UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN

MARCOS
Universidad del Per, DECANA DE AMERICA

FACULTAD DE MEDICINA

PROYECTO DE
INVESTIGACIN

HEMATOLOGA

Recuento mnimo de leucocitos para realizar la Frmula

leucocitaria en Frotis de sangre perifrica
UNMSM - 2013
LIMA -PER

INTEGRANTES
1.
2.
3.
4.
5.

PONCE SNCHEZ, Diana

ROCA BEJAR, Anel
LAURENTE GMEZ, Roxana
SOSA CORI, Manuel

DOCENTE
Lic. Yuri Roberts Congona Rivera

UNI UNIVERSITARIA

LIMA PERU 2013

INDICE
Pgina
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

TTULO DE LA INVESTIGACIN
AUTORES
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
JUSTIFICACIN DE LA INVESTIGACIN
OBJETIVOS DE INVESTIGACIN
HIPTESIS DE LA INVESTIGACIN
MARCO TERICO
7.1. ANTECEDENTES
BASES TERICAS

3
3
3
4
4
5
5

8. METODOLOGA DE LA INVESTIGACIN
8.1.
8.2.
8.3.
8.4.
8.5.
8.6.
8.7.
8.8.

Tipo de estudio
Poblacin
Muestra poblacional
Variables de Investigacin
Procedimiento
Instrumentos de recoleccin de datos
Plan de tabulacin
Anlisis estadstico de datos

9. ADMINISTRACIN DE LA INVESTIGACIN
10. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
11. ANEXOS

23
23
23
24
25
31
31
33
34
36
39

1. TITULO DE LA INVESTIGACION

Recuento mnimo de leucocitos para realizar la Frmula leucocitaria en

Frotis de sangre perifrica

UNMSM - 2013

2. AUTORES
PONCE SNCHEZ, Diana
ROCA BJAR, Anel
LAURENTE GMEZ, Roxana
SOSA CORI, Manuel

3. PLANTEAMIENTO Y JUSTIFICACION DEL PROBLEMA

Segn el CLSI en el documento H20A de 1992 , para formular una lmina se

deben tomar en cuenta el protocolo para la examinacin microscopia del frotis, en
unos de sus puntos menciona: un mnimo de 300 leucocitos deberan estar en la
zona de lectura, cuando el recuento de leucocitos no es menos de 4 x 10^9/L.
De los 300 presentes en la prctica clnica para contribucin al diagnstico slo se
realiza el recuento de 100 clulas en el trabajo de rutina. Sin embargo en aquellos
casos que se presenten leucopenias, es decir valores menores de 4 x 10^9/L , 3 x
10^9/L , 2 x 10^9/L o menos como en las leucopenias severas en la zona de
lectura debera presentar menos de 300 leucocitos, incluso existe la posibilidad de
que sean menor a 100 leucocitos, que es la cantidad mnima en rutina para
realizar la formula leucocitaria ( CLSI menciona que deberan ser contados 200
leucocitos)
De all viene la inquietud de hasta que valores de leucopenia se debera realizar la
formula diferencial de leucocitos con un margen de confianza confiable y vlido. A
partir d esto nos planteamos lo siguiente:
Cul es la cantidad mnima de leucocitos con la cual se puede formular una
lmina perifrica para el recuento diferencial de leucocitos?

4. OBJETIVOS DE INVESTIGACIN
OBJETIVO GENERAL

5.1.

Determinar el valor mnimo de leucocitos para realizar el recuento diferencial de

leucocitos con un margen de confianza confiable y vlido.
OBJETIVOS ESPECFICOS

Determinar el conteo de leucocitos en lmina perifrica en recuentos

menores de 4000 leucocitos.
Determinar el C.V por estirpe leucocitaria en el recuento diferencial en los
diferentes rangos de recuentos menores de 4000 leucocitos.

5. HIPTESIS DE LA INVESTIGACIN
En valores extremos menores de 1000 leucocitos no es recomendable usar la
frmula leucocitaria en una lmina perifrica.
6. MARCO TERICO
EXAMEN DEL FROTIS DE SANGRE PERIFRICA
EXAMEN CON OBJETIVO 10X

El examen del frotis sanguneo es un proceso de varios pasos. Se comienza con

el anlisis del frotis con un barrido del portaobjeto con el objetivo 10X o de bajo
aumento. Este paso es necesario para determinar la calidad general del frotis
,incluida la distribucin anormal de los eritrocitos que sugiere la presencia de
rouleaux(o de aglutinacin) o la de un nmero desproporcionado de grandes
clulas nucleadas(p.ej.,monocitos o neutrfilos) en los bordes del extendido. Si
esto ltimo sucede, debe prepararse otro frotis.Adems,el examen del frotis con
objetivo 10X permite la rpida deteccin de grandes clulas anormales, como
blastos, linfocitos reactivos y parsitos.

EXAMEN CON OBJETIVO 40X

Con el empleo del objetivo 40X,se busca un rea del frotis en la cual los eritrocitos
se encuentren uniformemente distribuidos y en donde apenas se toquen unos con

otros(dos o tres clulas pueden superponerse)(figura 1).Se examinan de 8 a 10

campos en esta rea del frotis y de determina el nmero promedio de leucocitos
por campo. Se multiplica el nmero promedio de leucocitos por campo de gran
aumento por 2000 para obtener una aproximacin del total de leucocitos
contados/mm3.
Este estimado es una herramienta de control de calidad til para validar el
recuento de leucocitos realizado por el analizador hematolgico. Debe resolverse
cualquier discrepancia entre el recuento de leucocitos del instrumento y el
estimado por el frotis.

Figura 1 rea correcta del frotis de sangre para realizar la evaluacin de la distribucin
celular y la estimacin de leucocitos(400X).

EXAMEN CON OBJETIVO 100X

El paso siguiente en la evaluacin del frotis es realizar el recuento diferencial de

leucocitos.Esto se efectua en la misma rea del frotis en la que se hizo el
estimado del recuento de leucocitos,pero utilizando el objetivo de inmersin en
aceite 100X.Cuando se analiza el rea correcta de un frotis de un paciente con
recuento normal de eritrocitos,se observan alrededor de 200 a 250 eritrocitos por
campo de 100X.Por lo general, el recuento diferencial incluye el conteo y la
clasificacin de 100 leucocitos consecutivos y el informe de estas clases como
porcentajes.El recuento diferencial se realiza de modo sistemtico; para ello se
utiliza un recorrido en patrn de guardia griega(Figura 2),que minimiza los errores
de distribucin de los leucocitos.Los resultados se informan como porcentajes de
cada tipo de leucocitos observado durante el recuento.Un ejemplo de recuento
diferencial de leucocitos es el siguiente:3% de neutrfilos en banda,55% de
neutrfilos polimorfonucleares,30% de linfocitos,6% de monocitos,4% de
eosinfilos y 2% de basfilos(cuadro 1).Se informa tambin cualquier alteracin de
los leucocitos que se observe;por ejemplo,cambios txicos,cuerpos de
Dohle,linfocitos reactivos y bastones de Auer.Cuando se encuentran presentes los
eritrocitos nucleados se cuentan e informan como nmero de eritrocitos

nucleados/100
leucocitos.La
evaluacin
de
la
morfologa
de
los
eritrocitos,leucocitos y plaquetas y el recuento estimado de plaquetas se realiza
tambin utilizando el objetivo de inmersin en aceite 100X.Las inclusiones de
eritrocitos(p.ej.,los cuerpos de Howell-jolly) y las inclusiones de leucocitos (como
los cuerpos de Dohle) pueden observarse tambin con este aumento.Cada
laboratorio debe establecer protocolos para estandarizar el informe de estas
alteraciones.

Figura 2 Patrn en guardia griega para realizar el recuento diferencial de

leucocitos.(De Rodak BF,Fritsma GA,Doig K.Hematology:clinical principles and
applications,3rd ed,philadelphia,2007,Saunders.)

Criterios del CLSI para el recuento diferencial de lmina perifrica

1.-La muestra de sangre venosa es extrada en tubos con tripotsico etilendiamina

tetra-acetato (EDTA K) 31,5 0,15 mg (en forma lquida o en polvo) por ml de

muestra.
2.-La condicin de la muestra
Macroscpicamente cuando se observa cogulos visibles estos son causa de
rechazo de la muestra para el anlisis.
3.-Anotar el nmero total de leucocitos, anotar cualquier condicin anormal del
espcimen, tales como la lipemia o hemlisis en el plasma sobrenadante.
4.-Preparacin de la lmina perifrica
Se realiza en portaobjetos (25x 75 mm, 0,8 a 1,2 mm de espesor) que estn
limpios, secos y libre de polvo. Si la sangre es leucopenia, preparar un gran
nmero de pelculas de sangre (por ejemplo, seis).
Preparar el frotis de sangre dentro de las 4 h de la extraccin de sangre en EDTA
K.
NOTA: No guarde la sangre en la nevera. Una mezcla adecuada (20 inversiones
completas a mano) es necesario, antes de la preparacin de un frotis de sangre.
Para preparar un frotis de sangre se coloca primero una gota (Aproximadamente
0,05 ml) de sangre bien mezclada cerca de un extremo del portaobjeto. Luego
colocar en un ngulo de 45 otro portaobjeto encima con los bordes pulidos e
inmediatamente extender la gota de sangre formando una pelcula. Posteriormente
se tie la pelcula dentro de una hora de preparacin con un Romanowsky,que
contienen fijadores, o fijar en una hora con "agua libre" (es decir, <3% agua)
metanol para realizar ms tarde la tincin.
5.-Requerimientos para una lmina de sangre aceptable
Cualidades deseables de un frotis de sangre
rea de trabajo suficiente
Mnimo 2,5 cm de longitud de un frotis
El frotis tiene que terminar en un borde cuadrado o recto.
Hacer el recuento de los leucocitos dentro de la zona de estudio(entre
cuerpo y cola).
Se producen frotices menos ptimos en los casos de anemia o policitemia o
en los casos que haya protenas plasmticas anormales (por ejemplo, en el
mieloma, enfermedad por crioaglutininas).

6.-Tincin de Romanowsky
Los colorantes tipo Romanowsky contienen metileno y/o productos de
oxidacin(azur B), y un colorante de fluorescena halogenados, por lo general
eosina B o Y.
Las preparaciones para un recuento diferencial requieren la tincin con
Romanowsky,que es una tincin ptima de los elementos celulares ,de gran ayuda
en la identificacin precisa de ambos leucocitos maduros e inmaduros, as como
las clulas anormales.
Protocolo para examinar el frotis
Evaluacin microscpica:

La lmina debe de ser barrida de 10X a 40X para ver clulas anormales y
una aceptable distribucin celular. Y con el objetivo de 100x para captar con
mejor resolucin los grnulos citoplasmticos y filamentos de neutrlifos.

Realizar la lectura donde se aprecia una distribucin lineal de los eritrocitos.

Un mnimo de 300 leucocitos debe estar dentro del rea de trabajo, cuando
el recuento total de leucocitos es no menos de 4 x 109 por L.

Los neutrfilos, monocitos, y linfocitos deben aparecer de manera uniforme.

Cuando el recuento total de leucocitos est dentro del rango normal, el
nmero de glbulos blancos por campo de 100X en el rea de la cola no
debe exceder de 2 a 3 veces el nmero por campo que en el cuerpo de la
pelcula.

A excepcin a ciertos estados patolgicos como Leucemia linfoctica

crnica.En caso de encontrar clulas rotas indentificables tambin
considerarlas en el conteo.En tanto que las clulas rotas no identificables
anotar como otro y anotarlo como observacin en el reporte de
laboratorio.

Procedimiento de conteo:

Usar el patrn de almena para el barrido del frotis. (Revisar el anexo

1).Cada clula identificada debe ser colocado en una de las siguientes
categoras: Neutrfilos segmentados, abastonados, linfocitos normal,
linfocitos variante; monocitos, eosinfilos, basfilos; otra nucleado excepto
las clulas rojas nucleadas.

 En cada frotis deben ser contados 200 leucocitos. Si la sangre es

leucopenia, procesar diapositivas adicionales en paralelo.
Expresar los conteos en porcentaje en base al total.
Contar las clulas eritroides nucleadas presentes y expresan el resultado
como el nmero por 100 leucocitos contados.

7. METODOLOGIA DE LA INVESTIGACIN
7.1.

TIPO DE ESTUDIO

El presente estudio es observacional, prospectivo y transversal.

POBLACIN DE ESTUDIO

7.2.

La poblacin estar conformada por los alumnos de Tecnologa Mdica que llevan
el curso de hematologa 2013 en la UNMSM.
7.3.

MUESTRA POBLACIONAL

La muestra poblacional para el presente estudio estar constituida por los 12

integrantes del grupo de los sbados que llevan el curso de hematologa 2013 en
la UNMSM. Por ello no se emplear ninguna tcnica de seleccin de la muestra ya
que el muestreo ser no probabilistico por conveniencia.
CRITERIOS DE SELECCIN
a) Criterios de Inclusin:
Muestras extradas con EDTA-K2 por su mejor preservacin de la
estructura.
Muestras centrifugadas e inducidas a un estado leucopnico por
extraccin de la capa de glbulos blancos.
Muestras que despus de haber sido tratadas al realizarle el
recuento de leucocitos presenten valores menores de 4000
clulas por mm3
b) Criterios de Exclusin
Lminas con coloracin no adecuada por el ph cido o por presencia
de precipitados.
7.4.

TCNICAS E INSTRUMENTOS

El anlisis de los datos recolectados se hizo usando Microsoft Excel 2002 y el

paquete estadstico SPSS 13.

7.5.

PLAN DE PROCEDIMIENTOS

1.-En primer lugar se debe tomar la muestra a 12 alumnos al azar que integran el
grupo de los sbados que llevan el curso de hematologa 2013 en la UNMSM.
Para ello vamos a utilizar todos los materiales necesarios para una buena toma de
muestra, y se va a utilizar tubos con anticoagulante EDTAK 2 en la cual se va a
obtener 3ml de muestra.

2.-Posteriormente determinar el recuento de leucocitos de cada muestra en la

cmara de neubauer y realizar la frmula leucocitaria respectiva de cada uno
analizando la zona de lectura.
3.-Deacuerdo a la cantidad de leucocitos hallados en la cmara de neubauer,se va
a proceder a diluir la muestra con el objetivo de simular una muestra leucopnica.
Para ello se va a diluir la muestra con NaCl al 0.9% con el objetivo de disminuir la
cantidad de leucocitos a 4000 mm3/ul.

a.-Extraer:1.8ml de
la muestra.
3ml de
muestr
a

1.8m

1.2m

b.-Remplazar con
NaCl hasta los 3ml
c.-Recuento de
leucocitos

1.8 ml
de NaCl
1.2m

10,000 mm3/ul---------------- 3ml

4.000 mm3/ul ---------------- 1.2ml
4.-Seguir diluyendo para obtener menor cantidad de leucocitos

4.000 mm 3/ul
3.000 mm3/ul
2.000 mm3/ul
1.000 mm3/ul

5.-Posteriormente realizar la frmula leucocitaria de cada dilucin y determinar la

cantidad de leucocitos en la zona de lectura.
6.-Ingresar los resultados a una hoja de Excel,para poder analizar el coeficiente de
variacin y en base a ello determinar el recuento mnimo de leucocitos para
realizar la Frmula leucocitaria en Frotis de sangre perifrica de manera confiable.
7.6.

ANALISIS DE DATOS

Supuestos para el anlisis estadstico:

 El mtodo de referencia representa la verdad. (Si aceptada, a continuacin,

desacuerdos representan un imprecisin del mtodo de prueba.)
Los valores de la prueba (y) se distribuyen gaussiana en cualquier valor de
referencia determinado (x).
La media de los valores de y de cada muestra es una funcin lineal de x.
Esto puede ser probado satisfactoriamente mediante el examen de la
x-y diagrama de dispersin de los medios de la referencia mtodo (x) frente
a los medios del mtodo de ensayo i (y) para cada muestra (i). En este
diagrama de dispersin, i superponer el sobre que tiene en cuenta la
imprecisin de los mtodos de ensayo y de referencia.Para simplificar la
construccin de la envolvente, calcular la media del nmero de clulas
contadas por el analizador para todas las muestras e introducir este nmero
"n" (ver La Figura 5). Los puntos de datos que caen fuera de la lmites
sobre debe ser examinado.

Para evaluar la imprecisin

Clinical Sensitivity

Construir un histograma para cada tipo de clula a partir de

todos los valores normales inicialmente tabulados. Examine
estos histogramas de valores atpicos. Estos pueden definirse
como ms de> 3 SD de la media.
Deducir la gama de valores de referencia a partir del histograma
de la restante valores. Definir el rango de referencia como el

centro de 95% de la poblacin. El 95% de los lmites se utilizan

para establecer la normalidad
Por lo tanto, con 100 muestras, excluir los dos valores ms altos
y ms bajos, o un total de cuatro. Tabular los valores de
referencia segn el tipo de clulas para cada mtodo.

8. CRONOGRAMA DE TRABAJO
Grfica de GANTT

Sem. 4

Sem. 3

Sem. 2

Sem. 1

JULIO
Sem. 4

Sem. 3

Sem. 3

Sem. 2

3. Aplicacin de instrumentos en
la poblacin

Sem. 1

2. Seleccin de la poblacin de
estudio

JUNIO
Sem. 4

1. Diseo y aprobacin del

proyecto

Sem. 2

ACTIVIDADES

Sem. 1

MAYO

4. Recoleccin de datos

5. Procesamiento de los datos

6. Anlisis estadstico de los

datos

7. Anlisis e interpretacin de los

resultados

8. Redaccin Preliminar
X
9. Revisin y crtica de la
redaccin

10. Presentacin del informe

X
11. Sustentacin
X

8.1.

PRESUPUESTO

A) BIENES

CANTIDAD
PRECIO S./
MATERIAL PUBLICITARIO
Cinta adhesiva
2
2.00
MATERIALES DE FLEBOTOMIA
Algodn
kilo
2.50
Bolsas de bioseguridad
3
3.0
Esparadrapo
1unidad
5.00
Tubos vacuteiner tapa
20
10.00
morada
Agujas N21
20
10.00
Ligadura
3 ligaduras
4.50
Campo
18
3.50
Rotuladores
2
5.0
INSTRUMENTOS E INSUMOS
Tips amarillos
1 bolsa
50.00
Tips azules
1 bolsa
50.00
Reactivos
Detergente
1 bolsa
3.20
Papel toalla
1 rollo
2.50
MATERIALES DE ESCRITORIO
Hojas bond

Lapiceros
MONTO TOTAL
B) SERVICIOS
CANTIDAD

PRECIO S./

Refrigerio
Transportes
PRESUPUETO TOTAL
PRECIO S./
TOTAL BIENES
TOTAL SERVICIOS
PRESUPUESTO TOTAL
9. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
9.1.

BIBLIOGRAFA CITADA

1) Claudia Patricia Aldana Acajabn (2003). Correlacin entre la determinacin

Enzimtica, el clculo por la frmula de Friedewald y el anlisis de

regresin en la determinacin de la lipoprotena de baja densidad. Informe
Final de Tesis. Guatemala. Pag 7-23
9.2.

BIBLIOGRAFA CONSULTADA

1) Koepke J.A. (1978).Differential Leukocyte Counting (ed.). College of America

Pathologists

2) John

Leukocyte
Differential
Count(Proportional) and Evaluation of Instrumental Methods. NCCLS
A.

Koepke,

M.D.(1992).Reference

Document H20-A. VOLUME 12 NUMBER 1

10. ANEXOS

ANEXO N1:

ANEXO N2:

ANEXO N3:

ANEXO N4:

ANEXO N5: