PRCTICA1

MATERIAL DE LABORATORIO, ACONDICIONAMIENTO Y

ESTERILIZACIN
I. OBJETIVOS
1) Dar a conocer al estudiante las tcnicas para el
acondicionamiento y esterilizacin de materiales y equipos ms
empleados en un laboratorio de microbiologa industrial.
2) Ejecutar con habilidad y destreza el acondicionamiento de
materiales para el anlisis microbiolgico.
) !usti"icar la importancia de los mtodos de esterilizacin para el
control microbiolgico de los alimentos.
II. MARCO TERICO
El acondicionamiento de los materiales as como la esterilizacin de
los mismos es el primer paso en el control microbiolgico de los
alimentos# pues de l depender el $ito del anlisis.
2.1.- METODOS DE ESTERILIZACION POR CALOR
El calor act%a desnaturalizando y coagulando las protenas.
2.&.&.' E()E*+,+-./+01 23* /.,3* (E/3
(e requiere temperaturas ele4adas y un periodo ms prolongado de
calentamiento que la esterilizacin con 4apor. (u uso est limitado
primariamente a la esterilizacin de material de 4idrio y aquellas
sustancias que sean impermeables al 4apor.
El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en
los e"ectos letales del calor seco debido a la desecacin en general#
lesin por o$idacin y e"ectos t$icos de los ni4eles de electrlitos.
En ausencia de agua# disminuye el n%mero de grupos polares de la
cadena peptdica y se requiere ms energa para abrir las molculas#
de all la aparente mayor estabilidad del organismo.
(e emplea el horno o estu"a de esterilizacin# en la que se aplica una
temperatura de &56'&768/ durante & hora.
a) Flame Llama D!"e#$a. /onsiste en e$poner los
materiales a esterilizar 9asas y agujas de :olle# esptulas# pinzas#
tijeras# etc.) al contacto de la llama de un mechero para eliminar
rpidamente los microorganismos del entorno; Ejemplo< mechero de
=unsen.
b) A!"e Cal!e%$e. 2ara ello se utiliza un horno bacteriolgico u
horno 2asteur# donde se esteriliza el material a temperaturas de
&768'&>68/ por 2 horas. Es generalmente empleado para esterilizar
material de 4idrio.
2.&.2 E()E*+,+-./+01 23* /.,3* ?@AED3
(e usa el 4apor# tanto porque las bacterias se mueren ms
rpidamente cuando se encuentran h%medas como porque el 4apor
proporciona un medio de distribuir el calor uni"ormemente en todas
partes del recipiente de esterilizacin# el 4apor debe conser4arse a
una presin de &666gBcm

sobre la presin atmos"rica para obtener

una temperatura de &2&8/. (e produce tambin rupturas de cadena
%nica en el .D1 # y la prdida de la 4iabilidad de las clulas
e$puestas a calor le4e puede correlacionarse con la introduccin de
estas rupturas. ,a lesin de .D1 parece ser enzimtica# como
resultado de acti4acin o liberacin de una nucleasa.
El calor produce tambin una prdida de la integridad "uncional de la
membrana y "iltracin de pequeCas molculas y material absorbente
de 256 nm. Este material es de origen ribosmico y aparentemente
es resultado de la degradacin de los ribosomas por ribonucleasas
acti4adas por el tratamiento con calor. E$iste tambin degradacin
del .*1 ribosmico y la prdida de 4iabilidad de las clulas
e$puestas a temperaturas ele4adas.
a) P" E&'ll!#!(%. (e coloca el material a esterilizar en agua
hir4iendo 9&668/) por &D'D minutos.
b) Va)" *e a+'a ,!% P"e,!(%. (e coloca el material a
esterilizar a la accin del 4apor de agua y a temperatura no mayor
de &668/; para ello puede hacer uso del autocla4e con la espita
abierta. (e utiliza para materiales termolbiles como es el caso de
algunos medios de culti4o.
c) Va)" *e a+'a #% P"e,!(%. (e realiza en un autocla4e a
&D libras de presin y &2&8/ por &D'26 minutos. (e emplea para
esterilizar medios de culti4o y todos aquellos materiales que no
pueden esterilizarse por calor seco. (e puede usar; autocla4e#
pasteurizacin o tindalizacin.
#.1- A'$#la.e/ es un equipo construido en acero ino$idable# de
"orma cilndrica# paredes resistentes# puede ser horizontal o 4ertical;
consta de<
E /aldera de material resistente# "ondo cnca4o
cubierta de una camisa metlica cilndrica.
E Dispositi4os para la instalacin de la "uente
calor"ica 9gas# electricidad o 4apor de agua).
E 3ri"icios superiores para purga de gases de
combustin.
E )apa con 4l4ula de seguridad# espita# manmetro.
E /anastilla para colocar el material a esterilizar.
2.0 ESTERILIZACIN POR FILTRACIN
/onsiste en hacer pasar las sustancias lquidas o gaseosas a
esterilizar a tra4s de membranas porosas que retienen a los
microorganismos; sir4e para la esterilizacin de sustancias
termolbiles. El material "iltrante puede ser de porcelana# tierras de
in"usorios# acetato de celulosa# etc.
2.1 ESTERILIZACIN POR RADIACIN 2LTRAVIOLETA
2oseen e"ectos letales y mutagnicos en las bacterias presentando
su mayor e"ecti4idad como agente bactericida en la regin espectral
de alrededor de los 256 nm de longitud de onda# ste mtodo
presenta muchas di"icultades tcnicas.
III. MATERIALES Y E32IPO
E Aaterial de 4idrio< pipetas# palcas petri
E Erlenmeyer# tubos de ensayo
E 2apel cra""# algodn# gasa# tijeras
E Aechero de =unsen
E ?orno 2asteur de aire caliente
E .utocla4e
IV. PROCEDIMIENTO E4PERIMENTAL
1.1 PREPARACIN DE MATERIAL A ESTERILIZAR
a-P"e)a"a#!(% *e $'&, ma$"a#e,
E ,os tubos# matraces y "rascos antes de su
esterilizacin deben lle4ar sus tapones de algodn
respecti4amente# los cuales deben cerrar sua4emente no muy
"lojos ni apretados# ni largos ni cortos# preparados seg%n el
mtodo siguiente<
E De acuerdo al tapn a con"eccionar se toma el
pedazo con4enientemente de algodn de "ibra# e$tendida#
rectangular
E 2racticar un dobles de &B a lo largo de la "ibra.
E Enrollar de un e$tremo# presionando sobre s
mismo hasta completar toda la longitud.
E *otar con los dedos el trozo con"eccionado
aplastando para drsele la "orma de cono truncado# con el
dimetro a la medida del recipiente a taponar# el tapn debe
entrar en el recipiente hasta la mitad# y el otro medio quedar
"uera. (e pueden preparar los tapones en4ueltos en gasa para
e4itar el hilachamiento.
T'&, *e E%,a5
E Formar un paquete de tubos de ensayo
taponados# empaquetarlos con papel :ra"t y amarrarlos# en su
de"ecto se le en4uel4e con papel slo la zona de las bocas.
F"a,#, 5 Ma$"a#e,
E ,os "rascos y matraces se taponan con algodn#
se cubre con papel :ra"t y se amarra con hilo pabilo.
E /olocar el nombre del medio de culti4o
E *otular la "echa de preparacin.
&-P"e)a"a#!(% )a"a )"$e+e" la, )!)e$a,
E En el e$tremo de succin de cada pipeta
introducir una porcin de algodn con au$ilio de una aguja o
puntero delgado# e4itando que quede muy ajustado.
E /ortar tiras largas de papel :ra"t de unos cm.
de ancho# y colocar uno de sus e$tremos# en una de las puntas
del papel en4ol4er la punta de la pipeta en "orma oblicua y
en4ol4er toda la longitud de la pipeta girndose en espiral en
"orma ajustada y en la parte terminal de la boquilla se remata
con una torsin para protegerla y se rompe el resto de papel
sobrante.
E .notar con un lpiz la medida de la pipeta y la
"echa de su esterilizacin.
#-P"e)a"a#!(% *e la, )la#a, )e$"!
E /ortar papel :ra"t tamaCo adecuado para cubrir
ntegramente las placas petri completas.
E /on la parte brillante del papel hacia "uera se
en4uel4e la placa ponindose esta en el centro# se en4uel4e la
placa tomndose dos e$tremos opuestos del papel# dndose
una 4uelta alrededor de ella# los otros dos e$tremos del papel
se doblan en tringulos# rematndose con un "uerte dobles
hacia el dorso de la placa# dndosele una apariencia de
paquete de regalo.
1.2 ESTERILIZACIN CON CALOR SECO
El procedimiento de esterilizacin por aire caliente slo se puede
emplear con utensilios de 4idrio o metal.
a-P"#e*!m!e%$ )a"a la e,$e"!l!6a#!(% e% 7"%
E 2onga el termostato a l7D8/ y encienda el horno.
E (i hay un 4entilador 4eri"ique que est
"uncionando.
E Gigile el termmetro. /uando la temperatura
llegue a l7D8/. sgase calentando durante 56 minutos ms.
E .pague el horno. Espere a que la temperatura
descienda hasta 568/. .bra la puerta del horno.
E El papel empleado para en4ol4er deber de
haber tomado un color marrn oscuro# si el color del papel es
amarillo plido indicar que el horno no se ha calentado
bastante. (i el papel se ha ennegrecido indicar que el horno se
ha calentado demasiado.
1.0 ESTERILIZACIN CON CALOR 89MEDO
a-P"#e*!m!e%$ )a"a la e,$e"!l!6a#!(% #% a'$#la.e
E ,lene con agua el "ondo de la autocla4e 9hasta el
soporte de la canasta). /ercirese que el agua no toque la
canasta. Elimine el e$ceso de agua abriendo la espita del
drenaje.
E +ntroduzca en el autocla4e la canasta con los
materiales que se 4an a esterilizar# se pueden aCadir
indicadores de la esterilizacin# como ciertas piezas de papel
especial que ennegrecen al lograrse la temperatura adecuada.
E /ierre la tapa de la autocla4e# cerciorndose de
que la arandela de goma se encuentra en su surco. .tornille a
ni4eles iguales los sujetadores de la tapa# con "irmeza pero sin
apretarlo demasiado.
E .brir la 4l4ula de salida del aire.
E +nicie el calentamiento de la autocla4e.
E Gigile la salida de aire hasta que aparezca un
chorro de 4apor. .guarde ' H minutos hasta que el chorro de
4apor sea uni"orme y continuo# esto indicar que todo el aire ha
sido e$pulsado de la autocla4e.
E /ierre a continuacin la 4l4ula de salida del
aire. .pritense los sujetadores de la tapa de la autocla4e y
reduzca la temperatura ligeramente.
E /uando se obtenga la temperatura adecuada
&268/ se deber regular el calor para conser4arla. I esperar
por &D minutos.
E *eduzca completamente el calor tan pronto
como se cumpla el tiempo requerido.
E /uando la temperatura descienda a menos de
>68/ abra la 4l4ula de salida de aire para igualar las presione
dentro y "uera del autocla4e.
E Deje en"riar el autocla4e y a continuacin retire
cuidadosamente la canasta con los utensilios estriles.
V. C2ESTIONARIO
D.&. JKu mtodo de esterilizacin utiliz en la prctica# cite
algunos ejemplosL.
D.2. J/ree usted que es importante acondicionar y esterilizar los
materiales antes del control microbiolgico# por quL
D. /ite en "orma ordenada cada uno de los pasos a seguir para
poner en "uncionamiento el autocla4e.
D.H. /ompare la resistencia al calor de las clulas 4egetati4as con
esporas bacterianas y e$plique a que se debe tal di"erencia.
D.D. /ite usted tipos de "iltros empleados en el proceso de
esterilizacin.
PRCTICA2
MICROSCOPIA
I.- OBJETIVOS
&) +denti"icar cada una de las partes del microscopio ptico#
conocer su "uncin y el cuidado de cada uno de ellas.
2) /onocer la mor"ologa de organismos unicelulares.
) /onocer los distintos mtodos de obser4acin de
microorganismos Min 4i4oN.
II.- MARCO TEORICO
El microscopio permite la obser4acin de estructuras muy pequeCas
que no pueden ser 4istas a simple 4ista. El poder de resolucin de un
microscopio esta en relacin in4ersa a la longitud de onda de la luz
usada.
2.1.- PARTES DEL MICROSCOPIO COMP2ESTO
1. Pa"$e me#:%!#a/
' 2ie
' /olumna 9pilar# charnela y brazo)
' )ubo< *e4l4er
' )ornillo macromtrico o sistema de mo4imiento rpido
' )ornillo micromtrico o sistema de mo4imiento lento
' 2latina< 2inzas sujetadoras de lminas y mandos coa$iales
' (ubplatina< 2ieza que asciende y desciende condensador#
anillo porta "iltros# dia"ragma iris y soporte para el espejo
2. Pa"$e ()$!#a *el M!#",#)!/
' 3culares< lentes situados donde 4a del ojo del obser4ador
' 3bjeti4os< lentes situados en el lado de la muestra
,os objeti4os traen impresas las siguientes caractersticas<
o Aagni"icacin< Ej. $ 2D
o .pertura numrica 9..1.)< Ej. 6#HD
o /ualidades de la lente< Ej. 2lan cuando se re"iere a un
objeti4o 2lanacromtico
o ,ongitud del tubo< Ej. &56 mm
o /orreccin de espesor de laminilla Ej. 6#&7 mm
o .parato de iluminacin. comprende< Espejo#
/ondensador# Dia"ragma
2.2.- 2SO DEL MICROSCOPIO COMP2ESTO
1. El A.3. debe agarrarse siempre del brazo# nunca del tubo o
platina porque deteriora el tornillo micromtrico.
2. Disponer el A.3. en una mesa horizontal y a una altura
con4eniente para obser4ar sin "atiga Geri"icar que los oculares
estn limpios y en posicin correcta.
. /uando se obser4e preparaciones "ijas# puede inclinar el tubo
del A.3. para una mejor comodidad si se trata de Aicroscopios
que no posean el sistema inclinado. (i se obser4an
preparaciones "rescas oNin 4i4oN debe mantenerse la platina
horizontal.
H. Geri"icar que los objeti4os en el re4l4er estn en orden
progresi4o de aumento.
D. /oloque el objeti4o de menor aumento en el eje ptico girando
el re4l4er hasta que haga Mcli:N.
5. (uba el condensador hasta que la lente superior este muy
cerca de la platina y abra el dia"ragma totalmente.
7. (i el Aicroscopio tiene luz incorporada# encender el interruptor
y si tiene espejo orientarlo hacia la 4entana mejor iluminada o
al "luorescente ms cercano.
8. 3bser4e por el ocular la iluminacin del campo y trate de
lograr la m$ima luminosidad mo4iendo el espejo; luego# si es
necesario baje ligeramente el condensador.
9. /olocar en la platina el preparado a estudiar# cuidando que la
laminilla cubreobjetos quede hacia arriba# la etiqueta hacia la
derecha del obser4ador y que el preparado se encuentre entre
el condensador y el objeti4o; es decir# atra4esado por los rayos
de luz. Este desplazamiento se logra utilizando los mandos
coa$iales.
10. 2ara iniciar la obser4acin# emplee siempre el objeti4o de
menor aumento 9panormico &6O) y procure que la distancia
objeto'objeti4o sea la mnima 9D mm.)# esto se logra bajando
el tubo con el tomillo macromtrico y obser4ando por un lado
del Aicroscopio el descenso del mismo. ,uego# obser4e por el
ocular y simultneamente suba al tubo con el tomillo
macromtrico hasta en"ocar el elemento en estudio# de
inmediato utilice el tomillo micromtrico para dar nitidez a la
imagen. Finalmente recorra la lmina con la ayuda de los
mandos coa$iales para su obser4acin integral# siempre
utilizando el tomillo micromtrico para no perder la nitidez.
/uando se trate de Aicroscopios en donde la platina asciende
al utilizar el tomillo macromtrico# la distancia objeto'objeti4o
debe ser de & a &#D cm.
&&. *egular el dia"ragma iris hasta obtener las mejores
condiciones de contraste.
12. El elemento que desee obser4ar a mas aumento coloque en
el centro del campo y cambie de objeti4o girando el sistema
de re4l4er# teniendo cuidado de girar el objeti4o del siguiente
aumento 9HDO) y 13 el de inmersin. 2onga ntida la imagen
%nicamente con el tomillo micromtrico.
Es importante tener en cuenta que para cambiar de un
aumento a otro no debe manipularse con el tomillo
macromtrico porque corre el riesgo de romper la lmina o la
lente "rontal del objeti4o.
13. 2ara obser4ar las estructuras con objeti4o de inmersin#
coloque el elemento seleccionado en el centro del campo y
gire un poco el objeti4o# de manera tal# que quede libre ste
sector de lmina para que pueda colocarse una gota de aceite
de inmersin. ,uego# contin%e girando el re4l4er hasta que el
objeti4o de inmersin 9&66O) contacte con la gota y encaje en
el eje ptico; "inalmente# obser4e por el ocular y aclare la
imagen solamente con el tomillo micromtrico.
Pna 4ez terminada la obser4acin limpie el objeti4o de
inmersin y la lmina con el campo ligeramente humedecido
con alcohol isoproplico o metanol.
2.0.- A2MENTOS DEL MICROSCOPIO Y CLC2LO APRO4IMADO DE
DIMENSIONES CEL2LARES
&. 2ara calcular el aumento del Aicroscopio# multiplique el
aumento del objeti4o por el del ocular.
Ej.< 3bjeti4o H6O y 3cular &6O
H6 $ &6 Q H66 aumentos
2. 2ara el clculo apro$imado de dimensiones celulares# se debe
conocer el dimetro del campo microscpico que 4ara de
acuerdo al objeti4o que se usa.
D!:me$" *el #am) m!#",#()!#
O#'la" O&;e$!.
D!:me$" *el
#am) e% m!#"a,
&6O &6O &D66
&6O HDO H66
&6O &66O &D6
Ejemplo< (i obser4amos una clula epitelial al Aicroscopio
con objeti4o &6O y ocular &6O# y si sta ocupa la
tercera parte del campo microscpico#
concluiremos que la clula mide
apro$imadamente D66 micras; es decir# la
tercera parte de &D66.
2.1.- C2IDADOS DEL MICROSCOPIO COMP2ESTO
&. El Aicroscopio debe tomarse por el brazo# nunca por el tubo
la platina# porque a la larga deteriora el tomillo micromtrico.
2. ,os objeti4os y oculares constituyen la parte mas delicada del
Aicroscopio# por lo que debe tenerse sumo cuidado en su uso.
.s# el en"oque debe hacerse sua4emente# e4itando que la
lente "rontal del objeti4o roce el cubre objetos. 2or ninguna
razn debe desmontarse los objeti4os.
El objeti4o de inmersin no debe usarse en seco y debe
quedar escrupulosamente limpio despus de su uso# para lo
cual use el McampoN ligeramente humedecido con alcohol
isoproplico o metanol.
3. .l "inalizar la obser4acin microscpica# coloque el objeti4o de
menor aumento en el eje ptico dejando un espacio de 2 cm.
entre ste y la lentilla del condensador# luego apague la luz.
2.<.- OBSERVACIN =IN VIVO> DE OR?ANISMOS 2NICEL2LARES
I%*!#a#!%e,/
&. +lumine correctamente su Aicroscopio# cuidando que la platina
est en posicin horizontal.
2. /oloque la lmina porta objetos en su Aicroscopio.
. 2onga una gota del agua estancada en el centro de la lmina
de manera que la luz del Aicroscopio la atra4iese.
H. 2roceda a en"ocar con menor aumento y obser4ar que tiene
e$ceso de iluminacin y poca 4isin de la muestra corrija ste
de"ecto bajando el condensador y cerrando un poco el
dia"ragma iris.
D. 3bser4ar elementos "ijos# con pocos mo4imientos y 4eloces
que tienen caractersticas especiales y un "ondo de partculas
de tierra y cristales grises y oscuros. 2ueden distinguirse<
' Al+a,# como la espirogira# de color amarillento 4erdoso a
manera de pequeCas escaleras en cuyo interior se
obser4an los cloroplastos.
' D!a$mea,, de di"erentes "ormas y tamaCos# se las
distingue porque son brillantes# amarillentas# poco m4iles;
4an desde la "orma de un barril pequeCo hasta cigarros o
prismas.
' Pa"ame##!'m# de gran mo4ilidad# atra4iesan raudamente
el campo de obser4acin. (on protozoarios que tienen
"orma o4oide# de zapatilla y se caracterizan por presentar
su cuerpo rodeado de cilios. En su interior obser4ar el
n%cleo y 4acuolas.
' )ambin puede obser4arse a la stilonichia# ms pequeCa
que el 2arameccium y con un pelo o cerda en un e$tremo.
' .lgunas 4eces se 4isualiza a la Euglena Viridis#
caracterizada por presentar un "lagelo largo 92rotozoario
"lagelado).
' ,a ame&a# di"cil de 4isualizar por su transparencia#
presenta pocos mo4imientos y se desplaza lentamente
emitiendo pseudpodos en la super"icie de su cuerpo.
' )ambin puede encontrar Vorticelas# tienen "orma de
cliz# con un pedicelo largo y delgado# generalmente 4i4en
en colonias. ,a super"icie del MclizN est rodeada de cilios.
6. ,uego# coloque una gota de colorante 4ital 9rojo neutro o azul
de metileno) en su preparado y obser4e nue4amente los
organismos unicelulares.
7. ?aga un dibujo de lo obser4ado y coloque los nombres
correspondientes.
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
2.@.- E4AMEN EN FRESCO DE MICROOR?ANISMOS
1. EAame% e% F"e,#
Es la "orma ms simple de realizar la preparacin de un
espcimen para su e$amen microscpico.
,as preparaciones en "resco se utilizan para obser4ar
microorganismos 4i4os.
?ay 2 tipos de tcnicas<
a. P"e)a"a#!(% e% B"e,# ,!m)le =e%$"e )"$a 5 #'&"e>.
/onsiste en colocar una gota de lquido con los microorganismos
sobre un porta objetos y luego cubrirla con un cubreobjetos.
&. ?$a )e%*!e%$e
/onsiste en colocar una gota de lquido con microorganismos en
un cubreobjetos y cubrirlo con un portaobjetos 9de "orma
in4ertida) con una e$ca4acin central 9portaobjetos e$ca4ados).
(e debe sellar la preparacin con 4aselina alrededor de la
e$ca4acin.
,a 4entaja de esta preparacin es que no se seca y puede ser
obser4ada durante un tiempo ms largo.
II. PROCEDIMIENTO E4PERIMENTAL
E4AMEN DE MICROOR?ANISMOS VIVOS
Este e$amen permite obser4ar microorganismos 4i4os# se realiza
con la "inalidad de obser4ar caracteres de mo4ilidad# mor"ologa#
agrupacin# obser4acin de hue4os y quistes de parsitos.
E4AMEN EN FRESCO
Ma$e"!al
'Aicroscopio
',minas cubreobjetos
',minas portaobjetos
'.gua destilada
'.sas de Solle
'Trmenes 4arios
'Auestras "ermentadas
'/ulti4o de microorganismos
Me$*l+Ca
'(i la muestra pro4iene de un lquido# con un asa de :olle se
coloca una gota de lquido sobre un portaobjeto# sobre el que
se coloca un cubreobjeto.
'(i la muestra pro4iene de un culti4o slido# se deposita
primero una gota de suero "isiolgico sobre el portaobjetos#
para luego con la ayuda del asa de :olle realizar una
suspensin y colocar un cubreobjetos.
'3bser4ar al microscopio con objeti4o H6O.
O&,e".a#!(% 5 Re,'l$a*,
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
III. C2ESTIONARIO
i. JKu 4entajas y des4entajas o"rece una preparacin en "rescoL
ii. JKu 4entaja presenta una preparacin gota pendienteL
iii. J*ealice un dibujo del microscopio y seCale sus partesL
i4. J. qu se denomina campo pticoL
4. JKu es el sistema para"ocalL
PRCTICA0
PREPARACIN DE 2N FROTIS BACTERIANO/ TINCIN ?RAM
I.- OBJETIVOS
2) 3bser4ar los microorganismos 4i4os en suspensin<
preparaciones h%medas y coloraciones supra4itables.
) 3bser4ar clulas muertas en "rotis seco y teCidas con
di"erentes procedimientos de coloracin.
II.- MARCO TEORICO
Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeCos y
su protoplasto posee un ndice de re"raccin cercano al agua# se
requiere generalmente tinciones biolgicas para 4isualizarlos
adecuadamente o demostrar el detalle de sus estructuras internas.
,os colorantes estn constituidos en su mayora por el anillo
bencnico# y di"ieren uno de otro en cuanto al n%mero y disposicin
de estos anillos y a la sustitucin de los tomos de hidrgeno por
otras molculas. .lgunos de los grupos crom"oros ms comunes
hallados en los colorantes son< /Q/# /Q3# /Q(# /Q1# 1Q1# 1Q3#
132.
,a intensidad de coloracin de colorante es proporcional al n%mero
de radicales crom"oros del compuesto.
2.&.' COLORACIONES DIFERENCIALES
PARED CEL2LAR
El espesor oscila generalmente entre 6.&D6

m y 6.D66

m de
espesor# pudiendo incluso alcanzar 6.>

m 9,actobacillus). ,as
paredes de las clulas j4enes son ms delgadas que las clulas
de culti4o antiguo.
?RAMPOSITIVAS. ,a pared celular de las Trampositi4as est
constituida principalmente por cadenas de peptidoglucano# a
menudo unidas por puentes peptdicos.
(in embargo estas clulas contienen tambin una gran cantidad
de cidos teicocos# polmeros de glicerol y ribitol unidos por
grupos "os"ato y aminocidos como D'alanina o az%cares como
la glucosa estn unidos a los grupos glicerol y ribitol.
?RAMNE?ATIVAS. 2resentan capas de en4oltura distintas#
dispuestas de manera la$a# estas incluyen la membrana e$terna
9AE)# con 4oluta# arrugada con surcos u ondulante# que contiene
el antgeno 3 somtico conocido como lipopolisacrido ,2(# una
capa densa intermedia# y la membrana plasmtica interna. Pn
espesor de 6.667D

m.
2.2.' /3LORACIONES VITALES
(on los montajes de materia 4i4a teCidos. (uelen utilizarse para
ello# determinados colorantes 9azul de metileno# rojo neutro) a
muy baja concentraciones 9&B&666# &B&6666). (u objeti4o es
"acilitar la obser4acin# mediante el colorante de la mor"ologa y
la estructura bacteriana# pero sin pro4ocar alteraciones celulares
ni destruir la bacteria.
2.0.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS
Este tipo de preparaciones son las ms "recuentes# tanto las
obtenidas directamente a partir de muestras clnicas como las
obtenidas a partir de desarrollo de culti4os.
,os pasos a seguir para la realizacin de una preparacin "ijada
y coloreada son<
a. C%Be##!(% *el F"$!,. 2uede prepararse a partir de
productos lquidos o slidos.
P"*'#$ l!D'!*. 2ara preparar un "rotis# se coloca sobre un
portaobjetos de 4idrio limpio y seco# una gota del material a
estudiar y se e$tiende con ayuda del asa de platino.
C'l$!. e% me*! ,(l!*. puede prepararse una suspensin
del material en una gota de solucin salina colocada
pre4iamente en el portaobjetos# e$tendindola con ayuda del
asa de platino.
b. Se#a*. (e dejar secar el "rotis a temperatura ambiente.
c. F!;a#!(%. ,a "ijacin tiene como objeto la inmo4ilizacin de
las estructuras del material a estudiar en un estado lo mas
pr$imo posible al estado 4i4o. /onsiste en una muerte rpida
de los microorganismos# debida a la coagulacin de las
alb%minas protoplsmicas. E$iste un gran n%mero de "ijadores#
tanto en "orma simple 9etanol# cido pcrico). ,as "ormas ms
habituales de "ijacin son< por el calor y alcohol en "ro.
d. Cl"a#!(%. Es el proceso de coloracin de los
microorganismos.
e. La.a*. Eliminacin del e$ceso de colorante.
f. Se#a*. (e secar la preparacin al aire.
CLASIFICACIN DE LAS COLORACIONES
,a clasi"icacin de los colorantes es algo con"usa# pero est
basada en los crom"oros presentes.
a. Se+E% ,' e,$"'#$'"a D'Cm!#a. 2ueden clasi"icarse como
Ucido o =sico# trmino que no ndica sus reacciones de p? en
solucin# sino# si una parte de la molcula es aninica o
catinica.
L, #l"a%$e, &:,!#,,

tiCen estructuras de naturaleza
cida# como la cromatina nuclear de las clulas. Ej< /ristal
4ioleta# Gioleta de Tenciana# Gerde de Aalaquita. (a"ranina.
L, #l"a%$e, :#!*,# reaccionan con sustancias bsicas#
tales como estructuras citoplsmaticas# y como colorante de
contraste. Ej< cido pcrico.
L, #l"a%$e, %e'$",# cuando se asocia un colorante
cido con uno bsico. Ej< Vright# Tiemsa# ?emato$ilina '
Eosina.
L, #l"a%$e, !%*!Be"e%$e,, suelen ser insolubles en agua
y solubles en alcohol. Ej< (udn +++.
CLASIFICACIN DE LAS TINCIONES
a. T!%#!%e, S!m)le,. (on las que utilizan un solo colorante y
permiten conocer la mor"ologa y tipo de agrupacin bacteriana.
ejemplo. )incin azul de metileno# )incin "ucsina.
b. T!%#!%e, D!Be"e%#!ale,. Ptilizan ms de un colorante y
sir4en para poner de mani"iesto las caractersticas de a"inidad
de los microorganismos por ciertos colorantes como; )incin
Tram# )incin cido'alcohol resistente.
c. T!%#!%e, E,$"'#$'"ale,. Ptilizan ms de un colorante y
sir4en para poner de mani"iesto estructuras bacterianas. como;
)incin de "lagelos# )incin de esporas# )incin de cpsulas#
)incin de corp%sculos metacromticos
IV. PROCEDIMIENTO E4PERIMENTAL
0.1. COLORACIONES VITALES
Estos tipos de e$menes pueden considerarse como
preparaciones en "resco o como tcnicas intermedias entre stas
y las preparaciones "ijadas y coloreadas. (on montajes de
materia 4i4a teCidas.
Ma$e"!al. Aicroscopio# ,minas portaobjetos# a e$aminar#
/ubreobjetos# (olucin de azul de metileno 9&B&666)# .sas de
platino# Trmenes di"erentes
P"#e*!m!e%$
' (obre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de
metileno 9lBl666).
' /olocar una gota de la muestra a e$aminar y con ayuda de
una asa de :olle mezclar. (eguir el procedimiento 9muestra
liquida o slida).
' 3bser4ar al microscopio con el objeti4o de H6O.
O&,e".a#!(% 5 Re,'l$a*,
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
0.2. PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS
P"e)a"a#!(% *el F"$!,
' Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo 4i4o.
(ostenga el asa inmediatamente arriba de la porcin azul de la
"lama. 2onga el asa tan cerca de la posicin 4ertical como sea
posible. Djela en"riar 9cuente hasta 26).
' )ome una porcin de la muestra que se 4a e$aminar#
colocando el asa en posicin plana en la super"icie del lquido.
' /oloque el asa sobre el portaobjeto y aplnese ligeramente
en el centro de ste 9el portaobjeto deber estar numerado).
' (osteniendo toda4a el asa aplanada sobre el portaobjeto
mu4ala trazando una espiral del centro a la peri"eria. Debe
dejar cierto espacio entre la muestra y cada uno de los H lados
del portaobjetos.
' Flamee de nue4o el asa hasta que est al rojo 4i4o para
destruir cualesquiera bacterias que se encuentren en ella.
F!;a#!(%
' /on"irme que el "rotis se ha secado completamente al aire
libre.
' 2ase el portaobjeto tres 4eces a tra4s de la llama del
mechero de =unsen# con la muestra hacia arriba.
' Djelo en"riar antes de aplicar la tincin.
0.0. TINCIONES SIMPLES
Ma$e"!al. Aicroscopio# ,minas portaobjetos# .zul de metileno
9solucin acuosa al &W)# (a"ranina 9solucin acuosa &W)# .sas de
platino# Trmenes di"erentes# .ceite de inmersin# Oilol
TINCIN DE AZ2L DE METILENO
,as bacterias aparecen de color azul# aunque el grado de
absorcin del colorante por los di"erentes microorganismos es
4ariable# y algunas estructuras como las esporas absorben el
colorante con di"icultad son as "cilmente di"erenciables.
P"#e*!m!e%$
' )ome una lmina portaobjeto limpia# coloque una gota de
agua destilada para hacer un "rotis.
' /on l esa tome una pequeCa porcin del culti4o en medio
slido y disuel4a en la gota de agua 9cuando el culti4o es medio
liquido no necesita de agua). ,os "rtices que se obtengan no
deben ser ni muy gruesos m muy "inos.
' Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama
sua4emente para obtener la "ijacin del "rotis.
' /ubrir la preparacin con el colorante 92 o gotas) y se deja
actuar de unos D minutos.
' ,a4ar bien con agua corriente# e4itando que el chorro de
agua caiga directamente sobre el "rotis# hasta quitar el e$ceso
de colorante.
' (ecar al aire# a temperatura ambiente.
' 3bser4ar al microscopio con lente de inmersin. 9&66O) y
con aceite de inmersin.
O&,e".a#!(% 5 Re,'l$a*,
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
TINCIN DE SAFRANINA
,as bacterias aparecen de color rojo.
P"#e*!m!e%$
' )ome una lmina portaobjeto limpia# coloque una gota
de agua destilada para hacer un "rotis.
' /on el asa tome una pequeCa porcin del culti4o en
medio slido y disuel4a en la gota de agua 9cuando el culti4o
es medio liquido no necesita de agua). ,os "rtices que se
obtengan no deben ser ni muy gruesos ni muy "inos.
' Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la
llama sua4emente para obtener la "ijacin del "rotis.
' /ubrir la preparacin con el colorante de sa"ranina 92
gotas) y se deja actuar de unos D minutos.
' ,a4ar bien con agua corriente# e4itando que el chorro
de agua caiga directamente sobre el "rotis# hasta quitar el
e$ceso de colorante.
' (ecar al aire# a temperatura ambiente.
' 3bser4ar al microscopio con lente de inmersin. 9&66O)
y con aceite de inmersin.
O&,e".a#!(% 5 Re,'l$a*,
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
0.1. COLORACIONES DIFERENCIALES
Ma$e"!al. Aicroscopio# ,minas portaobjetos# (et para la
coloracin de Tram# .sas de platino# Trmenes di"erentes#
.ceite de inmersin.
TINCIN ?RAM
El cristal 4ioleta act%a como un colorante primario# que se une a
la pared celular bacteriana luego de un tratamiento con una
solucin dbil de iodo 9Aordiente). .lgunas bacterias debido a su
naturaleza qumica de sus paredes celulares# poseen la
capacidad de retener el cristal 4ioleta# a%n luego del tratamiento
con un decolorante orgnico# tal como una mezcla de alcohol y
acetona. )ales bacterias se denominan Trampositi4as.
,as bacterias Tramnegati4as debido a su mayor contenido
lipdico en su pared celular# pierden la coloracin primaria del
cristal 4ioleta cuando son tratadas con el decolorante. El
colorante secundario o de contraste utilizado es la sa"ranina. ,as
bacterias Tramnegati4as que han perdido el cristal 4ioleta#
aparecen rojas o rosadas 4istas al microscopio# habiendo "ijado
la sa"ranina como contracolor a sus paredes celulares.
,as bacterias aparecen de color azul# aunque el grado de
absorcin del colorante por los di"erentes microorganismos es
4ariable# y algunas estructuras como las esporas absorben el
colorante con di"icultad son as "cilmente di"erenciables.
Rea#$!.,
' (olucin de /ristal Gioleta9/ristal 4ioletaQ &.6 g# .lcohol XD8
Q 26 ml# .gua destilada cspQ&66 ml)
' (olucin de ,ugol 9Iodo en cristales# &.6 g# Ioduro de
potasioQ 2.6 g# .gua destiladaQ&66 ml)
' Decolorante 9.cetonaQ D6 ml# EtanolQ D6 ml)
' (a"ranina 9 (a"raninaQ 6.2D g# .lcohol XD8Q &6 ml# .gua
destilada cspQ&66 ml)
P"#e*!m!e%$
' /oloque una azada de caldo nutriti4o que contiene una
mezcla de bacterias Trampositi4as y Tramnegati4as sobre una
lmina portaobjeto limpia.
' Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama
sua4emente para obtener la "ijacin del "rotis# con la "inalidad de
que el material no sea arrastrado durante el proceso de tincin.
' /olocar el preparado sobre un soporte de tincin y cubrir la
super"icie con solucin de cristal 4ioleta por & minuto. ,a4ar bien
con agua de caCo.
' /ubrir el preparado con +odo de Tram durante & minuto.
,a4ar con agua.
' (ostener el portaobjeto entre el pulgar y el ndice y baCar la
super"icie con unas gotas del decolorante acetona'alcohol hasta no
arrastrar ms colorante 4ioleta. (e requiere unos &6 segundos ms
o menos.
' /ubrir la super"icie con la sa"ranina durante & minuto. ,a4ar
con agua de caCo.
' (ecar al aire# a temperatura ambiente.
' 3bser4ar al microscopio con lente de inmersin. 9&66O) y
con aceite de inmersin.
O&,e".a#!(% 5 Re,'l$a*,
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
V. C2ESTIONARIO
&. JKu es un colorante y cules son sus propiedadesL
2. J2or qu se le llama a un colorante cido o bsicoL
. J. qu se debe la a"inidad que tiene un colorante
por la bacteriaL
H. JDe qu manera in"luye el p? en la coloracinL
5. J2or qu es necesario utilizar mtodos de tincin
para 4isualizar a las bacteriasL
5. Escriba la estructura del azul de metileno y
sa"ranina
7. Aencione H microorganismos que tengan la "orma
de bacilos
>. Aencione H microorganismos que tengan la "orma
de espirales
X. Dibuje los componentes de la pared celular de los
microorganismos grampositi4os y e$plique la "uncin que cumple
cada uno de ellos.
&6. Dibuje los componentes de la pared celular de los
microorganismos gramnegati4os y e$plique la "uncin que
cumple cada uno de ellos.
&&. E$plique el "undamento de la coloracin de Tram y
esquematice.
&2. J. qu se denomina mordiente y mencione tres
ejemplosL
&. Aencione tres razones por las que un
microorganismo grampositi4o se obser4a gramnegati4o.
&H. Dibuje la estructura del colorante cristal 4ioleta
&D. Aencione tres microorganismos 9gnero) que sean
cocos grampositi4os# bacilos# grampositi4os# cocos gramnegati4o
y bacilos gramnegati4os.