Bioqumica e Fisiologia Microbiana

Mestrado Integrado em Engenharia Biolgica 3 Ano

Sistemas Toxina-Antitoxina
Ana Margarida Santiago 65023
Joana Galante 65058
Pedro Pereira 65073
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
O nosso trabalho
Clula
Plasmdeo
Sistema bsico
de subsistncia
Gene da proteina
iniciadora
Genes de
controlo do nde
cpias
ORI
Sistema auxiliar
de subsistncia
Sistema de
partio
Eliminao de
multimeros
Sistema toxina-
antitoxina
Tipo I
Tipo II
Cromossomas
Sistema toxina-
antitoxina
Regulao
Aplicaes
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
Plasmdeos
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
Sistema auxiliar de subsistncia
gene da protena iniciadora da replicao
genes de controlo do nmero de cpias
origem de replicao ORI
Tipo 1: sistemas de partio distribui as cpias do
plasmdeo pela clula durante a diviso celular
Tipo 2: usa stios especficos de recombinao para
eliminar multmeros de plasmdeos originados por
recombinao homologa, o que previne a
formao de aglomerados de plasmdeos
Tipo 3: sistemas toxina-antitoxina - permitem a
sobrevivncia s das clulas com plasmdeos
Sistema bsico de subsistncia
Como que os plasmdeos subsistem dentro das clulas?
Como controlam a sua replicao?
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
Sistemas toxina-antitoxina uma ideia geral
Os sistemas TA contribuem para a
estabilidade dos plasmdeos por um
mecanismo de morte ps-
segregacional (PSK). Este serve-se da
menor estabilidade da antitoxina
relativamente toxina, levando
morte das clulas que no receberam
uma cpia do plasmdeo na diviso
celular.
O objectivo destes sistemas permitir
apenas a sobrevivncia das clulas
com plasmdeos, para que a nvel
evolutivo estes no sejam perdidos.
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
Ribonucleases altamente
especficas
Kid AU(A/C)
MazF ACA
YoeB adenosinas em RNA
Afectam a sntese proteca
Aco das toxinas
Fonte: E. Diego-Navarro et al
doi:10.1111/j.1742-4658.2010.07722.x
Fonte: Lieven Buts et al
doi:10.1016/j.tibs.2005.10.004
Kid-Kid
YdcE Bacillus subtilis
Fonte: PDB 1NE8
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
Aco das toxinas
Envenenam os ribossomas,
estimulando a sua
actividade de RNAse
O complexo ribossoma-
pptido fica bloqueado
Afectam o nvel de sntese
proteca
Fonte: Lieven Buts et al
doi:10.1016/j.tibs.2005.10.004
Fonte: Lodish et al
Molecular Cell Biology
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
Envenenam a actividade
da topoisomerase
Congelam o ciclo
enzimtico da DNA girase
numa fase em que as
cadeias de DNA se
encontram cortadas
Bloqueia a replicao ou a
transcrio e causa danos
no DNA
Aco das toxinas
CcdB - Girase
Fonte: Lieven Buts et al
doi:10.1016/j.tibs.2005.10.004
ParE
Fonte: PDB 3LNU
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
Aco das toxinas
Interferem com a membrana
citoplasmtica, reduzem o
potencial membranar () e
inibem o consumo de
oxignio/respirao
Possuem domnios
hidrofbicos
Alteraes morfolgicas nas
clulas ghost cells
Fonte: Kenn Gerdes et al
EMBO J. 1986 Aug;5(8):2023-9
Ex: Hok (host killing) e RelF de E. coli
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
Sistemas Toxina-Antitoxina
Tipo I e II
Tipo I: a antitoxina um RNA antisense
Exemplo: sistema TA Hok/Sok, do plasmdeo R1
Tipo II: a antitoxina uma protena instvel que neutraliza
directamente a toxina
Exemplo: sistema TA Kid/Kis, do plasmdeo R1
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
Legenda da figura: Organizao dos sistemas toxina-antitoxina. (A)
Normalmente, o gene da antitoxina precede o da toxina. (B) Nalguns
casos, a ordem a inversa.
Os sistemas TA podem ser transmitidos para
outra clula por transferncia gentica
horizontal;
Organizam-se geralmente em operes
antitoxina-toxina;
H auto-regulao;
Antitoxina de tipo II degradada por
proteases celulares especficas (ex: Lon).
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
Antitoxinas ideia geral
As antitoxinas de tipo II contm uma regio de ligao ao DNA
no terminal N e uma regio de inibio da toxina no terminal C;
A conformao do terminal C s activada na presena de
toxina;
Silenciamento do opero: a antitoxina inibe a toxina e o
complexo toxina-antitoxina actua como repressor do opero
TA;
Activao do opero: a degradao da antitoxina mais rpida
que a sua sntese.
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Tipo I
Estes sistemas baseiam-se no emparelhamento do RNA antisense
com o mRNA killer, impedindo a sua traduo;
H ento uma inibio da traduo por 2 mtodos:
- Degradao do complexo de RNA pela RNAse III;
- Obstruo do stio de ligao dos ribossomas (sequncia
Shine-Delgarno).
Perda do plasmdeo: degradao rpida do RNA antisense, parando
a sntese de mRNA killer. A expresso de genes da toxina activada
pelo restante mRNA killer.
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
Legenda da figura: Esquema representativo do modo de actuao do sistema Hok/Sok, do plasmdeo R1.
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Legenda da figura: Esquema explicativo da activao da traduo e do enrolamento especfico do mRNA Hok em clulas com plasmdeo
(A) e em clulas sem plasmdeo (B).
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Tipo II
Nestes sistemas, a antitoxina liga-se toxina, inibindo a sua
actuao.
Clula-filha sem plasmdeo: herda tambm complexos de
toxina-antitoxina.
A antitoxina degradada por proteases e a toxina fica livre.
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
A CcdA compete com a toxina pela ligao DNA girase.
A RelB impede o corte do RNA dentro dos ribossomas pela toxina
(ribossome-dependent).
A Kis e a MazE inibem a actividade de RNAse das respectivas toxinas
(ribossome-independent).
Legenda da figura: Modo de
actuao do sistema relBE.
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Regulao
O opero parD do plasmdeo R1 codifica para a toxina Kid e a antitoxina kis. A sua
regulao modelada ao nvel da transcrio e da pos-transcrio.
Constituio do opero parD
A iniciao da transcrio no parD ocorre numa regio que contem duas
sequncias palindrmicas homologas Regio I e Regio II espaadas por 33
bp. As Regies I e II, de 23 bp cada, contm um sequncia de 9 bp que
apresenta uma repetio imperfeita e invertida (IR).
Regio II
23 bp
Regio I
23 bp
33 bp
-35
Local de ligao
do ribossoma
-10 +1
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Legenda da figura: A Regio I contem 18 bp que apresentam uma simetria perfeita invertida, e inclui o 10 motif. A Regio II
apresenta os mesmo 18 bp mas com uma simetria imperfeita. O eixo axial de simetria est representado no interior das caixas
com tracejado. As bases das quais as desoxiriboses so protegidas pela Kis (barras grossas) ou pelo complexo kis-kid (barras
finas), da quebra por parte de radicais hidroxilo, esto indicadas. A sequencia de DNA dos elementos 35 e 10 do promotor e o
sitio de iniciao da transcrio esto indicados a azul. O local de ligao dos ribossomas (RBS) e o codo de iniciao (Met) esto
indicados a vermelho.
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Regulao na transcrio
Foi demonstrado que in vivo uma autoregulao eficiente do opero parD
requer uma aco consertada de ambas as protenas.
a antitoxina que interage como opero (reprimindo-o), contudo, quando na
ausncia de kid f-lo com baixa afinidade. Esta afinidade vai, assim, depender
do rcio toxina:antitoxina.
Na presena do opero:
[kid]>[kis] formam-se complaxos hetero-hexomericos estveis (kid2-kis)n , o
que neutraliza a aco da toxina, mas no interagem com o opero.
[kid]<[kis] e [kid]=[kis] formam-se hetero-hexomeros (kid2-kis2)n e hetero-
octomeros (kid2-kis2-kid2-kis2)n , respectivamente, e h uma grande
interaco destes com o opero.
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Kis:kid 1:1 ou
excesso kis
Represso do
opero
No h
reposio de kis
e kid
Kis degradada
pela protease
Lon
Excesso de kid
Diminuio da
represso do
opero
Reposio de kis
e kid
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ainda de referir que os octomeros ligam-se com os dois dmeros de
antitoxina ao DNA, enquanto os hexomeros ligam-se s com um dmero, o
que resulta numa maior eficincia de regulao por parte dos octomeros
(existentes no caso de equimolaridade).
H tambm uma maior afinidade com a Regio I, relativamente Regio II, o
que se pensa ser devido ao facto da Regio II ter bases no conservadas.
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
A regulao ao nvel da pos-transcrio apresenta-se como um mecanismo
adicional de regulao do rcio kid:kis. Foi provado que esta regulao se d
por limitaes degradao do RNAm dos genes do opero parD, e por
traduo conjunta.
A limitao na degradao do RNAm permite a permanncia de um maior
nmero de mensageiros correspondentes ao primeiro gene do opero, o que
resulta numa maior concentrao de Kis.
A traduo conjunta permite uma coordenao na sntese de Kis e Kid, para
que no se forme toxina semse formar antitoxina.
Regulao na pos-transcrio
Para se sintetizar toxina necessrio sintetizar antitoxina, mas o contrrio no
verdade.
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
Cromossoma
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
Sistemas TA cromossomais
A toxina e a antitoxina formam um complexo que
funciona como co-repressor do seu opero.
Exemplos: sistemas mazEF e chpA.
Estes sistemas esto envolvidos na estabilidade dos
plasmdeos.
So comuns no genoma de bactrias sujeitas a
alteraes frequentes no seu ambiente.
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
Legenda da figura: Diagrama esquemtico de um mdulo toxina-antitoxina.
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
Papis dos sistemas TA cromossomais
Resposta a stresses
mazEF:
causa morte celular sob vrias condies de stress
modulador de crescimento sob condies de falta de
aminocidos.
Morte celular programada
Estado de latncia
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
Factores estabilizantes de plasmdeos;
Estabilizam regies adjacentes do cromossoma e
impedem que sejam apagadas;
Controlo de qualidade durante a sntese proteica.
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Legenda da figura: Modelo da activao induzida pelo stress do sistema TA.
(A) Condies normais de crescimento
(B) Resposta ao stress
(C) Traduo das mensagens de resposta ao stress e inactivao do sistema TA.
Aplicaes
Fago P1
Fago T4
Fonte: SCIENCE PHOTO LIBRARY
United Kingdom
Os bacterifagos interferem com
a transcrio e traduo do
hospedeiro, quando o ciclo ltico
induzido;
Pode activar os sistemas TA;
Limita a produo de novos
fagos, bloqueia o metabolismo
celular ou lisa a clula antes de
os novos fagos estarem
montados
Amoxicilina
(-lactmico)
Aplicaes
Fonte: SCIENCE PHOTO LIBRARY
United Kingdom
Clulas persistentes clulas que no
crescem nem morrem na presena
de agentes anti-bacterianos, e por
isso apresentam tolerncia a vrias
drogas (MDR)
Observa-se a superexpresso dos
sistemas toxinas-antitoxina
Os sistemas TA cessam o
metabolismo bacteriano a uma
extenso tal, que os antibiticos
deixam de afectar as clulas
MRSA- Staphylococcus aureus
Mycobacterium tuberculosis
(mais de 30 sistemas TA)
Antibiticos
Aplicaes biotecnolgicas
Desenvolvimento de novas formas de tratar infeces
bacterianas, especialmente relacionadas com
clulas persistentes
Utilizao de toxinas (MazF, Kid) como ribonucleases
altamente especficas e silenciveis
Aplicao de toxinas para induo de apoptose em
clulas tumorais (Kid)
Construo de vectores de clonagem
commaior eficincia e estabilidade
Fonte: E. Diego-Navarro et al
doi:10.1111/j.1742-4658.2010.07722.x
Desenvolvimento de vacinas contra
bactrias (ghost-cells)
Concluses
O sistema Toxina-Antitoxina faz parte dos sistemas de subsistncia dos
plasmdeos, aumentando a sua eficincia e eliminando os segregantes;
As toxinas interferem com funes vitais da bactria: podem abrandar o
crescimento, parar o desenvolvimento celular ou mesmo provocar a morte
da clula;
Os sistemas podem ser classificados como Tipo I ou II, de acordo com a
natureza das antitoxinas. As antitoxinas so degradveis e so capazes de
inactivar a toxina ou a sua produo;
As antitoxinas formamumcomplexo comas toxinas capaz de regular o seu
opero;
Os sistemas TA tambm esto presentes no cromossoma, conferindo
vrias vantagens competitivas s estirpes que os possuem;
O estudo destes sistemas melhora a compreenso acerca da fisiologia
microbiana e pode ter aplicaes na rea da Biotecnologia.
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
Artigo de base
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applications and relationships with closely-related toxin-antitoxin systems. The FEBS Journal. (2010).
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Bibliografia
Bioqumica e Fisiologia Microbiana
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Bibliografia