Introduo

O estudo das velocidades de reao e como elas mudam em resposta a mudana nos
parmetros experimentais conhecida como cintica, sendo uma maneira muito
antiga para estudar os mecanismos enzimticos. Estudamos cintica enzimtica como
um conjunto de mtodos empregados para estudar os passos de uma reao
enzimtica.
Um dos fatores principais que afetam a velocidade de uma reao catalisada por uma
enzima purificada in vitro a concentrao do substrato presente, representada por
[S]. Uma das maneiras para se medir o curso que a reao do substrato faz para se
transformar em produto usar a velocidade mdia inicial (Vo). Em um experimento
cintico [S] sempre muito maior que a concentrao da enzima [E].
Em 1903 levou Victor Henri propor que uma enzima liga-se a molcula de seu
substrato para formar o complexo ES, sendo um passo obrigatrio no processo
cataltico enzimtico. Em seguida Leonardo Michaelis e MaudMenten propuseram que
a enzima primeiro combina-se reversivelmente com o substrato, para formar o
complexo enzima-substrato, considerado um passo relativamente rpido. Em seguida
em um passo mais lento,o complexo ES se rompe com o reaparecimento da enzima
livre e forma a reao do produto P.
Quando a enzima colocada em uma soluo contendo um grande excesso de
substrato, ocorre um perodo cintico inicial chamado de estado pr-estacionrio
durante o qual ocorre o crescimento do ES, esse estado tem um perodo muito curto e
no pode ser observado facilmente.
Para a realizao deste trabalho ser usada a equao de Michaelis-Mentn que
expressa a equao da velocidade para uma reao catalisada enzimticamente e com
o nico substrato. uma expresso da relao quantitativa entre a velocidade inicial
Vo, a velocidade inicial mxima Vmx, e a concentrao inicial de substrato [S]. A
equao descreve o comportamento cintico da grande maioria das enzimas, e todas
essas enzimas que exibem uma dependncia hiperblica de Vo em relao [S] so ditas
a seguir a cintica de Michaelis-Mentn.
Vmx e Km so parmetros que podem ser obtidos experimentalmente para qualquer
enzima dada, eles fornecem pouca informao sobre o nmero, velocidade ou
natureza qumica dos passos discretos da reao cataltica. O Km pode variar muito de
enzima para enzima e mesmo para diferentes substratos de uma mesma enzima,
muitas vezes o Km empregado como uma indicao da afinidade da enzima para seu
substrato. O Vmx varia tambm de uma enzima para outra.












Objeitvo geral

O objetivo geral deste trabalho acadmico compreende no estudo e analise das
reaes de cintica enzimtica e suas propriedades, possibilitando maior compreenso
no estudo das velocidades e variaes destas reaes.


Objetivo especfico

Para o estudo da cintica enzimtica foram realizados e analisados dados respectivos
cintica da invertase, que compreende em experimentos para a dosagem de acares
redutores (calibrao padro), velocidades de reao, variaes no substrato e efeitos
da variao de pH nas reaes. Atravs dos dados obtidos possvel uma melhor
compreenso sobre a dinmica das reaes enzimticas que ocorrem no nosso
organismo.
































Materiais e Mtodos:

PRTICA I: CURVA DE CALIBRAO PARA DOSAGEM DE ACARES REDUTODORES
PELO DNS
Sensibilidade do mtodo: 1 a 11 mols ou 0,2 a 2,0 mg

1. Organizar uma bateria com seis tubos de ensaio. Numer-los.
2. Adicionar os reagentes conforme tabela abaixo:
tubo Glicose 2mg/ml gua destilada (ml)
1 0 1,5
2 0,1 ml 1,4
3 0,2 ml 1,3
4 0,4 ml 1,1
5 0,8 ml 0,7
6 1,0 ml 0,5
3. Adicionar em cada tubo 1,0 ml de DNS (3,4-dinitrosalicilato) e leva-los em BM
fervente por 5 minutos.
4. Resfriar os tubos por 5 minutos e adicionar em todos 6,5 ml de gua.
5. Ler as absorbncias a 540 nm.
6. Traar grfico (absorbncia X concentrao), com linha de tendncia, calcular
equao reta e R
2
.


























PRTICA II: Cintica Enzimtica I-
1. Efeito do pH

Preparo dos reativos:
Enzimas: Pesar 50 gramas de leveduras secas (fermento de po), suspender em
250 ml de bicarbonato de sdio 0,15 mol/L e manter em banho-maria a 37
o
C
durante 6 horas, com agitao ocasional. Centrifugar por 20 minutos a 3.500
rpm. Coletar o sobrenadante, o qual contm a enzima invertase ativa. Como
este procedimento uma purificao parcial e no sobrenadante podero ser
encontradas enzimas de muitas outras vias metablicas, este material dito
extrato bruto. Conservar a temperatura de 4
o
C. Normalmente a concentrao
de enzima para os ensaios de 0,1 mg de protena/ml.
Soluo de sacarose 0,2 mol/L: usar esta soluo para obter outras solues
mais diludas de sacarose
Tampo acetato 0,05 mol/L pH 4,7
Soluo de 3,5-Dinitrosalicilato (DNS): Dissolver por aquecimento 5 gramas de
c. Dinitrosaliclico em 100 ml de de NaOH 2 mol/L. Dissolver separadamente
tambm com aquecimento 150 g de tartarato duplo de sdio e potssio em
250 ml de gua destilada. Misturar as duas solues e completar o volume para
500 ml com gua destilada
Tampo fosfato 0,05 mol/L pH 6,0; 7,0 e 8,0
Tcnica:
1. Organizar uma bateria com seis tubos de ensaio. Identificar de 1 a 8
2. Adicionar os reagentes conforme tabela:
Reagentes (ml) Tubo
1
Tubo
2
Tubo
3
Tubo
4
Tubo
5
Tubo
6
Tubo
7
Tubo
8
Tampo acetato pH
4,0
1,0
Tampo acetato pH
5,0
1,0
Tampo fosfato pH
6,0
- - - 1,0 -
Tampo fosfato pH
7,0
- - - - 1,0
Tampo fosfato pH
7,8
- - - - - 1,0 -
gua destilada 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8
Sacarose 0,2 mols/L 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Soluo de enzima
(0,1 mg/mL)
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
*ateno: a enzima sempre a ltima adio
3. Deixar a bateria de tubos de ensaio incubada temperatura ambiente por 5
minutos.
4. Adicionar 1,0 ml de DNS em todos os tubos e leva-los ao banho-maria fervente
por 5 minutos.
5. Deixar esfriar por 5 minutos e adicionar 6,5 ml de gua destilada em todos os
tubos
6. Calibrar o espectrofotmetro a 540 nm com o tubo 1.
7. Proceder leitura das absorbncias dos demais tubos.
8. Expressar os resultados na forma de grfico .
9. Traar grfico Michaelis&Menten (abcissa:concentrao substrato; ordenada:
absorbncia)
10. Traar grfico duplo recproco e calcular o Km (constante de Michaelis) e
Velocidade mxima (Vmax)








































PRTICA III: Cintica Enzimtica II-
2. Efeito da concentrao do substrato

Tcnica:
1. Organizar uma bateria com seis tubos de ensaio. Identificar de 1 a 6.
2. Adicionar os reagentes conforme tabela:
Reagentes (ml) Tubo
1
Tubo
2
Tubo
3
Tubo
4
Tubo
5
Tubo
6
Tampo acetato pH 4,7 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
gua destilada 1,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
Sacarose 0,01 mol/L - 1,0 - - - -
Sacarose 0,02 mol/L - - 1,0 - - -
Sacarose 0,05 mol/L - - - 1,0 - -
Sacarose 0, 1 mol/L - - - - 1,0 -
Sacarose 0,2 mol/L - - - - - 1,0
Soluo de enzim (0,1 mg/mL) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
*ateno: a enzima sempre a ltima adio
3. Deixar a bateria de tubos de ensaio incubada temperatura ambiente por 5
minutos.
4. Adicionar 1,0 ml de DNS em todos os tubos e leva-los ao banho-maria fervente
por 5 minutos.
5. Deixar esfriar por 5 minutos e adicionar 6,5 ml de gua destilada em todos os
tubos
6. Calibrar o espectrofotmetro a 540 nm com o tubo 1.
7. Proceder leitura das absorbncias dos demais tubos.
8. Calcular a velocidade da reao para cada tubo.
9. Traar grfico Michaelis&Menten (abcissa:concentrao substrato; ordenada:
absorbncia)
10. Traar grfico duplo recproco e calcular o Km (constante de Michaelis) e
Velocidade mxima (Vmax)


















Resultados


Mtodo de calibrao de acares redutores (DNS)


Grfico 1: Concentrao x Absorbncia.




Variao da concentrao de susbtrato



Grfico 2: Concentrao de amostra x Absorbncia. Grfico criado apartir de
equao da reta padro obtida no mtodo de calibrao (DNS).
y = 0.7325x - 0.0076
R = 0.9985
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 0.5 1 1.5
R = 0.9692
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
Velocidade de reao (Vo)


Grfico 3: Concentrao de susbtrato x Velocidade de reao. Grfico obtido
apartir do Grfico 2; divide-se os valores de absorbncia por 5 (cinco) para obter-se
as velocidades (Vo) de reao.



L. Burke

Grfico 4: Representao de modelo de grfico desenvolvido por L. Burke,
possibilita observar a reta como Vmx e o ponto de interseco como Vo.







0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
-150 -100 -50 0 50 100 150
Efeito do pH


Grfico 5: Concentrao x Valores de pH. Efeito do pH na variao do substrato.






























0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 2 4 6 8 10
Discusso

A curva de calibrao foi feita com pontos de concentrao entre 1 e 11 mols pois
essa a sensibilidade do mtodo. As leituras de absorbncia feitas no
espectrofotmetro aumentaram proporcionalmente com o aumento das
concentraes, obedecendo a equao y=0,7325x; R = 0,9985 obtida atravs de
mnimos quadrados.
Os resultados da curva foram coerentes com o esperado, pois os valores de
absorbncia crescem com o aumento na concentrao da amostra de glicose, porem
no esse aumento no segue um padro, possvel que isto seja inerente ao mtodo
uma vez que o mtodo do DNS tem baixa especificidade ou de vido ao mal
funcionamento do espectrofotmetro, que na ocasio encontrava-se oscilante. O
mtodo do DNS considerado um mtodo barato e conveniente, entretanto a sua
especificidade baixa, podendo haver muitos interferentes durante a identificao da
reao. Desta forma necessrio para cada anlise construir uma curva padro para
poder minimizar estes possveis interferentes.

Concentrao, velocidade de reao:

Foi observado experimentalmente que para uma determinada concentrao de
enzima, o aumento da concentrao de substrato causa um aumento gradual na
velocidade inicial da reao catalisada.

Em concentraes pequenas de substrato a velocidade de reao aumenta quase que
o dobro da concentrao de substrato, a enzima primeiro combina se reversivelmente
com o substrato para formar o complexo enzima substrato, em um passo reversvel
muito rpido, depois essa combinao se rompe e reaparece a enzima livre mas agora
com o produto formado,esse passo e bem mais lento que o primeiro, com isso e
possvel perceber que a velocidade da reao enzimtica deve ser proporcional a
concentrao da substancia reagente no segundo passo.

Podemos tambm ver que o valor

aumenta at chegar em um ponto. A partir da, o
valor no se modifica muito, mesmo se adicionar mais substrato, essa situao e
considerada a velocidade mxima de reao, uma situao onde todas as enzimas
esto com substrato ligado em seus stios ativos.


Efeito do pH:

Mudanas extremas de pH podem alterar a estrutura da enzima devido a uma
repulso de cargas, enquanto que mudanas mais brandas de pH podem levar a uma
dissociao de enzimas oligomricas, por outro lado, as mudanas de pH que no
afetam totalmente a estrutura de uma enzima podem diminuir sua atividade apenas
por estar afetando resduos do stio cataltico.
Segundo os resultados foi possvel observar que o pH timo para essa enzima o pH:
4,0, pois todos os outros resultados mostram que a velocidade de trabalho da enzima
decai com o aumento do ph.

Referencias Bibliogrfica

LEHNINGER, A. L. & NELSON, D. L. & COX, M. M. - Princpios de
Bioqumica. So Paulo, Sarvier, 1995. 839 p.

Atividades prticas realizadas em laboratrio.








































UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJA
CENTRO DE TECNOLOGIAS DA TERRA E DO MAR
CURSO DE OCEANOGRAFIA

Joo Becker; Helena Azevedo; Sara de Marco Fernandes; Diego Souza; Glauciane
Sanchotene









RELATRIO DE BIOQUMICA

CINTICA ENZIMTICA





















Itaja, 28 de maio de 2014

UNIVALI
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJA
CENTRO DE TECNOLOGIAS DA TERRA E DO MAR
CURSO DE OCEANOGRAFIA












RELATRIO DE BIOQUMICA

CINTICA ENZIMTICA








Atividade complementar
requerida para obteno da
parcial da M2 da matria de
Bioqumica no curso de
Oceanografia, ministrada pela
professora Tnia de Lima
Pacheco Pessati.






Itaja, 28 de maio de 2014

UNIVALI