Guia de Practicas Microbiologia

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
ESCUELA DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

GUIA DE PRCTICAS
MICROBIOLOGIA GENERAL Y DE LOS
ALIMENTOS
DRA. LILIANA LANCHIPA BERGAMINI
ING. AMELIA CASTRO GAMERO

TACNA - PER
2013
PRESENTACIN
El siguiente Manual de Prcticas de Microbiologa de los Alimentos est
dirigido a los estudiantes de Ingeniera en Industrias Alimentarias, con el
fin de impartir los conocimientos suficientes para calificar la calidad
microbiolgica de : productos alimenticios, agua, ambientes de los talleres
de produccin, utensilios y maquinarias ,adems para poder controlar los
procesos tecnolgicos ,desde el punto de vista higinico sanitario, con el
debido uso de la BPM ( Buenas Prcticas de Manufactura).
La realizacin de estos controles dar la seguridad de la obtencin de
productos alimenticios aptos para consumo humano. La importancia de la
correcta realizacin de los anlisis en el laboratorio de Microbiologa de
los Alimentos garantizar alcanzar este fin. Con ayuda de este manual ,
los alumnos podrn preparar los materiales necesarios , cumplir con las
tcnicas de asepsia, aprender las tcnicas de desarrollo de cada anlisis,
comparar resultados, y finalmente obtener seguridad en la aplicacin de
los mtodos de conservacin de alimentos, cuyas bases son el control de
los procesos microbiolgicos que ocurren en los alimentos.
El conocimiento de la variedad y cantidad de microorganismos en las
materias primas y en los productos alimenticios , y el uso de los
indicadores microbiolgicos dar lugar , a poder evaluar y calificar la
aplicacin correcta de las BPM en la elaboracin de productos
alimenticios.
Igualmente , aprendern a dirigir , organizar con responsabilidad , y
seguridad y a valorar las actividades de orden , limpieza y desinfeccin en
los talleres de produccin y en los laboratorios de control de calidad.
Con el desarrollo de estas prcticas, los alumnos secuencialmente,
lograrn al final del curso investigar en muestras de alimentos los
indicadores microbiolgicos que exigen las normas del Codex alimentarius
y las normas nacionales de Indecopi para desarrollar el control de
elaboracin de productos alimenticios.

Escuela Acadmico Profesional de Ingeniera en Industrias Alimentarias

Microbiologa general y de los alimentos/Ing. Amelia castro/ Dra. Liliana Lanchipa B. Pgina 1

NDICE
PRCTICA 1: REGLAS GENERALES EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
GENERAL Y DE LOS ALIMENTOS ,RECONOCIMIENTO DE MATERIALES Y
EQUIPOS...2
PRCTICA 2: COLORACIN GRAM ..................................................................................... 4
PRCTICA 3: PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO ............................................... 9
PRCTICA 4: MTODOS DE SIEMBRA Y CULTIVO ....................................................... 12
PRCTICA 5: AISLAMIENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS ................................ 16
PRCTICA 6: IDENTIFICACIN DE HONGOS ................................................................. 21
PRCTICA 7: AISLAMIENTO DE ENTEROBACTERIAS.25
PRCTICA 8: NUMERACIN DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS
VIABLES .................................................................................................................................... 30
PRCTICA 9: NUMERACIN DE HONGOS Y LEVADURAS ......................................... 34
PRCTICA 10: NUMERACIN DE COLIFORMES, DETERMINACIN DEL NUMERO
MAS PROBABLE (NMP) ......................................................................................................... 37
PRCTICA 11: NUMERACIN DE STAPHYLOCOCCUS UREUS COAGULASA
POSITIVO .................................................................................................................................. 44
PRCTICA 12: CONTROL HIGINICO DE SUPERFICIES MTODO DEL HISOPADO
O DE LAS TORUNDAS ........................................................................................................... 49
PRCTICA 13: DETECCIN DE SALMONELLA ............................................................... 52



PRCTICA 1
REGLAS GENERALES EN EL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA GENERAL Y DE LOS ALIMENTOS
1. No se debe comer ni beber en el laboratorio.
2. Evite llevarse objetos a la boca (como lpices, dedos, etc., cuando este en el
laboratorio.
3. Lave sus manos con agua y con jabn al terminar cada sesin del
laboratorio.
4. Si por accidente se derramara un cultivo de microorganismos llame al jefe de
prctica inmediatamente.
5. Si usted sufre algn percance (las quemaduras suelen ser bastante
comunes), notifique al jefe de prcticas inmediatamente.
6. Mantenga el orden y la limpieza del laboratorio.
7. Asegrese de que todas las llaves de agua y gas, as como todos los
aparatos elctricos en su mesa de trabajo estn apagados antes de cerrar el
laboratorio.
8. Al hervir un recipiente con agar para derretirlo asegrese que el tapn este
un poco flojo, de otra manera la botella puede estallar.
9. Al usar el microscopio: todos los lentes deben limpiarse con papel para
lentes diariamente antes y despus de usar el aparato (con gota de agua y
luego papel) o con papel humedecido con xilol.
10. Par evitar romper lminas portaobjetos: usar el anillo macrmetro para
descender el objetivo hasta que est tan cerca del porta objetos como sea
posible, el descenso del objetivo debe observarse lateralmente con cuidado
para asegurarse que el lente no toque el portaobjetos. Nunca observe por el
ocular y haga descender el objetivo al mismo tiempo. Cuando el lente este a
punto de tocar el portaobjetos, entonces ya puede ver por el ocular y
empezar a enfocar moviendo el objetivo hacia arriba hasta alcanzar el mejor
foco posible.



REGLAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
GENERAL Y DE LOS ALIMENTOS
1. Usar siempre mandil, gorra, zapatos especiales.
2. No salir fuera de los lmites del laboratorio con la ropa especial.
3. Cada trabajador est obligado a conservar su higiene personal, la limpieza
de su lugar de trabajo y del laboratorio.
4. No se debe comer ni fumar dentro del laboratorio.
5. El material (muestras) que ingresa al laboratorio siempre se considera
infectado.
6. Si cae algo del material que se investiga o cultivo de microorganismos en la
mesa de trabajo se limpia con una solucin desinfectante que debe
encontrarse cerca.
7. El material de vidrio usado siempre se esteriliza, luego se lava, se esteriliza
y se puede usar nuevamente.
8. Cuando ingresa una muestra se rotula y se registra en un cuaderno especial.
RECONOCIMIENTO DE MATERIALES
1.-Nombre y grafique los equipos existentes en el Laboratorio de
microbiologa de los alimentos.
2.- Cules son los materiales de vidrio ms utilizados para realizar las
siembras de microorganismos?
3.-Cmo se realiza el ciclo de limpieza del material de vidrio?
4.-Cules son los principales regmenes de esterilizacin del material de
vidrio?
5.-Indique las partes de un microscopio , y los cuidados que se deben de
tener con los objetivos.



PRCTICA 2
COLORACIN GRAM
I. FUNDAMENTO
La coloracin de Gram ha constituido, desde los albores de la
bacteriologa, un elemento fundamental para la taxonoma e
identificacin. Luego del descubrimiento casual realizado por el
investigador dans Christian Gram, pasaron muchos aos durante los
cuales se efectuaron las ms variables especulaciones sobre el
mecanismo de esta coloracin. Resultaba indudable, sin embargo, su
practicidad a los fines de la identificacin.
El conocimiento de las estructuras de las membranas bacterianas, tanto
en el aspecto fsico como en su composicin molecular que fueron
logrados a partir de la dcada del sesenta, demostr que la coloracin
de Gram distingue dos grupos de bacterias totalmente diferentes. Las
bacterias Gram positivas que presentan una gruesa capa de
peptidoglicano como estructura fundamental por sobre la membrana
citoplasmtica, y las Gram negativa, que encima de esta presentan una
delgada capa de peptidoglicano, a la que se superpone una capa de
lipopolisacridos-lipoproteina, denominada membrana externa.(Espinal
Georgina; Manual de prcticas de microbiologa; Santo

II. OBJETIVOS
Profundizar el conocimiento de las formas bsicas y disposicin
de las bacterias a travs de la realizacin de la coloracin de
Gram.
Reconocer la importancia de la coloracin de Gram en la
identificacin microbiana.
Realizar la coloracin de Gram.

Domingo, 2005)



III. EQUIPOS Y MATERIALES
1. Microscopio
2. Asa de inoculacin
3. Lminas de vidrio
4. Alcohol- acetona o alcohol de 95
5. Solucin de cristal violeta
6. Solucin de lugol
7. Solucin de safranina
8. Aceite de cedro
9. Cultivo de Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus y
Saccharomyces cerevisae.
PREPARACIN DEL REACTIVO
1. Solucin de cristal violeta:
Composicin:
- Cristal violeta 2 gr
- Alcohol etlico a 95%....20ml
- Oxalato amnico 0,8gr
- Agua destilada 80ml
Preparacin
- Disolver el cristal violeta en el alcohol y el oxalato amnico en
el agua destilada. Mezclar las dos soluciones y esperar 24
horas antes de utilizar la mezcla.

2. Solucin de yodo
Composicin:
- Yodo 1 gr
- Yoduro potsico 2gr
Preparacin:


- Triturar el yoduro potsico y el yodo junto en un mortero
aadiendo sucesivamente pequeas cantidades de agua
durante la operacin. Pesar la solucin a un matraz
volumtrico y enjuagar el mortero completando el volumen a
100ml.
- NOTA: puede utilizarse tambin la modificacin de Gram de la
solucin de yodo de lugol. Esta solucin es la misma que la de
Burke, excepto que la cantidad de agua es de 300ml en lugar
de 100ml.

3. Colorante de contraste:
Composicin:
- Safranina 0,25gr.
- Alcohol etlico 10ml
Preparacin:
- Disolver la safranina en el alcohol y mezclar la solucin
resultante con el agua destilada.
IV. PROCEDIMIENTO:
1) Limpie dos lminas portaobjetos. Realizar en cada una un frotis
de los cultivos indicados.
2) Secar el mechero bunsen a una temperatura moderada; pasando
varias veces la lmina por la llama hasta que toda el agua sea
evaporada.
3) Recubrir la lmina con la solucin de cristal violeta por 1 minuto.
4) Lavar suavemente con agua.
5) Recubrir con la solucin de lugol por 1 minuto. Eliminar el
exceso.
6) Lavar suavemente con agua
7) Decolorar con alcohol acetona
8) Lavar con agua para eliminar el alcohol-acetona residual
9) Recubrir la lmina de safranina por 30 segundos
10) Lavar suavemente con agua


11) Secar con un papel filtro o al calor del mechero
12) Observar al microscopio con objetivo de inmersin. (emplear
aceite de cedro).

V. RESULTADOS
Observaciones microscpicas:
Muestra 1
Nombre:

Muestra 2
Nombre:

Muestra 3
Nombre:

Muestra 4

Nombre:

VI. CONCLUSIONES
VII. RECOMENDACIONES
VIII. CUESTIONARIO
1.-Cules son las diferencias de la estructura de la pared celular
de los microorganismos gram-positivos y de los gram-negativos?
Grafique.
2.-Grafique los pasos para realizar la coloracin gran.


3.- Cmo acta el cristal violeta en la estructura de la clula durante la
Tincin?
4.- Qu importancia tiene la decoloracin?
5.- Nombre 5 gneros de bacterias gram-positivas.
Nombre 5 gneros de bacterias gram-negativas.

IX. BIBLIOGRAFIA
1.-Dr. L. Jack Bradshaw. Microbiologa de Laboratorio .Editorial el
manual moderno.
2.- Merck. Manual de medios de cultivo. Ed. Merck, Alemania,1982.
X. ANEXOS



PRCTICA 3
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

I. FUNDAMENTO
Para obtener colonia de microorganismos es necesario utilizar determinados
sustratos nutritivos (medio de cultivo), en los cuales los microorganismos
pueden desarrollar todos sus procesos vitales.
Los medios de cultivo deben de reunir los siguientes requisitos:
- Deben de contener nitrgeno, carbono, oxgeno, hidrgeno, sales
minerales (Na, K, etc.), (Fe, Cu, Cr, Zn, etc.) y factores de
crecimiento (vitaminas, hormonas, etc.). todas las sustancias
deben ser fcilmente asimilables por los microorganismos.
- Todos tienen un pH especfico.
- La presin osmtica en el medio debe ser igual que dentro de la
clula microbiana.
- Los medios de cultivo deben ser esterilizados.
Actualmente existen medio de cultivos desecados, los cuales se almacenan en
recipientes bien cerrados en lugares oscuros y a una temperatura de 15- 30 C
son higroscpicos. Tienen un tiempo de duracin de 5 aos desde su fecha de
fabricacin.
II. OBJETIVO
Los alumnos deben conocer los principios para la preparacin de los
medios de cultivo.

- Autoclave
- Bao Mara


- Material de vidrio (balones, placas Petri, tubos de ensayo, pipetas y
matraces).
- Cocinas
- Balanza y estufa

IV. PROCEDIMIENTO
Para la preparacin de medios de cultivo se utiliza agua limpia, destilada
neutra. Los recipientes que se utilizan se lavaran esmeradamente con el fin
de eliminar cualquier sustancia extraa.
En lo posible se prepara mximo 2 litros por recipiente.
Se separan segn las indicaciones de las etiquetas del envase de cada
medio de cultivo. Los medios que contienen agar o gelatina deben ser
calentados para obtener su disolucin. (Con cuidado!), los medios que no
contienen agar ni gelatinas se pueden disolver por lo general con agua fra o
bajo ligero calentamiento.
Antes de esterilizarlos es conveniente repartir el medio de cultivo en
porciones ms pequeas si las normas indicadas en el envase no indican
otra cosa, la esterilizacin de los medios de cultivo se lleva a cabo en
autoclave, a 121C durante 15 minutos.
V. RESULTADOS
Caractersticas de los medios slidos al final de la preparacin:
-
-
Caractersticas de los medios lquidos al final de la preparacin:
-
-
VI. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO
1.- Cmo se clasifican los medios de cultivo?
2.-Qu laboratorios expenden medios de cultivo?


3.-Cmo se esterilizan los medios de cultivo?
4.-Cmo se deben ser los envases para conservar los medios de
cultivo deshidratados?

IX. BIBLIOGRAFIA
1.-Dr. L. Jack Bradshaw. Microbiologa de Laboratorio .Editorial el manual
moderno.
2.- Merck. Manual de medios de cultivo. Ed. Merck, Alemania,1982.
X. ANEXOS



PRCTICA 4
MTODOS DE SIEMBRA Y CULTIVO
I. FUNDAMENTO TERICO

Dependiendo del tipo del material para la siembra de los fines de
investigacin del medio de cultivo utilizado existen varios mtodos de
siembra. Todos ellos cumplen con un fin: aislar microorganismos por eso
se requieren trabajar rpido, pero sin movimientos bruscos y durante el
proceso de siembra no est permitido conservar, las siembras deben
realizarse en lugares especiales para este fin.
Atencin: no olvide cumplir con las normas de seguridad durante el
trabajo.
Un medio de cultivo es un material alimenticio que se usa en el laboratorio
para el desarrollo de los microorganismos. Una vez que ha sido preparado, un
medio de cultivo puede ser inoculado(es decir, se le aaden microorganismos)
y a continuacin se incuban en condiciones que favorezcan el crecimiento
microbiano. El crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Un cultivo puro
contiene un nico tipo de microorganismos. Los medios de cultivo deben
contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y deben estar
exentos de cualquier microorganismo contaminante. Los medios de cultivo
contienen como mnimo: carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales
inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras
sustancias inductoras del crecimiento. Tambin se aaden colorantes que
actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o
como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras.
El agar es el principal agente solidificante utilizado en medios
bacteriolgicos. Se disuelve completamente a 100C y se solidifica al
enfriarse a 40C

II. OBJETIVO
Aprender los principales mtodos de siembra de microorganismos


III. MATERIALES Y EQUIPOS
Placas Petri.
Tubos de ensayo.
Pipetas.
Asa de nicromo.
Agujas de nicromo.
Medios de cultivo.
Mechero bunsen , estufa incubadora, estufa esterilizadora,
Bao mara.
IV. PROCEDIMIENTO

Para desarrollar la presente prctica, requeriremos una muestra que en
este caso ser la levadura de pan. La muestra se encuentra mezclada
en solucin de agua y colorante rojo para la percepcin eficaz de la
siembra de microorganismos, en el cual se tratara de aislar colonias.
Para tal efecto es necesario que el rea de trabajo est debidamente
esterilizada, para ello se procede as:
Limpiar la superficie de contacto con trapo hmedo.
Esterilizar el rea con alcohol y flamearla con el mechero bunsen.
Dejar el mechero bunsen siempre prendido ya que nos permite
esterilizar un rea de 40cm
2
.

A. SIEMBRA EN TUBOS.
1. SIEMBRA DE UN TUBO DE ENSAYO A OTRO TUBO
El tubo con el material para la siembra y el tubo con el medio de
cultivo se toman ambos con la mano izquierda en forma inclinada de
tal manera que los extremos de ambos tubos estn a un mismo
nivel.
Con la mano derecha se toma el asa y se esteriliza en posicin en el
mechero con la mano se extrae los dos tapones con el dedo
meique y el siguiente apoyndolos a la palma al mismo tiempo, se
flamea el extremo de los dos tubos: con el asa se toma un poco de


material de siembra luego de enfriarla y con cuidado se le traslada al
tubo con el medio de cultivo.

a. Cuando la siembra es en un caldo de cultivo, el asa con el
material se introduce en el lquido por la pared inferior del tubo y
se extrae por la pared superior. Atencin el caldo de cultivo
no debe mojar al tapn de algodn!
b. Para sembrar en un agar inclinado, al asa con el material se le
da movimiento de zig-zag en la superficie del agar de abajo
hacia arriba.
c. Para sembrar en una columna de agar vertical (por picadura) se
utiliza una aguja la cual se esteriliza bajo mechero y con el
material de siembra se introduce al fondo de la columna.
Despus de la siembra el asa de aguja se extrae del tubo se
flamea al extremo del tubo, se le coloca el algodn y se esteriliza
el asa o aguja en el mechero en posicin vertical.
d. La siembra en un caldo de cultivo, se puede realizar con una
pipeta de Pasteur o una pipeta graduada, luego de la siembra
las pipetas se colocan en un lquido desinfectante.

2. LA SIEMBRA A UN TUBO CON MEDIO DE CULTIVO DESDE UNA
PLACA PETRI.
La placa Petri con el material de siembra se coloca frente a uno con
la tapa hacia arriba, se esteriliza el asa, se abre la placa bajo
mechero, se toma con el asa un poco de material se retira el asa, se
cierra la placa y con la mano izquierda se toma el tubo con el medio
de cultivo. La siembra se realiza como en los casos del punto 1.

B. SIEMBRA EN PLACA PETRI.
1. TCNICAS DE LA PLACA ESTRIADA EN SECTORES (EN
SUPERFICIE).
La placa Petri con agar se divide en sectores. La siembra se realiza
con un asa (con material de siembra) sobre el agar realizando
movimientos en zig-zag desde un extremo de la placa hacia el centro


de asa. Es necesario que las estras no toquen los sectores vecinos.
Esterilizar el asa al terminar la siembra luego de cerrar la placa y
colocar la placa con la tapa hacia abajo.

2. TCNICAS DE SIEMBRA CON UN EXTENSOR (EN SUPERFICIE).
Con la mano izquierda levantar la tapa de la placa Petri bajo
mechero sosteniendo con el dedo ndice y el pulgar. Con un asa o
pipeta se vierte el material de siembra a la superficie del agar y con
el extensor se cubre toda la superficie con el material haciendo
movimientos giratorios. Al final se extrae el extensor se cierra la
placa y se coloca el extensor en una solucin desinfectante. Colocar
la placa con la tapa hacia abajo.

3. TCNICA DE VACIADO EN PLACA POR INCORPORACIN.
Rotular las placas. Colocar el material de siembra con una pipeta en
cada placa (1 ml). Agregar el agar. Realizar movimientos de vaivn
para distribuir bien el material. Colocar las placas con la tapa hacia
arriba hasta que enfre el agar. Invertirlas en el momento de llevarla
a incubar.

V. RESULTADOS
-Siembra en tubos de ensayo:

1.- 2.- 3.- 4.-

- Siembra en placas petri:
1.- 2.- 3.- 4.-



VI. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO
1.-Grafique los mtodos de siembra y cultivo.
2.-Cmo se prepara el asa de kholle : forma, esterilizacin?
3.-Cmo funciona una cabina de bioseguridad del tipo A-2?
4.-Principales regmenes de incubacin de placas petri sembradas en
forma aerbica.
5.- Cmo se realiza la incubacin anaerbica de placas petri
sembradas?

IX. BIBLIOGRAFA
manual moderno.
2.- Merck. Manual de medios de cultivo. Ed. Merck, Alemania,1982
3.-Pelczar M ,Reid R, Chan E. Microbiologa 4ta.edicin. Editorial
Mc.Graw Hill.
X. ANEXOS



PRCTICA 5
AISLAMIENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

I. FUNDAMENTO TEORICO:

El S. aureus es un coco inmvil, de 0.8 a 1 micrmetro de dimetro,
que se divide en tres planos para formar grupos de clulas
irregulares semejantes a racimos de uvas. En extendidos de pus los
cocos aparecen solos, en pares, en racimos o en cadenas cortas.
Los racimos irregulares son caractersticos de extendidos tomados
de cultivos que se desarrollan en medios slidos, mientras que en
otros cultivos son frecuentes las formas de diplococos y en cadenas
cortas. Unas pocas cepas producen una cpsula o capa de baba que
incrementa la virulencia del microorganismo.

El S. aureus es un microorganismo Gram-positivo pero las clulas
viejas y los microorganismos fagocitados se tien como gram-
negativos.

II. OBJETIVOS:

Aislar bacterias de la familia micrococaceae, gnero staphylococcus
y estudiar sus propiedades fermentativas y patogenicidad.
III. MATERIALES:
- Probetas, placa Petri, porta-objetos, matraces Erlenmeyer, asa
bacteriolgica, extensores, etc. estriles.
- Agar manitol-salado, agar Baird Parker, solucin salina al 0,9%.

IV. PROCEDIMIENTO :
Utilizar el siguiente material de investigacin:
- Secreciones de la nariz y la garganta.


- Productos alimenticios contaminados.
Realizar siembra en superficie en el Agar BAIRD PARKER y en el
agar manitol-salado y realizar la prueba de la coagulasa.
Agar manitol-salado:
Microorganismo crecimiento color colonia
- Enterobacter aerogenes inhibido
--
- Escherichia Coli inhibido
--
- Staphylococcus aureus buena a excelente
amarillo
- Staphylococcus epidermis pobre
rojo
- Staphylococcus epidermis buena a excelente
rojo.

Agar Baird Parker:
MICROORGANISMOS COLONIAS
Staphylococcus aureus Negras lustrosas convexas, 1a 5 mm de
dimetro con borde estrecho, blanquecino,
rodeados por un halo claro de 2 a 5mm. De
anchura dentro del halo claro presencia de
anillos opacos no visibles antes de la 48 horas
de incubacin
Staphylococcus epidermidis Negras lustrosas, pero de forma irregular. Al
cabo de 24 horas, presencia de zonas opacas
alrededor de las colonias
Micrococcus Crecimientos ocasionales , muy pequeas ,
pardas hasta negras, ausencia de halos de
clarificacin


Bacillus Pardo-obscuras, mate, presencia a veces de
halos de clarificacin al cabo de 48horas
Levaduras Blancas y sin halos de clarificacin

V. RESULTADOS
En placas petri con Baird Parker.
Muestra1: Muestra 2:.

Muestra 3:.. Muestra 4:.

Muestra 5:..

Observacin microscpica de Staphylococcus aureus:

VI. CONCLUSIONES
VII. RECOMENDACIONES.
VIII. CUESTIONARIO
1.-En el agar Baird Parker cmo crecen las colonias de
staphylococcus aureus?
2.-Cmo se prepara el Agar Baird Parker?.


3.-Quines son los principales portadores y transmisores de esta
bacteria?
4.-Por qu son termorresistentes?

IX. BIBLIOGRAFA
manual moderno.
3.-Pelczar M ,Reid R, Chan E. Microbiologa 4ta.edicin. Editorial
Mc.Graw Hill.

X. ANEXOS



PRCTICA 6
IDENTIFICACIN DE HONGOS

I. FUNDAMENTO TEORICO
Los hongos son microorganismos aerobios que se diferencian segn su
morfologa. Por esta caracterstica se les puede identificar
microscpicamente y diferenciarlos por gneros. Los principales
gneros que se desarrollan en los alimentos : mucor, ryzhopus,
thamnidium, penicillium, aspergillus y alternara.
Los hongos se pueden desarrollar en medios de cultivo como: OGA
,agar suero naranja y el agar patata glucosa.

II. OBJETIVO
Identificar los hongos provenientes de muestras de alimentos segn su
gnero y estudiar su morfologa.

III. EQUIPOS Y MATERIALES:

1. Microscopio compuesto con lente de inmersin.
2. Portaobjetos y cubreobjetos.
3. Aguja de inoculacin o estilete.
4. Lugol (lquido de montaje).
5. Pequea cantidad de alimento atacada por hongos en bolsas de
plstico.



IV. PROCEDIMIENTO:

1. Tomar una parte del hongo (micelio, esporas) y colocarlo sobre
un portaobjeto limpio y desengrasado en el que se ha colocado
una gota del lquido de montaje, dispersar o extender el micelio
con la ayuda de una aguja y la punta del cubreobjetos, luego
colocar el cubreobjetos sobre el material extendido. Observar con
el lente de inmersin.

2. Cuando el hongo presenta mucho micelio areo o desarrollado
superficial fino, o para estudiar las estructuras esporuladas utilizar
un pedazo de cinta adhesiva que se presiona sobre el micelio,
colocar la cinta con el micelio adherido en forma invertida sobre
una gota de lugol, aadir otra gota sobre la cinta y colocar el
cubreobjetos. Observar con lente inmersin.

3. Micro cultivo mtodo de Riddell

Colocar en el centro de un portaobjeto estril un pequeo block
de agar (6x6x2) y en cada uno de los 4 lados sembrar el hongo
en examen. Colocar el cubreobjetos estril sobre el agar y el
portaobjeto as preparado, colocarlo en una cmara hmeda:
placa de Petri estril con papel de filtro humedecido y de 2 varillas
de vidrio para colocar el portaobjeto. Incluir a temperatura
ambiente por 3 a 5 das.

Luego:
a) Con poco aumento examinar los bordes superiores del
desarrollo micelial del hongo en el cultivo proporcionado.

b) Anotar las siguientes observaciones.

Micelio si es septado o no, hialino u oscuro, delgado tipo
de ramificacin de la hifa.


Esporas asexuales si es conidia, esporangiospora o
artrospora su forma, tamao, color, si es suave, rugoso, o
si tiene 1,2 o ms clulas.

Fructificacin

1) Si es esporangio, su tamao, color forma e hifa.
2) Si est dispuesto en conidia, si es uno o ms
conidias, conidiforo, forma, y arreglo del esterigma,
arreglo de la conidia.
3) Estructura especial y localizacin: estolones,
rizoides, columela, apfisis, clamidospora, etc...

V. RESULTADOS
Muestra 1.:..

Muestra 2:.
OBSERVACIONES

Muestra 3:..

Muestra 4: MICROSCPICAS

Muestra 5:

Muestra 6:



VI. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO
1.- Cules son los principales gneros de hongos que se presentan en
los alimentos ?
2.-Graficar cada gnero e indicar los nombres de sus estructuras
,morfologa.
3.-Cules son los principales factores de crecimiento para hongos?
4.- Cmo se puede inhibir el crecimiento de hongos?
IX. BIBLIOGRAFA
moderno.
3.-Pelczar M ,Reid R, Chan E. Microbiologa 4ta.edicin. Editorial Mc.Graw Hill.
X. ANEXOS



PRCTICA 7
AISLAMIENTO DE ENTEROBACTERIAS

I. FUNDAMENTO: La familia enterobacteriaceae, est formada por
bacterias patgenas y no patgenas, su morfologa es en forma de
pequeos bastones, son gram negativos y fermentan la glucosa. Las
que tienen mayor importancia son las de los gneros Escherichia,
Shigella y Salmonella.
En el gnero Escherichia o coliformes se considera como indicador a E.
Coli de origen fecal, por su frecuencia. Son lactosa positivos, crecen a
37C a pH = 2 7,4.
Las bacterias del gnero Salmonella son lactosas negativas; crecen a
37
o
C, a pH = 7, 2,6.
A 65
o
C mueren en 15min. Y a 100
o
C en forma instantnea.
II. OBJETIVOS:
Aislar enterobacterias en medios adecuados y desarrollar la
prueba de IMVIC.
Estufa, autoclave, mechero, bao Mara, asas bacteriolgicas.
Placas Petri con medios de cultivo (EBM, BPLS, VRBA, VRBA
GLUCOSADO Y SS).
Tubos con caldos de enriquecimiento BRILA y Tetrationato
inoculados.
Medios de cultivo para la prueba de IMVIC.

IV. PROCEDIMIENTO:
Sembrar en estra del Caldo Brilla al VRBA Y EBM
Sembrar en estra del Caldo tetrationato al BPLS Y SS.
De ambos caldos pueden sembrar al VRBA Glucosado


Luego de incluir a las temperaturas y tiempos adecuados realizar
la prueba de IMVIC para una colonia representativa de E. Coli.
Prueba de indol:
Inocular en tubos con caldo peptonado o triptosa.
Incubar por 24 horas adicionar de 2 a 3 gotas de reactivo de
Kovacs por las paredes.
Dejar los tubos en reposo y observar la formacin de un anillo de
color rojo para el resultado positivo, o anillo color amarillo para
negativo.
Prueba del rojo de metilo.
Inocular los tubos conteniendo caldo MR VP.
Incubar a los tubos por 72 horas a 37
o
C.
Despus de las 72 horas adicionar a 5 gotas de solucin Rojo de
metilo y agitar.
Anotar como el Rojo de metilo positivo, la aparicin de un color
rojo, y como negativo la operacin de un color amarillo.

Prueba de Voges proskauer:
Inocular los tubos de caldo MR VP.
Incubar a 37
o
C por 48 horas.
A 1ml de cultivo aadir 0.6 ml de solucin de alfa naftol y 0.2 ml
de sol. KOH 40%. Agitar. Dejar reposar de 2 a 4 horas.
Reaccin positiva: coloracin rosada o carmes.
Prueba del citrato:
Inocular los tubos de citrato de Simmons.
Incubar a 37
o
C por 24 horas.
Anotar como positivo un crecimiento visible, acompaado de un
cambio de color verde al azul.



MEDIOS DE CULTIVO
EMB agar eosina-azul de metileno-lactosa-sacarosa
COLONIAS
Transparentes, de color ambarino
MICROORGANISMOS
Salmonella y Shiguella
Verdosas con brillo metlico a la luz
reflejada, con el centro negro azulado
a la luz transmitida.
E. Coli.
Ms grandes que las E. Coli,
mucosas, confluentes, con el centro
pardo grisceo a la luz transmitida.
Entrobacter, klebsiella y otros

MEDIOS DE CULTIVO
VRBA agar violeta cristal rojo neutro-bilis.
COLONIAS
Rojas con halo de precipitacin rojizo:
de 1-2mm de dimetro.
MICROORGANISMOS
Enterobacterias lactosa- positivas:
coliformes, E. Coli.
Colonias con punta de alfiler rosadas.
Incoloras.
Enterococos eventualmente
kleibsiella.
Incoloras Enterobacteriaceas lactosa-negativas

MEDIOS DE CULTIVO
BPLS agar verde brillante rojo de fenol-lactosa-sacarosa
COLONIAS
Rojo-rosadas con halo rojo
MICROORGANISMOS
Lactosa- negativas y sacarosa- negativos:
Salmonella y otros.
Verde- amarillentas con halo
verde- amarillento.
Lactosa positivos o sacarosa- positivos:
E. Coli, Citrobacter. Proteus vulgaris,
klebsiella y otros.
No obstante a veces inhibicin completa.


MEDIOS DE CULTIVO
SS agar para salmonella y Shigella
COLONIAS
Incoloras, transparentes
MICROORGANISMOS
Shigella y la mayora de las
salmonellas.
Transparentes con centro negro. Proteus y algunas de las salmonellas.
Rosadas hasta rojas E. Coli
Mayores que las de E. Coli rosada de
color cremoso- blanquecinas opacas,
mucosas.
Enterobacter aerogenes
V. RESULTADOS
Para lactosa + (coliformes):
1.-Crecimiento en Caldo Brilla:

2.-Crecimiento en VRBA:

3.-Crecimiento en BPLS:

4.-Crecimiento en EBM (E.coli):

5.- Prueba de IMVIC:

6.- Observacin microscpica: (E.coli):



VI. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO
1.-Interprete los resultados de la prueba de IMVIC , para E.coli. Explique
la formacin de indol.
2.- Cules son las bacterias coliformes , qu gneros son no
patgenos?
3.-Cmo crece E.coli en el agar azul de metileno? Cmo acta este
medio?
IX. BIBLIOGRAFA
moderno.
3.-Pelczar M ,Reid R, Chan E. Microbiologa 4ta.edicin. Editorial Mc.Graw Hill.
X. ANEXOS



PRCTICA 8
NUMERACINDE MICROORGANISMOS AEROBIOS
MESFILOS VIABLES

I. FUNDAMENTO TERICO:
La aceptabilidad de un proceso es frecuentemente el aspecto ms difcil
del anlisis de alimentos. Los anlisis microbiolgicos de los alimentos
son una herramienta eficaz en esta evaluacin, pero la interpretacin de
los resultados de laboratorio obtenidos en microbiologa es,
frecuentemente, el ms difcil y complejo aspecto de todo el proceso de
evaluacin, donde entran en juego el criterio profesional y las
circunstancias que rodean al hecho (brote, control de rutina, toma de
muestra en lnea de proceso o en punto de venta, producto listo para
consumo, etc.). Para una adecuada interpretacin de estos resultados
es importante establecer qu resultados son alcanzables y/ o
esperables.
Este indicador el RTBAMV es el ms importante para calificar la correcta
manipulacin de la materia prima durante todo el proceso de produccin
y el buen uso de la BPM hasta obtener el producto alimenticio final.

II. OBJETIVO
Conocer el mtodo para determinar el nmero de microorganismos
aerobios mesfilos viables.

1. Los requisitos necesarios para la dilucin de las muestras de alimentos.
2. Placas Petri
3. Pipetas bacteriolgicas de 1 y 10ml
4. Bao de agua regulado a 44- 46C para mantener el agar licuado
5. Bao de agua regulado a 29-31C
6. Contador de colonias
7. Agar Plate Count.


IV. PROCEDIMIENTO :
1. Preparar la muestra
2. Pipetear por duplicado a placas de Petri estriles alcuotas de 1ml a
partir de dilucin

Se sugiere esta serie de diluciones cuando no se conoce el rango
aproximado del nmero de bacterias.
3. Agregar rpidamente a las placas de Petri 15ml de agar licuado y
temperatura entre la preparacin de la dilucin y la dilucin del agar
no debe transcurrir ms de 10 minutos.
4. Mezclar inmediatamente la alcuota con el agar mediante
movimientos de vaivn y rotacin de las placas Petri. Una secuencia
satisfactoria de paso es la siguiente:
a. Mover la placa de arriba abajo 5 veces en una direccin
b. Rotar 5veces la placa en sentido de las agujas del reloj.
c. Mover la placa 5 veces en la direccin que haga ngulo recto al
usado en el primer tiempo
d. Rotar la placa en sentido inverso al de las agujas del reloj.
5. Como control de esterilidad, adicionar a placas Petri, agar sin inocular
y agar inoculado con el diluyente.
6. Una vez solidificado el agar, invertir las placas e incubarlas a 29-311C
durante 48 +/-3 horas.
7. Computo del recuento estndar en placas
a. Seleccionar 2placas correspondientes a una dilucin que contenga
entre 30 y 300colonias utilizando un contador de colonias
b. Si las placas de diluciones consecutivas presentan menores que
30 y mayores que 300, tomar el promedio de los 2 recuentos.
c. Si el nmero de colonias de las placas de 2 diluciones
consecutivas estn dentro del rango de 30-300, computar el
recuento para cada una de las diluciones y establecer la relacin
de los 2 recuentos. Si el cociente es menor que 2, reportar el
promedio de los 2 valores, pero, si el recuento mayor cociente 2
veces o ms que al menor, en este caso se reportara en recuento
del menor.


d. Multiplicar por el factor de dilucin reciproco de la dilucin utilizada.
Reportar el resultado como nmero de microorganismos aerobios
mesfilos por gramo o mililitro segn el caso.
8. Cmputo del estimado de recuentos estndar en placas.
a. Si la placa de las diluciones muestran ms de 300 colonias, dividir
cada duplicado de las placas de la dilucin ms alta en secciones
radiales convenientes (2, 4, 8.) y contar todas las colonias en una o
ms secciones. Multiplicar el total en cada caso por el factor
apropiado para obtener el nmero de colonias por cada placa.
Promediar los estimados de las 2 placas duplicadas y multiplicar
por la dilucin correspondiente. Reportar el resultado como
estimado del nmero.
Si no hubiese colonias en placas de mayor concentracin, reportar el
estimado como menor que la inversa de la dilucin.
Ejemplo:
= 0 colonias.
Se reporta como Si se hubiese sembrado, 0.1ml en
este caso se reporta
Expresin de resultados:
a. Se deber reportar nicamente 2 dgitos significativos, ellos son el
primero y el segundo (comenzando por la izquierda) del promedio
de los recuentos. Los dems dgitos se reemplazaran por cero.
Ejemplo:
523.000 se reportara 520.000 =
de alimento
segn el caso.
Si el tercer digito de la izquierda es 5 o mayor que 5, adicionar una
unidad al segundo dgito (redondear)

b. Si el recuento en placa se utiliza para determinar la aceptacin o
rechazo de un lote de alimentos, nicamente se considera el
recuento estndar en placa, nunca el estimado del recuento, ste


es til solamente como una aproximacin primaria en la
determinacin de la calidad microbiolgica de un alimento.
V. RESULTADOS:
Muestra RTBAMV
1.-
2.-

VI. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO
1.-Cmo se utiliza este indicador para evaluar la calidad de las
materias primas?
2.-Qu valores son aceptables para productos lcteos y crnicos
pasterurizados?
3.-Grafique el procedimiento de preparacin de diluciones de muestras.
4.-Por qu no se puede utilizar este indicador para productos
fermentados?
5.-Cul es la composicin del medio de cultivo Plate Count?

IX. BIBLIOGRAFA
1.-Bourgeois C. M. Microbiologa Alimentaria. Editorial Continental
S.A.1995.
2.-Frazier ,W.C. Microbiologa de los alimentos .Ed. Acribia . Espaa
2000.
3.- Mossel.D.Microbiologa de los alimentos. Ed. Acribia. Espaa 2000.
4.-DIFCO Manual de medios de cultivo. Ed. Difco.
5.-MERCK. Manual de medios de cultivo Ed. Merck, Alemania.
6.-Ministerio de Salud DIGESA . Manual de Anlisis Microbiolgico de
Alimentos.
7.-FAO-ONU- Manuales para el control de calidad de Alimentos para la
agricultura y la Alimentacin. Roma.

X. ANEXOS



PRACTICA 9
NUMERACIN DE HONGOS Y LEVADURAS

Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en
el ambiente, pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o
como contaminantes en equipos mal sanitizados. Ciertas especies de
hongos y levaduras son tiles en la elaboracin de algunos alimentos,
sin embargo tambin pueden ser causantes de la descomposicin de
otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja
competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos
donde el crecimiento bacteriano es menos favorable. Estas condiciones
pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales
o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de
antibiticos, o la exposicin del alimento a la irradiacin. Por lo tanto
pueden ser un problema potencial en alimentos lcteos fermentados,
frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas, granos, cereales y sus
derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas,
especias, etc.

II. OBJETIVO
Realizar adecuadamente mediante el mtodo de recuento en placa, la
numeracin de hongos y levaduras viables presentes en productos
alimenticios destinados al consumo humano.

1. Los requisitos para la preparacin de dilucin de las muestras de
alimentos.
2. Placas de Petri de vidrio 100 y 15mm
3. Pipetas bacteriolgicas de 1.5 y 10ml
4. Bao Mara o incubadora para temperar el agar a 44 46C
5. Incubadora regulada a 20 24C


6. Contador de colonias
7. Oxitetraciclina extracto de levadura glucosa agar (OGA),o Agar
patata glucosa o Agar suero de naranja.

IV. PROCEDIMIENTO
1. Preparar el alimento por uno de los tres procedimientos recomendados
en la seccin sobre preparacin y dilucin de las muestras de alimentos.
2. Pipetear por duplicado a las placas de Petri estriles, alcuotas de 1ml
de las diluciones
las diluciones preparadas y

sembradas pueden variar de acuerdo al nmero de colonias
sospechosas.

3. Agregar de 10 a 15ml de medio de cultivo, temperado a 44 46C.

4. Mezclar inmediatamente, la alcuota con el agar por:
a. Movimiento de la placa de arriba hacia abajo, por 5 veces.
b. Rotacin de las placas en sentido de las agujas del reloj, 5 veces.
c. Movimiento de la placa 5 veces en la direccin que haga ngulo recto
del usado en el primer tiempo.


d. Rotacin de la placa 5 veces en sentido inverso de las agujas del
reloj.
5. Despus de solidificado el agar, invertir las placas Petri e incubarlas a 20
24C por 3 a 5 das.
6. Usando el contador de colonias, contar todas las colonias, contar todas
las colonias de las placas que contengan de 20 100 colonias, efectuar
el examen microscpico cuando se requiera identificar las colonias.
7. Reportar el nmero de ufc de hongos y de levaduras por g o ml de
alimento.

V. RESULTADOS
Muestra Numeracin de
Hongos
Numeracin de
Levaduras
1.-
2.-

VI. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO
1.-Cules son las temperaturas de letalidad para hongos y levaduras?
2.-Qu son la micotoxinas ?
3.- Qu importancia tiene como indicador microbiolgico para evaluar
la materia prima y productos alimenticios?
4.-Segn el codex alimentarius , en que alimentos consideran este
indicador microbiolgico.

IX. BIBLIOGRAFA
1.-Bourgeois C. M. Microbiologa Alimentaria. Editorial Continental
S.A.1995.
2000.


Alimentos.
agricultura y la Alimentacin. Roma
X. ANEXOS



PRCTICA 9
NUMERACIN DE COLIFORMES, DETERMINACIN DEL
NMERO MS PROBABLE (NMP)

COLIFORMES:
La denominacin genrica coliformes designa a un grupo de especies
bacterianas que tienen ciertas caractersticas bioqumicas en comn e
importancia relevante como indicadores de contaminacin del agua y los
alimentos.
Coliformes significa con forma de Coli, refirindose a la bacteria principal
del grupo, la Escherichia Coli, descubierta por el bacterilogo alemn
THEODOR VON ESCHERICH en 1860.

Caracteres bioqumicos:
El grupo agrupa a todas las bacterias entricas que se caracterizan por
tener las siguientes propiedades bioqumicas:
ser aerobias o anaerobias facultativas
ser bacilosGram negativos;
no ser esporgenas
fermentar la lactosa a 35 C en 48 horas, produciendo cido lctico
y gas.

Las bacterias de este gnero se encuentran principalmente en el
intestino de los humanos y de los animales de sangre caliente, es decir,
homeotermos, pero tambin ampliamente distribuidas en la naturaleza,
especialmente en suelos, semillas y vegetales.
Los coliformes se introducen en gran nmero al medio ambiente por las
heces de humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse que la
mayora de los coliformes que se encuentran en el ambiente son de
origen fecal. Sin embargo, existen muchos coliformes de vida libre.



II. OBJETIVOS
Determinar el NMP de coliformes totales en muestras de
alimentos.
Determinar la numeracin de coliformes mediante el mtodo de
recuento en placa.
Determinar en NMP de coliformes fecales en muestras de
alimentos.

1. Los requisitos necesarios para la preparacin y dilucin de la
muestra de alimentos.
2. Incubadora de 35C 37C
3. Pipetas bacteriolgicas de 1ml
4. Aguja de incubacin con alambre de nicrn o platino iridio.
5. Caldo verde brillante bilis lactosa (CALDO BRILA) volmenes de
1ml en tubos de 150x15mm conteniendo tubos de fermentacin
invertidos (75x1mm).
6. agar violeta cristal-rojo neutro- bilis (VRBA) o agar ENDO o agar
Mc CONKEY

IV. PROCEDIMIENTO
NUMERO MS PROBABLE DE COLIFORMES TOTALES
1. Preparar las muestras de alimento de acuerdo al procedimiento
recomendado.
2. Pipetear 1ml de c/u de las diluciones del homogenizado de alimento en
tubos de caldo verde brillante bilis lactosa (caldo BRILA) utilizando tres
tubos por dilucin.
3. Incubar los tubos a 35C 37C por 24- 48 horas
4. Anotar los tubos que muestren produccin de gas (prueba presuntiva)
5. De cada tubo que contiene gas, aislar sobre placas con agar-violeta
cristal-rojo neutro-bilis (VRBA) o agar ENDO.
6. Incubar los tubos a 35C 37C por 24- 48 horas
7. Confirmar la presencia de bacterias coliformes por:


a. la formacin de colonias, rojo oscuro con dimetro mayor de 5mm
en agar VRBA.
b. La formacin de colonias rojas rodeadas halo en agar ENDO.
8. Anotar el nmero de tubos confirmados. Referirse a la tabla del NMP
para expresar el resultado.

NUMERACIN DE COLIFORMES DE ORGEN FECAL

I. EQUIPOS Y MATERIALES
1. Asa de inoculacin.
2. Bao de agua, regulado a 44 (+/- 0.1C)
3. Pipetas bacteriolgicas de 5ml
4. Caldo verde brillante bilis lactosa (caldo BRILA), volmenes de 10ml en
tubos de 150x15mm. Conteniendo tubos de fermentacin invertidos
(75x10mm).
5. Caldo triptosa, volmenes de 1ml en tubos de 150x15mm.
6. Reactivo de KOVACS.

II. PROCEDIMIENTO:
1. Seleccionar los tubos de caldo verde brillante bilis lactosa (caldo
BRILA) que muestren formacin de gas en prueba presuntiva.
2. Inocular una azada de cada tubo gas positivo a un tubo de caldo
BRILA y un tubo de caldo triptosado.
3. Incubar los tubos a 44 (+/- 0.1C)
4. Despus de 24 horas de incubacin, efectuar la prueba de indol
en los tubos con caldo triptosa.
5. Controlar la formacin de gas en los tubos con caldo BRILA
despus de 24 y 48 horas de incubacin.
6. Los cultivos que muestran produccin de gas en caldo BRILA y
formacin del indol en caldo triptosa son positivos para coliformes
fecales.
7. Referirse a la tabla de NMP para expresar el resultado.



NUMERACIN DE BACTERIAS COLIFORMES POR EL MTODO DE
RECUENTO EN PLACA
I. MATERIALES:
1. Los requisitos necesarios para la preparacin y dilucin de la
muestra.
2. Incubadora a 45-37C.
3. Pipetas bacteriolgicas de 1ml.
4. Bao de agua regulada a 44- 46C, para temperar el agar.
5. Agar Violeta Cristal Rojo Negro Bilis (VRBA)

II. PROCEDIMIENTO
1. Prepara la muestra por el procedimiento recomendado para la
preparacin de dilucin de muestra.
2. Transferir 1ml de cada dilucin de la muestra a una placa de Petri
estril.
3. Adicionar a cada placa de Petri, 10-15ml de agar violeta cristal
rojo bilis temperado a 44- 46C.
4. Mezclar el contenido de las placas mediante movimientos de
vaivn y rotacin de cada placa. Dejar solidificar la mezcla 5 a 10
minutos, luego distribuir un adicional de 10ml de medio de
plaqueado como doble capa, cubriendo completamente la
superficie de medio solidificado e que inhibir la formacin de
colonias en la superficie.
5. Invertir e incubar las placas durante 24 horas a 35-37C.
nicamente las colonias rojo oscuro que midan 0.5mm o ms de
dimetro en la placa, que tengan entre 20 y 200 colonias, se
consideran bacterias coliformes. Si es posible seleccionar para el
recuento solamente aquellas placas no con ms de 150 colonias
de estas colonias. Multiplicar el nmero de colonias por dilucin
para obtener el nmero de bacterias coliformes por gramo o ml de
muestra.



Tabla de NMP para expresar resultados.
Dilucin
10
-1
Dilucin
10
-2

Dilucin
10
-3
NMP
por g.
99% 95%
0 1 0 3 1 23 1 17
1 0 0 4 1 28 1 21
1 0 1 7 1 35 2 27
1 1 0 7 1 36 2 38
1 2 0 11 2 44 4 35
2 0 0 9 1 80 2 38
2 0 1 14 3 82 3 48
2 1 0 15 3 85 5 50
2 1 1 20 0 77 8 61
2 2 0 21 5 80 8 63
3 0 0 23 4 177 7 129
3 0 1 40 10 230 10 180
3 1 0 40 10 290 20 210
3 1 1 70 20 370 20 280
3 2 0 90 20 520 30 390
3 2 1 150 30 660 50 610
3 2 2 210 50 820 80 640
3 3 0 200 <100 1900 200 1400
3 3 1 500 100 3300 200 2400
3 3 2 >1100 200 6400 100 1800

a)Calculados a partir de los datos de Man (1975)
b)En cada nivel de dilucin, inocular 1ml en cada uno de tres tubos de
medio.
Para calcular en NMP de las diluciones mayores que las que se sealan
multiplicar el NMP por el factor de dilucin apropiado de 10,100,1000 ,
etc. Por ejemplo , si se han seleccionado tubos provenientes de las
diluciones
10
-2
,10
-3
, 10
-4
, multiplicar por 10 , si de las diluciones
10
-3
, 10
-4
, 10
-5
multiplicar por 100 .


V. RESULTADOS
Muestra NMP de Coliformes Totales
1.-
2.-

VI. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO
1.-Por qu es importante este indicador microbiolgico para evaluar la
calidad microbiolgica de productos alimenticios?
2.-Qu importancia tiene para evaluar la calidad microbiolgica del
suelo y del agua?
3.-Qu indica la presencia de E.coli?
4.-Utilizando qu buenas prcticas de manufactura se podra evitar el
aumento del NMP de coliformes totales?

XI. BIBLIOGRAFA
1.- Bourgeois C.M. Microbiologa Alimentaria. Editorial Continental
S.A.1995.
2000.
Alimentos.

XII. ANEXOS



PRCTICA 10
NUMERACIN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS COAGULASA
POSITIVO

Morfologa
El S. aureus es un coco inmvil, de 0.8 a 1 micrmetro de dimetro,
que se divide en tres planos para formar grupos de clulas
irregulares semejantes a racimos de uvas. En extendidos de pus los
cocos aparecen solos, en pares, en racimos o en cadenas cortas.
Los racimos irregulares son caractersticos de extendidos tomados
de cultivos que se desarrollan en medios slidos, mientras que en
otros cultivos son frecuentes las formas de diplococos y en cadenas
cortas. Unas pocas cepas producen una capsula o capa de baba que
incrementa la virulencia del microorganismo.
El S. aureus es un microorganismo Grampositivo pero las clulas
viejas y los microorganismos fagocitados se tien como
gramnegativos.

II. OBJETIVOS
Determinar la numeracin de staphylococcus aureus en muestras
de alimentos.


Diferenciar dentro del gnero de staphylococcus las especies no
patgenas y la patgena.

1. Los requisitos necesarios para la preparacin y dilucin de la muestra
de alimento
2. Placas de Petri de vidrio (100x 15mm) o de plstico de 90 x 15mm.
3. Pipetas de1ml graduadas al 0.1
4. Extensores de vidrio
5. Bao de agua regulado a 44-46C
6. Incubadora regulada a 35-37C
7. AGAR SAIR- PARKER
8. Caldo de cerebro-corazn
9. Tubos de 75 x 10mm contenido 0.3ml de plasma de conejo.
IV. PROCEDIMIENTO
1. Preparar diluciones

2. Pipetear 0. 1ml del homogenizado y las diluciones por duplicado en
la superficie de las placas de Agar BAIRD PARKER previamente
secadas y, distribuir cada inoculo con un extensor de vidrio hasta que
la superficie del medio aparezca seca.


3. Incubar las placas en posicin invertida a 371C durante 30-48horas.
4. Despus de 30 horas de incubacin seleccionar las placas que
representan entre 20 y 200 colonias y contar todas aquellas colonias
negras y brillantes con borde blanco angosto rodeadas de zonas
claras que contrastan con el medio opaco. Estas colonias
corresponden a Staphylococcus aureus.
5. Marcar la posicin de las colonias a incubar las placas durante 18
horas adicionales.
6. Al final del periodo de incubacin (48horas) contar todas las colonias
con las caractersticas descritas anteriormente y adems aquellas
colonias negras brillantes con o sin borde blanco y sin zonas claras.
Someter un nmero significativo de colonias sospechosas (no menor
a 5) la prueba de la coagulasa. Algunas cepas de S. aureus pueden
aparecer rodeadas de zona opaca despus de 30 horas de
incubacin de 35-37C, para un gran nmero de cepas a veces no
muestra esta apariencia despus de 48 horas y someter a un nmero
equivalente de ellas a la prueba de la coagulasa. esta prueba servir
ABP
ABP
ABP ABP ABP


para distinguir aquellos cultivos de S. aureus (coagulasa positivo) de
S. epidermidis (coagulasa negativa) que puedan dar una apariencia
similar
7. PRUEBA DE LA COAGULASA
a) Sembrar las colonias seleccionadas en Caldo de cerebro
corazn e incubar a 35-37C. durante 20 a 24 horas.
b) Adicionar 0.1ml del cultivo a tubos de 75x10mm que contenga
0.3ml de plasma de conejo incubar a 35-37C.
c) Examinar despus de 4 horas de incubacin si el plasma ha
perdido su fluidez o se encuentra un cogulo ms o menos
grande. Si la reaccin es negativa, incubar los tubos a
temperatura de laboratorio y re-examinar despus de 24 horas.
Las diferentes reacciones de coagulasa se observan en la
tabla de puntuacin.
8. Calcular del total de colonias caractersticas, la proporcin de la
colonias positivas a las prueba de la coagulasa teniendo en cuenta la
dilucin empleada y expresar el nmero de Staphylococcus
coagulasa positivo por gramo o mililitro de muestra

V. RESULTADOS
Muestra Numeracin de Staphylococcus
aureus coagulasa positivo
1.-
2.-

VI. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO
1.-Cmo se aplica este indicador microbiolgico en la produccin de la
leche y productos lcteos?
2.-Cmo se aplica este indicador para evaluar la calidad del aire de los
talleres de produccin de alimentos?
3.-Cmo se aplica este indicador para evaluar la calidad de comidas
preparadas y productos de pastelera?
4.-Indique como se realiza la prueba de la coagulasa


IX. BIBLIOGRAFIA
S.A.1995.
2000.
Alimentos.

X. ANEXOS



PRCTICA 11
CONTROL HIGINICO DE SUPERFICIES MTODO DEL
ISOPADO O DE LAS TORUNDAS

Es importante aprender cmo realizar controles microbiolgicos
higinicos de superficies , envases , utensilios, superficies de
maquinarias , manos de los trabajadores y del aire del medio
ambiente ya que una parte muy significativa de la contaminacin de
procesos alimentarios se debe a implementos y material de
procesamiento.

II. OBJETIVOS
Realizar el control higinico sanitario de superficies en talleres de
produccin de alimentos.
Controlar la limpieza de indumentaria y manos de los
trabajadores.
Realizar el control microbiolgico del agua y del aire del medio
ambiente.

1. Incubadoras a 35-37C, 29-31C, 20-24C.
2. Torundas de algodn con vstago de macera, estriles (3para
cada rea)
3. Plantillas de aluminio, con rea delimitada del

Estriles.
4. Pipetas bacteriolgicas de 1ml, graduadas a 0.1ml
5. Extensores de vidrio
6. Tubos que contiene 10ml de agua peptonada al 0.1
7. Placas con agar cuentagrmenes BAM.
8. Placas con agar VRBA o ENDO


9. Placas con agar OGA
10. Placas con agar selectivo para enterococos.

IV. PROCEDIMIENTO
1. Humedecer la torunda del algodn en el agua peptonada.
2. Colocar la plantilla de de aluminio sobre la superficie que se desea
controlar.
3. Pasar la torunda sobre la superficie delimitada por la plantilla en sentido
horizontal.
4. Depositar la torunda en el agua peptonada rompiendo el vstago por
debajo de la parte que est en contacto con los dedos, agitar l tubo para
dispersar el contenido.
5. Tomar una segunda torunda y proceder segn los pasos 1-4, frotando la
superficie en sentido vertical.
6. Tomar una tercera torunda y seguir los paso 1-4, frotando la superficie
en sentido diagonal.
7. Dejar en reposo las tres torundas durante 20minutos agitando de cuando
en cuando.
8. Depositar 0.1ml del diluyente sobre cada una de las placas
9. Distribuir el inoculo sobre la superficie del agar empleando un extensor
de vidrio
10. Incubar las placas a temperaturas adecuadas.

V. RESULTADOS
Muestra RTBAMV Numeracin
de Hongos
Numeracin
de levaduras
Numeracin
de coliformes
totales.
1.-

2.-

3.-



4.-

5.-

6.-

VI. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO
1.- Graficar los resultados obtenidos en las placas petri de las muestras
con las que se trabaj.
2.- Cmo se interpretan los resultados de los anlisis del aire del medio
ambiente?
3.-Qu importancia tiene analizar la superficie interna de los envases
para alimentos?
4.-Qu mtodos existen para analizar la superficie (piel ) de las
manos?
5.-Qu superficies se pueden analizar en un taller de elaboracin de
alimentos mediante el mtodo del hisopado?

IX. BIBLIOGRAFA
S.A.1995.
2000.
Alimentos.

X. ANEXOS



PRCTICA 12
DETECCIN DE SALMONELLA

I. FUNDAMENTO TERICO
El gnero Salmonella pertenece a la familia de las enterobacterias y
constituye un grupo muy complejo de microorganismos patgenos para
el hombre, pudiendo afectar a diversos animales.
La Salmonella es un bacilo en forma de bastoncillo, negativa a la tincin
de Gram, que puede causar enfermedades diarreicas en los humanos.
Los miembros del genero salmonella son bacilos gran negativos, de 0.7
1.5 x 2- 5um no fermentadores de lactosa, anaerobios facultativos, no
esporulados generalmente mviles por flagelos peritricos.
Las salmonellas se multiplican bien en medios ordinarios, las
salmonellas crecen en un amplio rango de temperatura de 1 -28C y su
pH ideal para su crecimiento es entre 6.6-8.2, son incapaces de tolerar
altas concentraciones de sal, y sobreviven en agua congelada durante
periodos prolongados.

II. OBJETIVOS
Investigar la presencia de Salmonella en muestras de alimentos.
Diferenciar Salmonella y Shigella del gnero Proteus.
Estudiar las enterobacterias lactosa negativas , mediante la
utilizacin de medios de cultivo apropiados y pruebas
bioqumicas.

1. Frasco con 225ml de caldo peptonado bufferado o caldo lactosado.
2. Tubos con 10ml de caldo de enriquecimiento selenito-cistina
3. Tubos con 10ml de caldo de enriquecimiento tetrationato seg.
MULLER-KAUFFMANN
4. Placas con Agar SS (salmonella shigella), o agar bismuto sulfito
seg. WILSON BLAIR.


5. Placas con agar BPL (agar verde brillante - rojo fenol- lactosa seg.
KAUFFMANN).
6. Tubos con agar hierro tres azucares TSI.
7. Tubos de solucin salina (0.85% NaCl).
8. Antisuero polivalente 0 (somtico)
9. Pipetas de 10ml
10. Portaobjetos para la prueba serolgica.
11. Asas y agujas de inoculacin.
12. Bao de agua caliente regulada a 43 (+/- 0.1C) o incubadora
regulada a 35-37C.

IV. PROCEDIMIENTO
Los mtodos para el aislamiento de salmonella se consideran en los
siguientes pasos
1. Enriquecimiento no selectivo:
Pesar 25g de muestra, sembrar 225ml de caldo de enriquecimiento
caldo peptonado bufferado o alternativamente en 225ml de caldo
lactosado. Incubar a 35-37C por 16-24 horas. Este paso es
indispensable para alimentos desecados y liofilizados
2. Enriquecimiento selectivo:
Llevar 1ml del cultivo anterior a 10ml de caldo de enriquecimiento
selenito y a 10ml de caldo de enriquecimiento de tetrationato seg.
MULLER y KAUFFMANN. Incubar a 43C por 24horas. O suspender
directamente en 100ml de caldo tetrationato unos 10g del material
objeto de investigacin, incubar a 43C durante 18-24horas a 37C
durante 48horas.

3. Aislamiento de placas de agar selectivo:
Partir de los cultivos de incubados realizar siembras por estras sobre
agar BPL y sobre agar SS. Incubar a 35-37C el agar BPL durante
24horas y el agar SS 18-24horas a 37C.

Examinar las placas: el agar BPL las colonias sospechosas de
salmonella son incoloras de un color intermedio entre rosa y el fucsia


o entre traslucidos y opacas y el medio que los rodea vara entre
rosceo a rojo. En el agar SS son incoloras y transparentes o
transparentes con centro negro. En el agar bismuto sulfito son pardas,
grises y negras y presentan a veces un brillo metlico, el medio que
las rodea es por lo general oscuro al principio volvindose ms tarde
negro a medida que aumenta el periodo de incubacin.

a. Pruebas bioqumicas:
Elegir dos o ms colonias sospechosas de cada placa. Si se
trabaja con agar BPL y agar bismuto sulfito, purificar en placas con
agar MAC MONKEY. Sembrar en agar nutritivo inclinado. Incubar
a 35- 37C por 24horas. Comprobar la dureza de los cultivos
mediante la coloracin gran, realizar prueba TSI. Si se trabaja con
el agar BPL y SS, realizar directamente la prueba TSI y dems
pruebas bioqumicas.
Prueba TSI: degradacin lactosa, sacarosa, glucosa, produccin de
gas y H
2
S; en el medio de cultivo en tubos de agar inclinado de
hierro de tres azucares, el cual se inocula por puntura y estra se
incuba a 35-37C por 24horas.
Reacciones positiva:
Parte inclinada: reaccin alcalina (color rojo), lactosa y sacarosa
negativa. Parte columnar: reaccin acida (color amarillo), glucosa
positivo con o sin produccin de H
2
S.
b. Prueba serolgica:
Tcnicas para la reaccin con el antisuero polivalente o somtico
en portaobjetos.
1. Ensayar primero el antisuero con cultivos testigos a fin de
comprobar su eficacia.
2. Usando un marcador de vidrio dividir la lmina portaobjetos
en dos secciones de 1x2cm.
3. Depositar una pequea cantidad de cultivo joven en agar
nutritivo en la parte superior de cada una de las secciones
marcadas.


4. Depositar una gota de una de una solucin de cloruro de
sodio al 0.85% estril en la parte inferior de cada seccin
marcada. Con una aguja de inoculacin estril emulsificar el
cultivo con la solucin salina en cada una de las secciones.
5. Aadir una gota de antisuero Salmonella polivalente 0 a uno
de los cultivos emulsificados y mezclar con un asa o aguja
estril.
6. Imprimir al portaobjetos movimientos de balance adecuados
durante 1 minuto hasta conseguir la mezcla completa.
7. Observar la reaccin sobre un fondo oscuro.
a. Si se produce una aglutinacin en la mezcla cultivo-
solucin salina-suero y en la mezcla cultivo solucin
salina se considerara como prueba positiva.
b. Se considerara como prueba negativa si se produce
aglutinacin en la mezcla cultivo solucin salina.
Estos cultivos debern probarse con antisuero
polivalente H (flagelar).
c. Se considerara no especifico sino produce
aglutinacin n ambas mezclas. En este caso ser
necesario recurrir a las pruebas adicionales descritas
por EDWARDS y EWING 1972.

V. RESULTADOS
1.-En Caldo Tetrationato.

2.-En Agar BPLS

3.- En Agar SS



4.-Pruebas bioqumicas:
TSI LIA Caldo rea

VI. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO
1.- Cules son los principales gneros de enterobacterias lactosa
negativas que se desarrollan en los alimentos y en cules?
2.-Mediante qu pruebas bioqumicas se pueden diferenciar Proteus de
Salmonella y Shiguella en el agar SS.
3.-Qu enfermedades puede causar Salmonella en el ser humano?
4.-Qu caractersticas poseen las colonias de Salmonella en el agar
SS.
5.- Qu otros agares se utilizan para el reconocimiento de Salmonella?
6.-Qu indican las normas sobre la presencia de Salmonella para un
producto alimenticio terminado?

IX. BIBLIOGRAFA
S.A.1995.
2000.
Alimentos.

X. ANEXOS

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