PCR:Reaccinencadenadelapolimerasa

GonzaloGreif.
UnidaddeBiologaMolecular.InstitutPasteurMontevideo
ndice:
Historia
LaReaccinencadenadelapolimerasa(PCR)
Algunostipsexperimentales
VariantesdelaPCR
Unavarianteespecial:PCRentiemporeal

1. Historia
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en ingls: Polymerase chain reaction) fue
concebidaporelDr.KaryMullis(verrecuadro)aprincipiosdeladcadadel80.Sibiensediscutequeen
el desarrollo final de la tcnica participaron varios investigadores y que el proceso para la puesta a
punto de la tcnica involucr varios aos, hay un consenso que la idea original fue desarrollada por el
Dr. Mullis, y por ello obtuvo el premio Nobel unos aos ms tarde. En el libro Making PCR: a story of
biotechnology, Paul Rabinow cuenta en detalle los acontecimientos histricos que dieron lugar a la
invencindelatcnica.
Segn cuenta en su pgina web (www.karymullis.com), la primera idea surgi en la medianoche de un
viernes en abril de 1983, conduciendo con su Honda gris entre Cloverdale y Boneville e imaginando la
reaccin. La historia completa se encuentra
contada de forma muy potica en su pgina
web.
Hasta ese momento obtener cantidad
suficiente de ADN puro para realizar
experimentosconstitualaetapalimitante.La
aparicin de las enzimas de restriccin en la
dcadadel70yeldesarrollodelatecnologa
del ADN recombinante a fines de los 70
haban hecho posible la obtencin de
fragmentos precisos de cidos nucleicos para
ser estudiados en detalle. Sin embargo, la
invencin de la reaccin en cadena de la
polimerasa produjo un salto tecnolgico,
permitiendo a los investigadores producir
cantidades ilimitadas de ADN especfico, sin
depender del clonado de fragmentos de ADN
en organismos vivos. Por otra parte la PCR
mostr tanta versatilidad, que ao a ao se
fueron desarrollando nuevas aplicaciones y
variantes. Hoy es una herramienta
KaryMullis(1944).
KaryBanksMullisnacien1944enLenoir,Carolinadel
Norte.EstudienelInstitutodeTecnologadeGeorgiay
en1972obtuvoundoctoradoenbioqumicadela
UniversidaddeCalifornia,Berkeley.Luegodeun
posdoctoradoenlaUniversidaddeSanFrancisco,se
incorporalaCorporacinCetuscomoqumico.Enlos7
aosqueestuvoall(19791986)trabajenlasntesisde
oligonuclotidosydesarrollelconceptodelaPCR.
En1986fuedesignadodirectordebiologamolecularen
XytronyxInc.enSanDiego,dondecontinusutrabajoen
tecnologasdeADNyfotoqumica.
En1993recibielpremioNobelporsuinvencindela
reaccinencadenadelapolimerasa.Elprocesoque
Mullisconceptualizen1983,esunodelosprincipales
avancesdelabiologamoleculardelsigloXX.
ActualmenteesunInvestigadorenelHospitaldeNiose
InsitutodeInvestigacinenOakland.Viveconsuesposa,
enCoronadelMaryenAndersonValley,California.
Fuente:www.karymullis.com
fundamen
2. El
La PCR e
determina
mezcla co
copias,(ii
regin qu
(una ADN
(retrotran
cadenas n
fragmento

Figura1.D
2004:Gua

ntalencualqu
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es una tcnic
ada de ADN
ompleja de c
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ue se desea a
N polimerasa
nscripcin seg
nacientes de
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uierlaborator
laReaccine
ca enzimtic
situada entr
cidos nucleic
ucletidos(ce
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guida de PCR
ADN (Figura
mprendidoen
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elatcnicade
riodebiolog
encadenade
ca in vitro u
e dos region
os. Para ello
ebadoresopr
i) una enzim
na ADN pol
R) y (iv) los d
a 1). El resul
ntrelosdoso
CRenlosprime
PCR).
amolecular.
lapolimeras
tilizada para
nes de ADN,
requiere: (i)
rimers)espec
a capaz de s
imerasa ARN
deoxinucleti
ltado de la r
ligonuclotid
eros3ciclosde

sa(PCR).
a amplificar
cuya secuen
el molde a p
cficoscomple
sintetizar AD
N dependien
idos (dNTPs)
reaccin son
dosespecfico
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exponencialm
cia se conoc
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N utilizando
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varios millo
os.
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dela
e ADN
TPCR
a las
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ar,
Generalm
fase, deno
presente
fase exp
(figura1)

En la tab
fragmento
al cabo d
fragmento
sucede e
exponenc

Engenera
a.
b
Figura2.C
PCRgrafica
amplificac
mente,lareac
ominada fas
en la reacci
onencial, en
yporltimo,
bla 1 se mue
oespecficoe
e 30 ciclos se
o amplificad
en la reacci
cial).
alcadaciclod
. Desnatura
seseparan
asegurar q
segundop
. Anillado o
que los ol
CinticadelaP
andolacantida
in.
Tab
frag
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n), dnde no
n la cual en c
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estra la ampl
encadaciclo.
e obtienen e
o (aunque l
n, permite
delareaccin
lizacin:ene
n.Estoselogr
que todas las
paso.
annealing: e
igonucletido
PCR.Enlagrfic
addeADNgen
la1.Amplifica
gmentosprodu
unacopianica
lificacindeP
os primeros 5
o se produce
cada ciclo se
eau,enlacu
lificacin exp
.Partiendode
en teora 1 bi
a tabla no
visualizar e
sedivideen
estaetapa,el
raaumentand
s molculas s
en esta etapa
os cebadores
casemuestran
neradaenfunc
cinexponenc
ucidostericam
adeADNmold
PCRsedescri
510 ciclos (de
en todava los
duplican los
ualnoseprod
ponencial y l
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illn de mol
contempla r
el poder de
3partes(figu
ADNmolde
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se encuentran
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que delimita
nlasdiferentes
cindelosciclo
cial.Latablain
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fragmentos
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a duplicacin
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realmente lo
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ura3):
doblecaden
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n en simple
tura de la rea
an el fragme
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s especficos.
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hebra y perm
accin dismin
nto que se d
Ciclo
adde
rtiera
rsticos.Lapr
ad de molde
La segunda,
en el ciclo an
iguras1,2).
ralizaysush
enerala94
o
C
mitir que ocu
nuye para pe
desea amplific
Copiasd
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20 1
21 2
22 4
23 8
24 16
25 33
26 67
27 134
28 268
29 536
30 1073
imera
inicial
, es la
terior
hebras
Cpara
urra el
ermitir
car se
deADN
2
4
8
16
32
64
128
256
512
1024
2048
4096
8192
16384
32768
65536
131072
262144
524288
1048576
2097152
4194304
8388608
6777216
3554432
7108864
4217728
8435456
6870912
3741824
unan a su regin blanco. La temperatura de unin de los cebadores depender de la
composicindebasesdelosmismos(verapartado:Cebadores).
c. Extensin: en este paso, la temperatura de la reaccin es aquella que permite la actividad
ptimadelaenzimapolimerasapresenteenlareaccin(verapartado:ADNPolimerasas).

Cebadores:
Los cebadores o iniciadores de la reaccin son
oligonucletidos cortos (entre 18 y 30
nucletidos), complementarios a la secuencia
blanco que se desea amplificar. Se utilizan dos
cebadores en cada reaccin, cada uno
complementario a uno de las hebras del ADN
molde, delimitando la regin que se desea
amplificar.Amododeejemplo:

Delasecuenciadeestoscebadoresdependerla
especificidaddelareaccin.Veintenucletidos
permiten una alta especificidad? Una molcula
de ADN puede contener 4 tipos de nucletidos:
A, T, C o G. La probabilidad de encontrar cada
uno de ellos es 1/4=0,25, entonces la
probabilidaddeencontrarunadeterminadaden
bases es (0,25)
n
. Un cebador de 20 bases, tiene
en teora una probabilidad de (0,25)
20
=9,9e13
de ser encontrada por azar. La respuesta a la
preguntaplanteadamsarriba,entonces,ess.
Temperatura de anillado. En el segundo ciclo de
lareaccindePCR,latemperaturautilizadaestal
que permite la unin de los cebadores a su
secuenciablanco.Estatemperaturasedetermina
dependiendo de la temperatura de
desnaturalizacin o melting de los mismos. La
temperaturadedesnaturalizacin(Tm)sedefine
como la temperatura a la cual el 50% de las
molculas se encuentran desnaturalizadas. Hay
varios algoritmos que permiten calcular dicha
temperatura. En la prctica, una frmula muy
utilizada es la siguiente: Tm=4(G+C)+2(A+T), (ej:
para la secuencia AGGTCGTGCA, la
Tm=4(4+2)+2(2+2)=32C, y en general se utiliza
estatemperaturamenos5grados,comoprimera
aproximacinalatemperaturadeanillado.
5.AATCGTAGCTACCGTCGAC..3
3.TTAGCATCG.ATGGCAGCTG..3
5 AATCGTAGC
ATGGCAGCTG5
Directo
Reverso
ADNPolimerasas:
Las ADN polimerasas son enzimas que
intervienen en la replicacin del ADN. Son
capaces de adicionar dNTPSa partir de la regin
3 de un cebador y copiar una secuencia molde.
LaspolimerasassintetizanelADNenladireccin
5' a 3'. Ninguna ADN polimerasa conocida es
capaz de comenzar una nueva cadena. Ella slo
puede aadir un nucletido en un grupo 3'OH
queyaexiste.Porestaraznlaenzimaprecisaun
cebador que presente un grupo 3' OH al cual
puede aadir el primer nucletido. Las ADN
polimerasas requieren Magnesio como cofactor
paraserfuncionales.
Eneldesarrollodelatcnica,laenzimautilizada
era una polimerasa aislada de E.coli (fragmento
KlenowdelaADNpolimerasaI),quepresentasu
actividadptimaa37
o
C,yseinactivaa94
o
C,es
por ello que en cada ciclo era necesario agregar
ms enzima. Luego, se sustituy por una
polimerasa termoestable aislada de Thermus
aquaticus (Taq), una bacteria termfila que vive
en la proximidad de las fuentes de agua termal
(entre 50 y 80
o
C), es por esto que su enzima
polimerasaesmsestable,ypermitesoportarlas
temperaturas elevadas durante los ciclos de la
PCR.
En la actualidad se han descrito y utilizado
diferentes polimerasas en la reaccin de PCR. La
eleccin de la enzima depender de factores
tales como: la fidelidad de la enzima o tasa de
error (capacidad de producir errores o no
durante el copiado), la velocidad (cantidad de
nucletidos incorporados por segundo en la
cadena naciente de ADN), la procesividad
(capacidad de unirse al molde), la actividad
exonucleasa (capacidad de correccin de
errores),extremosdelADNresultante,etc.



Figura3.P

3. A
Conceptu
embargo
exitosa.E
Unareacc
Com
d
Tampn
Olig
Olig
Po
M
Agualib

Lacantida
Engenera
unaconce
Pasosdurantee
AlgunosTipse
almente, la
la puesta a p
nlapresente
a. Compo
cinconvenci
mponente
dNTPs
ndereaccin
godirecto
goreverso
limerasa
Molde
redeADNasa
addemolder
allostampon
entracinest
elciclodereac
experimental
tcnica de l
punto de una
eseccin,rep
onentes
ionaldePCRs
Concentra
ensoluc
2,5
1
10uM(1
10uM(1
5U
Dep
a
requeridadep
esdereacci
ndardeClo
ccindelaPCR
es:
la reaccin e
a reaccin en
asaremossom
sepuederea
acininicial
cinstock
5mM
10X
10pmol/uL)
10pmol/uL)
U/uL
pende

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nqueseincl
rurodeMagn
R.
en cadena d
n particular d
meramentea
lizarconlasig
Concentraci
enlareac
0,25m
1X
1a5u
1a5u
1U
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V
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uM
uM
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mula:
Volumenpara
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2
2
0,10,5
0,10,5
0,2
Depende
csp.20u
DNgenmico
mercialmente
ctividadcomp
mente sencill
aspectos, pa
os.
a20uL
e
L
o,plasmdico,
disponiblein
pletadelaen
a, sin
ra ser
etc).
ncluye
nzima.
La concentracin de MgCl
2
presente en la reaccin es una de las variables con las cuales se pueden
ponerapuntoalgunasreacciones.
Enlarealizacindelareaccin,unpuntoimportanteeslahomogenizacindelosreactivos.Lasenzimas
seencuentranenglicerollocuallashacemsdensasytiendenaestarenelfondodeltubodereaccin.
b. CiclosyTemperaturas:
Encuantoalaeleccindelosciclosylastemperaturas,losmismosdependerndelacantidadinicialde
lasecuenciadianaquesedeseaamplificarylascaractersticasdecomposicindebases,tantodelADN
blanco como de los cebadores. Tpicamente, una reaccin convencional utiliza 35 ciclos, siendo cada
etapadedesnaturalizacin,anilladoyextensinde 30segundos.Eltiempodeextensintambinvara
de acuerdo al tamao del fragmento que se desea amplificar y la velocidad de la enzima con la cual
estamos realizando la reaccin. Cuando los fragmentos que se desea amplificar son mayores a 5000
bases,laextensinpuedenecesitarde5a10minutos.Lastemperaturasdedesnaturalizacinutilizadas
sonengeneral94o95
o
C,yladeextensindependedelaenzimautilizada,comnmentesiseutilizala
Taq se recomienda una temperatura de extensin de 72
o
C. La temperatura de anillado es clave para
tenerxitoenlareaccin,estatemperaturadependebsicamentedelacomplejidaddelADNblancoy
lacomposicindebasesdeloscebadores(verapartado:Cebadores).
c. Diseodecebadores:
Unpuntoclavedelaoptimizacin,quizseldemayorimportanciapararealizarunareaccinexitosa,es
eldiseodeloscebadores.Algunospuntosaconsiderarsedetallanacontinuacin.Lasecuenciadelos
cebadoresdebertenerunacomposicindebasestalquesucontenidoGCseencuentreentre40y60
%(estodependerdelacomplejidaddelADNblancoapartirdelcualrealizaremoslaamplificacin,por
loquenosiemprelopodemosrespetar).Amboscebadoresdebentenerunacomposicindebases,oal
menos un contenido GC, y un largo similar. Estos factores estn implicados en la temperatura de
melting,quenodeberavariarmsde5
o
Centreuncebadoryelotro.Elextremo3delcebadoresmuy
importante y se busca que sea una base G o C (lo cual provoca mayor especificidad, debido a que son
bases que se unen mediante 3 puentes de hidrgeno, en contraste con A y T que se unen mediante 2
puentes de hidrgeno). En los extremos 5 de los cebadores, no es necesario que haya un 100 % de
complementariedadconlasecuenciablanco,dehechopuedenadicionarsecolasde10omsbasesque
luego permiten la clonacin de estos fragmentos o la secuenciacin con cebadores universales. Otro
puntoimportanteaconsiderareslacapacidaddeesoscebadoresdehibridarseconsigomismosoentre
s.Siuncebadorposeeunasecuenciapalindrmicainterna,puedeformarunahorquilla(plegarsesobre
s mismo por complementariedad) y de este modo no estar disponible en la reaccin. Adems, si los
extremos 3 de ambos cebadores son complementarios entre s, pueden dar lugar a dmeros de
cebadores,evitandoaslaamplificacindelfragmentodeseadoyamplificandonicamentelosdmeros.
Generalmente,estosdmerosseformaninespecficamenteyseobservancomofragmentosdeltamao
de la suma del largo de ambos cebadores. Finalmente, para evitar la amplificacin de secuencias
inespecficas, es importante chequear en bases de datos de secuencias de ADN (ej. GeneBank:
ww.ncbi.nlm.nih.gov)laposibilidaddeamplificacindeotrosblancos.
d. Otrasconsideraciones:
Otrospuntosatenerencuentasonlacalidadycantidaddelmoldeapartirdelcualqueremosrealizarla
amplificacin. Se recomiendan relaciones espectrofotomtricas 260/280 y 260/230 mayores a 1,82,0.
Estas medidas aseguran una buena calidad de ADN con baja contaminacin de protenas y otros
inhibidores.LautilizacindekitsdepurificacincomercialesfacilitalaobtencindeunADNoARN(enel
casodeunaRTPCR)debuenacalidadeliminandomuchosdelosposiblesinhibidoresdelareaccin.
e. Contaminacin:
UnpuntoclaveenlasreaccionesdePCReslaminimizacindelaposibilidaddecontaminacin.Debidoa
lasensibilidaddelatcnica(dadaporlaamplificacinexponencialdefragmentos),esnecesariotomarla
mayor cantidad posible de recaudos para evitarla. En primer lugar, lo ideal es trabajar en tres reas
diferentes,separadasenloposiblefsicamente,yalascualessedebeaccedersiguiendouncaminoenel
cualunavezllegadaalaltimareanoesposiblevolveratrs(flujounidireccional).Laprimeradelas
reas,consujuegodepipetasexclusivoyzonaUVparadescontaminacin,esparalarealizacindelas
mezclas de reaccin (en esta rea slodebemoshacer la mezcla que incluye el tampn de reaccin, la
enzima, los dNTPs, el agua y los cebadores), esta rea en general es conocida como rea de prePCR.
Unavezfinalizadaestaetapa,dondesepreparanlacantidaddereaccionesnecesariasparaeltrabajo,se
pasaalasiguienterea,dndenicamenteseagregaratuboatuboelADNmolde(reaPCR).Siempre,
debemos incluir un tubo blanco de reaccin que debe tener todos los componentes de la mezcla
excepto el molde, que sustituiremos con agua. Idealmente se pueden realizar 2 blancos, uno que
cerraremos en el rea de prePCR, que permite detectar si
hay contaminacin de los reactivos, y otro que dejaremos
abiertodurantetodalamanipulacinparaasegurarqueno
hubocontaminacindurantelamisma.Tambin,enelcaso
de contar con un control positivo, la incorporacin del
mismo en cada tanda de reacciones es recomendable. Por
ltimo se pasa al termociclador (ver apartado:
Termocicladores) y a la visualizacin de los fragmentos
amplificados (ver apartado: Visualizacin de productos de
PCR).EstaltimareaesconocidacomoreadepostPCR.
De acuerdo al flujo unidireccional, estos tubos nunca
debenpasaralreadeprePCR.Serecomiendatrabajarcon
tnicas diferentes en cada rea. Idealmente, tambin se
puede hacer uso de presiones diferenciales en las
diferentes salas para minimizar los problemas de
contaminacin. Como veremos ms adelante, la aparicin
de la PCR en tiempo real, minimiz uno de los mayores
problemas de contaminacin al evitar la apertura de los
tubos una vez finalizada la reaccin (principal fuente de
contaminacindereacciones).
Termocicladores:
Enloscomienzosdelatcnicanoexistan
equipos de PCR automatizados, por lo
cual se utilizaban diferentes baos
termostatizados (a las temperaturas de
desnaturalizacin, anillado y extensin) y
manualmente se cambiaban los tubos de
un bao a otro. El primer equipo
desarrollado, de hecho, nicamente
automatiz el cambio manual de tubos.
Los equipos actuales constan,
bsicamente, de un bloque de metal que
puede ser calentado o enfriado
rpidamente (generalmente mediante el
sistema peltier), con posibilidad de
programar las temperaturas, rampas de
subida y bajada de las mismas y los
tiempos de cada etapa de los ciclos, as
como la cantidad de ciclos. En general
presentan una tapa trmica que evita la
evaporacin de la mezcla de reaccin
durantelaetapadedesnaturalizacin.
Por ltimo, el trabajo siguiendo procedimientos y normas GLP (Good Laboratory Practices) es
recomendableparaevitarcontaminaciones.

4. VariantesdelaPCR
UnavezqueelusodelaPCRsemasific,apartirdeladcadade1990,hansurgidovariantesynuevas
aplicacionesalatcnica.Eldetalledecadavarianteescapaalafinalidaddelcaptulo,porlocualsolose
harmencinaalgunadeellasyexplicaradeformaresumida.
a. RTPCR:EsunavariantedelaPCRmuyutilizadaenlaqueseutilizaARNcomomoldeinicialenvezde
ADN,yempleaunatranscriptasareversa(unapolimerasadeADNARNdependiente)pararealizarla
sntesisdeunADNcomplementarioalARN(ADNc).Enestaprimeraronda,comocebadorsepueden
utilizarhexmeros(oligonucletidosde6nucletidosdesecuenciaaleatoria)queseunenalazaren
cualquier regin del ARN molde, o un oligonucletido (en general un oligo dT) que permite la
capturaylarealizacindelADNcapartirdelARNmoARNconcolaspoliA.Unavezqueseobtieneel
ADNc,serealizalareaccindePCRconvencionalcomosedetallmsarriba.
VisualizacindeproductosdePCR:
El procedimiento ms comn para el anlisis de los fragmentos obtenidos en la PCR es la
electroforesis, ya sea en geles de agarosa o de acrilamida. La electroforesis permite separar
fragmentos de acuerdo a su tamao. Los fragmentos de ADN (cargados negativamente) se
desplazanporelgelatravsdeuncampoelctricohaciaelpolopositivo.Losfragmentosms
pequeosmigranmsrpidoysonlosquevemosmsabajoenelgel.Laeleccindelamatriz
(agarosaoacrilamida)yelporcentajeenlacualsepararlosproductos,dependerdeltamao
de los mismos y los largos diferentes que deseemos separar. Generalmente, los geles de
agarosa se visualizan agregando Bromuro de etidio, un agente que se intercala en el ADN y
fluoresce cuando es expuesto a la luz UV, y en el caso de los geles de acrilamida, la tincin se
realizaconnitratodeplata,queporinteraccioneselectrostticasseunealADN.

EjemploGelAgarosa:
Geldeagarosa1%teidoconbromurodeEtidio
dndesevisualizanproductosdeamplificacin
dediferentestamaos(carriles1,2,3y7)entre
250y500bases.Enloscarriles3a6,eltamao
pareceserelmismo.Sinembargo,laresolucin
deestetipodegelnohaceposibleestaafirmacin.
PM1234567
250pb
500pb
100pb
b. PCRanidadaonested:SetratadeunatcnicaqueaumentalasensibilidaddelaPCR.Enestecaso
setrabajacon4cebadores,enunaprimerarondaseamplificademaneraconvencionalconlosdos
cebadores ms externos a la regin que se desea amplificar. El producto de este primer PCR se
utilizacomomoldeparaunasegundarondaqueutilizacebadoresinternosalareginpreviamente
amplificada.Ladesventajadeestatcnicaeslaposibilidadaumentadadecontaminacin,yadems
nopermitecuantificarlacantidadinicialdeADNmoldepresentaenlamuestraanalizada.

c. PCRinsitu:LaPCRinsituconsisteenunareaccindePCRenseccioneshistolgicasoclulas,donde
los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin. Es realizada sobre
preparaciones fijas en un portaobjetos. En la tcnica de PCR in situ se realiza una primera
amplificacin de ADN blanco y luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con
sondasdeADN/ARN.

d. PCRmltiplex:PCRenlacualseamplificamsdeunasecuenciaenunamismareaccin.Empleados
o ms pares de cebadores en un nico tubo con el fin de amplificar simultneamente diferentes
fragmentos de ADN. Consiste en combinar en un nico tubo de reaccin todos los pares de
cebadores de las secuencias que queremos amplificar, junto con el resto de los reactivos de la
reaccinencantidadessuficientes.Susventajas:seobtienelainformacindevarioslocienunasola
reaccin, requiere menor cantidad de molde para el anlisis y menor cantidad de reactivos. Los
ejemplos de PCR mltiplex son muy comunes en el diagnstico de agentes infecciosos, donde se
intenta amplificar varios tipos virales en el mismo tubo y al mismo tiempo (ej. Amplificacin de
HerpesVirusenmuestrasbiolgicas).
OtrasvariantesdelaPCRincluyenlaPCRinversa,PCRdecolonia,PCRasimtrica,PCRaleloespecfica,
entreotras.
5. PCRentiemporeal:
LaPCRentiemporealeshoyunadelasvariantesmsutilizadas.Estatcnicapermite,adiferenciadel
PCR convencional, la cuantificacin de los productos de amplificacin, adems de otrasoportunidades.
Lacuantificacinesmuyutilizadaenloquerefierealanlisisdeexpresingnica.
La PCR en tiempo real fue reportada por primera vez en un artculo de Higuchi y colaboradores (R.
Higuchi y col., Biotechnology 1993, 11). Estos autores, utilizando una cmara para monitorear
reacciones de PCR durante el curso del termociclado, detectaron la acumulacin de ADN doble cadena
en cada ciclo de PCR, evidenciado por un incremento en la fluorescencia producto de la adicin de
BromurodeEtidioenlareaccin.Elaumentodefluorescenciaserelacionadirectamenteconelnmero
de copias de la molcula que est siendo amplificada, presentes inicialmente en la reaccin. A menor
nmero de copias presentes inicialmente, menor el nmero de ciclos necesarios para detectar
fluorescencia.
Mediante esta variacin de la PCR es posible seguir la cintica de cada reaccin en tiempo real, por lo
que permite una cuantificacin sensible y especfica del blanco que se desea analizar, al utilizar la fase
exponenc
cuantifica
En 1997
Biosystem
destacam
porQiage
Junto al
aproxima
sustituido
presenta
utilizado
marcadas
otrasalte
Acontinu
C
Q
C
C

a. C
Cmoobs
encadac
Figura 4.
utilizando
Loquese
curvasde
cial de la curv
acin.
surgen los p
ms. Desde en
os el LigthCy
en).
surgimiento
ciones y estr
o por el SYBR
mayorafinida
en la actual
sfluorescente
rnativascom
acinnoscen
inticaderea
Qumicasutiliz
uantificacin
urvasdedesn
inticaderea
servamosen
orridadePCR
Curva de am
SYBRGreenen
eobservaen
eamplificaci
va de amplifi
primeros equ
tonces han s
ycler de Roch
o de los eq
rategias para
R Green, una
adyespecific
idad, existe
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naturalizacin
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alizada con di
Gene6000.
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nadeellas(10
ms, esta tcn
ciales de PCR
erosos equip
ntinuado), y
PCR en tiem
fluorescencia
ue tambin s
BromurodeE
espectro de
yorespecifici
orfismospunt
entosimport
cloumbral
eal
depolimorfi
cloumbral
lo,lacintica
zamos(figura
luciones seria
adilucioness
00.000,10.00
nica presenta
R en tiempo
os con difere
el RotorGene
mpo real, s
. En este sen
se intercala e
Etidio.Sibien
estrategias b
idadypermit
tuales,porej
tantes:
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a4).
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00,1.000y1
a un amplio r
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surgieron ta
ntido, el Brom
en el ADN do
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delPCResl
10 de un fra
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do en la actua
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muro de Etidi
oble cadena,
encontinas
sondas espec
delacuantific
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agmento de in
moldeinicial,
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pplied
e ellos
alidad
rentes
io fue
, pero
siendo
cficas
cacin
vamos

nters,
,ylas
ccin).
La lnea roja horizontal representa el valor umbral de intensidad, a partir del cual las muestras
comienzan su fase exponencial de amplificacin. El ciclo umbral de cada muestra, es el ciclo en el cul
pasanenelumbral(indicadoconlacrculorojoparalamuestrademayorconcentracin).Enelejemplo,
queda clara la relacin inversamente proporcional entre el ciclo umbral y la concentracin inicial de
moldepresenteenlasreacciones.Amayorconcentracin,antesamplificarlamuestraymenorsersu
cicloumbral.Arribaalaizquierda,enlamismafigura,seobservalacurvadecuantificacingeneradaa
partirdeestosdatos,graficandoelcicloumbralenlasordenadasyellogaritmodelaconcentracinen
las abscisas. Por lo tanto, dado una muestra, de la cual se desea conocer su concentracin inicial de
molde,slodeberemosinterpolarelcicloumbraldeesamuestraennuestragrficadecuantificaciny
obtenerunvalordeconcentracin(estoloveremosconmsdetallecuandohablemosdecuantificacin
absoluta).
b. QumicasutilizadasenPCRentiemporeal:
Cmomencionamosantesexistendiferentesaproximacionesqueutilizanlafluorescenciaparamedirla
cinticadelPCR,unaformadeclasificarloseslasiguiente:
Agentesintercalantes: Enestecaso,seutilizanmolculasfluorescentesqueaumentansu emisin
cuandoseunenalADNdoblecadena,eselcasodelBromurodeEtidioySYBRGreen.Ladesventaja
de esta estrategia es la inespecificidad, ya que los agentes intercalantes se unen a cualquier
productoqueestesiendoproducidodurantelareaccin,yaseaelespecficoquequeremosmedir,
comoproductosinespecficos,dmerosdecebadores,etc.Otradesventajadeestaestrategiaesque
no puede utilizarse en reacciones multiplex. Como veremos ms adelante en este captulo, es
posible realizar curvas de desnaturalizacin y evidenciar presencia de dmeros de cebadores,
aunquenoesposibleeliminaresasealqueserunruidoennuestrasmedidas,cuandodeseemos
cuantificar.Laventajadeutilizaragentesintercalantesradicaenquepuedeutilizarseparacualquier
reaccindePCRyqueeseconmico.
Sondas:Lautilizacindesondasmejorasensiblementelaespecificidaddelmtodo.Haydiferentes
estrategiasquese basan ensondas (Taqman,FRET,Molecular beacon,etc.). Aqu desarrollaremos
nicamentelassondasdehidrlisis(ej.:Taqman)ylasdehibridacin(ej.:FRET)yaquesonlasms
utilizadas.
SondasTaqman:
LassondasTaqmansehibridandemaneraespecficaaunasecuenciadelproductodeamplificacin.
En uno de los extremos de la sonda (el 5) se encuentra unido un fluorocromo reportero el cual
mientras la sonda permanece intacta la emisin es apagada o quencheada por una segunda
molcula unida al extremo opuesto de la sonda (el 3). Esta molcula es un quencher, es decir
absorbe la emisin del fluorocromo reportero pero no la emite. Entonces, cuando la sonda est
intactanohayemisindelfluorocromo(Figura5).

Cuand
direct
separ
fluore
emisi
Figura6.E
laenzimaa
deADNrec
Sonda
Las so
peroe
el ext
fluoro
de on
excita
sonda
(Figur
Figura 5.
amplificac
loscebad
do se produc
to o forward
rando fsicam
escencia. Cu
ndeluz(Fig
squemadela
apartirdelceb
cinsintetizad
asFRET:
ondas FRET t
enestecaso
tremo 3 y en
ocromo unido
nda emisin
acin del seg
as se aproxim
ra7).
Esquema de
cin,conelflu
oresforward(
ce la amplifi
) la actividad
mente el flu
nto mayor c
gura6).
estrategiades
badorforward
a.
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setrataded
n la segunda s
o al extremo
del fluorocr
undo fluoroc
man, se excit
la estrategia
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F)yreverso(R
cacin, come
d 53 exonu
uorocromo y
cantidad de
sondasTaqman
(F),yelfluoro
ibridan de m
ossondas.En
sonda, que d
5. Las carac
romo de la
cromo. En est
ta el primer
de sondas Ta
doalextremo
R).
enzando desd
cleasa de la
y el quenche
producto ge
n.Semuestra
ocromoseparad
manera espec
nlaprimerad
debe hibridar
ctersticas de
primera son
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fluorocromo
aqman. Se mu
5(F)yelquen
de uno de lo
enzima ADN
er, permitie
enerado, may
lasondadegra
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cfica dentro
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cerca de la a
los fluorocro
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uestra la sond
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mbio de ene
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(Q).Semuestr
s (en este ca
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s la emisi
egradada y m
elaamplificac
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o de amplifica
unfluorocrom
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erga, y cund
isin del seg
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raelsitiodeun
aso el
sonda,
n de
mayor
cinde
hebra
acin,
moen
gundo
ngitud
da de
do las
gundo
cirse la
ninde
Figura 7.
fluorocrom
equipo,pe
emiteenu
En es
tempe
intera
en la
ejemp
quela
tempe
estem
desna
ejemp
espec
increm
Algun
Al igu
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Guan
sonda
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sonda

Esquema de l
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FRET)debese
Adems, en r
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aranodegrad
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aestrategiar
Esto permite
ndademane
nadelassond
de los alelos
diante curva
acinbuscad
an,ypresent
Asimismo, h
a reaccin de
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odopodrana
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de melting d
piando el AD
e melting d
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ambos
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s que
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e PCR
ePCR
actuar
a una
de las
DN (se
de los
enser
al de
,para
remos
s.
c. Cuantificacinabsolutayrelativa:
Lacuantificacinabsoluta,esaquellaenlacualseutilizaunacurvaestndarconstruidaapartirde
concentracionesconocidasdelblanco quesedeseaamplificary cuantificar.Eslaestrategiaelegida
en muchos kits comerciales de PCR en tiempo real para cuantificar cantidad de virus presentes en
muestras biolgicas (ej. Carga viral de HIV, HCV). Como comentamos ms arriba, se aprovecha la
relacin entre el ciclo umbral y la concentracin inicial de molde presente en las muestras o
estndares.
Las curvas de calibracin son altamente reproducibles, especficas y sensibles. Sin embargo
debemos asegurarnos la calidad de los estndares que utilizamos ya que de ellos depende el
resultadofinaldelacuantificacin.Elrangodinmicodecuantificacinpuedellegara9rdenesde
magnitud(ej.10
2
10
11
copiasinicialesdecidonucleico).
En el caso de los kits de diagnstico, muchas veces se utiliza un control interno que se agrega a la
muestra antes de ser extrado el cido nucleico (ARN o ADN), que sigue todo el proceso de
extraccin y amplificacin. Idealmente este control interno debe amplificarse con los mismos
cebadoresqueelblancoquesedeseacuantificar.Enestoscasosseutilizansondas,especficaspara
cadaunodelosamplicones,marcadasconmolculasfluorescentescondiferentespropiedadesque
permitadistinguirlos.Unaestrategiadecuantificacinimplicalarealizacindedoscurvasestndar,
unoparacadablanco(eldeintersyelcontrolinterno)yluegounacuantificacinrelativaalcontrol
interno que se agreg al comienzo del procesamiento de la muestra, lo cual asegura una
cuantificacinprecisaconsiderandolasprdidasdematerialdurantelaextraccin.
La cuantificacin relativa es la estrategia utilizada para estudiar los cambios en la expresin gnica
entre diferentes muestras. En este caso, se realiza una RTPCR en tiempo real, la que permite
determinarloscambiosdelosnivelesdeexpresindeundeterminadogenendiferentesmuestrasy
se expresa el resultado relativo a un mensajero que no cambia durante el proceso que estamos
estudiando(ej.ungenhousekeeping)ouncontrolinternoqueagregamosacadamuestra(comoen
elcasoquemencionamosenelprrafoanterior).
Existen diferentes modelos matemticos para hacer estudios de expresin gnica diferencial
mediantecuantificacinrelativa.Aqumostraremosdosmtodos,unodeellosnotieneencuentala
eficienciadelareaccindePCRyelotrostieneencuentaestefactor.Enelprimercasoseasume
unaeficienciade100%(esdecirqueelblancodeamplificacinseduplicaencadaciclo):Ecuacin1.
Ecuacin1.R=2
(CtgdiCtgh)Experimental(CtgdiCtgh)Control
=2
(Ct)

Dndegdi=gendeintersygh=genhousekeeping,deestemodo,seobtieneunarelacinentredos
condiciones (experimental vs. control) para un gen de inters utilizando para normalizar un gen
housekeeping. (Referencia: Livak and Schmittgen. Analysis of Relative Gene Expression Data Using
RealTimeQuantitativePCRandtheCtMethod.Methods25,2001).

En el segundo caso, se realiza una correccin basndose en la eficiencia de cada reaccin (para el
gendeintersyparaelgennormalizador):Ecuacin2.

Ecuacin2.R=Eficienciagdi
(CtgdiControlCtgdiMuestra)

Eficienciagh
(CtghControlCtghMuestra))

En este mtodo desarrollado por Pfaff y colaboradores (Nucleic Acids Res. 2001 29(9): E45), se
considera la eficiencia de la amplificacin de cada uno de los blancos que se analizan. Para ello se
realiza una curva de calibracin (sin necesidad de conocer realmente la cantidad de molculas
iniciales en la reaccin, sino haciendo diluciones seriadas a partir de un stock) y a partir de la
pendientedeestacurvasecalculalaeficienciadelareaccinmediantelaEcuacin3:
Ecuacin3.Eficiencia(E)=[10
(1/pendiente)
]1
Deestamaneraserealizaunaaproximacinmsrealista,yaquelaeficienciadeunexperimentode
PCRdifcilmentealcanceel100%comoplanteaelprimermtodo.
d. Curvasdedesnaturalizacinydeteccindepolimorfismospuntuales.
Las curvas de desnaturalizacin pueden realizarse cuando se utilizan agentes intercalantes y en
estrategiasconsondasdehibridacin(noenelcasodesondasdehidrlisis).Estascurvasserealizan
alfinalizarlareaccin,esdecir,cuandolasreaccionesalcanzanlafaseplateau.Paraelloseaumenta
la temperatura gradualmente desde por ejemplo 5060
o
C hasta 95
o
C. De esta manera, los
productos que se encuentran hibridados, y con una intensidad de fluorescencia alta (ya sea por el
agente intercalante o por la sonda hibridada) comienzan a desnaturalizarse provocando que el
agente intercalante del ADN doble cadena, o que las sondas se separen de su blanco, este hecho
provoca una disminucin de la seal de fluorescencia que puede seguirse en funcin de la
temperatura. Cuando hay un punto de inflexin en esta curva (Figura 8), el mismo corresponde al
punto de desnaturalizacin o temperatura de melting (Tm). Al calcular la derivada de la Intensidad
de fluorescencia en funcin de la Temperatura, y graficarla nuevamente en funcin de la
temperaturaseobservangrficascomolasdelaFigura9.

Figura 8. Curva de desnaturalizacin. Se grfica la fluorescencia en funcin de la temperatura. Las lneas verdes
corresponden a las muestras de la Figura 4. La lnea negra es la curva correspondiente a un blanco de
amplificacin.

Figura 9. Curva de desnaturalizacin derivatizada. Se grfica la derivada de la fluorescencia en funcin de la

temperaturaenlasordenadas,ylatemperaturaenlasabscisas.Loqueseobservaesunpicocorrespondienteala
Tmparalasmuestrasenverde.Ennegro,elblancodereaccinpresentaunpicodemenorTmquesecorresponde
conlapresenciadedmerosdecebadores.
La posibilidad de realizar este tipo de curvas permite distinguir la presencia de dmeros de
cebadoresenlareaccinoproductosinespecficosquepresentan,engeneral,unatemperaturade
desnaturalizacin menor que la del blanco especfico. En la Figura 9, puede verse un pico de
desnaturalizacinenlamuestraquecorrespondealblancodereaccin,dndealnohabermuestra
paraamplificarsefavorecelaformacindedmeros.Porlotanto,enestecaso,seobservaunaseal
deamplificacinenlascurvasdeamplificacin,quenoimplicaunacontaminacindelamuestraya
quenohayunpicoalaTmesperada.
Por ltimo es posible detectar polimorfismos puntuales mediante la realizacin de estas curvas, ya
sea utilizando sondas de hibridacin, como con una nueva generacin de agentes intercalantes
(Sito9 Green Fluorescent nucleic acid stain o EvaGreen dye) y la posibilidad de los equipos de
realizarcurvasdedesnaturalizacinmsprecisas(HRM:porhighresolutionmelting)(Figura10).
C
72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96
F
lu
o
r
e
s
c
e
n
c
e
15
10
5
0
C
73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97
d
F
/
d
T
2
1,5
1
0,5
0
Figura 10.
caso de un
mismas cu
diferencias
quantificat
correspond
alelomuta
Enel
sonda
dismi
Figura11.
elcasode
roja corres
ambospico

Curvas de de
na mutacin p
urvas pero mo
s y es ms f
tion.de/abhrm
dealhomocig
adoA)
casodelasso
aenelcasod
nucinenlat
Curvasdedes
unamutacin
sponde a un h
os,aunhetero
esnaturalizaci
puntual G por
ostrando la d
fcil determin
mguide.pdf).
otamutadoy
ondasdehibr
deestarpres
temperatura
snaturalizacin
puntualGpor
omocigota no
ocigotaparala
n obtenidas c
A y se muest
iferencia resp
nar los difere
Las curvas e
enazulelhete
ridacin(com
ente (al note
dedesnatura
nobtenidacon
rAysemuestr
rmal, la curva
mutacinestu
con HRM. Se o
ran los tres po
ecto a una m
ntes genotipo
en rojo corre
erocigotapara
moFRET),elp
ener unacom
alizacinenlo
nsondasFRET.
ranlostrespos
verde a un ho
udiada).

observa los dif

osibles genotip
muestra norma
os (imgenes
esponden al
alamutacin(
polimorfismo
mplementarie
osalelosque
Seobservalos
siblesgenotipo
omocigota mu
ferentes punto
pos. A la dere
al, en este ca
obtenidas de
homocigota
(esdecirunal
provocauna
edadperfecta
poseenlamu
sdiferentespu
os(enestecas
utado y la curv
os de inflexin
echa se observ
aso se acent
e http://www
normal, en
elonormalG
inestabilidad
a) provocand
utacin.
untosdeinflex
oparticular,la
va azul, que m
n en el
van las
an las
w.gene
verde
Gyun
denla
ouna

xinen
acurva
uestra
Comentariosfinales:
Para finalizar este captulo mencionaremos algunas de las aplicaciones de la PCR y PCR en tiempo
real.Lasmismasabarcandesdelainvestigacinbsicahastalaaplicada,pasandoporeldiagnstico
humano a la deteccin de Organismos Genticos Modificados en vegetales. Algunos ejemplos de
aplicacionesdelPCRson:
Investigacin:
Clonacin
Bsquedadenuevosgenes
Metagenmica
Anlisisfilogenticos
Anlisisdeancestra
Anlisisdeexpresindiferencial
etc.
Diagnstico:
Deteccin de mutaciones puntuales e Inserciones/Deleciones asociadas a enfermedades
genticas
Anlisisdeparentesco
Cuantificacinviral
Pronstico de enfermedades mediante anlisis de cuantificacin de la expresin de
determinadosgenes.
etc.

Lecturasrecomendadas:

1. Mullis y colaboradores. Specific Enzymatic Amplification of DNA In Vitro: The Polymerase Chain
Reaction.ColdSpringHarbSympQuantBiol.1986;51Pt1:26373.).
2. Saiki y colaboradores. Enzymatic amplification of Globin genomic sequences and restriction site
analysisfordiagnosisofsicklecellanemia.Science.1985Dec20;230(4732):13504.Primerartculo
publicado dnde se describe mtodo de PCR. Y se observa una aplicacin directa. Este grupo
incluye aMullis,y aotrosinvestigadoresque participaron enla puestaa punto dela tcnicayla
hicieronposible.MsallqueseconsidereaMulliselautorconceptualdelatcnica.
3. NobelLecture:DrKaryB.Mullis,LaJolla,California,U.S.A.,forhisinventionofthepolymerasechain
reaction(PCR)method.13octubre1993.
4. WilhelmyPingoud.RealTimePolymeraseChainReaction.ChemBioChem2003,4,11201128
5. Espinosa Asuar Laura. 2007. Gua prctica sobre la tcnica dePCR. En: L. E. Eguiarte, V. Souza y X.
Aguirre(edEcologamolecular.INE,CONABIOyUNAM.)
6. LivakySchmittgen.AnalysisofRelativeGeneExpressionDataUsingRealTimeQuantitativePCRand
the2[Delta][Delta]CTMethod.Methods,25(4):402408,2001.
7. Michael Pfaff. A new mathematical model for relative quantification realtime PCR. Nucleic Acids
Research,29(9):20022007,2001.
8. StephenA.Bustin.AZofQuantitativePCR.InternationalUniversityLine(ISBN0963681788).

Otrosrecursosinteresantes:

1. www.Karymullis.com(pginapersonaldeKaryMullis)
2. http://www.genequantification.info/ (pgina web realizada y mantenida por Pfaff y
colaboradoresconmuchomaterialsobrelaPCRentiemporeal).
3. www.idtdna.com (pgina web de la empresa IDT, proveedora de oligonucletidos, se puede
encontrarmaterialeducativoysoftwareparaeldiseodecebadoresysondas).
4. www.wikipedia.com