Biotecnolog

Biotecnolog

a Industrial
a Industrial
Producci
Producci

n industrial de Metabolitos
n industrial de Metabolitos
Biorreactores
Biorreactores
CONCEPTOS y TECNICAS de
CONCEPTOS y TECNICAS de
BIOTECNOLOGIA
BIOTECNOLOGIA
(
(
FCEyN
FCEyN

UBA )
UBA )
Miryan Cassanello
PINMATE Dep. Industrias, FCEyN-UBA
E-mail: miryan@di.fcen.uba.ar
Estadstica: ao 2002
(Fuente: Kent y Riegel, 2007)
Relevancia econmica de los
productos generados industrialmente
mediante procesos biotecnolgicos
Productos
Productos
biotecnol
biotecnol

gicos
gicos
:
: estn en todos los sectores de la
drogas (genricas
y no-genricas)
productos de
belleza
procesamiento de
alimentos para
humanos y
animales
procesamiento
textil y artculos
de limpieza
aplicaciones
industriales:
produccin masiva
de alcohol
suplementos
nutricionales
vida diaria:
Productos Organismo tpico utilizado Mercado
mundial
(ton/ao)
Alcoholes Etanol Saccharomyces cerevisiae 20 millones
Butanol/acetone Clostridium acetobutylicum 2.000
cidos
orgnicos
Acido ctrico Aspergillus niger 230.000
Acido glucnico Aspergillus niger 50.000
Acido lctico Lactobacillus delbrueckii 20.000
Aminocidos Acido L-
glutmico
Corynebacterium glutamicum
300.000
L-lisina Brevibacterium flavum 30.000
L-fenilalanina Corynebacterium glutamicum 2.000
L-arginina Brevibacterium flavum 2.000
Antibiticos Penicilinas Penicillium chrysogenum 40.000
Cefalosporinas Cephalosporium acremonium 10.000
Tetraciclinas Streptomyces aureofaciens 10.000
Productos obtenidos mediante procesos biotecnol
Productos obtenidos mediante procesos biotecnol

gicos
gicos
(Fuente: Doran, 1995) (Fuente: Doran, 1995)
Producto Organismo tpico utilizado Mercado mundial
(ton/ao)
Enzimas Proteasas Bacillus spp. 600
-Amilasa Bacillus amyloliquefaciens 400
Glucoamilasa Aspergillus niger 400
Glucosa isomerasa Bacillus coagulans 100
Pectinasa Aspergillus niger 10
Polmeros Xantanos Xanthomonas campestris 5.000
Dextrano Leuconostoc mesenteroides 200
Vitaminas B12 Propionibacterium shermanii 10
Vacunas Difteria Corynebacterium diphterie < 50 kg/ao
Ttanos Clostridium tetani Pequea
Protenas
teraputicas
Insulina Escherichia coli recombinante < 20 kg/ao
Interfern-
2
Escherichia coli recombinante 10
Hormona de
crecimiento
Escherichia coli recombinante o
clulas recombinantes de
mamferos
Pequea
BIOTECNOLOGIA
BIOTECNOLOGIA
Biotecnolog Biotecnolog a a
ROJA ROJA
Biotecnolog Biotecnolog a a
BLANCA BLANCA
Biotecnolog Biotecnolog a a
VERDE VERDE
Biotecnolog Biotecnolog a a
AZUL AZUL
Biotecnologa BLANCA (o industrial):
Aplicacin en la industria en general,
productos qumicos, nuevos materiales,
biocombustibles, etc.
Biotecnologa VERDE:
Aplicacin en agro-
alimentos
Biotecnologa AZUL:
Aplicacin en
organismos marinos
Biotecnologa ROJA:
Aplicacin en medicina
Ingenier
Ingenier

a
a
Qu
Qu

mica
mica
Qu
Qu

mica
mica
Biolog
Biolog

a
a
Bioqu
Bioqu

mica
mica
BIOTECNOLOGIA
BIOTECNOLOGIA
INDUSTRIAL
INDUSTRIAL
Biotecnologa : actividad multidisciplinaria que comprende la
aplicacin de los principios cientficos y de la ingeniera al
procesamiento de materiales por agentes biolgicos para proveer
bienes y servicios. (Definicin de la OECD)
Agentes biolgicos: clulas microbianas, animales, vegetales y
enzimas.
Bienes: cualquier producto industrial (alimentos, bebidas,
productos medicinales, etc.
Servicios: especialmente los relacionados con la purificacin de
aguas y tratamiento de efluentes.
Bibliografa libros de texto
Bioprocess Engineering. Basic concepts, Michael L. Shuler, Fikret
Kargi, Prentice Hall Int. Series, 2
nd
Ed. 2002.
Kent and Riegels Handbook of Industrial Chemistry and
Biotechnology, J.A. Kent (Ed.), Chapter 30: Industrial
Biotechnology: Discovery to Delivery, G. Chotani, T. Dodge, A.
Gaertner, M. Arbige, Springer, 11
th
Ed. 2007.
Principios de Ingeniera de los bioprocesos, Pauline M. Doran,
Editorial Acribia S.A, Zaragoza, Espaa. 1995. (Traducido 1998)
Biochemical Engineering Fundamentals, James E. Bailey, David. F.
Ollis, McGraw-Hill Int. Ed., 2
nd
. Ed. 1986.
Biochemical engineering and biotechnology, Ghasem Najafpour,
Elsevier, (2007) ISBN-10: 0444528458; ISBN-13: 978-0444528452
Bioreaction Engineering Principles, Jens Nielsen, John Villadsen,
Gunnar Lidn. Springer, 2da. Ed. (2005). ISBN-10: 0306473496;
ISBN-13: 978-0306473494
Bibliografa algunos reprints de biotecnologia industrial
Xu, J., Ge, X., Dolan, M.C., Towards high-yield production of pharmaceutical
proteins with plant cell suspension cultures. Biotechnology Advances 29 (2011)
278299
Brennan, L., Owende, P., Biofuels from microalgaeA review of technologies for
production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable and
Sustainable Energy Reviews 14 (2010) 557577
Huang, T-K., McDonald, K.A., Review: Bioreactor engineering for recombinant
protein production in plant cell suspension cultures. Biochemical Engineering
Journal 45 (2009) 168184
Rosche, B., Li, X.Z., Hauer, B., Schmid, A., Buehler, K., Microbial biofilms: a
concept for industrial catalysis? Trends in Biotechnology 27 (2009) 636643
Lacaze, G., Wick, M., Cappelle, S., Emerging fermentation technologies:
Development of novel sourdoughs. Food Microbiology, 24 (2007) 155160
Gavrilescu, M., Chisti, Y., Biotechnologya sustainable alternative for chemical
industry. Research review paper. Biotechnology Advances, 23 (2005) 471499
Butler, M., Animal cell cultures: recent achievements and perspectives in the
production of biopharmaceuticals. Appl Microbiol Biotechnol, 68 (2005) 283291
Kretzmer, G., Industrial processes with animal cells. Appl Microbiol Biotechnol, 59
(2002) 135142
Objetivo de la
produccin
industrial de
clulas o de
microorganismos
Producir las mismas clulas o
microorganismos (biomasa) en
gran escala
Producir en gran escala
compuestos (intracelulares o
extracelulares) resultantes del
crecimiento celular
(metabolitos)
Metabolitos
Primarios
Metabolitos
Secundarios
Metabolitos primarios
Metabolitos primarios
-Molculas generalmente sencillas, que participan de los caminos
metablicos esenciales. Son casi idnticos en todos los organismos.
-Son ms baratos y sencillos de producir, tienen bajo contenido de
actividad biolgica y frecuentemente son commodities
1. Componentes esenciales de las clulas/microorganismos:
protenas, cidos nuclicos, polisacridos (gelanos, xantanos) y
polisteres, cidos grasos (insaturados), esteroles.
2. Derivados del metabolismo intermedio: azcares (fructosa,
ribosa, sorbosa), cidos orgnicos (gluconato, cido lctico,
ctrico, actico, propinico, succnico, fumrico), alcoholes
(xilitol, etanol, glicerol, sorbitol, butanol), aminocidos (Lys,
Thr, Glu, Trp, Phe), vitaminas (B2, B12), nucletidos
saborizantes (cidos inocnico y guanlico), polisacridos y
polisteres de reserva.
Microorganismos productores: bacterias, levaduras y hongos
Metabolitos secundarios
Metabolitos secundarios
-Molculas mas complejas, que participan de caminos metablicos
no-esenciales, pero confieren capacidades de supervivencia en
situaciones de stress.
-Son muy variados y su estructura es fuertemente dependiente de la
especie y variedad utilizada para su produccin. Se generan en
condiciones particulares y son ms valiosos y complicados de
producir alto contenido de actividad biolgica
-Generalmente son productos especiales (alto precio). Funcionan
en los organismos que los producen como:
1. Armas contra otros microorganismos (antibiticos, toxinas,
inhibidores enzimticos, pesticidas)
2. Factores de crecimiento (hormonas)
3. Ionforos
4. Agentes de interaccin microbiana
5. Efectores externos
PROCESOS BIOTECNOLOGICOS o
PROCESOS BIOTECNOLOGICOS o
FERMENTACIONES
FERMENTACIONES
Biorreactor
o
Fermentador
Procesos que se llevan a cabo en un bio-reactor mediante los cuales
se transforman los sustratos de un medio de cultivo (materias primas)
en metabolitos y/o en biomasa (productos) empleando para este fin
microorganismos, clulas o enzimas.
Operaciones
unitarias
Operaciones
unitarias
Principales etapas de un proceso biotecnol
Principales etapas de un proceso biotecnol

gico industrial:
gico industrial:
1) Propagacin de cultivos: comienza en un tubo de ensayo o un tubo
congelado o liofilizado donde se conserva la cepa de inters, o de
una colonia del microorganismo previamente seleccionado. Se
propaga en el laboratorio progresivamente aumentando el volumen
del medio de cultivo.
Esterilizacin
Preparacin de
medios
Fermentacin
Separacin
Purificacin
Propagacin
de los cultivos
2) Fermentacin: Se prepara el medio de nutrientes y se esteriliza. Se
siembra un tanque de inculos cuyo volumen depende de la escala
industrial. V
inoculos
~50-1000L y V
fermentador industrial
~10-1000 m
3
).
Tratamiento
de efluentes
3) Separacin y purificacin: operaciones mecnicas de ruptura de
clulas; separacin de insolubles por filtracin, centrifugacin o
sedimentacin; separaciones primarias por extraccin, absorcin,
adsorcin, ultrafiltracin; purificacin por extraccin lquido-
lquido, extraccin en dos fases acuosas o cromatografa de
afinidad; aislamiento y acondicionamiento del producto.
Principales etapas de un proceso biotecnol
Principales etapas de un proceso biotecnol

gico industrial:
gico industrial:
Esterilizacin
Preparacin de
medios
Fermentacin
Separacin
Purificacin
Tratamiento
de efluentes
Propagacin
de los cultivos
4) No tiene relacin directa con el producto pero es una etapa
imprescindible por los volmenes involucrados y para preservar el
medio.
Selecci
Selecci

n (
n (
screening
screening
)
)
En la seleccin del microorganismo/clula, se debe tener en cuenta:
1. La cepa a utilizar debe ser genticamente estable.
2. La velocidad de crecimiento debe ser alta.
3. La cepa debe estar libre de contaminantes.
4. Sus requerimientos nutricionales deben cubrirse con medios de
cultivo de costo reducido.
5. Deben ser de fcil conservacin por largos perodos de tiempo sin
prdida de sus caractersticas.
6. Debe realizar el proceso fermentativo completo en tiempo corto.
7. Si el objetivo es un producto, este debe ser de alto rendimiento y
de fcil recuperacin a partir del medio de cultivo.
Los nuevos mtodos de screening incorporan tcnicas de ingeniera
gentica para crear diversidad.
Preparaci
Preparaci

n de medios de cultivo
n de medios de cultivo

Esterilizaci
Esterilizaci

n
n
Los componentes de los medios de cultivo son los efectores
externos de naturaleza qumica que deben cumplir con los
requerimientos del crecimiento y de formacin de productos y
suministrar energa para el mantenimiento celular.
Componentes de un medio de cultivo:
1. Macronutrientes, agregados en concentraciones de g/L, fuentes
de C, N, S, P, K y Mg
2. Micronutrientes o elementos trazas, representados por las sales
de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co, agregados en conc. de mg o g/L
3. Factores de crecimiento, constituidos por compuestos orgnicos
que no son sintetizados por las clulas y de funcin metablica
especfica; se suministran en baja concentracin (vitaminas,
algunos aminocidos, etc.)
Preparaci
Preparaci

n de medios de cultivo
n de medios de cultivo

Esterilizaci
Esterilizaci

n
n
Los medios pueden clasificarse considerando la naturaleza
qumica de los componentes en:
1. Medios sintticos o medios qumicamente definidos
2. Medios complejos, en cuya composicin intervienen
sustancias de origen animal o vegetal (ej.: extracto de
levadura, macerado de maz, harina de soja, etc.) que aportan
las sustancias fundamentales pero son qumicamente
indefinidas y de composicin variable.
Cualquiera sea el medio de cultivo, se debe esterilizar previamente
a ponerse en contacto con el inculo. Esterilizar significa eliminar
toda forma de vida de un medio o material. Generalmente se lleva
a cabo por filtracin o calentamiento.
Separaci
Separaci

n y purificaci
n y purificaci

n (
n (
downstream
downstream
)
): depende de la
eficiencia del proceso y del producto a obtener
Cintica de crecimiento de biomasa
Definiciones
Crecimiento en cultivos discontinuos o batch: Factores que afectan
Cuantificacin de la velocidad de crecimiento: Modelos, Ecuacin
de Monod
Crecimiento en cultivos continuos: Quimiostato, turbidistato
Fermentaciones
Fermentaciones
-
-
fermentadores o
fermentadores o
biorreactores
biorreactores
Es el corazn del proceso y debe optimizarse para evitar posteriores
etapas de separacin y purificacin.
Fermentaciones
Para el diseo de los biorreactores se debe considerar la cintica del
crecimiento de las clulas o microorganismos (biomasa) y la
velocidad de formacin de los productos deseados.
discontinuas o batch
semicontinuas (fed-batch)
continuas
Cin
Cin

tica de crecimiento microbiano

tica de crecimiento microbiano
nX P X S + +

El crecimiento microbiano es un ejemplo de reaccin auto-
cataltica. La velocidad de crecimiento est relacionada con la
concentracin de clulas.

biomasa de
cantidad mayor

ares extracelul
productos
biomasa ustrato S + +
aumento en el nmero de clulas
aumento del tamao de las clulas
Crecimiento
dt
dX
X
1
neta

X: concentracin msica de clulas (g/L)
t: tiempo (h)
Velocidad especfica neta de
crecimiento (h
-1
):
La velocidad especfica neta de crecimiento es la diferencia entre la
velocidad de crecimiento y la velocidad de desaparicin de biomasa
por muerte celular o por metabolismo endgeno:
Tambin se puede expresar la velocidad en funcin de la
concentracin de nmero de clulas en lugar de la concentracin
msica de las mismas. Si no se pueden medir las dos, se prefiere
la concentracin msica.
Formas de medir la concentracin de clulas
Directos
Indirectos
Mtodos
Se busca un mtodo rpido, fcil de seguir en lnea o de respuesta
rpida.
d g neta
k =
Determinaci
Determinaci

n de la concentraci
n de la concentraci

n m
n m

sica de c
sica de c

lulas:
lulas:
Mtodos directos (en ausencia de otros slidos en suspensin):
Masa de clulas secas (centrifugado/filtrado/lavado/secado)
Volumen de clulas centrifugadas en condiciones estndar
Absorcin de luz por clulas en suspensin
Mtodos indirectos: se basan en un efecto que inducen, como ser la
velocidad de consumo de un sustrato o de formacin de un producto.
Productos: etanol, CO
2
Sustratos: consumo de O
2
o de un sustrato base de C o N
Propiedades fsico-qumicas: viscosidad, pH
Ejemplo: seguir la concentracin de ATP, proporcional a la masa
de clulas.
UZ L O ATP uciferina l
luciferasa
2
+ +
Sensible
> 10
-12
gATP/L
Cin
Cin

tica de crecimiento de un cultivo en

tica de crecimiento de un cultivo en
batch
batch
Etapas: Etapas:
1) de latencia o
induccin
2) de crecimiento
exponencial
3) de desacelera-
cin
4) estacionario
5) de muerte o
declinacin
celular
1)
1) Latencia Latencia: : adaptacin del inculo al medio. Depende del inculo
(edad y tamao) y de los nutrientes. Se puede adaptar ex-situ.
2) 2) Crecimiento exponencial: Crecimiento exponencial: rpida multiplicacin de clulas
crecimiento balanceado (composicin de clulas constante).
3) 3) Desaceleraci Desaceleraci n: n: por consumo de un nutriente esencial o generacin de
subproductos txicos crecimiento desbalanceado, las clulas deben
readaptarse a las condiciones hostiles.
4) 4) Estacionario: Estacionario: velocidad de crecimiento nula. Las clulas an son
activas y pueden producir metabolitos secundarios (ej. antibiticos,
hormonas) productos de la desregulacin celular
5) 5) Muerte: Muerte: baja el nmero de clulas, difcil definir el lmite con la
etapa anterior.
1)
1) Latencia Latencia: : adaptacin del inculo al medio. Depende del
inculo (edad y tamao) y de los nutrientes. Se puede adaptar
ex-situ.
2) 2) Crecimiento exponencial: Crecimiento exponencial: rpida multiplicacin de clulas
crecimiento balanceado (composicin de clulas constante).
3) 3) Desaceleraci Desaceleraci n: n: por consumo de un nutriente esencial o
generacin de subproductos txicos crecimiento
desbalanceado, las clulas deben readaptarse a las condiciones
hostiles.
4) 4) Estacionario: Estacionario: velocidad de crecimiento nula. Las clulas an
son activas y pueden producir metabolitos secundarios (ej.
antibiticos, hormonas) productos de la desregulacin celular
5) 5) Muerte: Muerte: baja el nmero de clulas, difcil definir el lmite con
la etapa anterior.
t
0 neta neta g
neta
e X X dt
X
dX

dt
dX
X
1

= = =
Crecimiento balanceado: todos los componentes de las clulas
crecen con la misma velocidad la composicin media de las
mismas permanece constante. Es vlido para la etapa de crecimiento etapa de crecimiento
exponencial exponencial.
En este perodo, la velocidad de crecimiento es independiente de los
nutrientes y resulta en una cintica de primer orden.
neta
d 0
) 2 ln(
X 2 X

= =
Tiempo necesario para duplicar la biomasa:
Crecimiento no balanceado: los componentes de las clulas no
crecen con la misma velocidad la composicin media se modifica.
Esta situacin caracteriza especialmente a la etapa estacionaria etapa estacionaria
El estrs producido por la falta de nutrientes o por la existencia de
subproductos o toxinas inhibidoras que generan un medio hostil
induce una reestructuracin de las clulas para adaptarse a las nuevas
condiciones.
d g neta g
k =
Puede ocurrir:
La concentracin msica de clulas (X) es constante pero baja el
nmero de clulas viables.
X baja por lisis de clulas. Puede aparecer un segundo perodo
de crecimiento, los productos de lisis o las clulas muertas
constituyen un sustrato alternativo (crecimiento crptico).
X constante pero su metabolismo es activo; cambia la regulacin
celular produciendo metabolitos secundarios.
Coeficiente de mantenimiento Coeficiente de mantenimiento: : se emplea para definir la velocidad
especfica de consumo de sustrato para energa de mantenimiento.
m
dt
S d
X
1
- m

=
Energ Energ a de mantenimiento a de mantenimiento: : necesaria
para mantener la membrana celular activa
y el transporte de nutrientes, y para
funciones metablicas esenciales como la
movilidad y la reparacin de estructuras
daadas.
Si no hay sustrato disponible, el mantenimiento inducir prdida de
masa celular (metabolismo endgeno para adaptarse al medio).
Otras definiciones: Coeficientes de rendimiento Otras definiciones: Coeficientes de rendimiento: se definen en base
a la cantidad consumida de otro componente.
Rendimiento de formacin de clulas por masa
de sustrato consumida (g clulas/g S)
Y
X/S
es un valor constante en la etapa de
crecimiento exponencial.
Luego de la etapa de crecimiento exponencial, Y
X/S
deja de ser
constante, es un rendimiento aparente porque el sustrato se emplea
para otros fines:
tenimiento
- man para
energia
cimiento
- cre para
energia
productos de
formacion
biomasa de
formacion
S S S S S + + + =
Tambin se pueden definir rendimientos basados en otros componentes:
S
P
Y ;
DO
X
Y
P/S
O X
2

=
/
S
X
Y
S / X

=
g/g 4 , 1 9 , 0 Y ; g / g 6 , 0 4 , 0 Y
2
X/O S / X
= =
Ejemplo: Organismos creciendo en condiciones aerbicas en glucosa;
para la mayora de las bacterias y levaduras:
(en condiciones anaerbicas suelen ser menores)
Los rendimientos
dependen del medio
y de la fuente de C.
Para la mayora de
los casos:

=
consumido C de g
biomasa g
g/g 4 , 0 1 Y
S / X
(c) q
P
no-asociada al crecimiento celular (etapa estacionaria, donde
la
g
=0) ej.: metabolitos secundarios como antibiticos.
Relaci
Relaci

n del crecimiento de biomasa con la formaci

n del crecimiento de biomasa con la formaci

n de
n de
productos:
productos:
g X / P P
Y
dt
dP
X
1
q = =
Definimos la velocidad
especfica de formacin
de producto, q
P
X / P g P
Y q = =
+ =
g P
q
Se encuentran 3 situaciones:
(a) q
P
asociada al crecimiento celular, ej: produccin de una
enzima constitutiva de la biomasa (metabolito primario).
(b) q
P
parcialmente asociada (etapa de desaceleracin y
estacionaria), ej: fermentacin de cido lctico, xantanos y algunos
metabolitos secundarios.
0 ; te tan cons q
g P
= = =
Relaci
Relaci

n del crecimiento de biomasa con la formaci

n del crecimiento de biomasa con la formaci

n de
n de
productos:
productos:
dt
dX
X
1
Y Y
dt
dP
X
1
q
X / P g X / P P
= = =
g P
q = + =
g P
q
=
P
q
Asociada Parcialmente asociada No asociada
Metabolitos primarios Metabolitos secundarios
Factores que influyen
Factores que influyen

Temperatura del medio

Temperatura del medio
-psicrfilos (T
op
< 20C)
-mesfilos (20<T
op
<50C)
-termfilos (T
op
> 50C)
La velocidad de
crecimiento
disminuye por
encima de la T
op
La velocidad de
crecimiento
aproximadamente
se duplica cada
T = 10C
Por encima de T
op
ocurre muerte celular disminuye el nmero
de clulas viables cuando la velocidad de muerte supera la de
crecimiento.
Ambas velocidades siguen una ecuacin tipo Arrhenius con
E
a
1020 kcal/mol E
d
6080 kcal/mol
La muerte celular es ms sensible a T que el crecimiento
(importante para la esterilizacin)
La T tambin afecta la velocidad de formacin de producto pero
la T
op
y la E
a
suelen ser distintas.
Tambin influye sobre el Y
X/S
porque para T>T
op
, la energa de
mantenimiento es mayor baja Y
X/S
Para organismos inmovilizados puede cambiar el control.
) / exp( ' RT E A
a g
=
) / exp( RT E A k
d d d
=
Factores que influyen
Factores que influyen

pH
pH
del medio
del medio
Variacin de la velocidad especfica de crecimiento con el pH. Existe un
pH ptimo para cada tipo de clula, generalmente prximo a 7. Se puede
incrementar el rango adaptando las clulas por incrementos pequeos.
Rango de
pH ptimo
El pH ptimo suele ser distinto para el crecimiento que para la
formacin de producto.
Los pH aceptables varan en 1 o 2 unidades respecto del ptimo.
El pH ptimo depende de la biomasa, el rango va de 3 a 8.
- levaduras: 3 6
- hongos: 3 7
- clulas vegetales: 5 6
- clulas animales: 6,5 7,5
Algunos organismos pueden regular el pH empleando energa de
mantenimiento.
El pH puede variar mucho por efecto del medio (fuente de N,
aminocidos, CO
2
)
Factores que influyen Factores que influyen concentraci concentraci n de O n de O
2 2
disuelto (DO): disuelto (DO):
Es un sustrato importante para las fermentaciones aerbicas.
Debido a la baja solubilidad del O
2
en agua, puede ser un limitante de
la velocidad de crecimiento.
La solubilidad del oxgeno en agua depende de la presin, de la
temperatura y de las sales disueltas (a presin atmosfrica es 7ppm).
La concentracin crtica de oxgeno
disuelto C
O2,critica
es aquella por debajo
de la cual comienza a controlar la
velocidad de crecimiento:
510% de la concentracin de
saturacin para bacterias y levaduras y
1050% de la concentracin
de saturacin para hongos (segn
el tamao)
Transporte de oxgeno a las clulas
El O
2
se
introduce por
burbujeo y su
concentracin
depende de la
agitacin.

=
b O
*
O LG L
2 2
C C a k OTR
Velocidad de consumo
de oxgeno (OUR):
2
2
O / X
g
O
Y
X
X q OUR

= =
Velocidad de
transferencia:
Factores que influyen Factores que influyen otros factores otros factores
Potencial redox: afecta las reacciones de xido-reduccin. Esta relacionado
con la concentracin de O
2
, el pH y las concentraciones de otros iones.
Potencial de reduccin del medio:
Se puede reducir bajando la concentracin de O
2
(burbujeo de nitrgeno) o
por agregado de agentes reductores (cistena, Na
2
S, HCl).
Concentracin de CO
2
disuelta puede afectar. Puede ser txica para algunas
clulas y necesaria para otras.
Se regula modificando la concentracin en la corriente de burbujeo.
Fuerza inica: afecta el transporte de ciertos nutrientes desde y hacia el
interior de las clulas. Depende de la concentracin y de la carga de los iones
en el medio:
( ) ( ) ( ) ( )
+
+ + = H P 06 0 E mV E
2
O 0
log log ,

=
i
2
i i
2
1
Z c FI
Generaci Generaci n de calor por crecimiento microbiano n de calor por crecimiento microbiano
4050% de la energa suministrada por las fuentes de C se
convierten en ATP (forma en que las clulas acumulan energa)
el resto se libera como calor.
El calor liberado se puede calcular a partir de las entalpas de
combustin del sustrato y de la biomasa formada:
celulas O H CO
2 2
+ +
Ciclo entlpico
para calcular el
calor generado
Combustin de
las clulas
Hc (kJ/g)
Crecimiento
microbiano y
respiracin
1/Y
H
(kJ/g clula)
O H CO O Sustrato
2 2
) g / kJ ( H sustrato,
del combustion
2
S
+ +

c S / X S
S / X
H
H
c
S / X
S
H Y H
Y
Y
Y
1
H
Y
H

= + =

Algunos valores tpicos: Hc ~ 20 25 kJ/g clulas

Y
H
~0,42 g/kcal (glucosa); 0,30 g/kcal (malato); 0,18 g/kcal (etanol)
0,12 g/kcal (metanol); 0,061 g/kcal (metano)
El grado de oxidacin del sustrato afecta fuertemente la cantidad de
calor que evoluciona por el metabolismo de las clulas.
Para clulas en crecimiento activo, el requerimiento para
mantenimiento es bajo la evolucin de calor est directamente
relacionada con el crecimiento.
Velocidad total de generacin de calor en una fermentacin batch se
calcula considerando la velocidad de crecimiento.
En una fermentacin aerbica, se correlaciona con la velocidad de
consumo de oxgeno, dado que es el aceptor final de electrones.
V
Y
1
X Q
H
neta generado
=
2
O generado
Q 12 , 0 Q =
Configuraciones de refrigerantes en biorreactores: (a) camisa externa
(b) serpentn externo (c) serpentn interno helicoidal (d) serpentn
interno tipo deflector (e) intercambiador de calor externo
Reactor Reactor batch batch de de
escala laboratorio escala laboratorio
Reactor Reactor batch batch de de
escala industrial escala industrial
Estequiometr
Estequiometr

a
a
del crecimiento microbiano y formaci
del crecimiento microbiano y formaci

n de
n de
productos
productos
Procesos complejos reflejan el transcurso de miles
de reacciones intracelulares.
Es importante poder comparar el rendimiento y la generacin de calor
que se obtiene empleando distintos sustratos la estequiometra de
conversin de sustratos a biomasa y a productos extracelulares se
suele representar por ecuaciones pseudoqumicas simples.

2 2

3 2 n m
CO e O H d N O CH c NH b O a O CH + + + +

CH
m
O
n
representa un mol del carbohidrato empleado como sustrato
CH

representa un mol del material celular

La composicin del material celular depende del tipo de
organismo. Un mol de material biolgico es aquel que
contiene un tomogramo de C
Composicin elemental de la bacteria Escherichia coli
Elemento % en masa seca
C 50
O 20
N 14
H 8
P 3
S 1
K 1
Na 1
Ca 0.5
Mg 0.5
Cl 0.5
Fe 0.2
Otros 0.3
92% de la masa seca
total esta formado por
C, O, N, H
Componentes minoritarios
no se tienen en cuenta en la
frmula mnima
Por que una frmula mnima escrita como: CH
a
O
b
N
d
?
Balances
elementales:

2 2

3 2 n m
CO e O H d N O CH c NH b O a O CH + + + +

=
+ + = +
+ = +
+ =
c 3b : N
2e d c 2a n : O
2d c 3b m : H
e c 1 : C
Cociente respiratorio (RQ): moles de CO
2
producidos por mol de
O
2
consumido provee una indicacin del estado metablico y puede
emplearse para controlar el proceso.
a
e
consumidos O moles
generados CO moles
RQ
2
2
= =
Los balances para H y O pueden no dar informacin correcta por la
gran masa de agua que tienen las clulas se requiere informacin
adicional.
Los coeficientes estequiomtricos y la frmula mnima se calculan
planteando balances elementales, la informacin del cociente
respiratorio y un balance de electrones disponibles.
Para las reacciones mas complejas, con formacin de productos
extracelulares, se agregan componentes hay un coeficiente
estequiomtrico ms y se requiere mayor informacin.
Adems, los balances elementales no se relacionan con los
cambios de energa involucrados en la reaccin.
se desarroll el concepto de grado de reduccin, , para poder
plantear balances de electrones y protones en bioreacciones.
Balance de electrones disponibles:
Grado de reduccin: nmero de equivalentes de electrones
disponibles por tomo-gramo de C. Los electrones disponibles son
aquellos que se transfieren al O
2
al formarse CO
2
o H
2
O.

=
productos , i
i i
sustratos , i
i i
reduccion de grados : ; cos tri estequiome . coef :
i i

Cin
Cin

tica de crecimiento microbiano: Modelos

tica de crecimiento microbiano: Modelos
nX P X S + +

( )
dt
dX
X
1
k
d g neta


biomasa de
cantidad mayor

productos
biomasa ustrato + +
ares extracelul
S
X: concentracin msica de clulas (g/L)
t: tiempo (h)

neta
: Velocidad especfica neta de crecimiento (h
-1
)

g
: Velocidad especfica de crecimiento de biomasa (h
-1
)
k
d
: constante de muerte celular o disminucin de masa celular por
metabolismo endgeno (h
-1
)
Cuantificaci
Cuantificaci

n de la cin
n de la cin

tica de crecimiento: modelos cin

tica de crecimiento: modelos cin

ticos
ticos
Descripcin detallada debera involucrar diferenciaciones en la
estructura de la clula y la segregacin del medio de cultivo en
unidades que pueden tener diferentes concentraciones y propiedades
fsico-qumicas modelos estructurados-segregados
Modelos Estructurados Tienden a representar la estructura de las
clulas. Pueden dividir la clula en sus componentes y considerar las
reacciones y cambio de metabolismo que tienen lugar en cada zona
de la clula, como respuesta a cambios en el medio.
Modelos Segregados Tienen en cuenta que el medio no es
homogneo, permiten variaciones de concentraciones de biomasa y
de nutrientes y diferencias en las propiedades fisicoqumicas del
medio (viscosidad, densidad, pH, T, etc.). Tambin permiten
considerar la posibilidad de agregacin de clulas.
El grado de realismo y complejidad de un modelo depende del depende del
objetivo objetivo se debe elegir el modelo ms simple capaz de
representar en forma adecuada al sistema que nos interesa.
No estructurados
No segregados
Estructurados
No segregados
No estructurados
Segregados
Estructurados
Segregados
M
A
Y
O
R

C
O
M
P
L
E
J
I
D
A
D
MAYOR CAPACIDAD DE REPRESENTAR LA REALIDAD
Son ms
realistas, pero
son complejos y
demandantes de
tiempo de
clculo.
Modelos No-Estructurados Suponen una composicin fija de
la clula (equivalente a suponer crecimiento balanceado).
-Son estrictamente vlidos para la etapa de crecimiento
exponencial en batch
-No andan bien para transientes, salvo que la respuesta de la
clula sea rpida y/o las perturbaciones sean leves.
Modelos No-Segregados Consideran un medio homogneo.
-Representan adecuadamente muchos casos.
Nos restringimos a los modelos No-estructurados/No-segregados
S (

M)

g
(h
-1
)
Modelos cin Modelos cin ticos de crecimiento: controlados por sustrato ticos de crecimiento: controlados por sustrato
Suponen que la cintica depende solamente de un nico sustrato
esencial (por ej., glucosa). Los cambios en los otros sustratos no
afectan. Ms difundido Modelo de Modelo de Monod Monod
Supone que un Supone que un nico sistema nico sistema
enzim enzim tico controla el consumo de tico controla el consumo de
sustrato y que dicho sistema sustrato y que dicho sistema
determina la velocidad de determina la velocidad de
crecimiento de biomasa crecimiento de biomasa.
La premisa es generalmente falsa,
pero la ecuacin de Monod ajusta
una amplia gama de resultados
experimentales y es la expresin
ms empleada para el diseo de
fermentadores.
S K
S

s
m
g
+
=

S (

M)

g
(h
-1
)
S K
S

s
m
g
+
=

m
: mxima velocidad especfica
de crecimiento de biomasa
s m g
K S cuando >> =
K
s
: constante de saturacin o de
velocidad media
s m 2
1
g
K S cuando = =
Monod da buenos resultados para cultivos con baja velocidad de
crecimiento y baja densidad de clulas.
Para cultivos concentrados se usan expresiones similares,
modificando K
s
:
S S K
S

0 S
m
g
0
+
=

S S K K
S
o


0 s s
m
g
0 1
+ +
=

Nociones de dise
Nociones de dise

o de fermentadores o
o de fermentadores o
biorreactores
biorreactores
La eleccin del tipo de reactor y de la estrategia de operacin define
la produccin a obtener y la pureza del producto (nmero y tipo de
impurezas, reactivos sin convertir). Tambin determina si se puede
lograr un producto de calidad constante y una operacin confiable.
En bioprocesos los reactores representan un gran % del capital.
Tipos de reactores comnmente empleados
Discontinuos o batch: una vez que se carga, el proceso
ocurre sin ingreso de sustrato ni salida de productos.
Continuos (quimiostato): hay alimentacion
continua de sustrato y retiro continuo de productos
Semicontinuos (Fed-batch): hay ingreso
continuo o intermitente de sustratos, sin
retiro de productos.
Reactores discontinuos o batch
Produccin de biomasa o de un producto asociado a crecimiento
(metabolito primario):
En un batch se observan 4 etapas:
1) Preparacin para la nueva operacin (limpieza, esterilizacin,
llenado del reactor)
2) Sembrado y perodo de induccin
3) Perodo de crecimiento exponencial
4) Recuperacin del producto del reactor
La suma del tiempo involucrado en las etapas 1+2 y 4 es un tiempo
muerto, t
m
, a considerar en el diseo del reactor
vara con el tamao del reactor y con el tipo de fermentacin pero
generalmente es del orden de las horas (310 hs)
tiempo total de operacin para llegar a una concentracin final de
biomasa X
f
:

+ =

0
f
neta
m c
X
X
1
t t ln
La concentracin final de biomasa, X
f
, depende de la cantidad de
sustrato limitante del crecimiento y del rendimiento:
( ) S S Y X X
0 S / X 0 f
=
La mayora de las fermentaciones operan con una relacin X
f
/X
0
de
aproximadamente 1020. La velocidad de produccin de biomasa
por operacin del reactor batch, r
b
, se calcula dividiendo la masa
total que podemos formar por el tiempo que lleva la operacin:
( ) ( )
m 0 f neta
0 S X
b
t X X 1
S Y
r
+
=
ln /
/
Una operacin en un quimiostato en condiciones ptimas conduce
a una produccin significativamente superior. De todos modos, la De todos modos, la
mayor mayor a de las fermentaciones son procesos discontinuos a de las fermentaciones son procesos discontinuos. .
s m
kg
3
3
m
kg
Por qu?
En muchos casos no interesa el producto asociado a crecimiento;
el crecimiento de las clulas puede incluso inhibir la produccin
del producto deseado. En esos casos el producto deseado se genera
solo con velocidades de dilucin muy bajas, muy por debajo de la
que lleva a la ptima productividad de biomasa.
Para Para producci producci n de metabolitos secundarios, la productividad n de metabolitos secundarios, la productividad
en un en un batch batch puede superar significativamente a la de un puede superar significativamente a la de un
quimiostato quimiostato. .
Otra razn importante para que se prefiera la operacin
discontinua es la inestabilidad gentica. Los microorganismos que
se emplean suelen ser especies que han sido manipuladas y tienen
menor velocidad de crecimiento que las originales.
Un Un quimiostato quimiostato impone una selecci impone una selecci n severa cuando hay n severa cuando hay
mezclas de cultivo, conduciendo a la cepa de mayor velocidad mezclas de cultivo, conduciendo a la cepa de mayor velocidad
de crecimiento. de crecimiento.
Por qu?
Otro factor a tener en cuenta es la operabilidad y la confiabilidad
de la operacin. Los reactores batch conducen a productos con
mucha variabilidad genera problemas en las etapas de
purificacin. Sin embargo en los sistemas continuos una falla
mecnica o de control de alguna variable de operacin o de la
esterilizacin del proceso puede conducir a problemas severos.
Las consecuencias de una falla de operaci Las consecuencias de una falla de operaci n son mas graves n son mas graves
en un sistema continuo y las p en un sistema continuo y las p rdidas mayores. rdidas mayores.
La economa de mercado influye en la seleccin del reactor. Un
sistema continuo es un sistema dedicado a un dado proceso un
nico producto.
Muchos productos de fermentaciones se requieren en peque Muchos productos de fermentaciones se requieren en peque as as
cantidades y su demanda es dif cantidades y su demanda es dif cil de proyectar. Los sistemas cil de proyectar. Los sistemas
batch batch son m son m s vers s vers tiles, el mismo reactor puede emplearse tiles, el mismo reactor puede emplearse
para distintos productos. para distintos productos.
Cultivos continuos Cultivos continuos se agrega un medio con nutrientes frescos en
forma continua, a un volumen de control que contiene las clulas.
Se retiran continuamente productos y parte de las clulas.
-Cuando se alcanza el estado estacionario, X, S y P permanecen
constantes en un dado punto del reactor.
-Los cultivos continuos proveen un medio de cultivo constante para
el crecimiento de las clulas y para la formacin de productos
calidad calidad uniforme de los productos uniforme de los productos
-Pueden ser una herramienta importante para determinar como un
microorganismo responde al medio, y para generar un producto en
condiciones ptimas.
Sistemas para
lograr cultivos
continuos
Quimiostato
Turbidistato
Flujo Pistn Ideal (FPI): mezclado radial mezclado radial
perfecto y mezclado axial nulo perfecto y mezclado axial nulo; poco
empleado, salvo para inmovilizados
Sistemas con mezclado mezclado
perfecto perfecto: Tanques
continuos idealmente
agitados (TCIA)
Quimiostato: el crecimiento de biomasa suele estar controlado
por un nutriente esencial y el resto se agrega en exceso. Las
condiciones qumicas del medio son constantes.
Turbidistato: la concentracin de clulas en el reactor se mantiene
constante. La alimentacin se regula mediante el monitoreo de la
densidad ptica del cultivo. Se alimenta medio fresco cuando la
turbidez supera un lmite prefijado. El volumen se mantiene constante
retirando una cantidad de fluido equivalente a la que se agrega.
Se usa menos que el quimiostato porque es ms elaborado y porque el
medio cambia.
Puede ser muy til
para seleccionar
subpoblaciones que
puedan soportar
condiciones de
stress, porque la
concentracin de
clulas se mantiene
constante.
FPI (Flujo Pistn Ideal):
como no hay retromezclado,
los elementos de fluido con
clulas activas no pueden
inocular elementos de fluido
nuevos aguas arriba
se requiere el reciclo
continuo de clulas para
inoculacin continua del
medio fresco alimentado.
Un FPI es equivalente a un batch, en el cual la posicin en el
reactor equivale a un dado tiempo en el reactor batch.
Equipos con clulas inmovilizadas (trickling filters) se asemejan
a un FPI y no necesitan el reciclo, se usan extensamente en
tratamiento de efluentes.
L(+G,S)
L(+G,S)
Fotobiorreactor tubular helicoidal de
1000 L (Murdoch University, Australia)
Recuperacin de microalgas a partir
del medio de cultivo por filtracin
Cyanotech Corporation
(www.cyanotech.com), Hawaii, USA.
Cultivos continuos: Quimiostato ideal
Es un tanque agitado que se opera con circulacin continua (TCIA)
del medio de cultivo. La mayora requiere control (pH, T y C
O2
).
Se alimenta medio estril (X
0
= 0) a un tanque perfectamente
agitado (y aireado si es fermentacin aerbica). Se deja salir la
suspensin de clulas para mantener las concentraciones y el
volumen de lquido constante.
Burbujeo
de gas
Fv
S
0
, X
0
, P
0
Fv
S, X, P
Volumen de lquido =
volumen de reactor = V
Las concentraciones a la
salida del reactor son
iguales a las del interior
por la hiptesis de
mezclado perfecto
Balances de masa Ecuaciones de diseo
Planteando balances de masa para los distintos componentes, se
obtienen las ecuaciones de diseo.

V.C.
del dentro
acumulada
Masa
V.C.
del dentro
generada
Masa
V.C.
del dentro
consumida
Masa
reactivos
los con
VC al entra
que Masa
productos
los con
VC del sale
que Masa
Si el volumen de control V.C. es un QUIMIOSTATO
Un quimiostato opera en estado estacionario se cancela el trmino
de acumulacin de masa:

V.C. del dentro

generada Masa
reactivos los
con V.C. al
entra que Masa
V.C. del dentro
consumida Masa
productos los
con V.C. del
sale que Masa
Gas
Fv
S
0
, X
0
, P
0
Fv
S, X, P
V
Quimiostato - ecuaciones de diseo
Balance de masa de clulas:

V.C. del dentro

generada Masa
reactivos los
con V.C. al
entra que Masa
V.C. del dentro
consumida Masa
productos los
con V.C. del
sale que Masa
X V X F X F
neta 0 V V
+ =
( )X k V X F X F
d g 0 V V
+ =
Definiendo el factor de dilucin como caudal/volumen: D = F
V
/V
( )X k DX DX
d g 0
+ =
Si se alimenta medio estril (X
0
= 0) y
el mecanismo endgeno es despreciable
( )X k DX DX
d g 0
+ =
g
D =
F
V
: caudal volumtrico de medio
de cultivo agregado (L/h)
Importancia de este resultado: En un quimiostato en
EE, alimentado con medio estril y en condiciones
en las que el metabolismo endgeno es despreciable,
la velocidad o factor de dilucin, D, iguala a la
velocidad de crecimiento de clulas
se puede manipular la velocidad de crecimiento como un parmetro
independiente modificando las variables de operacin
el quimiostato es una herramienta experimental poderosa
Si la velocidad de crecimiento sigue la expresin de Monod
S K
S
D

s
m
g
+
= =

S: concentracin de sustrato limitante

del crecimiento de biomasa en EE
Si se impone un factor de dilucin D >
m
, las clulas no se podrn
reproducir lo suficientemente rpido para mantenerse se lavan, o
se vaca el quimiostato (washout)
g
D =
F
V
: caudal volumtrico de medio de cultivo agregado (L/h)
S: concentracin de sustrato limitante del crecimiento (g/L)
V: volumen del reactor (L)

g
: velocidad especifica de crecimiento de biomasa (1/h)
X: concentracin de biomasa (g/L)
q
P
(gP/gclulas/h): velocidad especfica de productos extracelulares
Y
M
X/S
(g clulas/gS) : mximo rendimiento de biomasa a partir de S
Y
P/S
(gP/gS) : rendimiento de producto extracelular a partir de S
BM sustrato en estas condiciones (EE y sin metabolismo endgeno):
0 V
S / P
P M
S / X
g V
S F
Y
1
X Vq
Y
1
X V S F = + +

V.C. del dentro

generada Masa
reactivos los
con V.C. al
entra que Masa
V.C. del dentro
consumida Masa
productos los
con V.C. del
sale que Masa
Formacin de biomasa
Formacin de producto
Concentracin msica de clulas en estas condiciones (EE y sin
metabolismo endgeno):
( )
Y
q
X
Y
X S S D
S / P
P
M
S / X
g
0
+ =

Como adems
g
= D , si la formacin de
productos extracelulares es despreciable:
( ) S S Y X
0
M
S / X
=
Estrictamente, depende de la concentracin de sustrato y de la
velocidad de crecimiento, no es exactamente igual para cualquier S
0
M
S / X
Y
La productividad en un fermentador continuo se
obtiene como el producto del factor de dilucin por la
concentracin de clulas, DX (g/Lh)
Productividad en un quimiostato, suponiendo vlida Monod (EE sin
metabolismo endgeno ni formacin de productos extracelulares): se obtiene del
producto del factor de dilucin por la concentracin de clulas, DX (g/Lh):
La velocidad de dilucin que maximiza la produccin de biomasa se obtiene
de derivar DX con respecto a D e igualar a cero:

+
=
0 s
s
m ) X ( op
S K
K
1 D
Es muy difcil lograr una operacin estable para D
m
. Generalmente, se
usa un valor de D algo menor que D
op(X)
como solucin de compromiso
para mejorar la estabilidad con buena productividad.
Normalmente K
s
<< S
0
D
op(X)

D =
m
, o sea al punto de lavado
( )
D
DK
S
S K
S
D
S S Y X
m
s
s
m
g
0
M
S / X

=
+
= =
=

=
D
K D
DS Y DX
m
s
2
0
M
S / X
)

op m
s op
0 op
M
S / X
op
D
K D
S D Y DX
Reemplazando la expresin de D
op
en la ecuacin que da la productividad
de biomasa DX:
Se obtiene la mxima productividad de biomasa que se puede alcanzar en
un quimiostato en EE, sin metabolismo endgeno y sin formacin de
productos extracelulares:
) ( ) ( )
0 s s s 0
0 s
s
m
M
S / X
op
S K K K S
S K
K
1 Y DX + +

+
=
Normalmente K
s
<< S
0
DX)
op

0 m
M
S / X
S Y
Efecto del factor de dilucin sobre la concentracin de clulas,
concentracin de sustrato y la productividad.
D (1/h) S (kg/m
3
) X (kg/m
3
)
0.06 0.006 0.427
0.12 0.013 0.434
0.24 0.033 0.417
0.31 0.04 0.438
0.43 0.064 0.422
0.53 0.102 0.427
0.6 0.122 0.434
0.66 0.153 0.422
0.69 0.17 0.43
0.71 0.221 0.39
0.73 0.21 0.352
0
0.1
0.2
0.3
0 0.2 0.4 0.6 0.8
DX
(kg/h.m
3
)
D (h
-1
)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0 0.2 0.4 0.6 0.8
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
X (kg/m
3
)
S (kg/m
3
)
D (h
-1
)
0
S
m

Algunas aplicaciones de los sistemas continuos:

- produccin de algunas protenas
- tratamiento de efluentes, en particular cuando se emplean
microorganismos o enzimas inmovilizadas.
- produccin de etanol
- produccin de productos asociados a crecimiento,
especialmente en gran escala (por ejemplo, cido
lctico)
Modificaciones de los sistemas continuos para emplearse en
bioprocesos
Quimiostato con reciclo
La generacin de biomasa es autocatalitica mayor
concentracion de biomasa lleva a mayor velocidad de
crecimiento.
Para lograr en un quimiostato una concentracin de biomasa
mayor, se pueden reingresar al reactor las clulas que salen.
Quimiostato con reciclo: el reciclo de clulas incrementa la
productividad y tambin la estabilidad en algunos sistemas, dado
que minimiza las perturbaciones (ej.: en tratamiento de efluentes,
muy sujeto generalmente a las variaciones en la alimentacin).
Gas
Fv
S
0
,X
0
,P
0
Fv
S
1
,X
2
,P
1
V
Fv(1+)
S
1
,X
1
,P
1
Fv
S
1
,cX
1
,P
1
Separador de clulas: puede ser
por filtracin, centrifugacin o
sedimentacin
: relacin de reciclo
basada en caudales
volumtricos.
c: factor de concentracin
relacin de la
concentracin de
clulas en la corriente
de reciclo sobre la que
sale del reactor
Balances de biomasa :

V.C.
del dentro
acumulada
Masa
V.C.
del dentro
generada
Masa
V.C.
del dentro
consumida
Masa
reactivos
los con
VC al entra
que Masa
productos
los con
VC del sale
que Masa
Gas
Fv
S
0
,X
0
,P
0
Fv
S
1
,X
2
,P
1
V
Fv(1+)
S
1
,X
1
,P
1
Fv
S
1
,cX
1
,P
1
( ) ( ) 0 X V cX F X F X F 1
1 neta 1 V 0 V 1 V
= + +
fresca reciclo
En EE: dX
1
/dt = 0
y si se alimenta medio
estril X
0
=0
( ) ( )
1 V 1 V 1 neta
cX F X F 1 X V + =
( ) c 1 D
neta
+ =
Gas
Fv
S
0
,X
0
,P
0
Fv
S
1
,X
2
,P
1
V
Fv(1+)
S
1
,X
1
,P
1
Fv
S
1
,cX
1
,P
1
[ ] ) c 1 ( 1 D
neta
+ =
Como c > 1 (1-c) < 0

D
neta
<
Cuando hay reciclo, el
quimiostato puede operar con
una velocidad de dilucin
mayor que la de crecimiento
BM sustrato limitante (en EE):
( )
1 V 0 V
S / P
1 P M
S / X
1 g 1 V
S F S F
Y
1
X Vq
Y
1
X V S F 1 + = + + +

V.C. del dentro

generada Masa
reactivos los
con V.C. al
entra que Masa
V.C. del dentro
consumida Masa
productos los
con V.C. del
sale que Masa
Formacin de biomasa
Formacin de producto
BM sustrato limitante
(en EE y en ausencia de productos extracelulares):
( )
1 V 0 V
S / P
1 P M
S / X
1 g 1 V
S F S F
Y
1
X Vq
Y
1
X V S F 1 + = + + +
( ) ( )
1 V 1 0 V M
S / X
1 g
S F 1 S S F
Y
1
X V + + =
( )
1 0
M
S / X
g
1
S S Y
D
X

=

[ ] ) c 1 ( 1 D 0 k Si
neta g d
+ = = =
( )
( ) c - 1 1
S S Y
X
1 0
M
S / X
1
+

=
La concentracin de clulas en un quimiostato en EE con reciclo se
incrementa por el factor 1/[1+(1-c)]
Si es vlida Monod
y para k
d
=0
[ ] + = =
+
=

) c 1 ( 1 D
S K
S
neta
s
m
g
( ) [ ]
( ) [ ]D c - 1 1
D c - 1 1 K
S
m
s
+
+
=

( ) [ ]
( ) [ ]
( ) [ ]

+
+

+
=
D c - 1 1
D c - 1 1 K
S
c - 1 1
Y
X
m
s
0
M
S / X
1

sin reciclo
con reciclo
X
1,sr
Velocidad de Velocidad de
generaci generaci n de n de
biomasa biomasa
c = 2 ; = 0.5
Gas
Fv
S
0
,X
0
,P
0
Fv
S
1
,X
2
,P
1
V
Fv(1+)
S
1
,X
1
,P
1
Fv
S
1
,cX
1
,P
1
X
1,cr
Quimiostatos mltiples en cascada: en algunas fermentaciones,
particularmente para la produccin de metabolitos secundarios (ej.:
un antibitico), conviene separar las etapas de crecimiento de
biomasa y de formacin del producto deseado pues las condiciones
ptimas son diferentes
con m con m ltiples ltiples quimiostatos quimiostatos, se pueden fijar condiciones , se pueden fijar condiciones
distintas en cada uno: distintas en cada uno: pH pH, temperatura, , temperatura, conc conc. de nutrientes . de nutrientes
por ejemplo, se pueden ajustar las condiciones para tener:
-Un primer tanque donde se promueva el crecimiento de biomasa
-Un segundo tanque donde se promueva la formacin de producto(*)
(*) el crecimiento ser desbalanceado y un modelo no-estructurado
no es el ms apropiado. Los resultados sern aproximados.
V
1
V
2
X
1
S
1
X
2
S
2
Fv,X
2
,S
2
Fv,X
1
,S
1
Fv,S
0
,X
0
Fv,S
0
,X
0

Quimiostatos mltiples en cascada:

Primer quimiostato
en EE, vlido Monod y con metabolismo endgeno despreciable
1 m
1 s
1
D
D K
S

( )
1 0
M
S / X 1
S S Y X =
Segundo quimiostato
BM de biomasa
EE en 0
dt
dX
V X V X F X F
2
2 2 2 , neta 2 2 V 1 V
= = +
( )

= =
2
1
2 2 , neta 2 2 , neta 1 2
2
V
X
X
1 D X X X
V
F
Como X
1
< X
2

neta,2
< D
2
Ejemplo de aplicacin de un sistema multietapa con agregado de una
corriente: cultivo de clulas modificadas por ingeniera gentica
En general se agregan promotores a los sistemas con clulas que
contienen ADN recombinante para inducir la produccin de la
protena de inters.
La presencia del promotor favorece la produccin de la protena
pero reduce la velocidad de crecimiento de las clulas que contienen
plsmidos, respecto de las que lo han perdido.
un quimiostato de una nica etapa tendr problemas de
inestabilidad gentica.
empleando un sistema de 2 etapas:
Primer quimiostato para produccin de clulas (sin promotor)
Segundo quimiostato para produccin de la protena (c/promotor):
Se logra mantener la estabilidad gentica por el continuo agregado
de clulas frescas.
Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch:
En este tipo de sistemas se agregan nutrientes frescos al fermentador
en forma continua o intermitente. Muy apropiado para mitigar
problemas de inhibicin por sustrato
V
0
S
0
,X
0
,P
0
X
0
,S
0
,P
0
1)Carga
X,S,P
V
Fv,S
0
(X
0
)
2)Realimentacin
X
f
,S
f
,P
f
V
f
X
f
,S
f
,P
f
3)Recuperacin
del producto
1) Desde la carga hasta el momento de la realimentacin peridica,
el sistema se comporta como un batch:
0
M
S / X m
S Y X =
X
m
es la mxima X a alcanzar con S
0
, que se da
cuando S << S
0
y para la cual tambin X
0
<< X
m
( ) S S Y X X
0
M
S / X 0
+ =
Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch:
Cuando X X
m
, se agrega una corriente de
nutrientes frescos con un caudal volumtrico
Fv y de una concentracin S
0
. La variacin de
volumen es:
( ) t Fv V V Fv
dt
dV
0
+ = =
Durante la realimentacin, el BM de biomasa
es:
Como el sustrato se consume casi todo dX/dt 0
(condicin de estado cuasi-estacionario). Luego:
D
neta

X,S,P
V
Fv,S
0
(X
0
)
2)Realimentacin
X,S,P
V
Fv,S
0
(X
0
)
X,S,P
V
Fv,S
0
(X
0
)
2)Realimentacin
( ) ( ) D X
dt
dX
D X DX
dt
dV
V
X
X X
V
F
dt
dX
neta neta 0 neta 0
V
+ = + =
( )
dt
dV
X
dt
dX
V
dt
VX d
X V X F
neta 0 V
+ = = +
acumula se genera se entra = +
Como D porque V,
neta
va disminuyendo continuamente.
Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch:
BM para el sustrato:
Si no consideramos la formacin de
productos y dado que la masa de sustrato
se mantiene siempre
baja y constante:
( )
( ) ( ) t Y S F V X XV Y S F XV
dt
XV d
M
S / X 0 V 0 0
M
S / X 0 V neta
+ = =
(es igual en ausencia de metabolismo endgeno)
Es decir, la masa de clulas generadas es linealmente proporcional
al tiempo, lo cual se observa experimentalmente en un fed-batch.
X,S,P
V
Fv,S
0
(X
0
)
2)Realimentacin
X,S,P
V
Fv,S
0
(X
0
)
X,S,P
V
Fv,S
0
(X
0
)
2)Realimentacin
( )
M
S / X
g
0 V
Y
XV
S F

=
( )
dt
VS d
Y
X Vq
Y
X V
S F
S / P
P
M
S / X
g
0 V
=

acumula se onsume c se entra =
Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch:
Variacin de las
concentraciones de
biomasa, sustrato y
producto, y de la
velocidad de
crecimiento y volumen
del cultivo en funcin
del tiempo, para el
primer ciclo de un
reactor alimentado
(fed-batch):
0
200
400
600
800
1000
0 0.5 1 1.5 2
0
0.2
0.4
0.6
V (mL)
V (mL)
X (g/L)
P (g/L)
X (g/L)
P (g/L)

(h
-1
)

(h
-1
)
t (h)
Sistemas con microorganismos inmovilizados: la inmovilizacin
de microorganismos tiene aplicacin si los productos son
extracelulares
Ventajas sobre los cultivos con clulas en solucin:
Proveen una alta concentracin de clulas
Las clulas se usan en forma continua y se eliminan costosos
procesos de recuperacin y reciclo de clulas
Se eliminan el problema del washout a altas velocidades de
dilucin
Se pueden lograr altas productividades
Se puede lograr un medio local favorable que conduce a mayores
rendimientos y una mejor performance del biocatalizador
En algunos casos mejora la estabilidad gentica
En algunos casos disminuye el dao por abrasin de las clulas
Sistemas con microorganismos inmovilizados
Desventajas respecto de los cultivos en solucin:
El problema ms grave es que no se pueden emplear para
productos que no sean excretados de las clulas
La inmovilizacin generalmente conduce a problemas de
limitaciones por transferencia de masa
El sistema se torna muy heterogneo por las limitaciones de
transporte y es difcil de controlar
Si las clulas estn vivas, el crecimiento y la evolucin de gases
ocasiona problemas y puede conducir a ruptura del soporte.
Los mtodos de inmovilizacin son similares a los que se utilizan
para enzimas. Se complica con las clulas vivas.
Inmovilizacin
Activa: captura o unin de clulas por
mtodos fsicos o qumicos
Pasiva: formacin de biofilms, crecimiento
de mltiples capas de clulas sobre un
soporte slido
Tambin se pueden emplear reactores de membrana, generalmente
tubulares (la estructura se asemeja a un intercambiador de calor de
carcasa y tubos). Los tubos son de una membrana semipermeable.
Las clulas se inoculan en la carcasa y el sustrato se bombea por los
tubos, a los cuales difunde el producto.
Un buen soporte debe ser rgido y qumicamente inerte; debe
contener a las clulas firmemente y tener alta capacidad.
Esquema de una
columna de burbujeo
Fermentadores: Equipos comnmente empleados
Tanques agitados
Columnas de burbujeo
Air-lift o reactor de arrastre
Lechos rellenos
Esquema de un tanque agitado
H/D~12
H/D~36
Tanques agitados de escala
laboratorio
Tanques agitados de escala
laboratorio con clulas
inmobilizadas
Fermentadores comerciales de escala laboratorio (V ~ 2 Fermentadores comerciales de escala laboratorio (V ~ 2- -20 litros) 20 litros)
Global Medical Instrumentation http://www.gmi-inc.com
Fermentadores de escala banco Fermentadores de escala banco- -piloto (V ~ 15 piloto (V ~ 15- -75 litros) 75 litros)
Fermentadores de Fermentadores de
escala piloto escala piloto
V ~ 100 V ~ 100- -1000 litros 1000 litros
Biorreactor de
escala piloto
Planta piloto de bioprocesos
Esquema de un tanque Esquema de un tanque
agitado de mayor escala agitado de mayor escala
Variables que se controlan en un
Variables que se controlan en un
biorreactor
biorreactor
industrial
industrial
Esquema de un fermentador
tipo tanque agitado de escala
industrial (100m
3
).
H ~ 15 m de alto
D ~ 4,2 m de dimetro
Tiene lneas de vapor
para realizar la
esterilizacin in situ de
las vlvulas, caeras y
sellos. Se debe esterilizar
tambin el aire que
ingresa por filtracin o
por calentamiento.
Biorreactor de
escala industrial
Reactor tanque industrial
-generalmente de acero inoxidable 316L SS, puede operar presurizado.
-debe minimizar zonas muertas y permitir la insercin de sensores
-relacin de aspecto H/D=2.53.0 para crecimiento de bacterias porque
mejora la transferencia de oxgeno. Para clulas animales se usan tanques
de baja relacin de aspecto H/D=1.5 para facilitar el mezclado
-se debe poder vaciar
totalmente
-si tiene menos de
500L pueden ser de
vidrio
Reactor tanque agitado: tipos de turbinas empleadas y efectos en la
agitacin que inducen
Agitacin inducida por turbinas
radiales del tipo Rushton
Agitacin inducida por turbinas
axiales
Interior de un
tanque agitado
Reactor tanque agitado: efecto de los baffles
Los baffles mejoran notablemente la turbulencia, rompen los vrtices
que se forman por la agitacin. Se los ubica levemente desplazados
de la pared para disminuir la formacin de zonas estancas.
Reactor tanque agitado: efecto de los baffles en un reactor de 2L
400rpm sin baffles
400rpm con baffles
vrtice
Agitacin y distribucin de gas en reactores agitados
La determinacin de la velocidad de transferencia de oxgeno y el
calor liberado son claves para el diseo de los fermentadores.
La velocidad de transferencia de O
2
depende de la dispersin de gas,
que es funcin del tipo de reactor; ej: en tanques agitados, aumenta al
aumentar la velocidad de agitacin.
> RPM
Influencia de la velocidad de agitacin sobre la turbulencia y la
dispersin de gas inducida por agitacin mecnica en un reactor
de laboratorio de 2L.
300 rpm 450 rpm 750 rpm
Tomografa de una seccin del
reactor agitado.
Jets gaseosos de los inyectores de gas
Perfil de velocidades (cm/s) del lquido
en un reactor gas-lquido agitado. Se
observa la formacin del vrtice
caracterstico de las turbinas radiales.
Reactor agitado en
suspensin de escala
banco: 20cm de
dimetro y de alto
(volumen ~ 8L)
Fraccin gaseosa (adimensional)
Reactor tanque agitado:
Problemas ocasionados por
la evolucin de espuma:
-peligro de contaminacin
-complica la circulacin de
gases
-complica el mezclado
-cambian las velocidades
de transferencia masa y de
calor
vrtice
Columna de burbujeo de escala banco: V~10L
Configuraciones comunes de fermentadores: columnas de burbujeo
Columnas de burbujeo
Regmenes de flujo en columnas de
burbujeo: depende del caudal de gas y del
distribuidor que se emplee
Columnas de burbujeo para el
cultivo de algas
Configuraciones de recirculacin interna inducida por el flujo de
aire Air-lift
Air-lift con
insercin de
aire en el
tubo central
Air-lift con insercin
de aire en el anillo y
mezclado en el tubo
central
Air-lift con insercin de aire en
el tubo central y recirculacin
inducida
Configuraciones comunes de fermentadores
Reactor air-lift de
laboratorio con entrada de
aire en el anillo circular
Riser: zona donde se hace la
inyeccin de aire, el flujo es
ascendente y contiene burbujas
Downcomer: zona donde el lquido
desciende, a lo sumo tiene pequeas
burbujas disueltas
Zona donde se produce la
separacin entre el gas que se
libera hacia el exterior del
reactor y el lquido que recircula
Shear Stress Kinetic Energy
Air-lift vertical con mezclado en el tubo central: perfiles
de velocidades, energa cintica y tensin de deformacin
Escala
banco
(0,2 x 2)m
Reactor de tipo air-lift circulante
Airlifts de forma
triangular para el
cultivo de algas
(planta piloto de
cogeneracin de
energa del MIT)
Configuraciones comunes de fermentadores
Reactores de lecho fijo uso frecuente en tratamiento de efluentes y
en producciones dedicadas
Reactores trickle-beds o de lecho a goteo
Cocorriente Contracorriente
Columnas de burbujeo
rellenas
Inmovilizacin pasiva (biofilms):
Los biofilms son grupos de clulas que crecen en multicapas
sobre soportes slidos.
El soporte puede ser inerte o biolgicamente activo.
La formacin de biofilms es comn en equipos de fermentacin
industriales (ej: tratamiento de efluentes y fermentaciones de hongos).
La interaccin entre las clulas y el soporte puede ser muy compleja.
Los biofilms presentan ventajas y desventajas similares a las de los
sistemas de microorganismos inmovilizados en forma activa.
Las condiciones dentro de un biofilm grueso varan con la posicin y
afectan la fisiologa de las clulas porque los nutrientes difunden
hacia el interior del film y los productos hacia fuera.
El espesor del biofilm afecta la performance: biofilms muy finos van
a dar baja velocidad de crecimiento por la baja concentracin de
biomasa y los muy gruesos tienen problemas difusionales, que pueden
ser o no un inconveniente, dependiendo de lo que se quiera lograr.
Normalmente existe un espesor de film optimo para el crecimiento de
biomasa y otro para la formacin de productos.
Estrategias de escalado:
-Multiplicacin
-Reglas de uso
-Anlisis del rgimen
y escalado hacia menor
tamao
La multiplicacin implica
replicar muchas veces el
resultado que se obtiene
en un reactor de escala
relativamente pequea, en
lugar de llevar a cabo el
proceso en un reactor de
mayor tamao.
Produccin de cido glucnico
Produccin de gluconato de sodio con A. niger
Produccin de antibitico
Produccin de lisina (10000 ton/ao)
en 20 fermentadores de 250 m
3
Drogas medicinales
% de uso en la industria
Criterio de escalado
30 Potencia/Volumen
30 k
L
a
LG
20 Velocidad en la punta del agitador
20 Concentracin de oxgeno
Reglas de uso : basadas en anlisis dimensional y criterios de
similaridad de algunos parmetros
Otras: velocidad (rpm) del agitador o impeler; dimetro del
agitador; caudal desplazado por el impeler; caudal desplazado
por el impeler, por unidad de volumen; numero de Reynolds
La concentracin de
oxgeno es diferente en
distintas zonas del
reactor. Se puede simular
considerando varios
reactores con distinta
alimentacin de oxgeno
Anlisis del rgimen
y escalado hacia
menor tamao
Modelo del sistema que supone
dos compartimientos con distinta
concentracin de oxigeno