16,6 ADN CONTENIDO

ADN se puede medir por la fluorescencia de yoduro de propidio con una cmara CCD o
citometra de flujo [ Vaughan y Milner , 1989 ] ( vanse las secciones 15.4 y 21.7.2 ) ,
aunque la generacin de la suspensin de una sola clula necesaria ser, por supuesto ,
destruir la topografa de la muestra . Anlisis de contenido de ADN es particularmente
til en la caracterizacin de clulas transformadas que son a menudo aneuploides y
heteroploides ( vase la Seccin 18.3 ) .

16.6.1 La hibridacin de ADN
La hibridacin de sondas moleculares especficas a secuencias nicas de ADN (
transferencia Southern ) [ Sambrook et al , 1989 . ; Ausubel et al. , 1996 ] puede
proporcionar informacin sobre especies determinadas regiones , regiones amplificadas
de ADN o secuencias de bases alteradas que son caractersticas de esa lnea celular.
Amplificaciones de genes lo tanto la cepa especfica , tales como la amplificacin de la
reductasa gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR ) , se pueden detectar en lneas
celulares seleccionadas para resistencia a metotrexato [ Biedler et al , 1972 . ] ; [ .
Schoenlein et al , 1992 ] amplificacin de theMDRgene en las clulas resistentes a
vinblastina ; la sobreexpresin de un oncogn especfico, o oncogenes en lneas
celulares transformadas [ Bishop , 1991 ; Hames y Glover, 1991 ; Weinberg , 1989 ] ; o
eliminacin, o la prdida de heterozigosidad en los genes supresores de [ Witkowski ,
1990 ; Marshall , 1991 ] . Aunque esto puede ser detectado en la digestin de restriccin
de extractos de ADN entero , este est limitado por la cantidad de ADN requerido y es
ms comn el uso de la reaccin en cadena de la polimerasa ( PCR) con un cebador
especfico para la secuencia de inters , permitiendo la deteccin en nmero
relativamente pequeo de clulas, como estaran disponibles en un experimento a escala
de laboratorio . Alternativamente , las sondas especficas se pueden utilizar para detectar
secuencias especficas de ADN por hibridacin in situ ( vase la Seccin 27.8 ) , que
tiene la ventaja de mostrar las diferencias topogrficas y la heterogeneidad dentro de
una poblacin de clulas . Tambin es posible marcar una cepa de clulas para la
identificacin futura mediante la transfeccin en un gen reportero , tal como la protena
verde fluorescente ( GFP ) , luciferasa , o - galactosidasa [ Krotz et al . , 2003 ] , y
despus de detectar por fluorescencia , luminiscencia , o transferencia de Southern o
mediante el ensayo de enzima cromognico para el producto del gen .

16.6.2 ADN Fingerprinting
ADN contiene regiones conocidas como ADN satlite que aparentemente no se transcriben.
Estas regiones son muy repetitivas, y sus longitudes varan, con el ADN minisatlite tiene 1 - a
las repeticiones de 30 kb y el ADN microsatlite tener slo 2-4 bases en repetir secuencias. Las
funciones de estas regiones no se comprenden del todo; que pueden ser puramente
estructural o pueden proporcionar un depsito de regiones potencialmente codificables para
la recombinacin gentica en la evolucin ulterior. Independientemente de su funcin, sin
embargo, estas regiones no estn altamente conservadas, debido a que no se transcriben, y
que dan lugar a regiones de hypervariability.When el ADN se corta con endonucleasas
especficas, secuencias especficas pueden ser sondadas con los ADNc que se hibridan a estos
hipervariable regiones o que se pueden amplificar por PCR con plantillas especficas. Las
sondas fueron originados por Jeffreys et al. [1985] (vase el Protocolo 16,8;. Stacey et al,
1992). La electroforesis revela variaciones en la longitud de los fragmentos en el ADN satlite
(polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin, RFLP) que son especficos para el
individuo del que se deriv el ADN. Cuando se analizaron por electroforesis en poliacrilamida,
el ADN de cada individuo da un patrn de hibridacin especfica segn lo revelado por
autorradiografa con sondas radioactivas o fluorescentes. Estos patrones han llegado a ser
conocido como las huellas dactilares de ADN y son la lnea celular especfica, excepto si hay
ms de una lnea celular ha sido derivada de un individuo, o si se han utilizado animales
donantes altamente endogmicas.
Huellas de ADN parecen ser bastante estables en la cultura, y las lneas celulares del mismo
origen, pero mantienen por separado en diferentes laboratorios para muchos aos, an
conservan las mismas o muy similares huellas de ADN. Huellas genticas de ADN es una
herramienta muy poderosa en la determinacin del origen de una lnea celular, si la lnea
celular original, o el ADN de los mismos o de la persona donante, se ha conservado. Esto pone
de relieve la necesidad de conservar una muestra de sangre, tejido o muestra de ADN cuando
el tejido est aislado de cultivos primarios (vase la Seccin 12.3.11). Adems, si se sospecha
de un error de identificacin o la contaminacin cruzada, esto puede ser investigado por las
huellas digitales de las clulas y todos los contaminantes potenciales. Huellas genticas de
ADN ha confirmado isoenzima antes y cariotipo [Gartler, 1967; Nelson-Rees y Flandermeyer,
1977; Lavappa, 1978; . Nelson-Rees et al, 1981] Los datos indican que muchas lneas celulares
de uso comn se crosscontaminated con HeLa (vanse las secciones 16.3, 7.10.1, 19.5;. Fig.
16.9 y la Tabla 13.2).
El siguiente protocolo para la toma de huellas dactilares de ADN ha sido proporcionada por
Glyn Stacey, NIBSC, SouthMimms, Herts EN6 3QG, Inglaterra, Reino Unido. Desde el primer
informe de la huella dactilar gentica multilocus por Jeffreys et al. [1985], muchas sondas se
han desarrollado para el anlisis de loci polimrficos llamado nmero de repeticiones en
tndem variables, o VNTR. En la huella de ADN multilocus, la sonda se utiliza en condiciones
que permitan hibridacin cruzada con diferentes familias de ADN repetitivo. As, el resultado
final representa la informacin polimrfica de muchas partes del genoma y por lo tanto es
potencialmente sensible a los cambios en complemento de ADN genmico de una lnea
celular. El primer protocolo dado aqu se basa en los mtodos de toma de huellas dactilares de
ADN multilocus originales publicados por Jeffreys et al. (1985) que ha sido aplicada de manera
til a una amplia gama de mamferos, no mamfero e incluso vegetales y microbianas para
estudios ecolgicos. Si bien este enfoque an requiere un alto nivel de experiencia tcnica en
la electroforesis en gel de agarosa y mtodos de hibridacin blot rpidas transferencia de
Southern se han desarrollado con un sistema de seal de la fosfatasa alcalina rpida que
proporciona resultados de las membranas del sur dentro de un da de trabajo (Tepnel). El uso
de secuencias repetitivas en el genoma del fago M13 como una sonda para las pruebas de
identidad se ha demostrado en animales, plantas y bacterias y, por tanto, representa una
tcnica de autenticacin muy amplio que tiene la ventaja aadida de que la sonda de ADN
puro est disponible comercialmente proporcionando un bajo un nico mtodo para el anlisis
de costos de la identidad de la lnea celular, donde estn involucradas las lneas celulares a
partir de una variedad de especies. Kits y servicios comerciales disponibles para el anlisis
basado en la PCR proporcionan una solucin rpida para la autentificacin de las lneas de
clulas humanas y se discuten a continuacin
Nota Seguridad. Procedimientos relacionados con materiales radiactivos deben ser
realizadas de acuerdo con las regulaciones nacionales y locales. Siempre consulte a su oficial
de seguridad biolgica local antes de iniciar este tipo de trabajo.
Discusin. Este simple mtodo de toma de huellas dactilares utilizando el fago de ADN de M13
(fig. 16.9) proporciona los patrones de huellas digitales tiles para lneas celulares de una
amplia variedad de animales, incluyendo insectos. Tenga en cuenta que algunas culturas
pueden mostrar las huellas dactilares con las bandas de alto peso molecular que estn mal
resueltos, y puede ser til en estos casos para interpretar slo aquellas bandas en un rango de
peso molecular de alrededor de 3-15 kb. El mtodo puede ser refinado utilizando el fragmento
de ADN de M13 ClaI-BsmI 0,78 kb, que contiene las secuencias de la sonda ms tiles.
Mtodos de la sonda de etiquetado no radiactivos tambin se pueden aplicar [Moreno, 1990].
Otras sondas de huellas dactilares multilocus tiles incluyen las sondas de 33,15 y 33,6
[Jeffreys et al., 1985] y sondas de oligonucletidos tales como (GTG) 5 [Ali et al., 1986], ambos
de los cuales estn disponibles comercialmente de Tepnel y Fresenius, respectivamente. Sin
embargo, el ADN del fago M13 es el ms fcilmente disponible y la sonda de toma de huellas
dactilares de multilocus ms baratos que se pueden aplicar de manera til a una amplia gama
de especies.
Una variedad de sondas de un solo locus y reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) mtodos
para el anlisis de VNTR tambin estn resultando muy til para la identificacin de cultivos de
clulas. Para las lneas celulares humanas, los kits de PCR multiplex dan fcilmente perfiles que
son especficos para el individuo de origen (por ejemplo, Promega). Sin embargo, la
experiencia con sistemas similares indica que el anlisis de STR puede no ser capaz de
diferenciar entre los clones de origen comn (Y. Reid, comunicacin personal, American Type
Culture Collection), aunque esto se puede lograr con huellas de ADN multilocus [Stacey et al.,
1993]. Las tcnicas basadas en el anlisis del ADN polimrfico amplificado al azar usando,
corto, cebadores de secuencias aleatorias simples pueden resultar problemticos en trminos
de reproducibilidad. Sin embargo,
mtodos de un solo cebador basado en mini-o secuencias de microsatlites parecen ser ms
prometedores y pueden tener una gama muy amplia de aplicaciones [Meyer et al., 1997].
Mtodos de PCR tambin estn disponibles que puede determinar la especie de origen de una
lnea celular [por ejemplo, Stacey et al., 1997]. Hay otros mtodos de identificacin que no
requieren el uso de PCR y estos incluyen anlisis de isoenzimas (vase la Seccin 16.8.2) y la
electroforesis en agarosa de restriccin digiere ADNg para visualizar directamente los
fragmentos de ADN especficos de la especie [Stacey et al., 1997]
Para la autenticacin de lneas celulares humanas hay un nmero cada vez mayor de empresas
que proporcionan servicios de pruebas de identidad (vase el Apndice II). El autor no puede
dar fe de la calidad del servicio prestado por alguna de estas organizaciones, y es importante
cuando se acerque a estas empresas a hacer ciertas preguntas para asegurarse que van a
prestar el servicio que usted necesita. Estas preguntas incluyen:
Se realizan las pruebas de si mismas o que subcontratan servicios de pruebas?
Cul es la especificidad de los mtodos utilizados para la identificacin individual?
Estn los marcadores genticos utilizados vinculados con los utilizados por los rganos
profesionales u otros centros de expertos?
Tienen experiencia en la interpretacin de datos de la lnea celular?
Tienen experiencia en la casa en los mtodos para ayudar en la interpretacin de los
resultados?
Se han de acreditacin por un organismo profesional o gubernamental apropiada o tienen
afiliacin formal con una organizacin o grupo de expertos?
Hay que recordar que las colecciones de servicio pblico tales como ATCC
(http://www.atcc.org), ECACC (hpa.org), DSMZ (http://www.dsmz.de), JCRB (http://cellbank .
nibio.go.jp /) tambin ser capaz de asesorar sobre dichas pruebas y pueden ofrecer como un
servicio.
Multilocus mtodos tienen el potencial de detectar cambios en la estructura gentica en
muchos lugares en todo el genoma [Thacker et al., 1988] y son generalmente ms verstil para
el anlisis de mltiples especies. El mtodo de toma de huellas dactilares se describe en el
Protocolo de 16.10 proporciona una ruta barato y sencillo para el control de calidad til para
lneas de clulas de una amplia gama de especies. Este tipo de pruebas permite la
confirmacin simultnea de la identidad y la exclusin de la contaminacin cruzada. Como se
ha reiterado recientemente por numerosos autores, los cuales son criterios esenciales para
asegurar los datos experimentales consistentes y evitar prdida de tiempo y dinero debido a
las culturas mal etiquetados o contaminados cruzada (por ejemplo, Stacey et al, 2000. Masters
et al, 2001.).
16.6.3 Perfiles de ADN
Debido a que las secuencias microsatlites son bastante pequeas, ha sido posible identificar y
cuantificar a corto repetir tndem (STR) secuencias en loci especficos. Multiplex segunda
generacin (SGM) examina 7 reas diferentes del genoma y SGM Plus examina 11, dando un
potencial discriminacin de 1:109. Hasta ahora esto slo se aplica a las lneas celulares
humanas, pero hay un gran potencial para la generacin de datos cuantitativos que sean
intercambiables entre diferentes laboratorios [Masters et al, 2001.; Langdon, 2004]. Los
perfiles de ADN est disponible como un servicio de un nmero de laboratorios incluyendo
LGC y ATCC. El siguiente protocolo se ha presentado por Amber James de LGC Diagnstico
Dept., Queens Road, Teddington, Middlesex, TW11 0NJ, Inglaterra, Reino Unido.
16.7 ARN y protenas de expresin
Las clulas de un fenotipo caracterstico particular, pueden ser reconocidos por el anlisis de la
expresin gnica por transferencia Northern [Sambrook et al, 1989.; Ausubel et al., 1996]
usando sondas radiactivas, fluorescentes, o luminiscentes. Este procedimiento puede llevarse
a cabo en el nivel celular, como en FISH (vase el Protocolo 27,9), o mediante hibridacin in
situ con sondas radiactivas (vase el Protocolo 27,8). La figura. 16.10. Secuenciador de ADN.
ABI 377 secuenciador de ADN usando anlisis electrofortico automatizado en gel de
poliacrilamida para separar y cuantificar secuencias STR amplificados. (Foto cortesa de A.
James, LGC Promochem).
Anlisis cualitativo de la protena celular total revela diferencias entre las clulas cuando las
clulas enteras, o extractos de membrana celular, se ejecutan en geles bidimensionales
[O'Farrell, 1975]. Esta tcnica produce una huella caracterstica'''' similares a un polipptido
mapas de hidrolizados de protenas, pero contiene tanta informacin que la interpretacin
puede ser difcil. Es posible escanear estos geles mediante densitometra computarizada
(Molecular Dynamics), que atribuye valores cuantitativos para cada mancha y puede
normalizar cada huella digital para establecer normas e interpretar las diferencias de posicin
en puntos. Etiquetado de las clulas con 32P, [35S] metionina, o una combinacin de
aminocidos 14Clabeled, seguido por autorradiografa, podr hacer un anlisis ms fcil, pero
no es una tcnica adecuada para el uso habitual a menos que la tecnologa para la preparacin
de geles bidimensionales se encuentra actualmente en utilizar en el laboratorio.
Anlisis de la expresin fenotpica se cuantific ahora ms fcilmente por PCR de transcriptasa
inversa (RT-PCR) de las transcripciones de genes a gran escala por el anlisis de la expresin de
genes de microarrays (Affymetrix) [Kiefer et al, 2004.; Staab et al., 2004]. Un ejemplo se da en
la Lmina 24. Los datos de esta placa se comparan tres diferentes tipos de clulas, por lo que
este ejercicio de perfiles indica claramente las diferencias
16.8 ACTIVIDAD ENZIMATICA
Funciones especializadas in vivo se expresan a menudo en la actividad de enzimas especficas ,
algunas de las cuales pueden expresarse in vitro ( vase la Tabla 16.2 ) . Desafortunadamente ,
muchas actividades enzimticas se pierden in vitro ( vanse las secciones 3.4.2 , 17.1.1 ) y ya
no estn disponibles como marcadores de tejido especificidad - por ejemplo , parnquima
heptico pierde actividad de la arginasa en unos pocos das de cultivo . Sin embargo , algunas
lneas celulares hacen expresar enzimas especficas , tales como la tirosina aminotransferasa
en la rata HTC lneas celulares de hepatoma [ Granner et al . , 1968 ] . En la bsqueda de
enzimas marcadoras especficas , la nivel constitutivo ( no inducida ) y el nivel inducida deben
medirse y compararse con un nmero de lneas celulares de control . Actividad sintetasa
glutamil , por ejemplo , caracterstica de la astrogla en el cerebro , se aumenta de varias veces
cuando las clulas se cultivan en presencia de glutamato en lugar de glutamina [ DeMars ,
1958 ; McLean et al . , 1986 ] . La induccin de la actividad de la enzima requiere condiciones
especializadas para cada enzima , y la informacin sobre estas condiciones se puede obtener a
partir de la literatura .
Inductores comunes son hormonas glucocorticoides , tales como dexametasona ; hormonas
polipeptdicas, tales como la insulina y el glucagn ; y alteracin en las concentraciones de
sustrato o de productos en el medio , como en el ejemplo mencionado anteriormente con
glutamil sintetasa .
16.8.1 Isoenzimas
Actividades de enzimas tambin pueden ser comparados cualitativamente entre las cepas de
clulas usando polimorfismos de protenas enzima entre las especies y , a veces , entre las
razas , individuos y tejidos dentro de una especie . Estos llamados isoenzimas , o isozimas ,
pueden ser separados por cromatografa o electroforesis , y los patrones de distribucin (
zimogramos ) pueden ser encontrados a ser caracterstica de las especies o tejidos (Fig. 16.12 )
. Nims y col . [ 1998 ] determin que la contaminacin cruzada entre especies lnea celular
puede ser detectado con el anlisis de isoenzima si las clulas contaminantes representan al
menos el 10 % de la poblacin total de clulas .
Los medios de comunicacin incluyen Electroforesis de agarosa , acetato de celulosa , almidn
, y poliacrilamida . En cada caso , un extracto de enzima en bruto se aplica a un punto en el gel
, y una diferencia de potencial se aplica a travs del gel . Los diferentes isoenzimas migran a
diferentes velocidades y pueden ser detectados despus de tincin con sustratos
cromognicos . Los geles teidos se pueden leer directamente por el ojo y se fotografiaron , o
escaneados con un densitmetro . Protocolo de 16,10 para el anlisis de la isoenzima
utilizando un sistema de gel de agarosa ha sido aportado por Jane L. Caputo, la American Type
Culture Collection, 10801 University Blvd. . , Manassas , Virginia 20110 , EE.UU.
16.8.2 La electroforesis de isoenzimas con Authentikit
Las especies de origen de una lnea de clulas se pueden determinar con el sistema de gel de
electroforesis Authentikit , que se puede utilizar para determinar la movilidad de los siete
isoenzimas : nuclesido fosforilasa ( NP ; CE 2.4.2.1 ) , glucosa - 6 - fosfato deshidrogenasa (
G6PD ; EC 1.1.1.49 ) , malato deshidrogenasa ( MD , CE 1.1.1.37 ) , lactato deshidrogenasa ( LD
; CE 1.1.1.27 ) , aspartato aminotransferasa (AST , CE 2.6.1.1 ) , la isomerasa de manosa - 6 -
fosfato ( MPI , CE 5.3 .1.8 ) y peptidasa B ( Pep B , EC 3.4.11.4 ) . Este sistema permite una fcil
deteccin de hasta seis lneas celulares por gel de siete marcadores genticos en menos de 3
horas [ heno , 2000 ] . En la mayora de los casos , la especie de origen se pueden determinar
mediante el uso de slo cuatro de los siete isoenzimas enumerados : nuclesido fosforilasa ,
deshidrogenasa de glucosa - 6 - fosfato , malato deshidrogenasa , y lactato deshidrogenasa .
Del mismo modo , la lnea celular interespecies contaminacin cruzada puede ser detectada en
la mayora de los casos mediante el uso de estos cuatro isoenzimas [ Nims y col . , 1998 ] ,
aunque peptidasa B tambin era necesario para analizar una contaminacin de una lnea
celular de ratn con una lnea celular de hmster
Anlisis de electroferograma. Conecte el gel seco a la forma de documentacin de geles;
alinear los pocillos de muestra en el origen, y medirlos. El fondo de color amarillo brillante de
las formas estn milmetro forrado y dar el mximo contraste y mejorar las bandas de color
prpura en el gel seco (ver fig. 16.12). Medir la distancia de migracin enzima midiendo desde
el centro de la zona de aplicacin a la mitad de la zona de la enzima. Distancias medidas rcord
para el estndar, el control y las incgnitas en el formulario de datos de la migracin de la
enzima. Transfiera los datos de migracin de la enzima a la ID de celda forma definitiva para
confirmar la identificacin de especies. Las instrucciones detalladas para la identificacin de
incgnitas se incluyen con las formas. Mantener estas formas en su cuaderno como un registro
permanente de sus resultados. Una discusin detallada de cada enzima se puede encontrar en
el Manual para la autenticacin de la clula y de identificacin, disponible a partir de
Innovative Chemistry, Inc.

Tcnicas de extraccin alternativos. Los extractos celulares se pueden preparar por
ultracentrifugacin, congelacin y descongelacin rpidamente tres veces, o el tratamiento
con alcohol octlico [Macy, 1978]. Un tampn de extraccin de clulas tambin est disponible
a partir de Qumica innovador, Inc. El control y estndar se puede preparar utilizando el
procedimiento estndar (vase el Protocolo 16,10) para la preparacin de extracto. El estndar
se prepara a partir de la lnea celular de ratn L929 (ATCC CCL-1), y el control se prepar a
partir de la lnea celular HeLa humanas (ATCC CCL-2). O'Brien et al. [1980] inform de que las
muestras podran ser almacenados a -70 C durante hasta un ao sin prdida sustancial de
actividad de la enzima.
16.9 ANTIGNICO MARCADORES
Como resultado de la abundancia de anticuerpos y kits de proveedores comerciales (vase el
Apndice II), los ensayos de inmunotincin y ELISA son algunas de las tcnicas ms tiles para
la caracterizacin de la lnea celular (Tabla 16.3). Independientemente de la fuente del
anticuerpo, sin embargo, es esencial para estar seguro de su especificidad mediante el uso de
material de control apropiado. Esto es cierto para los anticuerpos monoclonales y antisueros
policlonales por igual; un anticuerpo monoclonal es altamente especfico para un eptope
particular, pero la especificidad de la expresin del eptopo a un tipo de clula particular
todava debe ser demostrada.

16.9.1 La inmunotincin
Localizacin de anticuerpos se determina por fluorescencia, en el que el anticuerpo est
conjugado a un fluorocromo, tal como fluorescena o rodamina, o por la deposicin de un
producto precipitado a partir de la actividad de la peroxidasa de rbano picante o fosfatasa
alcalina conjugada con el anticuerpo. Tincin inmunolgica puede ser directa, es decir, el
anticuerpo especfico es en s mismo conjugado con el fluorocromo o una enzima y se utiliza
para teir directamente la muestra. Por lo general, sin embargo, se utiliza un mtodo indirecto
en el que el anticuerpo primario (especfico) se usa en su forma nativa para unirse al antgeno
en la muestra, seguido de tratamiento con un segundo anticuerpo, dirigido contra la
inmunoglobulina de la primera anticuerpo. El segundo anticuerpo puede estar conjugado a un
fluorocromo [Johnson, 1989] y se visualiz en un microscopio de fluorescencia (ver placas 11a,
15d, e, y 20c-f), o con peroxidasa y se visualiz en un conventionalmicroscope, despus del
desarrollo con una peroxidasa cromognico sustrato (ver placas 11b-d y 12a, b). Varios
mtodos han sido utilizados para mejorar la sensibilidad de la deteccin de estos mtodos,
particularmente los mtodos peroxidaselinked. En la tcnica de peroxidasa anti-peroxidasa
(PAP), un nivel de amplificacin adicional es aadido por reaccin con peroxidasa conjugada
con anticuerpo anti-peroxidasa de la misma especie como el anticuerpo primario [Jones y
Gregory, 1989]. Incluso mayor sensibilidad ha sido obtenido mediante el uso de un segundo
anticuerpo biotinconjugated con estreptavidina conjugada con peroxidasa o fosfatasa alcalina
(Amersham) o segundo anticuerpo goldconjugated (Janssen) con la intensificacin de plata
posterior (Amersham).
Variaciones
Fijacin. Para la superficie de la clula o, en particular, para la fijacin de antgenos sensibles,
el tratamiento de las clulas con anticuerpos primero, y luego posfijo como en el Paso 2.
Cuando se utiliza un sustrato de vidrio, acetona fra se puede sustituir por etanol cido.

Peroxidasa indirecta. Anticuerpo conjugado con peroxidasa sustituto para el anticuerpo
fluorescente en la etapa 6, y luego transferirlo a la peroxidasa sustrato. (Preparaciones teidas
con Diaminobencidina pueden deshidratarse y montado en DPX, pero carbazol acetato deben
ser montadas en glicerol como en el paso 7.)

PAP. Utilice segundo anticuerpo conjugado con peroxidasa en la etapa 6, y luego transferir el
cubreobjetos a lo complejo PAP diluida (1:100) (ms inmunobiolgicos proveedores-por
ejemplo, Dako, Vecta) en D-PBSA durante 20 min. Enjuague y agregue sustrato de peroxidasa
como para peroxidasa indirecta. Incubar, lavar y montar el cubreobjetos.

Marcadores de superficie celular. Antgenos especficos de la superficie celular son por lo
general tieron en las clulas vivas (a 4 C en presencia de azida de sodio para inhibir la
pinocitosis), mientras que los antgenos intracelulares se tien en clulas fijadas, requiriendo a
veces la luz tripsinizacin para permitir el acceso del anticuerpo al antgeno.
HLA y antgenos de los grupos sanguneos se pueden demostrar en muchas lneas celulares
humanas y sirven como herramientas de caracterizacin tiles. Polimorfismos de HLA son
particularmente valiosos, especialmente cuando el perfil del paciente donante se conoce
[Espmark y Ahlqvist-Roth, 1978; Stoner et al, 1981.; Pollack et al., 1981].
16.9.2 Inmunoanlisis
Ensayo de extractos de clulas puede ser preformado por ensayo ELISA en una matriz de placa
de microtitulacin con pocillos recubiertos con anticuerpos . Los ensayos se proporcionan en
forma de kit (por ejemplo , Assay Designs , I + D) y permiten la cuantificacin del marcador y de
la protena producto de expresin .
Anlisis de la expresin de antgeno tambin puede ser automatizado y se cuantific por
citometra de flujo ( vase la Seccin 21.7.2 ) ( BD Biosciences FACSStar o Guava Technologies )
, por anlisis de imagen de mltiples corrientes de clulas (Agilent 2100 ; . Fig. 16,13 ) , o por el
anlisis de microarrays de anticuerpos .

16.10 DIFERENCIACIN
Muchas de las caractersticas descritas en los marcadores antignicos o actividades
enzimticas tambin pueden considerarse como marcadores de diferenciacin , y como tales
pueden ayudar a correlacionar las lneas celulares con su tejido de origen . Otros ejemplos de
diferenciacin, y por lo tanto los marcadores especficos de la identidad de la lnea celular, se
dan en el captulo 3 ( vase el cuadro 3.1 ) , y los ensayos apropiados para estas propiedades
se pueden derivar de las referencias citadas en la tabla (vase tambin la seccin 17.6 y el
Captulo 23 . )