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Contagem de Cianobactrias do Gnero Microcystis e Determinao de

Microcistinas pelo Mtodo de Imunoensaio Competitivo no Controle de
Tratamento de gua para Abastecimento


Viviane Cavalli
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; Joseane Regina Cidral
2
; Ramiro Nilson
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Apresentao: Viviane Cavalli - Bacharel em Qumica pela FURB (Fundao
Universidade Regional de Blumenau), Especialista em Microbiologia pela PUC
(Pontifcia Universidade Catlica) do Paran, Mestre em Qumica pela
Universidade Federal de Florianpolis UFSC, Responsvel pelo Laboratrio de
Microbiologia do Servio Autnomo Municipal de gua e Esgoto SAMAE de
Blumenau/SC.


ENDEREO PARA CORRESPONDNCIA:

Viviane Cavalli. e-mail: vi.cavalli@terra.com.br
Empresa: SAMAE Servio Autnomo Municipal de gua e Esgoto.
Rua Bahia, 1530. Bairro Salto. CEP 89031- 000. Blumenau SC.
e-mail: qualidade@samae.com.br
Fone: (0XX47) 331-8411.







Blumenau, Julho de 2005.


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RESUMO

As cianobactrias podem ser encontradas em mananciais que abastecem
Estaes de Tratamento de gua e so conhecidas por serem potenciais
produtores de toxina. Sendo assim, os objetivos deste trabalho foram: identificar e
efetuar a contagem de clulas/mL do Gnero Microcystis; detectar a toxina
microcistina pelo mtodo de imunoensaio competitivo por tubos; introduzir este
mtodo para o controle de microcistina no Laboratrio de Microbiologia do
SAMAE de Blumenau. As amostras foram coletadas na barragem do Rio Ira em
Curitiba, com a colaborao do Laboratrio de Hidrobiologia da SANEPAR. As
coletas foram feitas em seis pontos distintos de 15 a 20 cm abaixo da superfcie
da gua, em frascos de vidro mbar e foram preservadas com lugol a 0,1%,
facilitando a sedimentao dos organismos. A contagem de cianobactrias foi
realizada em um microscpio invertido, utilizando aumento de 400x atravs da
Cmara de Utherml com capacidade para 10 mL, pela metodologia de contagem
de clulas por transectos. Para deteco de toxina , as amostras foram
congeladas por 24 horas e aps, descongeladas em temperatura ambiente.
Atravs do mtodo de imunoensaio competitivo, utilizando os padres de 0,5g/L
e 3,0g/L, comparou-se os resultados, onde a concentrao da amostra foi
inversamente proporcional ao desenvolvimento da cor, ou seja, quanto menor foi
a intensidade de cor desenvolvida na amostra, maior foi a concentrao de
microcistina da mesma.
Todas as amostras apresentaram um forte cheiro de esgoto sptico, com nmero
de clulas de cianobactrias/mL superior a dez mil e a microcistina apareceu na
concentrao acima de 3g/L. Conclui-se que o mtodo de imunoensaio
competitivo por tubos, apesar de sua grande limitao quanto aos seus padres,
de grande utilidade, pois um mtodo de ensaio acessvel e simples,
permitindo de imediato a deteco da presena ou ausncia da toxina e
principalmente agilidade na tomada de decises preventivas e corretivas quanto a
captao e o abastecimento da gua populao.

PALAVRAS-CHAVE: Cianobactrias, Mycrocistis, Microcistina, Imunoensaio.

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1. INTRODUO

A crescente eutrofizao dos ambientes aquticos conseqncia das atividades
humanas, causando um enriquecimento artificial de ecossistemas. A utilizao de
adubos qumicos e estrume, a descarga de esgotos urbanos e efluentes de
agroindstrias ou de outros setores industriais, promovem a entrada de
quantidades significativas de nutrientes e matria orgnica em corpos dgua,
favorecendo as floraes de algas, entre elas cianobactrias. (CORREIA, 2000)
Em nosso pas, h uma forte correlao entre a ocorrncia de floraes de
cianobactrias no reservatrio de Itaparica no Estado da Bahia, com a morte de
88 pessoas, entre as 200 intoxicadas pelo consumo de gua do reservatrio,
durante os meses de maro e abril de 1988. Em 1996, 123 pacientes renais
crnicos, aps terem sido submetidos a sesses de hemodilise em uma Clnica
de Caruaru, Pernambuco, apresentaram sintomas de hepatotoxicose. Destes, 54
vieram a falecer at 5 meses aps o incio dos sintomas. A referida clnica,
segundo Secretaria da Sade, recebia gua sem um tratamento completo e
usualmente era feita uma clorao no prprio caminho tanque utilizado para
transportar a gua, em perodos de falha no abastecimento pela rede pblica.
(AZEVEDO, 1998)
Tendo em vista estes acontecimentos, foi lanada a Portaria n 1469, de 29 de
dezembro de 2000 pelo Ministrio da Sade, exigindo em todas as Estaes de
Tratamento e Abastecimento de gua, uma anlise mensal da gua bruta em
casos onde o nmero de cianobactrias no exceder 10.000 clulas/mL, e
semanal, quando o nmero de cianobactrias exceder este valor. Acima de
20.000 clulas/mL, exigido o controle semanal de toxicidade na gua de sada
do tratamento e nas entradas (hidrmetros) das clnicas de hemodilise e
indstrias de injetveis, sendo que esta anlise pode ser dispensada quando no
houver comprovao de toxicidade na gua bruta.
A importncia na anlise da gua em relao s cianobactrias se d pela
liberao de toxinas na gua aps a lise celular, prejudicando, assim, a
potabilidade da gua. Algumas dessas toxinas so de ao rpida, causando a
morte por parada respiratria aps poucos minutos de exposio, tm sido
identificadas como alcalides organofosforados neurotxicos. Outros atuam
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menos rapidamente, so identificados como peptdeos ou alcalides
hepatotxicos. (CHORUS & BARTRAM, 1999)
Em Estaes de Tratamento de gua (ETAs), uma srie de microorganismos
patognicos so eliminados atravs do tratamento convencional, j as
cianobactrias, nessas condies, so estimuladas a produzir suas toxinas. Essas
toxinas permanecem na rede de distribuio de gua gerando risco sade
pblica.
As algas cianofceas so microorganismos aerbios fotoautotrficos, procariontos,
sendo a fotossntese seu principal meio de obteno de energia. Necessitam de
gua, gs carbnico, luz e substncias inorgnicas como nitrognio e fsforo.
(PRESCOTT et al. 1999)
As cianobactrias possuem enzimas fixadoras de nitrognio, as nitrogenases. So
microorganismos dotados de movimento e colorao que varia de verde-amarelo,
verde-azulado, verde, verde-cinza, cinza-preto e vermelho. Sua reproduo
assexuada, por simples diviso da clula. (PRESCOTT et al. 1999)
As cianobactrias esto distribudas em diferentes ambientes no solo como nas
guas, guas limpas e eutrficas, em fontes termais at geleiras. (CHORUS &
BARTRAM, 1999)
O crescimento mais favorvel desses microorganismos, se d em guas neutro-
alcalinas onde o pH pode variar de 6 a 9, de temperaturas entre 15 a 30C, onde
h alta concentrao de nutrientes como nitrognio, fsforo e gs carbnico.
Quando em condies favorveis tendem a formar massas visveis na superfcie
da gua. (CHORUS & BARTRAM, 1999)
O gnero Microcystis conhecido pela sua toxicidade e sua toxina denominada
microcistina. Cada gnero pode compor dezenas ou centenas de espcies,
txicas ou no, devido s substncias qumicas secretadas. (CHORUS &
BARTRAM, 1999)
As algas alteram principalmente a cor, o sabor e o odor da gua, alm de tornar o
tratamento mais caro, por causarem corroso, obstruo de filtros, dificultando a
decantao qumica e alterando o pH. (DI BERNARDO, 1995) Para combater a
presena de algas em estaes de tratamento de gua ou nos mananciais, era
utilizado o sulfato de cobre ou mesmo o cloro, como algicida. O sulfato de cobre
era recomendado numa concentrao de 1 mg/L, sendo ele o responsvel em
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potencial pela liberao das toxinas pelas cianobactrias (CETESB, 1973). Mas
estudos mostram que o sulfato de cobre utilizado at atingir concentraes
finais de at 0,25g/L, na eliminao de algas em mananciais. (BURNETT et
al,1994)
Segundo a Portaria n 518/maro/2004, revisada, do Ministrio da Sade, no
segundo pargrafo vedado o uso de algicidas para o controle de crescimento de
cianobactrias ou qualquer interveno no manancial que promove a lise das
clulas desses microorganismos, quando a densidade das cianobactrias exceder
20.000 clulas/mL, sob pena de comprometimento da avaliao de riscos sade
associados s toxinas.
As cianobactrias produzem mais dois tipos de toxinas: as neurotoxinas, e as
irritantes ao contato alm das hepatotxicas. Neste trabalho sero estudadas as
hepatotoxinas, por serem o tipo mais comum de intoxicaes atravs de
cianobactrias.

1.1. HEPATOTOXINAS

As hepatotoxinas so produzidas por espcies e cepas de cianobactrias,
incluindo os gneros: Anabaena, Microcystis, Nodullaria, Nostoc, Oscillatoria e
Cylindrospermopsis. So o tipo mais comum de intoxicaes envolvendo
cianobactrias e apresentam uma ao mais lenta, causando a morte entre
poucas horas e poucos dias, em decorrncia de hemorragia intra-heptica e
choque hipovolmico. Os sinais observados aps a ingesto dessas
hepatotoxinas so prostrao, anorexia, vmitos, dor abdominal e diarria.
(CARMICHAEL & SCHWARTZ, 1984; BEASLEY et al., 1989). Aps a ingesto
oral da toxina, ela chega ao sistema digestivo e levada ao leo, passando via
sistema porta para o fgado. (CARMICHAEL & FALCONER, 1993; NISHIWAKI et
al. 1994) A exposio crnica da toxina pela ingesto de gua pode aumentar o
ndice de cncer heptico. (CHORUS & BARTRAM, 1999)




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1.2. AVALIAO DE TOXICIDADE

Atualmente, a avaliao da toxicidade pode ser feita atravs de mtodos qumicos
e de bioensaios. Estes ltimos refletem de um modo mais real, os efeitos das
toxinas nos ecossistemas, embora exijam a manuteno das espcies em
cativeiro. Para se quantificar as toxinas quando esto presentes em
concentraes muito pequenas, so utilizados mtodos qumicos, como por
exemplo, a Cromatografia Lquida de Alta Preciso, HPLC. (CORREIA et al,
2000). O que dificulta a utilizao do HPLC necessidade de um padro da
toxina, que muito caro e no est disponvel em nosso pas, alm do que a
avaliao s realizada para microcistina, pela ausncia dos padres para as
demais cianotoxinas. Um mtodo mais acessvel para o controle de toxinas o
Mtodo de Imunoensaio Competitivo ELISA , o qual pode se determinar
qualitativamente, ou seja, se a toxina est presente ou ausente, e o ensaio
quantitativo, ou seja, pode-se obter o valor de concentrao em cada amostra,
sendo que no distingue entre as variedades da toxina. Este mtodo utiliza
padres da toxina Microcistina com intervalo de quantificao entre 0,5 a 3,0 g/L,
sendo que o limite mximo aceitvel pela Portaria n 518 de 1g/L.

2. METODOLOGIA

As amostras foram coletadas na barragem do Rio Ira na cidade de Curitiba, com
a colaborao do Laboratrio de Hidrobiologia da SANEPAR, devido a quase total
ausncia de cianobactrias nos mananciais que abastecem as estaes de
tratamento de gua da cidade de Blumenau. As coletas foram feitas em seis (06)
pontos distintos de 15 a 20 cm abaixo da superfcie da gua, em frascos de vidro
mbar. As amostras foram preservadas com lugol a 0,1%, facilitando a
sedimentao dos organismos em Cmara de Utherml de capacidade 10mL,
ficando em decantao por aproximadamente 12 horas, em cmara escura
mida.
A contagem de cianobactrias do Gnero Microcystis foi realizada em um
Invertoscpio, utilizando aumento de 400x em amostra contida em Cmara de
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Utherml de capacidade 10 mL, pela metodologia de contagem de clulas por
transectos.













Figura 01. Amostras de Cianobactrias do Gnero Mycrocistis.

Para confirmao da presena de microcistinas, as amostras foram congeladas
por 24 horas para promover a lise celular. Aps, foram descongeladas em
temperatura ambiente e atravs do mtodo de imunoensaio competitivo,
utilizando os padres de 0,5g/L e 3,0g/L, comparou-se os resultados, onde a
concentrao da amostra foi inversamente proporcional ao desenvolvimento da
cor, ou seja, quanto menor foi a intensidade de cor desenvolvida na amostra,
maior concentrao de toxina a mesma apresentou.


Figura 02. Tubos de ensaio contendo Microcistina em diferentes concentraes.
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3. RESULTADOS E DISCUSSO

As cianobactrias do gnero Mycrocystis, enquanto vivas, apresentaram um odor
caracterstico de capim e grama. Aps descongeladas em temperatura ambiente,
apresentaram um forte cheiro de esgoto sptico. As amostras de nmero 01, 02,
04, 05 e 06 apresentaram nmero superior a 20.000cl/mL. Portanto, conforme
Portaria 518/maro/2004 do Ministrio da Sade, devem ser submetidas a uma
anlise mais apurada, sendo a Cromatografia em HPLC o ensaio mais
recomendado, que permite a deteco exata em g/L de toxina encontrada, alm
de permitir a deteco de outras toxinas que tambm podem estar presentes
juntamente com a microcistina. O bioensaio em camundongos tambm
recomendado no caso de floraes de cianobactrias. Em todas as amostras
analisadas, a microcistina foi detectada em concentraes acima de 3g/L pelo
mtodo de imunoensaio competitivo. A amostra de nmero 03 apresentou nmero
inferior a 20.000 clulas de Microcystis, porm apresentou toxina acima de 3g/L
como as demais amostras, lembrando que a mesma apresentou outras espcies
de cianobactrias, as quais no foram consideradas neste trabalho. A tabela
abaixo mostra os resultados em nmero de cl/mL de cianobactrias para cada
amostra.

Amostras Cl./mL
01 58.388
02 45.820
03 16.117
04 47.818
05 28.027
06 44.155

Tabela 01. Nmero de clulas/mL de cianobactrias.

O nmero de clulas/mL encontrado em todas as amostras e a concentrao
elevada de microcistina em g/L foi causada devido a uma grande florao de
cianobactrias. A toxina encontrada, microcistina, de grande preocupao, pois
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afeta o fgado, e produz outros sintomas como diarrias, vmitos e dores de
cabea, podendo chegar a causar morte por envenenamento.

4. CONCLUSES

Conclui-se neste trabalho que o mtodo de imunoensaio competitivo por tubos,
apesar de sua grande limitao quanto ao limite de deteco e concentrao de
padres, de grande utilidade, pois um mtodo de ensaio acessvel e simples,
permitindo de imediato a deteco da presena ou ausncia de microcistina na
amostra e principalmente agilidade na tomada de decises preventivas e
corretivas quanto a captao e o abastecimento da gua populao.
J outros mtodos de deteco, como bioensaios em camundongos e anlise por
cromatografia, so de difcil acesso, porm, dependendo da concentrao de
clulas encontradas, faz-se obrigatrio realizar estes ensaios mais apurados.

5. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

1. AZEVEDO, Sandra, M. F. O. Toxinas de Cianobactrias: Causas e
Conseqncias para a Sade Pblica. Medicina On - Line, Volume 1, Ano 1,
Nmero 3.

2. BURNETT, Joo A. B., MATTOS, Snia P. & AZZOLIN, NEIVA M. P.
Intervenes da Companhia de Saneamento no Lago Parano. 1994.

3. CARMICHAEL, W. W. A Status Report on Planktonic Cyanobacteria - Blue
Green Algae and their Toxins. EPA/600/R-92/079, Environmental Monitoring
Systems Laboratory, Office of Research and Development, US Environmental
Protection Agency, Cincinnati, Ohio. 1992.

4. CETESB. Operao e Manuteno de ETA. CETESB: So Paulo SP, 1973.

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5. CORREIA, Filipa, DELGADO, Pedro & Castro, Vitor. Impacto do
Desenvolvimento e Toxicidade das Cianobactrias. Toxicologia 2000/2001,
Ecotoxicologia. Lisboa.

6. CHORUS, Ingrid & BARTRAM, Jamie. Toxic Cyanobacteria in Water A Guide
to their Public Health Consequences, Monitoring and Management. E & FN
Spon: London and New York, 1999.

7. DI BERNARDO, Luiz. Algas e suas Influncias na Qualidade das guas e nas
Tecnologias de Tratamento. ABES Associao Brasileira de Engenharia
Sanitria: So Paulo SP, 1995.

8. ROITT, Ivan ; RABSON, Arthur. Imunologia Bsica. Guanabara Koogan: Rio de
Janeiro - RJ, 2003.

9. MARZZOCO, Anita & TORRES, Bayardo B. Bioqumica Bsica. 2 edio.
Guanabara Koogan: Rio de Janeiro RJ, 1999.

10. NISHIWAKI, R., OHTA, T., SUEOKA, e., SUGAMUNA, M., K., WATANABE,
M. F. FUJIKI, H. Two significant aspecs of microcystin-LR: Specific binding
and Liver Specificity. Cancer Lett, 1994.