1

Nomenclatura

IPTG Isopropil--D-thiogalactopiranosido
OD Oxgeno disuelto (% de saturacin)
P Concentracin de producto (g/L)
S Concentracin de sustrato (g/L)
T Temperatura (C)
t Tiempo (h)
X Concentracin de biomasa (g/L)
Y
p/s
Rendimiento de producto respecto al sustrato
Y
x/s Rendimiento de biomasa respecto al sustrato

Letras griegas
c Velocidad especfica de crecimiento (h
-1
)
Viscosidad del fluido (0.001 Pa s)
c Nabla de calentamiento
e Nabla de enfriamiento
m Nabla de mantenimiento
1
Temperatura mnima de calentamiento
2
Temperatura mxima de calentamiento
Dimetro




2
Programa del Curso - Taller

Bioprocesos con Microorganismos Recombinantes

Fermentacin, Recuperacin y Purificacin


Responsables: Profesores participantes

Dr. Leobardo Serrano Carren Dra. Brenda Valderrama Blanco
I. Q. Vernica Albiter Hernndez Dr. Carlos Pea Malacara
QFB. Myriam Ortz Garca Dr. Leobardo Serrano Carren
Tec. Mario Caro Bermdez Dr. Edmundo Castillo Rosales
M. en B. Martn Patio Vera


Duracin:

El programa de entrenamiento tendr una duracin de una semana, durante el perodo del 17 al
23 de Octubre del ao en curso.

I.- Objetivos:

Objetivo general:

Proporcionar entrenamiento prctico e integral mediante el desarrollo de un
proceso de fermentacin sumergida a nivel Planta Piloto, utilizando un
microorganismo recombinante, as como las principales operaciones unitarias de
recuperacin y purificacin.

Objetivos especficos:

a) Escalar un proceso de fermentacin sumergida utilizando una cepa de E. coli
recombinante.

b) Recuperar y purificar una enzima recombinante intracelular empleando
operaciones unitarias bsicas.

II.- Descripcin resumida del proceso

El proceso de estudio, objeto del presente curso ser una fermentacin sumergida, en la que
interviene una cepa de E. coli recombinante, a la cul se le introdujo un plsmido con la
informacin necesaria para producir la enzima penicilino-amidasa. Dicha enzima es empleada en
la industria qumico-famacetica para la produccin de antibiticos semisintticos derivados de
la penicilina, como lo es la ampicilina.
El proceso de propagacin del microorganismo se inicia con la preparacin de un inculo, a
partir de una ampolleta con microorganismos liofilizados, en matraces Erlenmeyer de 250 mL


3
incubados bajo condiciones controladas de agitacin y temperatura. Una vez obtenido el
crecimiento deseado se continua la propagacin en matraces Fernbach de 2.5 L (cultivados en
condiciones similares a los matraces de 250 mL), los cuales servirn de inculo para dos
fermentadores Microferm. El volumen de trabajo de los fermentadores ser de 5 L y las
condiciones de operacin se proporcionan en la figura 1. Finalmente, se inocula un fermentador
de produccin piloto con 30 L de volumen de operacin en condiciones apropiadas de esterilidad
y control, se cultiva durante 12 horas y se deja madurando un lapso aproximado de 8 horas (en la
figura 1 se muestra un diagrama general del proceso).

Durante la fermentacin se tomarn muestras cada 30 y 60 minutos para medir biomasa,
actividad especfica de la enzima, densidad ptica, protena, glucosa anlisis microbiolgico
(cuenta en placa). Con los datos colectados se realizarn grficas de crecimiento, produccin y
consumo, adems de estimar los siguientes parmetros del proceso:

a) Clculo de los valores de las nablas de calentamiento ( c), mantenimiento ( m) y
enfriamiento ( e) del proceso de esterilizacin del reactor de 30 L suponiendo una poblacin
de 1x10
9
esporas de Bacillus estearotermophillus.

b) Cinticas de fermentacin (X, pH, OD, Protena, Actividad, S) .

c) Velocidad especfica de crecimiento ( ) .

d) Rendimientos aparentes (Y
x/s
, Y
p/s
) .

e) Clculo de los parmetros de la ecuacin de Leudeking - Piret.


para producto:
para sustrato:


Como es sabido, las etapas principales de un bioproceso son la transformacin bioqumica
(fermentacin) y el proceso de purificacin del metabolito de inters. Las tcnicas de separacin
que se emplean en los bioprocesos no solo dependen de la localizacin del producto, tamao de
molcula, carga elctrica y solubilidad; tambin dependen de la concentracin y el valor
comercial del producto (en la figura 2a y 2b se presenta un diagrama de bloques del proceso de
extraccin que se va a estudiar).

=
dP

d t
d X

d t
+
X
=
dS

d t
m
d X

d t
+
nX
_


4
Figura 1. Diagrama de flujo del proceso de fermentacin de
penicilino- amidasa



Liofilizado

Inocular Matraz de 250 mL con 50 mL de Inocular Matraz de 2.5 L con 0.500 L de medio
medio Luria. Incubar a 37
o
C, BSgL. Incubar a 29
o
C, 200 rpm
200 rpm durante 8 horas. durante 11 horas.



Inocular
con 500 mL




Maduracin Fermentador piloto con un Fermentador de 14 L con 5 L de
volumen de operacin de 30 L Inocular medio BSgL. Condiciones de
Condiciones de de medio BSg. Condiciones de operacin: 29 C, pH de 7.0, 200
operacin: 29C, operacin: 29 C, pH de 7.0, con 3 L rpm, aireacin 5 L/min. Tiempo
150 rpm, aireacin 300 rpm, aireacin 30 L/min. de proceso de 4 5 horas.
15 L/min. Tiempo Tiempo de proceso de 10 12 horas.
Aproximado de 8 horas.


5
Caldo de
fermentacin
Centrifugacin
Westfalia 10,000
rpm y temp.
ambiente
Concentrado celular
(Descargar en buffer de
fosfatos 0.1 M, pH 7.0)
Medir volumen, Analizar: protena
y actividad enzimtica
Muestra 2
Adicionar
sacarosa +
EDTA, agitar
lentamente por
15 minutos
Resuspender
inmediatamente
en agua al mismo
volumen, agitar
lentamente por
15 minutos
Centrifugacin
Minisharples a
12,000 rpm y
temperatura
ambiente.
Medir Volumen
Analizar: protena y
Act. Enzimtica
Muestra 1
Analizar: protena y Act.
Enzimtica
Muestra 4A
Sobrenadante
(desecho)
Medir Volumen
Analizar: protena y
Act. Enzimtica
Muestra 3
Medir volumen
Pasta
Sobrenadante
(desecho)
Medir Volumen, Analizar:
protena y Act. Enzimtica
Muestra 5A
Figura 2a. Diagrama general de flujo del proceso de purificacin
de la enzima penicilino-amidasa (shock osmtico)
Centrifugacin
Minisharples a
12 000 rpm
Liofilizar
(fraccin purificada)
Sobrenadante
Medir volumen.
Analizar: protena y Act.
Enzimtica. Muestra para
electroforesis
Muestra 7A
Pasta
Pesar la pasta.
Resuspender 0.1 g
en 10 ml de buffer
de fosfatos. Analizar:
protena y Act.
Enzimtica.
Muestra 6A
Determinar el peso
del liofilizado.
Analizar: protena
y Act. Enzimtica
Muestra final A
Columna de
cromatografa de
intercambio inico
Analizar: protena y Act. Enzimtica en cada fraccin
(tomar en consideracin el volumen de cada fraccin).
Muestra para electroforesis (fraccin ms pura)


6
Figura 2b. Diagrama general de flujo del proceso de purificacin de la enzima
penicilino-amidasa (Homogeneizador Molton Gaulin)
Centrifugacin
Beckman a 10 000
rpm, 10 min
Pasta
Sobrenadante
Columna de cromatografa
de intercambio inico
Analizar: protena y Act.
Enzimtica en cada fraccin
(tomar en consideracin el
volumen de cada fraccin).
Muestra para electroforesis
(fraccin ms pura)
Medir volumen. Dializar una
muestra de 60 ml en bolsas
de 10 kD. Analizar: protena
y Act. Enzimtica. Muestra
para electroforesis
Muestra 8B
Pesar la pasta. Resuspender 0.1 g en 10 ml de
buffer de fosfatos y dializar la muestra en
bolsas de 10 kD. Analizar: protena y Act.
Enzimtica.
Muestra 7B
Precipitacin con sulfato de
amonio (40 % de
saturacin). La adicin debe
ser lenta a 4 C y agitacin
lenta, dejar reposar de 2 3
horas con baja agitacin
Concentrado celular
(Descargar en buffer de
fosfatos 0.1 M, pH 7.0)
Medir volumen, Analizar: protena
y actividad enzimtica
Muestra 2
Tomar 120 ml
del concentrado
celular
Adicionar 80 ml
de buffer
Disminunir la temperatura
10 grados con respecto a
la temperatura ambiente
Ruptura celular en el
homogenizador a una
presin de 500 580
kg/cm
2
, dos pases
Centrifugacin
Beckman a 10 000
rpm, 10 min
Pasta
Sobrenadante
Medir Volumen. Analizar:
protena y Act. Enzimtica.
Muestra para electroforesis .
Muestra 6B
Pesar la pasta.
Resuspender 0.1 g en 10 ml de
buffer de fosfatos Analizar:
protena y Act. Enzimtica
Muestra 5B
Medir Volumen.
Analizar: protena
y Act. Enzimtica
Muestra 4B
Liofilizar
(fraccin purificada)
Determinar el peso
del liofilizado.
Analizar: protena
y Act. Enzimtica
Muestra final B


7
En este curso se va a trabajar con un microorganismo recombinante que produce una enzima
intracelular de inters industrial y para tal efecto se emplearn las siguientes operaciones
unitarias de separacin y purificacin:

1. Centrifugacin
2. Ruptura celular (shock osmtico y homogeneizador Molton Gaulin)
3. Cromatografa de intercambio inico
4. Liofilizacin



III.- Calendario de actividades


Domingo

17:00 a 19:00 Registro de participantes, bienvenida, introduccin general del curso y
organizacin de los dos grupos de trabajo (nombramiento del responsable de
cada grupo).

Grupo 1 Grupo 2









Lunes


8:00 a 11:00 Preparacin de material, medios de cultivo y las curvas patrn de protena por el
mtodo de Bradford y actividad enzimtica por el mtodo de p-
dimetilaminobenzaldehido.





8
Material por equipo:

600 mL de medio rico, para vaciar 20 mL aproximadamente en 30 cajas Petri
1 matraz Fernbach de 2.0 L con 500 mL de medio BSgL (figura 3)
1 matraz de 250 mL (con 50 mL de medio Luria)
1 caja de puntas de 1 mL para pipeta automtica (azules)
1 caja de puntas de 200 L para pipeta automtica (amarillas)
1 gradilla de tubos de vidrio de 15 x 160 mm con 9 mL de solucin salina (0.85 %
P/V)
Puntas de 5 y 10 mL para pipeta automtica
Perlas de vidrio (1 frasco corex de 50 mL)



Material para los dos equipos

10 pipetas de 10 mL
10 pipetas de 5 mL
10 pipetas de 1 mL
2 probetas de 50 mL
30 tubos corex de 50 mL para toma de muestras
1 litro de hidrxido de potasio 3 N
1 litro de agua destilada





Medio Luria


Reactivo Concentracin (g/l) Cantidad a pesar para
50 mL (g)
NaCl 10.0
Bactotriptona 10.0
Extracto de levadura 5.0
Kanamicina* 0.035
* Soluciones preparadas por el personal de Planta Piloto

Se mezclan y disuelven los componentes, excepto la kanamicina. Posteriormente, se esteriliza en
autoclave y cuando el medio se encuentre fro se le adiciona 3 mL de solucin estril de
kanamicina / L de medio de cultivo, de esta forma se obtiene una concentracin final de 0.035
g/L. La adicin de kanamicina se realiza en un rea estril.

(El pH es de 6.8 - 7 sin ajustar).




9
Medio Rico


Reactivo Concentracin (g/L) Cantidad a pesar para
600 mL (g)
Ext. de malta 2.0
Ext. de levadura 3.0
Bacto-peptona 5.0
Glucosa 10.0
Agar 15.0

Se mezclan y disuelven los componentes del medio de cultivo en un matraz Erlenmeyer y se
esteriliza en autoclave.

(El pH es de 6.8 - 7 sin ajustar).




Medio BSgL (para la propagacin de inculos)


Reactivo Concentracin (g/L) Cantidad a pesar para
500 mL, (g)
Glucosa 5.0
(NH
4
)
2
HPO
4
3.5
KH
2
PO
4
3.5
MgSO
4
. 7H
2
O
1.0
Sol. elementos traza* 3.0 mL/L
Extracto de levadura 5.0
Tiamina* 200 L/L
Kanamicina* 3 mL/L
* Soluciones preparadas por el personal de la Planta Piloto

Se mezclan el extracto de levadura, el fosfato de amonio dibsico y fosfato de potasio
monobsico en 480 mL de agua y se ajusta el pH a 7.4, con una solucin de hidrxido de potasio
3.0 N y se esteriliza. La glucosa se disuelve en un tubo corex de 15 mL a un volumen final de 10
mL con agua y se esteriliza, de igual forma el sulfato de magnesio. Despus que todo est
esterilizado se adicionan al fermentador la glucosa, sulfato de amonio, la solucin de elementos
trazas y 3 mL de sol. de kanamicina por litro de medio de cultivo (la solucin de kanamicina se
prepar con anterioridad y est estril), de esta forma se obtiene una concentracin final de 0.035
g/L. Tambin se debe agregar 200 L de sol. de tiamina por litro de medio de cultivo. Todas las
adiciones deben de realizarse en campo estril (figura 3).





10
Figura 3. Diagrama general de flujo para la preparacin del medio
BSgL (desarrollo de inculo).

Ajustar el pH a 7.4 con potasa

Glucosa Sulfato de magnesio Sol. de elementos
traza



Esterilizar Esterilizar Esterilizar

Esterilizar
Agregar 3 mL de
sol. por litro de
medio de cultivo

Enfriar a temperatura
ambiente y mezclar

Solucin de tiamina.
Filtrar, 0.22 m


Agregar 3 mL de sol. de Solucin de kanamicina
Agregar 200 l por litro kanamicina por litro de 11.7 mg/mL. Filtra 0.22
Medio de cultivo medio de cultivo m de dimetro de poro

Medio BSgL
Fosfato de amonio Extracto de levadura Fosfato de
potasio
dibsico monobsico


11
Preparacin de soluciones

1) Antibiticos e inductores (estas soluciones son preparadas por personal de la planta piloto)


Kanamicina

Preparar 30 mL de una solucin de kanamicina con una concentracin de 11.7 mg/mL en frascos
de 250 mL. La solucin preparada se esteriliza por filtracin en membrana de 0.22 m. Guardar
en refrigeracin a 4C. Para obtener una concentracin final de 35 mg/L de kanamicina en el
medio de cultivo agregar 3 mL/L de medio de cultivo.


IPTG

Se preparan 10 mL de una solucin de IPTG 100 mM en frascos de 250 mL, pesar 0.24 g de
IPTG y aforar a 10 mL con agua destilada, esterilizar por filtracin en membrana de 0.22 m.
Guardar en refrigeracin a 4C.


Tiamina

Disolver 0.01 g de tiamina en 50 mL de agua destilada, esterilizar por filtracin en membrana de
0.22 m, mantener en refrigeracin. Agregar 200 L por litro de medio de cultivo



2) Elementos traza (solucin preparada por personal de la planta piloto)

Preparar 220 mL de solucin de elementos traza en un frasco de 250 mL. Esta solucin se
prepara pesando las siguientes cantidades y aforando a 220 mL:

Componente Cantidad
(g)
FeCl
3
5.94
ZnCl
2
0.44
CoCl
2
6H
2
O 0.44
Na
2
MoO
4
2H
2
O 0.44
CaCl
2
H
2
0 0.24
CuCl
2
2H
2
O 0.24
H
3
BO
3
0.11
HCl 22.00 (mL)






12
Mtodos Analticos

Determinacin de protenas por el mtodo de Bradford
1

Fundamento
Es un mtodo colorimtrico donde la coloracin final es el resultado de la reaccin del azul de
Coomassie con los residuos de aminocidos bsicos y aromticos, especialmente arginina, de la
protena que deseamos analizar.

Una valoracin de la concentracin de la protena es esencial ser hecho rpidamente y
exactamente en muchos campos del estudio de la protena. El anlisis de Bradford se ha
convertido en el mtodo preferido para cuantificar la protena en muchos laboratorios. Esta
tcnica es ms simple, ms rpidamente, y ms sensible que el mtodo de Lowry. Adems, en
comparacin con el mtodo de Lowry, est conforme a menos interferencia por los reactivo
comunes y los componentes sin protenas de muestras biolgicas.
El anlisis de Bradford confa en el atascamiento del tinte Coomassie G-250 azul a la protena.
Los estudios detallados indican que el tinte libre puede existir en cuatro diversas formas inicas
para las cuales los valores del pKa sean 1.15, 1.82, y 12.4. De las tres formas cargadas del tinte
que predominan en la solucin cida el reactivo del anlisis, las formas rojas y verdes ms
catinicas tenga mximos de la absorbencia en 470 nm y 650 nm, respectivamente. En contraste,
la forma azul ms aninica del tinte, que ata a la protena, tiene un mximo de la absorbencia en
590 nm.
As, la cantidad de protena puede ser estimada determinando la cantidad de tinte en la forma
inica azul. Esto es alcanzada generalmente midiendo la absorbencia de la solucin en 595 nm.

Preparacin de soluciones

Reactivo de Bradford: Diluir 1 parte de reactivo de Bio-rad con cuatro partes de agua destilada,
filtrar a travez de papel Whatman #1 o equivalente.

Solucin de albmina: Pesar 10 mg de albmina de suero bovino y aforar a 10 mL con buffer de
fosfatos (BF1) pH 7.8, 0.1 M.

Curva patrn de protenas

Se realiza una curva patrn cada vez que se preparan los reactivos frescos, partiendo de una
solucin stock de 1 mg/mL de albmina bovina. La curva patrn se elabor en base a la siguiente
tabla:



1
Bradford M. Marion 1976. A rapid and sensive method for cuantitation of microgram quantitties of protein
utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem 72, 248-254.


13
No. De tubo 1 2 3 4 5 6 7*
Conc. De BSA, (mg/mL) 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.10 0.0
Sol. de albmina, (mL) 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.10 0.0
Agua destilada , (mL) 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 0.90 1.0
*El tubo No. 7 es el blanco de reactivos

1. Tomar 0.05 mL de las soluciones preparadas.
2. Aadir 2.5 mL de reactivo Bio rad diluido, agitar y reposar 5 minutos.
3. Leer a 595 nm contra un blanco procesado de la misma manera.

Nota: El tubo nmero 7 es el blanco contra el que deberan leerse los dems tubos.
Curva 1

No. de tubo Conc. de
protena
(mg/mL)
Densidad ptica
(595 nm)

7 0 b =
6 0.10 m =
5 0.20 r
2
=
4 0.40
3 0.60
2 0.80
1 1.00
Curva 2

No. de tubo Conc. de
protena
(mg/mL)
Densidad ptica
(595 nm)

7 0 b =
6 0.10 m =
5 0.20 r
2
=
4 0.40
3 0.60
2 0.80
1 1.00

Realizar la curva patrn por duplicado.

Determinacin de la actividad enzimtica de penicilino-amidasa

Fundamento

La determinacin de la actividad enzimtica se realiza a travs del mtodo del p-
dimetilaminobenzaldehido (p-DAB) reportado por Balansingham et al (1972)
2
. El fundamento se
basa en medir espectrofotomtricamente el color formado por la reaccin entre el grupo amino
del cido 6-amino penicilnico (generado por la hidrlisis enzimtica de la penicilina G), con el
carbonilo del p-DAB.


2
Balasingham, K., Warbureton, D., Dunnil, P. and Lilly, D. (1972). The isolation and kinetics of penicillin amidase
from E. coli. Biochem. Biophys. Acta 276: 250-256.


14
Preparacin de soluciones

I. Buffer de fosfatos (pH 7.8, 0.1 M)
Se prepara agregando 15.67 g de fosfato de potasio dibsico y 1.36 g de fosfato de potasio
monobsico. Posteriormente, se afora a 1 L y se revisa el pH con un potencimetro.
II. Solucin de p-DAB
Disolver 10 g de p-DAB en 400 mL de etanol al 60 % (v/v). Agregar 5 mL de H
2
SO
4

concentrado y aforar a 1 L con etanol al 60 % (v/v).

II. Solucin de penicilina G al 20 %
Disolver 0.2 g de penicilina G en 1 mL de buffer de fosfatos pH 7.8

Nota: Las soluciones I y II son preparadas por personal de la planta piloto.

Curva de calibracin para determinar la actividad enzimtica de penicilino-amidasa

Cada vez que se preparen soluciones, se debe realizar una curva estndar de actividad, utilizando
una solucin patrn de 6-APA (Sigma ) a 2.5 g/L en buffer de fosfatos y efectuando diluciones
progresivas como se explica en los pasos siguientes:
1. Se preparan 10 mL de solucin estndar de 6-APA a una concentracin de 2.5 mg/mL en un
matraz aforado.
2. Colocar una serie de 5 tubos de 13 x 100 mm en una gradilla y agregar 1 mL de solucin
buffer de fosfatos (0.1 M con pH= 7.8). Adems numerar progresivamente los tubos del 1 al 5.
3. Adicionar un mL de solucin estndar de 6-APA al tubo No. 1 y mezclar en vortex.
4. De la mezcla del tubo No. 1 tomar un mL y adicionarlo al tubo No. 2, mezclar en vortex y as
sucesivamente hasta el tubo No. 5.
5. En la misma gradilla colocar una serie de 6 tubos para centrifuga con 2.4 mL de etanol
absoluto y etiquetar del 1 al 6.
6. Pasar 100 L de cada uno de los tubos preparados en el paso 4 a su tubo correspondiente de
centrifuga. Al tubo No. 6 se agregan 100 L de buffer de fosfatos, para utilizarlo como blanco.
7. Se adiciona 1.25 mL de p-DAB a cada tubo de centrifuga (el tiempo de adicin del p-DAB
entre cada tubo debe ser en intervalos de 15 segundos para controlar el tiempo de reaccin).
8. Se centrifugan los tubos a 5000 rpm durante 10 minutos y se dejan reposar hasta completar 15
minutos, despus de la adicin del p-DAB, a temperatura ambiente.
9. Medir la absorbancia de cada uno de los tubos a una longitud de onda de 415 nm, calibrando
el cero con el blanco de reactivos (tubo 6).

Tabla de concentraciones

No. de tubo
1 2 3 4 5
Concentracin
(mg/mL) 1.25 0.625 0.3135 0.1562 0.0781
Nota: Se debe tomar exactamente los tiempos de reaccin, para garantizar un resultado confiable.


15
Curva 1

No. de tubo Concentracin
(mg/mL)
Densidad ptica
(415 nm)

6 0 b =
5 0.078 m =
4 0.1562 r
2
=
3 0.3135
2 0.625
1 1.25

Curva 2

No. de tubo Concentracin
(mg/mL)
Densidad ptica
(415 nm)

6 0 b =
5 0.078 m =
4 0.1562 r
2
=
3 0.3135
2 0.625
1 1.25

11:00 a 12:30 Preparacin de dos fermentadores de 14 L con 4.5 L de medio BSgL (figura 3)
cada uno. Las cantidades de reactivos para preparar los medios de cultivo se
calculan en base a 5 litros de medio (4.5 litros que se encuentran en la jarra y
0.5 litros del inculo), durante la fermentacin el pH es controlado a 7 con
hidrxido de potasio 3 N. Esterilizacin de los fermentadores.

12:30 a 13:00 Inocular dos matraces de 250 mL (con 50 mL de medio Luria estril) con un tubo
liofilizado, en el rea de proteccin de la campana (figura 1).

Medio BSgL (para la propagacin de inculos)

Reactivo Concentracin (g/L) Cantidad a pesar para
5 litros (g)
Glucosa 5.0
(NH
4
)
2
HPO
4
3.5
KH
2
PO
4
3.5
MgSO
4
. 7H
2
O
1.0
Sol elementos traza* 3.0 mL/L
Extracto de levadura 5.0
Tiamina* 200 L/L
Kanamicina* 3 mL/L
*Soluciones preparadas por el personal de la Planta Piloto

Se mezclan el extracto de levadura, el fosfato de amonio dibsico y fosfato de potasio
monobsico en 4355 mL de agua y se ajusta el pH a 7.4, con una solucin de hidrxido de
potasio y se esteriliza. La glucosa se disuelve en un volumen final de 100 mL de agua, se
esteriliza en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y de igual forma el sulfato de magnesio se
disuelve con agua a un volumen final de 25 mL, en un tubo corex de 50 mL (no estril). Despus


16
que todo est esterilizado se mezclan, se agregan la solucin de elementos trazas y 3 mL de sol.
de kanamicina por litro de medio de cultivo (la solucin de kanamicina se prepar con
anterioridad y est estril), de est forma se obtiene una concentracin final de 0.035 g/L.
Tambin se debe agregar 200 L de sol. de tiamina por litro de medio de cultivo. Todas las
adiciones deben de realizarse en campo estril (figura 3).

13:00 a 15:00 Primera sesin terica: Conceptos bsicos y prcticos de la construccin de
microorganismos recombinantes, Dra. Brenda Valderrama.

15:00 a 17:00 Comida.

17:00 a 19:00 Segunda sesin terica: Cintica e ingeniera de esterilizacin del medio de
cultivo, Dr. Edmundo Castillo.

19:00 a 20:00 Montaje de los dos fermentadores de 14 L.

21:00 a 21:30 Inocular los matraces Fernbach con el contenido de los matraces de 250 mL, en
el rea de proteccin de la campana de flujo laminar.

Nota: Marcar al final del da en el calendario las actividades realizadas

Condiciones de cultivo en el inculo del matraz Fernbach.

Fecha: ___________ Volumen del inculo: 500 mL pH: 7.2
Agitacin: 200 rpm Tiempo de cultivo: 8 12 horas Temperatura: 29 C

Resumen de actividades del da

Da Actividad Observaciones
Lunes Preparacin material, medios de cultivo y
preparacin de curvas patrn de protena y actividad
enzimtica.

Preparacin y esterilizacin fermentadores de 14 L
Inoculacin del matraz de 250 mL
Primera sesin terica
Comida
Segunda sesin terica
Montaje de los fermentadores de 14 L
Inoculacin matraces Fernbach

Martes

8:00 a 8:30 Inocular en condiciones de esterilidad dos fermentadores microferm con el
contenido de los matraces fernbach (figura 1). Determinar la densidad ptica y
pureza (tincin de gram) de cada uno de los inculos en matraz Fernbach antes
de inocular los fermentadores.


17
Tincin de Gram

Reactivos

Solucin de cristal violeta
Solucin de safranina
Solucin al 95% de alcohol etlico
Lugol

Materiales

Mechero de Bunsen
Asa de platino
Portaobjetos

Procedimiento

1. Limpiar los portaobjetos.

2. Fijar el microorganismo en el portaobjetos. Esto se realiza tomando una muestra del medio de
cultivo con el asa de platino y distribuyndola en el portaobjetos.

3. La muestra en el portaobjetos se seca con aire y posteriormente con calor.

4. Cubrir el portaobjetos con cristal violeta por un minuto.

5. Lavar con agua destilada.

6. Cubrir el portaobjetos con el mordiente (lugol) por un minuto.

7. Lavar con agua.

8. Decolorar con la solucin al 95 % de alcohol etlico, teniendo cuidado de no sobredecolorar la
muestra (la solucin se debe agregar gota a gota).

9. Lavar con agua.

10. Teir con la solucin de safranina, la tincin se debe realizar solo por 45 segundos.

11. Lavar con agua.

12. Secar el portaobjetos, las muestras se encuentran listas para observar al microscopio.

Densidad ptica al final del cultivo
del matraz fernbach (620 nm)*
Tincin de Gram***

* Si la absorbancia tiene un valor mayor a 1.000 realizar diluciones.
El blanco es medio de cultivo.
***La tincin de Gram es observada al microscopio.


18
Cintica del fermentador de 14 litros
Fecha:
Condiciones de operacin
Temperatura: 29 C pH: 7.2 Aireacin: 1.0 vvm Agitacin: 200 rpm
Hora Edad del
cultivo
Densidad
ptica (620
nm)*
pH Oxgeno disuelto
(%)
Tincin de Gram***






* Si la absorbancia tiene un valor mayor a 1.000 realizar diluciones.
*** La tincin de Gram es observada al microscopio.

8:30 a 10:30 Tercera sesin terica: Cintica microbiana, modelos para biomasa, producto y
sustrato, Dr. Leobardo Serrano.

10:30 a 13:00 Preparar y esterilizar 30 L de medio BSg (figura 4) en el fermentador B. Braun.

Medio BSg (Medio de produccin)

Reactivo Concentracin (g/L) Cantidad a pesar para
30 litros, (g)
Glucosa 5.0
(NH
4
)
2
HPO
4
3.5
KH
2
PO
4
3.5
MgSO
4
. 7H
2
O
1.0
Tiamina* 200 l/l
Sol. elementos trazas* 3.0 mL/l
IPTG* 250 l/l
*Soluciones preparadas por el personal de la Planta Piloto
.
Se mezclan el fosfato de amonio dibsico y el fosfato de potasio monobsico en 26, 300 mL de
agua destilada y ajustar el pH a 7.4, con una solucin de hidrxido de potasio 3 N y se esteriliza.
La glucosa se disuelve a un volumen final de 300 mL con agua destilada en un matraz
Erlenmeyer de 500 mL con oliva y de igual forma el sulfato de magnesio se disuelve en un
volumen final de 100 mL en un matraz Erlenmeyer con oliva de 250 mL y se esterilizan por
separado. Esterilizar 200 mL de agua en un frasco. Despus que todo est esterilizado se adiciona
al fermentador la glucosa, el sulfato de amonio, la solucin de elementos trazas, 250 L de
solucin de IPTG por litro de medio de cultivo. Tambin se deben agregar 200 L de sol. de
tiamina por litro de medio de cultivo. Todas las adiciones deben realizarse en campo estril
(figura 4). El agua estril es para lavar el matraz despus de las adiciones.


19
Figura 4. Diagrama de flujo para la preparacin del medio BSg (Medio
de produccin).

Ajustar el pH a 7.4 con potasa

Glucosa Sulfato de magnesio Sol. de elementos
traza



Esterilizar Esterilizar Esterilizar

Esterilizar
Agregar 3 mL de
sol. por litro de
medio de cultivo

Enfriar a temperatura
ambiente y mezclar

Solucin de tiamina
Filtrar, 0.22 m


Solucin de IPTG
Agregar 200 l por litro l por litro de m
Medio de cultivo medio de cultivo
Medio BSg
Fosfato de potasio Fosfato de amonio
monobsico dibsico


20
Toma de muestra, Plaqueo microbiolgico, determinacin de biomasa,
determinacin de glucosa residual, determinacin de protena y
actividad enzimatica


Diagrama del proceso de anlisis
Protena
Sonicar
2 pulsos
de 5 seg
Pasta,
resuspender
en buffer
Centrifugar
Sobrenadante
(desecho)
Pasta,
resuspender
en buffer
Muestra
20 ml
Microbiologa, plaqueo de la muestra
(viabilidad y pureza). Antes de los
otros anlisis.
(2 tubos
eppendor)
300 l
Pasta,
resuspender
en buffer
Actividad
Enzimtica
Sobrenadante
(4 tubos
eppendorf)
1 ml
Centrifugar
Densidad ptica
Glucosa
Sobrenadante
(desecho)
Centrifugar


Figura 5. Diagrama del proceso de anlisis de las muestras (plaqueo microbiolgico,
determinacin de biomasa, glucosa residual, protena y actividad enzimtica)
durante la fermentacin de 30 litros.



Toma de muestra del fermentador de 30 litros

1. Tomar 20 mL del medio de cultivo del fermentador por la vlvula de muestreo, en condiciones
estriles y utilizando tubos corex de 50 mL esteriles.


Anlisis microbiolgico

2. Realizar el anlisis microbiolgico (cuenta en placa, analizar viabilidad y pureza), este anlisis
se realiza antes de todas las dems determinaciones.

3. Una vez realizado el anlisis microbiolgico, transvasar 1 mL de la muestra en tubos
eppendorf (4 tubos).



21
4. Centrifugar los 4 tubos eppendorf durante 3 minutos a 12,000 rpm. Estas muestras sern
utilizadas para las mediciones de glucosa residual, densidad ptica, protena y actividad
enzimtica.

Determinacin de glucosa residual

5. Transvasar 1 mL del sobrenadante a un eppendorf para medir la concentracin de glucosa en el
analizador YSI (utilizacin del equipo de acuerdo al manual de operacin).

Determinanacin de densidad ptica

6. El paquete celular es resuspendido en 1 mL de buffer de fosfatos (0.1 M y pH 7.8).

7. Las clulas resuspendidas son utilizadas para leer densidad ptica a 620 nm, se utiliza un
blanco de agua destilada para calibrar el espectrofotmetro.

Nota: Cuando la densidad ptica sea mayor de 1.0 realizar una dilucin con agua destilada, de tal
manera que sta sea menor a 1.0.

Determinacin de actividad enzimtica en muestras de fermentacin

1. El paquete celular es resuspendido en 1 mL de buffer de fosfatos (0.1 M y pH 7.8).
2. Colocar 0.450 mL de la muestra problema resuspendida en buffer de fosfatos en tubos de
ensayo de 13x100 mm.
3. Incubar a 37
o
C durante 5 minutos, en un bao Mara.
4. Adicionar 0.05 mL de solucin de penicilina G al 20 %.
5. Incubar a 37
o
C durante 10 minutos.
6. Se toman 0.1 mL de muestra y se transfieren a tubos para centrfuga a los cuales previamente
se les adicion 2.4 mL de etanol absoluto (necesario para detener el avance de la reaccin).
7. Se adiciona 1.25 mL del reactivo p-DAB a cada muestra, se agitan y se centrifugan a 4,800
rpm por 10 minutos (el tiempo de adicin de p-DAB entre cada tubo debe ser en intervalos de
15 segundos para controlar el tiempo de reaccin).
8. Una vez transcurridos 15 minutos, a partir de la adicin de p-DAB, se mide la absorbancia a
415 nm utilizando un blanco de reactivos de la misma manera que las muestras.

Nota: agitar el tubo en cada paso, mediante ligeros golpes con la mano.


Para determinar la actividad enzimtica de las muestras se realiza el siguiente clculo:

Act. enzimtica
moles de 6- APA ( . . )( )( )
( )( . )( )( . ) ( )( )
D O b Dilucin
m ml min
U
ml
1000
216 24 10 0 45





22
Donde:

D.O. Densidad ptica a 415 nm
m Pendiente de la curva patrn
b Ordenada al origen de la curva patrn.
216.24 Peso molecular del 6-APA
10 Tiempo de la reaccin en minutos
0.45 Volumen de la muestra analizada (mL)
U Unidad de actividad enzimtica

Una unidad de actividad enzimtica se define como la cantidad de enzima que produce una
micromol de 6-APA por minuto.


Determinacin de protena total en caldo de fermentacin

1. Transvasar 300 L de muestra resuspendida en buffer de fosfatos en dos eppendor.

Nota: Realizar diluciones de acuerdo a la siguiente tabla con el buffer de fosfatos pH 7.8
(volumen final recomendado 300 L).

Densidad
ptica de la
muestra
(620 nm)
Dilucin Buffer de
fosfatos pH
7.8
( l)
Volumen de
muestra
( l)
0 a 2 Sin dilucin 0 300
2 a la final 1/10 270 30

2. Primer lavado. Centrifugar la muestra durante 3 minutos a 12, 000 rpm.
3. Decantar el sobrenadante cuidando de no tocar la pastilla celular.
4. Segundo lavado. Adicionar a la pastilla 300 microlitros de buffer de fosfatos pH 7.8.
5. Resuspender la muestra y centrifugarla a 12 000 rpm por 3 minutos.
6. Decantar el sobrenadante. Adicionar 300 microlitros de buffer de fosfatos pH 7.8 a la pastilla
y resuspender.
7. Sonicar la muestra durante 10 segundo (2 pulsos de 5 segundos).
8. Despus de sonicar las muestras realizar una dilucin, de ser necesaria, previa a la
determinacin de protena por el mtodo de Bradford.
9. Tomar 0.05 mL de las muestras.
10. Aadir 2.5 mL de reactivo Bio rad diluido, agitar y reposar 5 minutos.
11. Leer a 595 nm contra un blanco de agua procesado de la misma manera.




23
Para determinar la concentracin de protena de las muestras se realiza el siguiente clculo:

Concentracin de protena = (D.O - b) (Dilucin) = mg de protena
(m) mL

Donde:

D.O. Densidad ptica a 595 nm
m Pendiente de la curva patrn
b Ordenada al origen de la curva patrn.

Nota: Si la absorvancia no cae dentro del rango comprendido en la curva de ajuste se llevan a
cabo diluciones.

13:30 a 16:00 Toma de muestra del fermentador de 30 litros para anlisis microbiolgico
(esterilidad del medio). La hora de inoculacin del fermentador de 30 litros es en
base a la densidad ptica del cultivo del fermentador de 14 litros, la cual debe
tener un valor de 1.8 a 2.0. Inoculacin del fermentador B. Braun (figura 1). Se
inicia la toma de muestra, segn las cintica propuesta (pag. 24). El pH durante
la fermentacin es controlado con hidrxido de potasio 3 N.

14:00 a 16:00 Comida (segn se organizen los grupos).

16:00 a 24:00 Se continua la toma de muestra segn la cintica propuesta (pag. 24). El tiempo
aproximado de fermentacin es de 12 horas.

Maduracin

Cuando la glucosa se termina y el valor de oxgeno disuelto tiende a aumentar se inicia la
Maduracin del caldo de cultivo controlando que el oxgeno disuelto no disminuya del 20 % de
la saturacin, esto se realiza modificando las condiciones de operacin (agitacin, 150 rpm y
aireacin, 0.5 vvm).

Resumen de actividades

Da Actividad Observaciones
Martes Inoculacin de los fermentadores de 14 litros
Segunda sesin terica
Preparacin y esterilizacin del medio BSg en el
fermentador B. Braun

Toma de muestras y anlisis de las mismas
(protena, actividad enzimatica, densidad ptica,
azcares y anlisis microbiolgico).

Comida
Toma de muestras y anlisis de las mismas
(protena, actividad enzimatica, densidad ptica,
azcares y anlisis microbiolgico).



24
Hoja nm: __________
Cintica del fermentador de 30 litros.
Fecha: _________________ No. de inculo: _____________
Condiciones de operacin

Temperatura: 29 C pH: 7.0 Aireacin: 1.0 vvm Agitacin: __300 rpm_

Hora Edad del
cultivo
Densidad
ptica
(620 nm)*

Biomasa
(g/l)**

Azucar
residual
(g/Ll)
pH Oxgeno
disuelto
(%)
Protena
(mg/mL)
Actividad
enzimatica
(U/mL)
Actividad
especifica
(U/mg)***

Observaciones
0 Anlisis microbiolgico
1 Anlisis microbiolgico
2 Anlisis microbiolgico
3 Anlisis microbiolgico
3.5
4 Anlisis microbiolgico
4.5
5 Anlisis microbiolgico
5.5
6 Anlisis microbiolgico
7 Anlisis microbiolgico
8 Anlisis microbiolgico
8.5
9 Anlisis microbiolgico
9.5
10 Anlisis microbiolgico
10.5
11 Anlisis microbiolgico
*Si la absorvancia tiene un valor mayor a 1.000 realizar diluciones.
** La biomasa es calculada en base a la densidad ptica y la curva de peso seco (figura 5).
***La actividad especifica es calculada dividiendo la actividad enzimtica entre la protena.



25
Hoja nm: __________
Cintica del fermentador de 30 litros.
Fecha: _________________ No. de inculo: _____________
Condiciones de operacin

Temperatura: 29 C pH: 7.0 Aireacin: 1.0 vvm Agitacin: __300 rpm_

Hora Edad del
cultivo
Densidad
ptica
(620 nm)*

Biomasa
(g/l)**

Azucar
residual
(g/L)
pH Oxgeno
disuelto
(%)
Protena
(mg/mL)
Actividad
enzimatica
(U/mL)
Actividad
especifica
(U/mg)***

Observaciones



















* Si la absorvancia tiene un valor mayor a 1.000 realizar diluciones.
** La biomasa es calculada en base a la densidad ptica y la curva de peso seco (figura 5).
***La actividad especifica es calculada dividiendo la actividad enzimtica entre la protena.


26
FERMENTACIN 30 LITROS
PRODUCCIN

RESULTADOS DEL CONTROL MICROBIOLGICO

HORA 10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
















OBSERVACIONES DURANTE EL PROCESO













27

Densidad ptica a 620 nm
0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 1.4 1.6 1.8 0.0 1.0 2.0
P
e
s
o

s
e
c
o
,

g
/
l
0.2
0.4
0.6
0.8
1.2
1.4
0.0
1.0
y = -0.0501 + 0.6996x r
2
= 0.986
Figura 5. Curva de peso seco realizada en medio BSg (el blanco es agua).
Densidad ptica a 620 nm
0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 1.4 1.6 1.8 0.0 1.0 2.0
P
e
s
o

s
e
c
o
,

g
/
l
0.2
0.4
0.6
0.8
1.2
1.4
0.0
1.0
y = -0.0501 + 0.6996x r
2
= 0.986
Figura 5. Curva de peso seco realizada en medio BSg (el blanco es agua).
Figura 6. Curva de peso seco realizada en medio BSg (el blanco es agua).


28
Mircoles

Despus de realizar la fermentacin a nivel piloto (30 litros) el caldo de cultivo ser procesado
para purificar la enzima intracelular penicilino-amidasa. Dentro de esta seccin se evaluar el
rendimiento de purificacin. El proceso se dividir en dos partes: Grupo A (shock osmtico) y
Grupo B (Homogeneizador Molton Gaulin)

8:00 a 9:30 Toma de la muestra final del medio de cultivo para medir densidad
ptica, protena (sonicar la muestra) y actividad enzimtica. Centrfugacin del
medio de cultivo en la centrfuga Westfalia. La pasta es recuperada en buffer de
fosfatos 0.1 M a pH 7.0 (en un volumen aproximado de 1500 mL). Mezclar la
crema celular en el agitador de mesa. Tomar muestra para determinar protena y
actividad enzimtica (figura 7). Tomar una muestra de 120 mL de la crema
(suspensin celular) para realizar ruptura celular en el homogenizador Molton
Gaulin (Grupo B, figura 10a).
Sobrenadante
Concentrado celular
(dispersar la crema en
un agitador de mesa
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Biomasa: mg
Buffer de
Fosfatos
0.1 M pH 7.0
Centrifuga
Westfalia
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Biomasa: mg





Figura 7. Diagrama de anlisis de la muestra final de fermentacin.


29
Grupo A (shock osmtico):
9:30 a 10:00 Pesar 587.5 g de sacarosa y 39 g de EDTA, disolver ambos reactivos en un 1000
mL de agua destilada.

10:00 a 10:30 Adicionar la solucin de sacarosa-EDTA al resto de la crema (pasta celular). Una
vez incorparada la solucin de sacarosa-EDTA agitar lentamente durante
15 minutos (agitador de mesa, 200 rpm). Medir el volumen (ver figura 8a).

10:30 a 12:00 Centrifugacin de la suspensin en centrfuga Minisharples (2 cargas, ver figura
8a). Despus que la centrifugacin ha finalizado, tomar muestra del sobrenadante
para medir concentracin de protena y actividad enzimtica. El sobrenadante se
guarda en el cuarto fro a 4 C.

Sobrenadante
(guardar a 4 C)
Vol.: L
Sacarosa + EDTA
(agitar durante 15 min)
Centrifuga minisharples
(2 cargas)
Pasta
Concentrado celular
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg


Sobrenadante
Actividad
Enzimtica
Protena


Figura 8a. Procesamiento de la muestra shock osmtico (adicin de sacarosa +EDTA y 1
centrifugacin).


12:00 a 12:30 La pasta celular es resuspendida en agua (el volumen es el mismo en el que
quedo con la sacarosa y el EDTA, ver figura 8b). Una vez homogenea la pasta
celular en el agua, agitar lentamente por 15 minutos (agitador de mesa, 200 rpm).
Tomar muestra para la determinacin de protena (sonicar la muestra) y actividad
enzimtica.

12:30 a 14:00 Centrifugacin de la suspensin en centrfuga Minisharples (2 cargas, ver figura
8b). Despus que la centrifugacin ha finalizado, tomar muestra del sobrenadante
para medir concentracin de protena y actividad enzimtica, guardar muestra
para electroforesis (1 mL). La pasta celular se pesa y se prepara una suspensin
(pesar 0.01 g y disolverlo en 1 mL de buffer 0.1 M pH 7.8) para determinar
protena (sonicar la muestra) y actividad enzimtica, el resto de la pasta se


30
guarda a 4 C. El sobrenadante se guarda a 4 C para continuar con la
purificacin en columna de cromatografa.

Sobrenadante
(guardar a 4 C)
Resuspender en agua
(volumen final de concentrado
celular + sacarosa EDTA)
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Pasta
Centrifuga minisharples
(2 cargas)
Pasta
(guardar a 4 C)
Muestra para
electroforesis
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg



Sonicar
2 pulsos
de 5 seg
Pasta,
resuspender
en buffer)
Centrifugar
Sobrenadante
(desecho)
Protena
Concentrado celular
Sacarosa + EDTA
Pasta
(0.1 g en 10 ml
de buffer, dil 1/10)
Actividad
Enzimtica
Centrifuga
minisharples
300 l
Protena
Sobrenadante
(desecho)
Dilucin
1/10
Actividad
Enzimtica



Figura 8b. Procesamiento de la muestra shock osmtico (resuspencin en agua y 2
centrifugacin).

13:00 a 15:00 Cuarta seccin terica: Operaciones unitarias en la extraccin y purificacin de
protenas. Dr. Edmundo Castillo.

15:00 a 17:00 Comida.

17:00 a 19:00 Inicio del proceso de cromatografa de la muestra sometida a shock osmtico. A
cada una de las fracciones medir concentracin de protena y actividad
enzimtica (figura 9). Liofilizacin del resto de la muestra sometida a shock
osmtico.


31

Cromatografa de intercambio inico

La separacin de los componentes es producida por la interaccin o afinidad diferencial de los
componentes con la fase slida.

Los buffer utilizados son los siguientes

Buffer de trabajo : buffer de fosfatos de sodio 0.02 M, pH 5.8

Buffer de elusin : buffer de fosfatos de sodio 0.2 M, pH 7.8

Proceso de trabajo con la columna de cromatografa

1. Estabilizar la columna pasando buffer de trabajo. El flujo de alimentacin ser de 3 mL / min.

2. Una vez estabilizada la columna pasar una muestra de 20 a 28 mg de protena total, la cual
deber tener una actividad especfica de 5.9.

3. Con la finalidad de realizar un pegado total de la muestra sobre la resina pasar un volumen de
columna (38 mL) de buffer de trabajo.

4. Tomar una alicuota cada 3 minutos.

5. Para realizar la elusin de la protena de inters pasar aproximadamente 2.5 volmenes de
columna de buffer de elusin (95 mL).
6. Tomar una alicuota cada 3 minutos.

7. Terminada la elusin pasar 1 volumen de columna (38 mL) de NaCl 0.5 M.

8. Tomar una alicuota cada 3 minutos.

9. Determinar protena y actividad de acuerdo a los procedimientos descritos. Guardar muestra
de la fraccin ms pura para electroforesis.

10. Sanitizar y regenerar la resina.


Sanitizacin y regeneracin de la resina

La sanitizacin de la resina se realiza pasando 2 volmenes de columna de hidrxido de sodio
0.3 M y para la regeneracin se pasa 1 volmen de columna de cloruro de sodio 0.5 M.








32

Sobrenadante
Cromatografa de
Intercambio inico
(segn el protocolo)
Liofilizar
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Fraccin ms pura
Muestra para electroforesis
Fraccin ms pura
Cada fraccin obtenida
Liofilizar
Liofilizadora Labconco
Liofilizadora Usifroid



Fracciones de
cromatografa
Actividad
Enzimtica
Protena


Figura 9. Cromatografa de intercambio inico muestra despus de schok osmtico.



Resumen de actividades del da (Grupo A)

Da Actividad Observaciones
Mircoles Toma de la muestra final del medio de cultivo.
Centrifugacin del medio de cultivo (centrifuga
Westfalia)

Adicin de sacarosa + EDTA
Centrifugacin Minisharples
Resuspensin de la pasta en agua
Centrifugacin Minisharples
Cuarta sesin terica.
Comida
Cromatografa de intercambio inico, muestra shock
osmtico, liofilizacin del resto de la muestra
sometida a shock osmtico.

Liofilizacin de la fraccin ms pura.



33
Resumen de resultados

Protena Actividad
Etapa Volumen
(litros)

Peso
(g)
Dil. Densidad
ptica
(mg/mL)


(mg/g)
(mg
totales
)*

Dil. Densidad
ptica
(U/mL)


(U/g)
(U
totales
)**

Actividad
especifica
(U/mg)***

Recuperacin
por etapa
(%)
Fermentacin****
1


Centrifugacin Westfalia
2
concentrado crema
a) pasta celular****

Adicin de
sacarosa+EDTA******

Centrifugacin minisharples
a) Pasta celular + agua****
4


b)sobrenadante
3


Centrifugacin minisharples
a) Pasta celular****
6
(0.01g en 1 mL de buffer)

b)sobrenadante
5


* Protena total : multiplicar el volumen peso por la protena
** Actividad total: multiplicar el volumen peso por la actividad enzimtica
*** Actividad especifica: dividir la actividad total entre la protena total
**** Para la determinacin de protena y actividad enzimatica del punto a) la muestra se debe sonicar.
La numeracin representa el nmero de muestra.











34
Resumen de resultados

Protena Actividad
Etapa Volumen
(litros)

Peso
(g)
Dil. Densidad
ptica
(mg/mL)


(mg/g)
(mg
totales
)
*

Dil. Densidad
ptica
(U/mL)


(U/g)
(U
totales
)**

Actividad
especifica
(U/mg)***

Recuperacin
por etapa
(%)
Columna de cromatorafa





















Liofilizado******
* Protena total : multiplicar el volumen peso por la protena
** Actividad total: multiplicar el volumen peso por la actividad enzimtica
*** Actividad especifica: dividir la actividad total entre la protena total
****** Resuspender el producto liofilizado en buffer de fosfatos 0.1 M pH 7.8, considerando el mismo volumen que tenia antes de liofilizar.



35
Grupo B (Homogeneizador Molton Gaulin):
9:30 a 10:00 Tomar una muestra de 120 mL de la crema (suspensin celular) para realizar
ruptura celular en el homogenizador Molton Gaulin. Adicionar 80 mL de buffer
de fosfatos 0.1 M, pH 7.0 a los 120 mL de la crema celular y homogenizar
(figura 10a).

10:00 a 11:00 Ruptura de las clulas resuspendidas en el homogenizador Molton-Gaulin, dos
pases a una presin de 580 kg/cm
2
, con el objeto de romper las clulas
bacterianas y liberar la enzima (homogenizador Molton-Gaulin, ver figura10a).
El objetivo de romper las clulas con el homogenizador es comparar los
resultados del shock osmtico con la ruptura mecnica.

11:00 a 12:00 Centrifugacin de la suspensin (200 mL) en centrfuga Beckman (10, 000 rpm,
10 min), figura 10a. Despus que la centrifugacin ha finalizado, decantar el
sobrenadante, tomar muestra de este para medir concentracin de protena y
actividad enzimtica, guardar muestra para electroforesis. Pesar la pasta celular y
resuspender 0.01 g en 1 mL de buffer para determinar protena (sonicar la
muestra) y actividad enzimtica (figura10b).





2a. homogenizacin 1a. homogenizacin
Pasta
Sobrenadante
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Homogeneizador Morton-Gaulin
(a una presin de 500-580 Kg/cm
2
,
dos pases)
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Concentrado celular (120 ml)
Adicionar 80 ml de buffer
Centrifuga
westfalia
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Centrifuga Beckman
10,000 rpm, 10 min
Muestra para
electroforesis
Disminuir la temperatura
10 grados con respecto a
la temperatura ambiente




Figura 10a. Diagrama de procesamiento de la muestra homogeneizador Molton Gaulin y 1
centrifugacin.



36
Sonicar
2 pulsos
de 5 seg
Pasta,
resuspender
en buffer)
Protena
Concentrado
celular 120 ml
(dilucin 1/10)
Pasta
(0.1 g en 10 ml
de buffer, dil 1/10)
Homogeneizador
Actividad
Enzimtica
Protena
Centrifugar
Sobrenadante
(desecho)
300 l
Sobrenadante
Actividad
Enzimtica
Centrifuga
Beckman


Figura 10b. Diagrama de anlisis de la muestra homogeneizador Molton Gaulin y 1
centrifugacin.


12:00 a 13:00 Precipitacin de la suspensin de 200 mL: agregar sulfato de amonio hasta
obtener el 40 % de saturacin (226.0 g/l, ver tabla 1). La adicin debe ser en
forma lenta a 4 C y baja agitacin. Dejar reposar aproximadamente 3 horas con
agitacin (figura 10c).




Precipitacin
(40 % saturacin de
sulfato de amonio)
La adicin debe ser lenta a 4C
y agitacin lenta, dejar reposar de
2-3 horas con baja agitacin.
Sobrenadante




Figura 10c. Precipitacin de la muestra despus de homogeneizacin.




15:00 a 17:00 Comida.



37
AMMONIUN SULFATE
Final concentration of ammonium sulfate -% saturation at 0C
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
0 10,6 13,4 16,4 19,4 22,6 25,8 29,1 32,6 36,1 39,8 43,6 47,6 51,6 55,9 60,3 65,0 69,7
5 7,5 10,0 13,1 16,6 19,7 22,9 26,2 29,6 33,1 36,8 40,5 44,5 48,4 52,6 57,0 61,5 66,2
10 5,3 8,1 10,9 13,9 16,9 20,0 23,3 26,6 30,1 33,7 37,4 41,2 45,2 49,3 53,6 58,1 62,7
15 2,6 5,4 8,2 11,1 14,1 17,2 20,4 23,7 27,1 30,6 34,3 38,1 42,0 46,0 50,3 54,7 59,2
20 0 2,7 5,5 8,3 11,3 14,3 17,5 20,7 24,1 27,6 31,2 34,9 38,7 42,7 46,9 51,2 55,7
25 0 2,7 5,6 8,4 11,5 14,6 17,9 21,1 24,5 28,0 31,7 35,5 39,5 43,6 47,8 52,2
30 0 2,8 5,6 8,6 11,7 14,8 18,1 21,4 24,9 28,5 32,3 36,2 40,2 44,5 48,8
35 0 2,8 5,7 8,7 11,8 15,1 18,4 21,8 25,4 29,1 32,9 36,9 41,0 45,3
40 0 2,8 5,8 8,9 12,0 15,3 18,7 22,2 25,8 29,6 33,5 37,6 41,8
45 0 2,9 5,9 9,0 12,3 15,6 19,0 22,6 26,3 30,2 34,2 38,3
50 0 3,0 6,0 9,2 12,5 15,9 19,4 23,0 26,8 30,8 34,8
55 0 3,0 6,1 9,3 12,7 16,1 19,7 23,5 27,3 31,3
60 0 3,1 6,2 9,5 12,9 16,4 20,1 23,9 27,9
65 0 3,1 6,3 9,7 13,2 16,8 20,5 24,4
70 0 3,2 6,5 9,9 13,4 17,1 20,9
75 0 3,2 6,6 10,1 13,7 17,4
80 0 3,3 6,7 10,3 13,9
85 0 3,4 6,8 10,5
90 0 3,4 7,0
95 0 3,5
100 0
Reprinted by prermission of the Oxford University Press (Oxford) from Data for Biochemical Research, 2nd ed. Edited
by R. M. C. Dawson, D. C. Elliott, W. H. Elliott, and K. M. Jones. Oxford University Press (1969)
See Methods in Enzymology, Vol. 1, p. (1955) for a similar table prepared for 25 C.
Note: The pH of the solution may decrease significantly on addition of ammonium sulfate.
solids ammonium sulfate to add to 100 ml of solution
I
n
i
c
i
a
l

c
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

o
f

a
m
m
o
n
i
u
m

s
u
l
f
a
t
e
,

%

s
a
t
u
r
a
t
i
o
n

a

0

C


38
17:00 a 18:00 Centrifugacin de la solucin precipitada en centrfuga Beckman (10, 000 rpm,
10 min, figura 10d). Despus que la precipitacin ha finalizado, decantar el
sobrenadante. Pesar la pasta protica y resuspender 0.10 g en 10 mL de buffer.
Colocar 60 mL del sobrenadante en una bolsa para dilisis de 10 kD, en otra
bolsa colocar los 10 mL de la suspensin de la pasta. Dializar ambas muestras en
buffer (buffer 20 mM, pH 5.8) durante toda la noche.
Pasta
Sobrenadante
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Centrifuga Beckman
10,000 rpm, 10 min
Muestra para
electroforesis
Dializar una muestra de
60 ml en bolsa de 10 kD
Sobrenadante
Resuspender 0.1 g en 10 ml de buffer
de fosfatos y dializar la muestra
en bolsas de 10 kD

Centrifuga
Beckman
Sobrenadante
Pasta
(0.1 g en 10 ml
de buffer, dil 1/10)
Dializar
Dializar


Figura 10d. Procesamiento de la muestra y diagrama de anlisis despus de precipitacin

Resumen de actividades del da

Da Actividad Observaciones
Mircoles Toma de la muestra final del medio de cultivo.
Centrifugacin del medio de cultivo (centrifuga
Westfalia)

Ruptura de las clulas resuspendidas en el
homogenizador, dos pases (Homogenizador Molton-
Gaulin).

Centrifugacin del homogeneizado (centrfuga
Beckman).

Precipitacin de la suspensin de 200 mL
Tercera sesin terica.
Comida
Centrifugacin del homogeneizado (centrfuga
Beckman). Dilisis de las muestras.



39
Resumen de resultados

Protena Actividad
Etapa Volumen
(litros)

Peso
(g)
Dil. Densidad
ptica
(mg/mL)


(mg/g)
(mg
totales
)*

Dil. Densidad
ptica
(U/mL)


(U/g)
(U
totales
)
**

Actividad
especifica
(U/mg)***

Recuperacin
por etapa
(%)
Fermentacin****
1


Centrifugacin Westfalia
2
concentrado crema
a) pasta celular****

b)sobrenadante
3


Centrifugacin Beckman
4
a) pasta****
(0.01 g en 1 mL de buffer)

b) sobrenadante
5


Precipitacin


CentrifugacinBeckman
6
a) pasta*****
(0.01 g en 1 mL de buffer)

B )sobrenadante*****
7


* Protena total : multiplicar el volumen peso por la protena
** Actividad total: multiplicar el volumen peso por la actividad enzimtica
*** Actividad especifica: dividir la actividad total entre la protena total
**** Para la determinacin de protena y actividad enzimatica del punto a) la muestra se debe de sonicar.
***** Para la determinacin de protena y actividad enzimatica del punto a) y b) la muestra se debe de ser dializada. La numeracin representa el nmero de muestra.



40
Jueves

Grupo B:
8:00 a 9:00 Recuperacin de las muestras dializadas. Determinar protena y actividad
enzimtica (figura 10e).



Sonicar
2 pulso
5 seg
Pasta,
resuspender
en buffer)
Centrifugar
Sobrenadante
(desecho)
Protena 300 l
Actividad
Enzimtica
Protena
Sobrenadante
dializado
Pasta
dializada
(dil 1/10)


Figura 10e. Diagrama de anlisis de la muestra despus de dializar.


9:00 a 11:00 Inicio del proceso de cromatografa del sobrenadante dializado. A cada una de las
fracciones medir concentracin de protena y actividad enzimtica (figura 11).


Cromatografa de intercambio inico

La separacin de los componentes es producida por la interaccin o afinidad diferencial de los
componentes con la fase slida.

Los buffer utilizados son los siguientes

Buffer de trabajo : buffer de fosfatos de sodio 0.02 M, pH 5.8

Buffer de elusin : buffer de fosfatos de sodio 0.2 M, pH 7.8

Proceso de trabajo con la columna de cromatografa


11. Estabilizar la columna pasando buffer de trabajo. El flujo de alimentacin ser de 3 mL / min.

12. Una vez estabilizada la columna pasar una muestra de 20 a 28 mg de protena total, la cual
deber tener una actividad especfica de 5.9.

13. Con la finalidad de realizar un pegado total de la muestra sobre la resina pasar un volumen de
columna (38 mL) de buffer de trabajo.

14. Tomar una alicuota cada 3 minutos.


41

15. Para realizar la elusin de la protena de inters pasar aproximadamente 2.5 volmenes de
columna de buffer de elusin (95 mL).
16. Tomar una alicuota cada 3 minutos.

17. Terminada la elusin pasar 1 volumen de columna (38 mL) de NaCl 0.5 M.

18. Tomar una alicuota cada 3 minutos.

19. Determinar protena y actividad de acuerdo a los procedimientos descritos. Guardar muestra
de la fraccin ms pura para electroforesis.

20. Sanitizar y regenerar la resina.

Sanitizacin y regeneracin de la resina

La sanitizacin de la resina se realiza pasando 2 volmenes de columna de hidrxido de sodio
0.3 M y para la regeneracin se pasa 1 volmen de columna de cloruro de sodio 0.5 M.



Sobrenadante
Cromatografa de
Intercambio inico
(segn el protocolo)
Liofilizar
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Fraccin ms pura
Muestra para electroforesis
Fraccin ms pura
Cada fraccin obtenida
Liofilizadora Labconco




Fracciones de
cromatografa
Actividad
Enzimtica
Protena



Figura 11. Proceso de cromatografa de intercambio inico de la muestra despus de
homogeneizacin.


42
Ambos grupos:
11:00 a 11:30 Liofilizacin del producto final (fraccin ms pura de la columna).

11:30 a 12:30 Realizar la electroforesis de las muestras (el gel es proporcionado por personal
de la Planta Piloto. El volumen utilizado de cada una de las muestras es de 10 l
con una concentracin de 5 g de protena total.

15:00 a 17:00 Comida.

15:00 a 20:00 Desteimiento del gel. Anlisis de resultados y preparacin de grficos.



Resumen de actividades del da(Grupo B)

Da Actividad Observaciones
Jueves Recuperacin de las muestras dializadas y
determinacin de protena y actividad Enzimtica.

Cromatografa del sobrenadante dializado.


Resumen de actividades del da (Ambos grupos)

Da Actividad Observaciones
Jueves Liofilizacin del producto final (fraccin ms pura
de la columna)

Electroforesis de las muestra.
Cuarta seccin terica.
Comida.
Desteimiento del gel.
Analisis de datos y elaboracn de grficos.




43
Resumen de resultados

Protena Actividad
Etapa Volumen
(litros)

Peso
(g)
Dil. Densidad
ptica
(mg/mL)


(mg/g)
(mg
totales
)*

Dil. Densidad
ptica
(U/mL)


(U/g)
(U
totales
)**

Actividad
especifica
(U/mg)
***

Recuperacin
por etapa
(%)
Columna de cromatorafa





















* Protena total : multiplicar el volumen peso por la protena
** Actividad total: multiplicar el volumen peso por la actividad enzimtica
*** Actividad especifica: dividir la actividad total entre la protena total
****** Resuspender el producto liofilizado en buffer de fosfatos pH 7.8, considerando el mismo volumen que
tenia antes de liofilizar.



44
Viernes

8:00 a 9:00 Determinar protena y actividad enzimtica del liofilizado (fraccin ms pura,
figura 12).


Fraccin liofilizada
(resuspender en el mismo
volumen con buffer)
Actividad
Enzimtica
Protena


Figura 12. Diagrama de anlisis de la fraccin ms pura despus de liofilizacin.


9:00 a 11:00 Quinta sesin terica: Desarrollo de procesos de fermentacin industriales con
microorganismos recombinantes , M. en B. Martn Patio.

11:00 a 14:00 Anlisis de datos y elaboracin de grficos.

14:00 a 16:00 Comida.

16:00 a 20:00 Continua el anlisis de datos y la elaboracin de grficos.



Resumen de actividades del da

Da Actividad Observaciones
Viernes Determinacin de actividad Enzimtica y protena
de las muestras liofilizadas.

Quinta seccin terica.
Analisis de datos y elaboracn de grficos.
Comida.
Analisis de datos y elaboracn de grficos.



Sbado


9:00 a 12:00 Presentacin, anlisis y discusin de resultados.

12:00 a 13:00 Clausura del Curso-Taller , entrega de diplomas y Cctel de despedida
.


45
Sobrenadante
Concentrado celular
Pasta
Sobrenadante
Pasta
Sobrenadante
Cromatografa
Liofilizar
Diagrama de flujo del proceso
Shock osmtico
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Vol.: L
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Biomasa: mg
Peso.: g
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Peso: g
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Sacarosa + EDTA
Resuspender en agua


46
Diagrama de flujo del proceso
Homogeneizador Molton - Gaulin
2a. homogenizacin
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
1a. homogenizacin
Pasta
Peso.: g
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Sobrenadante
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Precipitacin
(40 % saturacin de
sulfato de amonio)
Pasta
Peso.: g
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Sobrenadante
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Cromatografa
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Vol.: L
Protena: mg
Act. Enz: U
Act. Esp.: U/ mg
Concentrado celular (120 ml)
Adicionar 80 ml de buffer