Universidad De Nario - Facultad De Ciencias Exactas Y Naturales diegofer1414@hotmail.com, angevanne02@gmail.com. Introduccin En un sistema biolgico se define al crecimiento como el aumento ordenado de las estructuras y los constituyentes celulares de un organismo. Segn ello, el aumento de la masa celular producido por acumulacin de productos de reserva (glucgeno, poli- hidroxibutirato) no constituyen crecimiento. Se puede considerar como crecimiento al incremento de clulas individuales por un lado, y por otro lado se puede considerar al crecimiento del nmero de clulas (proliferacin de la poblacin). En lo que se refiere al crecimiento de clulas individuales, este consiste en el aumento del tamao y peso de las clulas que precede a la divisin celular. Esta divisin trae aparejada un aumento en el nmero de clulas (proliferacin de la poblacin). Las bacterias se dividen por fisin binaria, a travs de la una cual clula madre al alcanzar un determinado volumen se divide dando dos clulas hijas. El proceso de fisin binaria consiste en la autoduplicacin del material hereditario seguido de la reparticin en las dos clulas hijas, las que se separan por estrangulamiento de la membrana celular y formacin de la pared celular. Los mtodos directos de cuantificacin de microorganismos permiten establecer la poblacin total de microorganismos existentes, tienen la ventaja de ser rpidos aunque no es posible diferenciar a las clulas vivas de las muertas. Entre estos mtodos tenemos la turbidimetra y el conteo de clulas.
Recuento microscpico: Un volumen conocido de muestra es depositado en un portaobjetos especial para cuenta (hemacitmetros, cmaras de Petroff-Hauser, Neubauer o de Helber; estas consisten de portaobjetos excavados y cuadriculados que facilitan el recuento por unidad de superficie y de volumen. Con la cuantificacin de microorganismos a travs del tiempo es posible el representar grficamente el crecimiento microbiano. La curva presenta distintas fases: Fase de latencia lag: perodo de adaptacin de un microorganismo a un nuevo medio de cultivo. Fase exponencial o logartmica: aumento regular de la poblacin que se duplica a intervalos regulares de tiempo (td). Fase estacionaria: cese del crecimiento por agotamiento de nutrientes, por acumulacin de productos txicos, etc. Fase de declinacin o muerte: el nmero de clulas que mueren es mayor que el nmero de clulas que se dividen. Objetivos. - Determinar el crecimiento microbiano mediante conteo de clulas y turbidimetra para obtener la curva de crecimiento. - calcular el tiempo de duplicacin y la ecuacin de la recta de la fase exponencial. MATERIALES Y MTODOS En la practica de laboratorio inicialmente se recibi una muestra inoculada de E.coli en 45ml de caldo nutritivo en Erlenmeyer de 50ml, de esta sustancia se tom 6ml y se la agreg a 1 tubo de ensayo que previamente fue marcado y se le midi la absorbancia (No) en el espectrofotmetro, este tubo fue tambin delimitado en funcin del tiempo t=0, seguidamente se pipeteo en los 7 tubos restantes 6 ml de TSB cultivo activo y se llevo a incubadora a 36 C, y posteriormente se midi la absorbancia y el crecimiento cada cierto tiempo; el crecimiento se lo realiza a travs del conteo en cmara, mediante el microscopio. Resultados y discusin. hora absorbancia Conteo en la cmara
1. Medicin de la densidad bacteriana. - grafica de crecimiento de E. coli
Grafica 1 cintica de crecimiento en funcin del aumento de masa celular D.O -Crecimiento balanceado. Una poblacin de bacterias que se encuentre en un medio adecuado en el que se mantienen constantes todos sus parmetros nutricionales y ambientales, crece de forma tal que el incremento por unidad de tiempo de masa celular, n de clulas, ADN, ARN, protenas, etc., es un valor constante y similar en cada caso: AM/M = AN/N = A[ADN]/[ADN] = A[protenas]/[protenas] = ... = K As pues, durante este crecimiento, de tipo exponencial o logartmico, el cultivo se comporta como una reaccin auto cataltica de primer orden: Velocidad de aumento del componente= = K{cantidad del componente} y = 0.1022e 0.0104x
R = 0.8893 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0 50 100 150 L n
D . O
( n m )
tiempo (min) cinetica de crecimiento E. coli Ln D.O Expon. (Ln D.O) Tambin se puede decir que el n de clulas, la masa celular u otros componentes se duplican en un mismo lapso de tiempo determinado. Este tipo de crecimiento se denomina balanceado o equilibrado. Se caracteriza, pues, por ser el crecimiento en el que todos los constituyentes celulares se duplican en un mismo tiempo, o dicho de otra manera: Aquel en el que estos constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de tiempo. Este factor es el coeficiente exponencial de crecimiento (), que es caracterstico para cada cepa bacteriana en cada medio determinado. -Expresin matemtica del crecimiento balanceado. Para deducirla se parti de la definicin emprica anterior, atendiendo por un lado al aumento de la masa celular, y por otro al incremento del nmero de individuos. 1. En funcin del aumento de masa celular D.O. , y por lo tanto, dM = Mdt Si integramos, resulta: M/M 0 = e (t-t0)
Si se presta atencin a e (t-t0) en la grafica corresponde a la variable Y, por lo tanto vamos a tener el valor de
= 0,1022c 0,0104 (coeficiente exponencial de crecimiento VC). Una vez obtenido este valor, se puede estimar el tiempo de generacin, as como tambin el coeficiente de correlacin (R2) R = 0,8893, nos muestra una correlacin positiva de relacin directa. Se tiene en cuenta ahora que la velocidad de crecimiento VC es relativa al tiempo de generacin tg. Tambin conocido como tiempo de duplicacin. La explicacin matemtica se la da mas adelante. Vc tg -Vc= Ln 2/ tg - tg= Ln2/ -tg= 0.693/ 0.1022= 6.78 h^(-1) tiempo de generacin o tiempo de duplicacin. 2. En funcin del aumento del numero de clulas.
Grafica 2. Velocidad de crecimiento de un cultivo microbiano. Escala lineal. Datos de la poblacin duplicada cada 17 min Supongamos que partimos de una clula. Tras una divisin (generacin celular), tendremos 2, tras dos divisiones tendremos 4, luego 8, etc: tenemos una y = 0.3813x + 14.478 R = 0.5917 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 50 100 150 l o g
d e l
n u m e r o
d e
c e l u l a s
Tiempo (min) Biomasa vs tiempo Valores Y Linear (Valores Y) serie geomtrica. 1, 2, 2 2 , 2 3 , 2 4 ,... 2 n (donde n es el nmero de generaciones transcurridas). Si en vez de partir de una clula partimos de N 0
clulas iniciales, tenemos: N = N 0 2 n ; por lo tanto: N/N 0 = 2 n {2.1} Por otro lado, el nmero de generaciones se puede calcular fcilmente teniendo en cuenta el tiempo transcurrido y conociendo el tiempo medio de generacin (g):
Sustituyendo esta expresin en la frmula {12.3} tenemos: N/N 0 = 2 (t-t0)/g
Aplicamos logaritmos neperianos:
{2.2} Ahora bien, como estamos ante un crecimiento balanceado, las dos expresiones matemticas {1.1} y {2.2} que se ha deducido (la de la seccin A, basada en masa, y la de la seccin B, basada en nmero de individuos) son equivalentes: , y por lo tanto: (t-t 0 ) = (t-t 0 )/gln2, de donde se deduce el valor del coeficiente de crecimiento exponencial: , expresado en h -1
Esta es la expresin matemtica del coeficiente del crecimiento balanceado, en funcin del tiempo medio de generacin (g). En nuestro caso como ya se conoce el valor de Y en la grafica que corresponde a (Y= ) simplemente despejamos g en la ecuacin lo que nos quedara de esta manera: Tg= Ln2/ Tg= 0.693/ 0.38 = 1.82 tiempo de generacin. Las graficas presentadas tienen en cierta forma el modelo tpico de crecimiento, aunque en ellas solo se observa la fase exponencial y no se observa ni la fase estacionaria, ni la fase de muerte. El periodo de latencia para E. coli esta entre los primeros 15-20 minutos de inoculacin despus de los cuales las graficas presentan un aumento de D.O y biomasa. Cabe resaltar que en la grafica la escala no resulto lineal debido a que el primer conteo microscpico del numero de bacterias que se realiz en la cmara fue muy alto con respecto a las siguientes lecturas, por tal razn se presenta el primer pico y de all se observa como ya retorna al crecimiento exponencial normal; este error en el conteo puede deberse a posibles errores de tipo humano. Turbidez. La turbidimetra mide la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas de una suspensin y cuantifica la luz residual transmitida Este mtodo se emplea ampliamente para seguir el crecimiento de cultivos microbianos; se puede medir repetidamente la misma muestra y construir grficos semilog para calcular tiempos de generacin. El principio de esto es que cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida; la energa radiante no puede producir ningn efecto sin ser absorbida. -Mtodos de medicin del crecimiento- Conteo microscpico directo Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de microbiologa, ya que consiste en contar con un microscopio la cantidad de clulas presentes en un volumen determinado. Para estos recuentos se utilizan generalmente cmaras de recuentos (cmara de Petroff Hauser, cmara de Neubaver Fig. 5- ). Una de las mayores ventajas del recuento microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de los objetos contados. Conclusiones. - mediante esta practica de laboratorio se aprendi los mtodos mediante el cual se logr cuantificar y graficar una poblacin de bacterias. - en todos los casos de crecimiento poblacional, este tiene una tendencia exponencial, teniendo en cuenta que primero tiene un periodo de latencia. - una desventaja del mtodo de conteo es el cansancio que le genera al operador, mientras cuenta, esto puede llevar a cometer errores. Bibliografa. 1. - Manual prctico de Microbiologa, Carlos Gamazo y Eduardo Lpez, Espaa, 2005, p. 39 2. http://www.microinmuno.qb.fcen.u ba.ar/SeminarioRecuento.htm 3. Robert L. Pecsok y L. Donal Shields, Mtodos modernos de anlisis qumicos, Editorial Limusa. 4. Brock, T. & M. Madigan. 1993. MICROBIOLOGA. 6ta Edicin. Prentice Hall Hispanoamrica S. A. Mxico. Cuestionario. - Fase exponencial o logartmica: en ella la velocidad de crecimiento es mxima y el tiempo de generacin es mnimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad mxima los nutrientes del medio. La evolucin del nmero de clulas durante esa fase se explica con los modelos matemticos que describiremos a continuacin. 2. Una representacin semilogartmica: es una representacin grfica de una funcin o de un conjunto de valores numricos, en la que el eje de abscisas o el eje de ordenadas tienen escala logartmica mientras el otro eje tiene una escala lineal o proporcional. Si la representacin se hace manualmente, se emplea papel semilogartmico,1 que posee la escala con las marcas adecuadas para este tipo de representaciones. Se emplean logaritmos decimales, de base 10. 3. La fase de latencia: se caracteriza por la adaptacin de los microorganismos, no se presenta cuando el inoculo es nuevo y si el inoculo proviene de un cultivo viejo, requiere de este periodo de adaptacin. 4. En la fase estacionaria: no hay una modificacin neta en el nmero de clulas, existe un frgil equilibrio que desaparece eventualmente cuando an las bacterias metablicamente activas mueren, debido a productos txicos y falta de nutrimentos (factores presentes en la fase estacionaria) asociados a enzimas liberadas por la lisis bacteriana.
5. El conteo bacteriano seala la magnitud de la poblacin total bacteriana. En ese sentido se puede determinar por diversas tcnicas que se basan en algunos de los siguientes tipos de medida: cuenta celular (directamente al microscopio o mediante un contador electrnico de partculas o indirectamente con la cuenta de colonias), masa celular (en forma directa pesando el contenido celular del nitrgeno o indirectamente por turbidimetra, proporcional al nmero de clulas) y actividad celular (indirectamente relacionando el grado de actividad bioqumica al tamao de la poblacin bacteriana). Existen muchos medios diferenciales, en la prctica rutinaria se usan los siguientes: Conteo en caja de petri Mtodo ms usado para contar bacterias. Un caldo de cultivo con microorganismos es diluido y posteriormente muestras del mismo son distribuidas en la caja de petri contenedora de agar. Es de suponerse que cada clula se dividir en sus mltiples alrededores para producir colonias separadas en el agar. Cada clula es llamada unidad formadora de colonias (UFC). Despus de la incubacin, el nmero de colonias se reflejar en el nmero de clulas UFC originalmente presentes. Es importante considerar un nmero limitado de colonias pues de no ser as, stas pueden sobre poblarse y dificultar el conteo de las mismas (rango sugerido de acuerdo a FDA 25-250 colonias). El conteo se facilita utilizando un contador de colonias. Este mtodo es deseable porque arroja el total de clulas viables (slo clulas vivas); en contraste con el conteo microscpico y el conteo de peso seco. Una desventaja radica en el tiempo que requiere para producir las colonias, ya que se necesitan como mnimo veinticuatro horas o ms. Por otra parte, no es cien por ciento fiable porque generalmente las colonias crecen unidas en cadenas o en grupos. Conteo por filtracin Es realizado cuando la cantidad de bacterias es muy pequea, como en casos de lagos y arroyos relativamente puros. En esta tcnica se necesitan al menos 100 mL de agua que atraviesen una membrana delgada de un filtro, con poros tan pequeos que no permitan el paso de bacterias, de esta forma stas son retenidas en la superficie del filtro. Posteriormente el filtro es transferido a una caja de petri que cuenta con un caldo nutritivo, en la cual las colonias surgen de las bacterias en la superficie del filtro. Las colonias bacterianas formadas por este mtodo son distintivas cuando ocupan un medio diferencial. Este mtodo es aplicado frecuentemente en la deteccin y enumeracin de bacterias coliformes, las cuales son indicadores de contaminacin fecal en la comida o en el agua. Mtodo del nmero ms probable (NMP) Es una tcnica de estimacin estadstica basada en el hecho que a mayor nmero de bacterias en una muestra, mayor ser la dilucin necesitada para reducir la densidad hasta el punto en que ninguna bacteria se le permita crecer en la serie de tubos de dilucin. Muestras microbianas son aadidas a tubos con caldos de lactosa y la presencia o ausencia de gas formado en la fermentacin y da un estimado de nmero de clulas. Este mtodo es ms til cuando las bacterias que estn siendo contados no crecern en medios slidos, como en el caso de Chemoautotrof phic nitrifying bacteria. Tambin es til cuando el crecimiento de la bacteria es en un medio lquido diferencial, usado para identificar microbios, como en bacterias coliformes. El NMP es la nica afirmacin en la cual existe 95% de probabilidad que la poblacin bacteriana sea de rango correcto, siendo el nmero estadstico ms probable. Determinacin directa por microscopio Las clulas se pueden contar en un frote teido, como es el caso del Mtodo de Breed, colocando en la preparacin un volumen conocido de la suspensin de clulas sobre un rea conocida del portaobjetos. Despus de haber fijado y teido el frote, es posible contar con un microscopio las bacterias. Como no es prctico recorrer toda el rea, se cuenta el nmero de clulas en unos cuantos campos microscpicos seleccionados al azar. Si el dimetro del campo microscpico se mide con micrmetro objetivo, se puede calcular fcilmente el rea, entonces el nmero de campos en 1 cm2 se multiplicar por el promedio del nmero de clulas por campo y despus por 100 (si se vierte 0.01 mL) el resultado ser igual al nmero de clulas por mililitro. Este mtodo es susceptible a muchas crticas debido a su falta de uniformidad al momento de hacer el frote. Mtodo de turbiedad Para algunos experimentos, es necesario estimar turbiedad, ya que es una forma prctica de monitorear el crecimiento bacteriano. Como una bacteria se multiplica en un medio lquido, ste se torna turbio o de aspecto nublado por las clulas. El instrumento usado para medir la turbiedad es un espectrofotmetro (colormetro). En el espectrofotmetro, un haz de luz es transmitido a travs de la suspensin bacteriana a un detector sensible a la luz. Mientras incremente el nmero de bacterias, menor ser la luz captada por el detector. Este cambio en la luz se registrar en la escala del instrumento como el porcentaje de transmisin. Tambin se registra una expresin logartmica llamada absorbancia (algunas veces nombrada densidad ptica), un valor derivado del porcentaje de transmisin que puede ser reportado. Ms de un milln de clulas por milmetro deben estar presentes para que la primera seal de turbiedad sea visible. Aproximadamente de 10 millones a 100 millones de clulas por mililitro son necesitadas para hacer una suspensin suficientemente turbia para leer en el espectrofotmetro. La turbiedad no es til para medir contaminacin en lquidos por la pequea cantidad relativa de bacterias. Determinacin del peso seco en las clulas Es el mtodo ms directo para las mediciones cuantitativas de la masa celular y probablemente el ms fcilmente realizable y reproducible, aunque se debe aplicar slo en suspensiones celulares muy densas y las clulas deben ser lavadas muy bien para removerles todo material extra. Se utiliza para bacterias filamentosas y mohos. En este proceso, el fungus es removido del medio de crecimiento, filtrado para remover material extrao, drenado en un secador y despus es pesado. 6. El recuento de viables es con mucho el mtodo ms sensible para le determinacin del nmero de bacterias ya que permite detectar incluso una sola clula viable en una suspensin su exactitud depende de que se tomen cierta precauciones. El nmero de colonias que se cuentan debe ser significativo (el error estndar es aproximadamente igual a la raz cuadrada del nmero de colonias contadas); preferiblemente se deben contar 2 o 3 placas con varios cientos de colonias en cada una. As mismo, si se est determinando el nmero de clulas en un cultivo en crecimiento, es importante tener en cuenta que ese nmero continua creciendo durante el proceso de divisiones celulares y se examina con el microscopio contraste de fases. En estas condiciones, resulta fcil identificar las clulas viables, ya que forman microcolonias, pudindose determinar con precisin su proporcin respecto a las no viables, que no se multiplican.
7. La constante de la velocidad de crecimiento se expresa como constante de la velocidad de crecimiento se expresa como k= In2 = 0.693 g y tienen unidades de hora 1. Mientras que g es una medida del tiempo que tarda una poblacin en duplicar su nmero de clulas, k es una medida del nmero de generaciones que ocurren por unidad de tiempo en un cultivo exponencial.