. 19171924, 2005.
MARRIS, E. The genome of the american West. Nature, v. 457, p. 950- 952, 2009.
MARSHALL, T. C.; SLATE, J.; KRUUK, L. E. B. Pemberton, J. M. Statistical
condence for likelihood-based paternity inference in natural populations.
Molecular Ecology, v. 7, p. 639655, 1998.
MASSEY, J. M.; GEORGE, M. Genmarks approach to marker assisted selection.
Animal Biotechnology, v. 3, n. 1, p. 95-110, 1992.
MATHUR, P. K. Markers Assisted Selection for the Canadian Swine Industry.
NATIONAL SWINE IMPROVEMENT FEDERATION ANNUAL MEETING, Des
Moines, Iowa, 2003. Proceedings
MAURICO, J. D. G.; BRAD, A. F.; RACHEL, P. C.; STEVEN, M. K.; JOHN,
W. K.; ROGER, T. S.; KREG, A. L.; KEN, G. D.; ALLAN, M. C.; CRAIG, W. B.
A secondgeneration linkage map of the sheep genome. Mammalian Genome,
v. 9, p. 204220, 1998.
McCormick, A.; Brady, H.; Theill, L. E.; Karin, M. Regulations of the
pituitary-specic homeobox gene GHF1 by cell autonomous and environmental
cues. Nature, v. 345, p. 829- 832, 1990.
MCRAE, A. F.; MCEWAN, J. C.; DODDS, K. G.; WILSON, T.; CRAWFORD, A.
M.; SLATE, J. Linkage disequilibrium in domestic sheep. Genetics, v. 160, n.
3, p. 1113-1122, 2002.
MEADOWS, J. R. S.; HAWKEN, R. J.; KIJAS, J. W. Nucleotide diversity on the
ovine Y chromosome. Animal Genetics, v. 35, p. 379385, 2004.
642
MEADOWS, J. R.; CEMAL, I.; KARACA, O.; GOOTWINE, E.; KIJAS, J. W. Five
ovine mitochondrial lineages identied from sheep breeds of the near East.
Genetics, v. 175, n. 3, p. 1371-1379, 2007.
MEADOWS, J. R.; HANOTTE, O.; DRGEMLLER, C.; CALVO, J.; GODFREY,
R.; COLTMAN, D.; MADDOX, J. F.; MARZANOV, N.; KANTANEN J, KIJAS JW.
Globally dispersed Y chromosomal haplotypes in wild and domestic sheep. Animal
Genetics, v. 37, n. 5, p. 444-454, 2006.
MEADOWS, J. R.; LI, K.; KANTANEN, J.; TAPIO, M.; SIPOS, W.; PARDESHI, V.;
GUPTA, V.; CALVO, J. H.; WHAN, V.; NORRIS, B.; KIJAS, J. W. Mitochondrial
sequence reveals high levels of gene ow between breeds of domestic sheep from
Asia and Europe. Journal of Heredity, v. 96, n. 5, p. 494-501, 2005.
MEIRELLES, F. V.; ROSA, A. J. M.; LBO, R. B.; GARCIA, J. M.; SMITH, L.
C.; DUARTE, F. A.M. Is The Americam Zebu Really Bos indicus? Genetics and
Molecular Biology, v. 22, n. 4, p. 543-546, 1999.
MEJDELL, C. M.; LIE, O.; SOLBU, H. Association of major histocompatibility
complex antigens (BOLA-A) with AI bull progeny test results for mastitis, Ketosis
and fertility in Norwegian cattle. Animal Genetics, v. 25, p. 99-104, 1994.
MIESFELD, R.; KRYSTAL, M.; ARNHEIM, N. A member of new repeated
sequence family wich is conserved throughout eukaryotic evolution is found
between the human - and -globulin genes. Nucleic Acids Research, v. 9, p. 5931,
1981.
MILLIGAN, B. G., LEEBENS-MACK, J.; STRAND A. E. Conservation genetics:
beyond the maintenance of marker diversity. Molecular Ecology, v. 3, p. 423-435,
1994.
MONAGHAN, M. T.; BALKE, M.; GREGORY, T. R.; VOGLER, A. P. DNA-based
species delineation in tropical beetles using mitochondrial and nuclear markers.
Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological
Science, v. 360, n. 1462, p. 1925-1933, 2005.
MOODY, D. E.; POMP, D.; NEWMAN, S.; MacNEIL, M. D. Characterization of
DNA polymorphisms in three populatoins of Herefrd cattle and their associations
with growth and maternal EPD in line 1 Herefords. Journal of Animal Science,
v. 74, p. 1784-1793, 1996.
MORIN, P. A.; LUIKART, G.; WAYNE, R. K. and the SNP workshop Group.
SNPs in ecology, evolution and conservation. Trends in Ecology and Evolution,
v. 19, p. 208216, 2004.
643
NADERI, S.; REZAEI, H. R.; POMPANON, F.; BLUM, M. G.; NEGRINI,
R.; NAGHASH, H. R.; BALKIZ, O.; MASHKOUR, M.; GAGGIOTTI, O. E.;
AJMONE-MARSAN, P.; KENCE, A.; VIGNE, J. D.; TABERLET, P. The goat
domestication process inferred from large-scale mitochondrial DNA analysis of
wild and domestic individuals. Proceedings of the National Academy of Sciences-U
S A, v. 105, n. 46, p. 17659-17664, 2008.
NEI, M. Genetic distances between populations. American Naturalist,
v. 106, p. 283-292, 1972.
NII, M.; HAYASHI, T.; MIKAWA, S.; TANI, F.; NIKI, A.; MORI, N.; UCHIDA,
Y.; FUJISHIMA-KANAYA, N.; KOMATSU, M.; AWATA, T. Quantitative trait loci
mapping for meat quality and muscle ber traits in a Japanese wild boar 9 Large
White intercross. Journal of Animal Science, v. 83, p. 308315, 2005.
NII, M.; HAYASHI, T.; TANI, F.; NIKI, A.; MORI, N.; FUJISHIMA-KANAYA,
N.; KOMATSU, M.; AIKAWA, K.; AWATA, T.; MIKAWA, S. Quantitative trait loci
mapping for fatty acid composition traits in perirenal and back fat using a Japanese
wild boar 9 Large White intercross. Animal Genetics, v. 37, p. 342347, 2006.
doi:10.1111/j.1365-2052.2006.01485.x
NOTT, C. F. G.; ROLLINS, W. Effect of the mh gene for muscular hypertrophy on
birth weigth and growth to one year of age in beef cattle. Growth, v. 43, p. 221- 234,
1979.
NOTTER, D. R. Genetic improvement of fertility using correlated traits and
molecular markers. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE REPRODUO
ANIMAL, 11., 1995, Belo Horizonte. Anais... Belo Horizonte: CBRA,
1995. p. 121-130, 1995.
OBRIEN, S. J.; GRAVES, J. A. M. Report of the committee on comparative gene
mapping. Cytogenetics and Cell Genetics, v. 58, p. 1124-1151, 1991.
OLSAKER, I.; MEJDELL, C. M.; SORENSEN, A.; LIE, O. High lysozyme activity
in a Norwegian bovine family co-segregates with a restriction fragment length
polymorphism. Animal Genetics, v. 24, p. 421-425, 1993.
OTOMO, P. V.; VAN VUUREN, B. J.; REINECKE, S. A. Usefulness of DNA
Barcoding in Ecotoxicological Investigations: Resolving Taxonomic Uncertainties
Using Eisenia Malm 1877 as an Example. Bulletin of Environmental
Contamination and Toxicology, v. 82, p. 261264, 2009.
OTTO, G.; ROEHE, R.; LOOFT, H.; THOELKING, L.; KNAP, P. W.;
ROTHSCHILD, M. F.; PLASTOW, G. S.; KALM, E. Associations of DNA markers
with meat quality traits in pigs with emphasis on drip loss. Meat Science,
v. 75, p. 185195, 2007. doi:10.1016/j.meatsci.2006.03.022
OVERTON, K. M., BEEVER, J. E.; LEWIN, H. A.; ROBINSON, J. L. The gene for
bovine Factor XI maps to chromosome 27. Journal Dairy Science, v. 79, p. 165,
1996. Supplement 1. Abstract.
644
PAIVA, S. R.; SILVRIO, V. C.; MCMANUS, C.; EGITO, A. A.; MARIANTE, A
da S; CASTRO, S. T. R.; ALBUQUERQUE, M. S. M.; DERGAM, J. A. Origin of
the main locally adapted sheep breeds of Brasil: a RFLP-PCR molecular analysis.
Archivos de Zootecnia da Universidade de Cordoba, Crdoba, v. 54, p. 395-399,
2005.
PATERSON, A. H.; LANDER, E. S.; HEWITT, J. D.; PETERSON, S.; LINCOLN,
S. E. Resolution of quantitative traits into Mendelian factors by using a complete
linkage map of restriction fragment length polymorphisms. Nature, v. 335, p. 721
726, 1988. doi:10.1038/3357 21a0
PEDROSA, S.; UZUN, M.; ARRANZ, J.; GUTIERREZ-GIL, B.; SAN PRIMITIVO,
F.; BAYON Y. Evidence of three maternal lineages in near eastern sheep supporting
multiple domestication events. Proceedings of the Royal Society B: Biological
Sciences, v. 272, p. 22112217, 2005.
PEMBERTON, J. M. Wild Pedigrees: The way forward. Proceedings of the Royal
Society B: Biological Sciences, v. 275, p. 613- 621, 2008.
PENA, S. D. J.; CHAKRABORTY, R. Paternity in the DNA era. Trends in Genetics,
v. 6, p. 204-209, 1994.
PIPER, L. R.; BINDON, B. M. The genetics and endocrinology of the Booroola
sheep F gene. In: WEIR, B. S.; EISEN, E. J.; GOODMAN M. M.; NAMKOONG,
G. (Ed.). INTERNATIONAL CONFERENCE ON QUANTITATIVE GENETICS
SINAUER ASSOCIATES, 2., Sunderland, 1988. Proccedings p. 270.
POPE, C. E. Embryo technology in conservation efforts for endangered felids.
Theriogenoly, v. 53, p. 163-174, 2000.
PUKAZHENTHI, B. S.; WILDT, D. E. Which reproductive technologies are most
relevant to studying, managing and conserving wildlife? Reproduction, Fertility
and Development, v. 16, p. 33- 46, 2004.
PUKAZHENTHI, B.; COMIZZOLI, P.; TRAVIS, A.J.; WILDT, D.E. Applications
of emerging technologies to the study and conservation of threatened and
endangered species. Reproduction, Fertility and Development, v. 18, p. 77- 90,
2006.
QUASS, R. L.; POLLACK, E. J. Mixed model methodology for farm and ranch beef
cattle testing programs. Journal of Animal Science, v. 51, p. 1277-1287, 1980.
RAMPILLI, M.; CAROLI, A.; BOLLA, P.; PIRLO, G. Relazioni tra gnotip
lattoproteici, composizione caseinica e attitudine alla coagulazione del latte nel
corso della lattazione. Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia, v. 39, p. 262-279, 1988.
RASMUNSEN, B. A.; CHRISTIAN, L. L. H blood types in pigs as predictors of
stress suscetibility. Science, v. 191, p. 947- 48, 1976.
645
REICHMANN, K. G.; DRINKWATER, R. D.; HETZEL, D. J. S.; Hielscher, R.
W.; Healy, P. J. Generalised glycogenosis (Pompes disease) in Brhman cattle. A
review of the Syndrome and its control in Australia. In: WORLD CONGRESS ON
GENETICS APPLIED TO LIVESTOCK PRODUCTION, 5., 1994, Guelph, Canada.
Proccedings p. 165- 168.
Renaville, R.; Gengler, N.; Vrech, E.; Prandi, A.; Massart, S.; Corradini, C.; Bertozzi,
C.; Mortiaux, F.; Burny, A.; Portetelle, D. Pit-1 gene polymorphisms, Milk yield,
and conformation traits for Italian Holstein- Friesian Bulls. Journal Dairy Science,
v. 80, p. 3431- 3438, 1997.
ROCHA, J. L.; BAKER, J. F.; WOMACK, J. E.; SANDERS, J. O.; TAYLOR, J. F.
Statistical associations between restriction fragment length polymorphisms and
quantitative traits in beef cattle. Journal of Animal Science, v. 70, p. 3360-3370,
1992.
ROCHA, J. L.; POMP, D.; VAN VLECK, L. D. QTL analysis in livestock. Methods
Mol Biol, v. 195, p. 311346, 2002.
ROCHA, J. L.; SANDERS, J. O.; TAYLOR, J. F. Genetic markers to manipulate
QTL: The additive illusion. Journal of Animal Science, v. 72, p. 250, 1994.
Suplemento 1. Abstract.
ROHRER, G. A.; ALEXANDER, L. J.; HU, Z.; SMITH, T. P.; KEELE, J. W.;
BEATTIE, C. W. A comprehensive map of the porcine genome. Genome Research,
v. 6, n. 5, p. 371-391, 1996.
ROHRER, G. A.; ALEXANDER, L. J.; KEELE, J. W.; SMITH, T. P.; BEATTIE, C. W.
A Microsatellite linkage map of the porcine genome. Genetics, v. 136, p. 231245,
1994.
RON, M.; BAND, M.; WYLER A.; WELLER, J. I. Unequivocal determination of
sire allele origin for multialleleic microsatllites when only sire and progeny are
genotyped. Animal Genetics, v. 24, p 171-176, 1993.
RON, M.; BLANC, Y.; BAND, M.; Ezra, E.; Weller, J. I. Misidentication rate in
the Israeli dairy cattle population and its implications for genetic improvement.
Journal of Dairy Science, v. 79, p. 676-681, 1996.
ROTHSCHILD, M. F. From a sows ear to a silk purse: real progress in
porcine genomics. Cytogenetics Genome Research, v. 102, p. 9599, 2003. doi:
10.1159/000075732
ROTHSCHILD, M. F. Porcine genomics delivers new tools and results: this little
piggy did more than just go to market. Genetics Research, v. 83, p. 16, 2004.
doi:10.1017/S0016672303006621
646
ROTHSCHILD, M. F.; JACOBSON, C.; VASKE, D. A.; Tuggle, C. K.; Short, T. H.;
Sasaki, S.; Eckardt, G. R.; McLaren, D. G. A major gene for litter size in pigs. In:
WORLD CONGRESS ON GENETICS APPLIED TO LIVESTOCK PRODUCTION,
5., 1994, Guelph, Canada. Proceedings p. 225-228.
RUBINOFF, D. Utility of mitochondrial DNA barcodes in species conservation.
Conservation Biology, v. 20, n. 4, p. 1026-33, 2006.
RUSSELLO, M. A.; AMATO, G. Ex situ population management in the absence of
pedigree information. Molecular ecology, v. 13, p. 2829- 2840, 2004.
RUSSO, T. P.; KLEIN, M. Cargill and MMI Genomics launch Tru-Marbling and
Tru-Tenderness DNA based selection products. Disponvel em: <http://www.
metamorphixinc.com/013107%20MMICargill.pdf>. Acesso em: 16 jul. 2009.
SAVOLAINEN, V.; COWAN, R. S.; VOGLER, A. P.; RODERICK, G. K.; LANE,
R. Towards writing the encyclopaedia of life: An introduction to DNA barcoding.
Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological
Science, v. 360, p. 18051811, 2005.
SAXENA, R.; VOIGHT, B. F.; LYSSENKO, V.; BURTT, N. P.; DE BAKKER, P. I.;
CHEN, H.; ROIX, J. J.; KATHIRESAN, S.; HIRSCHHORN, J. N.; DALY, M. J.;
HUGHES, T. E.;, GROOP, L.; ALTSHULER, D.; ALMGREN, P.; FLOREZ, J. C.;
MEYER, J.; ARDLIE, K.; BENGTSSON BOSTROM, K.; ISOMAA, B.; LETTRE, G.;
LINDBLAD, U.; LYON, H. N.; MELANDER, O.; NEWTON-CHEH, C.; NILSSON,
P.; ORHO-MELANDER, M.; RASTAM, L.; SPELIOTES, E. K.; TASKINEN, M.
R.; TUOMI, T.; GUIDUCCI, C.; BERGLUND, A.; CARLSON, J.; GIANNINY,
L.; HACKETT, R.; HALL, L.; HOLMKVIST, J.; LAURILA, E.; SJOGREN, M.;
STERNER, M.; SURTI, A.; SVENSSON, M.; SVENSSON, M.; TEWHEY, R.;
BLUMENSTIEL, B.; PARKIN, M.; DEFELICE, M.; BARRY, R.; BRODEUR,
W.; CAMARATA, J.; CHIA, N.; FAVA, M.; GIBBONS, J.; HANDSAKER, B.;
HEALY, C.; NGUYEN, K.; GATES, C.; SOUGNEZ, C.; GAGE, D.; NIZZARI,
M.; GABRIEL, S. B.; CHIRN, G. W.; MA, Q.; PARIKH, H;. RICHARDSON, D.;
RICKE, D.; PURCELL. S. Genome-wide association analysis identies loci for type
2 Diabetes and triglyceride levels. Science, v. 316, p. 13311336, 2007. doi:10.1126/
science.1142358
SCHINDEL, D. E.; MILLER, S. E. DNA barcoding a useful tool for taxonomists.
Nature, v. 435, p. 17, 2005. doi:10.1038/435017b.
SCHLEE, P.; GRAML, R.; SCHALENBERGER, E.; SCHAMS, D.; ROTTMANN,
O; OLBRICHBLUDAU, A.; PIRCHNER. F. Growth hormone and insuline-like
growth factor I concentrations in bulls of various growth hormone genotypes.
Theoretical and Applied Genetics, v. 88, p. 497-500, 1994.
SCHLTTERER, C.; HARR, B. Single nucleotide polymorphisms derived from
ancestral populations show no evidence for biased divesity estimates in Drosophila
melanogaster. Molecular Ecology, v. 11, p. 947-950, 2004.
647
SCHMUTZ, S. M.; MARQUESS, F. L. S.; BERRYERE, T. G.; MOKER, J. S. DNA
marker-assisted selection of the polled condition in Charolais cattle. Mammalian
Genome, v. 6, p. 710-713, 1995.
SCHWENGER, B.; SCHBER, S.; SIMON, D. DUMPS cattle carry a
point mutation inthe uridine monophosphate synthase gene. Genomics,
v. 16, p. 241-244, 1993.
SCHWERIN, M.; BROCKMANN, G.; VANSELOW, J.; SEYFERT, H. M.
Perspectives of molecular genome analysis in livestock improvemen- An overview.
Animal Research and Development, v. 42, p. 15-26, 1995.
SCHYMICK, J. C.; SCHOLZ, S.W.; FUNG, H.; BRITTON, A.; AREPALLI,
S.; GIBBS, J.; LOMBARDO, F.; MATARIN, M.; KASPERAVICIUTE, D.;
HERNANDEZ, D. Genome-wide genotyping in amyotrophic lateral sclerosis and
neurologically normal controls: rst stage analysis and public release of data.
Lancet neurology, v. 6, p. 322328, 2007. doi:10.1016/S1474-4422(07)70037-6.
SCOTT, L. J.; MOHLKE, K. L.; BONNYCASTLE, L. L.; WILLER, C. J.; LI, Y.;
DUREN, W. L.; ERDOS, M. R.; STRINGHAM, H. M.; CHINES, P. S.; JACKSON,
A. U.; PROKUNINA- OLSSON, L.; DING, C. J.; SWIFT, A. J.; NARISU, N.; HU,
T.; PRUIM, R.; XIAO, R.; LI, X. Y.; CONNEELY, K. N.; RIEBOW, N. L.; SPRAU,
A.G.; TONG, M.; WHITE, P. P.; HETRICK, K. N.; BARNHART, M. W.; BARK, C.
W.; GOLDSTEIN, J. L.; WATKINS, L.; XIANG, F.; SARAMIES, J.; BUCHANAN,
T. A.; WATANABE, R. M.; VALLE, T. T.; KINNUNEN, L.; ABECASIS, G. R.;
PUGH, E. W; DOHENY, K. F.; BERGMAN, R. N.; TUOMILEHTO, J.; COLLINS,
F. S.; BOEHNKE, M. A genome-wide association study of type 2 diabetes in
Finns detects multiple susceptibility variants. Science, v. 316, p. 13411345, 2007.
doi:10.1126/ science.1142382
SEATON, G.; HALEY, C. S.; KNOTT, S. A.; KEARSEY, M.; VISSCHER, P. M.
QTL express: mapping quantitative trait loci in simple and complex pedigrees.
Bioinformatics, v. 18, p. 339340, 2002. doi:10.1093/bioinfor matics/18.2.339
SEDDON, J. M.; PARKER, H. G.; OSTRANDER, E. A.; ELLEGREN, H. SNPs in
ecological and conservation studies: a test in the Scandinavian wolf population.
Molecular Ecology, v. 14, p. 503511, 2005.
SEIESTAD, M.; BEKELE, E.; IBRAHIM, M.; TOURE, A.; TRAORE, M. A view of
modern human origins from Y chromosome microsatellite variation. Genome
Research, v. 9, p. 558-567, 1999.
SHANKS, R. D.; HUANG, Y. C.; ROBINSON, J. L. Citrullinemia, marker for
economically important traits. WORLD CONGRESS ON GENETICS APPLIED TO
LIVESTOCK PRODUCTION, 5., 1994, Guelph, Canada. Proccedings p. 319-322.
SHUSTER, D. E.; KEHRLI, M. E.; ACKERMANN, M. R. A prevalent mutation
responsible for leukocyte adhesion deciency in Holstein cattle. Proceedings of the
National Academy of Science-USA, v. 89, p. 9925-9929, 1992.
648
SKALETSKY, H.; KURODA-KAWAGUCHI, T.; MINX, P. J.; CORDUM, H. S.;
HILLIER, L.; BROWN, L. G.; REPPING, S.; PYNTIKOVA, T.; ALI, J.; BIERI, T.;
CHINWALLA, A.; DELEHAUNTY, A.; DELEHAUNTY, K.; DU, H.; FEWELL, G.;
FULTON, L.; FULTON, R.; GRAVES, T.; HOU, S. F.; LATRIELLE, P.; LEONARD,
S.; MARDIS, E.; MAUPIN, R.; MCPHERSON, J.; MINER, T.; NASH, W.;
NGUYEN, C.; OZERSKY, P.; PEPIN, K.; ROCK, S.; ROHLFING, T.; SCOTT, K.;
SCHULTZ, B.; STRONG, C.; TIN-WOLLAM, A.; YANG, S. P.; WATERSTON,
R. H.; WILSON, R. K.; ROZEN, S.; PAGE, D. C. The male-specic region of the
human Y chromosome is a mosaic of discrete sequence classes. Nature, v. 423, n.
6942, p. 825-837, 2003.
SMITH, C.; SMITH, D. B. The need for close linkages in marker-assisted selection
for economic merit in livestock. Animal Breeding Abstracts, v. 61, n. 4, p. 197-204,
1993.
SMITH, S. L.; EVERTS, R. E.; TIAN, X. C.; DU, F.; SUNG, L.-Y.;
RODRIGUEZ-ZAS, S. L.; JEONG, B.-S.; RENARD, J.-P.; LEWIN, H. A.; YANG,
X. Global gene expression proles reveal signicant nuclear reprogramming
by the blastocyst stage after cloning. Proceedings of the National Academy of
Sciences-USA, v. 102, n. 17, p. 582587, 2005. doi:10.1073/PNAS.0508952102
Smith, S. J.; Cases, S.; Jensen, D. R.; Chen, H. C.; Sande, E.; Tow, B.; Sanan, D.
A.; Raber, J.; Eckel, R. H.; Farese JUNIOr, R. V. Obesity resistance and multiple
mechanisms of triglyceride synthesis in mice lacking Dgat. Nature Genetics,
v. 25, p. 87- 90, 2000.
SOLLER, M. Genetic mapping of the bovine genome using deoxyribonucleic
acid-level markers to identify loci affecting quantitative traits of economic
importance. Jounal of Dairy Science, v. 73, p. 2628-2646, 1990.
SOLLER, M.; BECKMAN, J. S. Genetic polymorphism in varietal identication and
genetic improvement. Theoretical and Applied Genetics, v. 67, p. 25-33, 1983.
SOMERS, J.; SMITH, C.; DONNISON, M.; WELLS, D. N.; HENDERSON, H.;
MCLEAY, L.; PFEFFER, P. L.. Gene expression proling of individual bovine
nuclear transfer blastocysts. Reproduction, v. 131, p. 10731084, 2006. doi:10.1530/
REP.1.00967
Spelman, R. J.; Ford, C. A.; McElhinnery, P.; Gregory, G. C.; Snell, R. G.
Characterization of the DGAT1 gene in the New Zealand dairy population. Journal
of Dairy Science, v. 85, p. 3514- 3517, 2002.
SPRINGER, M. S.; DEBRY, R. W.; DOUADY, C.; AMRINE, H. M.; MADSEN, O.;
DE JONG, W. W.; STANHOPE, M. J. Mitochondrial versus nuclear gene sequences
in deep-level mammalian phylogeny reconstruction. Molecular Genetics and
Evolution, v. 18, n. 2, p. 132- 143, 2001.
649
STEER, S.; ABKEVICH, V.; GUTIN, A.; CORDELL, H. J.; GENDALL, K. L.
Genomic DNA pooling for whole-genome association scans in complex disease:
empirical demonstration of efcacy in rheumatoid arthritis. Genes Immunology,
v. 8, p. 5768, 2007. doi:10.1038/SJ.GENE.6364359
STEINTHORSDOTTIR, V.; THORLEIFSSON, G.; REYNISDOTTIR, I.;
BENEDIKTSSON, R.; JONSDOTTIR, T.; Walters, G. B.; Styrkarsdottir, U.;
Gretarsdottir, S.; Emilsson, V. A variant in CDKAL1 inuences insulin response
and risk of type 2 diabetes. Nature Genetics, v. 39, p. 770775, 2007. doi:10.1038/
NG2043
STRATIL, A.; VAN POUCKE, M.; BARTENSCHLAGER, H.; KNOLL, A.; YERLE,
M.; PEELMAN, L. J.; KOPECNY, M.; GELDERMANN, H. Porcine OGN and
ASPN: mapping, polymorphisms and use for quantitative trait loci identication
for growth and carcass traits in a Meishan 9 Pietrain intercross. Animal Genetics,
v. 37, p. 415418, 2006. doi:10.1111/ j.1365-2052.2006.01480.x
SYVNEN A-C. Accessing genetic variation: genotyping single nucleotide
polymorphisms. Nature Genetics Reviews, v. 2, p. 930942, 2001.
TAKAHATA, N.; NEI, M. Allelic Genealogy Under overdominant and
frequenciy-dependent selection and polymorphism of mafor histocompatibility
complex loci. Genetics, v. 124, p. 967-978, 1990.
TANKSLEY, S. D.; RICK, C. M. Isozymic gene linkage map of the tomato:
applications in genetics and breeding. Theoretical and Applied Genetics,
v. 57, p. 161-170, 1980.
TAPIO, M.; MARZANOV, N.; OZEROV, M.; CINKULOV, M.; GONZARENKO,
G.; KISELYOVA, T.; MURAWSKI, M.; VIINALASS, H.; KANTANEN, J. Sheep
mitochondrial DNA variation in European, Caucasian, and Central Asian areas.
Molecular Biology and Evolution, v. 23, n. 9, p. 1776-1783, 2006.
TAPIO, M.; TAPIO, I.; GRISLIS, Z.; HOLM, L. E.; JEPPSSON, S.; KANTANEN, J.;
MICEIKIENE, I.; OLSAKER, I.; VIINALASS, H.; EYTHORSDOTTIR, E. Native
breeds demonstrate high contributions to the molecular variation in northern
European sheep. Molecular Ecology, v. 14, n. 13, p. 3951-3963, 2005.
TAUTZ, D. Hypervariability of simple sequences as a general source for
polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Research, v. 17, p. 6463-6471, 1989.
TAUTZ, D.; ARCTANDER, P.; MINELLI, A.; THOMAS, R. H.; VOGLER, A. P. A
plea for DNA taxonomy. Trends in Ecology and Evolution, v. 18, p. 7074, 2003.
TAVARES E. S.; BAKER, A. J. Single mitochondrial gene barcodes reliably identify
sister-species in diverse clades of birds. BMC Evolutionary Biology, v. 9, n. 8, p. 81,
2008.
650
TAYLOR, J. F.; COUTINHO, L. L.; HERRING, K. L.; GALLAGHER JUNIOR, D.
S.; BRENNEMAN, R. A.; BURNEY, N.; SANDERS, J. O.; TURNER, J. W.; SMITH,
S. B.; MILLER, R. K.; SAVELL, J. W.; DAVIS, S. K. Candidate gene analysis of
GH1 for effects on growth and carcass composition of cattle. Animal Genetics,
v. 29, p. 194201, 1998. doi:10.1111/j.1365-2052.1998.00317.
TELLAM, R. L.; LEMAY, D. G.; VAN TASSELL, C. P.; LEWIN, H. A.; WORLEY, K.
C.; ELSIK, C. G. Unlocking the bovine genome. BMC Genomics, v. 10, p. 193, April
2009. doi:10.1186/1471-2164-10-193.
THE BOVINE GENOME SEQUENCING AND ANALYSIS CONSORTIUM.
ELSIK, C. G.; TELLAM, R. L.; WORLEY, K. C. et al. The genome sequence
of taurine cattle: a window to ruminant biology and evolution. Science,
v. 324, p. 522-528, 2009.
The UniProt Consortium. The Universal Protein Resource (UniProt). Nucleic
Acids Research, v. 35, D193D197, 2007. doi:10.1093/NAR/GKL929
THUE, T. D.; SCHMUTZ, L. Localization of somatostatin to bovine chromosome
1q23-q25 by in situ hybridization. In: WORLD CONGRESS ON GENETICS
APPLIED TO LIVESTOCK PRODUCTION, 5., 1994, Guelph, Canada.
Proccedings
TORO, M. A.; CABALLERO, A. Characterization and conservation of genetic
diversity in subdivided populations. Philosophical Transactions of the Royal
Society of London. Series B, Biological Science, v. 360, p. 13671378, 2005.
TORO, M. A.; FERNANDEZ, J.; CABALLERO, A. Molecular characterization of
breeds and its use in conservation. Livestock Science, v. 120, p. 179-195, 2009.
TOURE, A.; CLEMENTE, E. J.; ELLIS, P.; MAHADEVAIAH, S. K.; OJARIKRE,
O. A.; BALL, P. A.; REYNARD, L.; LOVELAND, K. L.; BURGOYNE, P. S.;
AFFARA, N. A. Identication of novel Y chromosome encoded transcripts by testis
transcriptome analysis of mice with deletions of the Y chromosome long arm.
Genome Biology, v. 6, n. 12, p. R102, 2005.
TOZAKI, T.; KAKOI, H.; MASHIMA, S.; HIROTA, K.; HASEGAWA, T.; ISHIDA,
N.; MIURA, N.; CHOI-MIURA, N.; TOMITA, M. Population study and validation
for paternity testing for thoroughbred horses by 15 microsatellite loci. Journal of
Veterinary Medical Science, v. 63, n. 11, p. 1191-1197, 2001.
USHA, A. P.; SIMPSON, S. P.; WILLIANS, J. L. Probability of randon sire
exclusion using microsatellites markers for parentage verication. Animal
Genetics, v. 26, p. 155-161, 1995.
UZUN, M.; GUTIERREZ-GIL, B.; ARRANZ, J. J.; SAN PRIMITIVO, F.; SAATCI,
M.; KAYA, M.; BAYON, Y. Genetic relationships among Turkish sheep. Genetics
Selection Evolution, v. 38, n. 5, p. 513-524, 2006.
651
VAIMAN, D.; SCHIBLER, L.; BOURGEOIS, F.; OUSTRY, A.; AMIGUES, Y.;
CRIBIU, E. P. A genetic linkage map of the male goat genome. Genetics, v. 144, n.
1, p. 279-305, 1996.
VAIMAN, D.; SCHIBLER, L.; BOURGEOIS, F.; OUSTRY, A.; AMIGUES,
Y.; CRIBIU, E. P. A genetic linkage map of the male goat genome. Genetics,
v. 144, p. 279305, 1996.
VALENTINI, A.; POMPANON, F.; TABERLET, P. DNA barcoding for ecologists.
Trends in Ecology and Evolution, v. 24, n. 2, p. 110-117, 2009.
VAN TASSELL, C. P.; SMITH, T. P. L.; MATUKUMALLI, L. K.; TAYLOR, J. F. ;
SCHNABEL, R. D.; TAYLOR LAWLEY, C.; HAUDENSCHILD, C. D.; MOORE, S.
S.; WARREN, W. C.; SONSTEGARD, D T. S. SNP Discovery and allele frequency
estimation by deep sequencing of reduced representation libraries. Nature
Methods, v. 5, p. 247252, 2008.
VAN VLECK, L. D. Misidentication and sire evaluation. Journal of Dairy Science,
v. 53, p. 1697-1703, 1970.
VANKAN, D. M.; MOORE, S. S.; BELL, K.; HETZEL, D. J. S. Evaluation of DNA
microsatellites for parentage and paternity testing in cattle. In: CONFERENCE OF
I.S.A.G., 24., 1994 .
VANRADEN, P. M.; VAN TASSELL, C. P.; WIGGANS, G. R.; SONSTEGARD, S.;
SCHNABEL, R. D.; TAYLOR, J. F.; SCHENKEL, F. S. Invited review: Reliability of
genomic predictions for North American Holstein bulls. Journal Dairy Science,
v. 92, p. 1624, 2009.
VELMALA, R.; VILKKI, J.; ELO, K.; Mki-Tanila, A. Casein haplotypes and their
association with milk production traits in the Finnish Ayrshire cattle. Animal
Genetics, v. 26, p. 419-425, 1995.
VIGNAL, A.; MILAN, D.; SANCRISTOBAL, M.; EGGEN, A. A review on SNP
and other types of molecular markers and their use in animal genetics. Genetics
Selection Evolution, v. 34, p. 275305, 2002.
VISSCHER, P. M.; THOMPSON, R.; HALEY, C. S. Condence intervals in QTL
mapping by bootstrapping. Genetics, v. 143, p. 10131020, 1996.
WALLIS, J. W.; AERTS, J.; GROENEN, M. A. M.; CROOIJMANS, R. P. M. A.;
LAYMAN, D.; GRAVES, T. A.; SCHEER, D. E.; KREMITZKI, C.; FEDELE, M. J.;
MUDD, N. K.; CARDENAS, M.; HIGGINBOTHAM, J.; CARTER, J.; MCGRANE,
R.; GAIGE, T.; MEAD, K.; WALKER, J.; ALBRACHT, D.; DAVITO, J.; YANG,
S-P.; LEONG, S.; CHINWALLA, A.; SEKHON, M.; WYLIE, K.; DODGSON, J.;
ROMANOV, M. N.; CHENG, H.; DE JONG, P. J.; OSOEGAWA, K.; NEFEDOV, M.;
ZHANG, H.; MCPHERSON, J. D.; KRZYWINSKI, M.; SCHEIN, J.; HILLIER, L.;
MARDIS, E. R.; WILSON, R. K.; WARREN, W. C. A physical map of the chicken
genome. Nature, v. 432, p. 761764, 2004. doi:10.1038/nature03030
652
WANG, W. Y. S.; BARRATT, B. J.; CLAYTON, D. G.; ANDTODD, J. A.
Genomewide association studies: theoretical and practical concerns. Nature
Reviews Genetics, v. 6, p. 109118, 2005. doi:10.1038/NRG1522
WEBER J. L.; MAY, P. E. Abundant class of human DNA polymorphisms which
can be typed using the polymerase chain reaction. American Journal of Human
Genetics, v. 44, p. 38-396, 1989.
WELLER, J. I.; KASHI, Y; SOLLER, M. Power of daughter and granddaughter
designs for determining linkage between marker loci and quantitative trait loci in
dairy cattle. Journal of Dairy Science, v. 73, p. 252-2537, 1990.
WHEELER, D. L.; BARRETT, T.; BENSON, D. A.; BRYANT, S. H.; CANESE, K.;
Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic
Acids Research, v. 35, p. D5D12, 2007. doi:10.1093/NAR/ GKL1031
WIGGANS, G. R.; SONSTEGARD, T. S.; VANRADEN, P. M.; MATUKUMALLI,
L. K.; SCHNABEL, R. D.; TAYLOR, J. F.; SCHENKEL, F. S.; VAN TASSELL, C.
P. Selection of single-nucleotide polymorphisms and quality of genotypes used
in genomic evaluation of dairy cattle in the United States and Canada. Journal of
Dairy Science, v. 92, p. 34313436, 2009. doi:10.3168/jds.2008-1758
WILDER, J. A.; MOBASHER, Z.; HAMMER, M. F. Genetic evidence for unequal
effective population sizes of human females and males. Molecular Biology and
Evolution, v. 21, p. 2047- 2057, 2004a.
WILDER, J. A.; KINGAN, S. B.; MOBASHER, Z.; PILKINGTON, M. M.;
HAMMER, M. F. Global patterns of human mitochondrial DNA and Y
chromosome structure are not inuenced by higher migration rates of females
versus males. Nature Genetics, v. 36, p. 11221125, 2004b.
WILSON, E. O. The encyclopaedia of life. Trends in Ecology and Evolution,
v. 18, p. 7780, 2003.
Winter, A.; Krmer, W.; Werner, F. A. O.; Kollers, S.; Kata, S.; Durstewitz, G.;
Buitkamp, J.; Womack, J. E.; Thaller, G.; Fries, R. Association of the lysine-232/
alanine polymorphisms in a bovine gene encoding acyl-CoA:diacylglycerol
acyltransferase (DGAT1) with variation at a quantitative trait lcus for
milk fat content. Proceedings of the National Academy of Sciences-USA,
v. 99, p. 9300-9305, 2002.
WITT, J. D.; THRELOFF, D. L.; HEBERT, P. D. DNA barcoding reveals
extraordinary cryptic diversity in an amphipod genus: implications for desert
spring conservation. Molecular Ecology, v. 15, n. 10, p. 3073-3082, 2006.
WOMACK, J. E. The bovine genome. Genome Dynamics, v. 2, p. 69-78, 2006.
Woollard, J.; Schmitz, C. B.; Freeman, A. E.; Tuggle, C. K. Rapid communication:
HinfI polymorphism at the bovine PIT1 locus. Journal of Animal Science,
v. 72, p. 3267, 1994.
653
WU, C. H.; ZHANG, Y. P.; BUNCH, T. D.; WANG, S.; WANG, W. Mitochondrial
control region sequence variation within the argali wild sheep (Ovis ammon):
evolution and conservation relevance. Mammalia, v. 67, p. 109118, 2003.
XU, A.; VAN EIJ, K.; PARK, C.; LEWIN, H. A. Polymorphism in BoLA-DRB3 exon
2 correlates with resistance to persistent lynphocytosis caused by bovine leukemia
virus. Journal of Immunology, v. 151, p. 6977-6988, 1993.
YU, H. T.; PENG, Y. H. Population differentiation and gene ow revealed by
microsatellite DNA markers in the house mouse (Mus musculus castaneus) in
Taiwan. Zoological Science, v. 19, p. 475-483, 2002.
ZHIVOTOVSKY, L.; FELDMAN, M. W. Microsatellite variability and genetic
distances. Proceedings of the National Academy of Sciences-USA, v. 92, p. 11549-
11552, 1995.
ZIMIN, A. V.; DELCHER, A. L.; FLOREA, L.; KELLEY, D. R.; SCHATZ, M. C.;
PUIU, D.; HANRAHAN, F.; PERTEA, G.; VAN TASSELL, C. P.; SONSTEGARD,
T. S.; MARAIS, G.; ROBERTS, M.; SUBRAMANIAN, P.; YORKE, J. A.;
SALZBERG, S. L. A whole-genome assembly of the domestic cow, Bos taurus.
Genome Biology, v. 10, n. 4, p. R42, 2009.
655
Biotecnologia aplicada
a pecuria bovina
Carlos Frederico Martins
Luiz Gustavo B. Siqueira
Margot Alves Nunes Dode
Introduo
O aumento da exigncia mundial para produo de alimentos segu-
ros e de forma sustentvel tem obrigado a pecuria bovina a sofrer
adaptaes, buscando o aumento da eficincia reprodutiva e produ-
tiva dos animais em reas cada vez menores. Nesse sentido, as bio-
tcnicas de reproduo animal tm contribudo para a produo de
animais com gentipos superiores e com eficincia produtiva desta-
cada. Atualmente, a tecnologia de produo de embries bovinos tem
combinado a reproduo assistida com tcnicas celulares, moleculares
e genmicas, permitindo a multiplicao de animais geneticamente
valiosos, bem como a produo de animais transgnicos, com aplica-
o nas reas biomdica e agropecuria. Alm disso, os avanos na
criopreservao de espermatozides e embries tm facilitado o pro-
cesso de multiplicao de animais superiores, devido a facilidade de
intercmbio de material gentico dentro e fora do pas.
A inseminao artificial e a transferncia de embries so as tc-
nicas que proporcionam os maiores ganhos genticos para bovinos,
pois, juntamente com os programas de teste de prognie, aumentam
a presso de seleo das raas. Atualmente, a tcnica de produo in
vitro de embries bovinos tem se incorporado fortemente ao setor pro-
dutivo, tornando o Brasil o maior produtor de embries por essa tec-
nologia. A tcnica de fecundao in vitro tambm tem auxiliado no
desenvolvimento do processo de clonagem animal, o qual tem sido
utilizado comercialmente no pas como uma tecnologia de multipli-
cao de animais geneticamente superiores e estratgicos dentro de
determinadas linhagens.
656
Este captulo tem o objetivo de apresentar e discutir detalhes das
principais biotcnicas que impactam de forma prtica a multiplica-
o de bovinos. Dessa forma sero abordadas as biotcnicas de crio-
preservao de germoplasma, inseminao artificial, transferncia
de embries, fecundao in vitro e transferncia nuclear (clonagem).
Criopreservao de genomas
A preservao de clulas em baixas temperaturas denominada
de criopreservao, uma rea aplicada da criobiologia. Os avanos na
tecnologia de criopreservao tm desenvolvido mtodos que permi-
tem manter uma variedade de clulas viveis a baixas temperaturas.
Nesse sentido, a criopreservao tem se tornado uma ferramenta fun-
damental para reproduo de bovinos, bem como para formao de
criobancos genticos para conservao animal ex situ, possibilitando
o armazenamento de espermatozides, ocitos, embries e clulas
somticas. Essas clulas conservadas podem oportunamente ser uti-
lizadas pelas biotcnicas de reproduo, tais como a inseminao arti-
ficial, transferncia de embries, fecundao in vitro e transferncia
nuclear, e, dessa forma, promover a multiplicao de animais com
elevado mrito gentico, bem como de animais em risco de extino.
Criopreservao de espermatozides
O relativo sucesso alcanado com a criopreservao de smen tem
permitido avanos significativos no campo da agropecuria, tornando
possvel uma troca internacional de germoplasma de animais gene-
ticamente superiores; da biotecnologia, por permitir uma eficiente
estocagem de linhagens de murinos cientificamente importantes;
da conservao de espcies em risco de extino, por meio do banco
de recursos genticos; e da medicina reprodutiva humana (WOODS
et al., 2004).
O espermatozide uma clula altamente polarizada e especiali-
zada com uma estrutura tripartida em cabea, pea intermediria e
cauda. Esse gameta perde a habilidade de biosntese, reparo, cres-
cimento e diviso celular durante a fase final da espermatognese.
Dessa forma, a conservao de espermatozides requer uma reduo
657
Captulo 20 Biotecnologia aplicada a pecuria bovina
ou atraso do metabolismo das clulas espermticas para gerar um pro-
longamento de sua vida (YOSHIDA, 2000).
Uma estocagem efetiva de smen no estado congelado implica
em uma completa interrupo no processo de desenvolvimento das
clulas espermticas, que comeam no testculo e continuam atra-
vs do epiddimo e aps a ejaculao. A criopreservao do smen
pode ser considerada como uma lacuna entre o perodo de suspen-
so da animao espermtica e o processo que demarca a continui-
dade do desenvolvimento, que eventualmente conduz a fecundao
(VISHWANATH; SHANNON, 2000).
A maioria dos mtodos de criopreservao de espermatozides
de mamferos ainda consiste de vrios passos no fisiolgicos, que
envolvem a adio hipertnica de um agente crioprotetor permevel
(ACP), resfriamento, aquecimento e a remoo do ACP (WOODS
et al., 2004). Teoricamente, tem sido possvel calcular a adio mnima
de ACP requerida antes do resfriamento para evitar os danos osm-
ticos, bem como a taxa tima de resfriamento para evitar a formao
de gelo intracelular. Um dos mais importantes princpios da crio-
preservao reside na necessidade de remover o mximo possvel de
gua das clulas antes de proceder a sua congelao. Se essa desidra-
tao no ocorrer, grandes cristais de gelo se formaro, lesando seve-
ramente a estrutura intracelular. No entanto, a remoo demasiada de
gua das clulas tambm pode ser deletria (SEIDEL JUNIOR, 1984).
A fortuita descoberta do glicerol (POLGE; SMITH, 1949) como um
efetivo agente crioprotetor introduziu um novo sistema de estoca-
gem de smen, o qual prolonga a viabilidade espermtica e mantm o
potencial fecundante por longos perodos. Existe um argumento que
espermatozides estocados a -79 C (gelo seco) ou a -196C (nitrog-
nio lquido) mantm seu potencial fecundante indefinitivamente. No
entanto, outros especialistas consideram um perodo de tempo mais
curto para os espermatozides sobreviverem a baixas temperaturas
e manterem o potencial fecundante. Outras evidncias sugerem que
esse fato pode ocorrer devido inadequada manuteno da tempera-
tura de estocagem.
Vrios aspectos da criopreservao espermtica tm sido estudados,
tais como a composio qumica dos diluentes e seus efeitos sobre a
658
membrana plasmtica, limites de tolerncia osmtica, condutividade
hdrica e a permeabilidade dos crioprotetores (GILMORE et al., 1999).
Esses estudos sugerem que os espermatozides de cada espcie tm
diferentes propriedades criobiolgicas, bem como apresentam varia-
o quanto sensibilidade a manipulao (ex, pipetagem, centrifuga-
o), tolerncia osmtica, e sensibilidade ao resfriamento (KATKOV;
MAZUR, 1999; PHELPS et al., 1999).
De maneira geral, o sucesso da criopreservao da clula depende
da velocidade da congelao e da composio da soluo em que as
clulas so congeladas. Inicialmente, a gua extracelular congela no
momento em que a clula se aproxima do ponto de congelao, remo-
vendo o lquido extracelular, fato que acarreta um aumento de osmo-
laridade. Com esse desequilibro osmtico, a gua retirada da clula
para o compartimento extracelular, ocasionando uma diminuio do
volume celular. Uma adequada desidratao celular depende da velo-
cidade de congelao, de forma a no provocar uma lise da clula. No
caso de um processo de congelao muito lento, o equilbrio perma-
necer constante e a clula ficar exposta ao crioprotetor e ao estresse
osmtico por tempo prolongado, fato que poder acarretar a morte
celular. Ao contrrio, no caso de uma congelao muito rpida, a desi-
dratao ser insuficiente e causar a formao de gelo intracelular,
ocasionando a lise da clula na ocasio da descongelao (LOPEZ-
BEJAR et al., 1994). Para evitar o dano celular, mesmo com uma velo-
cidade de descongelao controlada, h necessidade do emprego de
crioprotetores. Mesmo com uma soluo crioprotetora empregada,
avaliaes citolgicas tm demonstrado leses na membrana plas-
mtica, regio acrossomal e na configurao da cauda espermtica
(WILLOUGHBY et al., 1996).
A criopreservao espermtica tem sido associada com sucesso com
a tecnologia reprodutiva humana e bovina. A maioria dos protocolos
utiliza uma curva lenta de resfriamento inicial (ex., 1 C/min. a 5 C/
min.), que comea a partir da temperatura corporal ou temperatura
ambiente, at atingir a temperatura de solidificao. Em seguida, aps
a formao inicial de gelo, faz-se necessria a adoo de uma taxa de
resfriamento mais rpida (ex., 100-200 C/min.), na presena de glice-
rol tamponado com gema de ovo e citrato de sdio. Com esse procedi-
659
mento, a taxa de sucesso tem sido satisfatria nessas espcies quando
o smen congelado utilizado na inseminao artificial ou fecunda-
o in vitro (HOLT, 2000).
Um protocolo padro tem sido idealizado para a criopreservao de
smen de todas as espcies. Entretanto, aqueles destinados a criopre-
servao de smen de mamferos apresentam limitaes e produzem
taxas de sucesso que variam entre as espcies e at individualmente
dentro da mesma espcie. Em algumas espcies, tais como suna,
um mtodo apropriado ainda est por ser determinado, enquanto em
outras espcies, como murina, um mtodo que parece ser apropriado
para uma linhagem falha em outra (CRITSER; MOBRAATEN, 2000).
Essas informaes indicam que um exame das propriedades criobio-
lgicas dos espermatozides, bem como um exame da exata natureza
da crio-injria espcie-especfica, deve ser realizada para se determi-
nar um apropriado protocolo de criopreservao (HOLT, 2000).
Apesar dos possveis avanos na tecnologia de criopreservao de
smen bovino, essa metodologia j uma grande realidade para bovi-
nocultura do Brasil. A maior aplicao da criopreservao de smen
bovino est na possibilidade de utilizao e disseminao de mate-
rial gentico de touros superiores por meio da inseminao artificial,
melhorando o desempenho do rebanho de corte e de leite e trazendo,
dessa forma, maior lucratividade ao pecuarista.
Criopreservao de embries
No sistema de produo de bovinos, a criopreservao de embries
tem contribudo com o processo de seleo gentica e tem reduzido
significativamente os custos dos programas de cruzamentos, porque
os embries podem permanecer disponveis at que as fmeas recep-
toras estejam prontas naturalmente, evitando os custos com a sincro-
nizao hormonal do cio (WOODS et al., 2004). A criopreservao de
embries permite uma melhor explorao da fmea doadora, pois os
embries excedentes dos programas de transferncia de embries e
fecundao in vitro podem ser estocados, formando um banco gen-
tico que poder ser utilizado em momento oportuno. Alm disso,
essa tecnologia garante com mais facilidade a importao e exporta-
660
o de germoplasma de interesse. Uma vez que os custos so meno-
res, h segurana higinico-sanitria e menores riscos de transporte.
As tcnicas de criopreservao de embries bovinos produzidos in
vivo esto bem estabelecidas. Inicialmente, o glicerol foi o criopro-
tetor mais utilizado (BILTON; MOORE, 1979), entretanto, como os
embries devem ser lavados vrias vezes para remover o glicerol antes
da transferncia para as fmeas receptoras e, por causa da sua toxici-
dade, esse crioprotetor tem sido substitudo pelo etilenoglicol. O eti-
lenoglicol se difunde para dentro ou para fora do embrio com rapi-
dez, permitindo a transferncia direta dos embries (sem lavagem
fora da palheta), fornecendo taxas de prenhezes similares ao glicerol
(VOELKEL; HU, 1992). Nesse caso, os embries so resfriados a 0,3 C
por minuto at -36 C para garantir a formao de poucos locais de
gelo, seguido pela imerso em nitrognio lquido (TOMINAGA, 2004).
Aps um rpido aquecimento (>300 C por minuto), os embries bovi-
nos tm apresentado taxas de gestao superiores a 50%.
A aplicao comercial em grande escala da tecnologia de produ-
o in vitro de embries bovinos altamente dependente de proce-
dimentos adequados de criopreservao. A sobrevivncia dos embri-
es produzidos in vitro e criopreservados pelo mtodo lento tem sido
bem menor do que os embries produzidos in vivo (DINNYS et al.,
1996; VAJTA et al., 1997). H muitas diferenas morfolgicas entre os
embries produzidos in vitro e os de origem in vivo, as quais podem
afetar a sobrevivncia aos procedimentos de criopreservao lenta
(WRIGHT JUNIOR; ELLINGTON, 1995; THOMPSON, 1997). O est-
gio de mrula produzida in vitro apresenta menos clulas compac-
tas, a sensibilidade da zona pelcida digesto enzimtica alte-
rada, e os embries produzidos in vitro so usualmente mais escuros
e mais leves, possivelmente devido ao aumento do contedo lipdico
(LEIBO; LOSKUTOFF, 1993). Alm disso, os embries produzidos
in vitro apresentam menos complexos juncionais, sendo encontra-
das diferenas na expresso do gene connexin 43 (protena de juno
tipo gap) (WRENZYCKI et al., 1996). A presena de soro fetal bovino
(SFB) no sistema de cultivo in vitro pode gerar vacuolizao, escuri-
do e menor compactao dos embries. A reduo na temperatura
durante o processo de resfriamento pode causar mudanas fsicas nas
661
membranas celulares, tais como separao dos componentes lipdi-
cos que resultam em alterao da funo da membrana plasmtica
(SCHIMSHICK; MCCONNELL, 1973).
Com as atuais tcnicas in vitro, um grande nmero de embries
pr-implantacionais podem ser produzidos relativamente a baixos
custos. Entretanto, os embries produzidos in vitro so caracterizados
pelo aumento da sensibilidade ao resfriamento e diminuio da tole-
rncia a criopreservao quando comparados com os embries pro-
duzidos in vivo (POLLARD; LEIBO, 1994). Nesse contexto, o maior
obstculo associado com essa tecnologia a carncia de mtodos ade-
quados para preservar os embries provenientes do sistema in vitro.
Dessa forma, h, no mnimo, duas abordagens para superar esse pro-
blema: melhorar os mtodos de criopreservao ou melhorar a qua-
lidade do embrio por meio da otimizao do ambiente para produ-
o dos embries in vitro.
At o presente, a congelao lenta e a vitrificao so comumente
utilizados para preservar os embries bovinos. A congelao lenta, que
mais amplamente utilizada, tem a vantagem de utilizar baixas con-
centraes de crioprotetores e permite a transferncia do embrio na
receptora logo aps a descongelao (VOLKEL; HU, 1992). As taxas
de produo de bezerros so levemente mais baixas aps a transfern-
cia de embries produzidos in vivo e criopreservados em comparao
com a transferncia de embries frescos. No entanto, a congelao
lenta de embries produzidos in vitro tem reduzido as taxas de sobre-
vivncia ps-descongelao, devido principalmente a sua susceptibi-
lidade a formao de cristais de gelo (KASAI et al., 2002).
O processo da conservao embrionria por vitrificao tem sur-
gido como grande alternativa para a criopreservao de embries bovi-
nos produzidos in vitro. A vitrificao a solidificao da soluo,
no pela cristalizao, mas sim pela extrema elevao da viscosidade
durante a congelao rpida. Embora a vitrificao elimine as injrias
dos cristais de gelo, a alta concentrao de crioprotetores requeridos
aumenta o risco dos danos osmticos e txicos (KUWAYAMA et al,
1994). Comparaes entre os dois mtodos de criopreservao tm
levado a diferentes resultados, mas parece que a vitrificao mais
662
adequada para a conservao de embries bovinos produzidos pela
fecundao in vitro (DYNNS et al., 1996).
Na vitrificao, a toxicidade das altas concentraes de crioprote-
tores determina que as clulas somente podem ser expostas a solu-
o crioprotetora por um curto perodo de tempo ou a um volume
mnimo de soluo (ARAV et al. 2002). Diferentes estratgias foram
aplicadas para diminuir o volume e para submergir a amostra rapi-
damente no nitrognio lquido, incluindo telas de microscpio ele-
trnico (MARTINO et al., 1996), open pulled straw (OPS) (VAJTA
et al., 1998), cryoloops (FUCHINOUE et al., 2004), cryotops e cryotips
(KUWAYAMA et al., 2005). Ambos os mtodos tm se tornado alter-
nativas viveis em relao s abordagens tradicionais, especialmente
para embries produzidos in vitro, embries micromanipulados e
ocitos (CARVALHAIS et al., 2006; MARQUES et al., 2007).
Criopreservao de ocitos
A criopreservao de ocitos ainda ineficiente em bovinos, sendo
um dos grandes gargalos para a tcnica de fecundao in vitro (FIV).
O sucesso da criopreservao de ocitos tornaria a produo in vitro
de embries uma tcnica completa.
Os ocitos tm uma menor permeabilidade tanto gua quanto aos
agentes crioprotetores. Assim, os ocitos resfriados a baixa tempera-
tura apresentam leses em elementos do citoesqueleto, grnulos cor-
ticais e membrana plasmtica (AMAN; PARKS, 1994). O rompimento
nos grnulos corticais e membrana plasmtica provavelmente con-
duzem a baixa taxa de fecundao e morte celular, respectivamente
(VINCENT; JOHNSON, 1992). Muitos problemas foram encontrados
e associados com o resfriamento e criopreservao de ocitos imatu-
ros, maturados in vitro ou ovulados. Como exemplo possvel citar
as anormalidades no fuso meitico anormal, com desorganizao
dos microtbulos e cromossomos (ROJAS et al., 2004; SUCCU et al.,
2007), alterao na distribuio dos grnulos corticais e aumento da
poliespermia (MAVRIDES; MORROL, 2005; MORATO et al., 2008).
A criopreservao de ocitos em fase de vescula germinativa ou em
metfase II, utilizando mtodos de resfriamento lento, tem resultado
em baixa sobrevivncia.
663
O processo de vitrificao de ocitos vem sendo intensamente
estudado e tem se tornado o mtodo de eleio para conservao de
ocitos bovinos, mesmo com os resultados ainda incipientes. Vrias
tcnicas de vitrificao vm sendo desenvolvidas com o objetivo de
evitar as crioinjrias, aumentando as taxas de resfriamento e aqueci-
mento. Alm disso, a aplicao de crioprotetores menos txicos, bem
como a combinao de dois ou trs crioprotetores tm sido utilizadas
(MORATO et al., 2008).
Vrios estudos vm apostando nas abordagens de vitrificao com
rpidas velocidades de resfriamento. A acelerao da velocidade de
diminuio das temperaturas pode reduzir as crioinjrias, permitindo
o uso de uma menor concentrao de crioprotetores e diminuindo o
tempo de exposio da clula ao crioprotetor. A utilizao de peque-
nos volumes de soluo de vitrificao permite um resfriamento mais
rpido e a reduo de fraturas celulares (ARAV et al., 2002).
Criopreservao de clulas somticas
A criopreservao de clulas somticas parece ser uma metodolo-
gia vivel para vrios tipos celulares. O procedimento prtico de crio-
preservao de fibroblastos tem sido realizado pela adio de 5% a
10% de crioprotetor, tais como glicerol ou dimetilsulfxido (DMSO)
nas clulas em suspenso em meio de cultura, alocadas em pequenos
tubos com poucos mL e em seguida depositado a -80 C em freezer.
Apesar de emprico, este simples procedimento ainda efetivo. Com
esse procedimento, a taxa de resfriamento no pode ser controlada,
porm para fibroblastos bovinos essa metodologia tem sido suficiente.
Inseminao artificial
A tcnica de Inseminao Artificial (IA) , por definio, a depo-
sio mecnica do smen no aparelho genital feminino por meio
de instrumentos especialmente desenvolvidos para este propsito.
Atualmente, a IA considerada a biotecnologia de reproduo assis-
tida que causa o maior impacto em programas de melhoramento ani-
mal, como resultado da sua eficiente forma de disperso de genes de
animais de superior mrito gentico.
664
Existem relatos de uso da inseminao artificial em equinos pelo
povo rabe ainda no sculo XIV. No entanto, o primeiro relato
cientfico de uso da IA ocorreu em 1784, quando o italiano Lazaro
Spallanzani obteve sucesso aps inseminar artificialmente cadelas.
Em bovinos, o primeiro nascimento de animais frutos de IA foi repor-
tado em 1938 (PELI, 1938). A tcnica de IA iniciou sua difuso para
uso comercial a partir dos avanos em procedimentos de manipula-
o do smen e, principalmente, aps a demonstrao de que esper-
matozides poderiam ser conservados a baixas temperaturas por lon-
gos perodos pelos pesquisadores Polge, Smith e Parker, em 1949.
No Brasil, o uso comercial da IA teve incio na dcada de 1970 do
sculo passado, e atualmente comercializam-se mais de 8,2 milhes
de doses de smen no Pas, com uma evoluo de 210,66%, quando
comparados dados dos anos de 1989 e 2008 (ASBIA, 2008). Estatsticas
mundiais indicaram que mais de 232 milhes de doses de smen
congelado foram produzidas por ano em todo o mundo no incio da
atual dcada (THIBIER; WAGNER, 2000). Contudo, uma baixa por-
centagem de matrizes do rebanho brasileiro inseminada artificial-
mente (cerca de 5% a 6%), o que coloca em evidncia a necessidade de
melhor divulgao e difuso da tcnica de IA para ser usada na grande
parte do rebanho ainda sob regimes de monta natural.
O sucesso de um programa de IA resulta de cinco fatores bsi-
cos: eficincia de deteco de cios; habilidade do inseminador (mo
de obra treinada); correta aplicao da tcnica; fertilidade do smen;
e fertilidade da fmea. Nesse sentido, importante a observncia de
todos os detalhes inerentes correta aplicao da tcnica, visto que a
baixa eficincia em um destes cinco fatores bsicos poder implicar
em resultados insatisfatrios.
Vantagens da inseminao artificial
As principais vantagens da tcnica de Inseminao Artificial so de
carter zootcnico, econmico e cientfico. Vantagens de ordem zoo-
tcnica referem-se ao melhoramento gentico que pode ser alcanado
por meio da disseminao de smen de animais superiores para pro-
duo de leite ou de carne; a eficincia do ganho gentico pelo uso de
touros provados com base na sua prognie; a preservao de mate-
665
rial gentico raro que poder ser utilizado no futuro; a diminuio da
movimentao de animais entre fazendas, diminuindo assim a disse-
minao de doenas; e tambm ao pacote de melhorias na escritura-
o zootcnica de uma propriedade quando a inseminao artificial
implantada (anotaes de cios, acasalamentos, partos ocorridos, etc...).
J vantagens de ordem econmica so resultantes da rapidez no
melhoramento gentico do rebanho, o que resulta em ganhos de pro-
dutividade em um reduzido perodo de tempo; do melhor custo-bene-
fcio da compra de smen e manuteno do botijo em relao com-
pra e manuteno de touros; do uso de reprodutores de alto padro
gentico, que se tornaria economicamente invivel em muitas fazen-
das devido ao preo do reprodutor, ao passo que, a compra de doses
de smen deste mesmo animal pode ser economicamente vivel.
A terceira classe de vantagens, a cientfica, se justifica se conside-
rarmos que a inseminao artificial a base para a aplicao de outras
biotcnicas de reproduo assistida, dentre as quais se destacam a
transferncia de embries e a fecundao in vitro. A inseminao arti-
ficial foi a primeira biotecnologia a ser aplicada em larga escala, e por
isso serve de base para o desenvolvimento tecnolgico futuro.
Observao de cios e horrio de inseminao
Considerando que a Inseminao Artificial ir substituir o uso de
touros em monta natural no rebanho, deve-se estar atento eficin-
cia de deteco de estro (cio). Estudos que correlacionaram nmero,
horrio e durao de observaes de estro com a eficincia de deteco
indicaram que maiores taxas de deteco de estro so obtidas quando
so realizadas cinco observaes dirias, com trinta minutos de dura-
o cada (VAN VLIET; VAN EERDENBURG, 1996). No entanto, por
questes operacionais, atualmente recomenda-se no mnimo duas
observaes dirias de 30 a 40 minutos cada.
O sinal principal ou primrio de estro o aceite a monta. A fmea
bovina em cio permanece imvel quando recebe monta do macho
ou de suas companheiras de rebanho. Para facilitar a identificao
da proximidade desse momento (o aceite a monta), existem alguns
sinais secundrios que devem ser observados. Entre esses se desta-
cam: montar em outras fmeas, inquietao, nervosismo, mugido fre-
666
quente, movimentar-se acima do normal, afastamento do rebanho,
vulva edemaciada (inchada), presena de muco saindo pela vulva,
cauda erguida, posio de lordose, urinar com frequncia, descan-
sar o queixo sobre a regio lombar das companheiras, posio de luta
(cabea-a-cabea com outras fmeas). Todos esses fatores iro ajudar
o observador a identificar que animais esto prximos ao cio, ou seja,
prximos do aceite a monta.
Alm da correta observao e identificao dos sinais apresentados
pela fmea em estro, tcnicas auxiliares de deteco de cio podem ser
empregadas pelo profissional inseminador. Rufies, que so machos
no castrados, com libido normal, submetidos a cirurgias de desvio
lateral/aderncia peniana ou fmeas androgenizadas, podem ser usa-
dos como uma ferramenta importante para o aumento da eficincia
de deteco de estro. Uma ferramenta adicional ao uso de rufies
o uso de bual marcador, que um dispositivo colocado na regio da
mandbula do rufio que ir marcar com tinta as fmeas que even-
tualmente sofrerem montas pelo macho rufio. O uso de bual mar-
cador representa grande importncia principalmente na diminuio
de perdas de cios curtos e (ou) noturnos. Com o avano das tecnolo-
gias, dispositivos eletrnicos tambm tm sido aplicados no auxlio
deteco de cios. Esses dispositivos identificam principalmente a
inquietao de animais que se movimentam acima do normal. Uma
terceira tcnica auxiliar para identificao de cios seria a sincroniza-
o do estro em um grupo de animais. Embora os esforos de obser-
vao e identificao de cios ainda sejam necessrios quando h a
sincronizao, a presena de um maior nmero de fmeas em estro
facilita a observao e a manifestao do estro devido maior intera-
o entre os animais em cio.
Aps a correta deteco de cio, faz-se necessria a inseminao arti-
ficial em momento apropriado. O horrio de inseminao definido
levando-se em conta os seguintes aspectos: (1) o momento da ovula-
o aps o incio do cio (24 a 30 horas): (2) o tempo de sobrevivncia
do ocito antes que comece a sofrer degenerao (6 a 8 horas); (3) a
necessidade de um perodo de tempo para que haja a capacitao de
espermatozides, afim de que se tornem aptos fecundao aps a IA
(6 a 12 horas); e (4) o tempo de sobrevivncia dos espermatozides no
667
interior do trato genital feminino (cerca de 24 horas) (HAFEZ, 1995).
Considerados todos esses fatores, a IA deve ser realizada prximo ao
final do estro (cerca de 12 horas aps aceitar a monta pela primeira
vez; Figura 1). De modo geral, recomenda-se a utilizao da regra
am-pm, na qual, animais observados em cio na parte da manh so
inseminados no final da tarde do mesmo dia, e animais observados
em cio na parte da tarde so inseminados no incio da manh do dia
seguinte (TRIMBERGER, 1948). Esse mtodo tem sido utilizado com
sucesso por vrias dcadas, o que no impede adaptaes do mtodo
ao manejo da fazenda em casos especficos.
Muito cedo Bom timo Bom Muito Tarde Horrio da Inseminao
Estro (Cio) - Aceita monta
Durao: 16h (3-30)
Metaestro - Saindo do Cio
Durao:8h (2-24)
0 12 18 24 Horas
Proestro - Entrando no cio
Durao: 8h (0-24)
6
Figura 1. Ilustrao dos sinais que auxiliam a deteco de cio durante trs
fases do ciclo estral bovino (proestro, estro e metaestro); durao mdia (mn.
e mx.) de cada fase; e indicadores do melhor horrio para se realizar a
Inseminao Artificial.
Fonte: Adaptado de Wattiaux, 2009.
668
A tcnica de IA propriamente dita
A tcnica de inseminao artificial em bovinos relativamente
simples de ser executada, o que no diminui a importncia de trei-
namento adequado do profissional responsvel. O inseminador o
maior responsvel pelo resultado da IA (gestaes), visto que est
envolvido na maioria das etapas do processo. Um inseminador efi-
ciente um profissional muito bem treinado e submetido a constan-
tes cursos de reciclagem e capacitao, dedicado, comprometido com
os resultados, e necessariamente interessado e motivado pelo servio
que est desempenhando.
A inseminao artificial propriamente dita inicia-se aps a detec-
o de uma fmea em estro e da definio do momento adequado a
insemin-la. Inicialmente, deve-se avaliar o histrico reprodutivo da
fmea e atentar para o nmero de dias ps-parto (no inseminar antes
de 45 dias ps-parto); nmero de inseminaes anteriores (avaliar
se houve excesso de repeties de cio); e verificar se no h gestao
confirmada para a matriz (possibilidade de cio falso/cio do encabela-
mento). O passo seguinte fazer a retirada de fezes do reto e higie-
nizao da regio perineal do animal (ao redor do reto e vulva). No
momento da retirada de fezes, deve-se observar a caracterstica do
muco saindo pela vulva, que deve ter aparncia transparente, crista-
lina. A higienizao consiste em lavagem com gua abundante para a
limpeza de toda a rea externa vulva, seguida de secagem com papel
toalha ou um pano limpo.
Terminada a limpeza, o inseminador deve proceder preparao do
material e descongelao do smen. Para isso, deve-se aquecer gua
limpa at que atinja a temperatura de 35 C a 37 C. A temperatura
da gua para descongelao do smen de extrema importncia para
minimizar a morte e leses de espermatozides durante o processo
de descongelao (Figura 2). Para descongelao, abre-se o botijo de
nitrognio lquido e retira-se uma palheta de smen com o auxlio de
uma pina de disseco. A palheta deve ser imersa em gua morna
(35 C a 37 C) por um tempo mnimo de 30 a 50 segundos. A palheta
de smen deve ser retirada da gua e seca com o auxlio de papel toa-
lha, antes que se prossiga a montagem do aplicador de IA. Com o apli-
cador montado, o inseminador ir introduzir o aplicador na vulva da
669
fmea a ser inseminada. Neste momento, importante a ajuda de uma
segunda pessoa, que ir auxiliar na abertura da vulva para que o aplica-
dor no toque o seu exterior. O momento entre a retirada da palheta de
smen da gua morna e a introduo do aplicador pela vulva da fmea
de extrema importncia e deve ser realizado o mais rpido possvel.
importante que o smen no passe por grandes variaes de tempe-
ratura, portanto quanto antes o aplicador for colocado no interior da
vulva, a uma temperatura constante, melhor. O inseminador ento ir
segurar o aplicador de IA com uma das mos e introduzir a outra mo
no reto da vaca, manipulando cuidadosamente a crvix at atingir o in-
cio do corpo uterino. O local de deposio do smen se localiza 1 cm
a 3 cm aps o ltimo anel cervical, ou seja, no tero inicial do corpo
do tero. O smen deve ser lentamente depositado nesse local, o que
ir permitir a disponibilidade de espermatozides para a fecundao
em ambos os cornos/tubas uterinas. Encerra-se a tcnica de IA com
a retirada do aplicador e uma leve massagem no clitris do animal.
b
bc
c
0
10
20
30
40
50
60
70
gua a 37 C gua a 20 C gua a 5 C "Na vaca"
a
Mtodo de descongelao
A
c
r
o
s
s
o
m
a
s

i
n
t
a
c
t
o
s

(
%
)
Figura 2. Efeito do mtodo de descongelao na integridade do acrossoma de
smen bovino criopreservado em palhetas francesas de 0,5 mL. Colunas acom-
panhadas de letras diferentes (a, b, c), diferiram estatisticamente (P < 0,05).
Fonte: Adaptado de De Jarnette et al., 2000.
670
Inseminao artificial em tempo fixo (IATF )
Considerando que as maiores limitaes difuso da Inseminao
Artificial em fazendas so a baixa eficincia de deteco de estros
(cio) e a realizao da IA no momento correto (LARSON; BALL,
1992), protocolos hormonais que permitem a inseminao artificial
em um momento pr-programado (tempo fixo) foram introduzidos
como uma alternativa vivel e eficiente para contornar esses entraves.
Estudos com inseminao artificial em tempo fixo (IATF) foram rea-
lizados inicialmente por pesquisadores americanos (PURSLEY et al.,
1995) e se difundiram rapidamente, chegando ao Brasil poucos anos
depois (BARROS et al., 2000).
Os protocolos hormonais de IATF levam em considerao a fisio-
logia hormonal e dinmica ovariana da fmea bovina, e objetiva sin-
cronizar os principais eventos reprodutivos que ocorrem durante o
ciclo estral bovino: (1) incio do desenvolvimento folicular; (2) lute-
lise; e (3) ovulao. O estudo das inter-relaes entre os principais hor-
mnios da reproduo (GnRH, FSH, LH, estradiol e progesterona)
permitiu a aplicao direta dos conhecimentos adquiridos, e um dos
exemplos de aplicaes prticas a IATF/sincronizao de ovulao.
Os efeitos do GnRH e do estradiol na emergncia de uma nova onda
folicular e na induo de ovulao; do FSH, no crescimento folicular;
do LH, na ovulao; e da prostaglandina F
2
, na regresso do corpo
lteo (lutelise) foram, e ainda so, levados em considerao no desen-
volvimento de protocolos eficientes para IATF.
Os princpios bsicos da IATF so: (1) induzir/sincronizar a emer-
gncia de uma nova onda de crescimento folicular pela aplicao ex-
gena de estradiol ou GnRH (ou seus anlogos); (2) induzir lutelise,
interrompendo a fase luteal, por meio da aplicao de prostaglandina
F
2
; e (3) induzir a ovulao pela aplicao de GnRH, LH ou estradiol
(PURSLEY et al., 1995; BARROS, 2000). A exposio progesterona
durante a fase de desenvolvimento folicular resulta em melhores taxas
de gestao aps o protocolo e, por essa razo, fontes de progesterona
exgena (dispositivos intravaginais ou auriculares) foram incorpora-
das aos protocolos (MAPLETOFT et al., 2003). Uma representao
esquemtica dos princpios para definio de um protocolo de IATF
apresentada na Figura 3.
671
Dia 0 Dias 7 ou 8 Dias 9 ou 10 Dias 10 ou 11
Exposio a progesterona exgena:
Implantes intravaginais ou auriculares
Induo de ovulao e/ou
emergncia de uma nova onda
de crescimento folicular
Induo de lutelise e
remoo da exposio
a progesterona exgena
Induo de do pico
pre-ovulatrio de LH para
sincronizar a ovulao
Principias hormnios utilizados:
GnRH, Benzoato de estradiol
Principais hormnios utilizados:
PGF2 e seus anlogos
Principais hormnios utilizados:
GnRH, Benzoato de estradiol,
Cipionato de estradiol ou LH
IATF
Figura 3. Representao esquemtica dos princpios bsicos de protocolos
de sincronizao de cios/ovulao para permitir Inseminao Artificial em
Tempo Fixo (IATF ).
Estudos tm sido conduzidos no intuito de investigar os efeitos de
alguns hormnios adicionais ao protocolo bsico de IATF na induo
de ciclicidade em vacas em anestro ps-parto. Os principais horm-
nios que tm sido adicionados ao protocolo so base de FSH (FSH-V
ou FSHp) ou hormnios que mimetizam seus efeitos (gonadotrofina
corinica equina, eCG; ERENO et al., 2007). Os objetivos so induzir
o crescimento folicular com o auxlio de gonadotrofinas exgenas, a
fim de que o folculo ovulatrio alcance um tamanho tal que induza
a onda pr-ovulatria de LH, vencendo os bloqueios a hormnios da
reproduo (p.ex., o LH) tpicos da fase ps-parto, resultantes, por
exemplo, da amamentao de bezerros. Adequada condio corporal
no ps-parto, contudo, ainda um pr-requisito importante para que
se obtenham resultados satisfatrios em termos de taxa de gestao
(B et al., 2003). importante salientar que protocolos hormonais
no substituem cuidados com a alimentao e um correto manejo
nutricional das matrizes a serem inseminadas. Dessa forma, o uso
de protocolos de IATF em animais subnutridos e (ou) com baixa con-
dio corporal provavelmente incorrer em resultados insatisfatrios.
Trasferncia de embries
A finalidade bsica da Transferncia de embries (TE) em bovinos
a multiplicao, de forma acelerada, do material gentico de uma
672
doadora superior. Especificamente, procura-se aumentar o nmero
de descendentes de uma determinada fmea, aproveitando o seu
potencial gentico para produo. Resumidamente, assim como a
Inseminao Artificial potencializa o uso de material gentico de tou-
ros superiores, a TE difunde material gentico de fmeas superiores.
A transferncia de embries, assim como a IA, tambm se tornou um
grande nicho de mercado e opera em nveis comerciais atualmente
no Brasil. Alm do vis comercial, a TE fornece conhecimentos bsi-
cos de desenvolvimento embrionrio inicial que podem ser aplicados
em outras biotecnologias da reproduo.
Datam do final do sculo XIX os primeiros relatos de sucesso em
transferncia de embries, em coelhos (HEAPE, 1891; citado por
BETTERIDGE, 2003; HASLER, 2003). Em bovinos, contudo, somente
em meados do sculo XX (1950) foi registrado o nascimento do pri-
meiro bezerro fruto de transferncia de embries (WILLETT et al.,
1951). O uso da tcnica de TE em escala comercial comeou modes-
tamente no incio da dcada de 1970, limitada por questes prticas
(coleta e transferncia cirrgicas, com a doadora sob anestesia geral).
Com a introduo dos mtodos de coleta e transferncia no cirrgi-
cas e a disponibilidade de prostaglandina F
2
para sincronizar doado-
ras e receptoras, a TE se tornou mais prtica e pde ser realizada na
prpria fazenda, o que aumentou bastante o potencial de difuso da
tcnica (HASLER, 2003).
Dados atuais registram cerca de 823.160 embries transferidos no
mercado mundial de TE em bovinos (THIBIER, 2008). No cenrio
nacional, o Brasil o segundo maior produtor de embries in vivo fora
da Amrica do Norte e Europa e se consolidou como o maior produtor
mundial de embries in vitro, respondendo por quase 80% das trans-
ferncias desses embries em 2007 (THIBIER, 2008).
Entre as principais aplicaes da TE, destacam-se: (1) planejamento
de acasalamentos e multiplicao de animais de gentipo superior;
(2) otimizao de programas de seleo e melhoramento gentico;
(3) conservao de recursos genticos (animais raros ou em risco de
extino); (4) controle de doenas no comrcio de material gentico;
(5) importao e exportao de material gentico a menor custo e com
673
menor risco sanitrio; e (6) fornece a base para adoo de outras bio-
tecnologias.
A TE em bovinos se caracteriza por trs etapas principais: (1) indu-
o da superovulao; (2) coleta, identificao e classificao dos
embries; e (3) transferncia ou congelao dos embries.
Superovulao de doadoras
A primeira etapa da TE diz respeito seleo de doadoras. Nesse
sentido, avalia-se o gentipo, o fentipo, a prognie (quando dispon-
vel), aspectos sanitrios do animal, o histrico reprodutivo e ainda
realizado um exame ginecolgico completo visando a identificao de
eventuais patologias ou qualquer outra condio de restrio. A supe-
rovulao de doadoras de embries tem a finalidade de induzir o cres-
cimento e a consequente ovulao de vrios folculos em uma esp-
cie monovulatria (bovinos). Os protocolos de superovulao (SOV)
so baseados em conhecimentos da fisiologia reprodutiva dos bovi-
nos, especificamente dinmica do crescimento de folculos ovarianos
e endocrinologia do ciclo estral. importante que se tenha em mente
alguns aspectos bsicos de fisiologia da reproduo, como por exem-
plo, a ocorrncia de, na grande maioria dos animais, duas ou trs
ondas de crescimento folicular durante um ciclo estral. A emergn-
cia de cada onda precedida por uma elevao nas concentraes de
FSH, o que causa o desenvolvimento de um pool de folculos peque-
nos (3 mm a 4 mm em dimetro), que iro crescer simultaneamente
at que se estabelea o processo de divergncia e dominncia folicu-
lar. O folculo dominante passar a crescer a taxas maiores do que os
chamados subordinados e exercer um efeito negativo sobre eles, cau-
sando sua atresia. O folculo dominante se torna ovulatrio, pois pro-
duz estradiol a concentraes suficientes para induzir a ovulao, caso
no haja o bloqueio da progesterona produzida pelo corpo lteo (aps
a ocorrncia de lutelise; proestro). Havendo alta progesterona (dies-
tro), o folculo dominante ir iniciar sua regresso (atresia), haver
uma elevao no FSH circulante e uma nova onda de crescimento foli-
cular ir emergir (Figura 4) (GINTHER et al., 1996).
674
FD1
Fd2
Fov
4
6
8
10
12
0 5 9 10 11 15 20 21
Dias do ciclo
LH
P4
FSH
Emergncia da
2 onda
D
i
m
e
t
r
o

f
o
l
i
c
u
l
a
r

(
m
m
)
Figura 4. Representao esquemtica da dinmica folicular na vaca, em um
ciclo caracterizado por duas ondas de crescimento folicular. O folculo domi-
nante da primeira onda (FD1) cresce em ambiente com alta progesterona,
o que impede a ovulao. J o folculo dominante da segunda onda (FD2) se
torna ovulatrio (Fov) aps a reduo na concentrao de progesterona cau-
sada pela lise do corpo lteo (CL) que, em geral, se inicia aps o 16-18 dia
do ciclo estral. As curvas representam concentraes plasmticas usuais de
hormnio folculo-estimulante (FSH), progesterona (P4) e hormnio lutei-
nizante (LH).
O tratamento superovulatrio deve ser iniciado no momento em
que h um maior nmero de folculos aptos a responder ao trata-
mento, ou seja, um maior nmero de folculos pequenos (3 mm a
4 mm) em crescimento (MAPLETOFT et al., 2002). Considerando-se
o ciclo estral da vaca, de maneira geral, recomendado o incio do
tratamento por volta do 9-10 dia do ciclo, que coincide com o dia de
emergncia da segunda onda de crescimento folicular (GINTHER
et al., 1989). Neste momento, o folculo dominante da primeira onda
j est afuncional e em regresso, e h um pool de folculos crescendo,
aptos a responder ao tratamento. A ausncia de um folculo domi-
nante funcional durante a SOV resulta em maior nmero de folcu-
los ovulatrios e maior nmero de embries coletados (BUNGARTZ;
675
NIEMANN, 1993). Inicialmente, a superovulao era induzida por
meio de tratamentos a base de gonadotrofina corinica equina (eCG),
um hormnio que possui ao folculo estimulante (MONNIAUX
et al., 1983). No entanto, quando preparaes a base de FSH se torna-
ram disponveis comercialmente (principalmente de origem suna),
esse tipo de produto passou a ser utilizado em grande nmero de tra-
tamentos superovulatrios (MONNIAUX et al., 1983).
Atualmente, o protocolo bsico para induo da superovulao em
bovinos consiste de seis a oito aplicaes de produtos a base de FSH
a intervalos de 12 horas, durante trs a quatro dias, em esquema de
doses decrescentes, ou seja, 40% da dose total no primeiro dia; 30%
no segundo dia; 20% no terceiro; e os 10% restantes no ltimo dia
de tratamento (Figura 5) (MONNIAUX et al., 1983). Dentro do proto-
colo, h ainda tratamentos (uma ou duas injees) com prostaglan-
dina F
2
, para que se cause a lise do corpo lteo presente e permita-se
doadora manifestar cio e ovulao. Em geral, um ou dois dias aps
o trmino da SOV, a doadora de embries ir apresentar cio e dever
ser inseminada artificialmente (12 e 24 horas aps o incio do estro).
Obviamente, este protocolo pode ser adaptado e (ou) modificado, mas
deve-se sempre respeitar os eventos que ocorrem em nveis ovarianos
e endcrinos durante o ciclo estral da vaca.
Estro
Dia 0 10 11
Induo da superovulao
FSH FSH FSH FSH
Coleta
e
TE
Cio base PGF2a
Cio
e
IA
IA
Dia 21 12 13 14 15
Figura 5. Ilustrao do protocolo bsico de induo da superovulao em
bovinos, com base em observao de cio (Dia 0); estimulao com FSH ex-
geno a partir da emergncia da segunda onda de crescimento folicular (Dia
10); induo de lutelise com prostaglandina F
2
(PGF
2
); e coleta de embri-
es sete dias aps o estro e IA.
676
Sincronizao de doadoras e receptoras
O resultado positivo da transferncia de embries (gestao)
depende, entre outros fatores, do grau de sincronia entre doadora e
receptora. O embrio recm transplantado ao tero de uma receptora
precisa encontrar um ambiente fisiologicamente compatvel, em ter-
mos endcrinos e de secreo, com a sua idade (sete dias) para que
continue o seu desenvolvimento normal. Melhores taxas de gestao
so encontradas quando h uma sincronia de 24 horas entre o cio da
doadora e da receptora (HASLER et al., 1987), sendo por isso recomen-
dada a utilizao de receptoras no D7 1 do ciclo estral (D0 = estro),
levando-se em conta que a doadora se encontra no D7.
Os mtodos de sincronizao de cios so bastante conhecidos e
variados, podendo ser utilizados progestgenos para prolongamento
da fase luteal, prostaglandina F
2
e seus anlogos para induo de
lutelise e reduo da fase luteal, ou sincronizao da onda de cresci-
mento folicular pela aplicao de estradiol ou GnRH.
H diferentes formas comerciais de progestgenos, sendo as princi-
pais os implantes auriculares e os dispositivos intravaginais. Seu uso
na sincronizao apresenta as vantagens de no ser dependente da
fase do ciclo estral e possibilitar maior flexibilidade na programao.
Desvantagens desse mtodo incluem custo elevado e traumas (irri-
tao vaginal ou implante auricular). J o uso de prostaglandina F
2

tem baixo custo, maior praticidade e apresenta ainda a vantagem de
os produtos comerciais estarem amplamente disponveis em lojas.
No entanto, a eficincia de sincronizao aps a aplicao de PGF
2

limitada, pois a lutelise induzida s ir ocorrer durante a fase de
diestro (dias 6 a 15 do ciclo estral), quando o CL tem sensibilidade ao
produto. Uma segunda limitao diz respeito ao grau de sincroniza-
o dos animais, visto que h diferenas de tempo entre a aplicao
de PGF
2
e a manifestao de estro, que pode ocorrer to cedo quanto
48 horas e to tarde quanto 96 horas aps o tratamento. Esses distin-
tos intervalos PGF
2
-Estro existem em razo do estdio de desenvol-
vimento do folculo dominante no momento do tratamento, o qual
ainda necessita de crescimento e maturao at que ocorra a ovula-
o (KASTELIC et al., 1990).
677
Atualmente, assim como na inseminao artificial, possvel na
TE a sincronizao da emergncia da onda de crescimento folicular
e subsequente induo da ovulao, permitindo assim a induo de
superovulao e coleta de embries em momento pr-determinado
(tempo fixo; SOVTF) e tambm a transferncia de embries em tempo
fixo (TETF) para receptoras com ovulao sincronizada (B et al.,
2002). Os princpios de SOVTF e TETF so semelhantes aos da IATF,
dizendo respeito basicamente: (1) sincronizao da onda folicular por
induo da ovulao ou atresia do folculo dominante pela aplicao de
preparaes a base de estradiol ou GnRH, associados progesterona
exgena; (2) superovulao com tratamento a base de FSH (SOVTF);
(3) induo da ovulao dos vrios folculos ovarianos (SOVTF) ou do
folculo dominante (TETF) pela aplicao de preparaes a base de
estradiol, GnRH ou LH; e (4) IA em tempo fixo (SOVTF) ou transfe-
rncia de embries sete dias aps o estro induzido (TETF). Os proto-
colos de SOVTF e TETF so ferramentas bastante teis quando h a
necessidade de programao das coletas e transferncias. Ainda, pro-
tocolos de TETF podem ser essenciais em locais onde h carncia de
mo de obra treinada para observao de cio em receptoras.
Procedimentos de coleta e transferncia de embries
Aps a induo da superovulao e inseminao artificial da doa-
dora, faz-se necessrio a coleta de embries. Devido ao desenvolvi-
mento embrionrio inicial em bovinos, em geral, coleta-se os embri-
es entre seis e oito dias aps o estro (Dias 6, 7 e 8 do ciclo estral)
quando os embries j se deslocaram das tubas uterinas em direo
ao lmen uterino e se encontram na fase de mrula ou blastocisto
(SENGER, 2005). A programao da coleta inicia-se com a escolha
e organizao do material de coleta. Nesse momento importante a
existncia de uma listagem de todo o material necessrio (check list),
principalmente se a coleta for feita na fazenda. Com o material orga-
nizado e separado, inicia-se a preparao da doadora (o que inclui a
retirada de fezes do reto, limpeza e higienizao da regio perineal
e anestesia epidural em animais bravios, pode ser necessria uma
leve sedao para tranquilizar o animal), que, depois de higienizada
e anestesiada, segue para a coleta em si.
678
O processo de coleta iniciado com a passagem de um cateter de
Foley pela crvix e posicionamento no corpo do tero ou na entrada
de um dos cornos. Em seguida, um pequeno balo inflado na extre-
midade do cateter para que no haja retorno de lquido e inicia-se a
lavagem dos cornos uterinos (flushing) com meio apropriado (soluo
salino-fosfato tamponada, PBS), utilizando-se um circuito de coleta
em forma de Y para que haja entrada e o retorno da soluo. O conte-
do do lavado uterino direcionado diretamente para um filtro cole-
tor de embries, que ir filtrar o excesso de lquido e no permitir a
passagem de possveis embries. Ao final da coleta, o filtro, contendo
pequena quantidade de lquido e as provveis estruturas embrionrias
coletadas, levado ao laboratrio, lavado com soluo PBS, e o seu
contedo colocado em placas de Petri para rastreamento, identificao
e manipulao dos embries recuperados. Os embries so ento clas-
sificados por grau de qualidade (STRINGFELLOW; SEIDEL, 1998),
transferidos para meio de manuteno (holding). Nesse momento
decide-se quanto transferncia ou criopreservao dos embries
coletados. No caso de criopreservao, os embries so transferidos
para placas de Petri contendo uma soluo crioprotetora (por exem-
plo, etilenoglicol ou glicerol), envasados em palhetas de 0,25 mL, e
ento iniciado o processo de congelao. No caso de transferncia
a fresco, os embries em meio de manuteno so envasados dire-
tamente para palhetas de 0,25 mL para que possam ser transferidos
para receptoras.
A prxima etapa inclui a seleo de receptoras e a transferncia
de embries propriamente dita. A seleo de receptoras uma etapa
extremamente importante no processo de TE, pois influencia dire-
tamente os resultados em termos de taxa de gestao (STROUD;
HASLER, 2006). Receptoras de embrio devem estar sob excelente
manejo nutricional (bom escore de condio corporal), sanitrio (livre
de doenas) e reprodutivo (ausncia de patologias), ou seja, devem ser
manejadas com a mesma ateno oferecida s doadoras (STROUD;
HASLER, 2006). A condio sine qua non para uma receptora ser con-
siderada apta a receber um embrio estar em sincronia com o ciclo
estral da doadora (Dia 71) e apresentar um corpo lteo (CL) funcio-
nal no momento da transferncia (JONES; LAMB, 2008). Nesse con-
679
texto, alm da avaliao visual da aparncia externa do animal, se faz
necessrio um exame do aparelho reprodutivo (tero e ovrios) com
o intuito de identificar a existncia de qualquer anormalidade uterina
(p. ex. infeco) e tambm identificar e localizar o corpo lteo (ovrio
direito ou esquerdo). O uso de ultra-sonografia na seleo de recep-
toras pode ser encarado como uma ferramenta adicional para auxi-
liar a tomada de deciso, mas no condio essencial. Alguns estu-
dos indicaram que, desde que a receptora tenha apresentado estro
em sincronia com a doadora e apresente um corpo lteo palpvel no
Dia 7, ela est apta a receber um embrio, independente da qualidade
ultrassonogrfica do CL e de concentraes plasmticas de progeste-
rona (SPELL et al., 2001).
A transferncia dos embries para receptoras aptas pode ser feita
pelo mtodo cirrgico ou no cirrgico, o mais utilizado. O mtodo
no cirrgico realizado sob leve anestesia epidural, por via transcer-
vical, com o auxlio de um aplicador de TE (inovulador). O embrio
deve ser transferido no tero final do corno uterino ipsilateral ao ov-
rio contendo o corpo lteo. O diagnstico de gestao pode ser feito
precocemente (aos 28-30 dias de gestao; i.e., 21-23 dias aps a TE)
por meio de ultrassonografia ou por palpao retal aps os 45 dias de
gestao.
Realidades e limitaes da TE
Dados mundiais de coletas de embries indicam um nmero mdio
de embries viveis por coleta de 6,22; considerando dados de 122 mil
coletas. Analisando-se os dados dos diferentes continentes, a variao
de 5,1 a 7,6 embries viveis/coleta (THIBIER, 2008). Esses dados
representam uma das grandes limitaes da TE, pois a mdia no
reflete a realidade, em que so observadas respostas excelentes (25-30
embries viveis) e respostas sofrveis (nenhum embrio coletado).
Essa grande variao na resposta pode ser explicada por alguns fato-
res: (1) diferenas no tratamento superovulatrio (preparao hormo-
nal, durao e momento do tratamento); (2) fatores inerentes ao ani-
mal doador (variao individual na reserva de folculos ovarianos e,
consequentemente, na populao de folculos disponveis para recru-
tamento; o status ovariano no incio do tratamento; e resposta ao FSH
680
exgeno); (3) fatores inerentes ao ambiente e histria do animal (con-
dio nutricional, histrico reprodutivo, repetidas superovulaes,
idade e raa); e (4) erros no procedimento de coleta e preparao das
doadoras (MAPLETOFT et al., 2002).
Apesar dos grandes avanos em tecnologia, a mdia de embries
viveis/coleta pouco variou nas ltimas dcadas, como demonstrado
por um estudo com 1.733 doadoras, que foram coletadas nos anos
de 1979 ou 1999 (HASLER, 2003). Em um programa de TE, aproxi-
madamente 1/3 (25% a 35%) das doadoras no respondero ao tra-
tamento (sem produo de embries); 50% a 60% tero respostas
ruins ou intermedirias; e apenas um nmero reduzido de doadoras
ter respostas acima da mdia, ou seja, boas ou excelentes. Ainda,
cerca de 30% das doadoras produziro a maioria (~70%) dos embri-
es (DONALDSON, 1984; MAPLETOFT et al., 2002).
Quando se inicia um programa de transferncia de embries, seja
ele de carter comercial ou no, deve-se ter em mente que para o
sucesso da manipulao hormonal do crescimento de folculos ova-
rianos necessrio um bom conhecimento da fisiologia reprodutiva e
endocrinologia da fmea bovina. Alm disso, importante saber que
a tcnica de TE apresenta limitaes inerentes fisiologia das doa-
doras (variao individual) e que a tcnica caracterizada por grande
varincia nos resultados. Embora um grande progresso tenha sido
feito em fisiologia da reproduo dos bovinos, fatores inerentes doa-
dora que afetam a resposta superovulatria so apenas parcialmente
entendidos.
Produo in vitro de embries
A inseminao artificial (IA) em bovinos foi o primeiro passo para
acelerar a transferncia de caractersticas desejveis, permitindo a dis-
seminao de genes de machos considerados superiores e a melhoria
do nvel zootcnico dos rebanhos. Um reprodutor bovino pode produ-
zir milhares de bezerros durante sua vida produtiva pela IA, enquanto
que no mesmo perodo, uma fmea no capaz de produzir mais do
que 8 a 10 bezerros. Portanto, o possvel ganho gentico obtido pela
linhagem materna era extremamente limitado. Com o desenvolvi-
mento de tcnicas de reproduo assistida em animais, ocorreu um
681
grande avano na otimizao e multiplicao de fmeas de interesse
no s para a produo animal, mas tambm para a conservao e
regenerao de espcies animais em perigo de extino.
A transferncia de embries (TE) proporciona um melhor aprovei-
tamento de matrizes de elevado mrito gentico, podendo aumentar,
em mdia, 10 vezes o nmero de crias/ano. Com o advento da produ-
o in vitro de embries (PIV) esse potencial de multiplicao se torna
ainda maior, pois aumenta consideravelmente, o nmero de produ-
tos/vaca/ano. Alm disso, essa tcnica tambm abre a possibilidade
de utilizar bezerras pr-pberes, vacas em incio de gestao, vacas
com subfertilidade adquirida e vacas senis.
Embries produzidos in vitro so aqueles produzidos pela mani-
pulao de gametas, fora de organismo materno. Essa tcnica, ini-
cialmente, se resumia a fecundao in vitro (FIV), entretanto, aps o
nascimento do primeiro bezerro em 1981 (BRACKETT et al., 1982),
avanos considerveis foram obtidos. Atualmente, essa tecnologia se
refere combinao de vrios processos interdependentes, que vo
desde a obteno dos ocitos imaturos transferncia dos embries
para as fmeas receptoras que levaro a gestao a termo.
Obteno de ocitos imaturos para PIV
Ocitos bovinos imaturos juntamente com as clulas do cumulus
que o rodeiam, complexo cumulus-ocito (COC), podem ser recupe-
rados dos ovrios in vitro quando se utiliza ovrios provenientes de
abatedouros ou de animais mortos e in vivo, que pode ser realizada
cirurgicamente ou por ultrassonografia transvaginal (OPU).
A recuperao in vitro de COC pode ser realizada por dissecao ou
fatiamento dos ovrios ou aspirao dos folculos ovarianos. A disse-
cao permite o isolamento mecnico de folculos individualmente,
sendo um processo trabalhoso e demorado. O fatiamento dos ov-
rios proporciona um maior nmero de estruturas recuperadas e,
importante quando se trabalha com ovrios isolados de vacas de ele-
vado mrito gentico. Nesse caso, alm da puno dos folculos vis-
veis na superfcie do ovrio, feita a dissecao desses ovrios maxi-
mizando o seu aproveitamento. A aspirao mtodo mais eficiente
682
e mais utilizado, e pode ser realizada com uma seringa ou com uma
agulha acoplada a uma bomba a vcuo, com a qual se aspiram todos
os folculos presentes na superfcie dos ovrios cujas medidas variem
entre 2 mm e 8 mm de dimetro (GORDON, 2003). A quantidade e
qualidade dos COCs recuperados so influenciadas por vrios fato-
res, tais como: poca do ano; estado fisiolgico do animal; tamanho
do folculo aspirado (DODE et al., 2001); raa e idade das doadoras.
A recuperao de COCs in vivo pode ser realizada cirurgicamente,
quando animais muito jovens so utilizados, ou por OPU, em que a
obteno de ocitos feita pela puno folicular com uma agulha aco-
plada a uma sonda transvaginal, de forma que, os folculos a serem
puncionados so visualizados na tela do ultrassom. A aspirao dos
folculos realizada com auxlio de uma bomba a vcuo, sendo os
COCs, juntamente com o lquido folicular, transportados por um sis-
tema de cnulas ao tubo coletor. A mdia de ocitos obtidos tambm
varia com a raa, a idade, o estgio fisiolgica da doadora e a estrat-
gia de puno adotada. possvel puncionar os folculos de uma doa-
dora duas vezes por semana, uma vez por semana ou uma vez a cada
duas semanas, sendo as duas ltimas alternativas possveis de dobrar
os resultados mediante a estimulao hormonal (GOODHAND et al.,
1999). Independente da estratgia, o resultado final esperado de pelo
menos uma gestao por semana por doadora (PEIXER et al., 1996;
BOUSQUET et al., 2000).
Independente do procedimento utilizado, aspirao in vivo ou in
vitro, os COCs coletados juntamente com o lquido folicular so depo-
sitados em um tubo estril, que se deixa decantar por em torno de 10
minutos. Aps esse perodo, o decantado transferido para uma placa
de Petri, em que ser realizada a busca e seleo dos ocitos.
Seleo de ocitos
Aps a recuperao, COCs devem ser classificados, utilizando como
critrio a homogeneidade e colorao do citoplasma e aparncia, com-
pactao e nmero de camadas de clulas do cumulus. Essa morfolo-
gia dos CCOs tem sido utilizada como mtodo de seleo visual por
ter sido correlacionada com as taxas de blastocistos. Existem vrios
683
sistemas para avaliao da morfologia de ocitos, tais como o sistema
de Stojkovic et al. (2001) descrito abaixo:
Qualidade 1: Complexo cumulus ocito com citoplasma homo-
gneo e com granulaes finas e mltiplas camadas compactas
de clulas do cumulus.
Qualidade 2: Ocito com citoplasma homogneo com peque-
nas reas mostrando pigmentaes irregulares, Cumulus com-
pacto menor do que na categoria 1 com pelo menos 5 camadas
completas.
Qualidade 3: Ocito com citoplasma heterogneo/vacuolizado,
a zona pelucida coberta com pelo menos 3 camadas de clulas
do cumulus e (ou) com pequenas reas desnudas.
Qualidade 4: Citoplasma heterogeneamente pigmentado e o
cumulus completamente/parcialmente ausente ou expandido.
Maturao in vitro de ocitos
Durante a ovognese, os ocitos de mamferos permanecem reti-
dos no estgio de diplteno da prfase da primeira diviso meitica,
desde a vida fetal at pouco antes da ovulao. A retomada da meiose
pode ser mediada por um estmulo hormonal in vivo, ou pela reti-
rada do ocito de dentro do folculo (WASSARMAN; ALBERTINI,
1994). Portanto, quando os ocitos so aspirados dos folculos ova-
rianos (normalmente entre 2 mm a 6 mm de dimetro) para serem
utilizados na PIV, eles ainda so imaturos e necessitam sofrer o pro-
cesso de maturao in vitro (MIV), que realizada cultivando os oci-
tos, logo aps a aspirao do folculo e seleo dos COCs, em meio de
maturao, com temperatura e atmosfera apropriada, por um per-
odo de 22 a 24 horas.
A maturao envolve mudanas nucleares e citoplasmticas que
devem ocorrer simultaneamente e que conferem aos ocitos a capa-
cidade de serem fecundados, descondensarem a cabea do esperma-
tozide, formarem os pr-ncleos e terem desenvolvimento embrio-
nrio normal (DODE et al., 2000a).
Os eventos nucleares envolvem reorganizao da rede de microt-
bulos, rompimento do envoltrio nuclear, condensao dos cromos-
somos e progresso para metfase I, anfase I, telfase I, expulso do
primeiro corpsculo polar e reteno no estgio de metfase II (CHA;
CHIAN, 1998).
684
No que se refere ao citoplasma, ocorre reprogramao na sntese
protica, mudana na atividade da protena quinase ativada por mit-
genos (MAPK) e do fator promotor da maturao (MPF), desenvol-
vimento dos mecanismos de liberao de Ca++, e aquisio da capa-
cidade de descondensar a cabea do espermatozide (SALAMONE
et al., 2001). Ainda durante esse perodo, ocorrem mudanas na orga-
nizao citoplasmtica, tais como: um contnuo desenvolvimento dos
estoques de lipdios;, reduo do aparelho de Golgi; redistribuio de
ribossomos; rearranjo das mitocndrias; e alinhamento dos grnulos
corticais prximos membrana plasmtica (DIELEMAN et al., 2002).
O aumento no estoque de lipdios pode estar associado com a forma-
o de um pool de energia essencial para o ocito suportar o desen-
volvimento aps a fecundao.
Outro evento que ocorre na maturao a expanso das clulas do
cumulus, que circundam os ocitos. Essas so clulas da granulosa
especializadas que esto metabolicamente associadas entre si e com
o ocito. No ocito imaturo, elas esto muito compactadas e durante
a maturao iniciam a secreo de cido hialurnico que se deposita
entre elas, separando-as e causando a expanso dessas clulas.
Fecundao in vitro
Para a fecundao in vitro, espermatozides e ocitos maturos so
co-incubados, em um meio especifico, por um perodo em torno de
18 horas, sendo possvel co-incubar por perodos menores sem afetar
as taxas de produo de embries (DODE et al., 2002a).
Para que a FIV ocorra com sucesso, necessrio que os ocitos
tenham sofrido uma maturao completa e que os espermatozides
tenham sido adequadamente preparados.
Para a preparao do smen a ser utilizado na FIV, vrios mto-
dos para remover o plasma seminal e (ou) crioprotetor e melhorar as
caractersticas seminais tem sido descritos. Entre eles, pode-se citar
a lavagem por centrifugao; gradientes de densidade; filtragem em
coluna de fibra de vidro; e migrao ascendente. Os mais utilizados
so gradiente de densidade utilizando percoll, e a migrao ascendente
conhecida por swim-up.
685
No Swim-up o smen depositado no fundo de um tubo contendo
meio de preparao de smen e deixado em repouso por aproxima-
damente 60 minutos. Os espermatozides vivos migram por motili-
dade ascendente para a poro superior do meio, os espermatozides
mortos, diluidor e demais constituintes do smen permanecem no
fundo do tubo. A poro superior recuperada e utilizada para a FIV.
No gradiente de percoll, os espermatozides tambm so selecio-
nados pela motilidade atravs da passagem por diferentes gradien-
tes. Para separao espermtica se utiliza duas concentraes, que
em geral so de 45% e 90%, depositadas em um tubo sendo o smen
colocado na superfcie do gradiente. Aps centrifugao, o sobrena-
dante retirado e o pellet lavado e utilizado para a FIV.
Alm da qualidade dos ocitos, do mtodo utilizado para prepara-
o do smen e do tempo de co-incubao, outros fatores podem afe-
tar a taxa de fecundao, tais como: a dose inseminante; a interao
touro-vaca; e a diferena entre touros na capacidade de fecundar e pro-
duzir embries, sendo a variao individual de touros um dos prin-
cipais fatores que interferem produo comercial de embries PIV.
Cultivo de embries produzidos in vitro
Aps a fecundao in vitro, os embries so transferidos para o cul-
tivo embrionrio onde permanecem por um perodo de sete dias, at
atingirem o estgio de blastocisto, quando ento podem ser transfe-
rido para o tero de fmeas receptoras que levaro a gestao a termo.
O cultivo in vitro de embries requer um sistema que suporte o
desenvolvimento embrionrio. Vrios sistemas de cultivo foram
desenvolvidos e utilizados. Esses sistemas incluem o cultivo em ovi-
duto de hospedeiro intermedirio, co-cultivo com vrios tipos de clu-
las somticas e cultivo livre de clulas somticas.
Cultivo in vivo em oviduto de coelhas ou ovelhas at o estgio de
blastocisto foi inicialmente muito utilizado, mas caiu em desuso aps
o desenvolvimento dos sistemas de co-cultivo. Apesar de esse mtodo
requerer procedimento cirrgico e ser oneroso, ainda utilizado por
alguns grupos de pesquisa (LONERGAN et al., 2006; GALLI et al.,
2003).
686
O co-cultivo com clulas somticas tornou possvel o cultivo total-
mente in vitro de embries PIV. Sendo que vrios tipos de clulas
somticas tais como da granulosa, epiteliais de oviduto, uterinas e
clulas de linhagem estabelecidas para cultivo como clulas VERO e
clulas BRL (Buffalo rat Liver Cells) podem ser utilizadas.
Entretanto, com o desenvolvimento do meio SOF, que foi criado
baseado na constituio do fluido do oviduto de bovinos, foi elimi-
nada a necessidade de co-cultivo (WATSON, 2000). Esse meio, con-
tudo, requer uma atmosfera de 5% de 0
2
, a qual difere da utilizada
para a MIV e FIV. Estudos tm demonstrado que o meio SOF tam-
bm pode ser utilizado com alta tenso de O2 sem afetar o desenvolvi-
mento embrionrio, desde que as clulas do cumulus remanescentes
no zigoto aps a FIV sejam mantidas (CORRA et al., 2008).
Diferena entre os embries in vivo e in vitro
Embries produzidos in vitro e os produzidos in vivo diferem em
vrias caractersticas, tais como: aspectos morfolgicos e metabli-
cos; alteraes cromossmicas; nmero de clulas; e expresso de
RNAm especficos, assim como, uma maior sensibilidade a criopre-
servao (VAN SOOM et al. 1996; VIUFF et al., 1999; BERTOLINI
et al., 2002). Essas diferenas, possivelmente determinam o comeo
de uma srie de problemas que levam uma reduo na eficincia da
tcnica (FARIN et al., 2001).
Os embries PIV apresentam maior vacuolizao, menor nmero
de clulas, menor densidade de mitocndrias, maior densidade de
lipdios (CROSIER et al., 2001) e junes incompletas entre as clu-
las do boto embrionrio e trofoblasto (FARIN et al., 2001). Em estu-
dos utilizando a tcnica de FISH para avaliar poliploidias, foi deter-
minado que 72% dos embries produzidos in vitro eram mixoplides
e que apesar de a mixopolidia ocorrer tambm em embries in vivo
nos in vitro, ocorre com maior frequncia e em estgios mais pre-
coces de desenvolvimento (VIUFF et al., 1999).
Na PIV cerca de 30% a 50% dos ocitos inseminados chegam ao
estgio de blastocisto e os ndices de gestao esto em torno de 40%
(VAN WAGTENDONK-DE LEEUW, 2006). As maiores perdas no
desenvolvimento embrionrio ocorrem nos estgios de 8 para 16 clu-
las (ativao do genoma do embrio) e ps-transferncia, em torno
dos dias 14 e 15 da gestao.
687
Aplicaes da PIV
A utilizao comercial dessa tcnica ainda est limitada ao custo, e
vai depender do balano entre o mrito gentico do produto (bezerro)
e o custo de sua produo. Entretanto, apesar do custo ainda ser alto,
a PIV est sendo gradualmente integrada a programas de melhora-
mento gentico, como uma ferramenta complementar para multipli-
cao animal.
Em termos prticos, o potencial da PIV fica mais evidente quando
se discute suas diferentes aplicaes. medida que o sistema PIV
melhora, novas alternativas surgem como a criopreservao do ocito
e do embrio para formao de bancos de germoplasma comercial ou
para preservao de espcies. No entanto, os maiores impactos da PIV
para a produo animal so: expanso gentica rpida pelo aumento
do nmero de produtos provenientes de fmeas geneticamente supe-
riores; produo de embries de vacas com subfertilidade adquirida,
vacas em incio de gestao e vacas senis, bem como, bezerras pr-
-pberes; possibilidade de se estabelecer fbricas de embries com
grau de sangue definido segundo o ecossistema e sistema de produ-
o; e sua aplicao associada sexagem de espermatozides produ-
zindo vrias gestaes com apenas uma dose inseminante sexada.
Consideraes sobre a produo in vitro de embries bovinos
Apesar dos avanos observados nessa rea nos ltimos anos, vrios
aspectos precisam ser ainda esclarecidos. As questes esto associa-
das avaliao da competncia biolgica dos gametas e ao prprio sis-
tema de cultivo. Estudos bsicos sobre os diversos mecanismos envol-
vidos esto sendo conduzidos a nvel mundial. Os resultados desses
estudos esclarecero os aspectos relativos maior susceptibilidade
dos embries PIV criopreservao, a menor viabilidade dos ocitos
de bezerras quando comparados aos de vacas e as baixas taxas de pre-
nhez devido menor qualidade desses embries.
importante salientar que, por se tratar de uma tcnica relati-
vamente nova, o monitoramento rigoroso das doadoras de ocitos,
dos ocitos, dos embries e dos produtos nascidos de fundamen-
tal importncia para que essa tcnica possa ser utilizada com segu-
rana, de forma adequada e nas situaes mais indicadas.
688
Transferncia nuclear (clonagem animal )
A transferncia nuclear ou clonagem com clula somtica uma
tcnica em que o ncleo (DNA) da clula transferido para dentro de
um ocito em fase de metfase II, com o objetivo de gerar um novo
indivduo, geneticamente idntico ao animal doador da clula som-
tica (TIAN et al., 2003)(Figura 6).
b) Cultura de clulas
doadoras
g) Desenvolvimento de
embrio clonado
f) Fuso celular e) Transferncia
nuclear
d) Enucleao c) Ocitos
maturados
a) Animal doador
i) Nascimento
dos clones
h) Transferncia
para receptoras
Figura 6. Representao esquemtica do processo de transferncia nuclear.
As clulas so coletadas do animal doador (a) e cultivadas in vitro (b). Um
ocito maturado em metfase II (c) ento tem seu ncleo retirado (enucle-
ado) (d) e a clula somtica do animal doador transferida para o interior
do ocito enucleado (e). A clula somtica e o ocito so fusionados (f) e os
embries se desenvolvem in vitro at a fase de blastocisto (g). Os blastocistos
podem ento ser transferidos para uma fmea receptora e os animais clona-
dos nascem aps completarem o perodo de gestao (i).
Fonte: Adaptado de Tian et al. (2003).
O procedimento de transferncia nuclear tem demonstrado que
genes inativados durante a diferenciao tecidual podem ser com-
pletamente reativados pelo processo de reprogramao nuclear. Esse
evento se resume na reverso da diferenciao celular, fazendo que
a clula adquira novamente a condio de totipotncia. A transfern-
cia nuclear com clula somtica pode ser utilizada para gerar ml-
tiplas cpias de animais geneticamente superiores; para produzir
animais transgnicos; para produzirem protenas de utilidade farma-
cuticas ou para genotransplantes (STICE et al., 1998; POLEJAEVA;
CAMPBELL, 2000); ou para preservar espcies em extino.
689
Em geral, o primeiro passo do processo de clonagem envolve a
coleta das clulas somticas do animal a ser clonado. A escolha da
clula somtica para o uso na transferncia nuclear varia grandemente
(EDWARDS et al., 2003). Tem sido utilizadas clulas somticas doa-
doras provenientes de vrios tecidos e de animais de vrias idades
(fetos, recm nascidos, jovens, adultos e at de animais mortos a um
relativo curto perodo aps a morte). Animais clonados vivos tm sido
obtidos de aproximadamente 12 dos 200 tipos de tecidos adultos dife-
renciados que existem nos mamferos. As razes para isso permane-
cem desconhecidas. Uma leve suposio existente que os tecidos
de animais mais jovens e tecidos com menos diferenciaes seriam
a melhor fonte de clulas doadoras, mas nenhuma evidncia conclu-
siva suporta essa hiptese (VAJTA; GJERRIS, 2006). Aps a coleta, as
clulas somticas podem ser utilizadas imediatamente ou aps longo
tempo de cultivo (KUBOTA et al., 2000). Bovinos adultos tem sido clo-
nados utilizando clulas do cumulus (TANI et al., 2001); fibroblastos
(HEYMAN et al., 2002); clulas da granulosa (PIEDRAHITA et al.,
2002); clulas da glndula mamria (KISHI et al., 2000); clulas mus-
culares (SHIGA et al., 1999); clulas do oviduto (GOTO et al., 1999);
e clulas uterinas (KATO et al., 2000).
O Segundo passo, talvez o mais trabalhoso da transferncia nuclear,
requer a remoo do DNA materno (enucleao) de um ocito em
metafase II (MII). Esse processo exige o uso de micropipetas e se ini-
cia aproximadamente 18 horas aps os ocitos terem sido depositados
no meio de maturao in vitro. A enucleao realizada usualmente
mecanicamente pela fixao do ocito em posio apropriada com
a ponta polida de uma pipeta de fixao com um vcuo suave e pela
aspirao da cromatina contida em parte do ocito por meio de uma
pipeta de enucleao afiada, que ultrapassa a zona pelcida (VADJA;
GJERRIS, 2006).
Para se evitar lises, os ocitos podem ser incubados em presena de
um inibidor de microfilamentos (cytochalasin B). Essa substncia relaxa
o citoplasma permitindo a remoo mecnica de 5% a 15% do cito-
plasma do ocito contendo o DNA materno. H vrias estratgias para
encontrar a cromatina no citoplasma do ocito, que devem ser realiza-
das com cautela para evitar danos e aumentar a eficincia do procedi-
690
mento (VADJA; GJERRIS, 2006). Na maioria das metodologias, o DNA
pode ser visualizado pelo corante Hoechst e iluminao ultravioleta.
Para a clonagem de bovinos, os ocitos so geralmente obtidos de
fmeas abatidas em frigorficos ou de animais vivos, os quais tm seus
folculos aspirados com o auxlio do ultrassom (BRUGGERHOFF
et al., 2002).
O prximo passo da transferncia nuclear insero do ncleo da
clula somtica no interior do citoplasma do ocito, construindo uma
estrutura equivalente a um embrio de uma clula. Para isso, inicial-
mente, uma clula somtica inserida mecanicamente no espao
perivitelino (EPV) do ocito por meio de micropipetas e, em seguida,
a clula somtica integrada ao citoplasma do ocito pela aplicao de
pulsos eltricos (GIBBONS et al., 2002). A clula somtica no interior
do EPV alinhada entre dois eletrodos, e pulsos com uma corrente
eltrica (por exemplo: 2.2 kV/cm por 40 s) poder produzir mais de
70% de estruturas fusionadas (EDWARDS et al., 1999). A eletrofu-
so dependente do contato da clula somtica com o citoplasma do
ocito, em que as membranas de cada citoplasma podero interagir
aps a formao de poros (FIRST; PRATHER, 1991). Dentro de pou-
cos minutos, aps a introduo da clula somtica no citoplasma,
ocorre a quebra da membrana nuclear e a condensao da cromatina
(CAMPBELL et al., 1996).
Em muitos casos, o pulso eltrico utilizado para fuso suficiente
para ativar o embrio clonado a se desenvolver. No entanto, o mtodo
de escolha de ativao nuclear do ocito reconstrudo por combi-
naes qumicas (GIBBONS et al., 2002) que mimetizam as aes
dos espermatozides aps a fecundao. Aps a ativao qumica,
os embries reconstrudos so cultivados e comeam a clivar. Nos
bovinos, uma transferncia no cirrgica do embrio para o tero da
fmea receptora pode ser realizada sete dias aps a ativao e o per-
odo cultivo.
Com a transferncia nuclear convencional tem sido relatado o nas-
cimento de animais vivos de 11 espcies, incluindo bovinos, sunos,
ovinos e caprinos (EDWARDS et al., 2003).
691
Aplicaes da transferncia nuclear
A clonagem animal apresenta teoricamente ilimitadas aplicaes na
pesquisa, indstria e agricultura, apesar do baixo nvel de eficincia.
No entanto, esforos esto sendo empregados para aumentar a efici-
ncia ou identificar situaes em que o presente nvel de eficincia
possa resultar em avanos na competncia (GABOR; GJERRIS, 2006).
Tem sido sugerido que as aplicaes da clonagem de animais de
fazenda sejam divididas em duas reas: (a) biomdica; e (b) agrope-
curia (LEWIS et al., 2004).
Aplicaes biomdicas
O maior potencial da clonagem de animais de fazenda parece ser
para as aplicaes biomdicas. Desde a dcada de 1980, tem sido
possvel modificar mamferos geneticamente por meio da injeo de
cpias de genes desejveis no interior dos pr-ncleos no zigoto. No
entanto, esse mtodo extremamente ineficiente, pois a maioria dos
embries injetados no se desenvolve, e menos de 1% dos animais
nascidos apresenta a mudana gentica desejada (GABOR; GJERRIS,
2006). Alm disso, o mtodo pode introduzir somente novos genes
no genoma e estes podem causar problemas, porque o local de inte-
grao aleatrio (PATERSON et al., 2003).
Aps vrias tentativas, a transferncia nuclear de clula somtica
tem se configurado na forma mais eficiente de produzir animais gene-
ticamente modificados. Pela introduo de modificaes genticas nas
clulas doadoras e escolha daquelas com a mudana desejada para o
procedimento de clonagem, modificaes genticas mais precisas no
genoma animal podem ser garantidas. Ademais, pela perspectiva eco-
nmica e aplicaes biomdicas, a ineficincia da tecnologia de clona-
gem um problema menor, uma vez que os animais que sero cria-
dos tero um valor comercial relativamente alto. Adicionalmente, a
transferncia nuclear com clula somtica pode ser utilizada para uma
rpida multiplicao dos animais transgnicos, os quais iro carregar
as mudanas desejadas (PATERSON et al., 2003).
As duas aplicaes da transferncia nuclear animal que parecem
ser mais realistas para os prximos anos so a criao de animais
692
modelos para doenas humanas e os animais biorreatores (GABOR;
GJERRIS, 2006).
Modelos para doenas
Os modelos para doenas so animais preparados para expressar,
genotipicamente e fenotipicamente certa doena humana. Eles podem
ser utilizados tanto para o entendimento da doena, como para iniciar
testes para possveis tratamentos. No entanto, esses modelos apresen-
tam limitaes devido s diferenas fisiolgicas com o humano, e tam-
bm devido ao limitado tempo de vida dos animais, especialmente o
camundongo (GABOR; GJERRIS, 2006). Os animais geneticamente
modificados podem oferecer uma soluo para esse problema. Um
exemplo disso mencionado por Paterson et al. (2003), em que a
criao de uma ovelha que expressa fibrose cstica prevista. Os ovi-
nos e especialmente os sunos so animais ideais para esse objetivo,
devido s similaridades na fisiologia e no tamanho dos rgos com
os humanos. Alm disso, esses animais so relativamente baratos,
a reproduo e manuteno so bem estabelecidas, e o longo tempo
de vida permite que as doenas se manifestem como nos humanos.
Um grande nmero de genes candidatos est disponvel para o poss-
vel estabelecimento de doenas humanas, incluindo doenas neuro-
degenativas (Parkinson, Alzheimer), alteraes de pele (psoriase) ou
outras doenas com suspeita ou com gentica conhecida, tais como:
diabetes mellitus, arteriosclerose e cncer de mama.
Biorreatores
Os Biorreatores so animais transgnicos que apresentam genes
que produzem protenas humanas inseridas no genoma animal. Essas
protenas podem ser recuperadas do animal e utilizadas no setor bio-
mdico para fins medicinais. A maioria das pesquisas nesse campo
tem sido desenvolvida para obter animais transgnicos para expres-
sarem protenas desejadas no leite. Potencialmente, protenas para o
tratamento de vrias doenas humanas podem ser produzidas dessa
forma no futuro. Protenas tais como o fator de coagulao IX, anti-
trombina humana e alfa 1-antitripsina tm sido recuperadas expe-
rimentalmente de animais transgnicos e clonados. Entretanto, a
693
ineficincia das tecnologias e a rigorosa regulao da medicina so
obstculos para o desenvolvimento da tecnologia dos biorreatores. O
risco da introduo de novas doenas nos humanos (zoonoses) pelo
uso de animais tem criado a necessidade de amplos testes para esses
compostos biolgicos recuperados antes da comercializao. Ainda,
o custo de produo total incluindo a construo do gene, a produ-
o do animal transgnico, a extrao e purificao do produto , deve
ser comparado com as oportunidades de renda para ampliar a viabi-
lidade comercial (LEWIS et al., 2004).
Aplicaes agropecurias
Embora os problemas tcnicos e cientficos sejam similares a rea
biomdica, as aplicaes da clonagem na agropecuria tm sido alta-
mente produtivas, por tornar eventualmente o procedimento vivel
com custo eficiente.
A clonagem tem sido utilizada para criar cpias de animais com
alto valor gentico, tais como vacas com alta produo de leite ou
touros com qualidade de carne superior (PATERSON et al., 2003).
Alternativamente, a clonagem pode ser utilizada para produzir cpias
de animais cuja linhagem so especialmente demandadas nos progra-
mas de cruzamento, e dessa forma, evitando a necessidade de repetir
vrios ciclos de cruzamento. Como exemplo, clonar um touro que tem
uma linhagem desejada e utiliz-lo para o cruzamento e aumentar o
nmero de filhos; ou clonar um grande nmero de animais para melho-
rar a qualidade gentica geral do rebanho (PATERSON et al., 2003).
A clonagem combinada com a modificao gentica animal tem
sido considerada uma melhor opo para competir com os esquemas
de cruzamentos tradicionais, uma vez que caractersticas que no
podem ser introduzidas de outra maneira nos animais podem, com
essa associao, ser disseminadas para uma populao. Nesse caso,
as principais estratgias de associao entre a clonagem e modifica-
o gentica incluem o aumento da resistncia de uma animal a doen-
as, tais como a mastite (WALL et al., 2005), touros transgnicos que
produzem somente filhas fmeas ou somente filhos machos (FABER
et al., 2003), e vacas leiteiras que produzem casena modifica e alte-
rao na sua proporo, melhorando desta forma a qualidade no leite
694
(BROPHY et al., 2003). Uma outra possibilidade gerar animais que
podem produzir menos efeitos negativos ao meio ambiente. O exem-
plo mais conhecido desse caso o enviropigTM, ou seja, um suno que
tem a capacidade de digerir o fitato das plantas e, dessa forma, libe-
rar menos fosfato nas fezes e consequente menos poluio ambien-
tal (KUES; NIEMANN, 2004).
Uma das preocupaes na produo de animais clonados est rela-
cionada ao possvel risco a sade humana devido ao consumo dos pro-
dutos desses animais. Porm, Takahashi e Yoshihio (2004) no encon-
traram diferenas biolgicas entre a carne de bovinos clonados com o
uso de clulas embrionrias e somticas em comparao com animais
no clonados. Da mesma forma, Tom et al. (2004) no encontraram
diferenas no valor nutricional do leite e da carne de produtos bovi-
nos clonados em comparao aos no clonados. Embora, os produtos
de animais clonados paream no apresentar riscos a sade humana,
preciso levar em conta as limitaes na metodologia e quantidade
das pesquisas para confirmar a inocuidade dos produtos clonados.
Finalmente, uma das barreiras para implementao da clonagem
na agropecuria o fato de os clones no serem cpias exatas de um
animal j existente, pois o DNA mitocondrial proveniente do ocito
sempre representar uma pequena parte diferente no novo indivduo.
A importncia desse fato ainda no est clara. Alm disso, os efeitos
epigenticos influenciam tambm a similaridade no nvel do fentipo
entre o animal original e o animal clone (VADJA; GJERRIS, 2006).
Problemas ligados ao procedimento de transferncia nuclear
A maior limitao da clonagem de bovinos adultos utilizando a
transferncia nuclear de clula somtica a extrema ineficincia na
produo de descendentes vivos. A morte de embries e fetos clona-
dos ocorre durante toda a prenhez. Alm disso, uma alta proporo
dos animais geralmente so maiores que o normal e morrem logo
aps o nascimento (EDWARDS et al., 2003).
Em geral, tem havido, no mnimo, cinco perodos de perdas obser-
vadas nos clones derivados de animais adultos. O primeiro, talvez o
mais drstico, ocorre durante o desenvolvimento pr-implantacio-
nal. Em bovinos (WELLS et al., 1998; HILL et al., 2000; EDWARDS
695
et al., 2001), assim como em outras espcies, incluindo caprinos, ovi-
nos e coelhos, mais de 65% dos embries de uma clula falham em
se desenvolver em mrula compacta ou blastocisto.
Aproximadamente 50% dos embries clonados de bovinos estabe-
lecem prenhez aps a transferncia de um nico embrio em fmeas
receptoras. Entretanto, prximo dos 30 dias e continuando at 60 dias
de prenhez, a morte embrionria pode ocorrer em 50 a 100% das pre-
nhezes de clone (ausncia de batimento cardaco e destacamento das
membranas fetais), caracterizando o segundo perodo de perdas de
prenhezes (EDWARDS et al., 2003).
As perdas nas prenhezes de fetos clonados so significativamente
mais altas que o esperado para animais provenientes de forma natu-
ral (HASLER, 1998). A avaliao da placenta de embries clonados na
idade entre 40 e 50 dias de gestao, revela que as placentas so hipo-
plsicas, parcialmente desenvolvidas, com cotildones rudimentares,
ou eventualmente normais quando comparadas com placentas deri-
vadas de embries de fecundao in vitro (HILL et al., 2000).
O terceiro perodo de perdas tem sido notado associado com o
aumento de abortos espontneos durante o segundo trimestre de pre-
nhez (EDWARDS et al., 2001). Exames macroscpicos e histopatol-
gicos dos fetos abortados tem demonstrado poucas anormalidades,
porm, a placenta frequentemente se apresenta de forma anormal,
com uma marcada reduo dos cotildones (menos de 20 cotildones,
quando se espera para este perodo 70 a 120 estruturas). As membra-
nas fetais tambm se apresentam delgadas e edematosas (SCHLAFER
et al., 2000).
O quarto perodo de perdas observadas para prenhezes de bovi-
nos clonados ocorre durante o terceiro trimestre, entre os dias 200 a
265 de gestao. As perdas durante esse perodo so caracterizadas
pela grande incidncia de hidroalantide e morte fetal (CHAVATTE-
PALMER et al., 2002). Alm disso, o hidroalantide acompanhado
pela reduo do nmero de placentomas, hipertrofia de cotildones
e edema de membrana intercoltiledornria (EDWARDS et al., 2003).
Anasarca fetal com edema generalizado do umbigo so usualmente
presentes. Dessa forma, a morte de fetos clonados ocorre primaria-
mente devido a inadequada placentao (EDWARDS et al., 2003).
696
Lquido aminitico e mecnio esto geralmente presentes no pul-
mo de todos os fetos a termo, indicando algum grau de estresse no
tero antes da morte. A maioria dos bezerros derivados de uma pla-
centa anormal necessita de monitoramento intensivo e terapia aps
o nascimento para tratar toda uma infinidade de complicaes. Os
principais problemas encontrados so imaturidade pulmonar, hiper-
tenso pulmonar, dificuldade respiratria, hipxia, hipotermia, hipo-
glicemia, acidose metablica, aumento de veias e artrias umbilicais
(HILL et al., 2000). No entanto, a severidade das complicaes pode
no ser evidente por vrios meses aps o nascimento.
De acordo com Vadja e Gjerris (2006), as anormalidades relaciona-
das com a tcnica de transferncia nuclear podem ser causadas pelos
seguintes fatores: inapropriada clula doadora ou ocito receptor; ina-
propriada sincronia entre a fase do ciclo celular do ncleo doador e o
citoplasma receptor; inadequada reprogramao do genoma doador;
inapropriada manipulao dos ocitos, clulas somticas e dos embri-
es durante o cultivo; vrias manipulaes mecnicas, osmticas, el-
tricas, trmicas e outros tipos de danos.
Apesar da extrema ineficincia da clonagem com clulas somti-
cas, h clones nascidos normais e saudveis, requerendo poucos cui-
dados aps o nascimento (LANZA et al., 2001). Pace et al. (2002) tm
observado similares taxas de crescimento, desempenho reprodutivo
e caractersticas lactacionais dos animais clonados em comparao
com bovinos leiteiros no clonados.
O sucesso da transferncia nuclear parece ser devido a uma sufi-
ciente atividade de reprogramao presente no citoplasma do ocito
para mudar completamente a clula adulta, mas a natureza dos fatores
envolvidos no tem sido precisamente caracterizada (ALLEGRUCCI
et al., 2005).
Consideraes finais
As biotcnicas de reproduo animal se encontram em vrias fases
de desenvolvimento. A inseminao artificial e a transferncia de
embrio so as tecnologias mais consolidadas, porm a fecundao
in vitro j assume lugar de destaque no cenrio nacional, especial-
mente para o criador da raa Nelore, pois a raa possui caracterstica
697
privilegiada na produo de ocitos e consequentemente embries in
vitro. A produo in vitro de embries a abordagem mais nova e fle-
xvel entre todas, entretanto requer mais cuidados tcnicos, uma vez
que exige equipamentos e conhecimentos laboratoriais especficos,
para garantir a qualidade do embrio in vitro. A clonagem animal por
transferncia nuclear de clulas somticas se constitui em uma rea
de rpido desenvolvimento e uma tcnica muito valiosa para produzir
animais com gentica superior, bem como cpias de animais transg-
nicos. No entanto, para melhorar a eficincia dessa tcnica so neces-
srios mais estudos sobre a reprogramao dos genes e sobre as alte-
raes epigenticas no embrio e ao longo da vida do animal clonado.
Referncias
ALLEGRUCCI, C.; THURSTON, A.; LUCAS, E.; YOUNG, L. Epigenetics and the
germline. Reproduction, v. 129, p. 137149, 2005.
AMAN, R. R.; PARKS, J. E. Effects of cooling and rewarming on the meiotic
spindle and chromosomes of in vitromatured bovine oocyte. Biology of
Reproduction, v. 50, p. 103110, 1994.
ARAV, A.; YAVIN, S.; ZERON, Y.; NATAN, D.; DEKEL, I.; GACITUA, H. New
trends in gametes cryopreservation. Molecular and Cellular Endocrinology,
v. 187, p. 7781, 2002.
ASBIA, Associao Brasileira de Inseminao Artificial. Relatrio estatstico de
produo, importao e comercializao de smen. 2008.
BARROS, C. M.; MOREIRA, M. B. P.; FIGUEIREDO, R. A.; TEIXEIRA, A. B.;
TRINCA, L. A. Synchronization of ovulation in beef cows (Bos indicus) using
GnRH, PGF2 and estradiol benzoate. Theriogenology, v. 53, p. 1121-1134, 2000.
BERTOLINI, M.; BEAM, S. W.; SHIM, H.; BERTOLINI, L. R.; MOYER, A. L.;
FAMULA, T. R.; ANDERSON, G. B. Growth, development, and gene expression
by in vivo- and in vitro-produced day 7 and 16 bovine embryos. Molecular
Reproduction Development, v. 63, p. 318-328, 2002.
BETTERIDGE, K. J. A history of farm animal embryo transfer and some associated
techniques. Animal Reproduction Science, v. 79, p. 203244, 2003.
BILTON, R. J.; MOORE, N. W. Factors affecting the viability offrozen stored cattle
embryos. Australian Journal of Biological Science, v. 32, p. 101107, 1979.
B, G. A.; BARUSELLI, p. S.; MARTINEZ, M. F. Pattern and manipulation
of follicular development in Bos indicus cattle. Animal Reproduction Science,
v. 78, p. 307326, 2003.
698
B, G. A.; BARUSELLI, p. S.; MORENO, D.; CUTAIA, L.; CACCIA, M.; TRIBULO,
R.; TRIBULO, H.; MAPLETOFT, R. J. The control of follicular wave development
for self-appointed embryo transfer programs in cattle. Theriogenology,
v. 57, p. 53-72, 2002.
BRACKETT, B. G.; BOUSQUET, D.; BOICE, M. L.; DONAWICK, W. J.; EVANS, J.
F.; VESSEL, M. A. Normal development following in vitro fertilization in the cow.
Biology of Reproduction, v. 27, p. 147-158, 1982.
BROPHY, B.; SMOLENSKI, G.; WHEELER, T.; WELLS, D.; LHUILLIER, P.;
LAIBLE, G. Cloned transgenic cattle produc milk with higher levels of _-casein and
_-casein. Nature Biotechnology, v. 21, p. 157162, 2003.
BRUGGERHOFF, K.; ZAKHARTCHENKO, V.; WENIGERKIND, H.;
REICHENBACH, H. D.; PRELLE, K.; SCHERNTHANER, W.; ALBERIO, R.;
KUCHENHOFF, H.; STOJKOVIC, M.; BREM, G.; HIENDLEDER, S.; WOLF, E.
Bovine somatic cell nuclear transfer using recipient oocytes recovered by ovum
pick-up: effect of maternal lineage of oocyte donors. Biology of Reproduction,
v. 66, p. 367373, 2002.
BUNGARTZ, L.; NIEMANN, H. Effects of a dominant follicle on ovarian
responses of dairy cows following various superovulatory treatment schedules.
Theriogenology, v. 39, n. 1, p. 198, 1993.
BURATINI JUNIOR, J.; PRICE, C. A.; VISINTIN, J. A.; BO, G. A. Effects of
dominante follicle aspiration and treatment with recombinant somatotropin (BST)
on ovarian follicular development in Nellore (Bos indicus) heifers. Theriogenology,
v. 54, p. 421431, 2000.
BOUSQUET, D., TWAGIRAMUNGU, H., DUROCHER, J. et al. Effect of LH
injection before ovum pick-up on in vitro embryo production with oocytes collected
at different intervals after the last FSH injection. Theriogenology, v. 53, p. 347,
2000.
CAMPBELL, K. H.; LOI, P.; OTAEGUI, p. J.; WILMUT, I. Cell cycle co-ordination
in embryo cloning by nuclear transfer. Reviews of Reproduction, v. 1, p. 4046,
1996.
CARVALHAIS, I.; MARQUES, C. C.; BAPTISTA, M. C.; VASQUES, M. I.;
HORTA, A. E. M.; PEREIRA, R. M. Effect of trans-10, cis-12 conjugated linoleic
acid (CLA) on post-thaw viability of biopsied bovine embryos. Reproduction in
Domestic Animals, v. 41, p. 334335, 2006.
CHA, K. Y.; CHIAN, R. C. Maturation in vitro of immature human oocytes for
clinical use. Human Reproduction Update, v. 4, p. 103-120, 1998.
699
CHAVATTE-PALMER, P.; HEYMAN, Y.; RICHARD, C.; MONGET, P.;
LEBOURHIS, D.; KANN, G.; CHILLIARD, Y.; VIGNON, X.; RENARD,
J. p. Clinical, hormonal, and hematologic characteristics of bovine calves derived
from nuclei from somatic cells. Biology of Reproduction, v. 66, p. 15961603, 2002.
CORRA, G. A.; RUMPF, R.; MUNDIM, T. C.; FRANCO, M. M.; DODE, M. A.
Oxygen tension during in vitro culture of bovine embryos: Effect in production
and expression of genes related to oxidative stress. Animal Reproduction Science,
v. 104, p. 132-142, 2008.
CRITSER, J. K.; MOBRAATEN, L. E. Cryopreservation of murine spermatozoa. Ilar
Journal, v. 41, p. 197-206, 2000.
CROSIER, A. E.; FARIN, p. W.; DYKSTRA, M. J.; ALEXANDER, J. E.; FARIN, C.
E. Ultrastructural morphometry of bovine blastocysts produced in vivo or in vitro.
Biology of Reproduction, v. 64, p. 1375-1385, 2001.
DE JARNETTE, J. M.; BARNES, D. A.; MARSHALL, C. E. Effects of pre- and post-
thaw thermal. Insults on viability characteristics of cryopreserved bovine semen.
Theriogenology, v. 53, p. 1225-1238, 2000.
DIELEMAN, S. J.; HENDRIKSEN, p. J. M.; VIUFF, D.; THOMSEN, p. D.;
HYTTEL, P.; KNIJN, H. M.; WRENZYCKI, C.; KRUIP, T. A.; NIEMANN, H.;
GADELLA, B. M.; BEVERS, M. M.; VOS, p. L. Effects of in vivo prematuration and
in vivo final maturation on developmental capacity and quality of pre-implantation
embryos. Theriogenology, v. 57, p. 5-20, 2002.
DINNYS, A.; CAROLAN, C.; LONERGAN, P.; MASSIP, A.;
MERMILLOD, p. Survival of frozen or vitrified bovine blastocysts produced in vitro
in synthetic oviduct fluid. Theriogenology, v. 46, p. 1425-1439, 1996.
DODE, M. A.; RODOVALHO, N. C.; UENO, v. G.; FERNANDES, C. E. The effect
of sperm preparation and co-incubation time on in vitro fertilization of Bos indicus
oocytes. Animal Reproduction Science, v. 69, p. 15-23, 2002.
DODE, M. A. N. Avanos na maturao ovocitria em bovinos. Acta Scientiae
Veterinariae, v. 34, p. 115-130, 2006. Suplemento 1.
DODE, M. A. N.; RODOVALHO, N. C.; UENO, v. G.; ALVES, R. G. A. Number and
morphology of oocytes obtained from ovaries of zebu cows according to follicle
size, physiological status and season. Archivos de Zootecnia, v. 50, p. 415-418,
2001.
DODE, M. A. N.; RODOVALHO, N. C. M.; UENO, v. G.; ALVES, R. G. O. Efeito do
tamanho do folculo na maturao nuclear e citoplasmtica de ovcitos de fmeas
zebunas. Pesquisa Agropecuria Brasileira, Braslia, v. 35, p. 207-217, 2000a.
DODE, M. A. N.; ADONA, p. R.; RODOVALHO, N. C. M. Reteno da meiose de
ovcitos bovinos em lquido folicular de folculos de vrios tamanhos. Arquivos da
Faculdade de Veterinria da UFRGS, Porto Alegre, v. 28, n. 1, p. 241, 2000b.
700
DONALDSON, L. E. Embryo production in superovulated cows: Transferable
embryos correlated with total embryos. Theriogenology, v. 21, n. 4, p. 517-524,
1984.
EDWARDS, J. L.; DORADO, C. M.; WILSON, T. J.; SCHRICK, F. N. Development
of cloned embryos reconstructed with serum fed or serum starved adult granulosa
cells. Theriogenology, v. 55, p. 265, 2001.
EDWARDS, J. L.; POWELL, A. M.; TALBOT, N. C.; GARRETT, W. M.; PURSEL,
v. G. Developmental potential of reconstructed embryos activated immediately
or 4 hours after assessment of fusion with fetal fibroblasts. Theriogenology,
v. 51, p. 202, 1999.
EDWARDS, J. L.; SCHRICK, F. N.; MCCRACKEN, M. D.; VAN AMSTEL, S. R.;
HOPKINS, F. M.; WELBORN, M. G.; DAVIES, C. J. Cloning adult farm animals:
a review of the possibilites and problems associated with somatic cell nuclear
transfer. American Journal of Reproductive Immunology, v. 50, p. 113-123, 2003.
ERENO, R. L.; BARREIROS, T. R. R.; SENEDA, M. M.; BARUSELLI, p. S.;
PEGORER, M. F.; BARROS, C. M. Taxa de prenhez de vacas Nelore lactantes
tratadas com progesterona associada remoo temporria de bezerros ou
aplicao de gonadotrofina corinica equina. Revista Brasileira de Zootecnia, v.
36, n. 5, Viosa, MG, set./out. 2007.
FABER, D. C.; MOLINA, J. A.; OHLRICHS, C. L.; VAN DER ZWAAG, D. F.;
FERNE, L. B. Commercialization of animal biotechnology. Theriogenology,
v. 59, p. 125138, 2003.
FARIN, P.; CROSIER, A. E.; FARIN, C. E. Influence of in vitro systems on embryo
survival and fetal development in cattle. Theriogenology, v. 55, p. 151-170, 2001.
FIRST, N. L.; PRATHER, R. S. Production of embryos by oocyte cytoplast
blastomere fusion in domestic animals. Journal Reproduction and Fertility,
v. 43, p. 245254, 1991.
FUCHINOUE, K.; FUKUNAGA, N.; CHIBA, S.; NAKAJO, Y.; YAGI, A.; KYONO,
K. Freezing of human immature oocytes using cryoloops with Taxol in the
vitrification solution. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, v. 21, p. 307
309, 2004.
GALLI, C.; DUCHI, R.; CROTTI, G.; TURINI, P.; PONDERATO, N.; COLLEONI,
S.; LAGUTINA, I.; LAZZARI, G. Bovine embryo technologies. Theriogenology,
v. 59, p. 599-616, 2003.
GIBBONS, J.; ARAT, S.; RZUCIDLO, J.; MIYOSHI, K.; WALTENBURG, R.;
RESPESS, D.; VENABLE, A.; STICE, S. Enhanced survivability of cloned calves
derived from roscovitine-treated adult somatic cells. Biology of Reproduction,
v. 66, p. 895900, 2002.
701
GILMORE, J. A.; LIU, J.; WOODS, E. J.; PETER, A. T.; CRITSER, J. K.
Cryoprotective agent and temperature effects on human sperm membrane
permeabilities: convergence of theoretical and empirical approaches for optimal
cryopreservation methods. Human Reproduction, v. 15, p. 335-343, 2000.
GINTHER, O. J.; KNOPF, L.; KASTELIC, J. p. Temporal associations among
ovarian events in cattle during oestrous cycles with two and three follicular waves.
Journal of Reproduction and Fertility, v. 87, p. 223-230, 1989.
GINTHER, O. J.; WILTBANK, M. C.; FRICKE, p. M.; GIBBONS, J. R.; KOT, K.
Selection of the dominant follicle in cattle. Biology of Reproduction, v. 55, p. 1187-
1194, 1996.
GOODHAND, K. L. L.; WATT, R. G.; STAINES, M. E.; HUTCHINSON, J. S.;
BROADBENT, p. J. In vivo oocyte recovery and in vitro embryo production from
bovine donors aspirated at different frequencies or following FSH treatment.
GORDON, I. (Ed.). Laboratory Production of cattle embryos. 2nd ed. Wallingford:
CABI Publishing, 2003. 548 p.
GOTO, Y.; KANEYAMA, K.; KOBAYASHI, S.; IMAI, K.; SHIN-NOH, M.;
TSUJINO, T.; NAKANO, T.; MATSUDA, S.; NAKANE, S.; KOJIMA, T. Birth of
cloned calves derived from cultured oviductal epithelial cells of a dairy cow. Animal
Science Journal, v. 70, p. 243245, 1999.
HAFEZ, E. S. E. Reproduo animal. 6. ed. So Paulo: Manole, 1995.
HASLER, J. F. The current status and future of commercial embryo transfer in
cattle. Animal Reproduction Science, v. 79, p. 245264, 2003.
HASLER, J. F. The current status of oocyte recovery, in vitro embryo production,
and embryo transfer in domestic animals with an emphasis on the bovine. Journal
of Animal Science, v. 76, p. 5274, 1998.
HASLER, J. F.; MCCAULEY, A. D.; LATHROP, W. F.; FOOTE, R. H. Effect of
donor-embryo-recipient interactions on pregnancy rate in a large-scale bovine
embryo transfer program. Theriogenology, v. 27, n. 1, p. 139-168, 1987.
HEAPE, W. Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova
within a uterine foster-mother. Proceedings of the Royal Society B, B 48, p. 457
458, 1891.
HEYMAN, Y.; CHAVATTE-PALMER, P.; LEBOURHIS, D.; CAMOUS, S.;
VIGNON, X.; RENARD, J. p. Frequency and occurrence of late-gestation losses
from cattle cloned embryos. Biology of Reproduction, v. 66, p. 613, 2002.
702
HILL, J. R.; BURGHARDT, R. C.; JONES, K.; LONG, C. R.; LOONEY, C. R.; SHIN,
T.; SPENCER, T.; THOMPSON, J. A.; WINGER, Q. A.; WESTHUSIN, M. Evidence
for placental abnormality as the major cause of mortality in first-trimester somatic
cell cloned bovine fetuses. Biology of Reproduction, v. 63, p. 1787 1794, 2000.
HOLM, P.; BOOTH, p. J.; SCHMIDT, M. H.; GRAVE, T.; CALLESEN, H. High
bovine blastocyst development in a static in vitro production system using SOFaa
medium supplemented with sodium citrate and myo inositol or without serum
proteins. Theriogenology, v. 52, p. 683-700, 1999.
HOLT, W. v. Fundamental aspects of sperm cryobiology: the importance of species
and individual differences. Theriogenology, v. 53, p. 47-58, 2000.
JONES, A. L.; LAMB, G. C. Nutrition, synchronization, and management of beef
embryo transfer recipients. Theriogenology, v. 69, p. 107-115, 2008.
KASAI, M.; ITO, K.; EDASHIGE, K. Morphological appearance of the
cryopreserved mouse blastocyst as a tool to identify the type of cryoinjury. Human
Reproduction, v. 17, p. 186374, 2002.
KASTELIC, J. P.; KNOPF, L.; GINTHER, O. J Effect of day of prostaglandin F2
treatment on selection and development of ovulatory follicles in heifers. Animal
Reproduction Science, v. 23, p. 169, 1990.
KATKOV, I. I.; MAZUR, p. Factors affecting yield and survival of cells when
suspensions are subjected to centrifugation. Influence of centrifugal acceleration,
time of centrifugation, and length of the suspension column in quasi-
homogeneous centrifugal fields. Cell Biochem Biophys, v. 31, p. 231-245, 1999.
KATO, Y.; TANI, T.; TSUNODA, Y. Cloning of calves from various somatic cell
types of male and female adult,newborn and fetal cows. Journal Reproduction and
Fertility, v. 120, p. 231237, 2000.
KISHI, M.; ITAGAKI, Y.; TAKAKURA, R.; IMAMURA, M.; SUDO, T.;
YOSHINARI, M.; TANIMOTO, M.; YASUE, H.; KASHIMA, N. Nuclear transfer
in cattle using colostrum-derived mammary gland epithelial cells and earderived
fibroblast cells. Theriogenology, v. 54, p. 675684, 2000.
KUBOTA, C.; YAMAKUCHI, H.; TODOROKI, J.; MIZOSHITA, K.; TABARA,
N.; BARBER, M.; YANG, X. Six cloned calves produced from adult fibroblast cells
after long-term culture. Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
v. 97, p. 990995, 2000.
KUES, W. A.; NIEMANN, H. The contribution of farm animals to human health.
Trends in Biotechnology, v. 22, p. 286294, 2004.
KUWAYAMA, M.; FUJIKAWA, S.; NAGAI, T. Ultrastructure of IVM-IVF bovine
blastocysts vitrified after equilibration in glycerol and 1,2-propanediol using 2 step
and 16-step procedures. Cryobiology, v. 31, p. 41522, 1994.
703
KUWAYAMA, M.; VAJTA, G.; IEDA, S.; KATO, O. Comparison of open and closed
methods for vitrification of human embryos and the elimination of potential
contamination. Reproductive BioMedicine Online, v. 11, p. 608614, 2005.
LANZA, R. P.; CIBELLI, J. B.; FABER, D., SWEENEY, R. W.; HENDERSON, B.;
NEVALA, W.; WEST, M. D.; WETTSTEIN, p. J. Cloned cattle can be healthy and
normal. Science, v. 294, p. 18931894, 2001.
LARSON, L. L.; BALL, p. J. H. Regulation of estrous cycles in dairy cattle: A review.
LEIBO, S. P.; LOSKUTOFF, N. M. Cryobiology of in vitro-derived bovine embryos.
LEWIS, I. M.; FRENCH, A. J.; TECIRLIOGLU, R. T.; VAJTA, G.; MCCLINTOCK,
A. E.; NICHOLAS, K. R.; ZUELKE, K. A.; HOLLAND, M. K.; TROUNSON, A.
O. Commercial aspects of cloning and genetic modification in cattle. Australian
Journal of Experimental Agriculture, v. 44, p. 11051111, 2004.
LONERGAN, P.; FAIR, T.; CORCORAN, D.; EVANS, A. C. Effect of culture
environment on gene expression and developmental characteristics in IVF-derived
embryos. Theriogenology, v. 65, p. 137-152, 2006.
LPEZ-BJAR, M.; LPEZ-GATIUS, F.; CAMN, J.; RUTLLANT, J.; LABRNIA,
J. Development in vitro of rabbit embryos after freezing by two-step or ultra-rapid
cooling methods. Zentralbl Veterinarmed A., v. 41, n. 10, p. 780-790, 1994.
MAPLETOFT, R. J.; MARTNEZ, M. F.; COLAZO, M. G.; KASTELIC, J. p. The
use of controlled internal drug release devices for the regulation of bovine
reproduction. Journal of Animal Science, v. 81, p. E28E36, 2003. E Supplement 2.
MAPLETOFT, R. J.; STEWARD, K. B.; ADAMS, G. p. Recent advances in the
superovulation in cattle. Reproduction Nutrition Development, v. 42, p. 601-611,
2002.
MARQUES, C. C.; BAPTISTA, M. C.; VASQUES, M. I.; HORTA, A. E. M.;
PEREIRA, R. M. Effect of polyunsaturated fatty acids (PUFA) on bovine oocyte
in vitro maturation and subsequent embryo development and freezability.
Reproduction in Domestic Animals, v. 42, p. 108109, 2007.
MARTINO, A.; SONGSASEN, N.; LEIBO, S. p. Development into blastocysts
of bovine oocytes cryopreserved by ultrarapid cooling. Biology of Reproduction,
v. 54, p. 10591069, 1996.
MAVRIDES, A.; MORROL, D. Bypassing the effect of zona pellucida changes on
embryo formation following cryopreservation of bovine oocytes. European Journal
of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, v. 18, p. 6670, 2005.
MONNIAUX, D.; CHUPIN, D.; SAUMANDE, J. Superovulatory responses of
cattle. Theriogenology, v. 19, p. 55-81, 1983.
704
MORATO, R.; IZQUIERDO, D.; ALBARRACIN, J. L.; ANGUITA, B.; PALOMO,
M. J.; JIMENEZ-MACEDO, A. R.; PARAMIO, M. T.; MOGAS, T. Effects of pre-
treating in vitro-matured bovine oocytes with the cytoskeleton stabilizing agent
taxol prior to vitrification. Molecular Reproductio Development, v. 75, p. 191201,
2008.
PACE, M. M.; AUGENSTEIN, M. L.; BETTHAUSER, J. M.; CHILDS, L. A.;
EILERTSEN, K. J.; ENOS, J. M.; FORSBERG, E. J.; GOLUEKE, p. J.; GRABER, D.
F.; KEMPER, J. C.; KOPPANG, R. W.; LANGE, G.; LESMEISER, T. L.; MALLON,
K. S.; MELL, G. D.; MISICA, p. M.; PFISTER-GENSKOW, M.; STRELCHENKO,
N. S.; VOELKER, G. R.; WATT, S. R.; BISHOP, M. D. Ontogeny of cloned cattle to
lactation. Biology of Reproduction, v. 67, v. 334339, 2002.
PATERSON, L.; DESOUSA, P.; RITCHIE, W.; KING, T.; WILMUT, I. Application
of reproductive biotechnology in animals: implications and potentials. Applications
of reproductive cloning. Animal Reproduction Science, v. 79, p. 137143, 2003.
PEIXER, M. A. S.; RUMPF, R.; de BEM, A. R. et al. Produo de embries e
gestaes a partir de ovcitos recuperados por ultrasonografia em fmeas
super-ovuladas. Arquivos da Faculdade de Veterinria da UFRGS, Porto Alegre,
v. 24, n. 1, p. 231, 1996.
PELI, I. First show of a group of calves born from artificial insemination and of
cows inseminated artificially. Nuova Veterinaria, v. 16, p. 151-156, 1938.
PHELPS, M. J.; LIU, J.; BENSON, J. D.; WILLOUGHBY, C. E.; GILMORE,
J. A.; CRITSER, J. K. Effects of Percoll separation, cryoprotective agents, and
temperature on plasma membrane permeability characteristics of murine
spermatozoa and their relevance to cryopreservation. Biology of Reproduction,
v. 61, p. 1031-1041, 1999.
PIEDRAHITA, J. A.; WELLS, D. N.; MILLER, A. L.; OLIVER, J. E.; BERG, M. C.;
PETERSON, A. J.; TERVIT, H. R. Effects of follicular size of cytoplast donor on the
efficiency of cloning in cattle. Molecular Reproduction Development, v. 61, p. 317
326, 2002.
POLEJAEVA, I. A.; CAMPBELL, K. H. S. New advances in somatic cell nuclear
transfer: Application in transgenesis. Theriogenology, v. 53, p. 117-126, 2000.
POLGE, C.; SMITH, A. U.; PARKES, A. S. Revival of spermatozoa after vitrification
and dehydration at lowtemperatures. Nature, London, v. 164, p. 166, 1949.
POLLARD, J. W.; LEIBO, p. Chilling sensitivity of mammalian embryos.
Theriogenology, v. 41, p. 107112,1994.
PURSLEY, J. R.; MEE, M. O.; WILTBANK, M. C. Synchronization of ovulation in
dairy cows using PGF
2
and GnRH. Theriogenology, v. 44, n. 7, p. 915-923, 1995.
705
ROJAS, C.; PALOMO, M. J.; ALBARRACIN, J. L.; MOGAS, T. Vitrification of
immature and in vitro matured pig oocytes: study of distribution of chromosomes,
microtubules, and actin microfilaments. Cryobiology, v. 49, p. 211220, 2004.
RUBIN, K. C. P.; PONTES, J. H. F.; NONATO JUNIOR, I.; ERENO JUNIOR, J. C.;
PANSARD, H.; SENEDA, M. M. Influncia do grau de sangue Nelore na produo
in vitro de ocito. Acta Scientiae Veterinariae, v. 33, p. 183, 2005. Suplemento 1.
SALAMONE, D. F.; DAMIANI, P.; FISSORE, R. A.; ROBL, J. M.; DUBY, R. T.
Biochemical and developmental evidence that ooplasmic maturation of prepubertal
bovine oocytes is compromised. Biology of Reproduction, v. 64, p. 1761-1768, 2001.
SCHIMSHICK, E.; MCCONNELL, H. Lateral phase separation in phospholipid
membranes. Biochemistry, v. 12, p. 2351-2360, 1973.
SCHLAFER, D. H.; FISHER, p. J.; DAVIES, C. J. The bovine placenta before and
after birth: placental development and function in health and disease. Animal
Reproduction Science, v. 6061, p. 145160, 2000.
SEIDEL, G. E. Principles of cryopreservation of mammalian embryos. In: BOVINE
EMBRYO TRANSFER WORKSHOP, 70., Sydney, 1984. Proceedings. Sydney: The
post-graduate committee in veterinary science, 1984. p.107-114.
SENEDA, M. M.; ESPER, C. R.; GARCIA, J. M. Relationship between follicle size
and ultrasound-guided transvaginal oocyte recovery. Animal Reproduction Science,
v. 67, p. 3743, 2001.
SENGER, p. L. Pathways to pregnancy and parturition. 2nd. ed. Pullman: Current
Conceptions, 2005.
SHIGA, K.; FUJITA, T.; HIROSE, K.; SASAE, Y.; NAGAI, T. Production of calves by
transfer of nuclei from cultured somatic cells obtained from Japanese black bulls.
Theriogenology, v. 52, p. 527535, 1999.
SPELL, A. R.; BEAL, W. E.; CORAH, L. R.; LAMB, G. C. Evaluating recipient
and embryo factors that affect pregnancy rates of embryo transfer in beef cattle.
STICE, S. L.; ROBL, J. M.; PONCE DE LEON, F. A.; JERRY, J.; GOLUEKE, p. G.;
CIBELLI, J. B.; KANE, J. J. Cloning: new breakthroughs leading to commercial
opportunities. Theriogenology, v. 49, p. 129-138, 1998.
STOJKOVIC, M.; MACHADO, S. A.; STOJKOVIC, P.; ZAKHARTCHENKO,
V.; HUTZLER, P.; GONALVES, p. B.; WOLF, E. Mitochondrial distribution
and adenosine triphosphate content of bovine oocytes before and after in vitro
maturation: correlation with morphological criteria and developmental capacity
after in vitro fertilization and culture. Biology of Reproduction, v. 64, p. 904-909,
2001.
706
STRINGFELLOW, D. A.; SEIDEL, S. M. Manual of the International Embryo
Transfer Society. Savoy: International Embryo Transfer Society, 1998.
STROUD, B.; HASLER, J. F. Dissecting why superovulation and embryo transfer
usually work on some farms but not on others. Theriogenology, v. 65, p. 65-76,
2006.
SUCCU, S.; LEONI, G. G.; BERLINGUER, F.; MADEDDU, M.; BEBBERE, D.;
MOSSA, F.; BOGLIOLO, L.; LEDDA, S.; NAITANA, S. Effect of vitrification
solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes.
TAKAHASHI, S.; YOSHIHIO, I. Evaluation of meat products from cloned cattle:
biological and biochemical properties. Cloning Stem Cells, v. 6, p. 165171, 2004.
TANI, T.; KATO, Y.; TSUNODA, Y. Direct exposure of chromosomes to
nonactivated ovum cytoplasm is effective for bovine somatic cell nucleus
reprogramming. Biology of Reproduction, v. 64, p. 324330, 2001.
THIBIER, M. Data Retrieval Committee Statistics of Embryo Transfer - Year 2007.
The worldwide activity in farm animals embryo transfer. International Embryo
Transfer Society Newsletter, v. 26, n. 4, Dec. 2008.
THIBIER, M.; WAGNER, H. G. World statistics for artificial insemination in cattle.
Livestock Production Science, v. 74, n. 2, p. 203-212, March 2002.
THOMPSON, J. G. Comparison between in vivo-derived and in vitro-produced
pre-elongation embryos from domestic ruminants. Reproduction, Fertility and
Development, v. 9, p. 341-354, 1997.
TIAN, X. C.; KUBOTA, C.; ENRIGHT, B.; YANG, X. Cloning animals by somatic
cell nuclear transfer biological factors. Reproductive Biology and Endocrinology,
v. 98, p. 1-17, 2003.
TOM, D.; DUBARRY, M.; FROMENTIN, G. Nutritional value of milk and meat
products derived from cloning. Cloning Stem Cells, v. 6, p. 172177, 2004.
TOMINAGA, K. Cryopreservation and sexing of in vivo and in vitro-produced
bovine embryos for their practical use. Journal Reproduction and Development,
v. 50, p. 2938, 2004.
TRIMBERGER, G. W. Breeding efficiency in dairy cattle from artificial
insemination at various intervals before and after ovulation. Research Bulletin,
Nebraska Agricultural Experiment Station, n. 153, p. 1-26, 1948.
VAJTA, G.; GJERRIS, M. Science and technology of farm animal cloning: state of
the art. Animal reproduction science, v. 92, p. 211-302, 2006.
VAJTA, G.; HOLM, P.; KUWAYAMA, M.; BOOTH, p. J.; JACOBSEN, H.; GREVE,
T. Open pulled straw (OPS) vitrification: a new way to reduce cryoinjuries of bovine
ova and embryos. Molecular Reproductio Development, v. 51, p. 5358, 1998.
707
VAJTA, G.; HOLM, P.; GREVE, T.; CALLESEN, H. Factors affecting survival
rates of in vitro produced bovine embryos after vitrification and direct in-straw
rehydration. Animal Reproduction Science, v. 45, p. 191-200, 1997.
VAN SOOM, A.; BOERJAN, M. L.; YSEBAERT, M. T.; KUIF, A. Cell allocation
to the inner cell mass and the trophectoderm in bovine embryos cultured in two
different media. Molecular Reproductio Development, v. 45, p. 171-182, 1996.
VAN VLIET, J. H.; VAN EERDENBURG, F. J. C. M. Sexual activities and oestrus
detection in lactating Holstein cows. Applied Animal Behaviour Science,
v. 50, p. 57-69, 1996.
VAN WAGTENDONK-DE LEEUW, A. M. Ovum pick up and in vitro production
in the bovine after use in several generations: a 2005 status. Theriogenology,
v. 65, p. 914-925, 2006.
VINCENT, C.; JOHNSON, M. N. Cooling, cryoprotectants, and the cytoskeleton of
the mammalian oocyte. Oxford reviews of reproductive biology, v. 14 , p. 73100,
1992.
VISHWANATH, R.; SHANNON, p. Storage of bovine in liquid and frozen state.
Animal Reproduction Science, v. 62, p. 23-53, 2000.
VIUFF, D.; RICKORDS, L.; OFFENBERG, H.; HYTTEL, P.; AVERY, B.; GREVE,
T.; OLSAKER, I.; WILLIAMS, J. L.; CALLESEN, H.; THOMSEN, p. D. A high
proportion of bovine blastocyst produced in vitro are mixiploid. Biology of
Reproduction, v. 60, p. 1273-1278, 1999.
VOLKEL, S. A.; HU, Y. X. Direct transfer of frozen-thawed bovine embryos.
WALL, R. J.; POWELL, A. M.; PAAPE, M. J.; KERR, D. E.; BANNERMANN,
D. D.; PURSEL, v. G.; WELLS, K. D.; TALBOT, N.; HAWK, H. W. Genetically
enhanced cows resist intramammary Staphylococcus aureus infection. Nature
Biotechnology, p. 23, v. 445451, 2005.
WASSARMAN, p. M.; ALBERTINI, D. F. The mammalian ovum. In: KNOBIL,
E.; NEIL, J. D. (Ed.). The physiology of reproduction. New York: Raven,
1994. p. 79-122.
WATSON, p. F. The causes of the reduced fertility with cryopreserved semen.
Animal Reproduction Science, v. 60-61, p. 481-492, 2000.
WATTIAUX, M. A. Heat detection, natural service and artificial insemination. In:
Babcock Institute for International Dairy Research and Development. University
of Wisconsin. Disponvel em: <http://www.infodairy.com/infodairy_upload_files/
Cows_heifers_calves/Reproduction/0187Heat%20determination,%20natural%20
and%20artificial%20insemination-e.pdf>. Acesso em: 20 ago. 2009.
708
WELLS, D. N.; MISICA, p. M.; TERVIT, H. R.; VIVANCO, W. H. Adult somatic cell
nuclear transfer is used to preserve the last surviving cow of the Enderby Island
cattle breed. Reproduction, Fertility and Development, v. 10, p. 369378, 1998.
WILLETT, E. L.; BLACK, W. G.; CASIDA, L. E.; STONE, W. H.; BUCKNER, p. J.
Successful transplantation of a fertilized bovine ovum. Science, v. 113, p. 247, 1951.
WILLOUGHBY, C. E.; MAZUR, P.; PETER, A. T.; CRITSER, J. K. Osmotic
tolerance limits and properties of murine spermatozoa. Biology of Reproduction,
v. 55, p. 715727, 1996.
WOODS, E. J.; BENSON, J. D.; AGCA, Y.; CRITSER, J. K. Fundamental
cryobiology of reproductive cells and tissues. Cryobiology, v. 48, p. 146-156, 2004.
WRENZYCKI, C.; HERRMANN, D.; CARNWATH, J. W.; NIEMANN, H.
Expression of the gap junction gene connexin43 (Cx43) in preimplantation
bovine embryos derived in vitro or in vivo. Journal Reproduction and Fertility,
v. 108, p. 17-24, 1996.
WRIGHT, J. M. Non-surgical embryo transfer in cattle: embryo recipient
interactions. Theriogenology, v. 15, p. 4356, 1981.
WRIGHT JUNIOR, R. W.; ELLINGTON, J. Morphological and physiological
differences between in vivo and in vitro-produced preimplantation embryos from
livestock species. Theriogenology, v. 44, p. 67-1189, 1995.
YOSHIDA, M. Conservation of sperms: current status and new trends. Animal
Reproduction Science, v. 61, p. 349-355, 2000.
711
Biotecnologia agropecuria
e propriedade intelectual
Luciana Harumi Morimoto Figueiredo
Mnica Cibele Amncio
Chang das Estrelas Wilches
Introduo
A Propriedade Intelectual compreende os direitos conferidos, em
lei, para a proteo das criaes da mente humana, ou seja, proteo
do resultado do trabalho intelectual nos campos industrial, cientfico,
literrio e artstico. De acordo como o Artigo 2, Pargrafo VII, da
Conveno da Organizao Mundial da Propriedade Intelectual, assi-
nada em Estocolmo, em 14 de julho de 1967, os direitos da proprie-
dade intelectual dizem respeito s obras literrias, artsticas e cient-
ficas; s interpretaes e s execues dos artistas; aos fonogramas e
s emisses de radiodifuso; s invenes em todos os domnios da
atividade humana; s descobertas cientficas; aos desenhos e modelos
industriais; s marcas industriais, comerciais e de servios, bem como
s firmas comerciais e denominaes comerciais; proteo contra
a concorrncia desleal e todos os outros direitos inerentes atividade
intelectual nos domnios industrial, cientfico, literrio e artstico.
As invenes so protegidas pelo sistema de patentes e esto relacio-
nadas com uma ideia concretizada, nova e aplicvel industrialmente.
A inveno deve ser resultante de um experimento e pode estar rela-
cionada a um processo ou a um produto, como uma mquina, um
artigo de manufatura, uma composio ou qualquer aperfeioamento
desses produtos.
No que diz respeito s protees das biotecnologias, vrios setores
da propriedade intelectual podem estar envolvidos. Um exemplo do
envolvimento dos diversos tipos de proteo na rea biotecnolgica
o famoso queijo Roquefort (legalmente reconhecido na Frana desde
1411), que depende da seleo e cultivo de um micro-organismo par-
ticular, Penicillium roqueforti, usado na fermentao do queijo. Esse
712
queijo foi originado na vila Roquefort-sur-Soulzon na Frana e ama-
durecido nas cavernas calcrias dessa regio. O sistema de proprie-
dade intelectual tem sido utilizado durante vrios anos para proteger
os interesses dos comerciantes de queijo no distrito de Roquefort.
Alguns aspectos do processo de se fazer o queijo usado no distrito
de Roquefort esto protegidos como segredo industrial. A Roquefort
Socit des Caves foi estabelecida em 1842 e formada por produto-
res locais e registrou uma marca distintiva oval em 1863. O governo
francs, em 1924, concedeu reconhecimento formal para o termo
Roquefort como uma proteo de denominao de origem (forma
de indicao geogrfica). Proteo similar foi adquirida no exterior,
por exemplo, a comunidade Roquefort registrou, em 1952, a palavra
Roquefort como uma marca de certificao para queijo nos Estados
Unidos, com a seguinte condio A marca de certificao usada
sobre os produtos para indicar que os mesmos foram manufatura-
dos com leite de ovelha e que foram curados em cavernas naturais
da Comunidade de Roquefort, departamento de Aveyron, Frana.
(WIPO, 2007)
1
.
Enquanto a biotecnologia tem se desenvolvido rapidamente nos
anos recentes, as principais aplicaes da biotecnologia na agricul-
tura foram identificadas h muito tempo e tm contribudo enorme-
mente para o aumento na produo e qualidade do produto. A pro-
teo de micro-organismos e processos relacionados pelo sistema
de patente tambm possui uma longa histria. Em 1873, o cientista
francs Louis Pasteur recebeu uma patente americana (US135245
Figura 1) pelo mtodo de purificar levedura para uso na indstria de
cerveja, para leveduras derivadas desse mtodo e para o equipamento
usado na purificao da levedura, com base no melhoramento signifi-
cativo da tecnologia de produo da cerveja que foi revelada no docu-
mento de patente.
1
World Intellectual Property Organization (WIPO), 2007: Apostila do WIPO Advanced Course:
Biotechnology and Intellectual Property.
713
Captulo 21 Biotecnologia agropecuria e propriedade intelectual
Figura 1. Pgina de rosto da patente US135245.
714
Para que uma inveno seja passvel de proteo por patente,
necessrio que ela seja nova (no pode ter sido revelada em nenhum
lugar do mundo sob qualquer maneira de divulgao), tenha aplica-
o industrial (finalidade de uso na produo econmica, seriada e
industrial) e envolva atividade inventiva (no seja bvia para um tc-
nico no assunto particular em que se insere a inveno). O Trade-
Related Aspects of Intellectual Property Rights (TRIPS) permite que
sejam excludas de proteo as invenes que sejam contrrias
ordem pblica e moral, possibilitando tambm deciso, pelos pa-
ses membros, para excluir de proteo as invenes relacionadas a
mtodos diagnsticos, teraputicos e cirrgicos e a mtodos de trata-
mento de seres humanos ou animais, assim como a excluso de prote-
o de plantas e animais, exceto micro-organismos. O TRIPS tambm
permite a excluso de proteo de invenes que sejam necessrias
para proteger a vida humana, animal ou vegetal, bem como o meio
ambiente ou a moralidade.
A legislao sobre a propriedade intelectual
e as invenes biotecnolgicas
Cada pas possui sua prpria legislao sobre a propriedade inte-
lectual, incluindo leis especficas correlatas, como a lei da inovao,
Conveno de Diversidade Biolgica, e outras que envolvam a prote-
o de tecnologias especficas, como, por exemplo, as criaes biotec-
nolgicas. A diretiva da Unio Europeia especfica para as invenes
biotecnolgicas d alguns exemplos de invenes que podem ser con-
sideradas contrrias ordem pblica ou moralidade (WIPO, 2007)
2
:
Processos de clonar seres humanos.
Processos para modificar a identidade gentica da linhagem ger-
minativa de seres humanos.
Uso de embries para propsitos industriais ou comerciais.
Processos para modificar a identidade gentica dos animais
que provavelmente causaro sofrimento sem qualquer bene-
2
715
fcio mdico substancial para o homem ou animal, e tambm
animais resultantes desses processos.
A Conveno de Patente Europeia (European Patent Convention,
1973), que estabelece a proteo de criaes tcnicas em mbito
regional, prev a excluso de proteo de invenes relativas a
variedades especficas de animais e vegetais [artigo 53 (b) da EPC].
Adicionalmente, o Escritrio Europeu de Patentes (EPO) faz objeo
proteo de invenes relacionadas com o tratamento de seres huma-
nos sendo via biolgica ou outros meios.
Na Austrlia, por exemplo, a Lei de Patentes de 1990 permite o
patenteamento de invenes usando micro-organismos, plantas e
animais, mas no usando seres humanos e processos biolgicos para
sua gerao. Alm disso, o Escritrio Australiano de Patentes tambm
regulamenta que o organismo vivo, incluindo um animal ou gene,
precisa apresentar uso industrial. Portanto, os animais precisam pos-
suir alguma funo, tal como modelo de pesquisa, ou ser produtor de
uma substncia utilizvel. No que se refere sequncia de DNA, ela
precisa codificar uma protena ou outro elemento funcional ou agir
como uma sonda para um alvo gnico especfico.
A Lei de Patentes dos Estados Unidos (United States Code Title
35 Patents, 2007) considera patentevel qualquer nova e utilizvel
manufatura ou composio de matria, independente de ser criada
ou descoberta pelo homem, em qualquer rea tcnica, no excluindo
seres humanos.
A Suprema Corte do Canad, por outro lado, tem como regra excluir
de proteo formas de vida desenvolvidas, tal como ratos transgni-
cos, porque esse tipo de criao no um produto manufaturado ou
composio relacionada dentro do significado de inveno. No Japo,
a lei exclui de proteo a mera descoberta de micro-organismos exis-
tentes na natureza e invenes de micro-organismos per se que so
incapazes de aplicao industrial (WIPO, 2007)
3
.
No Brasil, a Lei da Propriedade Industrial N 9.279, de 14 de maio
de 1996, no considera inveno o todo ou parte de seres vivos natu-
rais e materiais biolgicos encontrados na natureza, ou ainda que dela
3
716
isolados, inclusive o genoma ou germoplasma de qualquer ser vivo
natural e os processos biolgicos naturais (Art. 10, inciso IX). A lei
ainda no considera patentevel o todo ou parte de seres vivos, exceto
os micro-organismos transgnicos que atendam aos trs requisitos
de patenteabilidade novidade, atividade inventiva e aplicao indus-
trial previstos no art. 8 e que no sejam mera descoberta (Art. 18,
inciso III). Em vista desses dois artigos (10 e 18) da Lei, podem ser
patenteveis aquelas invenes biotecnolgicas que estejam relacio-
nados com processos envolvendo organismos vivos (p. ex.: mtodo de
produzir plantas transgnicas), construes gnicas (DNA recombi-
nante, vetores de expresso), micro-organismos transgnicos (p. ex.:
vrus e bactrias transformadas), protenas recombinantes e compo-
sies envolvendo extratos de materiais biolgicos.
Apesar da Lei da Propriedade Industrial brasileira no permitir a
proteo de plantas transgnicas, essas plantas podem ser protegi-
das por meio de um mecanismo sui generis denominado Proteo
de Cultivar, regido pela Lei brasileira 9.456/97. Por essa legislao, a
proteo de cultivares tem vigncia de 15 anos, exceto para videiras,
rvores frutferas, florestais e ornamentais, para as quais a proteo
de 18 anos. O rgo internacional responsvel pela proteo de novas
variedades de plantas a Union Internationale pour la Protection des
Obtention Vegetales (UPOV). Nos Estados Unidos, as plantas com
reproduo assexuada (exceto tubrculos) so protegidas pelo sistema
de patentes, enquanto as plantas que possuem reproduo sexuada e
tubrculos so protegidas pelo mecanismo da UPOV.
Outra importante questo envolvendo a propriedade intelectual
relacionada ao setor agrobiotecnolgico o acesso a recursos genti-
cos e ao conhecimento tradicional, que est regulamentada hoje pela
Medida Provisria n. 2.186-16, de 2001. De acordo com essa medida,
o Acesso ao Conhecimento Tradicional Associado a obteno de
informao sobre conhecimento ou prtica, individual ou coletiva,
associada ao patrimnio gentico, de comunidade indgena ou de
comunidade local, para fins de pesquisa cientfica, desenvolvimento
cientfico ou bioprospeco, visando a sua aplicao industrial ou de
outra natureza. importante tambm ter em mente a definio cons-
tante da Orientao Tcnica n. 1, de 24 de setembro de 2003, do
717
CGEN, qual seja: atividade realizada sobre o patrimnio gentico
com o objetivo de isolar, identificar ou utilizar informao de origem
gentica ou molculas e substncias provenientes do metabolismo dos
seres vivos e de extratos obtidos destes organismos (VASCONCELOS,
2010)
4
. A medida tambm conceitua o Acesso ao Patrimnio Gentico
como sendo obteno de amostra de componente do patrimnio gen-
tico para fins de pesquisa cientfica, desenvolvimento tecnolgico ou
bioprospeco, visando a sua aplicao industrial ou de outra natureza
(Inc. IV do Art. 7 da M. p. n. 2.186-16, de 2001). Essa definio deve
ser lida em conjunto com a definio constante da Orientao Tcnica
n. 1, de 24 de setembro de 2003 do CGEN, qual seja: acesso ativi-
dade realizada sobre o patrimnio gentico com o objetivo de isolar,
identificar ou utilizar informao de origem gentica ou molculas e
substncias provenientes do metabolismo dos seres vivos e de extra-
tos obtidos destes organismos (VASCONCELOS, 2010). Essas defini-
es so importantes para que os pesquisadores saibam se seu objeto
de pesquisa se encaixa em algum desses casos e, em caso afirmativo,
eles devero solicitar autorizao aos rgos responsveis (CGEN ou
qualquer rgo ou instituio credenciado) para evitar problemas futu-
ros. Encaixam-se dentro do escopo da Medida Provisria n 2.186-16
as pesquisas envolvendo: (1) qualquer espcie de material gentico,
seja ele animal, microbiano, fngico ou vegetal nativo ou domesti-
cado; e (2) conhecimento tradicional associado detido por comunidade
indgena ou local. importante ressaltar algumas atividades de pes-
quisa que no necessitam de autorizao do CGEN, exceto se envol-
verem acesso a conhecimento tradicional (VASCONCELOS, 2010)
5
:
Pesquisas que visem avaliar ou elucidar a histria evolutiva de
uma espcie ou de grupo taxonmico, as relaes dos seres vivos
entre si ou com o meio ambiente, ou a diversidade gentica de
populaes.
Testes de filiao, tcnicas de sexagem e anlises de caritipos
ou de ADN que visem identificao de uma espcie ou esp-
cime.
4
VASCONCELOS, R. M. 2010. Parecer AIT 080. Embrapa.
5
VASCONCELOS, R. M. 2010. Parecer AIT 080. Embrapa.
718
Pesquisas epidemiolgicas ou aquelas que visem identifica-
o de agentes etiolgicos de doenas, assim como a medio da
concentrao de substncias conhecidas cujas quantidades, nos
organismos, indiquem doena ou estado fisiolgico.
Pesquisas que visem formao de colees de ADN, tecidos,
germoplasma, sangue ou soro.
A autorizao de acesso e remessa de amostra de patrimnio gen-
tico para fins de pesquisa cientifica concedida pelo Ibama ou CNPq,
na qualidade de instituio credenciada pelo CGEN, desde que no
haja acesso ao conhecimento tradicional associado. As autorizaes
de acesso e remessa de amostras de patrimnio gentico e (ou) conhe-
cimento tradicional para fins de bioprospeco e de desenvolvimento
tecnolgico so concedidas, exclusivamente, pelo CGEN
6
.
Sistema de patentes
Conforme pode ser observado, o mecanismo de proteo das inven-
es biotecnolgicas pode envolver uma srie de segmentos da pro-
priedade intelectual, mas um dos principais mecanismos de prote-
o atravs do sistema de patentes. O documento de patente de
extrema importncia para esse tipo de proteo e ele composto basi-
camente de: relatrio descritivo (descreve a inveno, de modo a ser
reproduzvel por um tcnico da rea, podendo incluir na maioria das
vezes, a citao de exemplos), reivindicaes (define a matria que o
inventor pretende proteger) e resumo (apresenta as informaes bsi-
cas da inveno para efeito de divulgao). Dependendo do caso, o
documento de patente pode ter ainda desenhos (servem para facilitar
a compreenso da inveno) e listagem de sequncias (sero necess-
rias se, na inveno, estiverem contidas sequncias novas que sero
reivindicadas, quer se trate de sequncias de cidos nucleicos, quer
de aminocidos). Cada uma das partes do documento possui sua par-
ticularidade; no entanto, o relatrio descritivo e as reivindicaes so
fundamentais para esse tipo de proteo (FIGUEIREDO et al., 2008).
No relatrio descritivo de um documento de patente, a inveno
deve estar revelada de forma detalhada para que uma pessoa ver-
6
J est em andamento o credenciamento do CNPq para essas atividades (deliberao em
vias de publicao).
719
sada no assunto possa ser capaz de reproduzir a inveno por meio
das informaes descritas. Para o caso de invenes envolvendo
micro-organismo, deve haver um depsito do material biolgico em
Instituio Depositria Internacional (IDA) reconhecida de acordo
com o estabelecido pelo Tratado de Budapeste (Tratado Internacional
que regulamenta questes relativas a patentes e material biolgico),
uma vez que um micro-organismo no pode ser suficientemente des-
crito no relatrio. Esse depsito deixar o micro-organismo disponvel
para que um tcnico no assunto possa acessar e reproduzir a inveno.
As reivindicaes definem exatamente o que est sendo protegido
da inveno e devem ser fundamentadas no relatrio descritivo, carac-
terizando as particularidades do invento e definindo, de modo claro
e preciso, a matria objeto de proteo. A reivindicao deve se limi-
tar claramente matria para a qual est sendo solicitada/concedida
exclusividade com o intuito de ser exercida uma futura atividade eco-
nmica. Atravs do que est descrito nas reivindicaes, o pblico
poder saber, com segurana, os produtos e processos que esto pro-
tegidos e, consequentemente, aqueles que esto fora dos limites de
proteo e que podero ser utilizados sem precisar pagar royalties.
De acordo com Macedo et al. (2001), a obteno de efetiva prote-
o para invenes biotecnolgicas pode ser dividida em reivindica-
es de produto e de processo, que so agrupadas em diversos nveis
de importncia:
Primeiro nvel: reivindicaes dirigidas ao produto final, isto ,
o objeto patenteado que ser colocado no mercado (p. ex.: com-
posio inseticida).
Segundo nvel: dirigido para o processo de produo do produto
final ou pelo menos de um ingrediente ativo do produto final (p.
ex.: processo de produo da dita composio inseticida).
Terceiro nvel: mtodos de uso (p. ex.: mtodo de matar insetos).
Quarto nvel: matrias-primas, intermedirios, ferramentas e
semelhantes (p. ex.: cDNAs, plasmdeos envolvidos na confec-
o da composio).
Quinto nvel: processos intermedirios (p. ex.: screening).
Quando uma sequncia de DNA inserida dentro de um orga-
nismo para expresso de determinada protena que naturalmente
720
no era expressa por esse organismo, pode-se considerar tal evento
como uma inveno, uma vez que houve a formao de um efeito tc-
nico desejado (surpreendente) e inesperado. A extenso da proteo
nesses casos ser muito dependente do conhecimento pblico das
caractersticas da dita protena (p. ex.: nvel de purificao, sequn-
cia de aminocidos, mRNA correspondente, mapeamento do gene,
entre outros) e o escopo das reivindicaes nesses casos depender
da quantidade de informao revelada ao pblico (MULLER, 2003).
No entanto, importante ressaltar que a proteo da matria descrita
nas reivindicaes ser analisada pelos examinadores de acordo com
a legislao de cada pas.
No Brasil, uma sequncia de DNA como encontrada na natureza
no seria passvel de proteo por patente mesmo que nova, pois, de
acordo com a legislao vigente, o isolamento de sequncias de cido
nucleico de organismos no dotado de novidade, uma vez que j
existe na natureza. Por isso, os redatores de patente utilizam ferra-
mentas para fazer a proteo dessas sequncias, como, por exemplo,
reivindicar a proteo das sequncias de DNA atravs de uma cons-
truo gnica, que passvel de proteo no Brasil. O conhecimento
da matria descrita nas reivindicaes muito importante para que
possamos evitar infraes de direitos. Muller (2003) discrimina em
seu trabalho dois tipos de infraes das reivindicaes que podem
ocorrer por terceiros:
Infrao literal: em que cada elemento do produto infrator coin-
cide com a definio contida na reivindicao.
Infrao por equivalncia: em que o elemento do produto infra-
tor no se enquadra diretamente na definio do elemento da
reivindicao, no entanto ele constitui um equivalente tcnico
funcional desse ltimo.
Todos esses fatores mostram a importncia de se analisar um docu-
mento de patente, tendo especial ateno s reivindicaes para saber
como a tecnologia est protegida e tambm o alcance dessa proteo
no caso das invenes biotecnolgicas. O bom monitoramento das
tecnologias com vistas no que est protegido por meio das reivindi-
caes evitar possveis infraes das patentes e permitir aos pes-
721
quisadores ter conhecimento do que est livre para ser utilizado (fre-
edom to operate).
Importncia da informao tecnolgica
nos documentos de patente
A revelao da inveno o corao do sistema de patente. Os direi-
tos desse tipo de proteo so concedidos ao inventor para estimular
a pesquisa, desenvolvimento e inovao na indstria. A proteo de
patente possui um tempo limitado de durao, normalmente 20 anos,
e em troca a esse tempo de garantia de proteo (direito de exclusivi-
dade sobre a explorao da tecnologia protegida), o inventor deve reve-
lar detalhes de como trabalhar a inveno para que a mesma possa ser
livremente utilizada pelo pblico no trmino de vigncia da proteo
da patente. A lei tambm possibilita que outros pesquisadores pos-
sam utilizar a tecnologia protegida em suas pesquisas e que a inven-
o esteja liberada para fins educacionais, at mesmo na vigncia
da patente. Toda inveno revelada no relatrio descritivo do docu-
mento de patente e as informaes se tornam acessveis ao pblico
a partir de 18 meses da data de depsito do pedido (Lei 9.279, 1996).
Da mesma forma como a pesquisa bibliogrfica, o levantamento
do estado da tcnica em documentos de patente deve ser realizado no
incio do projeto. Essa providncia evita desperdcios com a realiza-
o de etapas de processo que j so conhecidas, ou com a obteno
de materiais que j existem, muitas vezes comercialmente.
A no-realizao do levantamento do estado da tcnica no incio de
um projeto de pesquisa poder, at mesmo, implicar a impossibili-
dade de uso de seus resultados, se houver coincidncia entre eles, total
ou parcialmente, e reivindicaes constantes em patentes de terceiros.
Atualmente, com o avano da cincia, principalmente na rea de
biotecnologia aplicada agricultura, esse problema tem ganho de
projeo, uma vez que muitos dos campos pesquisados j possuem
um representativo nmero de patentes cujas reivindicaes so to
amplas que englobam resultados de pesquisas sequer realizadas, o
que torna a busca tecnolgica imprescindvel para o pesquisador.
722
Alm disso, quando o levantamento feito precocemente, h pos-
sibilidade de redirecionar a pesquisa para a obteno de um produto
ou de um processo passvel de proteo.
A busca de informaes tecnolgicas tambm permite a identifica-
o de nichos no explorados, o que pode orientar linhas de pesquisa.
Oferece ainda uma noo do interesse mercadolgico ou do potencial
de mercado da tecnologia.
A organizao das informaes contidas nos documentos de patente
feita segundo uma normatizao estabelecida por um tratado inter-
nacional (Strabourg Agreement, 1971): a classificao internacional
de patentes (CIP). Essa classificao tem como objetivo a uniformi-
zao do arquivamento de dados tecnolgicos, distribuindo-os em
oito sees do conhecimento, as quais esto divididas em subsees,
classes, subclasses, grupos e subgrupos. As oito sees da CIP so:
Necessidades humanas (A).
Operaes de processamento; transporte (B).
Qumica; metalurgia (C).
Txteis; papel (D).
Construes fixas (E).
Engenharia mecnica; iluminao; aquecimento; armas;
exploso (F).
Fsica (G).
Eletricidade (H).
A rea biotecnolgica abrangida pelas sees A e C. Mais espe-
cificamente, a subclasse C12N a que possui maior relao com a bio-
tecnologia moderna Micro-organismos ou enzimas; composies
das mesmas; propagao, preservao ou manuteno dos micro-orga-
nismos; mutao ou engenharia gentica; meio de cultura. A busca
dos documentos de patente por meio da utilizao da classificao
internacional uma ferramenta extremamente til e eficiente para
recuperar os principais documentos protegidos na rea de interesse.
Alm da Classificao Internacional de Patentes (CIP), existem
classificaes locais utilizadas por algumas bases de patente, como
o caso da base do escritrio europeu (http://ep.espacenet.com), do
escritrio americano (www.uspto.gov) e da Derwent (http://apps.isi-
knowledge.com). A Derwent Innovations Index possibilita o acesso
723
a mais de 14,800,000 documentos de patente com links para paten-
tes citadas e documentos citando determinada patente, artigos cita-
dos e o texto completo do documento de patente. A classificao da
Derwent que est mais relacionada com a rea agrobiotecnolgica
a C06, que diz respeito biotecnologia, incluindo gentica de plantas
e vacinas veterinrias.
Todas as informaes contidas no documento de patente possuem
um elevado valor tecnolgico. Segundo informaes do Instituto
Nacional da Propriedade Industrial (MAYERHOFF, 2005)
7
, cerca de
80% de toda informao sobre tecnologias encontra-se nos bancos
de dados sobre patentes. Isso significa que, ao se realizar uma busca
bibliogrfica, sem prvia consulta aos bancos de dados de patente, o
pblico ter acesso a apenas 20% da informao existente no mundo, o
que poder impactar negativamente os resultados de muitas pesquisas.
Dados da OECD (2006) mostram que patentes em biotecnologia
tm crescido mais rapidamente do que todos os depsitos de patente
ocorridos no escritrio europeu de patentes (EPO). Entre 1991 e 2002,
o nmero de patentes biotecnolgicas cresceu 8,3% ao ano, enquanto
o depsito de patentes na EPO cresceu cerca de 5%. A taxa de cres-
cimento mundial de patentes na rea de biotecnologia comeou a
aumentar a partir de 1994. Depois de um crescimento constante na
dcada de 1990, o nmero de pedidos de patentes de biotecnologia
depositados sob o acordo internacional de patentes (PCT)
8
diminuiu
de mais de 11 500 pedidos em 2000 para 8 700 em 2006 (-4,6% ao ano
OECD, 2009). Por outro lado, o nmero total de pedidos de patente
PCT aumentou uma mdia de 5,7% ao ano de 2000 a 2006. O surto de
patentes de biotecnologia no final dos anos 1990 foi, em parte devido
aos pedidos de patentes relativos ao genoma humano, enquanto a
recente diminuio explicada por muitas vezes mais rigorosas
7
MAYERHOFF, Z. D. v. L. Informao tecnolgica. Braslia, DF, 2005. Apresentao em
PowerPoint do Curso de Capacitao em Propriedade Intelectual para Gestores de Tecnologia.
8
PCT um Tratado de Cooperao em Matria de Patentes (Patent Cooperation Treaty) que foi
estabelecido em 19 de junho de 1970, em Washington, como a finalida de desenvolver o sistema
de patentes e de transferncia de tecnologia. O PCT tem como objetivo simplificar, tornando
mais eficaz e econmico, tanto para o usurio como para os rgos governamentais encarre-
gados na administrao do sistema de patentes, o procedimento, no caso de uma solicitao
para proteo patentria em vrios pases. At junho de 2011 existiam 144 estados contratantes.
724
critrios para a concesso de patentes de material gentico.
Conseqentemente, o peso relativo da biotecnologia em todos os
registros de patentes internacionais diminuiu entre meados dos anos
1990 e incio dos anos 2000 em muitos pases. Em mdia, patentes de
biotecnologia representaram 6,5% do portflio de patentes dos pa-
ses de 2004-06, em comparao com 10,3% em meados da dcada
de 1990. O escritrio de patentes dos Estados Unidos (USPTO) mos-
tra um aumento significativo no nmero de solicitaes de proteo,
neste escritrio, na rea biotecnolgica agropecuria.
A Organisation for Economic Co-operation and Development/
OECD (2009) tambm mostra que a Dinamarca continua a ser um
pas ativo na rea de patenteamento de biotecnologia sendo respon-
svel por 15,7% de todos os pedidos de patente na rea depositados
pela Dinamarca no PCT. Estudos da OECD (2009) tambm mostram
que os Estados Unidos contriburam para 42% de todos os pedidos
de patente PCT na rea de biotecnologia entre 2004-2006. O Japo
e a Alemanha seguiram no ranking contribuindo com, respectiva-
mente 13% e 7% dos pedidos de patente na rea de biotecnologia. Sete
regies dos EUA esto entre as dez regies lderes em patenteamento
em biotecnologia entre 2004 e 2006, juntamente com Tquio para o
Japo, regio Nordrhein na Alemanha e da regio de Copenhague, na
Dinamarca. Atravs de uma busca no exaustiva realizada no Instituto
Nacional da Propriedade Industrial em agosto de 2010, foi constatado
que o nmero de pedidos de patente depositados no Brasil na rea
biotecnolgica foi de:
529 pedidos na rea de mutao ou engenharia gentica; DNA
ou RNA, vetores.
208 pedidos da rea de tecnologia do DNA recombinante.
951 pedidos na rea de vetores ou sistemas de expresso espe-
cialmente adaptados para clulas vegetais.
150 pedidos para processos para modificao de gentipos de
plantas.
98 pedidos para reproduo de plantas por meio das tcnicas de
cultura de tecidos;
283 pedidos para genes que codificam protenas vegetais.
413 pedidos para genes que codificam protenas animais.
725
Figueiredo et al. (2006) demonstraram que a maior parte das prote-
es biotecnolgicas no Brasil est na rea de preparaes medicinais,
e a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria (Embrapa) lidera o
nmero de depsitos brasileiros na rea de composies biocidas,
repelentes ou atraentes de pestes e reguladores de crescimento de
plantas. Entre todos os pedidos de patente da Embrapa, a rea de con-
trole biolgico foi a mais focada nos tipos de protees da empresa. O
trabalho tambm revelou que a maior parte dos pedidos da Embrapa
est centralizada principalmente na rea biotecnolgica agropecuria.
Como obter informaes em documentos de patente
O levantamento do estado da tcnica uma etapa fundamental que
antecede a redao do pedido de patente. Esse levantamento consiste
em identificar todas as informaes a respeito da rea de interesse
que j estejam disponveis ao pblico, em documentos de patente ou
no, e compar-las com as concretizaes da tecnologia que se deseja
proteger. Para que essa comparao de informaes possa ser reali-
zada eficientemente, imprescindvel que o pesquisador delimite,
com estrita preciso, cada etapa do trabalho que propiciou a obten-
o dos seus resultados. Figueiredo et al. (2008) relatam os procedi-
mentos para obter informaes em documentos de patentes, apre-
sentados a seguir.
O primeiro passo a ser dado pelo pesquisador montar um dia-
grama para se assegurar da preciso da procura. Abaixo, um bom
modelo de esquema:
Caractersticas do
Projeto ou Soluo
proposta
Problema tcnico
detectado com alto
potencial para possvel
soluo
Resultado que se
espera alcanar
O diagrama proposto acima, por mais bvio que possa parecer,
ajuda a identificar o conceito inventivo ou cerne da inveno.
comum surgirem produtos secundrios do projeto inicial, ou seja,
resultados esperados que foram substitudos por outras concretiza-
es da ideia original e que se mostraram mais importantes. Portanto,
726
o diagrama, ao identificar todas as caractersticas de possveis solu-
es, deixa perceber possibilidades at ento no imaginadas, durante
a busca de informaes em documentos de patente.
Existem algumas bases de dados que so gratuitas e trazem infor-
maes muito amplas. Algumas permitem acesso ao texto completo
da patente, incluindo as figuras. H tambm bases de dados privadas
que so bem qualificadas, mas, em geral, muito caras. As principais
bases gratuitas utilizadas para busca de documentos de patente so:
Escritrio brasileiro de propriedade intelectual (INPI): www.
inpi.gov.br (http://pesquisa.inpi.gov.br/MarcaPatente/jsp/ser-
vimg/servimg.jsp?BasePesquisa=Patentes) recuperao de
documentos de patente brasileiros com acesso ao documento
na ntegra atravs do escritrio europeu de patentes.
Escritrio norte-americano de patentes e marcas (USPTO):
www.uspto.gov (http://www.uspto.gov/patents/process/search/
index.jsp) recuperao de documentos de patentes america-
nos com acesso ao documento na ntegra.
Escritrio europeu de patentes (Espacenet): http://ep.espacenet.
com/ recuperao de documentos de patente do mundo todo
com possibilidade de acessar o documento na ntegra.
Para muitos Institutos de Pesquisa, atravs do portal da CAPES,
h a possibilidade de acessar a base da Derwent (apps.isiknowledge.
com), que uma tima base privada e possibilita o acesso aos docu-
mentos de patente do mundo todo.
A busca em documentos de patente pode ser realizada por: (i) cru-
zamento de palavras-chave; (ii) classificao internacional de paten-
tes; e (iii) por combinao de (i) com (ii).
O primeiro tipo, cruzamento de palavras-chave, familiar aos pes-
quisadores que o utilizam para fazer o levantamento bibliogrfico,
especialmente quando recorrem a ferramentas de pesquisa (search
engines) da web (World Wide Web), tais como o Google, o Yahoo e
outros. O sucesso desse tipo de busca depende diretamente da qua-
lidade da estratgia montada para encontrar a informao desejada.
Palavras de significado geral, como process, analysis, gene, apparatus
e semelhantes dificultam muito o direcionamento da busca.
727
Alm das possibilidades oferecidas pelo Google ou pelo Yahoo,
h outras ferramentas de pesquisa (search engines) especficas de
busca em documentos de patente, utilizando-se o cruzamento de pala-
vras-chave.
A classificao internacional de patentes abrange todas as reas
do conhecimento e pode ser acessada a partir da pgina do Instituto
Nacional da Propriedade Industrial (http://pesquisa.inpi.gov.br/ipc/
index.php).
Se simularmos uma busca na base da Derwent (apps.isiknowledge.
com) pela classificao internacional C12N 15/29 (Genes que codi-
ficam protenas vegetais) e a palavra-chave DREB, podemos recu-
perar 21 documentos de patente (Figuras 2 e 3) e ainda fazer outros
estudos adicionais, como, por exemplo, saber quem so os detentores
dessas tecnologias (Figura 4) e os pases onde as tecnologias de inte-
resse foram depositadas.
Figura 2. Estratgia de busca na base da Derwent utilizando palavra-chave e
classificao internacional de patentes.
728
Figura 3. Resultados obtidos com a estratgia de busca na base da Derwent
utilizando palavra-chave e classificao internacional de patentes.
UNIV QINGHUA
UNIV TIANJIN NORMAL
BEIJING BEIFANG JIESHI BIOLOGICAL
BEIJING WANFUCHUN FOREST RESOURCE DEV
CO
BEIJING WEIMING KAITUOAGRIC BIO TECH CO
BEIJING YANGHUA BIOTECH CO LTD
BIO-ORIENTED TECHNOLOGY RES
ADVANCEMENT
BIOTECHNOLOGY RES INST CAAS
CHINESE ACAD SCI BOTANY INST
DOKURITSU GYOSEI HOJIN KOKUSAI
NORINSUIS
Figura 4. Principais titulares dos documentos de patente relacionados com o
gene DREB e a rea de genes que codificam protenas vegetais (C12N 15/29).
Esses estudos de monitoramento tecnolgico so muito importan-
tes para formao de parcerias, conhecimento do portflio tecnol-
gico na rea de interesse, planejamento de pesquisa, entre outros.
729
Consideraes finais
O crescente volume de conhecimento gerado por intermdio da bio-
tecnologia unido ao avano do sistema de patentes nos pases deten-
tores desse conhecimento torna imprescindvel um monitoramento
das tecnologias de interesse para que o Brasil no fique eternamente
dependente do monoplio das empresas multinacionais e aumente
seu potencial tecnolgico. Estudos mostram a tendncia no aumento
do nmero de depsitos de pedido de patente no setor agrobiotecno-
lgico, o que intensifica a importncia de um melhor conhecimento
do sistema de proteo por patentes e sua utilizao como fonte de
informao tecnolgica.
Para que se obtenha xito no processo de internalizao do conhe-
cimento de propriedade intelectual no meio acadmico, detentor do
conhecimento, importante que os pesquisadores incorporem em sua
metodologia de pesquisa a busca em bancos de patente. Dessa forma,
poderemos reduzir gastos com pesquisas em duplicata, evitar a infra-
o de tecnologias de terceiros e aumentar a formao de parceiras e
o portflio de tecnologias a serem utilizadas na pesquisa.
Referncias
AUSTRALIA. Australia Patent Office: Pattents Act 1990. Disponvel em: <http://
www.austlii.edu.au/au/legis/cth/consol_act/pa1990109/>. Acesso em: agosto de
2010.
BRASIL. Medida provisria n. 2.186-16, de 23 de agosto de 2001. Conveno sobre
Diversidade Biolgica, dispe sobre o acesso ao patrimnio gentico, a proteo
e o acesso ao conhecimento tradicional associado, a repartio de benefcios e o
acesso tecnologia e transferncia de tecnologia para sua conservao e utilizao,
e d outras providncias. Disponvel em: <http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/
mpv/2186-16.htm>. Acesso em: 15 jul. 2010.
BRASIL. Lei N 9.279, de 14 de maio de 1996. Lei da propriedade industrial. Regula
direitos e obrigaes relativos propriedade industrial. Disponvel em: < http://
www.planalto.gov.br/ccivil_03/Leis/L9279.htm> Acesso: 16 jul. 2010.
CHAN, H. p. International Patent Behavior of Nine Major Agricultural
Biotechnology. AgBioForum, v. 9, n. 1, p. 59-68, 2006.
European Patent Convention (EPC 1973). Disponvel em: <http://www.epo.org/
patents/law/legal-texts/html/epc/1973/e/contents.html>. Acesso em: ago. de 2010.
730
FIGUEIREDO, L. H. M.; PENTEADO, M. I. de O.; MEDEIROS, p. T. Patentes em
Biotecnologia: patenteamento em biotecnologia agropecuria: cenrio brasileiro.
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento, v. 9, n. 36, p. 32-39, 2006.
FIGUEIREDO, L. H. M.; MACEDO, M. F. G.; PENTEADO, M. I. de O. Noes de
propriedade intelectual - patenteamento na Embrapa: conceitos e procedimentos.
Braslia, DF: Assessoria de Inovao Tecnolgica, 2008. 130 p. (Embrapa
Assessoria de Inovao Tecnolgica. Documentos, 1).
MACEDO, M. F. G.; MULLER, A. C. A.; MOREIRA, A. C. Patenteamento em
biotecnologia: um guia prtico para os elaboradores de pedidos de patente. Braslia,
DF: Embrapa Comunicao para Transferncia de Tecnologia, 2001. 200 p.
MULLER, A. C. A. 2003. 229 f. Patenteamento em biotecnologia: abrangncia
e interpretao de reivindicaes. Tese (Doutorado) - Escola de Qumica da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2003.
Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). OECD
Biotechnology Statistic. [S. l.], 2009. 103 p.
Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). OECD
Biotechnology Statistic. [S. l.], 2006. 157 p.
USA. Consolidates Patent Laws. United States Code Title 35- Patents. Jan., 2007.
Disponvel em: <http://www.uspto.gov/web/offices/pac/mpep/consolidated_laws.
pdf>. Acesso em: ago. 2010.
Impresso e acabamento
Embrapa Informao Tecnolgica
O papel utilizado nesta publicao foi
produzido conforme a certifcao
do Bureau Veritas Quality International
(BVQI) de Manejo Florestal.
Print and fnishing
Embrapa Technological Information
The paper used in this publication was
produced according to the
Bureau Veritas Quality Internationals
(BVQI) Forest Management Certifcation.

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