Tcnicas de ADN recombinante

Clonado de genes
Objetivo: Aislamiento y amplificacin de un gen de inters para su posterior
manipulacin gentica
Pasos:
1. Aislamiento y fragmentacin de la fuente de ADN: ADNg (genmico), ADNc
(copia), producto de PCR.
2. Insercin del fragmento de ADN en un vector de clonado.
3. Introduccin y amplificacin del vector recombinante en un organismo husped.
Enzimas de restriccin (ER)
5-GGATCC -3 5-AGATCT-3 5-GATC-3
3-CCTAGG-5 3-TCTAGA-5 3-CTAG-5
Bam HI Bgl II Sau 3AI
Patrn de digestin del ADN con
ER en gel de agarosa
Dejan extremos compatibles
Vectores para el clonado de genes
Componentes bsicos de un vector de clonado plasmdico de E. coli
Estrategia de clonado en plsmido
Pasos:
1. Construccin de vector recombinante.
2. Transformacin de clulas competentes.
3. Plaqueo en medio selectivo con antibitico (para
seleccionar las bacterias que adquirieron el plsmido) +
IPTG y X-Gal (para identificar las bacterias que tienen
el plsmido con inserto)
4. Validacin de la presencia de inserto
mediante:
a. digestin de plsmidos de colonias +con
ER y anlisis en gel de agarosa.
b. amplificacin del inserto a partir de las
colonias (colony PCR) y gel.
Seleccin de recombinantes (screening azul-blanco): -complementacin
Phagemids (pBs). Combina propiedades de
plsmidos y fagos filamentosos. Posee ori de fago
filamentoso (F1, M13) y ori de plsmido (pUC).
Producen ADN circular doble cadena o simple
cadena.
Otros Vectores de clonado
Fagos filamentosos (M13). Clonado en la forma
replicativa (RF, doble cadena circular) de fagos
filamentosos (M13).
Producen ADN simple cadena
Vector-T: Plsmido con extremos 5- T simple cadena.
Permite clonar productos de PCR que contienen A simple cadena en extremo -3, sin previa
digestin del vector con ER.
Vector mixto (shuttle vector)
Se puede amplificar en dos organismos diferentes.
pMDS99. Posee un ori para replicacin en bacterias (ori P15A) y otro para la
replicacin en haloarqueas (ori pHV2). Tiene dos marcadores de seleccin:
Kanamicina R para bacteria y Mevinolina R para haloarqueas.
Construccin y anlisis de
genotecas de ADN genmico
En bacterifago
Capacidad de clonado ~ 25 kbp
Bibliotecas de csmidos
Digestin parcial del ADNg
con ER de corte frecuente
(Sau3A)
Purificacin de fragmentos
de ADNg del tamao
deseado
Anlisis (screening) de genotecas
1. Por hibridacin con sondas especficas
2. Con anticuerpos (inmunoscreening)
3. Screening funcional. Ej. Deteccin de halos de protelisis
4. Transposon tagging. Generacin de bacterias mutantes usando Tn, preparacin de
genoteca de la mutante y screening del gen mutado por hibridacin usando como
sonda secuencias del Tn. Usado para identificar genes relacionados con la virulencia
en bacterias patgenas.
5. Por complementacin de una mutacin.
Approximate maximum length of
DNA that can be cloned into
vectors
Vector type Cloned DNA (kb)
Plasmid 20
lambda phage 25
Cosmid 45
P1 phage* 100
BAC (bacterial artificial chromosome) 300
YAC (yeast artificial chromosome 1000
Bacs y Yacs usados para construir genotecas apropiadas para la secuenciacin de
genomas completos de un microorganismo
Expresin heterloga de protenas recombinantes
El gen clonado se expresa en un tipo celular diferente al organismo de origen.
Propsito: Obtener cantidad suficiente de la protena de inters para su caracterizacin y/ o
para su aplicacin biotecnolgica.
Elementos tpicos de un vector
de expresin
La secuencia nucleotdica del inserto se
debe clonar en fasecon el codn de
inicio de la traduccin (ATG) del vector.
Expresin en bacterias. (E. coli)
Ventajas:
- Fisiologa y gentica muy conocida
- Fcil manipulacin en laboratorio
- Relativo bajo costo
Desventajas:
No produce muchas de las
modificaciones post-traduccionales
requeridas para la expresin de
protenas de eucariotas
- IPTG + IPTG
Plsmido de expresin pET
Promotor T7 y operador lac (regin reguladora)
rbs: sitio de unin al ribosoma
Sitios mltiples de clonado dentro del gen lacZ
(NdeI contiene codn inicio traduccin ATG)
His-tag: cola de polihistidina + codn stop (TGA)
Terminador transcripcional T7
E. coli Rosetta (DE3)
Hfx. volcanii DS70
pJAM
nep::His6
Nde I
Bpu 1102 I
pET-24b(+)
nep::His6
Nde I
Bpu 1102 I
Hind III
Clonado y expresin del gen de una proteasa extracelular de arquea halfila (Nep)
en dos sistemas heterlogos:
a. E coli (bacteria)
b. Haloferax volcanii (arquea halfila extrema)
Gen de inters: nep
Se analiza la expresin
de la protena de inters
por SDS-PAGE y
determinacin de
actividad proteasa
Anlisis de colonias recombinantes
- PCR
- crecimiento en placas con casena
- Actividad azocaseinoltica
Expresin de nep en E. coli
SDS-PAGE y tincin con azul de Coomassie de las protenas celulares (C) y del
medio de cultivo (M) de E. coli recombinante conteniendo el plsmido pET-nepHis6
La protena recombinante se sintetiz eficientemente en E. coli pero no
se secret ni present actividad enzimtica
Expresin del gen de la proteasa extracelular Nep de arquea halfila (Natrialba
magadii, Nm) en un sistema heterlogo haloarqueano (Haloferax volcanii, Hv)
La protena recombinante se sintetiz y secret eficientemente en H.v. y
present actividad enzimtica
Manipulacin de genes bacterianos
Tcnicas de mutagnesis dirigida. Permite cambiar bases en la secuencia nt de un gen.
Usos: determinar actividad biolgica de protenas con sustituciones de AA conocidas.
Mediante PCR
Mutagnesis sitio dirigida usando un oligo sinttico
El inserto se clona en un
vector que produzca copias
simple cadena del inserto
(fago M13) necesarias para
usar como templado.
Cassette mutagnesis y
disrupcin gnica
Cassette: fragmento de ADN
sinttico, lleva gen resistencia a Ab. Se
usan para reemplazar o interrumpir un
gen y generar una mutacin.
Disrupcin gnica por cassette
mutagnesis
Se anula la funcin de un gen dado por
mutagnesis por insercin. Genera
mutacin knockout (KO).
En procariotas (haploides) las clulas
KO son viables slo si el gen no es
esencial.
El plsmido con el cassette se linealiza
para impedir su replicacin en la
bacteria transformada, por la tanto, las
clulas resistentes surgen por RH y
poseen slo una copia del gen (la
mutante por insercin)