Tcnica original tincin aminocprica

De plata
Tincin
modificada
-Perfusin con paraformaldehdo al 4%

-Obtencin de cortes del cerebro de 30-35 micras y
almacenadas en solucin fijadora por 2 a 3 das
(opcional).

-Lavado con agua destilada antes de la
preimpregnacin durante 15-20 segundos. Pueden
ser necesarios dos lavados.

-PREIMPREGNACIN. La solucin se prepara en el
siguiente orden.
AgNO3 100mg
Agua destilada 100ml
cido aminobutrico 53mg
Alanina 46mg
Cu (NO3)2 al 0.5% 2ml
Cd(NO3)2 al 0.5% 0.2ml
La(NO3)3 1.5 ml
Rojo neutro al 0.5% 0.5 ml
Piridina 1ml
Trietanolamina 1 ml
Isopropanol 2ml
Antes de ser usada esta solucin debe ser irradiada
en un microondas de 700W usando el 60% de su
mximo poder hasta que la solucin alcance 50C.
Posteriormente la solucin se deja enfriar a
temperatura ambiente (22-25C) por una hora o
incluso toda la noche. Si se forma un precipitado, la
solucin debe filtrarse.
Los cortes se deben preimpregnar en un horno
convencional de laboratorio a 50C durante 45-40
min.
Las siguientes secciones de incubacin deben
dejarse enfriar a temperatura ambiente (22-25C)
mientras los cortes se encuentran en la seccin de
preimpregnacin.

-Dos lavados con acetona (Total 30-60 seg con
agitacin continua)
-Transferir a solucin Diamina de plata durante 45-
40 min a temperatura ambiente y bajo constante
agitacin. La solucin se prepara de la siguiente
manera (10ml son suficientes para 15 cortes):
AgNO3 412mg
Agua destilada 5ml
- Perfusin con paraformaldehdo al 4%
-Despus de la perfusin se pueden almacenar los
cerebros por 24H a 4C en la misma solucin de perfusin.

-Realizar cortes de 50 micras en vibratomo. Tambin son
viables cortes de 40 hasta 100 micras. Los cortes pueden
almacenarse en paraformaldehdo al 4% a 4C por 6
meses.

-Lavar con agua desionizada cinco veces 1-5 min c/u y
escurrir ligeramente en toallas de papel.

-Transferir a solucin cprica de plata a 40C por 1 hora,
posteriormente retirar y dejar enfriar a temperatura
ambiente toda la noche. La solucin se prepara:
Agua desionizada 120 ml
AgNO3 1.05 g
CuNO3 al 1% 1 ml
Alantoina al 0.1% 10ml
Piridina 6ml
Etanol absoluto 12ml
Buffer de borato 6ml

Para la preparacin del buffeer de borato se valora cido
brico 0.2M con Tetraborato de sodio 0.05M (en agua
desionizada) a pH 8.5.

-Al da siguiente escurrir en toallas de papel.

-Lavado con acetona al 100% durante 30-90seg

-Transferir a solucin de incubacin de diamina de plata
por 35 min. La solucin Se prepara:

Agua desionizada 60ml
AgNO3 12g
NaOH al 4% 30ml
NH4OH 15 ml
Agua desionizada 60ml
(total 120ml)

-Escurrir en toallas de papel

-Transferir a solucin reductora por 90 segundos a 5 min
(a partir de este punto se debe escurrir en toallas de
papel entre cada paso. La solucin se prepara de la
Etanol al 100% 4ml
Acetona 0.5 ml
LiOH al 0.4% 3 ml
NH4OH 0.65 ml

-Transferir a solucin reductora a 32C por 25min
con agitacin cada 5min. La solucin reductora se
prepara de la siguiente manera (aprox. 50ml para 15
cortes):
Formalina al 10% 11ml
Acido ctrico monohidratado al 1% 6.5 ml
Etanol al 100% 90ml
Agua destilada 800ml
Despus de estar 5 min en la solucin reductora, se
agregan por cada 100ml de sol. Reductora 1.2ml de
solucin diamina de plata (la misma usada para para
impregnacin).

-Lavado con agua destilada

-Transferir a solucin de cido actico glacial al
0.5% por 1-2min para detener la reaccin de
reduccin.

-Dos lavados con agua (una hora en total, con 15min
en el primer lavado).

-Almacenar toda la noche en agua destilada (para
estabilizar antes de realizar el blanqueamiento que
se realiza en dos pasos).

-Primer paso de blanqueamiento a temperatura
ambiente hasta que los cortes se vean relativamente
transparentes (20-60seg)
Primera solucin de blanqueado (11ml aprox)
Ferrocianuro de Potasio al 6% 10ml
en solucin de Clorato de Potasio al 4% sin
diluir, en acido lctico.

-Lavado con agua destilada

-Segundo paso de blanqueamiento (15-20 seg)
Permanganato de potasio al 0.06% 30 ml
cido sulfrico al 5% 1ml

-Lavado con agua destilada por lo menos dos veces
a temperatura ambiente de 1 a 5 min antes de la
estabilizacin.
siguiente forma:
Agua desionizada 135ml
Etanol absoluto 15ml
Formaldehdo al 37% w/w 180 L
cido ctrico anhidro 150mg

-Transferir a solucin blanqueadora e incubar por 10
minutos aproximadamente con agitacin continua o hasta
30 min si los cortes no adquieren el color caf oscuro. La
solucin se prepara disolviendo 450mg de K3Fe(CN)6 en
150 ml de agua destilada.

-Realizar tres lavados con agua destilada de 30 seg a 1
min c/u.

-Transferir a solucin estabilizadora por 1 minuto. La
solucin se prepara disolviendo 150mg de tiosulfato de
sodio en 150ml de agua destilada.

-Realizar tres lavados con agua destilada de 1 minuto
cada lavado.

-Montar los cortes en portaobjetos recubiertos con
solucin de montaje gelatina/alcohol

-Deshidratar pasando los cortes en alcoholes de
concentraciones crecientes (50,70, 2x 90% y 2x100%) de 5
minutos cada uno. Transferir a xileno tres cambios de 5
min c/u.

-Cubrir con Permount (medio de montaje) antes de que
se seque el Xileno.


-Estabilizacin se lleva a cabo en dos pasos:

1. Transferir a solucin al 2% de Tiosulfato
de sodio (con agitacin) de 1 a 3 min y
posteriormente realizar lavado con agua
destilada.
2. Transferir secciones a solucin fijadora
rpida (Solucin fijadora rpida
concentrada Kodak A+ B, diluida 1:6 en
agua destilada) 5 minutos mximo o hasta
que los cortes se vuelvan transparentes.

-Lavar con agua destilada, despus los cortes
pueden ser montados, deshidratados, aclarados y
recubrir.

Montaje y contraste.
Montar antes de la deshidratacin de una solucin
compuesta de partes iguales de 0,5% de gelatina y
80% de alcohol. Hidratar y sumergir en una solucin
de rojo neutro al 0.5% durante 15-20 min. Lavar dos
veces en agua destilada y deshidratar en alcohol al
50,70, 95 y 100% 15-20 segundos c/u.
Posteriormente en una solucin alcohol-xileno (1:1 y
despus 1:6) y dos veces en Xileno. Cubrir usando
DPX como medio de montaje.