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Avances en el Diagnstico Molecular: reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real
Esta tecnologa naci en los aos 90 cuando Higuchi y
colegas (6, 7) en Roche y Chiron realizaron la primera
reaccin de PCR en tiempo real utilizando el marcador
fluorescente BrEt (bromuro de etidio) el cual aumenta su
fluorescencia al unirse al ADN y siguieron la reaccin de
PCR con una videocmara. Subsiguientemente, esta
tecnologa madur rpidamente en un mercado
competitivo; esto es evidenciado por el nmero de
compaas que ofrecen equipamiento y reactivos para
PCR en tiempo real y la cantidad creciente de
publicaciones cientficas que incluyen esta metodologa.
El primer equipamiento para realizar PCR en tiempo real
fue comercializado en 1996 por Applied Biosystems,
posteriormente se fueron incorporando distintas
empresas como BioGene, Bioneer, Bio-Rad, Cepheid,
Corbett Research, Idaho Technology, MJ Research,
Roche Applied Science, y Stratagene.
En la PCR en tiempo real, los procesos de amplificacin y
deteccin se producen de manera simultnea dentro del
mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna accin
posterior. Adems, mediante deteccin por fluorescencia
se puede medir durante la amplificacin la cantidad de
ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisin de
fluorescencia producida en la reaccin es proporcional a
la cantidad de ADN formado. Esto permite conocer y
registrar en todo momento la cintica de la reaccin de
amplificacin (6,7). Los termocicladores para llevar a
cabo la PCR en tiempo real incorporan un lector de
fluorescencia y estn diseados para poder medir, en
cualquier momento, la fluorescencia emitida en cada uno
de los viales donde se realice la amplificacin.

Introduccin
En los ltimos aos, la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) en tiempo real Real Time PCR ha
surgido como una metodologa robusta y extensamente
utilizada para la investigacin biolgica ya que puede
identificar y cuantificar cantidades muy pequeas de
cidos Nucleicos (ADN y ARN) en forma especfica.
Como herramienta de investigacin su importancia se
debe a que su tecnologa permite determinar en forma
rpida y exacta cambios en la expresin gnica
resultantes de fenmenos fisiolgicos o patolgicos. De
esta manera es posible correlacionar la fisiopatologa con
los eventos moleculares lo que permite un mayor
entendimiento de los procesos biolgicos. Esta
metodologa se basa en la reaccin de PCR desarrollada
por Kary Mullis en la dcada de los 80, que permiti a los
investigadores amplificar grandes cantidades de ADN en
forma especfica (1- 3). Las diferentes metodologas que
aplican la PCR han propulsado a la biologa molecular
hacia delante, permitiendo a los investigadores manipular
el ADN, facilitando procedimientos comunes, como el
clonado, y permitiendo grandes emprendimientos como
el Proyecto Genoma Humano (4, 5). La PCR en tiempo
real representa otro salto tecnolgico que ha generado
nuevas expectativas para los investigadores, esto es en
parte porque la enorme sensibilidad de PCR ha sido
emparejada a la precisin proporcionada con la
deteccin en tiempo real de los productos de la PCR.

,

1 2 3 4
Dres. Sergio Lejona Maria Silvina Benetti Fabin Fay Oscar Fay
Laboratorio CIBIC. Centro de Diagnstico Mdico de Alta Complejidad S.A. Rosario. Argentina
1
Responsable rea Investigacin y Desarrollo
2
Responsable rea Biologa Molecular
3
Director Ejecutivo
4
Director General
Rosario, Argentina
slejona@cibic.com.ar
Abstract
In recent years, real-time polymerase chain reaction
(RT-PCR) has emerged as a robust and widely used
methodology for biological investigation because it can
detect and quantify very small amounts of specific
nucleic acid sequences. As a research tool, a major
application of this technology is the rapid and accurate
assessment of changes in gene expression as a result of
physiology or pathophysiology. For clinical molecular
diagnostics, real-time PCR can be used to measure viral
or bacterial loads or evaluate cancer status.
Key words: real-time polymerase chain reaction -
fluorophore - viral load
Resumen
En los ltimos aos, la reaccin en cadena de la
polimerasa en tiempo real (RT-PCR) ha surgido como
una metodologa robusta y extensamente utilizada para
la investigacin biolgica porque puede diferenciar y
cuantificar cantidades muy pequeas de Acidos
Nucleicos (ADN y ARN). En el rea de la investigacin
bsica, una de sus mayores aplicaciones es la
evaluacin rpida y exacta de cambios en la expresin
gnica como resultado de procesos fisiolgicos o
patolgicos. Para el diagnstico clnico, la reaccin en
cadena de la polimerasa en tiempo real puede ser
utilizada para medir las cargas vrales o bacterianas o
evaluar el estado de diferentes tipos de cncer.
Palabras clave: reaccin en cadena de la polimerasa
en tiempo real - fluoroforo - carga viral
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Sistemas de deteccin por fluorescencia empleados
en la PCR en tiempo real
Agentes intercalantes: son fluorocromos que aumentan
notablemente la emisin de fluorescencia cuando se
unen a ADN de doble hlice. El ms empleado en PCR en
tiempo real es el SYBR Green I el cual aumenta en ms
de 1000 veces su fluorescencia cuando se une al surco
menor del ADN (8). El incremento de ADN en cada ciclo
se refleja en un aumento proporcional de la fluorescencia
emitida (Figura 1). Este sistema de deteccin tiene la
ventaja de que la optimizacin de las condiciones de la
reaccin es muy sencilla, pero el principal inconveniente
de los agentes intercalantes es su baja especificidad,
debido a que se unen de manera indistinta a productos
generados inespecficamente o a dmeros de cebadores,
muy frecuentes en la PCR.
Molecular beacons son sondas parecidas a las
anteriores. Tienen una molcula donadora (reporter) en
el extremo 5' una aceptora (quencher) en el extremo 3' ,
pero, adems presentan una estructura secundaria en
forma de asa, en la que reside la secuencia de unin
SYBR Green I Unido
Florescencia (+)
SYBR Green I Libre
Florescencia (-)
Sondas de hibridacin especficas: estas sondas
estn marcadas con dos tipos de fluorocromos, un
donador y un aceptor. El proceso se basa en la
transferencia de energa fluorescente mediante
resonancia (FRET) entre las dos molculas. Las ms
utilizadas son las sondas de hidrlisis, denominadas
tambin sondas TaqMan, las molecular beacons y las
sondas FRET.
Sondas de hidrlisis (Taqman) son oligonucletidos de
unin especfica al ADN diana marcados con un
fluorocromo donador (reporter) en el extremo 5' que
emite fluorescencia al ser excitado y un aceptor
(quencher) en el extremo 3' que absorbe la fluorescencia
liberada por el donador. Para que esto ocurra, las
molculas donadora y aceptora deben estar
espacialmente prximas. Adems, el espectro de
emisin de la primera se ha de solapar con el espectro de
absorcin de la segunda. Mientras la sonda est intacta,
la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por
el aceptor (Figura 2A). Sin embargo, durante la
amplificacin de ADN blanco, la Taq polimerasa al
desplazarse a lo largo de la cadena en su accin de
sntesis, que tiene actividad 5' exonucleasa, hidroliza el
extremo libre 5' de la sonda, producindose la liberacin
del fluorocromo donador (Figura 2B). Como donador y
aceptor estn ahora espacialmente alejados, la
fluorescencia emitida por el primero es captada por el
lector (Figura 2C).
Figura 1: Mecanismo de accin del SYBR Green I
A
B
C
Figura 2: Mecanismo de accin de las sondas Taqman
especfica con el ADN blanco. Los extremos permanecen
plegados cuando la sonda no est hibridada, lo que
conlleva que donador y aceptor estn muy cerca uno de
otro. En esta conformacin la fluorescencia emitida por el
donador es absorbida por el aceptor y no es captada por
el lector del equipo. Sin embargo, al hibridar con el ADN
diana la sonda se abre, alejndose donador y aceptor,
pudiendo ser detectada la fluorescencia emitida por el
primero (Figura 3).
Figura 3: Mecanismo de accin de las Molecular beacons
Sonda
ADN diana
Mol beacons
Sondas FRET el sistema se compone de dos sondas que
se unen a secuencias adyacentes del ADN diana. Una de
las sondas lleva un donador (reporter) en el extremo 3' y
la otra un aceptor (quencher) en el extremo 5'. Cuando las
sondas estn hibridadas, los dos fluorocromos estn
prximos. Al ser excitado el donador transfiere su energa
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Biosystems y Roche Diagnostics (Tabla 1). Las
diferencias ms importantes entre estos equipos hacen
referencia a la rapidez y al nmero de muestras que se
pueden procesar al mismo tiempo. El nmero de canales
de lectura que presentan los equipos tambin es
importante. Disponer de varios canales de lectura
permite detectar la emisin de distintos fluorocromos a la
vez. De esa manera, se pueden usar varias sondas
marcadas con distintos fluorocromos, para identificar
diferentes tipos de ADN blanco en la misma reaccin
(PCR mltiple) o incorporar controles internos a la
reaccin, para detectar la presencia de inhibidores.
Formatos de PCR a tiempo real.
Amplificacin y deteccin de ADN o ARN blanco
en la muestra.
PCR mltiple.
Cuantificacin del ADN o ARN blanco en la
muestra.
Se puede cuantificar la concentracin inicial de
ADN (o ARN) blanco en la muestra de manera
muy sencilla, aadiendo simplemente controles
externos con concentraciones conocidas y
crecientes de ADN blanco (curva patrn) en la
tanda de amplificacin. En la PCR en tiempo real
el programa informtico va registrando el
incremento de fluorescencia (proporcional al
aumento de ADN) en cada ciclo y esta
informacin se refleja grficamente en curvas de
cintica de la reaccin para cada una de las
muestras y controles. Por tanto, se puede
controlar la amplificacin en las fases iniciales,
cuando la concentracin de los reactivos todava
no es limitante y el efecto de la variabilidad en la
eficiencia de amplificacin es menos importante.
Para cada muestra el programa informtico
calcula el nmero de ciclo en el que el lector
empieza a detectar un incremento de
fluorescencia significativo, con respecto a la seal
de base. El ciclo en el que se empieza a detectar
el aumento de fluorescencia se denomina punto
de corte (Cp o crossing point) o ciclo umbral (Ct, o
al aceptor que, a su vez, emite la fluorescencia que
detecta el lector del equipo (Figura 4).
A
B
Lector
En todos estos sistemas, el incremento de ADN en cada
ciclo se corresponde con un aumento de hibridacin de
las sondas, lo que conlleva un aumento en la misma
proporcin de fluorescencia emitida. El empleo de
sondas garantiza la especificidad de la deteccin y
permite identificar polimorfismos o mutaciones
puntuales.
Equipos para PCR en tiempo real
Estn compuestos por un termociclador y por un lector de
fluorescencia y diseados para poder efectuar la lectura
de la fluorescencia emitida en cada uno de los viales
usados y en cualquier momento de la reaccin. Los ms
utilizados son los equipos fabricados por Applied
Figura 4: Mecanismo de accin de las sondas FRET
Instrumento Fabricante Sistema Tcnico
Tiempo
de Reaccion
Capacidad
Serie GeneAmp
Applied
Biosystems
Convencional 2 hs. 96
Serie AbiPrism
Applied
Biosystems
Convencional 2 hs. 96
ICycler iQ Bio Rad Convencional 3 hs. 96-384
Light Cycler Roche Aire 20-60 min 32
Smart Cycler Cepheid Ceramica 40-60 min 16-96
MX4000 Stratagene Convencional 90 min 96
Rotor Gene Corbett Aire 50 min 32
Tabla 1
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threshold cycle) y es inversamente proporcional a
la concentracin inicial de ADN blanco presente
en la muestra. Con las concentraciones
previamente conocidas de los controles externos
y sus Cp correspondientes se dibuja una curva
patrn. Interpolando en ella los valores de los Cp
de cada muestra problema se puede inferir su
concentracin de ADN inicial (Figura 5).
Anlisis de curvas de disociacin:
Se basa en la aplicacin de un gradiente de
temperaturas creciente despus de la PCR para
monitorizar la cintica de disociacin de los
fragmentos amplificados. Mediante esta
aplicacin se puede determinar la Tm de los
amplicones para comprobar su especificidad.
Tambin permite el anlisis de mutaciones
puntuales, que se puede abordar de diferentes
maneras. Un enfoque sencillo consiste en usar
una sonda complementaria con el ADN blanco de
tipo salvaje, que abarque la posicin del
polimorfismo. El hbrido formado entre sonda y
ADN de tipo salvaje tendr una estabilidad mayor
que el formado entre la sonda y el ADN mutado,
puesto que en este caso la complementariedad
no es absoluta. La mayor estabilidad de la unin
entre la sonda y el ADN salvaje se reflejar en un
Tm superior. Las diferencias en la temperatura de
disociacin de los hbridos nos permitir
discriminar perfectamente entre el ADN de tipo
salvaje y el de tipo mutado, pudindose
establecer adems, de forma relativa la cantidad
de ambos (Figura 6).
Ventajas de la PCR en tiempo real
La primera gran ventaja de la PCR a tiempo real es su
rapidez, puesto que no se necesita ningn proceso
adicional de deteccin. Si el equipo empleado es el Light
Cycler o equivalente, esta ventaja todava es ms
acusada, pudindose completar el proceso de
amplificacin y deteccin en 30-40 min. Adems, gracias
a su rapidez, estos equipos se pueden rentabilizar al
mximo, permitiendo un flujo mucho mayor de muestras
y de ensayos. Otra ventaja muy importante de la PCR a
tiempo real es que al utilizar sistemas cerrados, el riesgo ,
Figura 5: Curvas de cintica de reaccin
Figura 6: Curvas de disociacin
de contaminacin disminuye de forma muy importante.
Los sistemas a tiempo real permiten cuantificar la
concentracin inicial de cido nucleico presente en las
muestras de manera mucho ms sencilla, ms precisa y
sobre todo en un rango mucho mayor (5-6) que en los
procedimientos convencionales (2-4). Asimismo, la
determinacin de mutaciones puntuales que pueden
estar relacionadas con resistencias a medicamentos
antimicrobianos o con factores de virulencia, es mucho
ms fcil. Los equipos para PCR a tiempo real tienen una
capacidad muy elevada ya que en el mismo instrumento
se pueden llevar a cabo ensayos cualitativos
cuantitativos, determinacin de mutaciones, PCR
mltiple, etc., mientras que para los procedimientos
convencionales se requieren mltiples equipos.
Aplicaciones de la PCR en tiempo real en el
Diagnstico Biomdico
Microbiologa (9,10)
a) Diagnstico e identificacin de patgenos
b) Medicin de Cargas virales y bacterianas
c) Identificacin de resistencia a los tratamientos
(aparicin de cepas mutantes)
d) Genotipificacin
Oncologa/Oncohematologia (11- 15)
a) Medicin de la expresin de genes
relacionados con diferentes tipos de tumores con
valor diagnstico, pronstico y predictivo de
respuesta al tratamiento
b) Determinacin y cuantificacin de diferentes
translocaciones causantes de desrdenes
oncohematolgicos.
Gentica Humana (16 - 19)
a)Determinacin de mutaciones y polimorfismos
causantes de enfermedades genticas y de
predisposicin gnica
b) Determinacin y cuantificacin de variantes
alelicas (polimorfismos) relacionadas con
diferente respuesta a drogas (frmacogenetica)
,
Avances en el Diagnstico Molecular: Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real
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