Laboratorio de Bioingenieria

Profesor (es): Juan Francisco Snchez

INGENIERA BIOTECNOLGICA
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE INGENIERA



Instituto Politcnico Nacional



Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniera Campus Guanajuato





Torres Garca Francisco Alejandro



Cuestionario

Tcnica Western-Blot





Materia: Tecnologas de Recombinacin Gentica



Grupo 4BV1




Docente:
Juan Francisco Snchez


Semestre Enero - Junio 2014


Laboratorio de Bioingenieria

Profesor (es): Juan Francisco Snchez

INGENIERA BIOTECNOLGICA
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE INGENIERA





1. En qu consiste el Western Blot?

Tcnica utilizada para identificar una protena en una muestra que contiene varias protenas.
2. Cmo funciona el Western Blot?

Las protenas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel en funcin de su peso molecular,
a continuacin se utiliza un anticuerpo especfico para detectar la protena de inters, el resultado
aporta informacin sobre el peso molecular de la protena y su cantidad relativa en la muestra.

3. Describa los tipos de Western Blot
Directo:
El anticuerpo primario marcado se une al antgeno de la membrana y reacciona con el sustrato
originando una seal detectable. En el mtodo directo de deteccin, el anticuerpo primario que
se utiliza para detectar el antgeno sobre la superficie de la membrana, debe ir marcado con una
enzima.
Indirecto
El anticuerpo primario sin marcar reacciona con el antgeno. Luego, un anticuerpo secundario
marcado se une al primario y reacciona con el sustrato. En el mtodo indirecto, se aade
primero un anticuerpo primario sin marcar contra el antgeno de la superficie de la membrana;
posteriormente se aade un anticuerpo secundario marcado contra el anticuerpo primario.
4. Son algunas aplicaciones del Western Blot
A. Prueba del VIH, diagnstico
del FIV, diagnostico de
encefalopata espongiforme
bovina.
B. Indica detecciones o errores
en el proceso de
transcripcin, ayudan a
conocer las funciones de los
genes.
C. Ninguna de las anteriores.

5. Define Inmungeno:
Protena especfica o secuencia de amino cidos que se inyecta en un animal para provocarle una
respuesta inmunitaria y producir anticuerpos especficos contra ella.

6. Mencione los principales errores en la prueba de Western Blot


Laboratorio de Bioingenieria

Profesor (es): Juan Francisco Snchez

INGENIERA BIOTECNOLGICA
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE INGENIERA



Bandas inusuales o inesperadas
No hay bandas
Bandas dbiles o seal dbil
Manchas irregulares o desiguales en la mancha.

7. Mencione detalladamente el mtodo de obtencin de protenas a partir de clulas
adherentes
Lavar las clulas en el matraz de cultivo de tejidos o el plato aadiendo fro tampn fosfato
salino (PBS) y mecerse suavemente. Deseche PBS.
Aadir PBS y utilizar un rascador de clulas para desalojar las clulas. Pipetear la mezcla en
tubos de micro centrfuga.
Se centrifuga a 1500 rpm durante 5 minutos y descartar el sobrenadante.
Aadir 180 l de buffer de lisis celular de hielo fro con 20 l fresco cctel inhibidor de la
proteasa. Incubar durante 30 minutos en hielo, y despus aclarar el lisado por centrifugacin
durante 10 minutos a 12.000 rpm, a 4 C.
Transferir el sobrenadante (o mezcla de protenas) a un tubo nuevo y almacenar en hielo o se
congela a -20 C o -80 C.
Medir la concentracin de protena usando un espectrofotmetro.

8. Cmo funciona la electroforesis en gel de poliacrilamida en western Blot?
El gel de poliacrilamida se coloca en un compartimento que contiene el tampn de migracin. Un
tampn de migracin suele contener 25mM Tris; 190mM glicina; 0,1% SDS; pH 8,3. Los lisados
proteicos se cargan en las calles del gel, normalmente entre 20 y 40 g por calle.
9. Cules son los principales Componentes de los geles en Western Blot
Constituidos de poliacrilamida, N, N-metilenbisacrilamida (Bis), persulfato de amonio (APS) y
TEMED.
En qu casos es til utilizar el mtodo Western Blot?
Cuando la protena de inters presente en mi muestra

Cuando se quiere determinar el nivel de variacin de expresin de la protena en distintos
tejidos o lneas celulares
Cuando se quiere determinar si la muestra es sana o patolgica