Engenharia Biomolecular e

Celular
Estruturas Artificiais para
Modulação de Orgãos in
vitro
Lisboa, 3 Dezembro 2009

Ana Sabino
Filipe Condessa
 Outline

Motivação

Modulação de Orgãos in vitro

Engenharia de Tecidos (I)
– Scaffolding

Engenharia de Tecidos (II)
– Entrega de Factores de Crescimento

Case Study

Tecido Hepático
 Motivação
“Tissue engineering is the exciting discipline of
design and construction of spare parts for the
human body to restore function based on
biology and biomedical engineering. The basis of
tissue engineering is the triad of signals for
tissue induction, responding stem cells, and the
scaffolding of extracellular matrix.”

A. Hari Reddi - Growth Factors and

Morphogens: Signals for Tissue Engineering
 Modulação de Tecidos
• Sinais de regulação bioquímica
– Factores de Crescimento
• Densidade de cell seeding
• Fonte das células
• Template de regeneração Tissular
• Miscibilidade
• Transporte de Massa
• Forças hidrodinâmicas
• Tempo de cultura celular
 Modulação de Tecidos e
Engenharia de Tecidos
• Factores Físicos (Mecânicos)
– Propriedades Mecânicas das Estruturas
• Flexibilidade dos Scaffolds
• Porosidade dos Scaffolds
• Taxa de Degradação dos Scaffolds
• Factores Bioquímicos
– Factores de Crescimento (i.e.)
• Entrega de Factores de Crescimento através de
moléculas libertadas pelos Scaffolds
 Engenharia de Tecidos

A engenharia de tecidos emergiu por volta de 1990 numa tentativa de

colmatar as limitações da transplantação de órgãos e da substituição por
tecidos sintéticos.

Tem como foco o acoplamento de células a uma matriz biodegradável

conhecida como scaffold.
Engenharia de Tecidos (I)
-Scaffolding
 Engenharia de Tecidos (I)
-Scaffolding
Taxa de absorção de alguns poliésteres:

Há que garantir que o tempo de

biodegradação é compatível
com o tempo de formação do
tecido para que não aconteça a
perda de suporte.

Libertação de fármacos
(factores de crescimento , entre
outros)

O scaffold deve exibir biocompatibilidade e biodegradibilidade, porosidade

adequada para a ancoragem e crescimento celular bem como facilidade na
difusão de nutrientes e produtos metabólicos.
 Engenharia de Tecidos (I)
-Scaffolding
O scaffold e as componentes bio-activas do mesmo têm que ser escolhidas
mediantes o órgão alvo

Dependem do tipo de células

É necessário optimizar a interface entre as células e o scaffold para

manter a funcionalidade e o comportamento celular e permitir a
construção do tecido nas três dimensões.
 Engenharia de Tecidos (I)
-Scaffolding
É necessário criar uma porosidade hierárquica

●
Nutrição
●
Vascularização

●
Acomodação das
células

●
Funções químicas
e mecânica
desejadas
Engenharia de Tecidos (I)
-Scaffolding
 Engenharia de Tecidos (II) - Entrega
de Factores de Crescimento
• Regeneração Tissular - Tecnologia de Entrega de Factores de Crescimento
(Review Biomaterials-based tissue engineering - Y.TABATA)
Disease or operation Growth Effect
Factor
Vascular Graft Surgery for heart bFGF Angiogenesis
Arteriosclerosis obliterans and buerger bFGF Angiogenesis
disease
Diabetic skin ulcer bFGF Angiogenesis and dermatogenesis
Periodontal disease bFGF Regeneration of alveolar bone
Hardness of hearing IGF-1 Inhibition of acoustic nerve ageing
Meniscus injury PRP Chondrogenesis
Facial plastic surgery bFGF Chondrogenesis, soft tissue
regeneration
Chest plastic surgery bFGF Regeneration of the sternum bone,
angiogenesis
Plastic surgery of soft tissues bFGF Angiogenesis
Facial nerve paralysis bFGF Nerve function recovery
Engenharia de Tecidos (II) - Entrega
de Factores de Crescimento

Desenvolvimento de polímeros capazes de
libertar substâncias de forma controlada

Facilitou a criação de scaffolds capazes de libertar
factores de crescimento de forma controlada

Permitiu o controlo de processos celulares por
periodos prolongados através de uma libertação
sustentada dos factores de crescimento
directamente no ambiente celular
Engenharia de Tecidos (II) - Entrega
de Factores de Crescimento

Encapsulamento de factores de crescimento
em matrizes de

Colagénio

Alginado

Ácido Hialurónico

Hidrogéis sintéticos

Tempo de meia vida muito superior ao de um
factor de crescimento em solução
Engenharia de Tecidos (II) - Entrega
de Factores de Crescimento

Imobilização de factores de crescimento através de
interacções com materiais contendo heparina

Heparina

Estabilização e imobilização do factor de crescimento
por interacções electroestáticas
− Específicas (sequência)
− Biomimetismo dos mecanismos naturais de
protecção dos factores de crescimento na matriz
extra-celular
− Elevada eficácia de hidrogéis em que é efectuada
uma co-encapsulação da heparina com os factores
de crescimento
Engenharia de Tecidos (II) - Entrega
de Factores de Crescimento

Heparina
− Possibilidade de modular a entrega recorrendo a hbp
(heparine binding peptides)
− Possibilidade de modular as propriedades mecanicas de
hidrogéis mediando a afinidade e cinética das ligações
heparina - hbp

Imobilização de bFGF (basic Fibroblast
Growth Factor) em matriz de colagénio com
heparina
− Manutenção da bioactividade pela bFGF
− Promoção do crescimento de células endoteliais
 Engenharia de Tecidos (II) - Entrega
de Factores de Crescimento

Incorporação covalente de hbp numa matriz de fibrina
(recorrendo ao factor XIIIa)

Incorporação da heparina e do factor de crescimento na
matriz de fibrina

Libertação passiva do factor de crescimento associado à
heparina minimizada pela ligação heparina – hpb
(covalentemente ligada à fibirina)

Possibilidade de modular a degradação celular da
matriz de fibrina ao factor de ligação através do rácio
Factor de Crescimento:Heparina:hbp

Superior a apenas libertação por difusão passiva
Engenharia de Tecidos (II) - Entrega
de Factores de Crescimento

Libertação de factores de crescimento
controlada por:

Dimensão dos poros (hidrogel)

Carga de Heparina

É no entanto um Mecanismo Passivo
 Engenharia de Tecidos (II) - Entrega
de Factores de Crescimento
 Estratégias para entrega localizada de factores de crescimento
 Imobilização de EGF (Epidermal Growth Factor) a uma superfície
vítrea utilizando PEG linkers (Poly(Ethylene Glycol))
− Manutenção da actividade face a EGF fisiologicamente absorvido (sem
bioactividade)
− Kuhl, P.R. and Griffith-Cima, L.G., Tethered epidermal growth factor as a paradigm for
growth factor-induced stimulation from the solid phase, Nat. Med. 2, 1022–7, 1996.
 Incorporação de TGF-β1 (Transforming Growth Factor) em hidrogéis
contendo PEG
− Aumento da produção da Matriz Extra Celular por parte de células musculares
lisas no gel.
− Mann, B.K., Schmedlen, R.H., and West, J.L., Tethered-TGF-beta increases
extracellular matrix production of vascular smooth muscle cells, Biomaterials 22, 439–
44, 2001a.

PEG
Engenharia de Tecidos (II) - Entrega
de Factores de Crescimento
A. Hari Reddi - Growth Factors and Morphogens: Signals for
Tissue Engineering

Tissue Engineering – John P. Fisher
 Case Study - Tecido Hepático
• Funções
– Regulação Metabólica
– Função Hematológica
– Produção de Bílis

Condições que potenciam o

transplante de hepatócitos
 Case Study - Tecido Hepático
Development of hepatic tissue engineering
(Fiegel et al, 2009)
Usar culturas celulares ao invés de transplantes de
fígado permite:

(1) que exista expansão celular

durante a fase in vitro

(2) a manipulação genética ou

imunológica das células a
transplantar

(3) tissue typing e criopreservar as

células a transplantar num banco de
células [10, 11].
 Case Study - Tecido Hepático
Processo
Isolam-se os hepatócitos e semeiam-se numa matriz extra-celular que tenha
presente factores de crescimento (como o bFGF) que garante uma
diferenciação suficiente dos hepatócitos

Esta cultura celular numa matriz 3D permite que seja colocada num bioreactor
de fluxo que vai aumentar a funcionalidade e sobrevivência celular

Estes hepatócitos são fácilmente transplantado para o ratinho

Neste procedimento podem ser transplantadas células equivalentes a um órgão

inteiro
 Case Study - Tecido Hepático
Desenvolvimento da vascularização
É vital para o sucesso do
transplante de hepatócitos que
ocorra vascularização inicial.

Modelo AV-loop (AVL)

Estratégia de vascularização
microcirurgica do scaffold (já
contendo os hepatócitos) em que
este permanece numa câmara
subcutânea na zona fémural
durante apróximadamente 14 dias e
depois é retirado.

É usada uma matriz de fibrina que permite o crescimento rápido de vasos

sanguíneos desde o AVL e suporta o enxerto dos hepatócitos
 Case Study - Tecido Hepático
Vinci et al, 2009
Adaptação geométrica a várias escalas

Materiais passíveis de serem utilizados

Colagénio,
•

Esponjas de Loofah em condições

•

celulares

Hidrogéis
•
 Case Study - Tecido Hepático
Conclusões

O transplante de hepatócitos é cada vez mais uma alternativa a estudar e

considerar.

O estudos aprofundado do meio necessário à óptima funcionalidade dos

hepatócitos e o avanço ao nível dos biomaterias permite uma melhor interface
scaffold/hepatócitos o que contribui para o aumento do sucesso desta prática.
Case Study - Tecido Hepático
Fiegel et al, 2009
Case Study - Tecido Hepático
Vinci et al, 2009
Case Study - Tecido Hepático

(Oh et al., 2000)