24 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 27- julho/agosto 2002

Produo de etanol por

Escherichia coli KO11
Pesquisa
Produo de etanol a partir de resduos agrcolas por Escherichia coli geneticamente modificada
Figura 1: Fermentao de hidrolisado de sabugo de milho por E. coli KO11
I. INTRODUO
PROLCOOL foi implanta-
do no Brasil, em meados da
dcada de 70, em decorrn-
cia da chamada crise de energia,
quando os preos do petrleo sofre-
ramchoques mundiais, refletindoime-
diatamente na balana econmica do
pas. Atualmente, o futuro do progra-
ma no Brasil incerto, pois a fonte
primria de energia no mundo conti-
nua sendo o petrleo, o qual recebe
grandes investimentos, quegerameco-
nomia deescala queotorna altamente
competitivo. Oetanol, almdepossuir
propriedades desejveis como com-
bustvel, tambmtraz benefcios com
respeito qualidadedoar urbanoedo
clima global. Dessa forma, existe um
grande interesse no seu uso, tanto na
formapuracomomisturadogasolina
(LYND et al, 1991). A gerao de
empregos, a fixao do homem no
campoe a utilizaodosolosopar-
metros difceis demedir, mas suficien-
temente importantes para no serem
desprezados ouminimizados.
Embora o etanol seja atualmente
produzido a partir da cana-de-acar
noBrasil, eapartir domilhoedeoutros
amilceos nos Estados Unidos, outras
fontes tambm podem servir como
matria-primabarataerenovvel. Tec-
nologias paraaconversodemateriais
lignocelulsicos em etanol j esto
disponveis, embora a umcustoainda
nocompetitivocomopreoda gaso-
lina nomercadomundial. Basicamen-
te, oprocessode conversodas fibras
hemicelulsicas e celulsicas de bio-
massa vegetal em etanol consiste em
tratar omaterial comcidodiludo, de
forma que a maior parte da hemicelu-
Katia Gianni de Carvalho Lima,
Doutoranda em Cincias dos Alimentos
Faculdade de Cincias Farmacuticas
Laboratrio de Microbiologia de Alimentos
Universidade de So Paulo
gianni@usp.br
Caroline Maki Takahashi
Mestre em Biotecnologia,
Departamento de Microbiologia
Instituto de Cincias Biomdicas
Universidade de So Paulo
Flavio Alterthum, Dr.
Departamento de Microbiologia
Instituto de Cincias Biomdicas
Universidade de So Paulo
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 26- julho/agosto 2002 25
lose e uma pequena poroda celulo-
sesejamconvertidasemacares. Aps
esse passo, as fibras celulsicas so
hidrolisadas por enzimas eohidrolisa-
dopodeser entofermentadoaetanol
(VON SIVERS et al., 1994).
Asoluodeacares resultanteda
hidrlise da hemicelulose consiste em
uma mistura de pentoses e hexoses. A
utilizao eficiente de pentoses, prin-
cipalmente xilose, umpasso impor-
tante para o desenvolvimento de pro-
cessos economicamente viveis de
produodeetanol apartir debiomas-
sa vegetal.
Saccharomyces cerevisiae, o mi-
crorganismomais freqentementeuti-
lizado na produo de etanol, no
capaz de fermentar pentoses. Dessa
forma, duranteos ltimos anos, tem-se
procuradomicrorganismos que sejam
capazes de fermentar eficientemente
uma ampla variedade de acares.
Escherichiacoli ummicrorganis-
mo potencialmente interessante para
ser usadoemprocessos industriais por
ser amplamente estudado, tanto do
ponto de vista fisiolgico como gen-
tico. capaz de fermentar eficiente-
mente uma grande variedade de a-
cares constituintes da biomassa ligno-
celulsica, mas produzumamisturade
produtos de fermentaode pequeno
valor agregado.
Foramconstrudos recombinantes
de E. coli que carregam os genes pdc
e adh de Zimomonas mobilis, permi-
tindo que o metabolismo do piruvato
durante a fermentaofosse desviado
da sntese de uma mistura de cidos
orgnicos para a produo de etanol
comeficinciadeconversosuperior a
95% do rendimento terico mximo
(INGRAM et al, 1991).
Vrios trabalhos mostraramacapa-
cidade de E. coli recombinante de
fermentar uma ampla variedade de
acares paraetanol comrendimentos
prximos aos tericos. Lactose, glico-
se, frutose, galactose, manose, xilosee
arabinose foramutilizados pelas dife-
rentes linhagens testadas quanto to-
lernciaambiental, estabilidadedoplas-
mdio, expresso das enzimas de Z.
mobilis e produode etanol (ALTER-
THUM & INGRAM, 1989). As melho-
res linhagens foramATCC9637, 15224
e 11303 contendo o plasmdio pLOI
297, sendoque a ltima alcanouuma
produo de etanol de 5,2 % (v/v) a
partir de 8% de xilose.
Aestabilidade das linhagens gene-
ticamente modificadas foi melhorada
pelainserodos genes quecodificam
pdc e adh de Z. mobilis no cromosso-
mode E. coli, eliminandoa necessida-
de de plasmdios e aumentando a
estabilidade do microrganismo para
aplicaes comerciais (OHTA et al,
1991). Os genes da etanolognese
originados deZ. mobilis foramintegra-
dos nocromossomodeE. coli pertodo
locus da piruvato formato liase, (pfl)
originandoE. coli KO11. Aintegrao
resultou em maior estabilidade dos
genes deZ. mobilis na bactria recom-
binante e E. coli KO11 mostrou-se
capaz de produzir etanol na ausncia
de genes presentes em vetores plas-
midiais (OHTA et al, 1991).
Aclonagembemsucedida dos ge-
nes de Z. mobilis emE. coli represen-
ta um modelo simples de como as
atuais ferramentas da gentica e da
biologia molecular podemser utiliza-
das para criao ou transferncia de
vias metablicas deummicrorganismo
paraoutronotaxonomicamenterela-
cionados.
Processos industriais de produo
de etanol a partir de cana-de-acar,
milho e beterraba j so amplamente
estabelecidos. Vrios microrganismos
tm-se mostrado capazes de fermen-
tar acares presentes emhidrolisados
lignocelulsicos, convertendo-os em
etanol. Num recente estudo compa-
rando o desempenho de diferentes
microrganismos emumhidrolisadode
sabugo de milho rico em pentoses, a
bactria recombinanteE. coli KO11foi
considerada a melhor fermentadora
(HAHN-HGERDAL et al., 1994).
LINDSAYet al., (1995) verificaram
a viabilidade de um processo de fer-
mentaoseqencial: noprimeiropas-
so, umamisturadehexoses epentoses
foi fermentadapor E. coli recombinan-
te; no segundo, glicose e levedura
foramadicionadas aomeio. Aconver-
so total da glicose em etanol, na
segunda etapa, indicouque a fermen-
tao prvia por E. coli recombinante
no impediu a atividade da levedura.
Tal processo pode combinar, em um
nico tanque de fermentao, os atri-
butos de E. coli recombinante, capa-
zes de fermentar eficientemente pen-
toses ou misturas de acares, com a
alta tolerncia ao etanol de leveduras
convencionais. Dessaforma, afermen-
tao de acares derivados de bio-
massa lignocelulsica por E. coli re-
combinantepoderia ser incorporada a
usinas jexistentes baseadas nautiliza-
odemilhooudecana-de-acar por
leveduras convencionais.
Estudos tm sido realizados para
avaliar a fisiologia e odesempenhode
E. coli KO11 emprocessos de fermen-
taoalcolica, comvistas utilizao
dessabactrianaconversoderesdu-
os que no podem ser aproveitados
nos processos tradicionais de produ-
o de etanol por S. cerevisiae, ofere-
cendo potencial para a expanso co-
mercial da produode lcool a partir
de fontes de matria-prima alternati-
vas.
Foi observado que E. coli KO11
pode eficientemente metabolizar mis-
turas complexas deacares derivadas
dahidrlisecidademateriais lignoce-
lulsicos, tais como bagao de cana-
de-acar, sabugo de milho, palha de
milho, Pinus spemadeira de carvalho
(BARBOSAet al., 1992; OLSSONet al.,
1995; ASGHARI et al., 1996).
BARBOSAet al., (1992) avaliaramo
desempenho de E.coli KO11 em hi-
drolisado hemicelulsico de Pinus sp
tratado com hidrxido de clcio ou
xido de clcio e sulfito de sdio,
suplementado com triptona e extrato
de levedura. Eficincia de converso
de 91%foi obtida, excedendoorendi-
mento e a produtividade obtidos em
fermentaes anlogas utilizando le-
veduras. A mesma bactria foi capaz
de fermentar os acares presentes
em hidrolisados hemicelulsicos de
palha e sabugode milho, comeficin-
cia de converso de 100% (BEALL &
INGRAM, 1992).
Emrecentes comparaes usando
leveduras e bactrias para fermentar
hidrolisados contendohexoses epen-
toses, mostrou-se que E. coli KO11 foi
superior a outros microrganismos em
produtividadeerendimentodeetanol,
almdeser resistentea produtos inibi-
dores produzidos durante a hidrlise
(HAHN-HGERDAL et al., 1994). Me-
lhorias, tantonapartetcnicacomono
desempenho do microrganismo, so
necessrias para reduzir os custos do
processo. Fermentao contnua, oti-
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mizao da etapa de destoxificao,
utilizao de fontes alternativas de
nutrientes e aproveitamento de sub-
produtos podemcontribuir para oba-
rateamentodoprocesso.
A utilizao de E. coli KO11 atual-
mente est restrita a umgrupopeque-
nodepesquisadores, pois asuapaten-
te est protegida. Porm, a partir de
2004, esse processo ser de domnio
pblicoe, portanto, poder ser utiliza-
do em qualquer lugar do mundo, em
particular aqui noBrasil, quericoem
resduos agrcolas (INGRAM et al.,
1991).
II. MATERIAIS E MTODOS
II.1. Microrganismo
O microrganismo utilizado foi Es-
cherichia coli KO11 contendo os ge-
nes que codificam para as enzimas
piruvato descarboxilase (pdc), lcool
desidrogenase B (adh) da bactria
Zymomonas mobilis epara resistncia
a cloranfenicol, integrados aoseucro-
mossomo. E. coli KO11 foi semeada
em placas contendo meio LB slido
contendo20,00 g/L de xilose e cloran-
fenicol, mantidas a 30C, repicadas
diariamente(TAKAHASHI et al, 2000).
II.2. Preparao do inculo e
experimentos de fermentao
E. coli KO11 foi cultivada emmeio
LB slido suplementado com 20,0 g/l
de xilose e incubada a 30
o
C por 24 h.
Colniasisoladasforamtransferidaspara
erlenmeyers contendo 50 mL de LB
lquido suplementado com 40 g/L de
xilose e cultivado a 30
o
C por 6 horas,
numagitador rotatrio. Culturas resul-
tantes foram diludas dez vezes em
bales volumtricos contendohidroli-
sado neutralizado e suplementado
(TAKAHASHI et al, 2000).
II.3. Hidrlise do sabugo
de milho
Osabugodemilhofoi inicialmente
modo para, ento, ser embebido em
cido sulfrico 1% (100,00 g de sabu-
go/600 mL H
2
SO
4
). Aps cerca de 24
horas, foi retirado o excesso de cido
(300 mL) e iniciada a hidrlise em
autoclave a 120
o
C por 40 minutos.
Atravs de presso mecnica, o sabu-
gofoi espremido, ohidrolisadoretira-
do, aquecidoa80C, adicionandoCaO
at pH 10,0 e suplementado com 1,0
g/L de sulfitode sdio. Aps oresfria-
mento a temperatura ambiente, o hi-
drolisadofoi centrifugadoeosobrena-
dante foi ajustado a pH7,0 comcido
sulfricoconcentrado. Para os experi-
mentos de fermentao, ohidrolisado
foi suplementado com 10 g/L de trip-
tona e 5,0 g/L de extrato de levedura
(TAKAHASHI et al, 2000).
II.4. Anlise dos parmetros
de fermentao
Oconsumode acares e a produ-
odeetanol foramdeterminadosusan-
doHPLC, comodescritoTAKAHASHI
et al., 2000. Forammedidos os seguin-
tes parmetros: Tempo (h); Concen-
trao de acar consumido (g/L);
Concentrao de etanol (g/L); Rendi-
mento (g de etanol produzido/ g de
acar consumido).
III. RESULTADOS E DISCUSSO
Segundo ZALDIVAR et al. (1999),
componentes alcolicos, aldedos e
cidos orgnicos produzidos durantea
hidrlise inibema produode etanol
por inibiremo crescimento microbia-
no. Porm, hidrolisados hemicelulsi-
cos de bagaode cana e de sabugode
milho podem ser fermentados por E.
coli KO11 depois de serem diludos e
neutralizados (ZALDIVARet al, 1999).
Alguns estudos sugerem que E. coli
KO11 mais tolerante a cido actico
que outros microrganismos (LULI &
STROHL, 1990).
Oprocessodecalagemcomhidr-
xido ou xido clcio conhecido por
aumentar a fermentabilidade dos hi-
drolisados ricos em carboidratos, po-
dendo estar relacionado com a varia-
odecidos orgnicos, inorgnicos e
comoutros produtos solveis (RANA-
TUNGA et al, 2000). O efeito mais
significativo desse tratamento um
grandeaumentonaquantidadedeons
de clcio, que est relacionado coma
melhora da fermentao. A adio de
carbonatodeclcionohidrolisadoau-
xiliananeutralizaodocidoproduzi-
do, alm de atuar como tampo e a
estabilizar o pH do meio durante a
fermentao. Esse tamponamentoau-
menta a utilizaode glicose e, subse-
qentemente, a produo de etanol,
sugerindo que o clcio pode ter um
efeito indireto para a produo de
etanol.
Inoculamos bales volumtricos
contendohidrolisadoneutralizadode
sabugo de milho com E. coli KO11.
Observamos que a fermentao foi
concluda em 69 horas; a xilose foi
totalmente consumida e obtivemos
36,00 g/L de etanol (Figura 01), que
corresponde a umrendimentode 0,50
(g de etanol/ g de acar).
E. coli KO11 fermenta arabinose e
glicose rpida e eficientemente, mas
tem mais dificuldade para fermentar
xilose, a qual foi consumida lentamen-
te emhidrolisados (DIENet al., 1999).
Alguns estudos tm mostrado que a
presena de glicose inibe a utilizao
de xilose (TAKAHASHI et al, 1994;
ASGHARI et al, 1996, TAKAHASHI et
al, 2000). Esses dados nos sugeremque
a xilose presente no inculo regula os
genes responsveis para a fermenta-
oalcolicadehidrolisados deresdu-
osagrcolas. Nossosresultadosdemons-
tram que E. coli KO11 capaz de
fermentar xiloseeficientementehidro-
lisados deresduos agrcolas, comosa-
bugode milho, comrendimentos pr-
ximos aos tericos (0,51 gde etanol/ g
de acar), no sendo afetada por ini-
bidores que possam estar presentes
noshidrolisados.
Paraqueumprocessodedestilao
sejaeconomicamentevivel, sodese-
jveis concentraes mais elevadas de
etanol do que essas obtidas emhidro-
lisados, que esto em torno de 5% (v/
v de etanol). TAKAHASHI et al. (1997)
estudaram um processo de produo
de etanol emduas etapas: na primeira,
E. coli KO11 fermentou hexoses e
pentoses presentes emhidrolisadohe-
micelulsico de bagao de cana-de-
acar a etanol; emseguida, fermento
de padaria e sacarose foramadiciona-
dos aohidrolisadofermentado. Oeta-
nol acumuladonomeiofoi de100,0g/
L, somatriadaproduopelabactria
e levedura. A fermentao em duas
etapas pode tornar mais atrativa a pro-
duo de etanol a partir de biomassa
lignocelulsica por E. coli KO11, ape-
nas utilizando recursos (sacarose e le-
vedura) presentes na prpria usina .
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 26- julho/agosto 2002 27
Emnossos experimentos, aps 110
horas, acrescentamos 150,00 g/L de
sacarose e 100,00 g/L de levedura
adquirida empadaria emhidrolisados
j fermentados por E. coli KO11. Ob-
servamos, aps 8 horas, que houve
produomximadeetanol, alcanan-
do 107,00 g/L de etanol, o que torna o
processodedestilaoeconomicamen-
te favorvel (dados no apresenta-
dos).
E. coli KO11, embora emmenores
propores, produz, emcondies de
anaerobiose, cido actico, lctico e
succnico(OHTAet al., 1991). Aparen-
temente esses cidos no foram txi-
cos levedura, no interferindo na
produode etanol. Esse processode
aumentodeconcentraofinal deeta-
nol importanteeconomicamentepor
vrios aspectos: utilizaodehidrolisa-
do de resduo agrcola j fermentado
por E. coli KO11comomeiodecultura
em usinas; utilizao de sacarose e
levedura presente emquantidade nas
usinas; processo de destilao mais
econmico devido a uma maior con-
centrao final de etanol; eliminao
da viabilidade de E. coli KO11, visto
que a essas concentraes de etanol a
bactria nosobrevive.
IV. CONCLUSES
E. coli KO11 capaz de fermentar
eficientemente sabugo de milho e
outros resduos agrcolas comrendi-
mentos prximos aoterico.
As leveduras (fermento de padaria)
foram capazes de fermentar efici-
entemente a sacarose, apesar da
presenadeprodutos dometabolis-
mo de E. coli KO11.
Oacrscimodefermentodepadaria
e de sacarose aps a fermentao
por E. coli KO11, aumentou a con-
centrao de etanol chegando a
107,00 g/L, tornando vivel e mais
atrativa a fermentaodohidrolisa-
do de sabugo de milho por E. coli
KO11 apenas utilizando recursos
(sacarose e levedura) presentes em
usinas de lcool e acar.
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