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Madre de Dios Capital de la Biodiversidad del Per

FACULDAD DE INGENIERIA
ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL DE
INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Determinacin de la concentracin de alfa beta
amilasas comerciales en la produccin de
etanol a partir de almidn de arroz utilizando
sacharomyces cerevisiea
GERARDINO TITTO IQUISE

PARA OPTAR EL TITULO PROFESIONAL DE
INGENIERO AGROINDUSTRIAL

PUERTO MALDONADO Per

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PERFIL DE ESTRUCTURA DEL PROYECTO DE TESIS
I. GENERALIDADES
TITULO: Determinacin de alfa y beta comerciales para la obtencin de
etanol a partir de almidn de arroz utilizando sacharomyces cerevisiae.

TESISTA: Gerardino Titto Iquise.
ASESOR: Biog. Martha Olivera. y ing. Mara Isabel Cajo Pinche
FECHA: de mircoles 21 de septiembre a mircoles 14 de diciembre del
2011.

II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

2.1.1 Fundamentacin del Problema
Actualmente se presenta un fuerte incremento en la demanda e
implementacin del proceso productivo de etanol a partir de deferentes
materias primas y diversas tecnologas, desarrollndose estudios que
mejoran el proceso de produccin de etanol, por tal motivo presente
estudio pretende encontrar una alternativa rentable en la produccin de
etanol a partir de almidn de arroz.

Dentro de proceso de produccin de alcohol de cereales no realiza el
malteo del arroz, importa la materia prima para la elaboracin de sus
deferentes productos, por lo tanto, el presente trabajo pretende emplear
arroz nacional no malteada como materia prima principal del proceso.
Debido a que esta contiene cantidades inferiores de enzimas amiloticas
en relacin a la arroz malteada, se busca establecer la concentracin
ms eficiente de enzimas, para la degradacin total o parcial del
almidn, contenido en los granos del arroz, con el fin de reducir costos
de produccin sin alterar la calidad final de los productos.

El empleo de enzimas tiene muchas ventajas: son de origen natural y
por lo tanto no son toxicas, son muy especificas en su manera de
actuar, por lo que no propician reacciones secundarias indeciables,
funcionan en condiciones moderadas de temperaturas y de PH e no
requieren de condiciones procesamientos drsticas que puedan alterar
la naturaliza del alimento, ni del equipo actan a bajas concentraciones y
son fcilmente inactivadas una vez alcanzado el grado de
transformacin deciado.




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2.2 Justificacin y Importancia
Importancia Medica : Se utiliza como desinfectante ya que elimina una
gran porcentaje de bacterias y virus en superficies y en la piel

Importancia Industrial: Es un reactivo y disolvente en la industria
qumica es utilizado para producir muchas otras sustancias, como
disolvente de sustancias menos polares que no pueden ser disolventes
por el agua; algunos de sus derivados son solventes de pegamentos

Importancia Energtica : Es un buen sustituyentes de la gasolina y
otros combustibles, ya que a diferencia de otros combustibles, el etanol
es ms limpio durante su combustin al no tener presencia de azufre
metales pesados entre otras sustancias toxicas y precursoras del efecto
invernadero, en Brasil es usado como sustituyente total de la gasolina o
usado en mezclas de gasolina y etanol, por lo tanto es mucha
importancia a nivel del medio ambiente

2.3 Objetivos

2.3.1 Objetivo General
Determinar la concentracin de y amilasas comerciales en la
obtencin etanol a partir de arroz sin maltear, como una alternativa de
produccin empleando saccharomyces cerevisiae.
2.3.2 Objetivos Especficos
Establecer las concentraciones de las enzimas comerciales, mediante
la determinacin de la concentracin de azucares fermentables y etanol
producidos utilizando como sustrato arroz sin maltear.

Medir parmetros fisicoqumicos (pH, temperatura) durante el proceso
degradativo y fermentativo del almidn de arroz que favorezca la
actividad de las enzimas y crecimiento de saccharomyces cerevisiae.

Observar el comportamiento de saccharomyces cerevisiae en las
diferentes concentraciones de enzimas probadas, teniendo en cuenta la
formacin de biomasa, consumo de sustrato y produccin de etanol en el
medio de fermentacin.

III. MARCO TEORICO
La fermentacin alcohlica a partir de cereales ha sido investigada por
varios aos, considerando al arroz, en trminos de produccin, el cereal
mas importante en el mundo, constituido por un 63-65 % de almidn las
empresas de alimentos y bebidas muestran un inters cada da por este
almidn, que es utilizado en la fermentacin de las azucares, utilizando
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levaduras que contienen enzimas catalizadoras que transforman los
azucares en alcohol y dixido de carbono, sin embargo, las levaduras no
tienen la capacidad de acceder a esta fuente de carbono directamente, por
lo que durante el malteado del arroz, el almidn de arroz. Se degrada
fundamentalmente a una mezcla de poliglucusa obteniendo el mosto de
fermentacin, actualmente en el mercado se encuentra una variedad de
enzimas comerciales producidas por microorganismo y que son usadas en
la industria de alimentos y bebidas. En la industria de bebidas las enzimas
de mayor importancia son las amilasas ya que se ven implicadas desde el
proceso de elaboracin de mosto. El uso de -amilasas, -amilasas y
glucoamilasas producidas por diferentes microorganismos ha beneficiado la
industrial por proveer una alternativa y un mtodo ms eficiente para la
produccin de dextrinas, maltosa y glucosa
3.1 Arroz
3.1.1 Taxonoma





3.1.2 Caractersticas Generales
El uso predominante del arroz para la elaboracin de malta se basa en una
de serie de factores tales como ser tradicionalmente el cereal de eleccin,
crece en una variedad de ambientes, con una germinacin rpida y
uniforme, el 60% del peso seco total del grano, contiene protenas,
generalmente en cantidades necesarias para proporcionar los aminocidos
necesarios para el crecimiento de la levadura, y posee una dotacin
enzimtica satisfactoria
En el proceso de elaboracin de cerveza o de whisky se emplea como
materia prima esencial. arroz que es caracteriza por tener carbohidratos
fermentables, protenas, minerales y una alta actividad enzimtica sin
embargo estas caractersticas tambin favorecen el desarrollo de
microorganismo capaces de producir diferentes meta bolitos y enzimas que
pueden modificar las propiedades finales del mosto y por consiguiente del
desarrollo de elaboracin de alcoholes de maz.

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TABLA 1. Composicin Granos de Arroz de 100
g
de Sustancia

arroz porcentaje
Protenas 1.6
Materia grasa 2.4
Hidratos de
carbono 65.5
Celulosa 1
Materias
minerales 2
agua 12

Aunque son varios los granos de cereal que pueden ser satisfactoriamente
malteados, los de arroz son generalmente presentan menos problemas
tcnicos. Sus cascaras ayudan a proteger el grano del malteado, adems
son tiles como coadyuvantes de filtracin en etapas posteriores
3.2 arroz malteada
Se entiende exclusivamente por arroz malteada al grano de arroz sometido
a germinacin parcial y posterior deshidratacin y/o tostado en condiciones
tecnolgicas adecuadas. El malteado es la germinacin controlada de la
semilla, seguida por su desecacin tambin controlada, durante este se
considera ala similla de arroz como una sistema complejo fisiolgico donde
los principales procesos son la sntesis de enzimas amilo lticas y
paleolticas y la degradacin de la estructura del espostermo . El objetivo
del malteado es Producer alta actividad enzimtica y el sabor
caracterstico, con una mnima prdida de peso seco. El grano
seleccionado para maltear debe estar sano, tener alto poder germinativo e
estar libre de pajas, granos y hongos
3.3 Almidn de Arroz
El almidn es un polmero semicristalino de glucosa de gran abundancia en
la naturaliza, por lo que se considera una buena fuente de obtencin de
este azcar para una fermentacin econmica y rentable la cantidad de
almidn contenido en grano de cereal Varia, pero generalmente oscila
entre el 60 y 75% del peso del grano. El almidn presente en los granos es
el ms importante de los carbohidratos para los fines industriales
resultando preciso degradarlo enzimticamente con una gelatinizacin
previa por accin de calor o sometiendo a un intenso trabajo mecnico. el
almidn de arroz gelatiniza a 58-90c pero durante la germinacin la
temperatura alcanzada es de solo 15c por lo tanto las enzimas que
degradan el almidn, las amilasas, operan en el malteado sin
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generalizacin previa . El almidn consta de dos fracciones: amilasa
(20%(p/p)) que es soluble en agua y amilo pectina (80%(p/p)) que es
insoluble en agua con un alto peso molecular
3.3.1 Amilosa
Es un polmero de glucosa que contiene de 1.000 a 4.000 unidades de este
monmero, tiene por lo tanto un peso molecular de 200.000-800.000
Dalton, valor que varia no solo segn la especie de planta, dentro de la
especie y depende de el estado de maduracin cada unidad de glucosa
esta unida por un enlace glocusidico -1.4 este enlace determina que el
grupo de reductor de la glucosa, situado en la posicin uno pierda la
correspondiente a una sola molcula de glucosa, porque solo tiene un
grupo reductor funcional, situado en un extremo
Generalmente, es un polmero lineal se cree que solamente para un parte
de la amilosa, siendo ligeramente ramificado el resto. Cuando se lixivia el
almidn para separar la amilosa calentando por encima de la temperatura
de gelificacion del almidn, la amilosa solubiliza es esencialmente lineal. La
naturaliza de gran longitud, confiere ala amilosa algunas propiedades
nicas, por ejemplo: su capacidad para formar complejos con el yodo,
alcoholes o cidos orgnicos. Estos complejos se llaman cloratos o
compuestos de inclusin helicoidal. A temperatura del ambiente, la cadena
de molcula de glucosa adopta una formacin en espiral cuyas helisis
permiten albergar en su interior una molcula de yodo, disuelto en un
disolucin de yoduro de potasio.
3.3.1.1 Amilopictina
Es un polisacridos cadenas principales son restos de glucosa unidos
enlace -1,4como en la amilasa y que espordicamente ramificaciones -
1,6localisadas cada 15-25 unidades lineales de glucosa su peso molecular
es muy alto ya que algunas fracciones llegan a alcanzar los 200 millones
de daltons. La amilopictina constituye alrededor del 75% de los almidones
ms comunes la consecuencia de los enlaces 1,6, es la formacin de una
molcula ramificada que al igual que la amilasa, tiene un solo ,grupo
funcional.
3.4 Mtodo Hidroliticas del Almidn
El principal inconveniente para la produccin de etanol a partir de almidn
radica en que la levadura no produce enzimas amilasas y no es capaz de
fermentar el almidn por consiguiente es necesario realizar una
ramificacin se puede realizar por dos mtodos: uno qumico y uno de
conversin enzimtica

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3.4.1 Mtodo Qumico
El almidn puede ser hidrolizado por cidos clorhdrico, (hidrolisisacida),
llegando a una conversin parcial del almidn a d- glucosas. Estos
mtodos es utilizado para preparar jarabe de glucosas a partir de
suspensiones que contiene 20% (p/p) de almidn a PH 2 y a una
temperatura de 140c (glazer y nikaido, 1988) tras tratamiento, si neutraliza
y se recupera el almidn no hidrolizado por filtracin.
Durante la reaccin, el acido penetra libremente por las partes amorfas del
almidn, y hidroliza los enlaces glucosidicos. El acido no puede penetrar
por los aires cristalinos, quizs de la doble hlice permaneciendo por ellos
intactas el efecto principal es reducir el molecular de las molculas del
almidn, dejando intacta de estructuras cristalina del grano.
Esta sacarificacin qumica presenta serios inconvenientes tales como: un
bajo rendimiento en la produccin de etanol, los residuos lquidos que
queda de la hidrolisis no son utilizados como alimentos para el ganado e
por ultimo requiere un mantenimiento costoso a causa de mayor deterioro
de las instalaciones por corrosin. Por lo anterior los mtodos enzimticos
se han convertido en buena alternativa.
3.4.2 Mtodos Enzimticos
Las hidrlisis enzimtica ha desplazado a la hidrlisis acida en los ltimos
30 aos, debido a que dispone de nueva enzimas. Hoy en da la mayor
parte de la hidrlisis de almidn se realiza usando enzimas, ya que estas
tcnicas presenta ventajas como: control de la formacin de productos no
deciables de mayor flexibilidad del producto.
Durante el malteado, el almidn del arroz se degrada fundamentalmente a
una mezcla de molculas de poliglucosa, algo menos complejas que los
originales. Para loe precisos respiratorios biosenteticos embrionarios, solo
se libera una cantidad limitada de azucares simples. El amilo pectina es
ms fcilmente degradado que la amilasa. En ziomas capaces de degradar
el almidn no gelatinizado del maz son los siguientes: fosforilasa, -
glocosidasa , -amilasa,-amilasa y enzimas descalificadoras . Durante la
deshidratacin de malta, las actividades de estas enzimas se reducen de
un modo drstico a excepcin de la - amilasas y - amilasas.
Hay tres tipos de descomposicin enzimticas de los glucanos: fosforolisis,
hidrlisis y transglicolisacion. La fosforolisis por la -1.4 glucan fosforilasa
solo ocurre intracelularmente. la transglicolisicion es la formacin ciclo
dextrinas con 6-8 unidades de glucosas a partir de almidn ,por accin de
bacillus macerans y otros
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TABLA. Accin Que Ejerce Sobre el Almidn De La Fosforilasa, -
Glucosidasa, -Amilasa, -Amilasa y Enzimas Descalificadoras.
ENZIMAS ACCIN
MICROORGANISMOS
PRODUCTORES
-GLUCOSIDASA
Necesita agua para la
hidrlisis, ataca enlaces
-1,4 o -1,6 con menos
frecuencia.
Exoenzima que acorta
las cadenas de almidn
en una unidad, partir del
extremo no reductor
libera glucosa.

Aspergillus niger, rhizopus
nibeus, aspergillus oryzae




-AMILASA
Necesita agua para la
hidrlisis, ataca enlaces
-1,4.
Acorta las cadena de
almidn en dos
unidades .partir del
extremo no reductor, las
que liberan como
maltosa



Bacillus megatirium,
bacillus cereus,
streptomyces sp.



-AMILASA
Necesita agua para la
hidrlisis, ataca enlaces
-1.4.
Endoenzima que rompe
las cadenas al azar
generando una mezcla
de maltosa y
oligosacaridos


Bacillus subtillis,Bacillus
amyloliquefaciens,Bacillus
polymixa,Bacillus
licheniformis





ENZIMAS
DESRAMIFICADO
RAS
(POLOLUNASA)
Necesita agua para la
hidrlisis, ataca enlace
-1,4. Des ramificacin
de la amilopeptina
produciendo una mezcla
de dextrinas y unos
pocos azucares.

Clostridium
thermodyrosulfurico,Leuco
nostoc, Enterobacter
aerogenes,Bacillus
polymixa


Normalmente la hidrlisis enzimtica de los grano de almidn presenta bajos
rendimientos de conversin a azucares fermentables, pasar que las
macromolculas del almidn pueden ser hidrolizado en estado granular, sin
embargo, los ensayo de hidrlisis de los grnulos naturales a menudo dan
como resultado un lento defiende producto de hidrlisis. Normalmente estos
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ensayos de hidrlisis analizan los azucares reductores liberados tras un
proceso hidroliticas empleando el mtodo de fehling. Este mtodo se basa en
propiedades reductoras de los azucares presentes en la muestra sobre una
solucin alcalina de cobre. Los azucares totales de los azucares reductores y
no reductores. Los azucares reductores son los monosacridos como la
glucosa, fructuosa, galactosa, etc. y disacridos como lactosa y maltosa los
cuales reaccionan con oxidantes suaves como los reactivos de fihlig, tollens y
benedect. El reactivo de fihlig tiene una coloracin azul y al reaccionar con los
azucares reductores, forma un precipitado de color rojizo oxido cuproso (cu2o)
y el acido carboxlico del respectivo aldehdo.
En general, la accin de y - amilasa en grnulos de almidn natural no es
muy eficaz, porque son muy resistentes a la digestin amilolitica y se necesita
un largo periodo de hidrlisis para poder degradar el almidn. Con los nuevos
avances tecnolgicos en los ltimos aos, sean descubiertas una nueva
generacin de enzimas como la -amilasa de aspirgillus kawachi u la
glucoamilasa de aspirgillus niger. Estas enzimas trabajan energticamente para
hidrolizar almidn granular que directamente puede hidrolizar el almidn en un
solo paso, a una moderada temperatura de generalizacin.
Estas enzimas tienen la ventaja de exo-actividad como la glucoamilasa, que es
capaz de perforar y profundamente orificios, as como la indo-actividad de la -
amilasa, que permite la ampliacin de los orificios. Esta combinacin mejora la
liberacin continua de glucosa fermentable a partir de los granos de almidones.
3.4.2.1 - Amilasas
Cataliza la hidrlisis al azar los enlaces -1,4 glucosidicos de la regin central
de la cadena de amilosa y amilo pectina, exceptuando las molculas cercanas
a la ramificacin, obteniendo como maltosa y oligosacaridos de varios
tamaos.
Esta enzima tiene un peso molecular de 50.000 Dalton, es estable a PH de 5.5-
8.0 con una actividad ptima de 5.9. Las -amilasas son enzimas dependientes
de calcio, aunque el catin no est integrado en el centro activo de la enzima,
se encuentra fuertemente unido a la enzima y solo se puede ser removidos a
PH bajos por el uso de agentes quelantes. La completa remocin de calcio
conlleva a una prdida total de actividad. Se cree que ca
++
estabiliza la
formacin global de la enzima, encontrndose hasta 10 iones por molcula de
enzimas. La importancia radica en que mantiene la molcula de la enzima en la
configuracin optima para generar una mxima actividad y estabilidad a
menudo se nombra la amilasa como enzima licuante debido a su rpida
accin para disminuir la viscosidad de las soluciones de almidn.
La actividad de la enzima se determina cualitativamente mediante la
disminucin de la capacidad de la solucin de almidn para el color azul
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caracterstico el yodo o midiendo la disminucin de la viscosidad de la
suspensin de almidn.
Los principales aplicaciones de las enzimas extracelulares que degradan el
almidn consisten en la conversin del almidn de jarabes que contienen
glucosa, maltosa, y oligosacaridos, en la produccin de azucares fermentables
en cervecera y en la obtencin de bebidas alcohlicas y en la modificacin de
la harina de panadera. Entre las enzimas comerciales utilizadas de destacan
las alfa amilasa de bacillus licheniformis, bacillus amyloliquefaciens y
aspergillus oryzae.
Se han obtenido termoestables a partir de bacillus subtilis y bacilus
licheniformis, permitiendo llevar a cabo la sacarificacin a alta temperatura,
acelerando el proceso y minimizando la contaminacin microbiana.
2.4.2.2 -Amilasas
La -amilasa o -1,4 glucan-maltohidrolasas es una exoenzimas que ataca los
enlaces 1,4 glucosidicos en la parte externa de la cadena de almidn, la
amilasa separa unidades de maltosa a partir de los extremos no reductores de
esta por hidrlisis alterna de enlaces glucosidicos. Las amilasas atacan la
amilosa solo de un extremo a la vez y, a causa de ello, son mucho menos
efectivas que las amilasas
Debido a que esta enzima esta imposibilitada para hidrolizar los puntos
ramificados -1,6 en la molcula de almidn, los productos finales de la accin
del sustrato son maltosa y dextrina, formndose pocas cantidades de manto
triosa y glucosa.
Las -amilasas contienen un grupo de sulfudrilo esencial para la actividad
enzimtica que se lleva acabo de forma ptima en un rango de PH entre 4 y 5.
La actividad de la enzima se analiza mediante mtodos colorimtricos quela
cantidad de azucares reductores, a partir del almidn. Estas enzimas estn
presentes en gran nmero de bacterias gran positiva formadores de esporas.
Algunos microorganismos productores son: bacillus polymyxa. B cereus
streptomyces sp. Y rhizipos japonicus aunque el rendimiento en las cepas
silvestre es generalmente bajo. Se han descubierto mutantes que producen
200 veces ms enzimas que la cepa silvestre.
3.4.2 Glucoamilasas
Las glucoamilasas o -1,4 glucan-glucohidrolasas son enzimas carbohidrolasas
no especificas, de accin externa, rompen enlaces glucosidicos -1,3. -1,6.
Generando glucosa a partir de de los enlaces termenales no reductoras de la
cadena de almidn. Por lo tanto son enzimas sacarificantes. Sin embargo, la
glucoamilasa es encapas de hidrolizar el almidn por completo a glucosa, ya la
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ruptura requiere la participacin de una enzima de accin interna. La
glucoamilasa puede ser separada en los fracciones glucoamilasas I y
glucoamilasa II. La glucoamilasa I posse alta actividad desrameficante la cual
se acelera en presencia de -amilasas. Por otro lado al glucoamilasa II posee
una baja actividad desramificante.
Las glucoamilasas frecuentes denominados amiloglucosidasas.son productos
por hongos como: aspirgillus niger. Adems siempre contiene cierta actividad
transglucosidasa. La cual cataliza la reaccin reversa. Que conduce a la
polimerizacin de la glucosa a maltosa.
3.4.2.4 Pupolanasa
La pupolanas es un enzima desramificante que acta sobre los enlaces -1,6
de la amilopictina liberando como nico producto la maltosa. Son utilizados
para mejorar la sacarificacin. Elevando el rendimiento de la liberacin de
glucosa.
3.5 Procesos De Produccin De Alcohol
3.5.1 Sustrato: Mosto
Es solucin de agua potable de carbohidratos, protenas, sales minerales y
dems compuestos resultantes de la degradacin de enzimtica la malta con o
sin adjuntos, arroz, sordo, trigo, realizada mediante procesos tecnolgicos
adecuados.












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Composicin Tpica Del Mosto


COMPONENTES

CANTIDA
D
(gl
-1

)
fructosa 2,1
glucosa 9,1
sacarosa 2,3
maltosa 52,4
malto
triosa
12,8
carbohidratos 23,9
nitrgeno total 0,8
Aminocidos totales
N
0,3
aminocidos totales 1,65
comp. Fenolicos
totales
0,25
Isoacidos

0,035
iones de calcio 0,065

3.5.2 Microorganismos: Saccharomyces Cerevisiae
En la industria se utiliza la levadura saccharomyces ceresiae, al ser
considerada como la mayor productor de etanol a nivel mundial. Este hecho se
evidencia en un sin nmero de atributos que para tal fin presenta esta
levadura, como por ejemplo su capacidad de respiracin tanto aerobia como
anaerbica. Y la utilizacin de su sustrato como glucosa, fructuosa, galactosa,
maltosa, entre otros. Saccharomyces cerevisiae es uno de los microorganismos
ms atractivos para trabajar, se ha comprobado a travs de la historia que no
es patgeno, ya que se ha utilizado en las industrias alimentarias y ha sido
clasificado como un organismo GARS. Asi mismo, poseen gran potencial para
la produccin de etanol fermentado de glucosa, soportando altas
concentraciones de la misma, logrando alto niveles de produccin rendimiento.
3.5.2.1 Morfologa
Es un hongo unicelular levaduriformes que presenta clulas alargadas,
globosas, elipsoidales con gemaciones blastoconidios multilaterales de 3-
10x4,5-1m que al microscopio se ven refringentes. Presenta ascos con hasta
cuatro ascosporas esfricas o elipsoides y de pared lista en su interior. Las
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colonias en agar sabourand son cremosas, blandas, de color crema o blanco,
con apariencia hmida y brillante y con bordes irregulares.
3.5.2.2 Reproduccin
Su reproduccin puede ser asexual, por germinacin. Cuando las condiciones
son adversas la mayor parte de las levaduras pueden reproducirse
sexualmente generando ascosporas. Durante la gemacin, la clula hija inicia
crecimiento formando una yema en la clula madre, posteriormente ocurre la
divisin nuclear, la sntesis de la pared y finalmente la separacin n de las dos
clulas

3.5.2.3 Requerimientos Nutricionales
3.5.2.3.1 Fuente de Carbono
Esta levadura tiene la habilidad para fermentar la glucosa, fructosa, maltosa,
maltoriosa presentes en los medios regulares, la sacarosa es hidrolizada
primeramente por la envertasa localizada en el espacio piriplasmatico
extracelular. Los azucares son transportadores a travs de la membrana celular
o transporte activo o pasivo, mediado por permeasas producidas
constitutivamente o indecibles. La maltosa y la amltotriosa son hidrolizadas
intracelularmente por la -glucosidasa. Las dextrinas, que comprenden la malto
triosa y productos de degradacin mayor, no son metabolizadas. Algunas
cantidades mnimas de azucares pentosicos tampoco son fermentados.
3.5.2.3.2 Fuente de Nitrgenos
Las levaduras no pueden asimilar el nitrgeno elemental ni los iones de nitrato.
Algunas cepas pueden utilizar los iones de amonio, pero la mayor parte de
nitrgeno requerido para la sntesis de constituyentes celulares esenciales,
procede de los requeridos para la sntesis de constituyentes celulares
esenciales, procede de los aminocidos y de los di-y tri-peptidos del mosto.
Estos han sido originados proporcionalmente por la propia malta como en el
caso de la utilizacin de carbohidratos por levaduras. Los aminocidos son
captados y utilizados consecuentemente, de acuerdo con la presencia de
enzimas adecuadas de transferencia en la membrana. Un mosto de malta total,
contiene 19 aminocidos .la propia clula produce aminocidos por transmisin
y/o sntesis a partir de un conjunto de diferentes cidos y cetacidos. En algunas
cepas de levadura, terminados aminocidos por siempre sintetizados dentro de
la clula, incluso aunque se encuentren presentes en la cantidad abundante en
el mosto, como en el caso de la argina, histidina y lisina.

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3.5.2.3.3 Macro Nutrientes
El ms importante de los macro nutrientes es el fosforo en cual est
involucrado en la sntesis de protenas y en los fosfolipidos que permiten la
resistencia a altas concentraciones de etanol: adems las levaduras sintetizan
poli fosfatos como reserva de energa. el fosforo puede ser tomado en forma
monobsica (H
2
PO
4
) Y puede ser aadido al medio como acido o como sal de
amonio, sodio o potasio y se debe encontrar de un 1 a 2% en el medio. El
sulfuro es requerido en la levadura para la sntesis de metionena y cistina, dos
aminocidos que contienen azufre. Se necesita ms o menos de 0.3 a0.5% del
medio. Los micro elementos cobalto, boro, cadmio,molibdinoy neuquel se
requiere en concentraciones de 0.1 a100m.
3.5.2.3.4 Vitaminas
El mosto proporciona una rica fuente de vitaminas y aunque las levaduras
defieren mucho en sus necesidades de vitamina para el crecimiento,
normalmente existe un aporte en variedad como de cantidad en la cuba
maceracin. Mosto debe contener biotena tianina (b1), acido nicotnico,
riboflavina, pantotenato clcico, inositol,piridoxina piridoxal y piridoxamina. Con
la excepcin del inositol, que interviene o participa en sntesis de la membrana
(fosfolipidos ), es decir desempea un papel estructural. Todas las vitaminas
tienen funcin cataltica como parte de algunas coenzimas en el metabolismo
(no-funcional). Los factores de crecimiento que comnmente requiere la
levadura son: biotina, cidos pantotenico e inositol importantes para la
resistencia del microorganismo a altas concentraciones del etanol.
3.5.2.4 Requerimientos Ambientales
3.5.2.4.1 Temperatura
Las temperaturas optimas de la fermentacin respiracin y crecimiento celular
de la levadura son claramente deferentes. La velocidad de fermentacin
aumenta generalmente con la temperatura entre los 15 y los 35c, as como
tambin los niveles de glicerol, acetona, bueteno-2-3diol, acetaldehdo, piruvato
y 2-cetoglutarato.
3.5.2.4.2 Oxigeno
Los requerimiento de oxigeno para la reproduccin y para fermentacin son
deferentes, mientras para la reproduccin se necesitan grandes cantidades de
oxigeno para la produccin de clulas hijas y para la sntesis de acido grasos
que sern los responsables de la resistencia a grandes concentraciones de
etanol necesita de ausencia de oxigeno.

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3.5.2.4.3 PH
Los valores comprendidos entre 3 y 6 son la mayora de veces favorables al
crecimiento y actividad fermentativa, esta ultimas es mayor cuando mayor sea
el PH.
3.5.2.5 Metabolismos
3.5.2.5.1 Azucares
Las levaduras son consideradas microorganismos anaerobios facultativos, ellos
son capaces de crecer en presencia o ausencia de oxigeno, cuando el oxigeno
es suficiente y el sustrato est lo suficientemente diluido, ellas consmenlos
azucares para el crecimiento de las clulas y para su reproduccin en cambio
cuando el oxigeno es reducido y los niveles de glucosa exceden 0.1% P/v.
ocurre l, proceso de fermentacin. cerevesiae usa la vea glicolitica o
enbdenmeyerof-pamas par metabolizar las molculas de azcar y obtener la
energa necesaria para su supervivencia. Cuando la levadura encuentra las
condiciones necesaria para la produccin de etanol, el peruvato es
descarboxilado y convertido en acetaldehdo, el cual tras la adicin de
hidrogeno se transforma en etanol.
3.5.2.5.2 Nitrgeno
La levadura prefiere los compuestos nitrogenadas fcilmente difusibles a
travs de la membrana celular, sobre todo los aminocidos, sus amidas, la urea
y las veces hexonicas . La degradacin no transcurre de un modo regular, sino
que guarda estrecha relacin con la acidez de la fermentacin.la curva de
acides empieza de manera alcalina ya que se hace necesario agregar un
exceso de nitrgeno al medio en forma de sales amoniacales que reacciona
con la sales alcalinas amoniacales orgnicas presentes en el medio. Las sales
de amonio entran a la clula y all se disocian, liberando cidos sulfrico, el
cual fatalmente Lesiona la pared celular, aunque las otras sales ayudan a
neutralizar la accin de estas acido. De esta manera el medio pasa de ser
alcalino a ser acido, paso que se acelera cuando empieza la degradacin de
los aminocidos orgnico, ya que durante la fermentacin de la levadura toma
el nitrgeno de estos compuestos de manera que los aminocidos van
perdiendo su carcter anfteros y convirtindose en cidos. Nuevamente la
cides disminuye cuando los acido orgnico van siendo metabolizados y la
levadura a logrado asimilar la mayor parte de azcar y del nitrgeno. No
obstante queda un resto de nitrgeno amnico no disociado.
3.5.2.5.3 Fosforo
L a levadura introduce este elemento a la clula en su forma inorgnica y
adentro obtiene cidos fosfricos, cuyo metabolismo varia a lo largo del
proceso de fermentacin. Poco despus de iniciada la fermentacin comienza
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la esterificacin del azcar con el acido fosfrico, el cual sale del anterior de la
clula de la levadura para unirse con el azcar y hacerlo asimilable. Durante
todo el proceso el acido fosfrico permanece entrando y saliendo, presentando
un ritmo alternativo adoptado a la germinacin de la levadura y al crecimiento
de la clulas hijas.
3.5.3 Fermentacin
Una fermentacin es una reaccin de oxidacin reduccin interna equilibrada
en l que algunos tomos es reducen mientras otros se oxidan, y energa se
produce por la fosforilacion a nivel de sustrato. Una ruta bioqumica muy usada
para la fermentacin de la glucosa es la glucolisis tambin denominada va de
embde-meyerrhof. La fermentacin anaerbica constituye el tipo ms sencillo y
primitivo de mecanismo lgico que permite la obtencin de energa de las
nutritivas, mediante reacciones de oxidacin y reduccin. En este proceso el
etanol es una molcula relativamente reducida que es produce junto con el CO
2

que es una molcula relativamente oxidada.
La fermentacin alcohlica es el proceso por el que los azucares contenidos en
la mosto se convierten en alcohol etlico. Par llevar a cabo este proceso es
necesaria la presencia de levaduras, las cuales extraen energa qumica de las
molculas de glucosa u de otros combustibles en ausencia de oxigeno
molecular para Producer etanol..la fermentacin alcohlica transcurre por la
misma ruta enzimtica de la glucolisis, pero necesita dos etapas adicionales.
En la primera parte, el tomo de carbono del piruvato es atacado por el
pirofosfato de tianina y experimenta una discarboxilacion, la coenzima queda
en forma de 2-hidroxietil, derivado que puede considerarse una forma de
acetaldehdo activado o ligado a la coenzima. En la etapa final al acetaldehdo
se reduce a etanol y el potencial de reduccin es proporcionado por el NADH
+
,
en una reaccin catalizada por alcohol-deshidrogenada. Las reacciones de la<
fermentacin alcohlica se conservan completas cuando hay formacin de ATP
a partir de fosfato. En realidad, este proceso no puede ocurrir sin la simultnea
fosforilacion oxidativo del ATP.
IV. HIPOTESIS, VARIABLES, INDICADORES Y DEFINICIONES
OPERACIONALES

4.1 Hiptesis
4.1.1 Hiptesis General
La concentracin de y amilasas comerciales en la obtencin de etanol a
partir de arroz sin maltear es una alternativa de produccin, regional y
nacional.

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4.1.2 Hiptesis Especficos
Las concentraciones de las enzimas comerciales mediante la determinacin
de la concentracin de azucares fermentables y que la utilizacin de arroz sin
maltear como sustrato es una alternativa de produccin de etanol.
Los parmetro fisicoqumicos, durante el proceso degradativo y fermentativo
de almidn de arroz favorecen a la actividad de las enzimas y el crecimiento de
saccharomyces cerevisiae
El comportamiento de saccharomyces cerevisiae es muy favorable en sus
deferentes concentraciones de enzimas probadas, teniendo en cuenta la
formacin de biomasa, consumo de sustrato y produccin de etanol en el
medio de fermentacin.
4.2 Sistema de Variables e Indicadores
4.2.1 Variables de Estudio
Las variables independientes de estudio son la concentracin de y
amilasas.
Las variables dependientes de estudio son la concentracin de azucares
reductores, formacin de biomasa de saccharomyces cerevisiae, y produccin
de etanol.
4.2.2 Indicadores independientes
PH
Temperatura.
Agitacin
4.2.3 Indicadores Dependientes.
Concentracin de glucosa
V. MATERIALES Y METODOS
5.1 Materiales, Equipos y Herramientas
5.1.1 materiales.
Matraz erlenmeyer de 2 litro.
Matraz erlenmeyer de 1litro
Matraz de 250 ml
Matraz aforado de 250ml
bureta
tapn de algodn
tapn de caucho
Embudo
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Soporte universal

5.1.2 Equipos.
Balanza analtica.
Bao mara
Cmara de neubauer
5.1.3 Reactivos.
Arroz no malteado
Agua destilada
Acetato de sodio
Solucin de fehling.a-b