M M todos electroqu todos electroqu micos para el micos para el an an lisis de alimentos. lisis de alimentos. Mtodos espectroscpicos: respuesta de la interaccin de radiacin electromagntica con el material en anlisis. Mtodos electromtricos: se basan en la cuantificacin de analitos a travs de su interaccin con corrientes elctricas. Medicin Mtodo Diferencia de potencial Potenciometra Resistencia (conductancia) Conductimetra Corriente vs. voltaje Polarografa Corriente vs. concentracin Amperometra Corriente vs. tiempo Coulombimetra Otros: Movilidad Electroforesis Mtodos electromtricos: Ejemplos del empleo de mtodos electroanalticos en el anlisis de alimentos Principio Ejemplos Potenciometra Electrodos in selectivos. Titulaciones potenciomtricas. Polarografa Electrodo para O 2 Amperometra Electrodos enzimticos. Coulombimetra Detectores para CG. Tit. automticos para K.Fischer. Conductimetra Detectores: para cromatografa (HPLC, IC, GC), electroforesis capilar. Determinacin de contenido de agua. Propiedades dielctricas det. de cont. de agua Caractersticas mecnicas de los materiales 2 Potenciometra. Electrodos in-selectivos. Determinacin de concentraciones a travs de mediciones de potencial Celda de medicin: electrodo in-selectivo (o indicador) + electrodo de referencia + dispositivo de medida. In solucin In membrana Las cargas transportadas durante este proceso generan la diferencia de potencial en la capa lmite, cuyo valor depende de la actividad del in en la solucin, a travs de la ecuacin de Nernst. El voltaje total de la celda de medida es: E = Eo + (RT/z i F) ln a i E es el voltaje de la celda de medida E o es el voltaje de de la celda de medida en condiciones estndar R es la constante de los gases T es la temperatura (en K) z i es la carga del in F es la constante de Faraday a i es la actividad del in en cuestin Pendiente de Nernst Tipos de electrodos La composicin de la membrana es decisiva para establecer a qu in o compuesto ser selectivo el electrodo. Se puede diferenciar entre membranas: Vidrio Membrana cristalina Membrana lquida Adems de comp. inicos se pueden determinar los gases disueltos en equilibrio con un in, y sustratos que forman iones durante transformaciones enzimticas. Membranas de estado slido. La ms empleada es la de vidrio. Los electrodos de vidrio son los electrodos in- selectivos ms ampliamente empleados para la medicin de iones H + . Para valores de pH muy altos (pH>10) o muy bajos ( pH<1) hay desviaciones, cuya magnitud depende de la composicin de la membrana. 3 pared externa pared interna (E) 1 (H + ) 1 (H + ) 2 = cte (E) 2 Electrodo de vidrio (pH) Electrodo selectivo de H 3 O + Fundamento: Los iones H 3 O + se fijan parcialmente sobre la pared externa e interna de la membrana de SiO 2 y la diferencia de concentraciones, genera un potencial elctrico (de membrana E M ). Electrodo combinado de pH. El electrodo de referencia externo se incorpora dentro del dispositivo. Electrodos de membrana cristalina se construyen con un precipitado muy poco soluble del elemento en cuestin (por ejemplo, AgCl, AgBr, AgI, Ag 2 S, que sirven para Ag o los aniones). El ms conocido es el de F - , realizado con LaF 3 que se emplea para determinar F - en productos de uso dental. Con estos electrodos se pueden determinar Cd +2 , Pb +2 , Cu +2 , CN - . Electrodo de Cl - Existen distintos diseos comerciales que responden a distintos tipos de aniones y cationes. 4 Electrodos de membrana lquida consisten en un solvente orgnico no miscible con agua en el que se disuelven intercambiadores de iones, o ionforos. El soporte de la solucin son discos porosos de plstico que absorben el lquido. Los intercambiadores de iones pueden ser tanto intercambiadores de cationes (como fosfatos sustituidos que responden a Ca ++ o Zn ++ ), o intercambiadores aninicos (como el in caprilmetilamonio). Electrodos de membrana lquida El intercambiador lquido forma complejos con el analito. A uno y otro lado de la interfase, tiene lugar el intercambio: [(RO) 2 POO] 2 Ca 2(RO) 2 POO- + Ca 2+ orgnico orgnico acuoso La diferente concentracin de Ca 2+ a ambos lados genera un incremento en el valor del potencial que se puede medir Ejemplos Ion intervalo respuesta interferencias Electrodos sensibles a los gases. Son electrodos in-selectivos que responden a compuestos no inicos debido a un equilibrio pre- existente entre un gas y la solucin en la que los iones son producidos. 5 Electrodo para CO 2 Emplea una membrana permeable al gas, para separar la solucin de la muestra de la solucin interna del electrodo. El CO 2 disuelto en la muestra difunde a travs de la membrana hasta que se alcanza el equilibrio entre la presin parcial de CO 2 en la muestra y en la solucin interna del electrodo. CO 2 + H 2 O H + + HCO 3 - [H + ] [HCO 3 - ] = constante CO 2 La concentracin de HCO 3 - se puede considerar constante, y H + = CO 2* constante E = E o + k. log H + Donde: E: potencial medido E o : potencial de referencia (una constante) H + : concentracin de iones H k: pendiente del electrodo. De esta manera, la concentracin de CO 2 es directamente proporcional a la concentracin de H + E = E o + k. log CO 2 Electrodo para amonaco El NH 3 en la solucin de anlisis difunde a travs de una membrana de tefln, por la cual los compuestos inicos no pasan, hasta el electrolito interno. Esto causa un cambio de pH, de acuerdo con: NH 3 + H 2 O NH 4 + + OH - Este cambio de pH se detecta por medio de un pHmetro. APLICACIONES DE ELECTRODOS SELECTIVOS Nitrato y nitrito en alimentos base de carnes. Determinacin de cloruros. Floruros en agua, bebidas etc. Calcio en leche Potasio en jugo de frutas. Nitrato, potasio calcio y cloruro en suelo y aguas Control analtico de cianuro,fluoruro sulfuro en efluentes, aguas naturales..etc 6 Estacin de Trabajo para Titulaciones Potenciomtricas Alimentos y bebidas Nmero de perxido: grasas y aceites comestibles Cloruros: leche, manteca, otros lcteos Acido ascrbico: jugos de frutas y alimentos en general Medio ambiente y Agua pH y alcalinidad Calcio y Magnesio Sulfato Demanda qumica de oxgeno (DQO) Industria qumica y farmacutica Determinaciones cido-base en medio acuoso / no acuoso . Karl Fisher Determinaciones redox Otra aplicacin de los electrodos de pH: Determinacin de la actividad enzimtica Como consecuencia de la actividad enzimtica se generan o se consume protones, lo que causa un cambio de pH. Se puede mantener el pH constante y luego medir la catidad de cido o base empleados. Sistema pH-stat Ej. para determinacin de lipasa, esterasa, proteasa, colinesterasa Polarografa Monitor polarogrfico de oxgeno Consiste en una medicin polarogrfica (corriente vs. Votaje). Ctodo: metal noble (oro o platino) nodo: usualmente de plata. 7 Solamente una pequea porcin del electrodo de Pt est expuesta, el resto del alambre est sellado con vidrio o resina epoxi. Una membrana cubre la punta del ctodo de alambre de Pt, y debajo de la membrana una pequea porcin de electrolito permite un contacto elctrico entre el nodo y el ctodo. La reaccin que ocurre en el ctodo es: O 2 + 4H + + 4e - --> 2 H 2 O Las caractersticas de la membrana determinan la velocidad de difusin de O del medio externo hacia el ctodo, lo que determina la sensibilidad, velocidad de respuesta y linealidad del electrodo de O. Otras sondas para O 2 cuentan con un electrodo plano circular de plata, concntrico con uno plano anular de Pb. A medida que el O 2 difunde a travs de la membrana y encuentra el voltaje aplicado, se reduce en el ctodo (el metal del ctodo acta como una superficie cataltica). ctodo: 2e - + 1/2 O 2 2OH - nodo: Pb + 2OH - PbO + H 2 O + 2e - 8 Ejemplo: Mtodo de Karl Fischer para la determinacin de agua . C 5 H 5 N . I 2 +C 5 H 5 N . SO 2 +C 5 H 5 N +H 2 O 2 C 5 H 5 N.HI +C 5 H 5 N. SO 3 Coulombimetra C 5 H 5 N . SO 3 +CH 3 OH C 5 H 5 N(H)SO 4 CH 3 En un electrodo (de trabajo) se genera iodo electroqumicamente mediante pulsos de corriente. Se obliga al sistema a producir la reaccin mediante una corriente constante. Se mide la duracin de un pulso con la indicacin voltamtrica de punto final, con un electrodo de platino como contraelectrodo. Permite determinar cantidades extremadamente pequeas de agua. Principio: por cada 1 F que circula se oxida o reduce 1 equivalente gramo de la sustancia. 1F = 96494C I = (V 2 V 1 )/R = (V 2 V 1 )/ (l/s) I = (V 2 -V 1 ) (.s/l) R es la resistencia es la resistividad s es la seccin de la muestra l es la longitud de la muestra es la conductividad Conductividad elctrica Anlisis de aguas La conductividad est ntimamente relacionada con la suma de la concentracin de los iones. Aproximadamente el valor de la conductividad en S/cm por un factor que oscila entre 0,55 y 0,7 es igual al contenido de slidos en mg/L. Agua de mar ~ 50000S/cm; aguas residuales 600 a 2000 S/cm; aguas de pozo 150 a 1000S/cm aguas de ro de 100 a 3000 S/cm. En vinos la determinacin de conductividad est relacionada con la genuinidad. Conductividad elctrica La medida de conductividad es funcin de la concentracin y movilidad de los iones. En sistemas de bajo contenido acuoso la limitante para la movilidad es el contenido de agua. En sistemas de alto contenido de agua no hay impedimentos para la movilidad inica y la conductividad es funcin de la concentracin de iones. La conductividad se mide mediante instrumentos comerciales de lectura directa de S/cm a 25C con un < 1%. 9 Conductividad (S) % de slidos (o T) En definitiva, la conductividad depende de la concentracin de iones y de su movilidad, por lo tanto, en un amplio rango de concentraciones o temperaturas, la dependencia ser: Partes del Sensor Elemento de reconocimiento Elemento Transductor Convierte el reconocimiento qumico en una seal electrnica medible Elemento Amplificador Sensores y biosensores Elementos de reconocimiento molecular Enzimtico (una enzima o una cascada de enzimas) Immunolgico (Antgeno-Anticuerpo) Genmico (hibridizacin de DNA) Clulas, tejidos, microorganismos Receptores artificiales Membranas lipdicas Elementos transductores (generacin de la seal) Elctrica ptica Acstica Magntica Calorimtrica 10 Elementos amplificadores de la seal Potenciomtrico Amperomtrico Coulombimtrico Transistor molecular Algunos ejemplos de biosensores enzimticos para el anlisis en el control de alimentos: L-lactato leche, fermentaciones lcticas. Emplea lactato oxidasa y deteccin amperomtrica. Grnulos de almidn daados y actividad diastsica. Aptitud panadera de harinas Emplea - amilasa, glucoamilasa y glucosaoxidasa y un electrodo para oxgeno. Glucosa y lactosa leche y productos lcteos, control de hidrlisis de lactosa. Emplea GOD, - galactosidasa y deteccin amperomtrica. Hipoxantina, inosina e IMP determinacin de frescura de pescado. Emplea nucleosidasa, nuclesido-fosforilasa y xantino oxidasa en un electrodo de C vtreo modificado y un electrodo para oxgeno. Glucosa, lactato y colesterol Emplea GOD, LO y CO y un electrodo para oxgeno. Etanol control de fermentaciones. Emplea ADH, NADH y electrodo de pasta de C. Histamina, putrescina y cadaverina. determinacin de frescura de pescado. Emplea diamino oxidasa y deteccin amperomtrica. Biosensores electroqumicos Ejemplo: deteccin de H 2 O 2 para la medicin de biomolculas. Algunos ejemplos de reacciones que liberan H 2 O 2 y permiten cuantificar biomolculas Medicin de glucosa 11 Medicin de Sacarosa Medicin de glutamina Medicin de etanol Y lo mismo para almidn, lactosa, galactosa, etc. Medicin del perxido de hidrgeno generado 1. Mediante un electrodo de Pt El H 2 O 2 se oxida en el nodo de platino, produciendo electrones. El flujo de electrones es proporcional a la concentracin de H 2 O 2 y, por lo tanto, a la concentracin de sustrato. Membranas de tres capas. 1. Policarbonato poroso, limita la difusin del sustrato en la segunda capa previniendo que la reaccin se vuelva limitada por difusin. 2. Enzima, por ejemplo glucosa-oxidasa. 3. Acetato de celulosa, permite que solo pequeas molculas, tales como perxido de hidrgeno alcancen el electrodo, eliminando muchos compuestos electroqumicamente activos que pueden interferir con la medicin. 12 2. Mediante Electrodos recubiertos con films de polmeros redox con HRP (peroxidasa de rbano) Un film de polmero redox que contiene HRP cubre superficie de un electrodo de carbono vtreo y conecta electroqumicamente la peroxidasa al electrodo. El polmero redox reduce el perxido de H generado electroqumicamente. (Bio)sensores optoelectrnicos Ejemplo: electrodo para determinacin de CO 2 . Consisten en un pequeos reservorios de buffer bicarbonato cubierto por una membrana silicona permeable a los gases. El buffer contiene HPTS (cido hidroxipiren- trisulfnico), un pigmento fluorescente sensible al pH. 13 El CO 2 difunde a travs de la membrana hacia el buffer, cambiando su pH. A medida que el pH cambia, cambia tambin la fluorescencia del pigmento. CO 2 + H 2 O <-> H 2 CO 3 <-> H + + HCO 3 - PTS - + H + <-> HPTS El equipo compara la fluorescencia del pigmento a dos longitudes de onda diferentes para determinar la concentracin de CO 2 de la muestra. Biosensores piezoelctricos La piezoelectricidad es un fenmeno que presentan determinados cristales que al ser sometidos a tensiones mecnicas adquieren polarizacin elctrica, apareciendo una diferencia de potencial y cargas elctricas en su superficie. Los materiales piezoelctricos son cristales naturales o sintticos que no poseen centro de simetra. El efecto de una compresin o de un cizallamiento hace disociar los centros de gravedad de las cargas positivas y de las cargas negativas. Aparecen cargas de signo opuesto en las superficies enfrentadas. Muestra Resonancia de plasmn de superficie SPR El plasmn es un fenmeno de densidad de carga electrnica ondulante que sucede en la superficie de una pelcula metlica cuando se refleja luz en condiciones especficas. 14 La resonancia es resultado de la transformacin de energa y momento de los fotones incidentes en plasmones de surperficie, y es sensible al ndice de refraccin del medio del lado opuesto al film que refleja la luz. Existen inmuno sensores pticos comercialmente disponibles basados en este fenmeno. Se mide el cambio en la posicin del detector a travs de la cada de intensidad reflejada cuando vara el ndice de refraccin por la presencia de analito I: blanco. II en presencia de analito. Algunos de los contaminantes que se han detectado con xito a travs de la SPR son: - pesticidas: 2,4-diclorofenol - alrgenos del man y avellana - toxinas de origen bacteriano (Enterotoxina B) y fngico: micotoxinas de Fusarium y Aspergillus (zearalenona, DON fuminisina B1 y aflatoxin B1) - microorganismos patgenos: E.coli 0157:H7, Salmonella enteritidis, Listeria monocytogenes, B.subtilis - virus: mosaico del tabaco Adems, en el campo de la calidad alimentaria se utiliza la Resonancia de Plasmones Superficiales para la deteccin, de cido flico, biotina y folatos en frmulas infantiles y leche. Otras aplicaciones para la SPR incluyen la deteccin de OMG, y los ms comunes de estos combinan ADN con transductores piezoelctricos (QCM) y pticos (SPR). 15 Sensor con superficie modificada con dextrano dextrano analito oro Las separaciones electroforticas se llevan a cabo en dos modalidades: Electroforesis convencional Electroforesis capilar Mtodos separativos basados en propiedades elctricas de los componentes: Electroforesis Convencional La electroforesis se define como el movimiento de partculas cargadas en un campo elctrico. La movilidad de las partculas es proporcional al voltaje aplicado y la carga neta de la molcula e inversamente proporcional a la friccin de la molcula; esta ltima depende de la forma y el tamao de la misma. 16 La mayora de las biomacromolculas (protenas, cidos nucleicos, polisacridos) poseen determinada carga elctrica con grupos aninicos y catinicos capaz de disociarse. La carga neta de la partcula est dada por el pH del medio y puede modificarse. La velocidad de migracin de un in (v) en el seno de un campo elctrico, es: v = E Donde E es la intensidad de campo elctrico (V/cm) y es la movilidad electrofortica La movilidad electrofortica es la velocidad de migracin de un in cuando se aplica un campo elctrico de 1 V/cm. Su signo es igual al de la carga de la partcula. (carga neta) Friccin (forma y tamao) = Entonces q E v = f C COOH H R NH 3 C H R NH 3 C H R NH 3 C H R NH 2 + + COO - + H + K 1 + COO - COO - + H + K 2 Equilibrio cido/base en aminocidos P.I. 17 Electroforesis Capilar: El empleo de un capilar permite aplicar un alto voltaje y mejorar la separacin de molculas pequeas o grandes. Ver Material Dra. Leiva