Crystal Structure of a p53 Tumor

Supressor DNA complex

Understanding Tumorigenic
Mutations
Porqu a p53?
Codificada pelo cromossoma 17
Peso molecular: 53 Kda
FUNO: manuteno da integridade do cdigo gentico (mesma sequncia
de nucletidos ao longo de toda a molcula de DNA
Ciclo de diviso celular
Verifica a ocorrncia de mutao na sequncia do cdigo gentico
Atravs de um conjunto de reaces, ativa de protenas de reparao, repondo o
DNA no seu estado normal
Impede que a clula entre em mitose e complete a diviso celular
Induz a morte celular atravs da apoptose
Impede que esta se multiplique (provocando senescncia celular)
Protena supressora de tumores: importante na manuteno da integridade do genoma

p53 induz a paragem do ciclo celular na presena de danos
do DNA.

Mutaes na p53 eliminam esta resposta elevada
frequncia de rearranjos no genoma.

Pensa-se que a instabilidade gentica resultante aumenta a
probabilidade das clulas tumorais escaparem s restries contra o
crescimento excessivo.

Mais de mil mutaes relativas p53 j foram descobertas e a maioria
so encontradas na poro central do aminocido 200.


A estrutura cristalina de um complexo contendo este domnio da p53
humana e o local de ligao ao DNA foi determinado a 2,2 e refinado a
cristalografia com fator R 20,5%.


A estrutura da protena apoia a hiptese de que a ligao do DNA
crtica para a atividade biolgica da p53 e fornece um quadro que permite
entender como as mutaes a inativam.


Cristalografia
Consiste em transformar as protenas em cristais e usar tcnicas
cristalogrficas para determinar a sua estrutura
Eletres difratam a radiao X

Obteno de uma imagem da densidade eletrnica da protena

Estrutura estabelecida a partir do mapa eletrnico

A poro central da p53 (resduos 102 292) tm um domnio estrutural
compacto que contm a sequncia especfica da atividade das ligaes de
DNA da protena.
Pensa-se que o domnio central a chave para entender como a p53
liga o DNA e como mutaes tumorais inativam essas ligaes.



Cristaliza-se o domnio central da p53 humana, determina-se a estrutura
do complexo a 2,2 e refina-se para um fator R 20,5%.


Os cristais cresceram a 4C numa cmara anaerbica pelo mtodo de
difuso de vapor
Os melhores cristais foram obtidos pela mistura a 0,7mM do complexo
contendo 1 molar equivalente de fragmento de DNA (em 50mM
bistrispropano-HCl, 100mM NaCl, 10mM DTT e pH 6,8).


Os cristais difratam a 2,2 mas os danos das radiaes limitam os
dados recolhidos a 1C para 2,8 (distncia tima das interaes
eletroestticas).

Modelos parciais contendo 40% da cadeia principal dos tomos da
protena foram usados para determinar os operadores no cristalogrficos
simtricos relacionados com os trs domnios centrais das molculas. Estes
operadores foram usados para calcular a mdia da densidade eletrnica com
o programa RAVE.

O mapa da mdia foi usado em conjunto com o mapa MIR inicial para
completar o modelo da unidade assimtrica. Este modelo foi refinado por
recozimento simulado (com X-PLOR) com um fator R 22% com dados entre os
8,0 e os 2,8 .

O modelo de 2,8 usado como ponto inicial para o refinamento contra
dados a 2,2 recolhidos com um cristal congelado a -175C.






Os cristais contm 3 domnios centrais na unidade assimtrica:
Um domnio central liga a um local prximo do DNA dupla hlice e faz
contacto com as bases e com a coluna fosfatada.
O segundo domnio central liga na mesma face da dupla hlice e interage
fracamente com cada uma, formando um dmero.
O terceiro domnio central no liga DNA mas faz contacto protena-
protena, que estabiliza o empacotamento do cristal.

Os trs domnios tm estrutura semelhante e pensa-se que as ligaes
do DNA no resultam em alteraes estruturais significativas.

Domnio central:
2 folhas antiparalelas que tm 4/5 cadeias
Numa ponta final da sandwich, as folhas juntam-se e formam uma
estrutura em barril. Esta regio contm NH
2
terminal e COOH terminal
ligados por pequenos loops de 5 a 11 resduos.
A descrio da estrutura foca a regio dos loops porque so o loop-
sheet-hlice e dois largos loops que compem a superfcie de ligao do
DNA da protena.

Os locais de ligao da p53 consistem em quatro cpias do pentmero
da sequncia PuPuPuC(A/T).
A estrutura do cristal revela que o domnio central se liga inicialmente a
um nico pentmero mas as bases de fora tambm participam na ligao
uma parte do pentmero adjacente tambm precisa para a ligao
PuPuPuC(A/T) (T/A)G.

No complexo, no h interaes diretas com bases mas o grupo
guanidina da Arg
248
est a 4,0 do grupo fosfato e acar. Tambm se
observou uma molcula de gua entre o grupo guanidina da Arg e o N
2
da
Gua
13
fazendo pontes de hidrognio que ligam os dois.


As mutaes mais frequentes encontram-se no loop L3 e L2:

as mudanas estruturais para acomodar mutaes nesta regio vo ter
mais efeitos nas ligaes de DNA do que aquelas na sandwich.
estas regies tm pequenas estruturas secundrias regulares e
dependem de interaes cadeia lateralcadeia lateral e cadeia lateral
coluna para a integridade estrutural.



A estrutura de cristal do domnio central fornece-nos uma nova viso
sobre a atividade de ligao da p53 e a sua inativao por mutaes
tumorais.
A maior parte destas mutaes ocorre no local do domnio central
responsvel pela ligao de DNA.
A ligao de DNA uma atividade crtica do p53 necessria para a
supresso de tumor.
A estrutura, assim, sugere possveis alvos para o design de compostos
para restaurar a atividade de mutantes de p53 encontradas em tumores.


Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding
tumorigenic mutations Science 15 July 1994: Vol. 265 no. 5170 pp. 346-355
DOI:10.1126/science.8023157
PubMed ID: 8023157
PDB accession code: 1TUP
Alexandra Teixeira
Catarina Cunha
Maria Ins Silva


TP2
23 de Outubro de 2013