MICROBIOLOGIA - Bacteriologa, Medios de cultivo y pruebas bioqumicas

Tema 1 - Microbiologia Clnica

(evolucin histrica, conceptos generales, organizacin de laboratorio)

Microbiologa - la ciencia que estudia los seres vivos no visibles al ojo
desnudo(microorganismos; aunque se incluyen metazoos parsitos no microscpicos),
que atribuyen el origen de la vida sobre la tierra y el mantenimiento del equilibrio en la
biosfera (en vida libre como saprofitos o depredadores con distinto grado de
simbiosis => comensalismo, mutualismo o parasitismo), aunque tambin tienen efectos
negativos como producir enfermedades; Los virus y viroides => parsitos endo-
celulares obligados (no se replica en vida libre); Microbiologa medica => estudia a los
microorganismos que afectan al hombre (reino procariota/ bacterias, los eucariotas del
reino Fung, los virus y viroides); Parasitologa =>estudia
los eucariotas microscpicas (protozoos) y macroscpicas (metazoos) de endo o
ectoparsito (los artrpodos estudiados tambin comovectores y reservorios de
enfermedades transmisibles);


Microbiologa medica:
- Microbiologa general => se estudia conocimientos histricos, clasificacin,
estructura y fisiologa de los microorganismos.
- Microbiologa especial => se estudia 4 grupos de agentes
infecciosos(bacteriologa, virologa, micologa y parasitologa) + recientemente los
viroides (moleculas circulares de ARN de bajo peso molecular que carecen de cubierta
proteica) y los priones(protenas codificadas por genes celulares y actan como seales
reguladoras, responsables de algunas enfermedades neurolgicas graves - Creutzfeldt-
Jacob y el Kuru)





Evolucin histrica de la microbiologa -
como ciencia especializada no aparece hasta finales del siglo XIX; cuatro periodos:
-1 => periodo especulativo (desde la antigedad hasta los primeros microscopistas)
-2 => desde 1675 hasta la mitad del siglo XIX (descubrimiento de los
microorganismos por Leeuwenhoek en 1675 - constructor de lentes holands que invent
el microscopio simple)
-3 => periodo de cultivo de microorganismos hasta finales de siglo XIX (Pasteur y Koch
logro cristalizar a la Microbiologa como ciencia experimental bien asentada.
-4 => desde principios del siglo XX hasta ahora (se
estudian fisiolgica, bioqumica, gentica, ecolgica y surgimiento
de virologa, inmunolgica.
- Redi, Spallanzani y otros fisicos del siglo XVII demostraron que el microorganismo no se
genera espontneamente (de novo), postularon la teora de la biognesis (ser vivo nace de
otro ser vivo).
- Pasteur (1822-1895) demostr que la fermentacin era producida por microorganismos
en crecimiento.
- Se dobl el inters de muchos naturalistas tras la publicacin de los libros de Darwin.
- Davaine (1863-1868) encontr grandes cantidades de m.o. en la sangre de las
vacas(bacteridios) y Robert Koch (1843-1910) en 1876 aisl con sus tcnicas de cultivo
puro el bacilo de antrax (Bacillus anthracis); ms tarde Koch y su colegas confirmaron que
las esporas son formas diferenciadas y resistentes de bacilos y demostraron que la
enfermedad poda transmitir sucesivamente a ratones sanos inoculndose bacilos
obtenidos de cultivo puro; basados en los postulados su maestro Henle, Koch postul
siguentes criterios:
- el microorganismo debe estar presente en todos los individuos enfermos
- el m.o. debe poder aislarse del hospedador y ser crecido en cultivo puro
- la inoculacin del m.o crecido en cultivo puro a animales sanos debe provocar
la aparicin de sintomas especficos de la enfermedad en cuestin (cada enfermedad
infecciosa esta causada por un tipo de bacteria diferente)
- el m.o. debe poder ser re-aislado del hospedador infectado de forma experimental.
Las 2 dcadas siguientes, se aislaron una gran variedad de bacterias patgenas; en Francia
el Instituto Pasteur se concentro sobre los procesos infectivos, la inmunidad del
hospedador y la obtencin de vacunas (vacuna antirrbica ensayada por Pasteur en 1885,
contribuye al nacimiento de la inmunolgia).



Conceptos generales y clasificacin - al finales del siglo XIX los microorganismos se
agrupan en un nuevo reino fuera de la teora de Darwin => Protistas para los protozoos,
las algas microscpicas, los hongos microscpicos y las bacterias como
seres microscpicos; Chatton en 1932 clasifica a los seres vivos en 4 reinos => animalia,
plantae, protistas inferiores o procariotas (bacterias) y protistas superiores o eucariotas
(algas, hongos y protozoos); Whittaker en 1969 agrupa en 5 reinos => animalia, plantae,
fungi, procariotas y protista; Magulis en 1992 los agrupa definitivamente por ahora en 2
superreinos /dominios, 5 reinos y 2 subreinos =>
- Dominio: procaryotae, 1 reino: monera, subreino: archeobacteria y eubacteria
(incluyendo todas las bacterias divididas en grupos)
- Dominio: eucaryotae, con 4 reinos: protista, fung, animalia y plantae (incluyendo
protozoos, hongos, algas, animales y vegetales); protista => son unicelulares eucariontes pero
que no cumplen con las caractersticas para estar en algn otro reino organismos de este tipo (p.ej.
protozoos)


Diferencias bsicas entre los procariotas y los eucariotas:
- clula eucaritica => presenta un ncleo verdadero rodeado por una membrana
nuclear con determinado numero de cromosomas que estn constituidos por ADN e
hitonas(protenas del ncleo); el citoplasma contiene mitocondrias, cloroplastos,
ribosomas y otros orgnulos celulares y todo ello se recubre por una membrana que se
prolonga hacia el interior, organizando unos canales en el que forma el retculo endo-
plasmtico (donde se encuentran los ribosomas - responsables de la sntesis de protenas);
la membrana celular puede o no recubrirse de pared celular (carece de peptidoglicano)
para proteccin o dar la consistencia a la clula; posee celulosa o quitina.


- clula procaritica => mas primitiva, no esta organizada y no posee
verdadero ncleo (ADN no esta rodeado de una membrana - se encuentra libre); no posee
mitocondrias, sino mesosomas (repliegues de la membrana celular donde se hallan
lasenzimas responsables de la respiracin); tampoco hay cloroplastos,
sino cromatforos(contienen clorofilas); los ribosomas se encuentran pegados a la
membrana citoplasmtica que estn protegidas por una pared celular (peptidoglicano -
exclusivo de procariotas, aunque arqueo-bacterias y micoplasmas no lo
poseen); las arqueo-bacterias, las eubacterias y los eucariotas se difieren en => la
estructura de RNA polimerasa y en la composicin de los lpidos de su membrana.


- los virus => un grupo aparte que no se ha integrado en ningn reino y se discute si son
o no seres vivos; es incapaces de reproducirse por si mismos, dependen de un husped que
les proporcione el mecanismo de la replicacin y sntesis de macromolculas); una vez que
han conseguido esto, salen de la clula infectada produciendo su muerte; hay virus que
infectan a clulas animales, otros a vegetales y otros a bacterias; un virus se define
como => un bloque de material gentico rodeado por una cubierta proteica que le sirve
como vehculo de transmisin; algunos pueden llevar una envoltura circundante
compuesta de lpidos y carbohidratos; los viroides (30 especies) => agentes
infecciosos (de menor complejidad gentica y estructural conocida) que solo afectan a
plantas superiores; constituidos por 1 cadena de ARN cclica corta que no
codifica protenas; tamao 10 veces menor que los virus (parecen ser una etapa primitiva
de los virus); los priones (proteinceous infectious
particle) => partculas patgenas de naturaleza proteica sin acido nucleico; identificados
en 1982, aunque desde el siglo XVIII se sospechaba de su existencia; las enfermedades
"prion" en el hombre (encefalopatas espongiformes transmisibles) afectan al sistema
nervioso y se cree que tambin a los musculos.



Organizacin de un laboratorio de microbiologa clnica

Estructura (depende del tamao y caractersticas, espacio que dispone y numero de
personal):
1. reas/ secciones bsicas:
- Seccin de toma de muestras
- Seccin de recepcin y registro de muestras
- Seccin de siembra de muestras
- Seccin de medios de cultivo
- rea de almacn
2. reas/ secciones especializadas:
- Seccin de bacteriologa (se divide en reas => urocultivos, coprocultivos y parsitos,
exudados y anaerobios, hemocultivos)
- Seccin de micobacterias
- Seccin de micologa
- Seccin de antibiticos
- Seccin de serologa o inmuno-microbiologa
- Otras secciones (virologa o biologa molecular)

Normas de seguridad e higiene en el trabajo - tratan de evitar el riesgo
de infeccin al personal que trabaja en el laboratorio as como su extensin a la
comunidad (establecidas por el CDC/ centro de control de la enfermedad) americano y del
instituto nacional de salud de ese pas.

Niveles de seguridad biologa:
Nivel 1 => valido para laboratorios de enseanza que trabajan con microorganismo
no patgenos bien conocidos y patgenos oportunistas:
- las puertas permanecen cerradas mientras se trabaja
- las mesas de trabajo se desinfectan al terminar el trabajo y cuando es necesario
(derrame/contaminacin)
- todo material contaminado debe ser esterilizado antes de desecharlo
- no pipetear aspirando con la boca
- no comer, fumar, aplicarse cosmticos, morder los lpices, bolgrafos o tener alimentos
en el laboratorio.
- lavarse las manos despus de trabajar con microorganismos y al terminar la jornada (uso
de guantes).
- realizar las tcnicas correctamente, evitando la produccin de aerosoles.
- llevar bata durante el trabajo que se quitara al salir del laboratorio.
- los materiales que no pueden ser esterilizados en el propio laboratorio, se transportaran
en contenedores cerrados para el traslado hasta su descontaminacin; debe existir
autoclave para descontaminar en el mismo edificio.
- deben existir programas de desinfeccin y desratizacin
- el diseo del laboratorio debe permitir una fcil limpieza incluso entre los muebles que
deben ser impermeable, resistentes a los cidos, lcalis y al fuego.
- cada laboratorio debe tener un lavabo.
- si las ventanas se pueden abrir, deben estar protegidas con mosquiteros

Nivel 2 => permite el trabajo con microorganismo de peligrosidad potencial
moderada (hospitales o centros de salud a nivel primario); adems de las normas del
nivel 1, comprende las siguientes:
- es obligatorio el uso de bata o pijamas que no deben usarse fuera del laboratorio,
especialmente en el comedor o cafetera o salidas fuera del edificio.
- las tcnicas serolgicas con Ags sin capacidad infectante pueden realizarse en las mesas
de trabajo
- el acceso al laboratorio debe estar limitado.
- se deben utilizar guantes en todas las tcnicas con productos potencialmente peligrosos o
animales.
- en un accidente de exposicin a productos contaminados (derrame, pinchazos),
comunicar inmediatamente al responsable del laboratorio.
- se toma una muestra de suero del personal cuando comienza a trabajar, se archivara
como suero base.
- existir un manual de normas de seguridad en el laboratorio que todo el mundo debe
conocer y donde se exponga lo que debe hacerse ante un accidente.
- se trabajara con cabinas de seguridad de nivel I, II o III cuando se realicen tcnicas que
suponen produccin de aerosoles como centrifugacin, homogenizacin de muestras,
siembra o procesamiento de muestras en general.

Nivel 3 => es adecuado para trabajar con microorganismos de alto riesgo y
comprende las normas de los niveles 1 y 2 y adems:
- todas las actividades con microorganismo o productos potencialmente patgenos se
realizaran en cabinas de seguridad; ningn trabajo se realizara en las mesas de trabajo.
- se utilizaran batas abiertas por la espalda, que no deben llevarse fuera del laboratorio;
utilizar guantes cuando se trabaja con material contaminado o animales que se
desinfectaran antes de desecharlos; en las habitaciones donde se tienen los animales se
utilizaran mascarillas rgidas.
- en el laboratorio no debe haber plantas o animales que no se utilicen en el trabajo.
- el laboratorio debe estar aislado de la circulacin general, existiendo una doble puerta de
entrada con una habitacin para cambiarse de ropa y con ducha.
- las superficies y los muebles deben ser de fcil limpieza; las ventanas deben cerrar
hermticamente; las puertas se cerraran automticamente.
- cerca de las puerta de salida existirn lavabos que pueden accionar con el pie, codo o
rodilla.
- existir un autoclave para descontaminar en el propio laboratorio
- existir un sistema de extraccin de aire con circulacin del mismo de la puerta de
entrada hacia el interior del laboratorio; regulacin de la entrada y salida del aire
acondicionado; el aire de salida de las cabinas de seguridad tipo III saldr directamente al
exterior; el de las cabinas tipo I y II se elimina directamente al exterior o al sistema general
del edificio pasando previamente por filtros de alta eficacia (HEPA).

Nivel 4 => este nivel solo se establece en laboratorios de experimentacin y no en
laboratorios de microbiologa clnica; se necesita este nivel cuando se manejan
microorganismos de altsimo riesgo o que son exticos en ese pas, especialmente
virus.











Tema 2 - El Control de calidad de un laboratorio microbiologa clnica

El control de calidad sirve para:
- Garantizar la fiabilidad de las tcnicas que se realizan en el laboratorio
- Asegurar resultados rpidos y tiles
- Estandarizar las tcnicas e interpretar correctamente los resultados
- Controlar la calidad de las muestras, estableciendo una buena comunicacin con
los clnicos y el personal encargados de obtener muestras
- Aumentar la profesionalidad del personal del laboratorio y la confianza de los clnicos en
los resultados que reciben.

Mtodos y reas de control de calidad
1. Control de calidad de las muestras => se debe controlar desde su obtencin,
transporte y procesamiento hasta la emisin de los resultados siguiendo normas
elaboradas con criterios claros de rechazo y establecer horarios fijos de recepcin de
muestras.
2. Medios de cultivo => deben ser empaquetados correctamente en bolsas cerradas para
evitar la desecacin, almacenados correctamente y etiquetados con la fecha de
caducidad (a 4C dura 8-10 semanas; sin empaquetar a 4C dura 2 semanas; los caldos y
agar en tubo con tapn a 4C - 6 meses); los que estn preparados en el laboratorio,
siguen un control siguiente:
- Control de esterilidad => comprobar con 1 unidad de cada lote (<100) o 3 unidad si es un
gran lote mediante incubacin a 37C durante 24 horas; si se contaminan, debe
rechazarse.
- Control de crecimiento => se inocula un medio de cada lote con un inoculo reducido
microorganismo control (cepas de coleccin) que asegure el crecimiento o con un
inoculo estndar.
- Control de medios con caractersticas selectivas => se inocula con el germen que no debe
crecer en ello.
- Control de las caractersticas bioqumicas => se utiliza un control positivo que produce
la reaccin bioqumica esperada.
3. Reactivos de identificacin => se deben marcar con la fecha del primer uso y la
caducidad.
- Los reactivos de identificacin se deben utilizar siempre con un control positivo y
negativo.
- No deben utilizarse reactivos caducados o cuyo aspecto no sea el adecuado y debe
asegurarse su almacenamiento correcto
- Hay que utilizar siempre el lote o el vial cuya caducidad este mas prxima
4. Cepas control => una coleccin de cepas de ATCC dispone de prcticamente todos los
microorganismo que se utilizan en controles de calidad.
5. Mantenimiento de las cepas control => se mantiene de manera que no pierdan
sus caractersticas tpicas.
6. Control de aparatos => se debe mantener una temperatura ambiente en el
laboratorio entre 23-29C y la humedad entre 30-50 %; al final de jornada se limpian los
superficies con un antisptico (fenol 5% o glutaraldehido)
- Limpieza => las neveras y congeladores se limpian y se
descongelan peridicamente (mnimo 1 vez al ao); las cabinas de seguridad, centrifugas,
agitadores de tubos se limpian todos los das al acabar el trabajo con antisptico fenol 5%;
lasestufas y baos se limpian cada 6 meses.
- Temperatura => un control diario de las estufas, baos, neveras y congeladores antes
de empezar el trabajo; se usa un termmetro para cada aparato colocado en el interior del
mismo
- Atmsfera de incubacin => se controla la cantidad de CO2 de las estufas con un
indicador que suele estar acoplado con sistema de alarma; se controla
la atmsfera anaerobiamediante catalizadores e indicadores de azul de metileno.
- Cabinas de flujo laminar => un cambio peridico de los filtros y un control de las
lmparas ultravioleta.
- Autoclaves => control de esterilizacin (fsico del aparato, qumico - tiras y biolgico -
esporas)
- Microscopios => se limpian con suavidad al terminar la jornada, taparlos con su funda;
se limpian cada semana los objetivos con alcohol-eter 50%; se realiza peridicamente un
ajuste de condensadores y objetivos.



Tema 3 - Tcnicas de descontaminacin, desinfeccin y esterilizacin

En todo laboratorio de microbiologa se debe tener en cuenta:
- todo material para la recogida de muestra debe estar esterilizado
- todo material para la realizacin de las pruebas debe estar estril
- antes de cualquier esterilizacin, el material debe estar limpio y/o desinfectado
- conviene utilizar material desechable
- el material de uso asptico debe guardarse separadamente del uso sptico
- la limpieza de residuos en el suelo, mesas de trabajo y cualquier superficie se realiza
mediante desinfeccin peridica
- destreza y formacin por parte del personal sanitario de laboratorio (deben trabajar en
condiciones de total asepsia)
- la manipulacin de todo material debe seguir el protocolo de trabajo con medidas
cautelares para la prevencin de accidentes laborales.

Fases de la manipulacin del material del laboratorio
- Material desechable (jeringas, guantes, lancetas) => se utiliza una sola vez y se
desecha o se destruye; material punzante o cortante se desecha en recipientes resistentes a
la puncin; si no es punzante, se auto-clavar y se tirar en contenedores especiales.
- Material reutilizable (de vidrio, de metal, batas, gorro de tela) despus de
su utilizacin se limpia, se desinfecta o se esteriliza (segn los casos)
- Todo instrumento se limpia inmediatamente despus de utilizar (segn el protocolo de
cada caso), despus se desinfecta o se esteriliza directamente para destruir cualquier forma
de vida incluidas formas de resistencia o esporas.
- Materiales no esterilizados (pero si se desinfecta - destruir toda forma de
vida patgena) que se pueden utilizar => portaobjetos para la tincin, frascos lavadores
con agua destilada, frasco de colorantes, etc.

Principios bsicos de descontaminacin - concepto de
limpieza, desinfeccin y esterilizacin
- Limpieza => se separa el material entre los de uso asptico y sptico, se limpia; los
instrumentos se limpian primero con agua fra (la sangre se adhieren con
calor), despus con agua caliente y jabn frotando en los ngulos, se enjuaga y se volver a
aclarar con agua destilada; se seca y se comprueba su estado; se protege si es necesario.
- Desinfeccin => materiales o superficies inertes (suelo, mesa), se utilizan
metodos qumicos (detergentes, hipocloritos, etc.); desinfeccin de manos, piel y mucosas
corresponde a tcnicas de antisepsia (se aplica tpicamente antispticos).
- Esterilizacin => se usa para la reutilizacin de cualquier material.

Tcnicas de descontaminacin fsica
A. Tratamientos trmicos por calor seco y hmedo - consisten en
la esterilizacin o desinfeccin de los grmenes por aplicacin de calor seco o hmedo.

1. Descontaminacin por calor seco (depende de la temperatura, se consigue o no
la esterilizacin)
- Flameado => exponer un objeto a la llama de un mechero durante un tiempo segn el
material de que se trate (p.ej. la asa de siembra)
- Incineracin => se usa un horno crematorio para destruir material
desechables(jeringas, catteres)
- Horno seco => estufas de Pasteur o Poupinel (hornos metlicos de doble pared y
bandejas ajustables) mediante resistencias elctricas, esterilizan durante 2 horas a 180 o
3horas y media a 160C; tienen termmetro externo que mide la temperatura en el interior
y un selector de temperatura y un reloj;

2. Descontaminacin por calor hmedo
- Ebullicin => se utiliza poco porque no es fiable; introducir el material en agua
hirviendo (100C) durante 10 minutos como mnimo; no es
un mtodo de esterilizacin (no destruyen esporas)
- Autoclave => un recipiente cilndrico que se cierra hermticamente; externamente lleva
un manmetro que registra la presin en el interior cuando esta en marcha; presenta
una vlvula de seguridad que se abrir espontneamente cuando la presin interna supere
la elegida o resulte peligrosa, una llave de purga que permite la salida de vapor y un reloj
que selecciona el tiempo deseado con alarma que indica el final del proceso; interiormente
hay una rejilla que se coloca por encima de una resistencia elctrica cubierta por agua
destilada; es muy utilizado y se conseguir esterilizacin si sometemos el autoclave a
1 atmsfera durante 20 minutos (120C); en el se puede esterilizar => material metlico,
cristal, torundas, compresas, paos, batas, plsticos y gomas reutilizables; el
inconveniente=> con el tiempo los objetos metlicos se oxidan.
Tcnica => con autoclave apagado y abierto, aadimos agua destilada hasta la rejilla, sin
cubrirla (para que el material que deseamos esterilizar no contacte directamente con el
agua); las piezas pequeas se colocan en cestas/ cajas; se cierra la tapa y se ajusta
a presin; se abrir la llave de purga para que permita la salida de vapor y se ajustara
la presin deseada para la esterilizacin y el tiempo (1 atmsfera - 20 minutos);
se pondr en marcha el aparato y se espera hasta que salga vapor por la llave de purga; se
cerrara la llave de purga y la presin comenzara a subir hasta llegar al nivel programado; a
partir de aqu comenzara a contar el tiempo de esterilizacin; una vez realizada
la esterilizacin se apagara el interruptor del autoclave y se esperara a que
el manmetro baje a 0; cuando la presin este a 0, abriremos la llave de purga para que
salga gran parte del vapor que todava se encuentra contenido; esto se realizara con
cuidado para evitar descompresiones bruscas que podran originar la apertura de aquellos
recipientes tapados con algodn graso; una ves comprobado la salida de vapor, se abre la
tapa del autoclave y se extrae el material.
- Tyndalizacin => mtodo de esterilizaciones consecutivas (repetidas en 3-4 das hasta
que se elimine el germen contaminante); se utiliza cuando existe
una contaminacin de algn material o en el propio autoclave; tericamente no se deben
alcanzar temperatura >100C y no se debe abrir el aparato o recipiente que se somete a
tyndalizacin; objetivo => destruir las esporas cuando germinan y evitar contaminaciones
por microorganismos resistentes.
- Vapor fluente => utilizar el autoclave siguiendo la tcnica habitual, pero la llave de
purga abierta, lo que impedir que se produzca presin y la temperatura nunca sea >
100C; es utilizado para materiales o medios que no deban soportar temperaturas
>100C (p.ej. medios muy azucarados, para evitar su caramelizacin); es poco usado en
microbiologa.
- Uperizacin => mtodo muy utilizado en la industria alimentaria (tratar el medio a una
temperatura de 149-150C durante unos instantes (1-5 segundos). No se alteran las
propiedades del medio y produce esterilizacin.
- Pasteurizacin => no es un mtodo de esterilizacin y es utilizado en la industria
alimentaria (calentar el medio a temperaturas entre 62C (15 minutos) y 72C (30
minutos); no destruye las formas de resistencia.

Tratamientos a temperatura ambiente

1. Radiaciones ionizantes - las utilizadas en microbiologa son:
- Rayos ultravioletas => para mantener la esterilidad de superficies y recintos; tienen
poca penetracin; acta impidiendo y alterando la duplicacin del ADN celular; se debe
evitar su presencia en la piel;


- Rayos gamma => para conseguir esterilizacin en fri, producidos por isotopos
radiactivos; presentan un poder de penetracin muy alto, constituyendo
el mtodo de esterilizacin mas utilizado a nivel industrial (materiales de uso nico o
desechable p.ej. guantes, jeringas, catteres, prtesis, vlvulas y que pudiera alterarse por
calor)
2. Sistemas de filtracin (filtrar a las estructuras que sobrepasen un determinado
tamao, segn el tipo de filtro; la efectividad del filtro es proporcional al tamao del poro,
pudiendo conseguirse esterilizacin); presencia de presin, vaci y la carga del filtro (+);
las bacterias en medios neutros son (-).
- Filtros de membrana => filtros de celulosa muy purificada y con un tamao de poro
fino o muy fino; existe desde sistemas sencillos hasta sistemas de piezas desmontables que
llevan acoplada una bomba de vaci para ejercer succin sobre el medio a filtrar.


- Filtros de vidrio poroso o de fibra de vidrio => se utilizan en casos especficos y
tienen mas resistencia que los anteriores.


- Filtros de Chamberland => son de porcelana porosa, mas caros que los anteriores y
menos utilizados.


- Filtros de flujo laminar => dispositivos de filtrado donde entra aire contaminado y
sale estril; utilizados como mecanismo de esterilizacin en campanas de flujo laminar, en
quirfanos y recinto que pretende crear o mantener un ambiente estril; flujo => vertical u
horizontal.


- Ultrasonidos => introducir el material en tanques de distintos tamaos con liquido
desinfectante; una vez puesto en marcha el dispositivo, comienza a vibrar a gran velocidad
originando pequesimas burbujas que entran en todos los recodos del material
consiguiendo eliminar los microorganismos; es poco utilizado, caro y poco prctico.



Tcnicas de descontaminacin qumica
1. Mtodos qumicos de desinfeccin (desinfectantes que se aplica sobre objetos y
superficies y antispticos que se aplica sobre la piel y mucosas); condiciones que cumplir
en un buen mtodo de desinfeccin:
- matar el mayor numero de grmenes o al menos todos los patgenos
- ser econmico
- no ser corrosivo, toxico ni irritante para los tejidos
- se deber diluir al menos en agua
- tener un olor agradable



Los ms utilizados:
- Detergentes catinicos => diluidos al 1% para desinfeccin de manos; mas frecuente
para limpieza y desinfeccin de paredes, suelos, ropa y objetos (sin diluir)
- Clorofenoles => muy eficaces y se asocian con los detergentes catinicos para mejorar
el grado de desinfeccin.
- Compuestos clorados => para desinfeccin de superficies, ropas, urinarios; se suelen
usar diluidos en agua (lejias /hipocloritos)
- Acido fenico => diluido al 5% para la limpiar objetos y superficies.
-Amoniaco
Los antispticos mas utilizados:
- Alcoholes => limpiar y desinfectar la piel, las manos (etanol), el filo de instrumental y
superficies pequeas (metanol) que no tiene contacto con la piel (p.ej. alcohol
isopropilico70%)
- Mercurio-cromo => contiene mercurio y un buen desinfectante para heridas
superficiales (las mantiene secas y protegidas)
- Derivados yodados => para preparar la piel antes de una intervencin quirrgica, en
la puncin lumbar, antes de puncin para hemocultivo, etc.; son efectivos y ejercen
su accin por oxidacin (p.ej. betadine, ibetane)

Mtodos qumicos de esterilizacin - los mas empleados son "Oxido de
etileno" => en forma de gas (10C) mezclado con CO2, ya que puro es muy oxidante
y podra explosionar al mezclarse con O2; presenta un gran poder de penetracin y es muy
efectivo y duradero; la esterilizacin se produce a => temperaturas bajas (40C) con
humedad relativa alta (40-60%) durante un tiempo de 3-8 horas (media de 5); se
requiere cmaras o instalaciones especificas para ello, son muy caras; el oxido de etileno se
aplica a cualquier material sensible al calor y que no pueda esterilizarse por otros mtodos
(p.ej. endoscopia, plsticos termo-lbiles, cauchos, material elctrico); el material est listo
para ser utilizado a las 48 horas despus de la esterilizacin; deber conservarse estril en
el interior de una bolsa de plstico cerrada por procedimientos termoelctricos y dura 6
meses.

Control de esterilizacin - permiten comprobar la eficacia del proceso de esterilizacin
1. controles de esterilizacin de tipo fsico => incluidos en el aparato de
esterilizacin (manmetros - miden presin; vacuo-metros - miden el vaci en el
interior; termmetros, grficos que registran los valores parmetros mas significativos del
proceso: temperatura, humedad, presin, vaci, tiempo etc.)
2. controles de tipo qumico - comercializados en forma de cinta adhesiva, como
indicadores del proceso de esterilizacin (por encima de la temperatura determinada
cambian de color), fundamentalmente para el control trmico.
3. sistemas de tipo biolgico - comercializados en forma de capsulas cerradas en cuyo
interior hay esporas de resistencia a la esterilizacin conocida; dichas ampollas, tras haber
sido sometidas a condiciones de esterilizacin, se incuban a 56C (Bacillus strearat-
haemophilus) o a 40C (Bacillus subtilis); a cabo de 24-48 horas, se procede a su lectura
donde la germinacin y cambio de color indicara si se han producido condiciones de
esterilizacin.


Tema 4 - Toma de muestras (recogida, manejo y tratamiento)

Seleccin de la muestra para tener significacin diagnostica - representativa del
proceso patolgico y cantidad suficiente (p.ej. no es relevante un esputo poco purulento y
contaminado por saliva); recipiente estril adecuado (para un pus de un absceso =>
anaerobio, estriles);

Procedimiento para la toma de muestras:
- La toma de muestras debe realizarse antes de iniciar el tratamiento ATB (al menos
informar al laboratorio de ATB que est recibiendo)
- Es muy importante seguir las normas necesarias para evitar la contaminacin externa de
las muestras (descontaminar la piel, evitar reas con flora normal, medio de
cultivo especficos para el patgeno sospechoso)
- La extraccin o recogida de las muestras se debe realizarse en el estado adecuado de la
enfermedad (durante la fase aguda o diarreica)
- La cantidad recogida debe ser suficiente y es fundamental que se utilice un
recipiente estril y que se envi a laboratorio lo ms pronto posible.

Extraccin de sangre para hemocultivos (septicemia)
La tcnica de extraccin (se hace en un pico febril > 38,5C /antes de la toma de
la siguiente dosis de ATB) => smarch en el antebrazo, escoger la vena antes de
la desinfeccin (alcohol 70 o clorhexidina alcohlica un rea de 5cm - frotando
rigurosamente), yodo-povidona 2% desde el centro hacia afuera en el circulo, dejar secar 1
minuto, ponerse guantes estriles, realiza la extraccin , cambiar la aguja antes de inyectar
la sangre en las botellas de cultivo, desinfectar otra vez la piel con alcohol (sensibilidad al
yodo), remitir las botellas de hemocultivos inoculadas inmediatamente; se recomienda 3
muestras de 10 ml (cada extraccin para 2 botellas (aerobios y anaerobios) en 24 horas con
intervalo de >1 hora (al menos 2-3 extracciones separadas 30 minutes en 24 horas) en
sitios diferentespara dilucidar un posible contaminante de la piel; en nios es suficiente
extraer 1-5 ml mximo cada extraccin; pacientes con tubuladora intravenosa/ catter, se
toma en la va mas abajo; se extrae lo ms limpio posible para no incluir bacterias
saprofitas de la piel; los frascos se marcan con etiqueta del paciente, numero de cama y
hora de extraccin.

Recogida de LCR (el procesamiento inmediato/ urgente) => se recoge insertando
un agua, de forma asptica, en el espacio subaracnoideo a nivel lumbar, se recoge en 3-4
tubos estriles con tapa de rosca (tubo 3 o 4 => recuento celular, 1 y
2 =>microbiolgicos y bioqumicos; si solo se llena 1 tubo => microbiologa retirara
de forma asptica la cantidad necesaria, el resto => citolgicos y bioqumicos; el volumen
de muestra es importante (10 ml) para la deteccin (ej. M. tuberculosis y C. neoformans);
no se deben refrigerar (temperatura ambiente o estufa a 37) excepto para estudios virales
se pueden refrigerarse hasta 24 horas o congelarse a -70C si hay una mayor demora; la
muestra bacteriana => turbio (meningococo dentro de leucocitos), virales => transparente;

Recogida de otros lquidos estriles - la aspiracin percutnea de liquido sinovial,
pleural, pericrdico y peritoneal se hace de forma asptica y se inyecta inmediatamente en
un frasco o tubo esterilizadas (transporte anaerobio), antes, se expulsar las burbujas de
aire de la jeringa; se puede aadir una pequea cantidad de heparina para evitar la
coagulacin.

Recogida de muestras del tracto respiratorio superior:
- Exudado farngeo => se realiza mediante una torunda de algodn, dacrn o alginato
de calcio frotando vigorosamente ambas reas amigdalinas, la faringe posterior y las zonas
de inflamacin, ulceracin, exudacin o formacin de capsulas; la lengua se oprime con un
depresor para reducir al mnimo la contaminacin del hisopo con secreciones bucales.
- Exudado nasal => se realiza introduciendo un hisopo profundamente en cada fosa
nasal y rotando suavemente.
Tracto respiratorio inferior - el esputo es una muestra menos relevante por la
posibilidad de la contaminacin por saliva; una buena muestra => instruir
debidamente al paciente para lograr una expectoracin profunda (ayudarle con fisioterapia
respiratoria/ clapping, hidratacin o nebulizacin); pacientes con traqueotomas => se
recoge aspirando(en un frasco de Lukens); las secreciones bronquiales se recoge
mediante broncoscopio, instilando una pequea cantidad de SF estril en
el rbol bronquial (tambin puede estar contaminado por flora del tracto superior, aunque
es ms relevante que esputo); una muestra ms profunda se recoge mediante broncoscopio
con lavado bronco-alveolar (BAL) para buscar Pneumocistis carinii y hongos; cepillado
bronquial es una tcnica mas agresiva en caso de neumonas por aspiracin; muestras de
bacterias anaerobias se recoge por una puncin transtorcica, biopsia transbronquial y
pulmonar abierta.

Recogida de heces (se procesa lo antes posible):
- Toma de muestras para coprocultivo - se recoge con un escobilln que se
introduce en un tubo estril preparado con un medio de transporte adecuado (Cary y
Blair) (tubo con una cuchara y liquido rojo/transparente; tambin se puede utilizar frasco
de orina estril; medio Cary y Blalir mantiene la viabilidad de los patgenos intestinales);
basta con impregnar la torunda en las heces en la parte donde se observa sangre, moco o
pus;
- Muestras para estudio parasitolgico - se recoge durante 3 das consecutivos, se
guardan en la nevera en un recipientes cerrados para evitar la desecacin (temperatura 3-
5C); los huevos, las larvas y los quistes de protozoos permanecen viables varios das; la
cantidad de muestra es pequea (1 cucharilla de caf en un frasco con alcohol polivinilico
/PVA 1:3); para investigar oxiuros (parsitos) se utiliza preparacin con cita de celofn; se
proporcionan al paciente 6 portaobjetos (se toma durante 6 das consecutivos) con cinta
adhesiva transparente; se toma la muestra a primera hora de la maana antes de lavarse;
se aplica la cinta sobre los mrgenes del ano con una suave presin, se retira y se coloca de
en el porta;

Recogida de orina - el frasco estril no debe abrirse antes de la recogida; las partes
genitales se lava solo con agua; se recoge a primera hora de maana para
estudio microbiolgico, de forma asptica, se echa el primer chorro, se recoge la segunda
mitad unos 20-30 ml.
Sondaje vesical (puncin de sonda) y puncin suprapubica - se realiza por el personal de
enfermera

Recogida de muestra de tracto genital - se utiliza un tubo
con escobilln de algodn como medio de transporte; exudado uretral => el hisopo se
introduce 2 cm dentro de la uretra y se rota suavemente antes de retirarlo (muestras
separadas para el cultivo de gonococos y clamidias o ureaplasmas => se utiliza 2
escobillones, 1 para estudio de gonococos 2 para clamidias o ureaplasmas); exudado
cervical => se inserta un hisopo especial (como uretral) en el canal cervical y rotando-
lo y moviendo-lo durante 30" antes de retirar; exudado vaginal => el hisopo se sumerge en
el fornix posterior de la vagina; para aislamiento de gonococos pueden ser transportados
en el medio de Stuart modificado o en el medio de Amies con carbn en
temperatura ambiente, hasta su inoculacin; para aislamiento de clamidias y
micoplasmas, el medio es tampn con sacarosa y ATB; se puede refrigerar si hay
demora en el proceso.

Procedimiento para muestras en anaerobiosis - se obtiene mejor con una jeringa y aguja, a
los que debe expulsarse todo el aire.

Transporte de muestras:
- Mtodos convencionales => el ms utilizado es hisopos en tubos de plstico que
llevan incorporados diversos medios de transporte que consiste en un agar semi-solido, pH
regulado, carece de nutrientes, pero contiene tioglicolato de sodio como reductor, para
prolongar la viabilidad de los microorganismos cuando exista demora entre la recogida y
su cultivo; los ms utilizados => (1) Medio de Stuart (los exudados farngeos,
conjuntivales, nasales y heridas) que mantiene un pH favorable e impide
la deshidratacin de las secreciones durante el transporte y
la oxidacin y autodestruccin enzimtica de los patgenos presentes (2)Medio de
CaryBlair (muestras fecales) donde las salmonellas y las shigelas pueden recuperarse hasta
49 das despus de la toma de muestras y Vibrio cholerae hasta 22 das despus.

- Transporte de muestras para estudio en anaerobiosis => cuando la muestra se
va a procesar dentro de 30 minutos, puede servir como transporte una jeringa con una
aguja insertada en un tapn de goma; si la demora va a ser mayor, se usa un tubo /frasco
ampolla lleno de CO2 y libre de O2 con N2/ H2 con indicador en agar o caldo; la muestra
liquido se inyecta a travs del tapn de goma despus de expulsar el aire de la jeringa y
aguja; existe tambin un hisopo en un tubo anaerobiosis

Envi de muestras (las medidas especiales para un envi por correo a un laboratorio de
referencia):
- Muestras que contengan virus deben ser refrigeradas inmediatamente y enviarse en una
caja con unidades comerciales refrigerantes
- La sangre no se enva entera, se separa el suero y se enva en un tubo estril
- La muestra <de 50 ml debe ser envasado en un recipiente hermtico irrompible con
espacio suficiente entre ambos para retener en caso de rotura; el envase se coloca dentro
de otro envase para el envi; el envase externo se identifica con un rotulo rojo y blanco
para Agentes biolgicos /Material bio-medico.

Manejo inicial de las muestras en el laboratorio - la mayor parte de las muestras
para estudio bacteriolgico que vayan a demorarse en su procesamiento deben mantenerse
en la nevera a excepcin de LCR; los fragmentos de pelos o raspados de piel y uas para el
aislamiento de hongos pueden ser mantenidos a temperatura ambiente durante
varios das antes de ser inoculados (protegidos del polvo).







Tema 5 - Procesamiento de las muestras en microbiologa clnica
(protocolos de siembra)

Normas bsicas generales (antes de proceder al procesamiento de la muestra):
1. Volante de peticin debe estar bien cumplimentada (filiacin y datos administrativos del
paciente, datos clnicos, datos de la
muestra, teraputica seguida, determinacin solicitada)
2. Tener constancia de que la obtencin de la muestra ha sido realizada correctamente,
siguiendo las normas y criterios establecidos por el laboratorio, as como su recogida,
transporte y conservacin.
3. La siembra de dicha muestra se har en los medios idneos para cada caso, bien en
placa, por agotamiento y/o mtodo cuantitativo, o bien en tubo.

Procesamiento de las muestras
1. Orinas (debe llegar al laboratorio en contenedor estril y ha de conservarse a 4C en
menos de 24 horas)

[a] Agar sangre, chocolate o Cled/Cystine-Lactose-Electrolyte-
Deficient (medios general y especifico para orinas): se siembra en 3 direcciones/
cubrir totalmente la superficie (cuantitativa en Cled o AS( -) para contar colonias; realizar
antibiograma); crecern todo tipo de grmenes: cocos Gram(+), bacilos Gram (-
),levaduras; en Cled/AS no crecen cocos Gram(-) (Neisseria, Moraxella,
Chlamydia); en AS se comprueba las caractersticas hemolticas o no de las bacterias
ej. Stafilococcus aureus (B hemoltico) y en Cled, las caracterstica lactosa (+) =>
amarillas o lactosa (-) sin cambio de color => azul verdosas.

[b] Agar MacConkey (selectivo para bacilos Gram(-) => se siembra por
agotamiento en cuadrantes (puede ponerse un disco de Colistina en el inoculo para
ayudar a la identificacin de E.coli (sensible a colistina - comn en orinas);
crecen bacilos Gram(-): Enterobacterias y tambin Pseudomonas;
observaremos las caractersticas de lactosa (+) => colonias rojas y lactosa (-) sin cambio de
color => rosa.

[c] Agar Citrato de Simmons (solo en algunos protocolos); se siembra en
la lengeta del tubo preparado en pico de flauta; las colonias consumidoras de
citrato (+): vira a azul y las que no, permanece verde; se usa para la diferenciacin de
Enterobacterias (para diferenciar entre coliformes y coliformes fecales. Los
coliformes fecales no fueron capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono ni a
las sales de amonio como fuente de nitrgeno. Los coliformes no
fecales como Enterobacter aerogenes o Salmonella enteritidis podan utilizar el
citrato en este medio dando una reaccin alcalina) en base a su capacidad de utilizar el
citrato (mediante citrato permeasa)


Los grmenes mas frecuentes que podemos encontrar (en orina se
identifican especies):
- E. coli (el ms frecuente) => bacilo Gram(-), mvil, sensible a Colistina, lactosa (+),
indol (+)
- Streptococcus faecalis => coco Gram(+), catalasa (-), oxidasa (-).
- Proteus spp (todas) => bacilo mvil Gram(-), resistente a Colistina, lactosa (-), oxidasa
(-), Triptfano Desaminasa/TDA (+), ureasa (+) tardo.
- Stafilococcus aureus => coco Gram(+), catalasa (+), coagulasa (+), B hemoltico,
oxidasa(-).
- Candidas spp (todas) => morfologa de levaduras (parece como hemates)
- Klebsiella spp : bacilo Gram(-), inmvil, sensible a Colistina, ureasa (+), colonias
mucosas, lactosa (+), tardo.
- Pseudomonas spp : bacilo Gram(-), mvil, sensible a Colistina, lactosa (-), oxidasa (+)

2. Coprocultivos (contenedor especifico para coprocultivo "Cary y Blair" / bote de orina;
conservada a 4C, procurar procesarla en <24H; se siembran por agotamiento en
cuadrantes).

[a] Hecktoen o SS => medios selectivos y diferenciales donde crecern el genero
Salmonella y Shigella; en Hecktoen las Salmonellas spp => colonias lactosas (-),
verdosas y pueden ser SH2/sulfihidrogeno/ acido sulfidrico (+) con fondo negro, son
bacilos mviles, sensible a Colistina; las Shigellas spp: lactosas (-), SH2(-),
bacilos inmviles en fresco y sensibles a Colistina; las colonias lactosas (+) en este medio
sern amarillas; en SS las Salmonellas y Shigella sern el del medio (caramelo)
y tambin con el fondo negro (Salmonellas SH+ y lactosa (- ); colonias lactosa (+) =>
rojizas; las colonias lactosas+ no son patgenas (coliformes fecales) y no se investigan.

[b] Agar Yersinia CIN => para buscar colonias de Yersinia spp (rosa clarito -
Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica y Yersinia pseudotuberculosis.) que aparece
como lactosa (+),sensible a Colistina y bacilos Gram- e mviles, fermentador de
manitol. La inhibicin selectiva de organismos gram negativos y gram positivos se
obtiene mediante cristal violeta (inhibidor de Gram+), desoxicolato sdico (inhibidor de
Gam+) y los agentes antimicrobianos: cefsulodina, Irgasan (Triclosan) y novobiocina
(inhibidor de S. epidermidis).
[c] Agar Campylosel: crecer Campylobacter
spp (bacilos Gram(-) con flagelos) como colonias pequeas
translucidas, sensibles a Nalidixico (especies C.
coli y C.jejuni) resistente a Nalidixico el C. fetus, en fresco aparecen en coma/en S, ureasa
(+) oxidasa (+) catalasa (+); al hacer la prueba del hipurato C. jejuni sern (+) y C.coli (-)
; P. hipurato: un procedimiento cualitativo para determinar la capacidad de las bacterias
de hidrolizar enzimticamente (hipuricasa) el hipurato sdico que da lugar a acido
benzoico y glicina un compuesto de color morado.



[d] Caldo Selenito => caldo enriquecido para los gneros Salmonella y Shigella. el
selenito de sodio inhibe la flora Gram(+) y la mayora de la flora
entrica excepto Salmonella spp.


[e] Agar McConkey (solo en algunos protocolos) => los coliformes aparecern como
colonias rojas por ser lactosas (+); no es necesario???

[f] Agar TCBS /tiosulfato citrato bilis sacarosa (detectar Vibrio cholerae):
aparecen colonias de color amarillo sacarosa (+), oxidasa (+) y son bacilos Gram(-)
pleomrficos; el extracto de levadura y la peptona proporcionan el nitrgeno y las
vitaminas. El citrato sdico, el tiosulfato sdico, la bilis de buey y un pH alcalino fuerte
inhiben los organismos Gram(+) y suprimir los coliformes (inhibidor para la mayora de
las entero-bacterias), favoreciendo el crecimiento de Vibrio cholerae porque este
organismo es sensible a los entornos cidos. La alta concentracin de sodio favorece el
crecimiento de Vibrio cholerae que es halotolerante (tolera el medio salado) y de otras
especies de Vibrio, cuya mayora es haloflica. La sacarosa(+) es un carbohidrato
fermentable, y el cloruro sdico estimula el crecimiento. El tiosulfato sdico es una fuente
de azufre y acta con el citrato frrico como indicador para detectar la produccin de cido
sulfhdrico/SH2. El azul de bromotimol y el azul de timol son indicadores de pH. En Mc,
Vibrio Cholerae es lactosa (-).


3. Exudados vaginal y uretral (la muestra llegara en uno o varios escobillones; se
siembra por agotamiento en cuadrantes).

[a] Agar Sangre (medio general): buscamos Streptococcus B hemoliticos del grupo B
(S.agalactiae), que aparecern como colonias pequeas translucidas con un halo de B
hemlisis alrededor de la colonia; son cocos Gram(+), catalasa y oxidasa (-), anaerobio
facultativo, prueba de ltex (+)
[b] Agar chocolate => buscamos Haemophilus spp como colonias muy pequeas
grisceas que crecen bien por ser grmenes exigentes en su crecimiento que requieren
factor X y/o V (proceden de la degradacin de la Hb); tambin podemos colocar discos de
factor X y/o V y mirar el satelitismo; al fresco como coco-bacilos inmviles, Gram-; oxidasa
y catalasa variable.
[c] Agar Thayer Martin o New York => buscamos N. gonorrhoeae o N.
meningitis que aparecern como colonias de color gris; son diplococos Gram-, catalasa (+),
oxidasa (+) que fermentan la glucosa pero no el resto de los azucares.
[d] Agar Gardnerella => buscamos Gardnerella vaginalis, como colonias B-
hemolticas y al fresco como bacilo pequeo, Gram variable, anaerobio facultativo, oxidasa
(-) y catalasa (-). La presencia de sangre humana favorece el crecimiento de las especies
estudiadas, ya que producen -hemlisis alrededor de las colonias. La -hemlisis en agar
con sangre humana es altamente indicativa de presencia de G. vaginalis. Los antibiticos
incluidos en el medio inhiben la mayora de los contaminantes Gram(-) y de las levaduras.


[e] Vagicult o Roiron (medio liquido) => crecen levaduras (Candidas spp) y
Trichomonas (protozoo unicelular flagelado).


[f] Agar Sabouraud (se puede incluir para detectar Candidas spp)

[g] Medio de deteccin de Micoplasmas y Chlamydias






4. Semen - la muestra llegara en contenedor estril/ bote de orina; se siembra por
agotamiento en cuadrante en medios: Cled, McConkey , Agar Sangre, Agar chocolate,
Thayer Martin o New York, Roiron, y cultivo de Clamydias, buscando en cada caso los
mismos grmenes que en el caso del exudado vaginal.

5. Esputo - la muestra ha de llegar en contenedor estril y conservarse menos de 24H a
4C; antes de sembrar se observa por el microscopio si la muestra es vlida/ no est
contaminada por saliva; se siembra por agotamiento en cuadrantes; solo se siembra
cuando en el Gram, el cociente leucocitos/ celulas epiteliales sea > 2,5 (recuento en
fresco/al microscopio); si es < a 1,5 es dudoso. Cuando sean muestras de UCI o
provenientes de neumonas se siembran siempre.

[a] Agar Sangre: buscamos colonias de Streptococcus pneumoniae o
Branhamella catharralis; S.pneumoniae >> colonias verdosas (alfa hemlisis) y al
fresco como coco Gram(+), catalasa (-), sensible a la Optoquina; Branhamella catarralis >>
colonias blanco-grisceas y al fresco como cocos Gram(-), oxidasa (+), catalasa (+) que no
utiliza ningn azcar (no es fermentadora), pero reduce los nitratos a nitritos/ nitratasa(+)
(lo que le diferencia del genero Neisseria que adems es fermentadora de glucosa y
maltosa).

[b] Agar chocolate: buscamos Haemophilus spp. como colonias puntiformes
translucidas, que al fresco como coco-bacilos, Gram(-), catalasa y oxidasa variable; agar
chocolate polyvitex (contiene factor V/ NAD y factor X /hemina procedente de la
degradacin de Hb)
[c] Agar McConkey : donde creceran Enterobacterias y otros bacilos Gram(-).

[d] Medio de Lowestein-Jensen (o Coletsos) => para rescatar Mycobacterium
tuberculosis, bacilos acido alcohol resistente (Zhiel Neelsen+) de crecimiento muy lento;
los niveles bajos de la penicilina y el cido nalidxico tambin estn presentes en el medio
de LJ para inhibir el crecimiento de lo Gram+ y Gram-, con el fin de limitar el crecimiento
de especies de micobacterias solamente. Presencia de verde malaquita en el medio inhibe
las floras mayora acompaante; que se desinfecta y se solidifica mediante un proceso de
espesamiento; el Glicerol mejora el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis.

[e] Medio Legionella => muestras de UCI; la Legionella pneumophila es bacilo
Gram-(en realidad, se tie muy mal, aerobio exigente, movil; en general, no fermenta ni
oxida los azucares, sino que utiliza los aminoacidos; es hipurato(+) un procedimiento
cualitativo para determinar la capacidad de las bacterias de hidrolizar enzimticamente
(hipuricasa) el hipurato sdico; necesita L-cisteina para crecer y tambin iones frricos
Fe. La inhibicin del crecimiento de las bacterias Gram+, la mayora de las bacterias
Gram(-), levaduras y mohos, a travs de una combinacin optimizada de 3
antibiticos. Las colonias que crecen en medio Agar Legionella y no crecen en medio AS
deben considerarse, con alta probabilidad, colonias de Legionella.

6. Cepillado bronquial (la muestra vendr en el cepillo y se conservara a 4C < de
24H);se siembra en los mismos medios que en el caso anterior (esputo) aadiendo
adems: agar sangre anaerobios (ASA) o medio AKV (agar sangre kanamicina-
vancomicina), selectivopara bacilos Gram(-) anaerobios y Bacteroides (bacilo Gram(-),
anaerobio estricto).
7. Exudado faringeo y oral (la muestra viene en torunda, se sembrara por
agotamiento en cuadrante).
[a] Agar sangre => crecer todo tipo de grmenes (medio general enriquecido)
[b] Agar chocolate => crecera todo tipo de grmenes
[c] Agar Mac Conkey => creceran las Enterobacterias y otros bacilos Gram(-) poco
exigentes.
[d] Agar CNA /agar sangre (de cordero) colistina nalidixico, medio selectivo para
Gram+/ inhibe los Gram(-): para deteccin de Streptococcus B-hemoliticos,
Enterococcus y Staphylococcus??
[e] Agar Sabouraud (solo en orales): deteccin de Candidas spp.

8. Exudados varios - abscesos heridas ... (se sembrara por agotamiento en cuadrantes.
La muestra ha de llegar en tubo estril y se conservara a 4C menos de 24H.
[a] Agar sangre => crecer todo tipo de grmenes
[b] Agar chocolate => idem
[c] Agar Mac Conkey => crecern las Entero-bacterias y otros bacilos Gram (-) poco
exigentes.
[d] Agar CNA /agar sangre (de cordero) colistina nalidixico, medio selectivo para
Gram+/ inhibidor Gram(-) crecern bien los Steptococcus B-hemolticos.
[e] Agar ANA (agar sangre anaerobios/ASA, aunque tambin puede utilizarse agar AKV,
agar sangre kanamicina y vancomicina) => medios selectivos para bacilos Gram(-)
anaerobios (estrictos) y Bacteroides.
[f] Caldo Tioglicolato => crecen bien todo tipo de bacterias aerobias o anaerobias;
permite el desarrollo de una amplia variedad de microorganismos, incluidos los
nutricional-mente exigentes. Adems, se observa que las bacterias estrictamente aerobias,
crecen en la parte superior, mientras que las anaerobias facultativas o anaerobias estrictas
crecen en las profundidades del medio.


RELACION DE LAS BACTERIAS CON EL OXIGENO EN TIOGLICOLATO
En base a la relacin de las bacterias con el oxgeno, estas se pueden clasificar en :
1. Aerobio estricto: Un organismo el cual requiere utilizar el oxgeno como aceptador
terminal de electrones , puede tolerar un nivel del oxgeno equivalente o mayor de una
atmsfera de aire (oxgeno del 21%), y tiene un tipo terminantemente respiratorio de
metabolismo (Mycobacterium tuberculosis, Bacillus).
2. Anaerobio o Aerobio facultativo: Un organismo que puede crecer bien en
ausencia del oxgeno y en la presencia de un nivel de oxgeno equivalente a una atmsfera
del aire (oxgeno de 21%) => Enterobacterias, Vibrio spp, Haemophilus spp..
3. Microaeroflico (anaerobio aerotolerante): Un organismo que es capaz de un
crecimiento oxgeno-dependiente, pero no puede crecer en la presencia de un nivel del
oxgeno equivalente a una atmsfera de aire (oxgeno de <21%) => Campylobacter
fetus, Pseudomonas y Neisseria.
4. Anaerobio estricto: Un organismo que es incapaz de crecimiento oxgeno-
dependiente y no puede crecer en la presencia de una concentracin de oxgeno
equivalente a una atmsfera de aire (oxgeno de 21% - nada de O2). (Clostridium
botulinum).

5. Anaerobios aero-tolerantes: Pueden crecer con o sin oxgeno
pero su metabolismo es siempre fermentativo (Lactobacillus)
9. Liquido cefalorraqudeo - se siembra por agotamiento en cuadrante del sedimento
del tubo centrifugado a 1500 rpm a 3000 rpm durante 20 minutos, si en el tubo hay mas
de 1 ml de muestra. Sino, vortear el tubo. La muestra se ha de procesar de inmediato y si
no es posible, conservarse a 37C.
[a] Agar sangre => buscamos Neisseria meningitidis, como pequeas colonias no
hemolticas y al fresco se ve como diplococos, Gram(-), oxidasa (+), catalasa (+),
fermentador de glucosa y maltosa (la fermentacin de este azucar le diferencia del
gonococo; tambin puede crecer Streptococcus pneumoniae (neumococo) que
aparecen como colonias verdosas (Alfa hemolisis) y al fresco como cocos Gram(+), catalasa
(-), sensible a la optoquina.
[b] Agar chocolate => dem y ademas pueden crecer Haemophilus spp como colonias
puntiformes translucidas, que al fresco aparecer, como coco-bacilos, Gram(-), catalasa y
oxidasa variable.
[c] Agar Thayer-Martin => medio selectivo para Neisserias, crecern bien los
meningococos /N.meningitidis.
[d] Medio tioglicolato (caldo) => medios para anaerobios y aerobios.
(f) Adems se har una extensin para Gram.
10. Otros lquidos estriles (sinovial, pleural, pericardio...)- se siembran por
agotamiento; la muestra ha de llegar en tubo estril y su conservacin no se ha de demorar
mas de 24H a 4C.
[a] Agar sangre => crecern casi todo tipo de microorganismos, con caractersticas
hemolticas de algunos de ellos.
[b] Agar chocolate => crecern casi todo tipo de grmenes, sobre todo exigentes.
[c] Agar McConkey => crecern Enterobacterias y otros bacilos Gram(-) poco exigentes.
[d] Agar CNA => agar columbia colistina nalidixico (sangre de cordero), selectivo para
Gram (+)
[e] Agar ASA => agar sangre anaerobios selectivo para bacilos Gram(-) anaerobios y
Bacteroides.

11. Cateteres y sondas - se siembra mediante la tcnica de Maki (rodamiento del
cateter)
[a] Agar chocolate => crecern casi todo tipo de grmenes, y podrn crecer bien algunos
exigentes como el Haemophillus.
[b] Agar sangre => crecern bien casi todo tipo de grmenes y podr verse sus
caractersticas hemolticas si las tuvieran
[c] Caldo tioglicolato => si se observa crecimiento se har un pase por Agar chocolate.
[d] Tambin puede ponerse en una placa de agar MacConkey.
12. Hemocultivos - la muestra se introduce en el vial de hemocultivos, conservando a
37C en el Bactec (detecta CO2) hasta su identificacin.



Tema 6 - Medios de Cultivo en bacteriologa clnica (Clasificacin y
Preparacin)
Medios de cultivo - compuesto por distintos nutrientes requeridos para cultivar
grmenes como las bacterias, hongos y parsitos segn sus necesidades nutricionales de
cada uno; en funcin de sus requerimientos, existen grandes diferencias entre los medios
de cultivo que nos sirven para diferenciar cada tipo de microorganismo que podr crecer
en unos medios de cultivo y no en otros.

Funcin de medios cultivo:
- separar y aislar distintas especies microbiales presentes en una muestra.
- paso previo para el estudio de identificacin de un microorganismo problema.
- conocer el metabolismo en funcin del nutriente o sustrato que utiliza (lactosa) o
metabolito que produce (indol).
- estudios macroscpicos => visualizar las caractersticas de las colonias en medios slidos.
- realizar antibiogramas determinando la sensibilidad (mayor/menor) de la bacteria
problema a distintos antibiticos.
- pruebas de CMI (concentracin minima inhibitoria)
- conservar las especies microbiales o muestras.

Requerimientos energticos y no energticos de los medios de cultivo - fuente
de energa (fuente de carbono y de nitrgeno) y fuente no energtica (azufre, fsforo,
iones metlicos, factores de crecimiento, f. de arranque y inhibidores) necesarios para el
desarrollo (crecimiento) de cultivos microbiales; fuente de carbono => acido actico,
alcohol, citrato sdico, azucares (mono o disacridos incluso almidn => glucosa, lactosa,
maltosa), CO2 (bacterias fotosintetizantes y quimiolitotrofas); conocer el tipo de azcar
utilizado => til para su identificacin bioqumica y clasificacin taxonmica; fuente de
nitrgeno (menos energtica) => protenas completas (gelatina - determinar actividad
proteoltica/gelatinasa; extractos de carne y sales de amonio), pptidos/polipeptidos
(peptonas - extractos de levadura, casena - trpsica de casena/triptfano => formacin de
indol) o aminocidos y otros => nitratos, nitrgeno orgnico, amoniaco, sales de amonio,
aminocidos; conocer la fuente nitrogenada => til para clasificacin taxonmica; fuente
de azufre => sulfatos, tiosulfatos, aminocidos (metionina, cisteina, tiamina); fuente de
fosforo => fosfatos; iones metlico => hierro, potasio, sodio, magnesio y en
concentraciones mas bajas => cinc, manganeso, cobre, cobalto, etc;

Otros requerimientos no energticos:
Factores de crecimiento => componentes que muchas bacterias no son capaces de
fabricar por si solas para su crecimiento (aminocidos => cisteina; factor X y factor V
procedente de la degradacin Hb; vitaminas, bases puricas y pirimidicas); factores de
arranque => sustancias que permite a la bacteria salir de su fase de latencia y comenzar
su fase de crecimiento exponencial (fuentes de energa => glucosa; iones metlicos que
estimula el crecimiento); factores inhibidores => componentes que bloquar el proceso
metablicos de algun microbio; muy tiles para la identificacin y tipificacin bioqumica
de las bacterias (azida sodica => impide Gram(-(; antibiticos => inhibidores y
destructores; colorantes laeosina azul de metileno utilizado por medio Levine; cristal
violeta en medio MacConkey => impide Gram(+).

Condiciones que ha de cumplir un medio de cultivo:
1. Una composicin de nutrientes adecuada (requerimientos energticos y no energticos)
2. Condiciones fsico-qumicas apropiadas:
- Temperatura optima/ideal
(segn la especiemicrobiana: psicrfilas <20C;mesfilas 18-45C; termfilas > 45C; las
bacterias patgenas del hombre 35-37C; fuera de estas no crecen o crecen mucho mas
despacio;) e.j.: Yersinia 22C, Campylobacter 45C (los dos son gastrointestinales)
- Grado de humedad (cantidad de agua que necesita para crecer)
- pH adecuado es en general cercano a la neutralidad +/- 7(estabilizante de pH : buffers
o tampones que facilitan el crecimiento); pH acido => Tiobacilos (cerca a 0); pH
alcalino => bacilos ureasa positivo/ Proteus (en torno a 8) y Vibrio cholerae (pH 9)
- Presin osmtica en general isotnia (300 miliosmoles)
- Presencia o ausencia de oxigeno; la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias
son facultativos que se desarrollan bien con y sin O2; existen pocos anaerobios estrictos;
bacterias microaeroflica => produce mas CO2.

Principales tipos de medios de cultivo
- segn su proporcin de agua / su consistencia (slidos, lquidos, caldo)
- segn su uso / su utilizacin (para aislamiento, crecimiento en general /recuento,
identificacin, mantenimiento de cepas, para antibiogramas)
- segn su origen del que proceden (naturales, sintticos y semi-sintticos, complejos)
- segn su presentacin (deshidratados o liofilizados, slidos en placa petri, slidos en
tubo, lquidos en tubo, semi-slidos en tubo, doble fase en frasco o tubo).

Medios de cultivo segn su proporcin en agua:
- Medios slidos > 15% de agar; para aislamiento, identificacin, elaboracin de
antibiogramas) =>1881 Koch utiliza la gelatina (inconveniente => se funde a 24oC y
existen bacterias gelatinasa positiva que destruiran tal medio); posteriormente Hesse su
alumno usa el agar (medio inerte).
- Medios lquidos/caldos => contiene agua, fuente de carbono, sales minerales y
algunos lleva factores de crecimiento, vitaminas, peptonas y aminocidos.
- Medios semisolidos => agar semi-slidos (<5% de agar)

Medios de cultivo segn su uso o utilizacin:
- Medios para aislamiento => {a} medios enriquecidos (componentes basicos +
caseina soja, triptofano para microorganismo exigente; e.j. agar sangre/chocolate
{b} medios selectivos (componentes basicos + componentes que impiden el crecimiento de
algn tipo bacteriano para seleccionar) e.j. medio Rothe (para aislar Streptococcus
faecalis /Gram(+)contiene azida sdica que impide Gram(-); la mayoria de medios
selectivos son tambin medios diferenciales {c} medios diferenciales (= medios selectivos +
sustancias resalta las caracteristicas microbiales de algunas; e.j. medio Levine (contiene
eosina y azul de metilenoque inhibe Gram(+) y algunas Gram(-), facilita a las
enterobacterias y lactosa (para las fermentadoras)
- Medios para crecimiento en general => liquida o solida sirve para el crecimiento
de la mayor parte de las bacterias (componentes bsicos + sales y agua) ; e.j. el caldo
comun (contiene extracto de carne, peptona, glucosa, cloruro sodico y agua); el caldo
Tioglicolato.
- Medios de identificacin (= medios diferenciales) => sirve para
clasificar taxonmica-mente el microoganismo; e.j. agua peptonada = indol positivo; caldo
Stuart urea-indol = ureasa; glucosa = fermentacin de glucosa (sacarolitico = sacarosa
positivo).
- Medios de mantenimiento de cepas => mantener las cepas vivas durante periodos
de tiempo relativamente largos a temperaturas bajas para impedir su crecimiento;
e.j. leche descremada congelada
- Medios para antibiogramas; e.j. Proctor (antibiogramas fungicas), Mueller
Hinton(a.b.bacterianas), Wilkins-Chapman (a.b. bacteriana anaerobicas).

Medios de cultivo segn su origen
- Medios naturales => poco utilizados, se preparan artesanalmente, constituidos por
ciertos tejidos, lquidos orgnicos (leche, huevo, patata, suero sanguneo)
- Medios semi-sintticos => parte de su composicin son extractos naturales (levadura,
malta, patata, sangre, leche) + constituyentes sintticos
- Medios sintticos => estructuras sintticas ms o menos puras y qumicamente
definidas disueltas en agua destilada (los ms utilizados en bacteriologa y en general);
contiene: fuente de carbono o azcar, fuente de nitrgeno inorgnica como iones NO-3,
NH+4 o orgnica como peptona, aminocidos, aminas, etc., compuestos minerales como
oligoelementos, factores de crecimiento (vitaminas, aminoacidos, bases puricas o
pirimidnicas).
- Medios complejos => son los primeros que se utilizaron en bacteriologa; en
actualidad se usa mas en parasitologa y virologa; se preparan de forma compleja (tejidos
animales/carne de musculo, hgado, corazn, yema de huevo, azucares, pepetonas,
vegetales, etc.

Medios de cultivo segun su presentacion
- Medios deshidratados o liofilizados
- Medios ya preparados
- Medios slidos en placa Petri
- Medios slidos en tubo
- Medios lquidos en tubo
- Medios semislidos en tubo
- Medios de doble fase en frasco

Principales medios utilizados en microbiologa
1. Agua peptonada (peptona en medio acuoso con pH 7 a 37C 24-48 horas) =>
determinacin de la produccin de indol debido a su alto contenido en triptfano; tras la
adicin de 5/6 gotas de reactivo Kovacs en hidrxido potsico (KOH 40%) => anillo rojo
en la superficie indicara indol positivo.


2. Medio Chapman (selectivo y diferencial) => aislamiento
de Staphylococcus (halfilos)S.aureus (coagulasa+); Comp: alto contenido de cloruro
sdico 75 gr (agar manitol salado); 15 gr de D-manitol (diferencial => azcar utilizado por
algunos estafilococos), 25 gr de rojo fenol (indicador positivo de pH a 37C 24-48 horas =>
amarillo dorado); es orientativa, se debe completar la prueba con pruebas bioqumicas
(coagulasa/latex); S.epidermidis no fermentan el manitol, por tanto el color sigue rojizo o
purpureo.


3. Agar de Thayer y
Martin (Agar New York City) => no permite el
crecimiento de muchos microorganismos, pero si
permite aislar gonococos y meningococos (Neisseria); Comp: agar chocolate/ sangre
calentado + formula polyvitex (vitaminas y aminocidos) + VCAT (vancomicina => inhibe
los Gram+, colistina => inhibe los coliformes /Gram-,anfotericina =>
antifngico, trimetropinsulfametroxazol => antibitico de amplio espectro).


4. Agar chocolate Polyvitex => medio general enriquecidos donde crecen la mayora de
bacteria y Haemophyllus); Comp: agar chocolate + formula polyvitex (vitaminas y
aminocidos) incluyendo factores X (hemina) y V (NAD/ nicotinamida adenina
dinucletido) proporcionados por la hemoglobina y PolyViteX.


5. Medio base Christensen (lquidos y slidos) => para la prueba de la ureasa; ureasa+
de rojo => rosa; grmenes con ureasa+ => Proteus y Helicobacter pilory



6. Medio citrato de Simmons (agar solido)
=> prueba de citrato (como fuente de
energa) para la investigacin de bacilos Gram(- (la diferenciacin entre coliformes y
coliformes fecales. Los coliformes fecales (E.coli) no fueron capaces de utilizar el citrato
como fuente de carbono ni a las sales de amonio como fuente de nitrgeno. Los coliformes
no fecales comoEnterobacter aerogenes o Salmonella enteritidis podan utilizar el citrato
en este medio dando una reaccin alcalina); Comp: citrato sdico, azul de
bromotimol (indicador pH, de que el citrato esta consumido /se alcalina; verde => azul);
grmenes con citrato permeasa =>Klebsiella pneumoniae, Salmonella, Enterobacter
aerogenes.


7. Medio Clark y Lubs (caldo/ liquido) => para diferenciar entero-bacterias
medianteprueba de Voges-Proskauer (produccin de acetona/ acetil metil carbinol => por
reduccin a 2,3 butanodiol o por oxidacin a diacetilo); y prueba de Rojo de
Metilo (acidificacin del medio con pH <4,5 y cambio de color a rojo); grmenes
con VP+ => Klebsiella pneumoniae yEnterobacter aerogenes; grmenes
con RM+ => Proteus, E.coli y Salmonella.


8. Medio Cled/Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient (solido) => recuento e
identificacin de grmenes en las vas urinarias; Comp: lactosa en alta cantidad, azul de
bromotimol (indicador del consume lactosa verde => amarillo); las colonias mas frecuente
=> E.coli (amarilla L+), Proteus (azul L-), Klebsiella (amarilla azulada y muy mucosa (L+),
Pseudomonas aeruginosa (verde L-), Streptococcus faecalis (amarilla L+), Staphylococcus
aereus (amarilla L+).




9. Agar sangre (se comercializa con nombre TSA => tripticasa, soja, agar)
=> investigacin de microorganismos hemolticos (consume hemates); es un medio
general enriquecida; Comp: sangre de cordero (agar columbia) o caballo o ternero =>
estriles y desfibrinadas; alfa hemlisis/ neumococo (parcial) => halo verdoso/difuso
alrededor de la colonia; beta hemlisis/ Streptococcus B-hemoltico y Staphylococcus
aureus que causan anginas (total) => halo transparente; gamma
hemlisis/ Pseudomona causa gastro intestinales (no hemolizar) => sin halo.


10. Medio eosina azul de metileno /EMB (Medio Levine) => selectivo y diferencial,
para aislamiento de entero-bacterias Gram(-) (E.coli, Enterobacter, Salmonella, Shigella,
Proteus, Klebsiella) Comp: alto contenido de lactosa (indicador fermentadora), eosina azul
de metileno(indicador de pH y inhibidor los Gram(+) y las floras de Gram(-) fastidiosas).




11. Medio de agar Hektoen (diferencial y
selectivo) => aislamiento de entero-bacterias patgenas Gram(-); Comp: sales
biliares (inhibe Gram(+)), lactosa (indicador de L+ => amarillo/naranja) sacarosa,
peptona, tiosulfato sdico y citrato frrico amoniacal (indicador de la produccin
SH2/H2S => puntos negro), azul de bromotimol, fuschsina cida (indicadores de pH); en
condicin normal es verde => fermentacion de lactosa/acidificacin => vira a
amarillo/naranja (caractersticas de fermentadora L+Escherichia, Serratia, Klebsiella,
Citrobacter, Enterobacter y Vibrio cholerae); cuando se consume lactosa + peptona (se
acidifican primero, y despus se basifican) => verde; cuando se consume
azufre/ disulfurasas+ => precipita el hierro y la colonia se vuelve negro (caracterstica
de Salmonella y Proteus vulgaris).


12. Medio Kliger o KIA (Kliger Iron Agar) => medio solido en tubo (color caramelo);
muy semejante y mas utilizado es TSI (triple sugar, iron) + 10 gr de sacarosa; muy
utilizado para la identificacin de entero-bacterias, pruebas de la lactosa, glucosa, gas y
SH2; Comp: lactosa (indicador de L+), peptonas, glucosa, citrato frrico amoniacal y
tiosulfato sdico(componentes para producir SH2), rojo fenol (indicador de pH); los
grmenes productor deSH2+ => Proteus, Salmonella y Citrobacter; los productores del
gas CO2+ => Salmonella y Citrobacter y E.coli.


13. Medio MacConckey (color rosa) => aislamiento e identificacin de entero-bacterias
Gram(-)/ poco exigentes; Comp: sales biliares (inhibidor Gram(+)), lactosa (indicador L+),
cloruro sodico, rojo neutro, cristal violeta (inhibidor los cocos de Gram+); L+ (consumidor
de lactosa) => rojo (E.coli y Enterobacter aerogenes), L- (no fermentador)=> Salmonella,
Shigella y Pseudomonas; Gram- exigentes => Neisseria, Haemophyllus.


14. Medio Mueller Hinton (general) => para la realizacion de antibiograma por el
mtodo de Bauer-Kirby


15. Medio Ornitina Movilidad/ MIO (preparado en tubo/ semisolido) => identificacin
de la movilidad bacteriana (entero-bacterias), capacidad para descarboxilar la
ornitina (orinitina descarboxilasa /est dada por un color prpura/ alcalinidad del medio y
la produccin de indol (al aadir reactivo de Kovacs); La movilidad se demuestra por un
enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas all de la lnea de
inoculacin; el germen que da resultado positivo de los 3 pruebas => E.coli.




16. Medio caldo F-
Selenito (selectivo) => medio enriquecido con
fosfato para el aislamiento de Salmonella; Comp: selenito sdico (inhibidor de flora
Gram(+) y Gram(-) excepto Salmonella); despus tambin se hace cultivo con agar SS.


17. Medio agar S-S (color caramelo) => aislamiento de las bacterias patgenas
importantes Salmonella y Shigella; Comp: lactosa (indicador fermentadora de
L), tiosulfato sdico y citrato de hierro (indicador de SH2), sales biliares y verde
brillante (inhibidor bacillos Gram(+), rojo neutro (indicador de pH); L+ (coliformes -
E.Coli y Klebsiella) => rojas o rosadas; L- y SH2- => incoloras (tpico de Shigella); L- y
SH2+ con la precipitacin de hierro => negro (tpico de Salmonella).

18. Medio Agar XLD (agar xilosa-lisina-desoxicolato) => se utiliza para el aislamiento y
diferenciacin de bacilos entricos Gram-, especialmente del gnero Salmonella y
especialmente Shigella (entero-bacterias patgenas); Comp.: xilosa (la fermentan
los entricos menos Shigella), sacarosa y lactosa, desoxicolato de sodico (inhibe Gram+);
se puede utilizar para la identificacin de lactasa+, lisina
descarboxilasa+ => Salmonellaque alcaliniza el medio y SH2+ (tiosulfato sdico +
citrato de hierro amoniacal).




19. Medio caldo Columbia => caldos
para hemocultivos.
20. Medio Castaeda (caldo y solido) => bsqueda de grmenes Brucella, Vibrios y
Pasteurella en sangre (hemocultivos).
21. Medio de Lowenstein-Jensen (selectivo) => cultivo de Mycobacterium
tuberculosis y otras micobacterias; Comp: fcula de patata, verde malaquita => inhibidor
de la mayora de grmenes; la prueba se confirma con tincin de acido alcohol
resistencia (Con la tincin de Ziehl-Neelsen las micobacterias se observan como bacilos de
color rojo); micobacterias patgenas crecen muy lenta (+ 7 das); los niveles bajos de la
penicilina y el cido nalidxicotambin estn presentes en el medio de LJ para inhibir el
crecimiento de Gram(+) y Gram(-), con el fin de limitar el crecimiento => nico de
micobacterias.


22. Medio Sabouraud => para el aislamiento e identificacin de hongos micelares y
levaduriformes.

23. Medio Sabouraud gentamicina tetrazolium => para el aislamiento
e identificacinde Candida (levaduriformes); La gentamicina inhibe el crecimiento de la
mayora de las bacterias Gram(-) y Gram(+).




24. Medio Schaedler con vitamina K3 (caldo o agar solido) => para cultivo
deanaerobios (estrictos y facultativos); La presencia de factores de crecimiento como el
extracto de levadura, la hemina y la vitamina K3 y la adicin de sangre de cordero permite
el crecimiento incluso de las especies ms exigentes. El agente reductor (L-cistina) y la
elevada concentracin de dextrosa en el medio favorecen el crecimiento de especies
anaerobias p.ej. Lactobacillus, Streptococcus, Clostridios y Bacteroides.
25. Medio CPS cromognico (agar/ solido) => es un medio de aislamiento y
de identificacin destinado a las muestras urinarias; permite realizar (1) el recuento
microbiano (mtodo de inoculacin estandarizado); (2) identificacin de: Escherichia
coli, Enterococcus del grupo D, KES (Klebsiella, Enterobacter, Serratia), Proteeae (Proteus,
Providencia, Morganella); la concentracin elevada de agar evita el crecimiento invasivo de
Proteus; el medio se inocua directamente a partir de la orina,
respetando tcnicas adecuadas de toma de muestras y su transporte; permite la
identificacion directa de:
a. E.coli => coloracin espontanea (rosa a burdeos) de las colonias productores de B-
glucuronidasa (B-GUR) y coloracin azul revelada por el reactivo indol cuando la cepa
genera triptofanasa.
b. Enterococcus y KES => coloracin espontanea azul-verde de las cepas
que producen B-glucosidasa (B-GLU).
c. Proteeae => coloracin marrn revelada por el reactivo TDA cuando la cepa
genera triptfano desaminasa (sin reactivo es incoloro).
Modo operativo - dejar atemperar las placas a temperatura ambiente; inocular la muestra
con el asa calibrada de 10ul => sumergir el asa en la orina, mantenerlo verticalmente;
descargar el asa al realizar una estra sobre un radio de la placa;
realizar estras perpendiculares muy apretadas sobre toda la superficie de la placa; incubar
en la estufa con la tapa hacia abajo a 37C en aerobiosis; se examinan los
cultivos despus de 24 horas de incubacin.


Lectura e interpretacin:
Recuento - estimar la concentracin bacteriana comparando la densidad de las colonias
presentes sobre la mitad superior de la placa con la del esquema; <1000 (negativo), entre
1000 - 100.000 (dudoso), mas de 100.000 (positivo)
Identificacin - observar las colonias
(1) Colonias de color rosa a burdeos o translucidas con centro rosa a
burdeos=> presuncin de E.coli; confirmar mediante una deteccin de indol (depositar
una colonia sobre un disco de papel previamente embebido de una gota de reactivo R1 del
envase ID Indol TDA) => indol+ da una coloracin azul (E.coli); la ausencia de color azul
(indol-) se debe proceder a la pruebas de API.
(2) Colonias de color azul-verdoso y observacin de cocos Gram(+) mediante examen
directo => Enterococcus; si no cumple esta condicin, se debe proceder a las pruebas de
API.
(3) Colonias de color azul-verdoso y observacin de bacilos Gram(-) mediante examen
directo => grupo KES; la identificacin se debe proseguir mediante pruebas bioqumicas
(ureasa(+) => Klebsiella; ornitina descarboxilasa+ => Enterobacter; gelatinasa(+) =>
Serratia).
(4) Colonias incoloras a marrn-anaranjado => efectuar TDA (depositar sobre algunas
colonias idnticas, una gota de reactivo R2 del envase ID Indol TDA), observar
la coloracin despus de unos 30 segundos => TDA+ da una coloracin marrn (+/-)
oscuro; efectuar indol => indol+ da color azul (Proteus, Providencia o Morganella);
ausencia de coloracin azul es indol(-) (Proteus mirabilis); TDA- da
una coloracin amarilla y la identificacin se debe proceder a las pruebas de API.


Tema 7 - Mtodos de Siembra (cultivo de las cepas)

Sembrar - cultivar la muestra utilizando tcnica y medios adecuados para conseguir el
objetivo (identificar el microorganismo).

Preparacin de inculos (pequea parte de muestra)
- Muestras viscosas o concentradas (anlisis cuantitativo) => suspender un cultivo joven y
puro o un producto patolgico (muestra biolgica) en 5 ml de solucin diluyente (caldo de
cultivo, suero fisiolgico estril o agua destilada estril.
- Ajustar con la escala con un gradiente de turbidez (tecnica de Kirby-Bauer) => tubos
numerados como patrn de referencia segn la concentracin de microorganismos; se
ajusta mediante comparacin visual aproximada o mediante la absorbancia de
espectrofotometra; escala de Mcfarland => una serie de tubos con precipitacin blanco de
sulfato de bario por reaccin de acido sulfrico + cloruro de bario (escala 0,5 = 1,5 x
10.6/ml de microorganismos en el inoculo; escala 1 = 3 x 10.6 /ml; escala 2 = 6 x10.6./ml.


Mtodos de inoculacin y aislamiento de microorganismos
1. Mtodos de siembra - inoculacin:
{a} En medio liquido; con asa => se sumerge el asa cargada en el medio y se agita; con
pipeta => se vierte el contenido de la pipeta sobre el medio de cultivo y se homogeneiza;
con escobilln = con asa.
{b} En medio solido (en placa):
- Inoculacin previa al vertido en placa (tcnica de Barry - no se utiliza mucho) => 0,1 ml
de inoculo + 25 ml de medio cultivo => fundido/ atemperado a 45-55C para no esterilizar
=> homogeneizar => verter en la placa de Petri.
- Inoculacin sobre la superficie del medio solidificado (tcnica de Kirby-Bauer) => se
prepara el inoculo en un tubo estril; se introduce un escobilln estril impregnando; se
elimina el exceso presionando el escobilln con movimiento de rotacin contra las paredes
del tubo; se siembra la placa empleando la tcnica de los tres giros distribuyendo
uniformemente el inoculo; se deja secar la placa 4-5 minutos en posicion semiabierta e
invertida, quedando lista para ser utilizada (en los antibiogramas).
{c} En medio solido (en tubo):
- Siembra por estria en superficie inclinada => se toma la muestra con el asa /hisopo; se
introduce en el tubo que contiene el medio; desde el fondo y en progresin ascendente se
desliza el asa en movimiento de zig-zag (se utiliza para pruebas bioqumicas y renovar
cepas).
- Siembra en picadura (para ver la movilidad de los grmenes en la zona de puncin +
pruebas bioqumicas) => se toma la muestra con la aguja o hilo; se punciona en el centro
del medio introduciendo la punta de la aguja hasta 2-3 mm del fondo del tubo; se extrae la
aguja por la misma lnea que se introdujo; medio solido inclinado => puede realizarse
tambin una siembra en estra por la superficie del medio con la misma aguja; agar semi-
solido => puede usar el asa en lugar de la aguja.


2. Metodos de siembra - aislamiento (para obtener cepas puras/ bien aisladas) :
{a} Siembra en estria o zig-zag => se deposita el inoculo en el extremo superior de la placa;
se siembra con el asa o con hisopo, a partir del inoculo, con un movimiento en zig-zag cada
vez mas amplio de lado a lado de la placa; el estriado ha de hacerse sin presionar el medio,
suavemente, sin levantar el asa y sin flamearla; las colonias mas aisladas las obtendremos
en la zona mas distal del inoculo, es decir al acabar la siembra.
{b} Siembra en tres direcciones => se deposita el inoculo en el extremo superior de la placa
dejando deslizar hacia el centro para ello inclinaremos la placa (tambin se puede arrastras
con el asa); mediante asa o escobilln, haremos movimientos laterales de un lado a otro de
la placa, dejando las estrias muy juntas; giramos la placa 90 y realizamos la misma
operacin, sin flamear o cambiar de asa; volvemos a girar la placa haciendo lo mismo; al
final nos queda una placa muy bien tapizada. Se realiza en urinocultivos para el contaje de
las colonias.
{c} Siembra en estra mltiple => se deposita el inoculo en un extremo de la placa; con el
asa se reparte en varios tramos, siguiendo el borde de la placa; entre cada tramo se ha de
flamear o cambiar el asa; los segmentos seguidos describen un poliedro regular y el ultimo
tramo se efecta hacia el interior en el que se obtendrn colonias aisladas.
{d} Tcnica por agotamiento en cuadrantes (lo que usamos) => es muy similar a la anterior
pero sin flamear el asa y estriando mas los cuadrantes, aprovechando mas la placa.
{e} Tcnica de los 4 cuadrantes => se divide la placa en 4 cuadrantes (pueden rotularse por
la parte posterior); se deposita el inoculo en el extremo superior de uno de los cuadrantes y
se siembra en estra; sin flamear el asa, se realiza la misma operacin sucesivamente en los
otros 3 cuadrantes; en cada uno de ellos se sembrara el inoculo que queda adherido al asa,
tras la siembra del anterior; en el ltimo de los cuadrantes sembrado, se encuentran las
colonias aisladas.
{f} Tcnica de los tres giros => se siembra en estra la mitad de la placa; flamear el asa; se
gira la placa 90, sembrando en estra la mitad superior de la misma; se repite la
operacin, es decir se ha de flamear el asa, se gira la placa y se estra; la colonia aisladas
aparecer en la zona sembrada en ultimo lugar.






Tema 8 - Caractersticas biolgicas de la bacteria (Morfologa)

Bacterias - organismos unicelulares de tamao 0,2-2 um, relativamente sencillos,
cuyamaterial gentico no esta rodeado por una membrana nuclear especial (procariotas).

Estructura - constituidos por elementos obligados (presentes en todas las bacterias
eindispensables para su vida => pared celular, membrana plasmtica, citoplasma,
ribosomas y la regin nuclear); elementos facultativos (son elementos de
supervivencia y virulenciaque pueden estar o no presentes en la bacteria => capsula,
flagelos, pelos/pilis, endosporas e inclusiones citoplsmicas)


Pared celular - es el lmite externo de la clula con estructura rgida, parecida a la pared
celular de las clulas vegetales; funciones => protegerse de cambios externos adversos,
mantener la morfologa de la clula, proporciona la resistencia a los antibiticos, dar
un paso selectivo de algunas sustancias, proporciona la especificidad de grupo y de tipo
(clasificacin), implicada en la patogenicidad; dar el color en la tincin de Gram,
violeta oscuro => Gram (+). y color rosa => Gram(-)

Estructura y composicion de la pared celular
- Gram(+) => mono-estratificada y gruesa, compuesta por mureina (peptidoglicano -
mono-capa, 50% peso seco/mucha cantidad), polisacridos, protenas y cidos teicoicos;
- Gram (-) => biestratificada y fina (1 capa es mureina en poca cantidad y 2 capa
formada por polisacridos protenas, fosfolipidos y lpidos, no tiene cidos teicoicos); las
bacterias que no son sensibles a la tincin de Gram => BAAR/ acido alcohol resistentes
(micobacterias); las que sin pared celular => los de genero mycoplasma/ patgenas; la que
tienen (formas S), pero la pierden (formas L).


Membrana plasmtica - estructura delgada que se extiende por dentro de la pared
celular, encerrando al citoplasma; funciones => acta como barrera selectiva, interviene en
la degradacin de nutrientes y produccin de energa, en algunas se encuentran pigmentos
y enzimas para la fotosntesis; estructura y composicin => fosfolpidos, protenas y
glicolpidos; mesosomas => plegamientos hacia dentro de la membrana plasmtica,
irregulares (no existen en las clulas eucariticas), se encargan de dirigir la duplicacin
del ADN bacteriano y realizar la respiracin.

Citoplasma - es todo lo que hay en el interior de la membrana plasmtica; funcin =>
engloba los orgnulos celulares (regin nuclear, ribosomas, inclusiones/depsitos de
reserva, vacuolas); no tienen ni aparato golgi, ni retculo endotelial plasmtica, ni
mitocondria; composicin => 80% de agua, enzimas, iones y principios inmediatos.

Regin nuclear - una zona en el interior del citoplasma donde se acumula el acido
nucleico; funciones => el acido nucleico transmite la informacin gentica de la clula
sobre estructuras y funciones celulares; estructura y composicin => es un ncleo difuso
que contiene 1 molcula ADN bicatenario, formando N cromosomas (enroscada en forma
de anillo); plsmidos => estructuras que pueden existir adems de ADN cromosmico
(formadas por moleculares de ADN extra-cromosmico bicatenario, pueden estar libres o
unidos al ADN cromosmico /episomas), se replican independientemente, se transmite
por conjugacin, portan genes muy importantes que determinan la resistencia a
antibiticos, tolerancia a metales txicos y sntesis de enzima.

Ribosomas - son orgnulos celulares muy abundantes (presentes en eucariotas y
procariotas) dan aspecto granuloso a su citoplasma; funciones = > sntesis de protenas;
estructura y composicin => en grupos de 3 o 4 unidos por un filamento de ARN mensaje
(polirribosomas), cada ribosoma tiene 2 subunidades de 30 y 50 Svedberg (velocidad
relativa de sedimentacin), procariotas - 70S y eucariotas - 80S; comp: 60%ARNr y 40%
protenas.

Elementos facultativos (algunos no tienen - variables) - son elementos de
supervivencia y virulencia
Inclusiones citoplsmicas - aparecen en el citoplasma y no tienen una estructura
uniforme; funciones => depsitos de reserva e intervienen en funciones de regulacin;
Tipos: (1) Grnulos de reserva => lipdicos, corpsculos metacromticos (fosfato
inorgnico), polisacridos (glucgeno y almidn), grnulos de azufre; (2) Vacuolas =>
acmulos de gases o lquidos rodeados de membrana (donde se fija CO2).

Flagelos - largos apndices filamentosos frecuentes solo en los bacilos (su presencia es
rara);funciones => responsable de la movilidad (elementos patognico: facilitar la difusin
de las bacterias a travs de las membranas); estructura => tres partes (filamento, codo y
corpsculo basal); tipos => montricas (1 solo flagelo en un extremo), loftricas (2 o mas
en un extremo), anftricos (un grupo de flagelos en un extremo y otro grupo en el otro
extremo), pertricos (flagelos distribuidos en toda la superficie de la bacteria);

Pelos /pilis o fimbrias - elementos rgidos constituidos por una protena (pilina);
cortos, muy numerosos, distribuidos sobre la superficie, mas frecuentes en Gram(-) que en
Gram(+);funciones => capacidad de fijacin a superficies (pelos comunes), proporcionan
pelos comunes y sexuales (son morfolgicamente iguales), sistema de intercambio de
informacin gentica por conjugacin (pelos sexuales).

Endosporas - solo en bacilos (Bacillus aerobio estricto y Clostridium anaerobio estricto);
una forma de resistencia que adoptan algunas bacterias ante situaciones adversas
(deficiencia nutricional, desecacin, frio, temperaturas elevadas, agentes qumicos); se
forman por un proceso de esporulacin /esporognesis, pueden permanecer latentes
durante cientos de aos y volver a una forma vegetativa por un proceso
germinacin; localizacin => zona central, subterminal o terminal (depende de su tamao,
pueden o no deformar el bacilo); la espora=> clula en reposo con capacidad de resistencia
a la desecacin, calor y agentes qumicos;esporulacin => la produccin de estructuras,
enzimas y metabolitos nuevos y la desaparicin de muchos componentes celulares;
Morfolgicamente comienza con el aislamiento del ncleo y elementos energticos
mediante el crecimiento en vaginante de la membrana; los elementos esenciales para la
vida quedan protegidos en esa nueva estructura (endosporas); la bacteria queda en estado
latente esperando una condicin externas favorables para resurgir.

Capsula - estructura que rodea la pared bacteriana; se visualiza con tincin negativa
(tinta china); funciones => regula el intercambio de agua, iones y nutrientes, sirve
como almacn externo de nutrientes, defensa frente a Acs, fagos y celulas
fagocticas (elemento virulencia),protege de la desecacin (contiene agua), formacin de
colonias (habitualmente engloba mas de una bacteria); estructura y composicin =>
polisacridos y protenas.


Tamao y Morfologa de las Bacterias - 0,2 - 2 um; es preciso utilizar el microscopio
ptico;
morfologa => informacin primaria sobre el tipo de bacteria, pero no de forma
concluyente (viene dada por la rigidez de la pared;
formas => esfrica/coco, coco-bacilo, bastoncillo/cilndrica/bacilo, helicoidal/espirilo, en
coma/vibrio, espiral/espiroqueta, estrella y cuadrangular /forma de hifas de hongos
(actinomyces/ streptomyces - productor de muchos ATB, ATF y inmunosupresores);
agrupacin de los cocos => aislados, en parejas/diplococos (granos de cafe - tpico de
neisserias/meningitis), en cadenas/estreptococos, tetradas o tretacocos (4 celulas =>
micrococcus/micrococacceae), en racimos/estafilococos, en formas cubicas de 8
elementos/sarcinas (sarcinas ventriculi - tolerancia al medio cida/ estomago);
agrupacin de los bacilos => aislados, en parejas/diplobacilos, en
cadena/estreptobacilos, algunos se parecen a cocos/cocobacilos(E.coli), en
forma empalizada/letra china (corynebacterium - algunos son saprofitos de la piel y
tambin causante de difteria).

Aroma tpicos => Pseudomonas aureginosa (olor a jabn); Haemophyllus (olor
asemen/yeso); Citrobacter (olor a ftido); Proteus (olor a amoniacal); Klebsiella y E.
coli (olor a levadura de pan).




Tema 10 - Fisiologa de las bacterias

Morfologa macroscpica - estudio de la forma y estructura de las colonias (masas
constituidas por muchos millones de bacterias, se aprecian a simple vista y originadas a
partir de una bacteria en el medio solido); reconocible en funcin de => 1. caractersticas o
tipo de medio de cultivo solido donde se ha desarrollado (un microorganismo puede dar
lugar a distintos tipos de colonias) 2. tipo de microorganismo (mayor movilidad =>
colonias extendidas y planas); la verificacin de las colonias (siempre en medios slidos
sembrndolo por estra) => en placa y en tubo con agar inclinado.

Las colonias en placa - sembrndolo por estra
El tamao y el aspecto de cada colonia son bastante constante para cada gnero y especies,
hecho que se puede utilizar como caracterstica diferencial; tamao => 1-2 mm (E.coli);
4-6mm (stafilococcus en agar sangre); extendidas en forma de velo invadiendo toda la
superficie del medio (Proteus en AS); puntiformes +/- 0,5 mm o inferiores (stafilococos en
AS);
forma => segn el espesor (planas, elevadas, semiconvexas, cncavas semicncavas,
semiesfricas, en meseta); segn los bordes (lobuladas, onduladas, rizoides, redondeadas,
filamentosas, especuladas);
superficie de la colonia/ elevacin/ aspecto => lisa, rugosa (con capsulas), plana,
acuminada, umbilicada, mucosa, seca;
consistencia de la colonia=> duras, viscosas, mucosas, secas, muy secas, cremosas;
transparencia y coloracin=> debido a la elaboracin de algn tipo de pigmento,
formacin de alguna sustancia por parte de la bacteria o la utilizacin de algn sustrato del
medio que se acidifique o basifique;
la presencia o no de halos de transparencia => generado por la prueba de la
gelatinasa (+) en placa y tambin por la actividad hemoltica de ciertas bacterias con
hemolisinas (estreptococos hemolticos tipo alfa, beta y gamma).








Las colonias en tubo, con agar inclinado - sembrndolo por estra
Las colonias presentan las mismas caractersticas que en placa, pero su visualizacin es
mucho peor (menor superficie); aspecto => filiforme, rizoide, arborescente, filamentoso,
difuso, perlado, equinulada, arrosariada.


Morfologa microscpica - estudio de la estructura fina de las bacterias

1. Estudio de su forma como clula procariota individual:
oval/esfrica => coco/cocoidea; cilndrica/bastn => bacilo; espiral/helicoidal =>
espirilo/sacacorchos /espiroquetas; filamentosa/forma de hifas de hongos => filamentosas
(actinomyces/ streptomyces), formas intermedias => vibrio, coco-bacilos; bacterias
helicoidales => Borrelia (poca espiras y amplitud), Treponema (tiene mas espiras) y
Leptospira (muy apretadas y enroladas).
2. Estudio de su agrupacin bacteriana (no todas las formas bacterianas se agrupan,
p.ej. los espirilos y los actinomicetos) => los mas frecuentes son las formas cocoideas y las
bacilares son menos frecuentes; las cocoideas => diplococos (parejas /granos de caf =>
neisserias y neumococos); estreptococos (paralelos/cadenas => ); tetradas o tretacocos (4
celulas => micrococcus/micrococacceae); estafilococos (racimos => staphylococcus/
micrococcus); sarcinas (cuboidales de 8 celulas o mas; sarcina ventriculi y tambin
stafilococcus); las bacilares => diplobacilos/parejas, estreptobacilos/ cadenas y formas
irregulares/en empalizada/letra china (corinebacterium).




TAXONOMA - CLASIFICACIN DE LAS BACTERIAS
La clasificacin definitiva de las bacterias esta aun por establecer; los que se utilizan
actualmente deben considerarse como provisionales o transitiva; la mas utilizada suelen
ser recogidas de las manuales BERGEY'S en la 9 edicin de Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology de 1994, se agrupan a las bacterias en 35 grupos, situados en 4
categoras mayores:
1. Eubacterias Gram- (bacterias verdaderas) con 16 grupos; en esta categora se
incluyen a la mayor parte de las bacterias que provocan a la patologa humana.
Espiroquetas:
-Familia Leptospiraceae (genero - Leptospira)
-Familia Spirochaetaceae (genero - Borrelia, Treponema)
Helicoidales /vibrioides aerobias - microaerfilas mviles (crecen mejor a bajas
presiones de oxgeno):
- Familia Campylobacteriaceae (genero - Campylobacter, Helicobacter)
Bacilos y cocos aerobios - microaerfilos (crecen mejor a bajas presiones de
oxgeno):
-Familia Pseudomonadaceae (genero - Pseudomonas, Stenotrophomonas)
-Familia Alcaligenaceae (genero - Bordetella) => bacilos y coco-bacilos
- Familia Legionellaceae (genero - Legionella)
-Familia Neisseriaceae (genero - Neisseria) => diplococos
-Familia Moraxellaceae / Familia Branhamaceae (genero - Moraxella, Branhamella)
=>diplococos
- Otros generos => Brucella (cocobacilos)



Bacilos anaerobios y facultativos:
- Familia Enterobacteriaceae (genero - Citrobacter, Enterobacter, Escherichia,
Klebsiella, Serratia, Hafnia [coliformes] Morganella, Proteus, Providencia, Salmonella,
Shigella, Yersinia/peste)
- Familia Vibrionaceae (genero - Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas)
-Familia Pasteurellaceae (genero - Haemophilus)
- Otros generos => Gardnerella
Cocos Gram- anaerobios => genero - Veillonella
- Familia Rickettsiaceae (genero Coxiella, Ehrlichia, Rickettsia) - son parsitos
intercelulares obligados, altamente pleomrficas cocos/bacilos/hilos
- Familia Chlamydiaceae (genero Chlamydia) - son parsitos intercelulares obligados
de forma esfrica.
2. Eubacterias Gram+ con 13 grupos (17-29); en este grupo hay los que provocan
patologia humana (la mayoria).
Cocos => genero - Staphylococcus y Streptococcus
Bacilos esporulados => genero - Bacillus (aerobio) y Clostridium (anaerobio)
Bacilos regulares no esporulados => genero - Lactobacillus y Listeria
Bacilos irregulares no esporulados:
-Familia Corynebacteriaceae (genero - Corynebacterium)
Micobacterias:
-Familia Mycobacteriaceae (genero - Mycobacterium)
3. Micoplasmas (Mollicutes / bacterias sin pared) de 1 solo grupo (30); dentro
de este grupo, los que provocan patologa humana =>genero Mycoplasma/ Mycoplasma
pneumoniae y Ureaplasma.
4. Arqueobacterias con 5 grupos (31-35); todas las bacterias de este grupo no
provocan patologia humanas (viven en las situaciones extremas => termofilas/
termogenas)

Taxonoma => la ciencia de la clasificacin que agrupa y separa los organismos de
acuerdo con su caractersticas fenotpicas, estructurales o genticas para facilitar su
estudio; la misin => construir un esquema racional, para clasificar y nombrar los
organismos; el sistema jerrquico de la taxonoma se ha formado gradualmente a partir del
sistema binomial / binominal / binaria de nomenclatura genero y especie establecida por
Linneo en 1758 (un botnico); la taxonoma no es una ciencia esttico, goza de gran
dinamismo y esta en la relacion con los avances de los procedimientos empleada para su
estudio; el termino de sistemtica se utiliza como sinnimo de taxonoma; los grupos de
taxonoma van de dominio - imperio - reino - tribu - divisin - clase - orden - familia -
genero y especie.
Para la asignacin de una bacteria, se siguen las normas recogidas por el cdigo
internacional de nomenclatura bacteriana y adquieren validez cuando ha sido publicado
por el Intl Journal of Systematic Bacteriology; bien en un articulo o bien dentro de los
sistemas en las listas de las bacterias aprobadas que incluyen sus nmeros; una especie
bacteriana, viene definida por un nombre genrico de un nombre especifico latinizado o
helenizado y concuerdan gramaticalmente; la inicial de genero va con letra maysculas y el
de especie con minsculas; tanto el nombre de genero o especie se escriben con letra
cursiva/ italica o en su defecto, subrayado; en la denominacin de un especie, la palabra
que define genero puede ser abreviada a su inicial seguida de un punto (p.ej. E.coli o
E.coli); los nombres de las bacterias no se eligen de manera arbitraria, sino que pueden ser
descriptivos, p.ej. Staphilococcus aureus (cocos en forma de racimos - dorados); o pueden
dar homenaje a un autor p.ej. Pasteurella, Bacilo de Koch, tambin puede dar referencia a
un acontecimiento p.ej. Legionella; el nombre generico es nico; para referirse a un especie
o varios especies no determinadas su genero => E.spp/ sp; algunas de las categoras
taxonomia superiores, se forman aadiendo las palabras que las asignan distintas
terminaciones, p.ej. aceae; para el orden => ales (sufijo) p.ej. Mycoplasmatales; todas las
categoras taxonoma se expresa en cursiva o itlica.
FLORAS BACTERIANAS
Flora Normal de la especie humana => la poblacin de microorganismos comensales
que normalmente coloniza la piel y las membranas mucosas de las personas adultas sanas;
la piel y las mucosas colonizadas por microorganismos dinmicos => cambios cualitativos
y cuantitativos constantemente; 2 poblaciones:
1. La flora residente (FR) => un nmero relativamente fijo de especies de
microorganismos (comensales y oportunistas) en una zona definida (si se producen
alteraciones, suelen ser temporales); permanecen intactas; encuentran condiciones
fisiolgicas y nutritivas adecuadas; no es esencial para la vida, pero es normalmente
beneficiosa (produce vitamina K en el intestino y ayudan en la absorcin de nutrientes y
impide la colonizacin de microorganismos potencialmente patgenos.
2. La flora transitoria (FT) => microorganismos no patgenos o potencialmente
patgenos, que colonizan la piel o las mucosas en periodo corto de tiempo; tiene poca
importancia, pero si la flora residente se altera, la flora transitoria puede multiplicarse y
producir infecciones. La supresin de FR => vaci ecolgico => ocupacin de
microorganismos ambientales o de otras zonas de cuerpo => infecciones.
FR oportunistas => los que tienen acceso a lugares estriles; algunos ejemplos:
- Streptococcus viridans son comensales del tracto respiratorio superior y de la boca, si
alcanza el torrente sanguneo => si vlvula cardaca daada => posible endocarditis;
- Bacteroides son comensales del intestino grueso => si apendicitis perforada => posible
peritonitis o bacterimia.
- Infecciones de pacientes inmunodeprimidos por causas diversas (cncer, leucemias,
linfomas, SIDA)
- E.coli es comensal del colon => lugar estril (o no habitual) a traves de uretra =>
infeccin urinaria

Las causas de las interpretaciones errneas => no se toma en cuenta al
microorganismo como patgeno o se le descarta (como mero contaminante); la omisin o
inclusin de una especie en una de las categoras no implica que no pueda ser aislada en
otra zona del cuerpo o que en condiciones especiales, pueda producir enfermedad.

Flora normal de la piel, boca y vas respiratorias superiores
- Las principales (en faringe y traquea) => Staphylococcus epidermiditis (coagulasa (-)),
Staphylococcus aureus (coagulasa+) en pequeas cantidades, Micrococcus spp,
Neisseria de especies no patgenas, Estreptococos A-hemolticos y no hemolticos, las
anaerobias facultativas, Candidas.
- FT/no residente se elimina o se disminuye => pH acido, los cidos grasos de las
secreciones sebceas, lisozima, el sudor y el lavado diario con jabones desinfectantes; se
disminuye de forma temporal => la repoblacin es muy rpida.
- Al nacer => la boca y faringe son estriles; tras 12 horas => Streptococcus viridas (las
mas abundantes en la boca), posteriormente => estafilococos (S.epidermiditis), diplococos
Gram(-), difteroides (Corynebacterium); salida de dientes => espiroquetas de Bacteroides,
Fusobacterium e Actynomicetes, vibrios anaerobios, Lactobacilos y levaduras; Adulto
normal=> las principales (mira arriba!!)
- Los bronquios, bronquiolos y alvolos suelen ser estriles.
Flora normal del tracto intestinal
- Al nacer => estril, posteriormente => colonizado por microorganismos de los
alimentos dependiendo de la dieta (p.ej. la leche materna => Estreptococos y
Lactobacilos y el bibern => flora mixta con menos Lactobacilos) .
- Adulto normal => el esfago contiene lo que previenen de la saliva y comida; en el
estomago hay poco (pH acido protegen la clera y salmonelosis - excepto Helicobacter
pilorique puede causar ulcera pptida, tiene ureasa que alcalina/neutralizar el acidez:
degradar la urea => amoniaco); el intestino delgado superior contiene Lactobacilos y
enterococos;intestino delgado inferior (leon y ciego) contiene la flora fecal; el
colon contiene >100 especies 96-99% anaerobios facultativo y estricto => Bacteroides spp,
Fusobacterium spp, Lactobacilos/ Bifidobacterium spp, Clostridium spp, cocos Gram+
anaerobios (Peptostreptococcus spp).
- La utilidad/beneficio => sintetiza la vitamina K, transformacin de los pigmentos
biliares en cidos biliares, absorcin y metabolismo primario de nutrientes.
- La administracin de anti-microbianos orales => la posible proliferacin de cepas
resistentes al anti-microbiano administrado y pueden ser diseminada.
- La administracin de ATB por va parenteral en una ciruga intestinal => necesario para
reducir al mnimo posible el numero de microorganismo, evitar trauma en el acto
quirrgico y infeccin peritoneal e diseminada.

Flora normal de la uretra
- Los ms frecuentes son estafilococos, enterococos, Corynebacterias, Neisserias no
patgenas, enterobacterias (la mayora son pobladores de la piel que recubre esta zona).
- En los cultivos de orina, se deben limpiar con cuidado la zona perineal antes de tomar
una muestra.

Flora normal de la vagina
- Al nacer, esta colonizada por Lactobacilos aerobios (produce pH acido), posteriormente
el pH acido se convierte en neutro y aparece flora mixta de cocos y bacilos, hasta la
pubertad.
- En la pubertad esta colonizada por Lactobacilos aerobios y anaerobios que produce
cidos por su metabolismo de hidratos de carbono => cambio a pH acido (proteccin a los
otros microorganismos potencialmente patgenos.
- En la mujer adulta esta colonizada ademas de los anteriores (Lactobacillus acidophillus -
aerobios y anaerobios), estreptococos anaerobios (hemoliticos o no hemoliticos) y otros; el
moco cervical contiene lisozima con actividad bactericida.
- En la menopausia la flora vaginal cambia, aparece de nuevo una flora mixta de cocos y
bacilos.
- La administracin de antibiticos de amplio espectro, puede eliminar las especies
protectoras, producindose una multiplicacin excesiva en la vagina de levaduras
(candidas) u otras causantes de vaginitis.
Flora normal de la conjuntiva del ojo
Predomina los difteroides (Corynebacterium xerosis), Staphylococcus epidermidis y
estreptococos no hemolticos; pueden estar presentes otras especies; el control de la flora
lo ejercen las lagrimas, por su contenido en lisozima.

Tema 11 - Examen Microscpico (observacin de microorganismos vivos)

Nociones de microscopia (repasar apuntes de 1 curso)
Microscopio instrumento que permite amplificar la imagen de un objeto o de un ser
pequeo (micros: pequeo y scopein: ver); inventado 1610 por Galileo, el primer cientfico
italiano observando el exterior de una abeja o Jansen, el holands.

Fundamento Si se sita entre el ojo y el objeto un sistema ptico capaz de aumentar el
Angulo visual, se podr ver el objeto con mayor amplitud y claridad. El sistema de lentes -
produce una imagen aumentada de una muestra diminuta. El objetivo - pequea lente de
proyeccin que aumenta y proyecta la imagen primaria del objeto hacia el extremo
superior del tubo del microscopio (imagen area). El ocular (lupa) - aumentando la imagen
area. La imagen final - se forma en la retina del ojo. La imagen virtual (el ojo percibe la
imagen final en el plano virtual).
Aumento es el nmero de veces que se ve el tamao de un objeto por encima de su
valor real. En el microscopio ptico compuesto, se calcula multiplicando el aumento
individual del objetivo por el aumento individual del ocular. Objetivo - x4, x10, x40, x100.
Aumento ptico ocular - x5, x10
Resolucin la capacidad del microscopio para mostrar los detalles ms finos de un
objeto. Poder de resolucin (limite de resolucin o distancia resoluble) la distancia
minima entre dos puntos que permite distinguirlos como tales (la capacidad de
microscopio para distinguir 2 puntos separados aunque estn muy prximos entre si).
Disminuir la distancia resoluble = aumentar el poder de resolucin = aumentar la apertura
numrica (AN) = disminuir la longitud de onda de la luz empleada = aumentar el ngulo
alpha en el espacio objeto = aumentar el ndice de refraccin (IR) en el espacio objeto
(rellenar el espacio existente entre la muestra y el objetivo con una sustancia de mayor
ndice de refraccin, como aceite).

Numero de campo dimetro de la imagen observada a travs del ocular (en mm).
Profundidad de foco el espesor de la muestra que es posible tener enfocado por completo
>< aumento y AN (apertura numrica) de la lente.

El contraste para mejorarlo, disminuye el cono de iluminacin (se controla mediante el
diafragma de apertura) procedente del condensador.

Partes de un microscopio ptico compuesto:
Parte mecnica sistema de soporte o esttico (pie, brazo, cabezal); sistema de ajuste
(anillo de ajuste de las dioptras, tornillo de fijacin del cabezal, tornillos reguladores de la
platina, tornillo de elevacin del condensador, tornillos de centrado del condensador,
tornillo de seguridad del condensador, control del diafragma de apertura del condensador,
anillos de enfoque macro-mtrico y micromtrico, control de ajuste de la claridad/ la luz).
Parte ptica sistema de iluminacin (fuente de luz - lampara halogena de intensidad
graduable; condensador - dispositivo que contiene una lente que concentra la luz, generada
en la lampara, hacia la preparacin; diafragma de apertura - el control adecuado del cono
de iluminacin que atraviesa la muestra y entra en el objetivo = se ajusta AN); lentes
(objetivos - generan imagen real, invertida y aumentada del objeto; oculares - captan la
imagen formada por el objetivo y la amplian)


Material necesario para la visualizacin microscpica portaobjetos esmerilado y
biselado, cubreobjetos 22x22, lquido de inmersin (se usa sin cubreobjetos) es
imprescindible cuando se observa muestra desecada con objetivo de 100x
(tradicionalmente aceite de madera de cedro, actualmente aceites sinttico)

Tipos de microscopios:
Microscopio de campo oscuro si dentro de la muestra hay elementos transparentes,
con un indice de refraccin diferente al del medio que los circunda, la luz es difractada e
incide sobre el objetivo y pueden ser visualizados; permite la observacin de seres
microscpicos transparentes y no teidos (Treponema pallidum preparacin en fresco).

Microscopio de fluorescencia consta de una fuente de luz muy intensa (lmpara de
Hg a alta presin), emite una radiacin que puede incidir en la muestra desde abajo, tras
atravesar un condensador de campo oscuro (iluminacin transmitida); se emplea un tipo
especial de liquido de inmersin (glicerina); Tipos de fluorescencia: Fluorescencia
primaria - fluorescencia natural (auto fluorescencia) - vitamina A-tiamina, vitamina B-
riboflavina; Fluorescencia secundaria - colorantes fluorescentes: auramina (demostrar la
presencia del bacilo de Koch en esputos), naranja de acridina (detectar Gardnerella
vaginalis en los exudados vaginales; Fluorescencia terciaria inmunofluorescencia - fijacin
del fluorocromo (colorante) como rodamina y ficoeritrina al elemento investigado (a traves
de Ac marcado).
Fuente de luz => Filtro primario => Muestra Fluorescente => Filtro secundario => Luz
fluorescente de exitacion (UV) Observador
Microscopios electrnicos de transmisin (TEM) una gran amplificacin y
permite la observacin de elementos que son demasiado pequeos como para ser vistos en
un microscopio ptico, pero no sirve para observar elementos vivos, a causa del vaco que
ha de establecerse dentro del tubo y es muy costoso (solo se usa en lab de investigacin). El
poder de resolucion en microscopio electronico es x1000 > que microscopio ptico;
emplean electrones en lugar de unas fotones; microscopio ptico < 200 nm - fotones: 400 -
700 nm longitud de onda.
Microscopio electrnico de barrido (MEB) no tiene tanto poder de resolucin
como el de transmisin, pero sin embargo, proporciona una enorme profundidad de
campo y genera unas imgenes que producen una gran sensacin de tri dimensionalidad.
1973 se comercializo el 3 modelo que une las caracteristicas de los 2 anteriores (la gran
resolucion de los TEM y la gran definicion y contraste de los MEB.

Examen en fresco de bacterias vivas (Gota pendiente) - para conocer la movilidad
y la disposicin bacteriana en una muestra se debe observar los grmenes vivos a partir de
cultivos jovenes (lleva pocas horas), que permiten visualizar mejor su movilidad y su
preparacin en fresco.

Condiciones que debe cumplir para este fin:
- cantidad de muestra adecuada (ni mucho ni poco)
- la muestra recogida en condiciones de esterilidad
- adecuadamente distribuida en el portaobjetos (amplia y homognea)
- cantidad de agua o colorante adecuada
- para la fijacin por calor => no debe calentarse demasiado (no quemar el dorso de la
mano y la gota +/-consumida) => para hacer tincion
- seguir el mtodo o tcnica adecuada, se trabaja con limpieza y orden, evitando cualquier
contaminacin.

Tcnicas para observar los microorganismos vivos - examen en fresco, entre
portaobjetos y cubreobjetos, sobre gota pendiente en porta excavado (no lo hacemos) y con
tincin vital.
Examen en fresco - suspender el microorganismo en agua destilada o SSF colocandolo
en un portaobjetos y posteriormente visualizarlo por microscopio su morfologa (cocos o
bacilos), disposicin/agrupacin y motilidad; Material => portaobjetos, microscopio,
portaobjetos excavado, cubreobjetos, asa de siembra, mechero Bunsen o de alcohol (para
flamear el asa de siembra), muestra de microorganismo problema, agua destilada estril,
vaselina (opcional).
Tcnica - Mtodo de examen en fresco entre portaobjetos y cubreobjetos:
- preparar portaobjetos y cubreobjetos limpios y desengrasados
- depositar una gota de agua estril en el portaobjetos (50ul/lambdas)
- con el asa de siembra esterilizada por flameado, tomar un poco de muestra del
microorganismo y suspenderla en la gota.
- homogeneizar la muestra, colocar con cuidado sobre la suspensin un cubreobjetos,
evitando que se formen burbujas de aire al caer el cubre sobre la suspensin.
- observar al microscopio con objetivo de 40 aumentos.

Mtodo de examen en fresco sobre gota pendiente en porta excavado:
- colocar en el centro de un cubreobjetos una gota de la suspensin microbiana con una asa
de siembra estril.
- colocar vaselina en los bordes del pocillo del porta excavado
- invertir el cubre sobre el porta excavado, colocandolo encima del rea cncava del
portaobjetos.
- la vaselina adherir el cubre al porta formando una cmara evitando su evaporacin y
corrientes de aire.
- se invertir la preparacin
- observar al microscopio con objetivo de 40 aumentos.

Resultados - es importante no confundirlos con los movimientos brownianos que se
producen cuando se desplaza el medio liquido y hace que todos las bacterias siga dicha
corriente en dicha direccin; el sellado con vaselina evita este problema.

Coloracin vital - es una tcnica intermedia entre los exmenes en fresco y las tcnicas
de tincin despus de fijacin previa???; consiste en teir las muestras bacterianas con
colorantes muy diluidos, permite al microorganismo acumular parcialmente dichos
colorantes; la dilucin debe ser muy altas para que no resulten toxicas para las bacterias,
evitando la muerte de tales grmenes; material => microscopio, asa de siembra estril,
portaobjetos, cubreobjetos, mechero, papel de filtro, una suspensin de muestra problema,
aceite de inmersin, altas diluciones de colorantes para disminuir su toxicidad (rojo neutro
en solucin acuosa al 1:1.000 o 10 lambas : 10 ml y azul de metileno en solucin acuosa al
1:1.000 o 1:500).

Tcnica (se puede hacer igual como en fresco) - colocar sobre el portaobjetos
limpio y desengrasado una gota de suspensin muestra junto con otra gota del colorante
diluido utilizado; mezclar bien ambas gotas con el asa de siembra y colocar el cubre objetos
con cuidado para evitar que se formen burbujas de aire; observar al microscopio con
objetivo de inmersin; resultados => los microorganismos se visualizaran vivos y
ligeramente coloreados de rojo, en el caso de haber utilizado como colorante el rojo neutro
o de color azul si se utiliza el azul de metileno.


Tema 12 - Las tinciones en bacteriologa

La morfologa bacteriana (es incolora) puede ser estudiada por visualizacin de los
microorganismos => vivos sin teir (observar su posible movilidad) y teidos mediante
colorantes con una concentracin que matan la bacteria y no permiten observar su
movilidad, pero mejora notablemente la visualizacin de su morfologa y estructuras.

Ventajas de las tcnicas de tincin:
- observar mas adecuadamente su morfologa y permite diferenciar entre los distintos tipos
- dar informacin complementaria de sus estructuras internas y/o externas que no se
observa en fresco.
- al conocer sus caractersticas tintoriales, nos orienta hacia un grupo u otro en la
clasificacin bacteriana.

Factores que afectan a toda tcnica de tincin:
- pureza del colorante (a + impurezas => + error y - calidad en la tincin).
- concentracin del colorante (valores ideales oscilan entre 0,2 y 2%)
- pH del colorante (en general son neutro +/- 7 o entre 6,8-7,4)
- conservacin del colorante
- elaboracin (no lo hacemos /vienen preparadas)
- tcnica empleada (material limpios y seguir los pasos de la tcnica)
- temperatura (en general la ambiental)
- cantidad de muestra (representativa y homognea)
- realizar correctamente el frotis (fijarlo bien, en general por calor => coagula las proteinas
bacterianas, para que no se arrastre con el colorante mordientes y decolorantes)
- soluciones mordientes (ayudar a fijar el colorante a las estructuras microbianas, p.ej.
lugol en la Gram)
- tiempos de tincin (segn el colorante que usemos)

Principales tcnicas de coloracin - clasificacin de colorantes => [1] segn su origen
(naturales y artificiales) [2] segn su comportamiento qumico (cidos, bsicos y neutros).
Colorantes naturales - extrado de plantas como la hematoxilina (del tronco de una
planta que por oxidacin produce hematena; el azul de ndigo (de una
leguminosa); extrado de animales como el carmin (de una cochinilla)
Colorantes artificiales - preparados artificiales y obtenidos de alquitrn de
hulla(colorantes anilina cidos, bsicos y neutros en forma de sales) p.ej. cristal violeta,
violeta de genciana, fucsina bsica, acido pcrico, azul de metileno, etc.

Colorantes segn su comportamiento qumico - se unir de forma mas estable a la
estructura que tie, dependiendo de su estructura fsico-qumica; constituido por un anillo
bencnico que unen distintos radicales => radical cromforo; a+ numero de radicales =>
+poder colorante de la solucin;
[1] colorantes cidos o aninicos: la carga del radical colorante es (-) => colorantes
citoplasmticos que son bsicos (los componentes citoplasmticos captan muy bien los
colorantes cidos) => las eosinas, las auraminas.
[2] colorantes bsicos o catinicos: la carga del ion cromforo es (+) => colorantes de
la zona nuclear que son cidas o ligeramente cidas => fucsina bsica, cristal violeta o
violeta de genciana, azul de toloudina, azul de metileno o las tioninas.
[3] colorantes neutros: es una sal compuesta de un colorante acido y un colorante
bsico => el eosina azul de metileno; es hidro-solubles (posee las propiedades de
colorantes cidos y bsicos).
[4] colorantes indiferentes: insolubles en agua y solubles en alcohol, no predomina ni
la carga+ ni (-), pero tampoco es de carcter neutro => colorantes de los lpidos
como Sudan III, Negro Sudan, etc.

En bacteriologa es frecuente la utilizacin de => fucsina fenicada, violeta de genciana, azul
de metileno (son colorantes bsicos) y de aadir un mordiente que ayude a fijar dicho
colorante; los colorantes cidos se utiliza como un contraste y los colorante neutros e
indiferente como coloraciones particulares; el proceso de tincin => reaccin de
intercambio de iones entre colorante y sitios activos de la superficie o del interior de la
clula (los iones teidos/colorantes reemplazan iones de los componentes celulares) y esto
permite contrastar mucho mas el germen con respecto al medio que le rodea.

Preparacin de un frotis - realizar una extensin y fijar la muestra problema para
posterior coloracin y visualizacin al microscopio; poner en un portaobjetos, a traves de
un asa de siembra una cantidad de microorganismo problema suspendido en medio
liquido estril, extendindolo adecuadamente hasta formar una fina pelcula homognea
que posteriormente se fijara generalmente con calor cuando sea requerido, segn el
mtodo de tincin que se utilizara posteriormente; material => portaobjetos, asa de
siembra o platino, agua estril, muestra problema; tcnica => pequea cantidad de la
muestra liquida se deposita y se extiende homogneamente en el centro del portaobjetos
con el asa de siembra para tener una capa fina (segn la viscosidad, se puede diluir con
unas gotas de agua estril); si la muestra es solida (una colonia), se deposita primero una
gota de agua estril y se aade con el asa de siembra una pequea cantidad de la colonia, se
extiende homogneamente; dejar secar al aire; se fija mediante el flameado (en algunos
casos se podr hacer con alcohol) para coagular las protenas y los grmenes quedan
adheridos al portaobjetos.

Tcnica de tincin - los pasos:
-realizar un frotis y fijacin por calor (generalmente), con la intensidad de calor adecuada
que soporte el dorso de la mano.
-coloracin segn el tipo de tincin (generalmente con colorantes bsicos que tien
estructura acida)
-decoloracin que permite diferenciar distintos grupos bacterianos (genero Micobacterium
son resistentes a la decoloracin cida/BAAR); Gram(-) decoloradas con el alcohol
96/alcohol acetonas, alcohol acido, acidoclorhidrico => micobacterias
-lavado siempre entre paso y paso con agua destilada para evitar interferencias entre un
producto y otro.
-coloracin de contraste (generalmente cido), se aplican al final para las estructuras
decoloradas con el decolorante, p.ej. safranina.
-observacin al microscopio
Tipos de tinciones bacterianas:
(1) Tincin simple => fijacin previa, se utiliza 1 solo colorante, permite la visualizacin
de la morfologa y la agrupacin bacteriana; clasificacin => tinciones simples con
colorantes bsicos, cidos y neutros; se basa en => la afinidad de los colorantes que suelen
ser de tipo bsico (azul de metileno, violeta de genciana, azul de toloudina => 1-2 minutos,
dan color azul a las celulas o fucsina fenicada diluida => da color rojo a los componentes
celulares.

(2) Tincin negativa => es un tincin simple (1 solo colorante => tinta china o solucin
acuosa de nigrosina al 1%) con diferencias que no necesita fijacin previa (no mata las
bacterias), permite observar caractersticas estructurales de la bacteria ademas de su
morfologa sobre un fondo oscuro, como es la presencia de capsulas p.ej. los
neumococos; se basa en => colorante acido cargado negativamente, los microorganismos
no se tien (se quedan claros y brillantes sobre un fondo teido oscuro); para obtener una
capa fina (para dejar pasar el paso de luz del microscopio y evitar a formarse grietas al
secarse el colorante) se puede hacer una extensin con el borde de otro
portaobjetos; resultado => se observan las capsulas (si las tienen) en forma de un halo mas
claro que rodea el cuerpo de la bacteria.


(3) Tinciones diferenciales => fijacin previa (en general por calor), se utiliza 2
colorantes(el ultimo es de contraste), permite visualizar su morfologa y caractersticas
estructurales (composicin de la pared bacteriana, su resistencia a la decoloracin cida
(t.Gram y t.ZhielNeelsen).
(4) Tinciones estructurales => fijacin previa (en general por calor), se utiliza al menos
2 colorantes, nos permite observar su morfologa y caractersticas estructurales como
esporas, flagelos, cilios, capsulas, corpsculos metacromticos (utiliza 1 solo colorante???).
Tincin diferenciales de Gram => descubierto en 1883 por Cristian Gram, cuando
trabajaba con material de biopsias y utilizada a partir de 1886 como tincin diferencial; es
ms empleado en bacteriologa, para clasificar 2 grandes grupos (Gram(+) y Gram(-) );
distinto comportamiento debido a la distinta composicin de la pared de las clulas
bacterianas; se emplea como el primer colorante bsico (cristal violeta o violeta de
genciana) que teir de color azul violeta todas las bacterias, posteriormente un mordiente
el lugol que aumenta la afinidad del primer colorante a las clulas (lo fijara), finalmente
un agente decolorante que decolora solamente un tipo de bacterias (Gram(-)) que sern
teidas con el colorante de contraste o segundo colorante (la safranina) de color rosa-rojo;
si se quedan con el color azul violeta sern Gram(+).


Material de la tincin Gram => portaobjetos, pinzas de madera, asa de siembra,
mechero de Bunsen, pipeta Pasteur, asa de tincin (punte), frasco lavador, muestra
problema, aceite de inmersin, colorantes para la tincin de Gram.
Tcnica:
- realizar la preparacin de frotis => extender 1 gota de agua destilada estril + una colonia
de la bacteria problema por la superficie de la portaobjeto
- fijacin por el calor, pero no quemar las bacterias
- aplicar el colorante cristal violeta durante 1,5 minuto o violeta de genciana durante 2
minutos
- lavar abundantemente con agua para eliminar el exceso de colorante
- aadir un mordiente, el lugol durante 1 minuto (solucin iodoiodura de potasio con OH
de 96 o con acetona a 5/1 o con OH 50%)
- vuelve a lavar con agua el exceso
- decolorar con solucin decolorante (alcohol 90)
- lavar abundantemente con agua
- cubrir el portaobjetos con la safranina durante 1 minuto. lavar con agua para arrastrar los
restos de colorantes y dejar secar al aire - observar con objetivo de inmersin (100x).
Tincin de grmenes del acido alcohol resistentes (BAAR + criptococo)
A. Tincin de Ziehl-Neelsen
Este mtodo fue desarrollado por Ehrlich en 1882 trabajando con bacilo de Koch y
mejorado posteriormente por Ziehl-Neelsen; objetivo => diferenciar del resto, las
bacterias tipos BAAR (bacterias acido alcohol resistentes, p.ej. Mycobacterium), debido a
su gran cantidad de componentes miclicos (lipoideos y cereos/cera) que forman parte de
la pared de este tipo de bacteria (los colorantes convencionales no penetran en el interior
de estas bacterias); De ah se necesitan colorantes altamente concentrados y la presencia
de calor que facilite su penetracin al interior de dichas bacterias; una vez teidas, su
decoloracin posterior no es posible (resiste incluso a decoloraciones cidas); dicha tincin
se emplea principalmente para el diagnostico y estudio de enfermedades como
tuberculosis y la lepra.
Material => es el mismo que esta descrito en la tincin simple, pero en cuanto los
reactivos:1 colorante - solucin fenicada de fucsina bsica (carbo fucsina), 2 colorante de
contraste - solucin hidro-alcohlica de azul de metileno fenicado, 3 decolorante - alcohol
acido al 3%(97% alcohol).
Tcnica => preparacin de frotis y fijacin calor; cubrir el frotis con fucsina fenicada
bsica 5 minutos aplicando en este tiempo calor, hasta la emisin de vapores, evitando que
se caliente demasiado o que se seque el colorante; lavar abundantemente con agua
destiladahasta arrastrar el colorante; decolorar con alcohol acido para arrastrar restos del
colorante (10-30 segundos); lavar abundantemente con agua destilada; cubrir el frotis
con colorante de contraste /azul de metileno fenicado 30 segundos sin necesidad de
calentar, para teir aquellas bacterias que no son resistentes a la decoloracin (se han
decolorado) y resaltar el color rojo de los BAAR+; lavar, secar, rotular y observar con
objetivo de inmersin.
Resultados => con el 1 colorante, BAAR- y BAAR+ (ambas) se tien de rojo; con el
decolorante, BAAR- se decoloran y BAAR+ no se decoloran; con el 2 colorante (de
contraste), BAAR- setien de azul y BAAR+ permanecen de color rojo/ acido alcohol
resistencia+ (bacilos Mycobacterium y algunos Nocardia)

B. Mtodo de Kin Youw modificado (coloracin en fri) Reactivos => 1 colorante:
fucsina fenicada (con fenol) de KinYouw, decoloracin a 3%, 2 colorante: azul de metileno
fenicado (con fenol); tcnica => idntica, salvo para la fucsina de KY, dejamos actuar 5
minutos sin calentamiento; existen otras tcnicas de tincin de los BAAR => tincin de
auramina o de rodamina que usan microscopio de fluorescencia.
Tincin de espiroquetas (para las espiroquetas)
Tincin estructurales => tincin de esporas, de flagelos, de cilios (similar a flagelos, pero
corto y se extiende por todo el cuerpo, como pilis), de corpsculos metacromticos y de
capsulas.
Tincin especiales => tincin de auramina y de naranjo de acridina.

Tema 13 - Pruebas bioqumicas para la deteccin del metabolismo
hidrocarbonado de las bacterias.

Metabolismo - conjunto de reacciones qumicas que tiene lugar en las clulas vivas;
necesitan energa que se obtiene por oxidacin (perdida de electrones) de sustancias
introducidas en forma de alimentos; la gran mayora de las bacterias (hetertrofas) se
nutren de sustancias orgnicas que proceden de otros seres vivos y otras (auttrofas -
cianobacterias) se nutren de sustancias orgnicas que sintetizan ellas mismas a partir de
sustancias inorgnicas; 3 etapas en metabolismo =>
1-catabolismo/hidrlisis/degradacin de sustancias nutritivas => compuestos ms
sencillos + energa en forma de ATP (adenosin trifosfato)
2-anfibolismo/metabolismo intermedio del producto del catabolismo => compuestos de
bajo peso molecular
3-anabolismo/metabolismo biosinttico de sustancias simples => biosntesis de
macromolculas /moleculas complejas + gasto de energa.

Enzima - catalizadores biolgicos (protenas); cada enzima afecta solo a un sustrato
especifico.
Reduccin => captan electrones.

Catabolismo de hidratos de carbono - oxidacin de azucares para obtener la energa
es muy importante, aunque tambin se catabolizan lpidos y protenas; la 1 etapa de la
degradacin de la glucosa => oxidacin de esta para formar acido pirvico (gluclisis); 2
procesos => la respiracin (necesita O2) o la fermentacin (no necesita O2); la gluclisis
(no precisa O2) se produce en 3 vas, en funcin de la dotacin enzimtica.

1 va glucoltico/ ruta de Embden-Meyerhof Parna (EMP) fue descubierto
porPasteur => se obtiene 2 moleculas de ATP mediante fosforilacin por cada molcula de
glucosa que se oxida; este proceso se puede realizar en presencia o no de O2; a partir de la
formacin de acido pirvico, las bacterias que usan esta va, normalmente utilizan la va
fermentativa para acabar transformando este acido pirvico en cidos
mixtos; degradacin/ hidrlisis de glucosa (6C) => acido pirvico + 2 ATP (fosforilacin)
=> cidos mixtos (fermentacin); son 9-10 reacciones qumicas con un enzima diferente en
cada una; utilizados por las bacterias fermentadoras que poseen
deshidrogenasas (Clostridium, Enterobacter, Salmonella)

2 va de las pentosas fosfato /va fosfoglucnica (va HMP) - es una ruta mixta y
va alternativa; este ciclo rompe los azucares de 5 carbonos /pentosas
y tambin glucosa,mediante sucesivas reacciones y produce => pentosas
intermedias (precursores de sntesis de cidos nucleicos y ciertos aminocidos) de gran
utilidad para las celulas; ademas de la gluclisis via EMP, muchas bacterias utilizan HMP
como una va alternativa para la oxidacin de la glucosa => produce acido lctico o acido
mixto + 1ATP (p.ej.Enterobacterias/ E.coli); esta va es un hbrido de la va ED y la EMP,
ya que en las primeras etapas, la oxidacin de la glucosa es similar a la via ED y en las
etapas posteriores es similar a la va EMP, es decir: proporcionan a las bacterias no
oxidativas un medio de oxidar la glucosa a acido pirvico puro, porque no tienen las
enzimas necesarios para comenzar la va EMP, apareciendo en los sistemas analticos
como fermentadoras.

3 va de Entner-Doudoroff (va ED/ va aerobia => requiere O2) - es otra va por
la cual la glucosa se oxida a acido pirvico; por cada molcula de glucosa se producen 1
molcula de ATP para ser utilizada por la clula en reacciones bio-sintticas; esta
va requiere enzimas especficos y solo los microorganismos que las poseen pueden
utilizarla sin seguir la va de las pentosas fosfato ni la gluclisis; los microorganismos que
la utilizan son Pseudomonas y Neisseria (aerobio estricto), por carecer de las
deshidrogenasas necesarias para oxidar el acido pirvico al acido lctico u otros cidos; los
hidrogeniones se transfieren al ciclo de Krebs y se acabaran obteniendo agua; oxidacin de
glucosa => acido pirvico + 1ATP (no producen acido lctico ni acido mixto)

Respiracin - es un proceso fosforilacin oxidativa de generacin de ATP y se caracteriza
por el aceptor final de electrones generalmente es una molcula inorgnica (O2); la glucosa
se degrada => acido pirvico se sigue oxidando por la va de la respiracin o la
fermentacin (en funcin del sistema enzimtico que tienen) => ATP + CO2 + H2O;
durante la respiracin, cualquier molcula orgnica puede ser degradada /oxidada con un
mayor rendimiento que en la fermentacin.

Respiracin aerbica - cuando el aceptor final de Hidrgenos (electrones) es el O2; en
la respiracin, el acido pirvico producido por la gluclisis se escinde en 2 partes: una
parte se unen con CoA => forman acetil CoA que entra en el ciclo de Krebs donde se
liberan electrones y protones (H+); la otra parte para biosntesis???
Cadena de transporte de electrones (se encuentra en la membrana citoplasmtica de las
clulas procariticas y en las membranas internas de las mitocondrias en las clulas
eucariticas) - los electrones se mueven desde los coenzimas reducidos hasta una molcula
inorgnica como O2 en la respiracin aerbica o hasta una molcula inorgnica diferente
del oxigeno NO3- ion nitrato, SO2-4 ion sulfato, etc.; las molculas transportadoras
de electrones son 3 tipos => [1] flavoprotenas - realizan reacciones de oxidacin
reduccin, [2] citocromos - protenas con un grupo prostticos (Fe) en forma oxidada,
[3] ubiquinonas o coenzima Q - transportadores no proteicos de bajo peso molecular.

Respiracin anaerbica - cuando el aceptor final de electrones (H-) es una sustancia
inorgnica distinta del O2, tal como iones nitratos NO-3, sulfatos SO2-4, carbonatos CO2-
3. (Pseudomonas y Bacillus)
Fermentacin - proceso que se inicia a partir de acido pirvico formado en la gluclisis
de EMP /HMP, en cual el aceptor final de los electrones es un compuesto orgnico y no
requiere O2; caractersticas principales => (1) no precisa O2, pero se puede ocurrir
en su presencia, (2) no necesita el ciclo de Krebs ni cadena transportadora de
electrones, (3) utiliza1 molcula orgnica como aceptor final de electrones, (4) libera
energa a partir de azucares y otras molculas orgnicas (aminocidos, cidos orgnicos,
purinas, pirimidinas), (5) libera solamente 2 molculas de ATP por cada molcula del
sustrato inicial, (6) los productos finales pueden ser acido lctico, etanol y CO2, acido
propinico, acido actico, CO2 y agua, acido butrico, etc. (compuesto orgnico); cuando el
aceptor final de electrones es el lactato, se producir acido lctico y en general cuando el
aceptor final sean otras sales orgnicas, se formaran cidos mixtos p.ej. acido succnico,
que son responsables de la cada de pH en las pruebas empleadas, para la identificacin
bacteriana; adems, las bacterias que tienen la dotacin enzimtica apropiada, pueden
seguir degradando estos cidos mixtos hasta CO2 y otros compuestos orgnicos; es til el
anlisis de los productos finales para identificar as los microorganismos; la mayor parte
de la energa producida en la fermentacin queda almacenada en los productos finales; las
fermentadoras => Streptococcus, Lactobacillus, Clostridium, Escherichia, Salmonella,
Enterobacter.

Prueba de la B-D Galactosidasa (ONPG) - se basa en la capacidad que tienen los
microorganismos de fermentar lactosa, mediante 2 enzimas => Lactosa Permeasa (esta
en la membrana celular y es capaz de transportar la lactosa a travs de ella) y B-D-
Galactosidasa (esta en el interior de la clula y es capaz de desdobla la lactosa en glucosa y
galactosa).

Clasificacin de los microorganismos segun su capacidad de fermentar o no la
lactosa:
- fermentadores activos de lactosa en 24 horas (poseen ambos enzimas)
- no fermentadores de lactosa (carecen de ambos enzimas, no degradan la lactosa, no
penetra en la clula)
- fermentadores tardos de lactosa (poseen el enzima B-D-Galactosidasa, permeabilizar la
lactosa ligeramente cuando la concentracin es alta en 2-15 das).


La aplicacin fundamental es la diferenciacin de
Enterobacteriaceae =>Escherichia (+) es fermentadora activo, Proteus (-) es no
fermentadora y Klebsiella (+) es una fermentadora tarda de lactosa, es decir lactosa (-) y
ONPG (+); para detectar la enzima B-D-Galactosidasa => se utiliza un compuesto similar a
la lactosa (orto-nitrofenol): al liberarse al medio alcalino por la accin de BDG produce un
color amarillo.
Material => 1 tubo de ensayos estriles, bao mara o estufa a 37C, asa de siembra,
solucin fisiolgica estril, discos de ONPG, microorganismo problema
Tcnica => una suspensin densa (con muchas colonias) de un cultivo puro en 0,5 ml de
suero fisiolgico estril se aade un disco de ONPG y mezclar durante unos segundos,
incubar a 37C durante 30-60 minutos (en general se vira antes de 30 minutos)
Resultados => en ONPG+ se produce una coloracin amarillo y en ONPG- no se produce
color (incoloro).
Tema 14 - Pruebas bioqumicas para la deteccin del metabolismo proteico de
las bacterias

Principal productor de energa => catabolismo de la glucosa y las oxidaciones de
protenas y lpidos (estn relacionados entre si); la hidrlisis de protenas/ protena+agua
(mediante enzimas proteolticos extracelulares, secretadas por ciertas bacterias que sirve
para su tipificacin/tipacin) => polipptidos y aminocidos; las pruebas bioqumicas
investigan fundamentalmente la capacidad de un microorganismo de producir la hidrlisis
de la gelatina; catabolismo de protenas/ protelisis se realiza mediante
proteinasas/proteasas y peptidasas (desaminacin) para obtener => ion amonio NH4+ (+)
acido orgnico; acido orgnico entrar al ciclo de Krebs y ion amonio NH4+ es secretado de
la clula.
Produccin de acido sulfhdrico - tcnica con indicador incorporado al tubo/a la
placa => algunos microorganismos actan metabolizando protenas con aminocidos
azufrados (cistina, cisteina) y liberan azufre en forma de gas acido sulfhdrico SH2; el gas
es detectado a travs del medio que contiene fuente de hidrgeno (azcar) fuente de
azufre(tiosulfato sodio, cistina, cisteina) y un indicador de pH (sales de hierro /citrato
frrico amoniacal) => un precipitado negro); se observara la liberacin del gas SH2 por
algunos microorganismo que poseen enzimas desulfurasas (activada por la fermentacin
de la glucosa => acidifica/produce cidos/baja el pH) que actan sobre los aminocidos
azufrados; la temperatura de incubacin (estufa) tiene que oscilar entre 35-36C (superior
a 37 se inhibira la produccin de SH2).

Material => tubo de cultivo (KIA/kliger iron agar y TSI/triple sugar iron), agujas y asas
de siembra, estufa de cultivo, muestras de problema; si se realiza en placa de cultivo
(Hektoen y SS);
Tcnica => a partir de un cultivo puro y reciente de microorganismo problema se tomara
una muestra con una aguja; sembrar en picadura (tubo de KIA o TSI) o con agotamiento en
cuadrante (Hektoen o SS); incubar durante 18-24 horas; si la tcnica se realiza
con Brucella(microaerofila), se debe incubar con una atmsfera de CO2.
Resultados => SH2 positivo (Salmonela y Proteus) se observa a lo largo de la lnea de
inoculacin ennegrecimiento del medio; SH2 negativo (Brucella y Shigella) no se
ennegrece el medio.
Bacteria con enzimas desulfurasas (activada por la fermentacin de azucar) + indicador de
pH/sales de Fe + fuente de S + (H+) => H2S gas + indicador pH => precipitado negro
insoluble/ puntos negros (FeS)
Prueba de las descarboxilasas - enzimas que actan sobre el grupo carbxilo de los
aminocidos Lisina, Ornitina, Arginina para formar => aminas (alcalinas) y se desprende
CO2 (el proceso se realiza en anaerobiosis) => se realiza mediante el sistema multiprueba
(API - buscar el cdigo en el libro); estas pruebas se aplican para la identificacin de
Enterobacteriaceas; se investiga la alcalinizacin del medio inicialmente de color purpura,
se observara el viraje del color del indicador del pH; la presencia del enzima investigado
supondr la alcalinizacin del medio (sigue el mismo color como el inicio); cada pocillo
contiene indicador de pH y amino acido correspondiente al enzima a investigar; cada
descarboxilasa acta sobre un aminocido especifico; en cada reaccin se desprende CO2 y
se alcaliniza el medio:
- L-lisina + LDC/lisina descarboxilasa => Cadaverina + CO2
- L-ornitina + ODC/ornitina descarboxilasa => Putrescina + CO2
- L-arginina + ADH/arginina deshidrolasa => L-citrulina + NH3 (descarboxilacin) =>
Putrescina +CO2


Material => pruebas de API, pipeta Pasteur.
Reactivos => caldo de Moller para descarboxilasas (lleva pequea cantidad en su
composicion una pequea cantidad de glucosa, peptonas y los indicadores rojo cresol y
purpura de bromo cresol, pH6); aminocidos ensayados en forma L, muestra de problema
y papel parafina.
Tcnica => se aade una gota del inoculo (suspensin microbiana) en cada pocillo de la
prueba de API; se incuba a 35C durante 18-24 horas.
Resultados => durante las primeras horas de incubacin, el caldo vira a amarillo, por la
fermentacin de glucosa que lleva el medio; pero si el aminocido es descarboxilado, el pH
vuelve a subir, ya que se forma aminas alcalinas que es de color purpura (descarboxilasa+);
si se queda amarillo sera descarboxilasa-; grmenes con descarboxilasa+ (Escherichia no
es 100% descarboxilasa + de Lisina, Arginina y Ornitina):
- Lisina => Klebsiella, Serratia, Salmonella
- Ornitina => Serratia, Proteus, Salmonella
- Arginina => Salmonella, Pseudomonas

Tema 15 - Pruebas bioqumicas para la deteccin de la actividad enzimtica de
las bacterias

Pruebas oxidasa - esta denominacin se le da de forma genrica al enzima citocromo
oxidasa que participa en la transferencia de electrones en la cadena respiratoria hacia el
oxigeno; oxidasa => enzima que cataliza la transferencia de electrones del sustrato al
oxigeno; los aerobios o anaerobios facultativos obtienen su energa por la respiracin y la
almacenan en forma de ATP, el oxigeno es reducido a partir de un sustrato orgnico que
procede de la nutricin con la intervencin de un sistema de transporte de electrones
denominado cadena respiratoria, producindose agua o perxido de hidrgeno segn la
especie microbiana; los citocromos son hemo-protenas que contiene Fe y actan como
ltimo eslabn de la cadena respiratoria aerobio, transfiriendo H+ al O2 con formacin de
H2O; este sistema se encuentra en los organismos aerobios y anaerobios facultativos,
carenciandolo de ello los anaerobios estrictos; se observara el cambio de color de un
indicador de pH incoloro cuando esta reducido (p-fenilendiamina=> formar indofenol de
color violeta oscuro) y coloreado cuando se oxida;
Aplicacin => detectar en el microorganismo estudiado el enzima citocromo oxidasa;
diferenciar entre Enterobacteriaceas (oxi(-)) de Pseudomonadacea (oxid(+)); diferencia
entre gneros Moraxella (oxi(+)), Neisseria (oxi(+)) de Acinetobacter (oxi(-)).


Material => placa sembrada con microorganismo problema, asa de plstico, papel de
filtro, porta, reactivo oxidasa de Kovacs.
Tcnica => mezclar una pequea muestra pura con el reactivo en el papel de filtro que se
sita por encima de una porta, esperar 30-60 segundos y se observar el posible cambio de
color; otra manera: se aade directamente el reactivo oxidasa de Kovacs sobre las colonias
de la placa Petri con agar sangre y tambin en otro medio; si son oxidasa positivo toman un
color marrn y en seguida pasan a negro parduzco.
Resultados => oxidasa+ aparece un color purpureo en el papel, si se desarrolla el color a
los 10-60" se considera oxidasa retardado positivo, despus de 60" es negativo; oxidasa- no
se produce color.
Pruebas de catalasa
La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayora de los microorganismos aerobios
y anaerobios facultativos que contienen citocromo; es un enzima fundamental que acta
sobre el perxido de hidrgeno/H2O2 (es un producto final de la degradacin aerbica
oxidativa de los hidratos de carbono); si se acumula H2O2, estos grmenes moriran;
fundamento:si el microorganismo tiene el enzima catalasa y se pone en contacto con H2O2
=> se descompone en H2O + O2; aplicacin => diferenciacin de Streptococcus (-) de
Staphylococcus (+) y Micrococcus (+);


Material => portaobjeto, pipeta Pasteur, asas de siembra de plstico (las de platino
catalizar la reaccin)
Reactivo => H2O2/ agua oxigenada, microorganismo de problema
Tcnica => se coloca una gota de H2O2 (agua oxigenada) en un porta objeto,
simultneamente, con una asa se aade una colonia del cultivo del microorganismo de 12-
24 horas, homogeneizar y observar.
Resultados => catalasa+ forma burbujas de O2 inmediatamente; catalasa- no aparecen
burbujas; se podrn observar falsos positivos si se utilizaran medios de cultivo agar
sangre o otros que lleven hemates (los hemates contiene catalasa).

Pruebas de Nitrato reductasa o Nitratasa (se realiza con multiprueba de API)
La nitratasa (nitrato reductasa) es el enzima que cataliza el proceso en cual el nitratos son
reducidos a nitritos (presentes en algunos microorganismos anaerobios o anaerobios
facultativos que utilizan nitrgeno como ultimo aceptor de electrones en el proceso
metablico/ respiracin anaerbica); depende de la especie bacteriana se trate, se pueden
producir diversos productos finales; reaccin: nitrato/NO-3 + nitratasa => nitrito/NO-
2 =>N2 (nitrgeno molecular/ gas nitrgeno) o otros => amoniaco / oxido ntrico / oxido
nitroso / hidroxil amina; la prueba detecta los productos finales liberados al medio
mediante un reactivo colorimtrico API; aplicacin => diferenciacin de especies
de Haemophilus y Neisserias; cuando no se forma color (rojo) al aadir los
reactivos, puede significar => [1] no se ha reducido el nitrato, se comprueba
aadiendo polvo de zinc que acta como reductor y si hay un cambio al rojo, es nitratasa (-
) y si no hay cambio de color, sera nitratasa (+); [2] la reduccin de nitratos ha sido llevada
hasta la formacin de N2, se observa con la aparicin de grietas o burbujas; [3] la
reduccin de nitratos ha formado otros productos nitrogenados (oxido ntrico, amoniaco,
hidroxil-amina, etc.);

Material => multiprueba de API; reactivo => Nit A y Nit B, Zinc en polvo,
microorganismo; el medio no debe contener azufre ya que si el microorganismo es
productor de H2S (acido sulfhdrico) este impide la formacin de color; tcnica =>
hacemos un inoculo a partir de un cultivo puro reciente de 12-24 horas, inoculamos el
medio; incubar a 37C durante 12-24 horas, agregar 1 gota de Nit A y 1 gota de Nit B,
observar si hay un cambio o no antes de 30 segundos (se interpreta rpido, ya que el color
puede desaparecer); si no se forma color, se aade al tubo un poco de polvo de
Zinc; resultados => hay 2 posibilidades de que sean Nitratasa+ (Haemophilus y
Branhamella Catarallis): [1] cuando aparece color rojo o rosado fuerte al aadir el reactivo
A y B que indica la reduccin de nitratos a nitritos; [2] al aadir polvo de zink no se
desarrolla color indica formacin de otros productos nitrogenados;Nitratasa- => cuando se
forma color rojo o rosado al aadir polvo de zinc en menos de 30 segundos.

Prueba de Ureasa (se hace en manual y con el sistema API) - detecta la presencia de la
ureasa en los microorganismos cuando se observa la alcalinizacin de un medio liquido; la
ureasa cataliza la hidrlisis de la urea => carbonato amnico, que sube el pH, con lo que el
medio se alcaliniza; aplicacin => diferenciar Proteus (+) de otras Enterobacteriaceas /
E.coli (-) o positivo retardado (+) como Klebsiella;


Material => tubos de cultivo, asas, pipeta Pasteur, estufa de cultivo o bao mara.
Reactivo => caldo urea de Stuart/ urea-indol (de color mbar) y microorganismo de
problema
Tcnica => con el asa estril se toma una muestra de cultivo puro reciente 18-24 horas;
inoculamos el microorganismo en un tubo con caldo urea de Stuart; incubar 37C; la
reaccin se produce entre 1-4 horas
Resultados => en ureasa (+) el caldo de color mbar vira a rosa fuerte durante el tiempo
de reaccin (1-4 horas); en ureasa (-) no vira el indicador; algunas cepas de Klebsiella,
Enterobacter, Brucella, requieren 6 das de incubacin.

Prueba de Coagulasa (se hace con el kit comercial que contiene Acs anti coagulasa) -
observar la coagulacion del plasma en forma de grumos o precipitacin al ponerse en
contacto el microorganismo con el reactivo (si se utiliza el plasma en la prueba); la
coagulasa es un enzima producido por microorganismos capaz de coagular en
plasma; aplicacin => diferenciar Staphylococcus aureus (coco Gram(+), catalasa(+),
beta hemoltico (+) y coagulasa(+) de otro Staphylococcus; esta prueba solo se hace si el
germen es coco Gram(+), catalasa(+), beta hemoltico(+); tcnica => (usando el kit
comercial /prueba de ltex) seguir la instruccin de la casa comercial que hacen el
reactivo; resultados => coagulasa(+) se observa en forma de grumos (si se utiliza un
plasma como reactivo => se observara la formacin de un hilo de fibrina en la reaccin) y
en coagulasa(-) no se forma grumos.


Prueba de Triptfano Desaminasa (TDA) - se basa en la capacidad que tienen
algunas bacterias de desaminar el triptfano por la accin de TDA, produciendo =>
acido indol pirvico que reacciona con citrato frrico amoniacal y el cloruro frrico que
lleva el medio produciendo un color marrn (determina la presencia de la enzima
TDA); tcnica => en un medio liquido de TDA (color mbar); se puede utilizar el reactivo
urea-indol; aadimos 1 sola colonia de un cultivo puro y 1 gota de reactivo TDA del API,
incubar a 37C entre 18-24 horas, y leer; resultado => el color marrn/caf indica la
presencia de TDA+ y sera negativo si no hay cambio de color; los gneros que tienen TDA+
=> Proteus, Providencia y Morganella.
Tema 16 - Pruebas bioqumicas simultaneas (macro-tcnicas, micro-tcnicas,
sistemas rpidos, otros mtodos)

Macrotcnicas - sistemas multiprueba que permiten realizar varias pruebas bioquimicas
simultneamente, facilitando notablemente la identificacin del microorganismos:
- Kliger Iron Agar (KIA)
- Triple Sugar Iron (TSI)
- Agar Sulfuro Indol Motilidad (ASIM) Motility Indol Agar (MIA)
- IMVIC
- Lisina Iron Agar (LIA)
- Motilidad Indol Ornitina (MIO)

KIA (Kligler Iron Agar) - se pueden realizar 3 pruebas a la vez:
- utilizacin de azucares (fermentacin glucosa 0,1% y lactosa 1%)
- produccin de gas (CO2)
- produccin de acido sulfhdrico (SH2)

Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de
fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de
hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de
color negro.
Fundamento => cuando el microorganismo fermenta los azucares, se acidifica el medio
porque se forman cidos orgnicos; si el medio no tienen azucares como fuente de hidratos
de carbono, utilizara protenas que alcalinizan el medio por la formacin de aminas; las
protenas en condiciones de aerobiosis (en el pico) se metabolizan mejor por la va de
descarboxilacin oxidativa de los aminocidos que en anaerobiosis (en el fondo); la glucosa
se metaboliza mejor que lactosa (la molcula es mas pequea/sencilla); para metabolizar la
lactosa, el microorganismo debe tener B-D galactosidasa y lactosa permeasa.
Material => tubos de cultivo, asa y aguja de siembra, estufa de cultivo
Reactivo => tubo con agar KIA en pico de flauta (color rojo anaranjado), microorganismo
Tcnica => es importante tener un tubo de control; se recoge una colonia puro y joven
con un aguja; inocular por picadura y estra un tubo de cultivo con medio KIA en pico de
flauta; incubar 18-24 horas a 37C; la reaccin se ha de observar justo despus de terminar
el periodo de incubacin (suficiente tiempo para la fermentacin del azcar); si se lee
despus de 24 horas, se puede dar un falso alcalino, porque el germen habra utilizado la
peptona y el medio se alcaliniza; el pH esta ajustado a 7,4 (neutro) e indicador rojo fenol a
6,8 (cualquier cambio de pH va a virar el medio);
Resultados => se observaran los 3 parmetros: cambios de pH/color, produccin de gas
CO2 (grietas en el medio/ se desplaza) y produccin de acido sulfhdrico SH2 (precipitado
negro); siempre se compara con un tubo de control no inoculado.


Cambios de pH - [a] resultado final de la fermentacin solo de la glucosa => K/A zona
superficial roja (reaccin alcalina de las aminas) y zona profunda amarillo (reaccin
cida);despus de la fermentacin de la glucosa, el medio de cultivo inicialmente es
amarillo entero, pero posteriormente la parte del pico se alcalina/rojo (haba poca cantidad
de glucosa) por la descarboxilacin oxidativa de los aminocidos (que forman la peptona)
que se produce mejor en aerobiosis; la fermentacin de glucosa en el pico es inicialmente
mediante la va EMP, utiliza tanto para los aerobiosis y anaerobiosis, dando un intermedio
clave (acido pirvico), que a su vez el acido pirvico es degradado mediante el ciclo de
Krebs por los aerobiosis o anaerobiosis facultativos dando CO2 + H2O y ATP; en cambio,
en el fondo, el acido pirvico es degradado hacia acido lctico y acido mixtos que mantiene
el pH acido de manera estable.; son caractersticas de Morganella, Providencia y
Shigella; tambin P.mirabilis, S.typhimurium, S.enteritidis, S.flexneri.
[b] en la fermentacin de glucosa y lactosa => A/A zona superficial y profunda son
amarillas (caractersticas de E.coli y K.pneumoniae);
[c] no metabolizan ni lactosa ni glucosa (pero si la peptona) => K/K todo el tubo es de
color rojo (si se trata de anaerobiosis) o si se trata de aerobiosis, la zona profunda es de
color naranja (se alcalina mas la zona con mas O2 => Pseudomonas, P.aeruginosa)
[d] si no se consume ni glucosa, ni lactosa ni peptona => no hay cambio de color en el tubo
(grmenes inertes).

Produccin de gas CO2 - aparecen burbujas, agrietamiento o desplazamiento del medio
del fondo del tubo, debido a la formacin de hidrgeno y de anhdrido carbnico (CO2)

Produccin de acido sulfhdrico SH2 - se manifiesta por el color negro de la capa
profunda o un anillo negro cerca de la parte superior de la capa profunda o un precipitado
negro en la capa profunda (que puede enmascarar la acidificacin del medio =>
fermentacin de la glucosa activa la desulfurasas); SH2+ => Proteus y Salmonella.

TSI (Triple Sugar Iron) - identificacin de Yersinia enterocolitica como sacaroltica
(tambin Proteus, Lactobacillus y Clostridium), ya que el medio lleva el 3er hidrato de
carbono (sacarosa al 1%); los fundamentos y la interpretacin de los resultados son los
mismos que en el mtodo anterior, pero es imposible saber si el azucar utilizado es uno u
otro o ambos.


Agar sulfuro-indol-motilidad/ ASIM o motility-indol-agar (MIA) - tal como
indica su nombre, sirve para determinar la motilidad de los microorganismos, la
produccin de indol y la formacin de acido sulfhidrico; la forma de realizarla es la
siguiente => se siembra en picadura y se incuba a 37C durante 18-24 horas; la motilidad
se ver por la zona del inoculo con un zig-zag (en la picadura); la produccin de indol se
ver con un cambio de color a violeta purpura (el medio es de color violeta clarito); la
produccin de SH2 se ver por un cambio a negro.


IMVIC (Indol - Motilidad - rojo de Metilo - Voges-Proskauer - Citrato) - se
emplean en la identificacin de la familia enterobacteriaceas; se hacen de una en una y
conjuntamente;
Prueba de indol => estudia el metabolismo proteico/ la capacidad de degradar el
triptfano (aminocido) y de formar segn la bacteria: indol y productos indlicos (escatol,
acido indol-actico), mediante triptofanasa (enzima intracelular).
Material => tubos de ensayo, asa de siembra, pipeta Pasteur, estufa de cultivo, mechero.
Reactivo => caldo urea-indol de la casa Biomerieux, reactivo indol de Kovacs,
microorganismo.
Tcnica => Mtodo de Kovacs: en el tubo con 500 lambdas de reactivo urea-indol, se
siembra el microorganismo problema, incubar a 37C durante 4 horas, aadir al cultivo 2
gotas de reactivo indol de Kovacs (debe ser siempre fresco), agitar suavemente el tubo y
dejar unos segundos en reposo.
Resultado => en indol(+), aparece un anillo rojo en la superficie del medio (E.coli);
en indol-, no hay cambio de color (Klebsiella pneumoniae)


Prueba de rojo de Metilo => muchas enterobacteriaceas con importancia clnica
(E.coli, Proteus mirabilis, Yersinia, Salmonella typhimurium, Citrobacter
freundii, Sighella, Vibrio) son anaerobios facultativos, que para tener energa para sus
reacciones metablicas, utilizan la fermentacin acido-mixta de los hidratos de carbono
producindose => acido succnico, acido actico, alcohol etlico (cidos mixtos); en RM
positivo, aparecen un color rojo fuerte en la superficie y en RM negativo, no hay cambio en
la superficie del medio.
Material => igual que anterior
Reactivo => Medio de Clark y Lubs en tubo (liquido amarillo), solucin de rojo de metilo
y microorganismo
Tcnica => (a) en el tubo del medio Clark y Lubs se siembra el microorganismo problema
(b) actualmente se utiliza la modificacin de Barry que es poner un inoculo abundante en
0,5 ml de reactivo de Clark y Lubs y dejar incubar entre 18-24 horas (c) a este cultivo se le
aaden unas 5 gotas de indicador rojo de metilo que es rojo a pH 4,5 y amarillo a pH 6,3; el
medio cambiara de color cuando el pH sea inferior a 4,5.
Resultados => RM+ superficie del medio rojo fuerte y RM- => color amarillo en la
superficie del medio


Prueba de Voges Proskauer (2 microbilogos) - lo podemos hacer en el API => la
fermentacin butanodilica/ butilengliclica/ acetonica (acetil metil carbinol) que es una
va alternativa de metabolismo de acido pirvico, se produce => un metabolito neutro
(producto intermediario), en presencia de aire y hidrxido potsico 40%/KOH (por
oxidacin) se forma => diacetilo y aadiendo alfa naftol, se forma un complejo rojo; por
reduccin, la acetona forma => 2,3 butanodiol;
Material => multiprueba API y resto igual
Reactivo => Medio de Clark y Lubs (liquido amarillo), solucin de alfa naftol
(VP2),solucin de hidrxido potsico al 40% o hidroxilo sdico al 40% (KOH),
microorganismo problema.
Tcnica => en un tubo de ensayo que contenga un medio de Clark y Lubs se siembra el
microorganismo problema, se incuba 24 horas a 37C, se aade 0,2 ml (200 lambdas)
solucin KOH 40%, luego 0,6 ml de la solucin alfa naftol, agitar e inclinar casi
horizontalmente el tubo para que se favorezca la oxidacin de la acetona, reposar el tubo
10 minutos e interpretar los resultados.
Resultados => en VP positiva (+), p.ej. Klebsiella pneumoniae y Enterobacter aerogenes,
antes de 1 hora aparece coloracin rojo rosada en la superficie del medio; VP negativa (-
) p.ej.E.coli y Proteus, la superficie del medio queda de color amarillento o cobrizo (la
reaccin de los reactivos al mezclarse); la mayora de enterobacteriaceas en VP dan
reacciones opuestas a la reaccin de RM (VP+ => RM- o VP- => RM+); las bacterias VP+
producen menor cantidad de cidos mixtos que sern insuficientes para bajar pH del
medio con rojo metilo, por ello, cuando una bacteria es RM- => VP+.




Prueba del Citrato => se investiga la capacidad del microorganismo de utilizar el citrato
como nica fuente de carbono y sales de amonio inorgnicas como fuente de nitrgeno,
por el crecimiento de colonias y el viraje de color del indicador incorporado en el medio
causado por la alcalinizacin; los microorganismos que utilizan el citrato, tambin utilizan
las sales de amonio; citrato sdico es una sal de acido ctrico que es uno de los metabolitos
del ciclo de Krebs y algunas bacterias pueden obtener energa por una va diferente a la de
la fermentacion de los hidratos de carbono, utilizando al citrato como nica fuente de
carbono;la alcalinizacin del medio es producido por la formacin de amoniaco a partir de
las sales de amonio que haba y la formacin de carbonatos y bicarbonatos se debe a la
degradacin del citrato.
Material => igual que anterior
Reactivos => medio solido de Citrato de Simmons en tubo con azul de bromotimol (agar
inclinado) y microorganismo de problema
Tcnica => inocular un tubo de Citrato de Simmons con microorganismo mediante
escobilln, solo la lengeta y guardar otro tubo que sirve de control negativo; incubar 24-
48 horas a 37C dejando los tubos destapados para que se desprenda el CO2, leer los
resultados a las 18-24 horas de incubacin.
Resultados => en Citrato (+) p.ej. Enterobacter aerogenes, aparece color azul
intenso en la superficie del medio y crecimiento de colonias en la lengeta; en Citrato (-
) p.ej. E.coli, no aparece cambio de color (verde) ni crecimiento.


Micro-tcnicas
1. Sistema en Tiras (API - Biomerieux)
El material y reactivos necesarios para la realizacin de estas pruebas se encuentran
comercializados en kits; fundamento => los medios deshidratados en micro-tubos se re-
hidratan mediante una suspensin de 5 ml de agua estril con 1 colonia bacteriana y se
incuban; el proceso metabolismo del microorganismo, genera cambios del color en el
medio de cultivo o al aadir reactivos y esos cambios se interpretan mediante tablas de
lectura o ordenadores (se deben seguir rigurosamente las instrucciones del fabricante);
principalmente se utiliza para la deteccin de Enterobacteriaceas, bacterias aerobios no-
fermentativas, anaerobios, levaduras, estafilococos; despus de utilizar todo debe ser
incinerado o descontaminado en autoclave o sumergido en un germicida.



2. Sistemas en Tubos (entero-Tube BBL)
Se utiliza para identificacin de Enterobacteriaceas y otras aplicaciones; fundamento =>
un tubo en forma de lpiz con numerosos compartimentos (normalmente son 8 con
diferentes medios, donde pueden leer hasta 11 caractersticas); este tubo se inocula (con 1
colonia del medio y alambre de la inoculacin atraviesa todas las cmaras) y se incuba,
produce cambios de color en cada compartimento; mediante un cdigo numrico o
colorimtrico, se puede identificar al microorganismo.




3. Sistema rpidos - mtodos automatizados
Cuando las muestras son procesadas a travs de mtodos automatizados se logran
excelentes resultados en tiempo muy cortos (se deben seguir las normas dadas por los
fabricantes);
- Para deteccin primaria del crecimiento (espectrofotometra infrarroja) => detecta los
niveles de anhdrido carbnico (CO2), p.ej. BACTEC
- Para identificacin (fotometra) => VITECK (crecimiento, identificacin y antibiograma)









Tema 17 - Pruebas de sensibilidad a los anti-microbianos

Antibiograma - estudio de la sensibilidad del microorganismo patolgico a los
antimicrobianos; se debe hacer antes de establecer el tto de una infeccin microbiana;
diferentes metodos de antibiograma => (1) por difusin que darn resultados
cualitativos de resistencia, sensibilidad o intermedios a los diferentes ATB (2) por dilucin
nos dar resultados cuantitativos en base a 2 conceptos (CMI/ Concentracin Mnima
Inhibitoria y CMB/ CM Bactericida) (3) por deteccin enzimtica, consiste en detectar la
enzima del germen que confiere resistencia a los ATB p.ej. deteccin de betalactamasa,
adenilasa, acetilasa, etc.
Clasificacin de las sustancias anti-microbianas:
(a) un microorganismo es sensible => cuando ATB alcanza niveles plasmticos => a CMI
en el lugar de la infeccin; CMI => la mnima cantidad de ATB capaz de inhibir el
crecimiento de un germen; CMB => la mnima cantidad de ATB que matara al germen;
normalmente CMI es suficiente para combatir una infeccin y los mecanismos
inmunitarios se encargan de eliminar el microorganismo, siendo por tanto la CMI es el
termino ms utilizado.
(b) un microorganismo es resistente => cuando la concentracin mxima de ATB que se
puede localizar en el lugar de la infeccin no es suficiente para eliminar el germen, es
decir, la concentracin de ATB necesario para destruir el germen no se puede elevar mas
por efectos txicos secundarios.
(c) microorganismo de sensibilidad intermedia => no est afectado por dosis normales de
ATB dadas a intervalos normales, pero con una dosis alta en el lugar de la infeccin sin
llegar a dosis que produzcan efectos txicos, puede eliminar el germen.


Casos clnicos => Pseudomonas que da problemas respiratoria/ urinaria y es resistente a
casi todos los ATB, se dar una dosis toxico o una combinacin de ATB por va
endovenosa.

Normas bsicas => no efectuar un antibiograma directamente del producto patolgico,
ni tampoco utilizar mezclas de grmenes (se debe realizar un aislamiento por agotamiento
en placa), excepto para muestras de orina ambulatoria (normalmente es una infeccin
mono-microbiana); para elegir un ATB se deber ensayar aquellos que son tiles
clnicamente y se encuentran disponibles en el mercado farmacutico.

Factores a tener en cuenta: (1) caractersticas tintoriales del germen (Gram(+) o (-
)) (2) lugar de la infeccin (especialmente las vas urinarias y meningitis); es importante
porque es necesario que la CMI sea alcanzable en los lquidos corporales para que sea
efectivo (3)bacteria investigada.
La seleccin de ATB representativo de cada grupo para realizar las pruebas de
sensibilidad
Normalmente se selecciona un ATB representativo de cada grupo para realizar las pruebas
de sensibilidad; habitualmente se acepta que no es necesario hacer pruebas de sensibilidad
para un ATB cuando no se han descrito resistencias en esas especies, p.ej. Streptococcus
pyogenes.


1. Betalactmicos => todo el grupo tiene en comn que presenta un anillo
betalactmico y el mecanismo de accin consiste en inhibir la formacin de peptidoglicano
de la pared celular; son bactericidas.
a. Penicilinas - tiene espectro desigual => a veces es mas efectivo a uno pero no a otro.
* Penicilina G sodica - la forma oral es P V
* Amoxicilina - infeccin del tracto respiratorio inferior: bronquitis aguda y crnica,
neumonas bacterianas y bronconeumona, producidas por
estreptococo, estafilococo sensible,neumococo y H.influenzae. Gastrointestinal: fiebre
tifoidea o paratifoidea. Genitourinaria: cistitis, uretritis, pielonefritis, bacteriuria,
gonorrea, aborto sptico, sepsis puerperal. De piel y tejido blando (incluida infeccin de
herida quirrgica), por estreptococo, estafilococo sensible y E. coli
* Amoxicilina + acido clavulanico (es un inhibidor de las betalactmasas producida por
algunas bacterias)
b. Cefalosporinas - actualmente se ha desarrollado la 4 generacin (semi-
sintticos; bacteriostticas frente a cocos Gram(+) y bacilos Gram(-)
* Cefotaxima (indicado para gonorrea; profilaxis quirrgica; epiglotitis y meningitis por
Haemophilus)
* Cefuroxima (efectividad contra Neisseria gonorrheae y otras bacterias productoras de
penicilinasa; es activa contra Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis y estreptococo beta-hemoltico; son susceptibles Escherichia
coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis)
2. Derivados de betalactmicos:
* Aztreonam - se utiliza comnmente frente a las infecciones causadas por Pseudomonas
aeruginosa, pero su espectro abarca a las enterobacterias (incluida Escherichia coli), como
p.ej. Klebsiella, Haemophilus, Citrobacter y Proteus.

3. Aminoglicosidos => en general su mecanismo de accin es la inhibicin de la sntesis
de protena en diferentes fases segn el ATB; en general derivan de los hongos y son
potentes bactericidas; son de amplio espectro y provocan toxicidad renal y audio
vestbular en alta dosis o a las personas susceptible.
* Estreptomicina (tratamiento de infecciones causadas por grmenes sensibles, como:
Mycobacterium tuberculosis, Salmonellas, enterococos, estreptococos, neumococos y
algunos Gram(-) como Haemophilus influenzae; es eficaz en infecciones del tracto
respiratorio)
* Gentamicina (Acta sobre bacterias Gram(-) aerobias, incluyendo enterobachtericeas,
Pseudomonas y Haemophilus. Acta tambin sobre estafilococos (S.aureus y
S.epidermidis)
* Tobramicina (Infecciones del tracto respiratorio inferior como neumona,
bronconeumona y bronquitis aguda causadas por P.aeruginosa, Klebsiella sp.,
Enterobacter sp., Serratia sp., E.coli y S.aureus)
* Neomicina (es activo in vitro contra Escherichia coli, Klebsiella y contra flora
anaerbica intestinal)

4. Lincosamidas => inhibe la sntesis proteica
* Clindamicina (es un buen ATB frente anaerobios) - Su actividad antibacteriana
es similar a la de eritromicina (macrolidos) en contra de estafilococos y estreptococos;
adems es efectiva en contra de anaerobios, en especial Bacteroides fragilis.
5. ATB polipeptdicos y glucopeptdicos => su mecanismo de accin es inhibir la
formacin de peptido glicano de la pared celular (bactericidas)

a. Activos frente a Gram(+)
* Bacitracina - es utilizado para la identificacin del estreptococo del grupo A a cual es
sensible; es bactericida; se utiliza tpicamente para infecciones cutneas (por su efecto de
nefrotoxicidad) acta sobre cocos y bacilos Gram(+) (Neisseria y Treponema pallidum)
* Vancomicina - por su alta toxicidad renal y ptica, se reservan para infecciones
de Gram(+) resistentes; es bactericida; tiene accin ante cocos Gram(+) y bacilos Gram(+)
b. Activos frente a Gram(-) => ambas (polimixinas) se usan tpicamente sobre
Gram(-), tambin se usa como ATB de identificacin; tienen accin ante entero-
bacterias (excepto Proteus, Providencia y Serratia), Pseudomonas aeruginosa, Vibrio,
Pasteurella, Haemophillus y Bordetella; son ATB de segunda eleccin (para bacilos
Gram(-) resistentes a otros ATB)
* Polimixina B
* Polimixina E (Colistina)
c. Activos frente a Mycobacterium tuberculosis

6. Otros
* Fosfomicina - es un ATB de origen espaol de un amplio espectro que acta sobre la
pared celular (se usa en infeccin urinaria)
* Acido fucsidico - acta sobre la sntesis proteica y destaca su accin
sobre Staphylococcus aureus.

7. Tetraciclinas - son bacteriostticas y su mecanismo de accin es inhibir la sntesis de
las protenas; no se deben administrar a menores de 8 aos por tener efecto secundarios
sobre la denticin y los huesos; tambin pueden producir toxicidad sobre el tracto
gastrointestinal y el hgado; son de amplio espectro; origen biolgico o semi-
sinttico; activas frente a cocos y bacilos Gram(+) y Gram(-) aerobios;
son frmacos de eleccin en brucelosis, clera, granuloma inguinal (ETS).
* Tetraciclina
* Doxiciclina - es el tratamiento de fiebre tifus, fiebre Q, erupciones
pustulosas por Ricketsiasy fiebre de las montaas rocosas por Ricketsias, infecciones del
tracto respiratorio causadas por Mycoplasma pneumoniae; el tratamiento de infecciones
causadas por Gram(-): chancroidecausado por Haemophilus ducreyi, plaga debida
a Yersinia pestis (anteriormente Pasteurella pestis), tularemia debida a Francisella
tularensis (anteriormente Pasteurella tularensis), clera causada por Vibrio chole-
rae (anteriormente Vibrio comma), infecciones por Campylobacter en fetos causadas
por Campylobacter fetus (anteriormente Vibrio fetus), brucelosis causada por especies
de Brucella (junto con estreptomicina), bartonelosiscausada por Bartonella
bacilliformis, granuloma inguinal causado por Calymmatobacterium granulomatis.

8. Cloranfenicol - es de amplio espectro; inhibe la sntesis proteica y es toxica a nivel
medular; es de origen sinttico, bacteriosttico, acta frente a Gram(+) y (-)
(especialmente Haemophilus influenzae y Salmonella)

9. Macrolidos y similares - inhiben la sntesis proteica; amplio espectro; se dan cuando
es alrgica a penicilina; son bacteriostticos y bactericidas en alta dosis.
a. Eritromicina (un buen ATB frente neumnia atpica, legionelosis, difteria, tos ferina)
b. Azitromicina - para tratar ciertas infecciones causadas por las bacterias, como la
bronquitis; neumona; enfermedades de transmisin sexual (ETS); y las infecciones en los
odos, pulmones, piel y garganta; no tienen ningn efecto sobre los resfriados, la gripe y
otras infecciones virales.
c. Claritomicina - interfiere la sntesis de protenas en las bacterias sensibles; faringitis,
amigdalitis, sinusitis, bronquitis aguda, reagudizacin de bronquitis crnica, neumona
bacteriana (adquirida en la comunidad), infeccin de piel y tejidos blandos leve-moderada,
foliculitis, celulitis, erisipela, infeccin localizada o diseminada por Mycobacterium
avium o M. intracellulare, infeccin localizada por M. chelonae, M. fortuitum y M.
kansaii. Prevencin de infeccin diseminada por M. avium complex en pacientes con VIH
de alto riesgo
10. Quimioterpicos de sntesis
a. Sulfamidas (es bacteriosttico, de origen sintetico; inhibe la sntesis de acido flico;
activo frente Gram(+) y (-), Clamidias, Nocardia)
b. Trimetropin+sulfametoxazol (cotrimoxazol) - inhibe la sntesis de acido flico; elimina
las bacterias que provocan infecciones, incluyendo las infecciones que afectan las vas
urinarias, los pulmones (neumona), odos e intestinos
c. Quinolonas (6) - inhiben la replicacin del ADN bacteriano son buenos ATB de amplio
espectro, pero se ha abusado mucho.
d. Norfloxacina - infecciones de las vas urinarias y la prstata; inhibe la replicacin del
ADN bacteriano. La norfloxacina pertenece a una clase de antibiticos
llamados fluoroquinolonas; tomar norfloxacina aumenta el riesgo de que desarrolle
tendinitis.
e. Ciprofloxacina - inhibe la replicacin del ADN bacteriano; para tratar o prevenir
determinadas infecciones bacterianas, tambin se usa para tratar o prevenir el ntrax (una
infeccin grave que se puede propagar en forma intencional como parte de un ataque
bioterrorista) en quienes han estado expuestos a los grmenes del ntrax suspendidos en el
aire; tomar ciprofloxacina aumenta el riesgo de que desarrolle tendinitis.

11. Quimioterapia antituberculosa - actualmente se emplea:
* Rifampicina - ATB sistmico, antituberculoso, bactericida. Inhibe la sntesis de ARN
bacteriano. Tuberculosis en todas sus formas (asociado a otros
tuberculostticos). Brucelosis.Erradicacin de meningococos en portadores asintomticos,
no enfermos. Alrgicos o con contraindicaciones a otros antibiticos o quimioterpicos.
Infecciones causadas porestafilococos (S.aureus, S.epidermidis, cepas polirresistentes) y
por enterococos (S.faecalis, S.faecium).
* Isoniacida - para tratar la tuberculosis, y para prevenirla en personas que han tenido
contacto con las bacterias de la tuberculosis. Elimina slo las bacterias activas (en
crecimiento). Debido a que las bacterias pueden estar en un perodo de incubacin (sin
crecimiento) durante largos perodos, la terapia con isoniazida (y otros medicamentos para
evitar la tuberculosis) debe hacerse durante mucho tiempo (por lo general entre 6 y 12
meses).
* Etambutol - el tratamiento de tuberculosis pulmonar; debe ser usado en conjuncin con
otros frmacos antituberculosos.

12. Quimioterapia antimictica:
* Nistatina
* Miconazol
* Amfotericina B.
* Fluconazol

13. Quimioterapia anti-viral
* Aciclovir - antiviral activo frente al virus herpes humano, inhibe la replicacin de ADN
viral, interfiriendo con el ADN polimerasa viral.
* Ribavirina - La ribavirina se utiliza con un medicamento interfern, para tratar la
hepatitis C en personas que no han sido tratadas con interfern antes. La ribavirina
pertenece a una clase de medicamentos antivirales llamados anlogos de nuclesidos. Esta
acta impidiendo que el virus que provoca la hepatitis C se propague dentro del cuerpo.


Pruebas de sensibilidad anti-microbiana - tcnicas que investigan la actividad anti-
microbiana de distintos quimioterpicos frente al microorganismo estudiado; sus
principales aplicaciones:
- contribuir a la identificacin de los microorganismos (p.ej. sensibilidad del
neumococo/S.pneumonia a la optiquina; del S.pyogenes a la Bacitracina)
- constituye una base fundamental para la instauracin de una terapia adecuada.
Son tcnicas estandarizadas y se ha demostrado que existe un paralelismo entre los
resultados de sensibilidad obtenidos in vitro con los efectos teraputicos in vivo; la prueba
ms utilizada es la difusin en medio solido a excepcin de los grandes laboratorios que
utilizan sistemas multiprueba o mtodos automatizados (Vitec, Pasco...)

Antibiticos - un grupo de compuestos qumicos teraputicamente muy tiles y
que antaos se caracterizaban por ser subproductos metablicos de un
microorganismo siendo casi siempre letal para otros grmenes (p.ej. a los hongos);
actualmente la mayora son sintetizados en el laboratorio; uno de los primeros
es descubierto en 1927, cuando Alexander Flemming descubri la penicilina extrayendo-lo
de un hongo (Penicillium notatum) siendo en 1929 cuando efectu los primero ensayos de
sensibilidad anti-microbiana (se contaminaron las placas sin querer por un hongo); en
1939 Rose y Miller intentaron estandarizar las mltiples variantes de los anlisis de
sensibilidad microbiana por difusin en placa y posteriormente en los aos 50, Kirby-
Bauer y Anderson estandarizaron la tcnica que se utiliza actualmente por difusin en
medio solido o en placa.

Los principales pruebas para hacer un antibiograma:
a. Manuales
1. Prueba de dilucin en medio solido y liquido
2. Prueba de elucin en disco
3. Prueba de deteccin enzimtica
4. Prueba de difusin en medio solido (de Kirby-Bauer)

b. Automatizadas
Trminos utilizados en las pruebas anti-microbianas:
- Microorganismo sensible o sensibilidad => es inhibido por un ATB a dosis habituales
- Microorganismo de sensibilidad intermedia => el germen "in vitro" no es claramente
sensible al ATB, pero si lo seria "in vivo" incrementando la dosis habitual sin llegar a dosis
toxicas
- Microorganismo resistente o resistencia => no es sensible al ATB a dosis habituales y es
necesario administrar dosis toxicas
- CMI (cantidad mnima inhibitoria) => es la menor concentracin de un ATB capaz de
inhibir el crecimiento bacteriano de una cepa dada
- CMB (cantidad mnima bactericida) => es la menor concentracin de un ATB con la que
no quedan bacterias vivas de una cepa dada

Tcnicas manuales de realizacin de las pruebas de sensibilidad anti-
microbiana
a. Pruebas de dilucin (es una tcnica de centros de investigacin /lenta
/engorrosas) => se basan en el estudio al unsono de diferentes concentraciones de ATB, lo
que les da un carcter cuantitativo en base a los conceptos CMB y CMI; 2 tipos => en
medio liquido y solido; se utilizan 10 tubos con grmenes en caldo nutritivo o agar y a cada
tubo se le aade una cantidad prefijada de ATB diluido seriadamente, excepto en el tubo de
control; se incuban 18-24 horas a 37C y se examina la turbidez que indica crecimiento de
grmenes; en el tubo donde no hay turbidez se ha inhibido el crecimiento de los
grmenes; con estos datos estudiamos la CMI y la CMB de los antibiticos.

b. Pruebas de elucin en disco (disolver) => se realiza introduciendo discos de un
ATB en tubos con caldo nutritivo; el ATB se disuelve en el caldo alcanzando una
concentracin final conocida, posteriormente se inocula un volumen de una suspensin
microbiana y se sigue la misma metodologa descrita antes obtenindose resultados
cuantitativos o cualitativos en base a sensibilidad, sensibilidad intermedia o resistencia (no
se utilizan habitualmente).

c. Pruebas enzimticas de deteccin => fundamentalmente se detectan las beta-
lactamasas; un reducido nmero de bacterias son resistentes a las penicilinas y
cefalosporinas(ATB B-lactmicos) debido a que producen un enzima (b-lactamasa) capaz
de inactivar estos ATB, p.ej. los gonococos, pneumococo y algunos estreptococos; consiste
en observar el crecimiento de los grmenes en presencia de dichos ATB; se toma la colonia
sospechosa y mezclar-la con un sustrato que si cambia de color nos indica que la colonia es
B-lactamasa (+), por lo tanto es resistente a los ATB B-lactamico; se denomina Prueba de
NITROCEFIN.

d. Prueba de difusin en medio solido (antibiograma clsico) => estandarizado
desde los aos 50 (se hace igual en todo el mundo) por Kirby-Bauer y Anderson en todos
sus pasos y es ms utilizado actualmente en forma manual; fundamento => depositar
discos impregnados de ATB sobre cultivos de microorganismos en placa; la difusin del
ATB a traves del medio produce un halo de inhibicin del crecimiento cuyo dimetro ser
proporcional a la potencia del ATB dando resultados cualitativos de resistencia,
sensibilidad o sensibilidad intermedia a los ATB; material => placas de Petri (9cm), pinzas
metlicas estriles o dispensador automtico, pie de rey o regla milimetrada, medio
Mueller-Hinton, discos de ATB, suspensin microbiana al 0,5 escala Mc Farland (10
elevado 8 u.f.c./ml; escala Mc Farland => el 0,5 se prepara aadiendo 0,5 ml de Cl2Ba
0,04 M a 99,5 ml de acido sulfrico 0,36M); una placa llena => mas de 10 elevado 6.

Tcnica => el medio Mueller-Hinton se vierte en placas con un espesor de 4 mm; la
siembra utilizada preferentemente (a) la de Kirby-Bauer: se introduce un escobilln en el
inoculo preparado al 0,5 Mc Farland (no tenemos) y se siembra en 3 direcciones y se deja
aproximadamente 4 minutos la placa semi-abierta e invertida antes de colocar los
discos; (b)la de Barry: se hace una inoculacin previa al vertido de las placas, se aaden
0,1 ml del inoculo a 25 ml del medio Mueller-Hinton fundido y se vierte en placa (no se usa
mas)


Eleccin de ATB => se debe seleccionar un ATB representativo de cada grupo excepto en
los casos donde existan diferencias significativas en los espectros de actividad o
resistencia; los aspectos importantes que prevalecen a la hora de seleccionar un ATB => las
caractersticas tintoriales del germen (Gram+o-), el lugar de la infeccin (orina,
meningitis) y la bacteria investigada.
Concentracin de los discos => tiene que estar perfectamente estandarizada siguindose
las normas de la Federacin de Drogas y Alimentos/ FDA => la actividad del disco debe
estar entre 65% y 150% y de la OMS => entre 75% y 135%; siempre se debe utilizar un
control para controlar la actividad de los discos; en general, se escogen discos con una
concentracin que producen un halo de inhibicin entre 20 y 30 mm para organismos
tipificados como sensibles y de menos de 10 mm para los resistentes.
Implantacin de los discos (papel de filtro grueso de un dimetro 6mm que van
impregnados con una concentracin determinada de ATB); Manual => se saca el disco de
ATB con unas pinzas estriles y se deposita en la placa, la distancia mnima entre los discos
es de 24 mm para evitar la superposicin de los halos, deben estar situados a 15 mm del
borde como mnimo (se colocan 8 discos) una vez depositado el disco se presiona
ligeramente con la punta de pinzas; Automtica => se utilizan dispensadores
automticos que son unos dispositivos de plstico del tamao de una placa de Petri con
unos orificios gua que permiten la colocacin simultanea de todos los discos en el lugar
adecuado, y con una pinza se presionan ligeramente los discos para que al girar o invertir
la placa no se caigan los discos.
Incubacin => 18-24 horas a 35-37C (mximo 48 horas)
Lectura e interpretacin del antibiograma => los resultados se expresan segn el
halo de inhibicin que aparece alrededor de cada disco; el halo se mide con una regla
calibrada o pie de rey midiendo los dimetros, y segn cul sea clasificaremos al germen
como sensible (la dosis habituales es eficaz), intermedio (se deben incrementar las dosis
habituales sin llegar a dosis toxicas) o resistente (ATB es totalmente ineficaz);

Observacin al mtodo:
1. preservar la estandarizacin en todos sus pasos
2. puesto que la difusin del ATB es casi instantnea no debe moverse ningn disco una
vez que se ha puesto en contacto con la superficie del agar
3. los discos se tienen que conservar en la nevera
4. procurar que la lectura se haga a las 18-24 horas, evitndose el exceso de incubacin
5. Aunque el medio elegido es el Mueller-Hinton, se pueden emplear medios enriquecidos
como AS (estreptococo), agar chocolate (Haemophylus) para grmenes exigentes
6. de vez en cuando hay que colocar controles de calidad
7. cuando el germen sea anaerobio el mtodo es diferente

Mtodo automatizados de identificacin y susceptibilidad - actualmente existen
diferentes mtodos automatizados para realizar el antibiograma; los ms utilizados se
basan fundamentalmente en la medida bien fotomtrica o bien turbidimtrica del efecto de
un ATB sobre el crecimiento de una bacteria en medio liquido comparndolo con el de la
misma bacteria en un medio sin ATB; otros mtodos se basan en tcnicas de impedancia
elctrica microcalorimetra bioluminiscencia, radiometra ...

Los mtodos fotomtrico y turbidimtrico p.ej. sistema Vitec, se resume:
- se utilizan unas tarjetas desechables del tamao de un naipe donde se inyecta la muestra
ya diluida mediante un modulo inyector; la tarjeta presenta unas perforaciones donde lleva
incorporadas diferentes medios selectivos liofilizados;
- la tarjeta se sella y se coloca en un modulo incubador y de lectura, leyndose de manera
automtica los resultados cada hora; los datos los almacena un ordenador que los compara
con valores umbrales ya almacenados; el ordenador puede dar resultados a las 4 horas (lo
normal entre 4 -13 horas)

El sistema Microscan utiliza un sistema semejante al de dilucin en caldo pero en
miniatura utilizando paneles con caldo de Mueller-Hinton deshidratado (como API); tras
la inoculacin y re-hidratacin con una suspensin estandarizada del microorganismo y su
incubacin a 35C por un mnimo de 16 horas, la CIM o una sensibilidad cualitativa
(sensible, intermedio o resistente) para el organismo en prueba se determina observando
la menor concentracin ATB, que muestre inhibicin de crecimiento; esta deteccin puede
hacerse manualmente mediante un visualizador de micro-dilucin o mediante un lector
conectado a un ordenador; viene en tripletes de un ATB con diferentes concentraciones.

Agentes antimicrobianos (ATB) activos frente a Gram(-) => Cefuroxima,
Cefotaxima, Colistina, Tobramicina ; frente a Gram(+) => Eritromicina, Tetraciclina,
Vancomicina, Meticilina, Clindamicina, Doxicilina; frente a ambos Gram (+) y (-) =>
Ampicilina, Cefalotina, Gentamicina, Cotrimoxazol, Cloranfenicol, Imipenem,
Amoxicilina+acido clavulonico.

Clasificacin de los antibiticos segn su efecto bacteriano
Bactericidas: Penicilinas, Cefalosporinas, Aminoglucsidos, Rifampicina, Quinolonas,
Monobactmicos, Polimixinas
Bacteriostticos : Tetraciclinas, Eritromicina, Sulfonamida, Novobiocina, Cloranfenicol
Clasificacin de los antibiticos segn su mecanismo de accin sobre la
estructura bacteriana
I. Inhibicin de la sntesis de la pared celular
Penicilinas
Cefalosporinas
Vancomicina
Fosfomicina
Tercoplanina
Bacitracina
II. Lesin en la permeabilidad de la membrana celular
Poliomixinas
Colistinas
Nistatina
Anfotericn B
III. Inhibicin de la sntesis proteica
Cloranfenicol
Tetraciclina
Aminoglucsidos
Lincomicinas
Eritromicina
IV. Inhibicin de la sntesis de cidos nucleicos
Quinolonas
Sulfonamidas
Rifampicina
Trimetropn




Nota: (*) Penicilina semisinttica resistente penicilinasa




Estudio de la orina

Funcin del rin:
- La eliminacin de nuestro organismo de una importante cantidad
de residuos metablicos, muchos de ellos intiles, y de otros que incluso
pueden comportarse como txicos.
- La regulacin de la composicin de los fluidos de nuestro organismo facilitando as, tanto
la supervivencia de las clulas como el optimo desarrollo de todos los
procesos metablicos.
- El control hormonal de la presin arterial (adrenalina, noradrenalina)
- El control de los niveles orgnicos del calcio (mineral corticoides aldosterona, 1,25
dihidroxicolecalciferol)
- El control de la eritropoyesis (eritropoyetina)

Nefronas - son unidades funcionales bsicas consiste de 2 partes => el glomrulo (dentro
de la cavidad "capsula de Bowman") y la red tubular.

El glomrulo - rodeado de una cavidad (capsula de Bowman) y dispone de una extensa
red vascular; filtrar/ depurar el plasma 25 ml de sangre por minuto (150 litros de plasma/
dia); se filtra agua, urea, creatinina, aminocidos, cido rico, glucosa, protenas de bajo
pm.

La red tubular - el filtrado por el glomrulo es recogido en la capsula de Bowman y se
dirige hacia la red tubular donde se lleva a cabo un proceso de reabsorcin selectiva =>
reabsorber agua, ciertos elementos tiles para el organismo y que deben ser recuperadas
(glucosa, agua, sodio, cloruro, potasio, bicarbonato, urea, aminocidos, protena) y permite
la secrecin de otras que, por su toxicidad, deben ser posteriormente eliminadas mediante
la miccin (amonio, urea, hidrogeniones/H+); se elimina 1 ml de orina por minuto (1500
ml diarios); la red tubular est formada por => tbulo contorneado proximal, asa de
Henle, tbulo contorneado distal y tbulo colector.

Mecanismo de la funcin renal:
- Filtracin glomerular => filtra el plasma desde los capilares que lo envuelven hasta la
capsula de Bowman.
- Reabsorcin tubular => el producto de la filtracin glomerular se modifica su
composicin al atravesar la red tubular.
- Secrecin tubular => transporte de sustancias, desde la red capilar hacia
los tbulos renales; destaca la secrecin activa de iones H+, que permite la regulacin del
equilibrio acido-base en el organismo.

Procedimiento de la recogida de muestra (el personal facultativo determina el tipo
de muestra necesaria para el anlisis) => informar a la persona del objeto
del anlisis; indicar el tipo de muestra deseada; orientar acerca
de la tcnica de obtencin de la misma; indicar las pautas de almacenaje y
transporte adecuado (si se toma fuera del laboratorio); insistir en la importancia de la
limpieza en general y de la higiene antes de la recogida (evitar
la contaminacin involuntaria); describir el tipo y caractersticas mas adecuadas del
recipiente a utilizar; tener en cuenta la capacidad del paciente para evacuar la vejiga de
forma voluntaria y la necesidad de utilizar tcnicas invasivas para obtener la orina en
condiciones adecuadas.

Recogida de muestras de orina
- Miccin espontanea => paciente responsable de la misma para obtener muestra
sin contaminacin; prevencin: eliminar la primera porcin de la miccin y asegurar el
lavado minucioso previo de los genitales; indicaciones: anlisis fsico-qumico, estudio
del sedimento, concentracin de creatina y microbiologa (en ocasiones).
- Cateterismo vesical/ sondaje (realizada por personal enfermera) => pacientes que
presentan dificultades de la miccin, mujeres para evitar la contaminacin vaginal.
- Puncin supra-pbica (realizada por personal facultativo) => diagnostico
de infeccin por microorganismos extraos en nios.

Tipos de muestras para un anlisis de orina (sin supervisin -
miccin espontanea):
- Primera orina de la maana => se recomienda porque la concentracin de solutos es
variable a lo largo del da y esta en relacin con la ingesta de lquidos.
- Orina tomada al azar => muestra vlida para cultivos microbiolgicos
- Orina minutada (fraccionada, de 2 horas, de 24 horas) => gran utilidad para el paciente
diabticos

Anlisis de orina - procedimiento tcnico encaminado a examinar los componentes que
la integran, su cantidad y la proporcin en que se encuentran; su estudio proporciona
gran informacin acerca de mltiples alteraciones orgnicas y de muy
diversa etiologa (rion, procesos metablicos) => permite detectar
alteraciones patolgicas, estados fisiolgicos particulares no patolgicos (embarazo) y un
buen funcionamiento renal.
Objetivos:
- obtener informacin del estado general del rion y las lesiones que pudieran afectarlo
- detectar la existencia de una alteracin a nivel de las vas urinarias
- teniendo en cuenta aquellos productos que se eliminan va urinaria, detectar alteraciones
funcionales de otros rganos
- detectar las alteraciones metablicas de diversa etiologa
- se intenta encontrar sustancias o componentes que normalmente no se encuentran en la
orina
- detectar alguna alteracin en la concentracin (por defecto o por exceso) de componentes
que habitualmente se encuentran en la orina

Tipos de anlisis de orina => anlisis elemental, completo, rutinario, anormales y
sedimento.

Parmetro bioqumico => Densidad - Bilirrubina - Cuerpos cetnicos - Protenas -
Urobilinogeno - Glucosa - Hemoglobina - Nitritos - pH - Hemates - Leucocitos
(actualmente se utiliza determinacin por qumica seca / tiras reactivas).

Anlisis general de una muestra de orina:
- Fsico/macroscpico => cantidad, aspecto/turbidez, color, olor, densidad, pH
- Qumico/anormales => protenas, glucosa, cuerpos cetnicos,
sangre/hemoglobina, bilirrubina/ pigmentos biliares, urobilingeno/ urobilina, nitritos
-Microscpico => estudio de estructuras cristalinas/cristales y de formas amorfas
en suspensin, estudio citolgico, estudio bacteriolgico.
-Microbiolgico => urinocultivo, identificacin del germen (pruebas bioqumicas), ATB
(antibiograma).
- Parasitolgico => tcnicas especificas de visualizacin macroscpica de parsitos;
estudio microscpico de parsitos en la muestra de orina: parsitos enteros o parte de
ellos, huevos, formas de resistencia (quistes).

El orden cronolgico de un anlisis general=> caractersticas fsicas macroscpica -
sedimentacin (a 1500 rpm durante 10-15 minutos) - pruebas bioqumicas (tiras
reactivas); la muestra sobrante se debe guardar hasta que la analtica haya concluido; hay
que revisar los resultados del sedimento concuerdan con las pruebas qumicas y
comprobar las anomalas detectadas han sido confirmadas.

Examen fsico - macroscpico
Es orientativo => para diagnosticar una patologa, hay que confirmar con
otros anlisis complementarios; hay que tener en cuenta
situaciones fisiolgicas (menstruacin, grado de hidratacin, etc.) que pueden alterar
las caractersticas de la muestra;
1)- Cantidad / diuresis normal 1200-2000 ml/24H; alteracin => oliguria/inferior,
poliuria/superior, anuria/falta de eliminacin (<300 ml/24H)
2)- Aspecto / turbidez; recin emitida: clara y transparente; almacenada: sedimento
blanco/fosfatos y carbonatos, sedimento rojizo (uratos desaparecer al calentar la orina a
60C);
3)- Color amarillo / mbar (en funcin de la concentracin)
4)- Olor aromtico, ligeramente amoniacal
5)- Densidad 1.010-1.030 (se determina mediante tiras reactivas);
6)- pH normal 5,5-6 (ligeramente cida); pH alcalino => posible contenido
de grmenes con ureasa.

Pruebas bioqumicas cuantitativas
Protenas - en condiciones normales las protenas se encuentran 130-150
mg/da en funcin del volumen de orina eliminado; en recin nacidos 2-8 mg/100 ml;
cantidad de protena (con peso molecular menor)=> (a) albumina 1/3 del total
(fisiolgica); (b) globulinas; (c) protena de Tamm-Horsfall (T-H) es muco-
protena viscosa que no se encuentra en el plasma - se forma en el tbulo contorneado
distal, constituye la matriz de los cilindros; (d) transferrina; (e) IgA.
Proteinuria => eliminacin de protena en orina superando los VN
- intensa (>4 g/da) indica un dao renal grave; se dan en sndrome nefrtico,
glomerulonefritis (aguda y crnica), congestin venosa renal;
- moderada (de 0,5 - 4g/da) indica un dao renal menos graves; se dan en pielonefritis
con hipertensin, nefropata diabtica, mieloma mltiple.
- leve (<0,5 g/da) se dan en riones poliqusticos, lesiones renales incipientes.
- de patrn glomerular => pierde su selectividad en la filtracin.
- de patrn tubular => cuando hay lesin tubular
- de forma intermitente o transitoria => puede ser fisiolgica (hay que comprobarlo)
- de forma persistente => suele cursar con hematuria y su pronstico es peor.

Glucosa - la orina normal carece casi por completo de glucosa (filtrado y absorbido);
normoglucemia => 6-120 mg/dl; umbral renal 160 mg/dl; glucosuria => aumento de
la concentracin de glucosa en orina por encima de los VN, causada por (1) aumento de la
glucemia por encima de umbral renal (2) alteracin renal (tubulopata)

Cuerpos cetnicos (compuesto por acido acetilacetico/diacetico, acido beta-
hidroxibutirico, acetona) - en personas sanas, los CC se sintetizan en el hgado y se
metabolizan por completo, de forma que en la orina aparecen en
concentraciones mnimas (indetectables); cetonuria=> aparicin de
cuerpos cetnicos detectables en orina; la presencia de cetonuria y el aumento de
cetonemia implica que no se realiza correctamente el catabolismo oxidativo de
los cidos grasos; las causas de cetonuria:
- sobrecarga de lipidos en la dieta
- diabetes mellitus (coma diabetico)
- vmitos (en nios y embarazadas)
- bajo consumo de hidratos de carbono o alteracin en su metabolismo
- ayuno prolongado

Hemoglobina - no aparece en orinas normales; hemoglobinuria => presencia de Hb
en orina (si la cantidad es alta, se puede ver a simple vista); causas => enfermedad renal
de vas altas, anemias hemolticas, reacciones transfusionales, infecciones (malaria,
paludismo)

Pigmentos biliares (bilirrubina y biliverdina) - se forman en bazo, higado y MO
por degradacin fisiolgica de Hb; 2 tipos => BB-Albumina / indirecta y BB-Glucurnico
/directa; aparece BB en orina, siempre que aumente la BB directa en sangre por causas =>
enfermedad obstructiva (ictericia obstructiva/ acumulacin en
sangre), lesiones hepticas(hepatitis, hepato-toxicidad).

Urobilingeno - BB directa con la bilis, pasa al intestino delgado donde por accin de la
flora bacteriana se transforma en urobilingeno o estercobilingeno (se elimina
en mayora con las heces y la orina en menor concentracin); la cantidad de urobilingeno
aumenta en la orina en las hepatitis y las anemias hemolticas; la determinacin de
urobilingeno debe realizarse rpidamente en orina, ya que se transforma en urobilina +
O2(falso negativo).

Nitritos - su aparicin en la orina indica crecimiento bacteriano (bacteriuria), de
grmenes capaces de reducir los nitratos ingeridos con la dieta, hasta nitritos (entero-
bacterias); un resultado negativo de la prueba de los nitritos, no indica ausencia de
microorganismos, ya que puede haber bacterias que no son productores de nitritos o
ausencia de nitratos ingeridos en la dieta.

Examen microscpico de orina - sedimento urinario - estudio de elementos o
estructuras de origen y composicin variados que aparecen suspendidos en la orina que
proporciona ayuda para el diagnostico y evolucin de las enfermedades renales; la muestra
debe examinarse antes de transcurridas 3-4 horas desde su recogida (algunas estructuras
como clulas y cilindros se lisan fcilmente; obtencin del sedimento: homogeneizar
bien la muestra, verter 10 ml en un tubo de centrifuga (fondo cnico), centrifugar a 1500
rpm durante 10 minutos; decantar el sobrenadante (quedando solo 1 ml), re-suspender el
sedimento residual, montar un fresco (una gota entre porta y cubreobjetos, evitando
la formacin de burbujas), observar al microscopio a 40x, intensidad lumnica media y
condensador a media altura; tambin se puede observar a 10x en el permetro de cubre si
hay los cilindros hialinos.
Estructuras organizadas
- Hemates: pueden proceder de cualquier parte del sistema renal; en gran numero
indica infeccin, traumatismos, neoplasias y litiasis renal; presencia normal de 1-2/campo
o como una contaminacin menstrual; pueden confundirse con levaduras y cristal de
oxalato clcico monohidratado; con tincin Gram se diferenciar => los hemates son
teidos de rojo, levaduras de violeta y cristales incoloros; es importante distinguir
entre macro-hematuria (se ve en el sedimento de color rojizo) y micro-
hematuria (nicamente se detecta al microscopio), tambin si el color rojo
observado macroscpicamente procede de hemates o Hb (al centrifugar el sedimento, el
color rojizo de Hb permanece).


- Leucocitos (neutrfilos): pueden proceder de cualquier parte del sistema renal; >50%
de ellos se lisan al permanecer mas de 2-3 horas a temperatura ambiente;
presencia normal de 1-2/campo (varn) y 1-3/campo (mujer); cifra superior de normal en
el sedimento => piuria (>5 leucocitos/campo indica => infeccin renal en cualquier nivel);


- Espermatozoides: formados por 2 partes cabeza y cola; frecuente en un sedimento
del varn (eyaculaciones recientes, poluciones nocturnas, etc.), y en mujer despus de
haber mantenido relaciones sexuales.
- Bacterias: la composicin de orina es un excelente medio de cultivo para los
microorganismos; la mayora de ocasiones son fruto de una contaminacin de la flora
saprofita alojada en zonas prximas al meato urinario => anal, perineal, vaginal (sobre
todo en mujeres); su presencia en el sedimento, no debe ser tenida en cuenta salvo que
vaya acompaada de piuria (aumento de leucocitos).
- Levaduras: su presencia en la gran mayora debido por una contaminacin, salvo
acompaada de una piuria; en personas diabticas, debido a la glucosuria, parecen facilitar
el crecimiento mictico; su identificacin es sencilla, por su forma ovoidea, frecuentemente
con presencia de clulas en gemacin; su tamao es ligeramente mayor que
los hemates (pueden confundirse); su aumento en la orina se trata de vaginitis causada
por Candida albicans.
- Parsitos: (1) Protozoos: normalmente se trata de Trichomonas vaginalis (frecuente
en sedimentos de mujeres con vaginitis que puede ser asintomtico y mas raro en los de
hombres); aspecto piriforme de mayor tamao que los leucocitos y una gran motilidad (por
sus flagelos); su identificacin es ms complicada cuando la motilidad esta mermada (al
ser de un tamao semejante al de los leucocitos); la piuria que le acompaa puede hacer
pensar (errneamente) en una infeccin bacteriana y se descarta esta posibilidad al
obtener urocultivos negativos;
(2) otros parsitos: su aparicin es siempre el resultado de una contaminacin de la
muestra de orina con materia fecal;


Celulas epiteliales: el rbol urinario esta revestido por 3 tipos de
epitelio => (1)columnar /tubular /renales /cuboideo (capsula de Bowman, tbulos distal,
proximal y colector) (2) transicional o urotelio (pelvis renal, urteres, vejiga y uretra)
y (3) escamoso (uretra y vejiga); una escasa descamacin es normal, pero se puede
aumentar por causas => microorganismos, productos qumicos, cuerpos extraos,
procesos degenerativos, procesos invasivos-destructivos.

- Celulas tubulares /renales /cuboideas: son de tamao 1/3 mayores que los
leucocitos; su forma normal es redonda con ncleo grande y cntrico; un
sedimento normal 0-1/campo; aumentado en pielonefritis y glomerulonefritis.


- Celulas de transicin (segunda capa de vejiga): el epitelio transicional
espluriestratificado (3 capas => basal, intermedia y superficial); las clulas son de
tamao 2-4 veces mayor que leucocitos; su forma es redondeada, piriforme o raqueta con
un ncleo pequeo; un sedimento normal 0-2/campo; su aumento exige un
estudio citolgico mas completo (p.ej. tincin de Papanicolau), por posibilidad de un
carcinoma en cualquier punto entre la pelvis renal y la vejiga.


- Celulas del epitelio escamoso: son planas y tienen abundante citoplasma con nucleo
centrico y pequeo; a veces sus bordes aparecen doblados, replegados; un
sedimento normal 0-1/campo.


Cilindros: se forma en tbulos colectores y distales; es un resultado de
la consolidacin de las protenas en los tbulos de las nefronas; es normal encontrarse
algunos (sobre todo hialinos) en el sedimento; se desintegra en la orina a pH alcalino y en
presencia de bacterias (con ureasa); la matriz de todos ellos es una muco-protena (Tamm-
Horsfall) segregada en la orina; causantes de su formacin => (1) disminucin del pH
de la orina, (2) aumento de la densidad o concentracin de solutos, (3) un grado de
estancamiento de la orina (disminucin del filtrado glomerular); el lugar de la nefrona en
que se forman, determina su tamao y forma => cilindros estrechos (contorneados)
proceden de los tbulos distales y cilindros anchos se originan en los tbulos colectores.

- Cilindros hialinos: se pueden encontrar en grandes cantidades en orinas normales
(deshidratacin y estrs fsico) y tambin en nefropatas; su aparicin en el sedimento no
tiene significacin clnica (1-2/campo); para visualizar su escasa refringencia, hay que
evitar un exceso de iluminacin; normalmente sus contornos se aprecian con suficiente
nitidez y uno de sus extremos es romo (un dedo de guante); existe tambin cilindros
granulo-hialinos, muy semejante a los hialinos, pero con algunas incrustaciones en su
estructura (sin significacin clnica);


- Cilindros granulosos: predomina la estructura granular y desaparece el aspecto
hialino;2 tipos => cilindros granulosos finos (semejante a los hialinos en tamao y forma;
tienen mayor refringencia debido a la masiva pequeos grnulos de inclusin) y cilindros
granulososgruesos (estructura totalmente diferente a los hialinos; son de mayor tamao,
aspecto rgido y mayor refringencia; sus borden son contrastados y angulados; en
orinanormal 0-1/campo; el aumento de su presencia indica una nefropata.


- Cilindros celulares: la presencia de ellos en la orina nunca es normal; tipos:
(1) Epiteliales - la matriz del cilindro engloba celulas epiteliales que se han desprendido de
la luz tubular; gran variedad de nefropatas, lesiones del epitelio tubular (debidas
adiversos txicos industriales, medicamentos y virus) puede causar la formacin de este
cilindros.
(2) Hemticos (eritrocitarios) - aparecen en sedimentos con hematuria; es un signo
de lesin a nivel del parnquima renal (vasculares o pielonefritis); la cantidad de estos
cilindros suele ser escasa y dificulta su localizacin.
(3) Leucocitarios - fcil de reconocer porque los leucocitos presentes en su matriz se
conservan estables durante el trayecto por los tbulos; su presencia normalmente
acompaada por piuria intensa e indica infeccin localizada en
el parnquima renal(pielonefritis) o lesiones de tipo inflamatorio (glomerulonefritis
aguda).
(4) Bacterianos - se parecen a los granulosos toscos; generalmente unidos a piuria y muy
probablemente se trate de una pielonefritis.


- Cilindros grasos: cilindros granulosos o celulares con pequeas
inclusiones lipdico (gotitas de grasa); muy refringentes y tonalidad amarillenta donde se
localizan dichas inclusiones; indica una nefropata todava no manifestada.


- Cilindros creos: son muy refringentes, rgidos, de apariencia dura, superficie rugosa y
brillante (como la cera de las velas), los extremos angulados y generalmente de gran
tamao; su presencia es un sntoma claro de una alteracin renal importante; suelen estar
inmersos en una cilindruria (presencia de la mayora de los diversos tipos de cilindros).



Estructuras no organizadas
Cristales: en general son productos finales del metabolismo que adoptan formas
cristalinas segn la condiciones fsico-qumicas de la orina (la pH sobretodo, densidad,
temperatura, etc.) y se excretan a nivel urinario; se diferencian en 3 grupos:
(1) Cristales endognos normales - no corresponden a alteraciones metablicas ni
funcionales, muy frecuente en el sedimento y pueden aparecer en orinas recin emitidas.
(2) Cristales endognos patolgicos - reflejan trastornos metablicos o afectacin grave
de algn rgano o sistema y muy raras veces aparecen en orina.
(3) Cristales exgenos - aparecen en la orina tras la introduccin en el
organismo (va enteral o parenteral) diversas sustancias (contrastes radiolgicos/
contraste radiopaco va endovenosa y medicamentos p.ej. sulfonamidas, etc.)




- Cristales de acido rico: en orinas cidas; son birrefringentes; de formas
variadas (p.ej. agujas); color entre marrn rojizo, el amarillo e incluso incoloros; indica
una situacin patolgica o concentraciones elevadas de acido rico; un sedimento normal
0-2/campo.


- Cristales de oxalato clcico mono-hidrato y di hidratado: en orinas cidas y
ligeramente neutras; menos frecuente; de forma prismas incoloros -casi nunca aislados-
unidos por un punto intermedio (pesas de gimnasia), la mas frecuente es de forma
sobre; tambin los hay de forma redondeados, finamente estriados, incoloros y con
una depresin central (radios de bicicleta); un sedimento normal 0-2/campo.


- Uratos amorfos: en orinas cidas; se presentan como un precipitado amorfo,
coloreado debido a la presencia de pigmentos urinarios de color amarillo-naranja (color
ladrillo); no tiene mucha importancia clnica.


- Cistina: en orinas cidas; tiene significacin clnica por si solos => aparecen
comoconsecuencia de cistinuria; aspecto incoloro con forma de
placas hexagonales, regulares finasy transparentes; es imprescindible una vez observados
en el sedimento, confirmar la concentracin de cistina en la orina.


- Leucina y tirosina: en orinas cidas; raramente se observan; son productos finales
del metabolismo proteico y suelen aparecer juntos en
situaciones clnicas graves=> destruccin o necrosis tisular importante,
fundamentalmente de tejido heptico (hepatitis, cirrosis, etc.); los cristales de tirosina
forman manojos de agujas finas y los de leucina son
como grnulos esfricos de estras radiales y concntricas, de aspecto oleoso o graso y muy
refringentes; ambas son de color amarillo o marrn.


- Cristales de bilirrubina: en orinas cidas; de pacientes
con bilirrubinemia (bilirrubina alta en sangre); de forma agujas con color marrn-
rojizo (flecha verde).


- Uratos amoniacos: en orinas muy alcalinas; de color amarillo/marrn muy intensa;
predomina la forma esfrica de distinto tamao; no tienen mucha importancia clnica,
peropueden estar asociados a infecciones del tracto urinario, por bacterias con ureasa+.


- Carbonato clcico: en orinas alcalinas o neutras; no es frecuente y no tiene mucha
importancia clnica (procedencia de ingesta vegetales); de forma amorfo o granular, en
ocasiones como pequeos lazos y raramente como pequeas esferas incoloras;


- Fosfato clcico (hipurato clcico): en orina alcalina o neutra; no es frecuente; de
forma prismas largos y afilados (agujas), en ocasiones se agrupan formando rosetas o
estrellas, tambin como placas granulares, amorfas e incoloras (similares a acido rico); no
tiene mucha importancia clnica, pero puede ser ligada a hipertrofia de prstata o algunas
infecciones urinarias crnicas; clculos urinarios contienen fosfato clcico.


- Fosfato triple (amnico-magnesico-clcico): frecuente en orinas alcalinas o
neutras; de forma tapa de atad, aunque tambin puede verse como octaedros (muy
variable); no tiene mucha importancia clnica.


- Cristales de creatina: raramente encontrados en orinas de adultas, pero es frecuente
en orinas de nios y nias antes de la pubertad; es un metabolito de
la degradacin endgena del tejido muscular (su aumento => distrofias musculares,
poliomielitis, etc.); de forma pseudo-hexagonal caracterstica.

- Fosfato amorfo: en orinas alcalinas; de semejante forma a uratos amorfos, pero
de color blanquecino.




Informe del sedimento urinario
1. debe preceder por el estudio de "anormales" en orina (tiras reactivas => pH, densidad
y caractersticas patolgicas)
2. deben observarse al microscopio optico (40x) al menos 10 campos.
3. debe proporcionar una visin del valor medio de cada elemento o estructura, obtenido
en todos los campos observados.
4. debe ser "escueto" y "conciso" (solo hay que poner lo verdaderamente importante)
5. debe seguirse un orden => hay que informar primero el examen realizado de citolgico,
segundo el de qumico y por ultimo el de microbiolgico.
Examen citolgico:
- celulas hematolgicas => se redactan con nmeros y abreviaturas (p.ej. 6-8 L/C =
no.leucocitos por campo); se informa si existe piuria y hematuria y si se forma acmulos.
- celulas epiteliales => se redactan con adjetivos: escasas (algunas 1-3) - moderada (3-4) -
abundante (6-8) - intensa (muy abundante 10-12); las importantes son las renales y las
de transicin; las celulas escamosas (de las vas bajas), se informan cuando son
abundantes.
- cilindros: se redactan al igual que las celulas; es importante identificarlos e indicar en el
informe el tipo de cilindro.
Examen qumico (en un sedimento de orina normales, es frecuente no incluirlos en el
informe):
- cristales => se redactan con adjetivos; cuando son muy abundante, se habla de "diatesis".
- compuestos amorfos => se redactan con adjetivos
Examen microbiolgico:
- bacterias => se redactan con adjetivos; es necesario especificar el tipo de m.o. y su
movilidad
- levaduras => se informa con adjetivos.
Examen microbiolgico de una muestra de orina - en condiciones normales
carecen totalmente de flora bacteriana; la infeccin del tracto urinario es frecuente y
la mayora de m.o. patgenos proceden de la flora intestinal => Bacilos Gram(-) (E.coli,
Proteus spp, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae); Cocos
Gram(+) (Streptococcus grupo D y Staphylococcus); Levaduras (Candida spp.); la toma de
muestra debe ser obtenida en condiciones aspticas en un recipiente estril, evitando en
todo momento la contaminacin; el paciente debe ser instruido de la forma mas adecuada.

Anlisis de microbiolgico (urinocultivo)
1. Preparacin de un "inoculo"
2. Sembrar en medio Cled (la ausencia de electrolitos, impide la invasin por
proteus);McConkey (un medio selectivo y diferencia para m.o. Gram(-)); agar Cetrimide
(eficaz para la bsqueda de pseudomonas)
3. Incubar a la temperatura optima de crecimiento de los m.o. buscados (generalmente a
37C)
4. Realizar el recuento tras la incubacin (presumible-mente han crecido los causantes de
la infeccin) => menos de 10.000 mo/ml de orina es negativo; mas de 100.000 mo/ml
hay infeccin urinaria; entre 10.000 y 100.000 mo/ml el diagnostico es incierto; puede
haberse infeccin no detectada por causas => un tratamiento ATB instaurado,
una obstruccin a nivel de las vas renales o la muestra recogida por una puncin supra-
pbica (sin pasar por la uretra, donde esta la infeccin).
5. Una vez determinada la infeccin, hay que resembrar en medios selectivos, para
proceder la identificacin (tipacin) del germen causal de la misma.









Tema 18 - Cocos aerobios y anaerobios facultativos (patologa e identificacin)

Gram(+) => Micrococaceae (Staphylococcus - Micrococcus - Stomatococcus -
Planococus); Streptocococeae (Streptococcus - Pediococcus - Gemella -
Aerococcus);Peptococaceae
Gram(-) => Neisseriaceae (Neisseria - Branhamella - Moraxella)
Staphylococcus => cocos Gram+ inmviles, aerobios y anaerobios facultativos, tamao
+/- 1 um; en forma de racimos, catalasa(+), gelatinasa(+), nitratasa(+), fermentadores de
muchas azucares (via EMP); no capsulados y resiste al calor; crecen en medios generales y
medios con alto contenido de NaCl (halfilo); resistentes a agentes externos, distribuidas
ampliamente en la naturaleza, flora normal de las mucosas y la piel, causante de la
intoxicaciones alimentarias, heridas, etc.
Especies importantes (existe >25 especies y varios sub-especies/ cepas)
(1) S. aureus (saprofito de >40% de fosas nasales y 10% de vaginas) => estafilococo
dorado (pigmento amarillo); coagulasa(+); fermenta el manitol; sensible a la novobiacina.
- 30 Ags (propiedades antifagocitarias y producen estructuras pigenas/ caractersticas en
las lesiones: polisacrido A es el mas importantes - inducen la formacin de
Acs; protena A - un potente agente antignico) => se subdividen en tipos segn sus
caracteres antignicos;
- Produce toxinas (hemolisinas - lisan eritrocitos y leucocitos; t.exfoliativa/ exotoxina -
causa eritemas en la piel; leucopidinas - destruyen pmn y macrfagos; enterotoxina - anula
la accin del jugo gstrico y acta en el centro del vomito, nauseas y diarreas);
- Fermentos/enzimas (coagulasas (-) activa la
protrombina; fibrinolisinas o estafiloquinasas(-) activador del
plasmingeno; penicilinasas o beta-lactamasa (-) romper el anillo b-lactamico de las
penicilinas creando resistencia);
- Hemolisinas alfa - provoca hemlisis beta en AS; hemolisina beta -
provoca hemlisis alfa en AS;
- Enterotoxinas tipo A, B (causan intoxicaciones alimentaria) y D causa enterocolitis;

La accin patgena directa => procesos inflamatorios, forunculos, supurativos y de
necrosacin (en heridas y quemaduras); indirecta => afecta al tubo digestivo por
la entero-toxina (gastroenteritis con nauseas, vmitos y diarreas, duracin 1-2 das, se trata
con sueros orales o anti-diarreicos); la bacteria no llega al intestino (solo su toxina), por
eso no se encuentra en las heces; crece muy bien con la temperatura veraniega y en las
cremas; infeccin generalizada (septicemia) => formacin de cogulos o trombos
intravenosos, artritis, pleuritis, endocarditis, osteomielitis o meningitis en los debilitados
(periodo de incubacin 1-6 horas).



(2) S.epidermidis y (3) S.saprophyticus son estafilococos oportunistas; distribuidas
en el medio ambiente, la piel y mucosas; son patgenas en
debilidad; S.saprophyticus puede tener pigmento dorado y puede fermentar
Manitol; S.epidermidis sensible a la novobiocina (lo que le diferencia a S.saprophyticus).

Aislamiento de los estafilococos:
- Muestra procede de las heces => medios selectivos Chapman, ricos
en NaCl(carcter halfilo), contiene manitol (diferencia S. aureus del resto de
Staphylococcus); Otros tipos de muestras => medio AS (observar caractersticas de las
colonias - color, hemlisis, etc).
Pruebas bioqumicas:
- Los estafilococos degradan muchas azucares (glucosa, sacarosa, fructosa, manosa, etc.);
produce gelatinasa(+), catalasa(+), nitratasa(+), crecen muy bien a 37C, hemolisina alfa y
beta, coagulasa(+) (S.aureus).
Diagnstico bacteriolgico:
- Toma muestra con torunda estril o por puncin segn los casos en total
asepsia; tincin Gram; aislamiento en medio Chapman/manitol salado y AS, tras
la incubacin observar las colonias; pruebas bioqumicas - coagulasa (S.aureus),
fermentacin de glucosa, catalasa, gelatinasa, hemolisinas alfa y beta (cepas patgenas),
fibrinolisinas, fermentacin del manitol (S.aureus); estudio de la sensibilidad a
la novobiocina(diferenciar S.epidermidis de S.saprophyticus)
- Diferenciacion del genero Staphylococcus y Micrococcus (en principio no es
patogeno) => Staphylococcus sensible a bacitracina y eritromicina; Micrococcus a veces
pueden daroxidasa+.
- Estafilococos coagulasa- es un grupo heterogneo (+ importante son S.epidermidis y
S.saprophyticus) 80% en el pasado no causan infecciones importantes, pero cada vez esta
tomando mas importancia; ademas muestra resistencia a varios ATB alternativa de
penicilina (meticilina y cloxacilina); pueden producir infecciones urinarias, bacteriemias
(por la implantacin de cateteres i.v.) y endocarditis.


Streptococcus => cocos Gram(+), tamao pequeo, capsulados, anaerobios facultativos,
se agrupan en cadenas, fermentador de glucosa, son saprofitos, oportunistas y
algunos patgenos; poseen Ags (polisacrido C - segn sus caractersticas, se clasifican
engrupos A-V de Lancefield; protena M antifagocitarias, la posee el grupo A)

Clasificacion
A. segn el tipo de hemolisis (capacidad de romper hemates -
produce hemlisis alrededor de sus colonias en AS) => gamma hemoltico,
alfa hemolticos/ hemlisis parcial (decoloracin parda verdosa
S.viridans);beta hemolticos/ hemlisis total (halos de transparencia grandes entorno a su
colonia) -grupos A, B, C, D (enterococo) G y F; estreptococo NO Beta-hemolticos - grupo
D, S.viridansy S.pneumoniae (alfa y gamma)
B. segn sus caracteres bioqumicos (sensibilidad a bacitracina, optoquina,
tolerancia a NaCl, degradacin de bilis esculina y factor CAMP):
- Sensible a bacitracina (grupo A)
- Crecimiento en NaCl 6,5% (grupo D enterococos)
- Factor CAMP => potenciar la accin hemoltica de S.aureus (lo produce grupo B)
- Pruebas de bilis esculina - hidrolisan este compuesto (grupo D enterococos)
- Sensible a optoquina (S.pneumoniae /neumococo)
- Hidrlisis de hipurato sdico (grupo B)
C. segn los caracteres antignicos (a traves de reacciones serologcas especificas
=> aglutinacin, precipitacin, inmunofluorescencia, etc.) => los Ags en la pared celular
(pptido glicano - toxica y facilita la unin de ellos a las clulas epiteliales
invadidas; polisacrido C - distintas caractersticas que confiere la agrupacin de los
estreptococos (grupos de Lancefield);
- Grupo A (la mas importantes) => la mayora son Beta-hemolticos y patogenos al
hombre; protena M se presenta como pelos en el permetro de la pared celular (anti-
fagocitaras).
- En las capsulas del grupos A y C se encuentra enzima
hialuronidasa(caractersticas anti-fagocitaras)
Accin patgena e Inters clnico:
(1) Streptococcus del grupo A (S.pyogenes) => causan 90% de las infecciones
estreptoccicas; muy sensibles a los agentes externos; son floras de la mucosa nasal
y farngea; poseen polisacrido C (proporciona la especificidad de grupo)
y protena M(facilita la adherencia a las clulas invadidas y proteccin a la fagocitosis);
son Beta-hemolticas, sensibles a la bacitracina y variable a optoquina
- Poseen hemolisinas estreptoccicas/ estreptolisinas (O y S); estreptolisina
S(poco antignico) => holoprotena toxica responsable de hemlisis en medio
AS;estreptolisina O (muy antignico) => hetero-protena exotxica muy activa de
efecto hemoltico frente a glbulos rojos y leucocitos (pmn y macrfagos => alterando la
estructura celular); induce a la formacin de Acs ASLO.
- Produce toxina eritrognica responsable del exantema de la fiebre escarlatina;
- Enzimas estreptoquinasas (activador de plasmingeno => plasmina en fibrinolisis);
induce a la formacin Acs; se utiliza en el hospital en procesos trombo-gnicos.
-Enzima desoxirribonucleasa estreptoccica (despolimeriza ADN);
son antignicas y se distingue en 4 grupos (A-B-C-D)
-Enzima Hialuronidasa (hidroliza el acido hialurnico del tejido conjuntivo); facilita
su invasin.
- Proteinasa estreptoccica (origina procesos inflamatorios y necrosacin)
Patogenicidad de S.pyogenes (grupo A) => Infecciones en la piel o mucosas
(+frecuentes - anginas/faringitis sobre todo a nios/contacto directo, otitis y
sinusitis) 95% de infecciones naso-faringeas son producidas por estreptococos del grupo
A; infecciones NO supuradas/ inmunolgica => fiebres reumticas (complicaciones de tto
no adecuados), glomerulonefritis, endocarditis, meningitis, sepsis.


(2) Streptococcus del grupo B (S.agalactiae) => saprofito del hombre en rino-
faringe, uro-genital, vaginal e intestinal; produce infecciones oportunistas; hipurato(+)
(degrada el hipurato sdico) es lo que le diferencia del grupo A; posee factor
CAMP (potenciar la accin hemoltica de S.aureus); puede originar meningitis e
infecciones pulmonares en el neonato, infecciones del tracto respiratorio, mucosas, piel,
etc; son Beta-hemoliticos, resistente a la bacitracina;



(3) Streptococcus del grupo C => es el mas proximo al grupo A;
sonBeta hemolticos (tambin alfa y gamma) y muy sensible a los agentes externos;
resistente a la bacitracina; crecen en medios salinos (NaCl 6,5%); posee enzima
hialuronidasa; saprofito del hombre en la rinofaringe; puede producir mastitis en vacas,
muermo en caballos y sepsis ??? en el hombre.
(4) Streptococcus del grupo D => son alfa, beta y gamma hemolticos; resistentes a
agentes externos y ATB;
- los enterococos => S.faecalis y S.faecium; son saprofitos del intestino del
hombre; crecen bien en NaCl 6,5% (a diferencia de los NO enterococos); hidrolizan la bilis
esculina; son alfa-beta-gamma hemolticos; resistente a la bacitracina; puede
producir infeccin urinaria e herida.
- los No enterococos => S.bovis, S.equinus y S.anginosos (afecta vacas y
caballos);hidrolizan la bilis esculina; resistente a la bacitracina;
(5) Streptococcus del grupo G, F y E => saprofitos de la rinofaringe, vias genitales e
intestino en el hombre; pueden producir infecciones en vias urinarias, heridas; resistente a
la bacitracina; son alfa y beta-hemolticos; crecen variable en medios salinos (NaCl 6,5%)

(6) Streptococcus Alfa hemoliticos (S.viridans) => no son capsulados; producen
alfa y gamma hemolisis; saprofitos de la orofaringe, mucosa bucal, placa dental (caries);
resistente a la optoquina;
(7) Streptococcus pneumoniae (neumococo) => es un grupo a parte; diplococos,
Gram(+) y son capsulados; muy sensibles a medios externos; son alfa y
gamma hemolticos;sensibles a optoquina; crecen variable en medios salinos (NaCl
6,5%); saprofito en aparato respiratorio; puede producir neumonias, inflamaciones
sinusitis, otitis y meningitis (mas frecuente en adultos);


Aislamiento:
- toma de muestra con total asepsia de la rino-faringe con hisopo estril, una muestra del
pus (si hubiera); se analiza de inmediato (estreptococos son sensibles a medios externos);
- un frotis para la tincin de Gram; si se sospecha S.pneumoniae se realiza
una tincin negativa con tinta china y prueba de "Quellung" (determinar Ags de la
capsula); se produce una reaccin de Quellung cuando un Acs tipo especfico se une al
polisacrido capsular del neumococo y causa un cambio en el ndice refractivo de la
cpsula hacindola aparecer hinchada y ms visible.
- la siembra en AS-CNA (posibles hemlisis - estreptococos son resistentes a nalidixico que
inhibe el crecimiento de otros grmenes); realizar hemocultivos si se sospecha endocarditis
o sepsis; las colonias son grisaceos, redondos de bordes lisos y pequeos; medios selectivo
y diferencial con NaCl 6,5% => permite el crecimiento de enterococos del grupo D.
Pruebas bioqumicas:
- pruebas de catalasa-, hemolisis en AS, sensibilidad o no de optoquina y bacitracina;
hidrolisis de hipurato (positivo en el grupo B), utilizacin de bilis esculina.
- identificar los grupos antignicos segn el tipo
de sustancia polisacrido C (clasificacin de Lancefield) por metodo serolgicos => prueba
de ltex (romper la capsula para sacar la sustancia; reaccin inmuno-complejo Ag-Ac).
- los Gram(+) en general son sensibles a la vancomicina excepto algunos cocos Gram(+),
catalasa(-) que no son estreptococos (Pediococcus es resistente a la vancomicina).

Pruebas serologcas / inmunologicas:
- la bsqueda en el suero (dilucin seriadas) del paciente de Acs frente a toxinas y enzimas
de estreptococos (sobre todo grupo A) => ttulos de Acs antiestreptolisinas O (ASLO); para
saber si la infeccin es aguda o creciendo; en caso de fiebres reumticas con ttulos de
ASLO negativos, se determinan los ttulos de Acs
antiestreptoquinasas (ASK), antihialuronidasas(ASH); pruebas de hinchamiento
capsular con suero antineumococico polivalente (prueba de Quellung) muy utilizado para
determinar S.pneumonia => se aaden Acs contra Ags capsulados, si hay aglutinacin es
signo de que esta estreptococo.

Neisseria => cocos Gram(-); en forma de diplococos (granos de caf), aerobios;
son saprofitos de mucosas (genitales, faringe, fosas nasales) y cavidades del hombre y los
animales;citocromo-oxidasa y catalasa+; utilizan azucares con metabolismo oxidativa y
fermentativa; producen pigmentos carotenoides; nutricional-mente exigentes; sensibles a
medios externos.
Especies mas importantes - 4 gneros => Neisseria, Branhamella (B.catharralis),
Acinetobacter y Moraxella.
(1) Neisseria meningitidis (meningococo) => es una especie patgena para el
hombre; son parsitos obligados del hombre (no se encuentran libre en la naturaleza);
es difcil de cultivar si hay competicin (acompaadas por otros grmenes);
son capsulados; utiliza glucosa y maltosa; posee fimbrias (facilita su adherencia) y capsulas
(contiene polisacridos con comportamientos serolgicos diferentes A,B,C, etc.); crecen a
35-37C; son muy sensibles a medios externos; producen meningitis epidmico (contagio
por gotas de flugge en contacto ntimos); otros causantes de meningitis => Haemophyllus
influenzae, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Pseudomona aeroginosa,
Micobacteria, Neisseria meningitidis, Cryptococcus neoformans y otros.
(2) Neisseria gonorrhoeae (gonococo) => idnticas caractersticas que
meningococo; utiliza glucosa como fuente de carbono; requieren medios enriquecidos con
CO2 5-10% para potenciar su crecimiento a 35-37C; son muy sensibles a medios externos
y son parsitos estrictos del hombre y produce gonorrea (no se encuentra libre en la
naturaleza);
(3) Neisseria saprofitas => saprofitos de la rino-faringe y genitales; son poco exigentes
y crecen a 22-35C en medios generales; resistentes a medios externos y no
son patgenos para el hombre.
Accin patgena e inters clnico
Neisseria meningitidis (meningococo) => diplococos /granos de caf; coloniza las
mucosas y vas respiratorias (sobre todo superiores); 5-30% son portadores sanos en rino-
farngeo; afectan a nios de 6 meses hasta 5 aos (causas mas importantes de mortalidad
infantil); tambin afectan nios mayores y adultos jvenes de 6 hasta 25 aos;
estructura antignica => componentes de su capsula (polisacrido),
las fimbrias (facilitar la adherencia y la invasin) y protenas de la membrana (toxica sobre
las celulas invadidas);
Cuadro clnico - comienza con una rino-faringitis de sintomatologa leve (sobre todo en
nios - en adultos se forman Acs anti meningococo) evoluciona a forma severa, se complica
con bronquitis; si el meningococo pasa a la sangre, originara micro-focos en la piel
conerupciones petequiales (1-2mm) en el tronco e extremidades inferiores, cefaleas, fiebres
altas, artralgias; puede pasar a LCR con fiebres muy altas, cefaleas fuertes, rigidez de
nuca, vmitos, diarreas, etc.; se agravan hasta la muerte sin tto efectivo y rpido; el
examenLCR es turbio, purulento con abundantes meningococos (debido a acumulacin de
pmn con meningococo dentro (celulas CLUE); tto con penicilina (G) - el tto del portador
es rifampicina.


Neisseria gonorrhoea (gonococo) => idnticas caractersticas que el meningococo; su
afinidad particular es sobre las mucosas uro-genitales, con fimbrias (adherencia a las
celulas epiteliales dificultando la fagocitosis); posee endo-toxina que inactiva
Acs prximos; produce gonorrea en hombres y mujeres (ETS);
Cuadro clnico - tras un contacto sexual, los gonococos se adhieren a la superficie de la
mucosa gracias a las fimbrias y protenas de la membrana; posteriormente se penetran a
tejidos sub-epiteliales y empiezan a multiplicarse, liberando endo-toxina con efecto
toxico a la uretra, cuello del tero, ano (donde colonicen), produce la destruccin de
celulas del epitelio y supuracin (secrecin purulenta) y dolor a la miccin; en las mujeres
puede ir acompaada por uretritis, vaginitis y 20% salpingitis de las trompas (produce
esterilidad en mujeres); 50% de los casos son asintomticos con lo que la ausencia de
tratamiento conduce a la cronificacin; puede provocar bacterimia dando artritis
supurativos; tto => penicilina o sus derivados; en neonatos provoca gonococia ocular que
conduce a la ceguera - se previene instilando gotas de nitrato de plata - mtodo de
"Crede" y (contra Chlamydia es mas efectivo) eritromicina???


Aislamiento - caracteres bioqumicos - diagnostico
N.meningitidis - toma de muestra de LCR (puncin lumbar), sangre y/o exudado
faringeo; se deben examinar de lo antes posible (sensibilidad al medio externo); se
transporta en un medio de Thayer-Martin modificado a 37C (en caliente); si la muestra de
LCR es turbio o purulento, se divide en 2-3 tubos; 1er tubo se centrifuga y sobre
el sedimento se realizan frotis Gram; 2nd tubo se utiliza para la siembra en AS, agar
chocolate, Mueller Hinton y Thayer-Martin; 3er tubo se realiza un hemocultivo y
recuento celular; meningococo crecen dando colonias transparentes diminutas y
no hemolticas; las placas se incuban a 37C enambiente de CO2 5-10%.
- Pruebas bioqumicas => catalasa+, oxidasa+, prueba de la utilizacin de glucosa y
maltosa por oxidacin (aerobio), lactosa-, nitratasa-.
- Estudios serolgicos => inmunofluorescencia directa del LCR o el suero, contrainmuno-
electroforesis y tcnica ELISA.
- Existe sistema de multi-prueba para Neisseria y Haemophylus.
N.gonorrhoeae - toma de muestra a partir de la uretra (hombre), recto en homosexuales
y uretra, cuello de tero y recto (mujer), se realizan en el laboratorio (sensibilidad a medio
externo), por la maana antes de la primera miccin (al ser posible); se procede de
inmediato al estudio directo y la siembra en medios especficos o se transporta en medio
TM modificado.
- se realiza la tincin (Gram(-) en forma de granos de caf); en el frotis se ven los pmn con
diplococos dentro; la siembra se har en AS, agar chocolate, Thayer-Martin (con factores
de crecimiento y ATB vancomicina, anfotericina, colistina y trimetropin que inhibe el
crecimiento de otros grmenes); en TM los gonococo son colonias pequeas de color gris
y los meningococo son blanquecinas se incuba a 35-37C y atmsfera enriquecida de CO2
5-10%;
- Pruebas bioqumicas => utilizacin de azucares por va oxidacin (glucosa(+), lactosa,
maltosa(+) para meningococo, y sacarosa); oxidasa y catalasa son positivos, nitratasa(-).
- Pruebas serologcas => hemoaglutinacin, inmunofluorescencia indirecta, ELISA (mas
utilizadas)
- Sistema de identificacin multiprueba para Neisseria y Haemophylus.


Neisseria saprofitos (Neisseriaceas) - normalmente son flora de oro-faringe/ naso-
faringe; son especies de bajo patogenicidad, aunque a veces implicadas en meningitis y
otros; no requieren medios especiales para su crecimiento.
- Branhamella catharralis / Moraxella catharralis => hoy
en da la clasificacin es confusa (la tendencia - dentro de la familia moraxellacea), otros
autores tienden a diferenciarla y la clasifican como familia Branhamellaceae; es Gram(-),
oxidasa(+), catalasa(+), nitratasa(+) (reducen nitratos a nitritos), no fermentan azucares,
crecen bien en medios generales (AS, agar chocolate y Thayer Martin), son aerobias o 5%
de CO2; flora normal de naso-faringe, pero a veces se asla como agente causal en
septicemias e infecciones otorrinolaringolgicas (sinusitis, otitis).
- Acinetobacter => anteriormente clasificada dentro de la familia Gram(-) no
fermentadoras (pero oxidasa- => bacteria inerte) junto con Pseudomonas; actualmente
esta incluido dentro de la familia Moraxellaceae; son microorganismos que pueblan
fundamentalmente suelos y aguas y presentes en medios hospitalarios
(infeccin nosocomial); la especie mas importante
=> A.calcoaceticus (causan neumonas, infecciones urinarias y sepsis); crecen en Mac,
AS y otros; en AS producen colonias grises con halos de hemlisis, oxidasa(-), catalasa(+),
son cocobacilos Gram(-) (se pueden confundir con Neisserias por su tamao).
- Moraxella => coco-bacilo, Gram(-), no fermentador, inmvil, oxidasa(+),
catalasa(+), difcil de distinguir con Neisseria; en general los no fermentadores son
muy difciles de distinguir y requiere numerosas pruebas bioqumicas para etiquetarlos.


Tema 19 - Enterobacterias y vibrios (patologa e identificacin)
Enterobacterias - bacilos o coco-bacilos Gram-, aerobios y anaerobios
facultativos, mviles (flagelacin pertrica) o inmviles, fermentadoras de glucosa (con o
sin produccin de CO2), oxidasa(-), catalasa(+); algunos usan metabolismo fermentativo y
otros usan metabolismo oxidativo; la mayora son nitratasa+; algunos son sulfuhidratasa+
(Proteus y Salmonella), indol(+) (E.coli); son saprofitas/ flora del tracto gastrointestinal
del hombre y de los animales; tambin se encuentra en el agua y en el suelo; resistentes a
medios externos; son potencialmente patgenos en individuos debilitados y produce
infecciones oportunistas; algunos son patgenos siempre donde sea se encuentra, otras
depende de la muestra donde se asla y el resto se cuestiona su papel.

Caractersticas antignicas:
- Ag somtico / Ag O => es lipo-polisacrido, termo-estables, se encuentra en la pared
bacteriana, es una endo-toxina (la parte polisacrido es muy antignico y la
parte lipdica es inactiva bioqumica-mente).
- Ag capsular / Ag K => se encuentra en la capsula bacteriana, es polisacrido, es anti-
fagocitaras (relacionado con la virulencia de ciertas especies como E.coli K-1 y Salmonella
thyphi).
- Ag flagelar /Ag H => es caracterstico de las cepas mviles, es proteico y responsable
de la accin patgena de la bacteria.
Clasificacin segn su capacidad para fermentar la lactosa:
- Fermentadoras rpidas de lactosa (coliformes) => Escherichia, Enterobacter y
Klebsiella(tarda a veces)
- Fermentadoras lentas de lactosa / ONPG(+) (coliformes) => Citrobacter, Serratia,
Hafnia, Yersinia (patgeno) y Shigella sonnei.
- NO fermentadoras de lactosa (no coliformes) => Salmonella, Shigella, Proteus,
Morganella, Providencia y Edwardsiella.
Salmonella - entero-bacterias no coliformes, mviles con flagelacin pertrica; bacilos
Gram(-); en general provocan infecciones entrico febriles (gastroenteritis, entero-colitis o
fiebres tifoideas o para-tifoideas).
Especies importantes - S.typhi, S.choleraesuis, S.enteritidis, S.paratyphi A,B y C,
S.arizonae.
Accin patgena e inters clnico
- Ag somtico O, Ag flagelar H y Ag capsular VI (en S.typhi - Ag termolbil con
poderprotector frente a los cidos /cida gstrica, resistencia y anti-fagocitaras)
- endotoxina y enterotoxina (efecto irritante y citotxico sobre el tracto intestinal)

Cuadros clnicos
1. Infecciones entricas (S.typhi - fiebres tifoideas o S.paratyphi A,B o C - para-
tifoideas); Las fiebres tifoideas son transmitidas al hombre va oral (alimentos crudos,
poco hechos, mal conservados y aguas contaminadas), llega al estomago, resiste la
acidez gstrica,pasa al intestino delgado (leon), penetra por endocitosis destruyendo parte
de las celulas de la mucosa intestinal; una vez dentro las salmonellas
son fagocitadas por macrfagos y transportadas por diferentes vas y provoca bacterimia :
todo sucede en el periodo de incubacin (8-15 das); comienzo brusco de signos y sintomas
=> los macrfagos les transportan hacia el bazo, higado y MO,
produciendo multiplicacin de nuevas salmonellas, volver al intestino generando placas
ulceradas, necrosacin de placas de Peyer y en casos mas graves originar perforacin y
hemorragias.
Las fiebres para-tifoideas son mucho mas leve con un periodo de incubacin de entre 7-10
dias con bacterimia y estado febril que dura varias semanas; no
hay perforacin intestinal ni hemorragias ni invasin de salmonellas a
otros rganos; cuadros clnicos => dolores de cabeza, fiebres altas, anorexia,
astenia/ cansancio; preciso un tratamiento que dura 9-10 das.
2. Infecciones gastrointestinales y enterocolitis (S.enteritidis - la mas frecuente,
S.choleraesuis, S.typhimurium y otras); periodo de incubacin 12-36 horas; se
transmite por alimentos contaminados con una concentracin de salmonellas de 10
millones a mil millones/ml, depende de tipo de la cepa; el alimento les facilita su llegada a
pasar el estomago y llegar al intestino delgado colonizando el leon y el ciego, se penetran
por fagocitosis al epitelio y se multiplican originando una inflamacin que genera cuadros
diarreicos con dolor abdominal (perdidas de electrolitos y agua), fiebres altas,
nauseas, vmitos; re quiere untratamiento de re-hidratacin que dura 6 das - las floras se
encargan de eliminarlas.


Aislamiento - pruebas bioqumicas - diagnostico de Salmonella
Salmonelosis => toma muestra de las heces (coprocultivo), anlisis del alimento
sospechoso; medios de cultivo SS, McConkey, caldo selenito; pruebas bioqumicas:
ONPG(-), TDA(-), Citrato(+) (S.cholera-suis y S.enteritidis, tambien son CO2+ y Ornitina
descarboxilasa+), SH2+, fermentacion de azucares: Glucosa(+), Trehalosa(+)
(S.typhi yS.enteritidis), etc.
Fiebres tifoideas y para-tifoideas => toma muestra de diferentes localizacin segn la
fase de enfermedad; en la fase de incubacin se busca en heces (coprocultivos), en
orina(urocultivo), sangre (hemocultivo); en la fase inicial de la enfermedad / periodo
febril, se realiza hemocultivo; en el periodo posteriores o finales se busca en
heces (coprocultivo); medios adecuados; se realiza las pruebas bioqumicas, reacciones
de aglutinacin cuantitativa (ttulos) de Ags O, H y VI a traves de
sueros especficos monovalentes y polivalentes, especialmente para Ag VI
(pruebas inmunolgicas).
Mucaptest => prueba inmunolgica utilizando suero polivalente (Acs anti O y anti H), un
resultado positivo dara unas colonias fluorescentes (posible Salmonella).



Shigella - bacilo Gram(-) inmvil, no fermentador de lactosa (excepto S.sonnei) ;
son patgenas para el hombre, provoca afecciones graves y contagiosas sobre el tracto
gastrointestinal (disentera bacilar) especialmente en ambientes de salubridad baja.

Accin patgena e inters clnico - se debe a la produccin de sustancias toxicas, Ags
O y K, plsmidos (facilita la invasin), adhesinas (adherencia a las celulas que
invaden),exotoxina con propiedades citotoxicas (tipo A - origina necrosis celular, ulceras,
hemorragias y perforacin), neuro-toxicas y entero-invasivas (tipo B - adherencia a las
celulas del epitelio gastrointestinal); al llegar al intestino del hombre va oral (puede
resistir el acido gstrico, por la alta cantidad ingerido y tambin protegido por los
alimentos), ejerce su accin toxica, pasar al colon originando necrosis con signos y
sintomas caractersticas (las toxinas de S.disenteriae no suelen pasar a la
sangre); cuadros diarreicos van acompaados dedolor clico, nausea, vmitos, malestar
general y fiebres muy altas con deposiciones sanguinolentas con moco y pus.

Aislamiento - pruebas bioqumicas, diagnostico de Shigella
Toma muestras de heces recin emitidas en los primeros das de la enfermedad (hay mayor
numero de shigellas), eligiendo restos de moco y sangre si los hubiera; el estudio
riguroso(teniendo en cuenta que Shigella se destruye en medios cidos y a temperaturas
<4C; medios de cultivos SS, McConkey, Hektoen, Yersinia CIN, Campylosel, TCBS;
pruebas bioqumicas TDA, KIA (K/A para Shigella y A/A para S.sonnei), ONPG (positivo
para S.sonnei), fresco, ureasa(-), VP-, nitratasa(+), manitol
(positivo para Shigella y negativopara S.disenteriae); pruebas de aglutinacin cuantitativa
(titulo) para demostrar Acs en el suero del paciente a traves de sueros especficos mono y
polivalentes.





Escherichia - enterobacterias bacilar o coco-bacilar Gram(-) mviles, fermentadoras de
glucosa y lactosa, produce CO2, aguantan temperaturas altas (la diferencia de otros
coliformes), resistente a medios externos, fcil de encontrar en el agua,
alimentos (indicativo de contaminacin fecal reciente); saprofito de flora aerobia y
anaerobia facultativa del tubo digestivo; puede provocar trastornos gastrointestinales de
diarrea, infecciones urinarias, meningitis en neonatos y excepcionalmente bacterimia; la
especie mas importante para el hombre es E.coli (segn la cepa puede tener
Ag somtico O, capsular K y flagelar H, fermentos y endo-toxinas).

Accin patgena e inters clnico - los cuadros clnicos son variables segn el tipo de
toxina que originen; algunas cepas de E.coli forman Ag O y K anti-fagocitaras y resistencia
a bactericidas y ATB (alto poder invasivo); otras cepas forman endo-toxinas, causante de
cuadros febriles y diarreicos; otras cepas tienen un mecanismo de accin anlogo al de
Shigella con menor gravedad; a veces la entero-toxina que producen es parecida a la de
Vibrio cholerae que causa perdida masiva de agua y electrolitos.
- si la cepa de E.coli forma una entero-toxina citotxica parecida a Shigella => cuadros
diarreicos en brotes epidmicos que afectan a nios y lactantes (E.coli entero-patgena)
- si forma una entero-toxina semejante a Vibrio cholerae => procesos diarreicos en nios,
adultos, originndose espordica-mente brotes epidmicos (diarrea del viajero - E.coli
entero-toxgena)
- si forma una entero-toxina citotxica similar a S.disenteriae => procesos diarreicos
graves, hemorragico espordicamente en brotes (E.coli entero-hemorragica)
- si presenta ciertos plsmidos que incrementan su capacidad de invasin => cuadros
diarreicos graves que afectan a nios, adultos con brotes epidmicos en casos aislados
(E.coli entero-invasiva)
Las cepas de E.coli se distingue con sueros antignicos; E.coli tambin puede provocar
infecciones urinarias (cistitis, pielonefritis, etc), infecciones biliares, heridas, meninges
(meningitis en neonatos).
Aislamiento, pruebas bioqumicas - diagnostico
Toma de muestra representativa de alimento, agua, heces, exudado; frotis de Gram;
medios de cultivo Mc, Levine; pruebas bioqumicas => lactosa(+), indol(+), citrato(-)
, sensible a la Colistina.


Yersinia - entero-bacterias muy patgenas para el hombre (Y.pestis - causante la
peste bubnica); son coco-bacilos Gram(-), mviles a
25Ccon flagelacin pertrica e inmviles a 37C, fermentadores de glucosa (ONPG
variable),capsuladas (Y.pestis) y oxidasa(-).
Especies mas importantes - Y.pestis (agente etiolgico de la peste bubnica en el
hombre) trasmitida a traves de ratas y pulgas, originando enfermedad grave
febril, epidmico de alta mortalidad; Y.pseudotuberculosis afecta animales y
excepcionalmente al hombre; Y.enterocolitica (sacarosa(+) en medio TSI); los
2 ltimos afectan mas a animales que al hombre (nios) => originando estados febriles y
diarreicos.

Accin patgena e inters clnico de Y.pestis => cuadros agudos y febriles con
alta inflamacin de los ganglios linfticos, hemorragias internas, petequias difusas en la
piel, en ocasiones septicemia y neumnia; es muy contagiosa, se origina en lugares de
salubridad baja; la muerte se produce por shock sptico (fracaso multi sistmico) o
por neumnia; factores de virulencia:
- La toxina murina (liberada al medio cuando muera la bacteria) => protena que bloquea
la utilizacin de O2 por parte de las celulas.
- Endo-toxinas (liberadas en el transcurso de la enfermedad) => origina el proceso febril
- Ag V con propiedades anti-fagocitaras
- Coagulasas y fibrinolisinas

Y.pestis llega al hombre a traves de la picadura de pulga (infectada por ratas con
peste),atraviesa los vasos linfticos, pasa a los ganglios donde se multiplica originando
bubones,pasa a la sangre y se disemina por el bazo, higado, pulmones, piel, mucosas, se
multiplica provocando lesiones pigenas (toxina murina), hemorrgicas, necrtica y
edematosa; en casos graves aparece coagulacion intravascular diseminada (CID) (por
la accin de lascoagulasas) o ditesis hemorragica (por la accin de las fibrinolisinas),
colapso circulatorio, toxema generalizada y muerte; formas clnicas:
1. Peste bubnica (la mas frecuente); tras el periodo de incubacin de 3 -
7 das despus de la picadura, aparecen signos y sintomas
con escalofros, vmitos, formacin de bubones en las ingles axilas y/o zonas submaxilares
(los tejidos circundantes aparecen inflamados); sin tratamiento se agrava hasta la muerte.
2. Peste pulmonar (es la complicacin de peste bubnica); se
produce afeccin pulmonar grave con insuficiencia respiratoria, cianosis; es altamente
mortal.
3. Peste septicmica es estadios ltimos de la peste en cual quiera de sus formas y es
generalmente mortal.
Aislamiento - pruebas bioqumicas - diagnostico
Toma de muestra de exudados purulentos del bubn (por aspiracin), de sangre, LCR,
tejido pulmonar, ndulos linfticos o esputo, heces, segn los casos; la tincin Gram(-),
nigrosina (visualizacin de capsulas); medios de cultivo => Mc, Yersinia CIN (colonias
muy pequeas); pruebas bioqumicas => mvil a 22C y inmvil a 37C, Lactosa(-
), ONPG(+),ureasa(+), indol y TDA(-), oxidasa(-), nitratasa(+); a
veces Y.pestis y Y.pseudotuberculosis son ONPG variable; Y.enterocolitica es sacarosa(+).


Entero-bacterias oportunistas - bacilos Gram(-) aerobios y anaerobios facultativos,
poco exigentes nutricional-mente, ampliamente distribuidos en el medio ambiente;
son saprofitos de la flora gastrointestinal, resistente a medios externos y ATB; no
son patgenos al no ser si el husped es debilitados, pueden provocar infecciones
hospitalario; en la mayora son lactosa(+), bacilos Gram(-) coliformes;
Principales especies de coliformes/ lactosa(+) (Escherichia, Enterobacter,
Citrobacter, Serratia, Klebsiella y Hafnia) y no coliformes /lactosa(-) (Proteus,
Morganella y Providencia).
1. Escherichia => Gram(-) aerobias y anaerobias facultativas, fermentadoras rpidas de
lactosa y glucosa, produce CO2, indol(+), citrato(-), sensible a Colistina, mviles.
2. Enterobacter => fermentadora rpida de lactosa, produce CO2, produce acetona de la
glucosa (VP(+) ), citrato(+), mvil, ornitina-descarboxilasa(+), son comensales de flora
intestinal; puede provocar a individuos debilitados diarreas, infecciones del tracto
respiratorio, heridas, etc; especies importantes: E.aerogenes y E.cloacae.
3. Serratia => fermentadora lenta de lactosa (ONPG(+)) y la
glucosa,produce acetona (VP(+)), mviles, citrato(+), ADNasa(+), ornitina(-)
descarboxilasa(+), saprofitas del hombre y tambin en el medio ambiente (agua y
otros lquidos), resistentes a ATB y desinfectantes; provoca infecciones urinarias y sepsis a
personas debilitadas
4. Citrobacter (huelen a peste) => fermentadora lenta de lactosa (ONPG(+)), mvil,
fermenta la glucosa y VP(-) RM(+), citrato(+); son comensales del tubo digestivo del
hombre y puede provocar infecciones urinaria, respiratoria, sepsis, bacterimias,
meningitis a los individuos debilitados; especies importante => C.freundii.
5. Klebsiella => inmviles, fermentadoras tarda de lactosa, utiliza glucosa
yproduce acetona (VP(+)), citrato+, ureasa+; son comensales del tracto gastrointestinal
y vas respiratorias superiores; puede provocar neumonas, rinitis, infecciones urinarias;
especies importante => K.pneumoniae (sub especies VP(+) y VP(-)
y K.oxytoca (indol(+)).

6. Hafnia => mviles a 22C y inmviles a 37C, fermentadora lenta de lactosa
(ONPG(+)),citrato(+), utiliza glucosa y produce acetona (VP(+)); provoca infecciones
hospitalarias.

7. Proteus, Morganella y Providencia => NO fermentan la lactosa, pero si glucosa y
produce CO2, RM(+); mviles, TDA(+) (diferenciar del resto entero-bacterias), pueblan
aguas residuales, el suelo, materia orgnica y son comensales en la flora intestinal del
hombre; pueden provocar infecciones hospitalarias; especies importantes:
- Proteus mirabilis (indol-, ureasa+, TDA+, SH2+), P.vulgaris (indol(+), ureasa(+),
TDA(+) )
- M.morganii (ureasa(+), indol(+), TDA(+) )
- Providencia rettgeri (ureasa-, indol+, TDA+)
P.mirabilis puede provocar infeccin urinaria, descompone la urea de la
orina quegenera precipitacin de
sales clcicas => formacin de clculos renales; tambin puede provocar infecciones
gastrointestinales, toxinfecciones alimentarias, heridas, etc.




Accin patgena e inters clnico - si el husped se encuentra debilitado
(postoperatorio, tratamiento inmunosupresores) los saprofitos podran ser patgenos; las
infecciones mas frecuentes =>
- tipo urinario (40% de las infecciones hospitalarias - pacientes sondados, encamados,
intervencionados quirrgica-mente) provocado por E.coli, P.mirabilis, P.vulgaris,
Klebsiella y Enterobacter, provocando cistitis (de las vas bajas) y pielonefritis (de
las vas altas); son infecciones agudas con fiebre, dolor lumbar, polaquiuria o anuria y
disuria; es frecuente en los anlisis de orina piuria, bacteriuria y proteinuria;
- tipo abdominal son poco frecuente => abscesos y peritonitis debido
a perforacin intestinal.
- tipo respiratorio (20% de las infecciones hospitalarias) afectando vas respiratorias
altas, neumonas y bronco-neumonas (pacientes con afecciones crnicas)

Aislamiento - pruebas bioqumicas - diagnostico
- Toma de muestra segn las afecciones o procesos patolgicos en condiciones de total
asepsia
- Examen directo (fresco y tincin Gram)
- Aislamiento en medios especficos/ selectivos (Hektoen, Mac) que inhiben los Gram+
- Pruebas bioqumicas e inmunolgicas



Familia Vibrionaceae - Genero Vibrio, Aeromonas y Pleisomonas (los
patogenos)
Especie mas importante y patgeno del genero Vibrio - V.cholerae => bacilos Gram-
anaerobios facultativos de morfologa curva (pleomrficos), mviles (flagelacin loftrica),
crecen bien en medios generales y pH alcalino (sensibles al medios cidos), oxidasa+ (la
diferencia de la enterobacteriaceae), halfilo, catalasa+, afectan al tracto gastrointestinal
del hombre; es el agente causal del clera => provoca diarreas graves hasta llegar a
la deshidratacin (diarreas masivas), shock hipovolmico, coma y
muertepor deshidratacin (puede perder hasta 10-15 lt/da de agua y electrolitos); se
diferencia dePseudomonas por la diferencia en el patrn de fermentacion de azucares.

Accin patgena e inters clnico:
- Ag somtico O (polisacridos) se utiliza para su tipacin
- Ag flagelar H (no tiene valor para su tipacin - comn a todas las cepas)
- Exotoxina / entero-toxina proteica (el principal efecto patgeno del clera - provoca
diarrea masiva)
- Adhesina (protena que tiene afinidad por los azucares) que permite adherirse a la pared
intestinal
Para formar cuadros graves es necesario su penetracin por va oral (agua o alimentos
contaminados con el bacilo, p.ej. productos marinos crudos), eludir el medio acido del
estomago (sucede cuando se ingieren >100 millones de grmenes - en el caso de epidemias
donde se encuentra 1 milln/ ml de agua).
Aislamiento - caracteres bioqumicos - diagnostico
- Toma de muestra a partir de las heces diarreicas, vmitos, procedindose de inmediato a
su identificacin (sensible a medios externos); medio de transporte Cary-Blair.
- Aislamiento en medios de cultivo especficos TCBS que impide el crecimiento de gran
parte de microorganismos => produce colonias amarillas por la fermentacion de la
sacarosa sobre el medio verde y tambin se siembre en el Mc.
- Pruebas bioqumicas => oxidasa+, catalasa+, sacarosa+ (produce un tipo de
acido dbiles que no bajara mucho el pH)
- Pruebas serologcas para determinar el titulo de Acs.
Aeromonas - bacilo Gram- no fermentadoras de la misma familia; el especie mas
importante Aeromonas hydrophila; catalasa+ y oxidasa+, VP+, lactosa-, ureasa-, indol+,
SH2-, mviles; no son halfilo (a diferencia de Vibrio) implicadas en procesos diarreicos.

Plesiomonas - tiene las mismas caractersticas bioqumicas que Aeromonas (excepto en
pruebas de VP y ornitina descarboxilasa); el especie mas importante Plesiomonas
shigelloides(se propone a incluirla a la familia enterobacterias); hay que hacer API para
distinguirla de Aeromonas (Plesiomonas - ornitina descarboxilasa+)





Tema 20 - Bacilos y cocobacilos aerobios y anaerobios facultativos
(patologa e identificacin)

Pseudomonas - bacilos pequeo (coco-bacilo) Gram-, mviles (flagelacin), en
generalaerobios estrictos, catalasa y citocromo oxidasa positivos, en
generalmetabolismo glucdico oxidativo; ampliamente distribuidos en el agua y suelo,
pasando de aqu a los animales y al hombre; son oportunistas en el ambiente hospitalario
(pacientes inmunodeprimidos), en ocasiones resultan muy graves (resistente a muchos
ATB - hay que combinar varios).
Los especies mas importantes:
- P. aeroginosa => presenta pigmentos fluorescentes, saprofita en la piel, tubo
digestivo??, puede provocar cuadros graves en individuos debilitados y es mortal si se
produjese septicemia;
- P. maltophilia (ahora se llama Stenotrophomonas maltophilia) se
llama as, porqueoxida maltosa (no oxida la glucosa); cogen cada vez mas importancia;
oxidasa variable.
Accin patgena e inters clnico - Pseudomonas aeroginosa
- Ag somtico O (polisacridos), Ag flagelar H (proteico), Ag mucoide M (produce
exotoxinas => enterotoxina responsables de cuadros diarreicos y toxina eritrodrmica).
Sustancia => (1) piocina (pigmento azulado de accin bactericida), (2) fluoresceina(pigme
nto verde amarillo) y (3) pigmento melnico (tie de color marrn los cultivos).
- Cuadros graves o muy graves (de carcter oportunista) => sinusitis crnicas, infecciones
del aparato respiratorio (neumonas, faringitis, bronco-neumonas); puede
producir endocarditis en drogadictos y paciente con SIDA; enterocolitis, pielonefritis
y meningitis en neonatos; en grandes quemaduras, agravando la lesin o
provoca infeccin de heridas quirrgicas; en casos mas graves puede originar bacterimia
(quemaduras graves).

Aislamiento - caracteres bioqumicos - diagnstico bacteriolgico
- Toma de muestra de cualquier producto patolgico, especialmente de carcter purulento
en total asepsia.
- Examen directo (tincin Gram); si el pus es azulado se sospechara de P.aeroginosa.
- Aislamiento en medios generales (el bacilo piocinico es fcil de cultivar) a temperatura
37C; es importante estudiar la presencia de pigmentos que se difunden en el medio;
lapiocianina es un pigmento responsable de la coloracin azul verdosa que puede adquirir
el medio y el olor a jabn de las colonias son las caractersticas de P.aeroginosa.
- Pruebas bioqumicas de citocromo oxidasa+, catalasa+, gelatinasa+, utilizacin de la
glucosa va oxidativa (aerobio).
- Pruebas serologcas para buscar Acs anti Pseudomonas.




Brucella - bacilos pequeos (coco-bacilos) Gram- inmviles, aerobios estrictos, algunas
crecen mejor en atmsferas ricas en CO2 (5-10%), su crecimiento es lento, catalasa+,
oxidasa+, nitratasa+, ureasa+, sensibles a medios cidos y se destruyen fcilmente a
temperatura de pasteurizacin.

Especies mas importantes (en funcin del husped en el que anidan):
- Brucella melitensis afecta a cabras y ovejas; afecta al hombre a traves de sus leches no
esterilizada, quesos frescos, carne cruda o poco hecha.
- Brucella abortus afecta a bvidos (la mayora de los casos de brucelosis en Espaa - en
menor proporcin B.melitensis)

Accin patgena e inters clnico - depende de su estructura antignica; Brucella es
capaz de mantenerse latente en el interior de la celulas que la han fagocitado y
posteriormente, empezar a multiplicarse con la consiguiente produccin de endo-
toxina;penetran en el hombre a traves de heridas y va digestiva (alimentos procedentes de
animales infectados (leche no esterilizada, quesos frescos, carne cruda o poco hecha);
posteriormente,pasaran a los ganglios linfticos, donde sern fagocitadas
por neutrfilos (en la sangre) y macrfagos (en los tejidos) y se distribuyen por todo el
organismo, volver a pasar al torrente circulatorio originando bacterimia (brucelosis
aguda o fiebres de Malta); se caracteriza por artralgias difusas (dolores de
articulaciones), sudoracin abundante, esplenomegalia y otras distintas
formas clnicas dependientes de la localizacin de Brucella (orquitis, neumnia brucelar,
etc); las fiebres son ondulantes con tendencia a las recidivas(frecuente entre los 3 y 6
meses subsiguientes a la infeccin por Brucella);


Bordetella - bacilos o coco-bacilos Gram- aerobios estrictos, inmviles (algunas
son mviles), capsulados; son parsitos estrictos (no se encuentran libres en la
naturaleza); se transmite por las gotitas de flugge o contacto directo.

Especies mas importantes:
- Bordetella pertussis (bacilo Bordet y Gengou) => la mas patgena y es
elagente etiolgico de la tosferina
- B.parapertussis => aislada en casos benignos de tosferina y no es estrictamente patgena
- B.bronchiseptica => afecta mas a animales que al hombre; aislada en el hombre
excepcionalmente en casos benignos de tosferina.

Accin patgena e inters clnico (Bordetella pertussis) - se infectan a traves de
gotitas (flugge) que se producen al hablar; tras periodo de incubacin de 1-2 semanas,
empiezan a multiplicarse en la superficie de las celulas epiteliales ciliadas de la traquea,
bronquios y bronquiolos, originando inflamacin en estas zonas, paralizacin de sus
cilios y consiguiente necrosacin; presenta una fuerte accin tusgena (tos seca) que puede
llegar a agotar debido a la accin de la toxina proteica y incremento de las mucosidades
queobstruyen los bronquios (bronco-constriccin) lo que facilita un dficit en
la ventilacin pulmonar; puede originar cianosis, taquicardia y vmitos alimenticios; es
altamente contagiosa, pero ya existe vacunas de la tosferina.


Haemophilus - bacilos muy pequeos Gram- aerobios y anaerobios
facultativos, inmviles y patgenos para el hombre y muchos animales; sensibles a medios
externos, desecacin, el calor y muchos antispticos; necesita medio de cultivo especifico
con sangre como AS o agar chocolate (contiene factores X/hemina o ferroprotoporfirina
y factor V/NAD o nicotinamida-adenina-dinucleotido necesarios para el proceso
de respiracin).

Especies mas importantes (clasificadas en funcin de los factores que necesitan):
- Haemophilus influenzae (bacilo de Pfeiffer) es el agente etiolgico de 10-15% de
lasmeningitis en nios de corte edad en Espaa y de neumonas en ancianos; requiere
ambosfactores V y X.
- H.parainfluenzae es agente causales en ciertas meningitis, afecciones respiratorias y
septicemias; tambin son saprofitos en fosas nasales y boca; requiere solo factor V.
- H.ducreyi es agente etiolgico del chancro blando (enfermedad venrea /ETS); requiere
solo factor X.

Accin patgena e inters clnico (Haemophilus influenzae):
- Es capsulada (su capsula esta formada por polisacridos distintos de A-F) en Espaa es
mas frecuente la del tipo B.
- Posee endo-toxina que es responsable de lesiones en la traquea y bronquios en procesos
neumnicos
- Suelen afectar a las vas respiratorias originando neumonas, bronquitis aguda en
ancianos y adultos debilitados.
- Puede producir meningitis en nios de corta edad; se transmite por va area y mas
frecuente en invierno y primavera; comienza como infeccin de las vas respiratorias altas
yposteriormente se extiende via sangre hasta el sistema nervioso produciendo meningitis
purulenta con mortalidad alta sin tratamiento a tiempo.
- Existe vacuna para H.influenzae tipo B.

Aislamiento - caracteres bioqumicos - diagnostico de Haemophilus:
- Toma de muestra a partir del exudado farngeo, esputo o lquidos purulentos (en caso
de infeccin de vas respiratorias), LCR por puncin lumbar (en caso de
sospecharmeningitis).
- Examen directo (tincin Gram, tincin negativa)
- Se cultiva en agar chocolate o AS de conejo/caballo, se aaden discos que contengan
factores V y X, ATB como la bacitracina que inhibe a otros grmenes; se formaran
satelitismo segn sus necesidades de los factores; incubar en la atmsfera rica en CO2.
- Pruebas bioqumicas => indol+, ureasa+, nitratasa+, oxidasa variable (segn la
cepa),fermentacion de glucosa positiva, ONPG-.
- Tcnicas inmunolgicas => determinar el Ags capsular (se realizan por la urgencia del
diagnostico)


Legionella - la especie mas importante para el ser humano, es Legionella
pneumophila(el agente etiolgico de la legionelosis / neumnia atpica por Legionella);
un coco-bacilo o bacilo Gram-, aerobio estricto, requiere medios muy especficos para
crecer (agar legionella),catalasa+, oxidasa+, en ocasiones puede presentarse de forma
filamentosa; en general son mviles, pero algunas cepas son inmviles.

Accin patgena e inters clnico - se transmite va area a partir de aerosoles
procedentes de aguas contaminadas o sistemas de aire acondicionado o humidificadores
contaminados con Legionella; tras el periodo de incubacin (+/- 1 semana) se produce
fiebres altas, astenia, malestar generalizado, tos, anorexia, dolor pleural agudo, disnea (un
cuadro tpico de una neumnia atpica); se conoce como la enfermedad de los
legionarios; el pronostico sera mas severo en ancianos o adultos debilitados aunque con el
tratamiento preciso suele remitir sin problema.


Bacillus - de la familia Bacillaceae; el genero Bacillus son bacilos esporulados aerobios o
anaerobios facultativos con tamao entre 1-7 micras Gram+ y en su mayora mviles; otro
genero de la misma familia es Clostridium son bacilos esporulados y anaerobios estrictos,
que origina en su mayora potentes exotoxinas responsables de cuadros clnicos graves.

Especies mas importantes de Bacillus:
- Bacillus anthracis (agente etiolgico del ntrax o carbunco)
- Bacillus cereus (responsable en muchas ocasiones de trastornos gastrointestinales)
- otros bacilos son comensales para el hombre o saprofitos del suelo, agua, etc., y que
depende del estado inmunitario, puede producir diferentes cuadros clnicos (p.ej. Bacillus
subtillis).

Accin patgena e inters clnico de Bacillus anthracis:
- Es un bacilo grande, habitualmente se presenta en forma de cadenas cortas o en parejas,
formando fcilmente esporas sobre todo en los cultivos viejos; es inmvil, presenta
capsulas(los patgenos) y exotoxina proteica que proporcionan propiedades anti-
fagocitaras.
- En general, el cuadro clnico que produce es el carbunco animal o humano; en el humano
tiene lugar tras un primer contacto a partir de animales infectados que tras periodo
de incubacin de 2-3 das surge una pstula maligna (color negro en la mano) en el punto
de contagio (las manos y cabeza); comienza con una ppula eritematosa que se complica
a vescula pruriginosa que se convierte en ulcera o escara, que sin tratamiento puede
necrosarse y extenderse en superficie y profundidad; los casos no tratados, podran ser
graves, ya que existe el riesgo de septicemia intensa que en pocas horas podra originar la
muerte; lo mas habitual son las formas benignas que curan con facilitad tras un
tratamiento.
- En casos excepcionales pueden aparecer formas internas como el carbunco
pulmonar ante la inhalacin de polvo contaminado con esporas de Bacillus anthracis que
da lugar a neumonas graves; tambin puede producirse carbunco intestinal por
la ingestin de alimentos contaminados con las mismas esporas y originara
diarreas, vmitos, dolor tipo clico, fiebre, etc.




Acinetobacter - (tambin esta descrito en genero de Moraxella/ Neisseriaceas) este
genero engloba especies que pueblan la flora de suelos y agua, al igual que Pseudomonas,
son bacilos Gram- no fermentadoras, capsuladas y presentes en ambiente hospitalarios
donde afectan a pacientes inmunodeprimidos; la especie mas frecuente es Acinetobacter
calcoaceticus que produce infeccin urinaria, neumonas y sepsis; crecen bien en Mc y AS
que da colonias grises y B-hemolticas; se diferencian de Pseudomonas en
que Acinetobacter es oxidasa-; son fcilmente confundible con Neisserias porque es bacilo
muy pequeo (coco-bacilo); tambin es muy resistente a los ATB.


Tema 21 - Corinebacterium (patologa e identificacin)

Genero Corinebacterium - pequeos bacilos inmviles a temperatura corporal, se
comportan como Gram+, suelen agruparse en formas geomtricas parecidas a letras chinas
o abecedario (empalizadas); presenta granulaciones metacromticas, catalasa+, anaerobios
facultativos y pueden dar lugar a un velo superficial en medios lquidos; presentan ciertos
rasgos comunes con Mycobacterium en su pared bacteriana que es muy rica
en cidos miclicos, arabinosa y galactosa, aunque la tincin de BAAR (Zhiel-Nielssen)
paraCorinebacterium resulta negativa; la especie mas importante es Corinebacterium
diphteriae.

Accin patgena e inters clnico de Corinebacterium diphteriae - el bacilo
diftrico llega al hombre por va respiratoria a traves de gotitas de saliva (pflugge) u
objetos recientemente contaminados invadiendo la oro-faringe y las amgdalas;
desde aqu se extiende, liberando toxinas y enzimas inhibiendo la sntesis proteica
celular, originando necrosis en las celulas epiteliales que invade; este epitelio necrosado
junto con leucocitos y fibrina formara una pseudomembrana que cubre las amgdalas, que
puede llegar a provocar una obstruccin respiratoria si se extiende por la naso-faringe y
laringe; tal pseudomembrana se encuentra fuertemente adherida a las mucosas, de forma
que si se intenta arrancar, originaria al paciente una fuerte hemorragia; en general
los signos y sintomas de la difteria suelen ser de tipo respiratorio; en casos excepcionales,
por va linftica podra pasar a la sangre difundindose al resto del organismo.


Tema 22 - Mycobacterium y Nocardia (patologa e identificacin)

La familia Mycobacteriaceae engloba un solo genero Mycobacterium; son pequeos
bacilos finos rectos y a veces incurvados, excepcionalmente pueden encontrarse algo
filamentosos; son inmviles con una pared tpica y caracterstica no encontrada en
ninguna otra familia excepto Nocardia (altamente enriquecida con cidos miclicos y
componentes creos que se tie muy difcilmente - responde a Gram+), se necesitan
colorantes con alta capacidad tintorial para su penetracin; una vez teidos son
altamenteresistentes a la decoloracin cida (AAR+ o acido alcohol resistencia positivo) lo
que les diferencia del resto de microorganismos; son muy distribuidos en la naturaleza,
pueden sersaprofitos del agua y suelo y puede provocar infecciones graves al hombre y en
ocasiones crnicas como la lepra; necesita gran cantidad de oxigeno para sobrevivir
(aerobias estrictas).

Las especies mas importantes del genero Mycobacterium (3 importantes grupos):
(1) Bacilos de Mycobacterium cultivables en medios artificiales, de crecimiento
lento(>1semana hasta 3 semanas); en funcin de los cuadros clnicos se subdividen en 2
grupos:
a. especies que producen tuberculosis al hombre y a los animales (Mycobacterium
tuberculosis y Mycobacterium bovis).
b. especies de micobacterias atpicas de crecimiento lento, podran presentar un
poder patgeno para el hombre distinto al de la tuberculosis y la lepra (Mycobacterium
avium y Mycobacterium marinum).
(2) Micobacterias de crecimiento rpido (<1semana); no tiene inters clnico (no
son patgenos) para el hombre.
(3) Bacilos de Mycobacterium no cultivables sobre medios artificiales y patgenos para el
hombre (Mycobacterium leprae) y ciertos roedores (Mycobacterium lepraemurium)

Los micobacterias tambin se pueden clasificar en funcin de la produccin de pigmentos,
de las morfologas de las colonias y de la velocidad del crecimiento.


Accin patgena e inters clnico
Mycobacterium tuberculosis - responsables de tuberculosis en el hombre
Muy rica en componentes lipdicos en su pared celular dotndole un carcter tintorial
especifico AAR+ que servir para su identificacin y clasificacin; contiene protenas que
provocan la formacion de Acs (reaccin de la tuberculina /test de Mantoux); es capaz
decrecer en el interior de las celulas que constituyen el sistema retculo endotelial, se
multiplican dentro de ellas sin ser destruida; en el frotis de baciloscopia se puede
observar forma cordones microscpicos.

Llega al hombre por inhalacin (excepcionalmente por ingestin de alimentos
contaminados con Mycobacterium o a traves de las heridas de la piel); produce
una lesin primaria en el pulmn y mas concretamente a nivel de los alvolos pulmonares,
provocando unaintensa reaccin inflamatoria que da lugar a exudacin; estos bacilos
pueden llegar hasta los vasos linfticos y de aqu a los ganglios, retornando a
la circulacin venosa y originandofocos metstasis en distintos rganos; sin tratamiento se
va desarrollando evolucionando hacia una necrosis "caseosa" (parecida a queso de
caverna); despus de 6 semanas o mas va evolucionando hacia
una destruccin y desintegracin de las celulas pulmonares con la formacin de una masa
solida, homognea, parecida al queso (caverna tuberculosa); provocara fiebres mas o
menos variables, sudoracin por la tarde, adelgazamiento progresivo, tos dbil o intensa (a
veces con esputos muco-purulentos) y en fases mas avanzada,hemoptisis; en general
cualquier parte del organismo podra verse afectada a causa de diseminacin
(gastrointestinales, genito-urinarias, pericrdicas, etc.)

Mycobacterium leprae - productoras de la lepra en el hombre
Se multiplica con extraordinaria lentitud y su clnica es bastante insidiosa y no ha podido
ser cultivado en ningn medio in vitro, por lo que se conocen poco
sus caractersticas microbiolgicas; su nico reservorio es el hombre con
autentica predileccin por las terminaciones nerviosas; es un bacilo inmvil, rectilneo, se
tie con Zhiel-Nielssen (AAR+); suelen encontrarse en la mucosa nasal, en la dermis y en
biopsias de lesiones en individuos con lepra;

La va de entrada es a traves de lesiones en la piel, se propagan a los nervios
superficiales prximos, concretamente a las celulas de Schwam; de aqu propagarse
via linftica al sistema venoso y disemina a otros rganos (lepra lepromatosa); se
multiplica mejor en las partes mas fras del organismo (la cara, extremidades) invadiendo
los nervios mas superficiales; el bacilo se multiplica en el interior de los macrfagos de la
piel y las celulas de Schwam, originando inflamacin y perdida de sensibilidad; en estado
grave tambin aparece en rganos mas profundos y su pronostico es mas complicado; su
periodo de incubacin es muy difcil de determinar, puede durar muchos aos; su periodo
de invasin es muy insidioso, sintomas raros y no asociables a lepra (picor, hormigueo y
perdida de sensibilidad en las manos/pies; a partir de aqu, de forma lenta y progresiva
aparecen lesiones cutneas (maculas prominentes en extremidades y cara); su periodo
durara toda la vida y su evolucin mas o menos grave depender del grado de inmunidad
del husped; tto => ATB sistemico.

Micobacterias atpicas - producido por Mycobacterium avium y Mycobacterium
marinum
Las micobacterias atpicas son m.o. patgeno para el hombre, frecuentemente
de carcter pulmonar, a veces confundido con Mycobacterium tuberculosis ya que
la sintomatologa es similar => tras una invasin, se
producen formacin de tubrculos y consiguiente necrosis caseosa con formacin de
cavernas, diseminacin y cuadros de fibrosis pulmonar con rara aparicin de focos extra-
pulmonares; la gravedad de lesiones depende del estado inmunolgico del paciente;
los grmenes invadir especialmente individuos inmunodeprimidos; la va de entrada es
muy variable (respiratoria o mucosas).



Aislamiento - caracteres bioqumicos - diagnostico
a)- Aislamiento de Mycobacterium tuberculosis
- Muestras puede proceder de esputo, aspirado bronquial, aspirado gstrica; LCR e orina;
la muestra de esputo han de someterse a
una descontaminacin, homogenizacin y concentracin (mediante centrifuga) previa al
cultivo; LCR, orina, etc. se puede sembrar directamente, pero lo mejor seria centrifugar-
lo antes.
- Se realizara un examen microscpico del frotis previa tincin de Zhiel-Nielssen
(AAR); tambin se pueden utilizar tinciones fluorescentes (auramina, rojo de tiacina,
naranja de acridina), cuando se sospecha que hay pocos bacilos (todo se trabaja bajo la
campana de flujo laminar).
- Para aislar el bacilo de Koch de muestras estriles (LCR, orina) se
utilizaramedios lquidos como Proskauer-Beck; si pretendemos hacerlos crecer en
medios slidos (esputo), existe medios especficos como Lowenstein-Jensen o Coletsos,
que contienen huevo, aminocidos, sales minerales y verde malaquita (inhibe
los grmenes contaminantes) cuyo crecimiento es lento (2-4 semanas); tambin existe agar
Middlebrook que se suele emplear junto con el anterior para completar su identificacin;
Micobacterias son muy exigentes en su crecimiento => incubar a 37C, en la oscuridad, en
el ambiente con CO2 de 5-10% (en 1 semana) y en atmsfera normal a partir de la 2
semana; los tubos desenroscados hasta que se evaporen el agua (sin secar el medio);
la mayora tardan entre 3-6 semanas en crecer (algunos aun mas); si hay crecimiento,
se har la identificacin de su morfologa mediante tincin de Zhiel-Nielssen y pigmentos.
- Pruebas bioqumicas => la mas importante es la prueba de la niacina+ (todas las
micobacterias producen cido nicotnico durante su crecimiento; M.tuberculosis no
metabolizan el cido nicotnico y por ello lo acumulan y es excretada al medio, sobre todo
en medios con base de huevo, del cual puede ser extrada y detectada); es nitratasa+ y
catalasa+(solo algunas cepas de Mycobacterium tuberculosis no tienen la catalasa; en
general tienencatalasa termolbil (a temperatura alta no tienen catalasa).
- Pruebas serologcas => la mas utilizada es la tcnica ELISA; actualmente
la identificacin se hace con el PCR, posteriormente se realiza la hibridacin con las
sondas genticas (ADN) de M.tuberculosis marcadas.
- Pruebas de alergia /la prueba de la tuberculina (Mantoux); tuberculina es un extracto
proteico de bacilo tuberculoso; es solo toxico para individuos que han estado en contacto
con dicho germen, originando una reaccin intradrmica en la cara anterior del brazo
intensa; este eritema endurado (ppula de >10mm es positivo) se debe leer hacia 48-72
horas (se mide la ppula no la zona roja); despus de las 4-6 semanas posteriores al
contacto, la prueba del Mantoux dar de por vida positiva.

b)- Aislamiento de Mycobacterium leprae
- Muestras a partir de heridas sospechosas en piel y otras localizaciones.
- Se realiza una tincin de Zhiel-Nielssen o AAR, que deber dar positiva
- No podr ser cultivada en medios de cultivo
- Se realizara un diagnostico serolgico (un estudio de la inmunidad celular y humoral del
individuo)
- Pruebas cutneas: (depende del resultado, se hace los 3 pruebas o solo algunos).
1. reaccin de la lepromina => para conocer el tipo de lepra que posee ese individuo
(prueba de intra-dermorreaccin /Ag de bacterias inactivadas); Las personas que no tienen
lepra tendrn poca o ninguna reaccin de la piel al Ag. Los pacientes con un tipo particular
de lepra, llamado lepra lepromatosa, no tendrn ninguna reaccin de la piel al Ag; una
reaccin positiva de la piel se puede observar en pacientes con lepra tuberculoide y lepra
dimorfa tuberculoide.
2. test de pilocarpina => para buscar la ausencia de sudoracin de la piel
lesionada despus de una inyeccin de clorhidrato de pilocarpina.
3. test de la histamina => inyectar histamina de tal forma que en una piel
sana aparecer una reaccion alrgica caracterstica, mientras que en las lesiones
lepromatosas esto no sucede debido a que los nervios perifricos estn lesionados y
no aparecer ninguna reaccin alrgica.

c)- Aislamiento de Micobacterias atpicas
- Recogida de muestra de los lugares sospechosos en total asepsia
- Tincin de Zhiel-Nielssen (positiva); tincin fluorescencia con auramina, rojo de tiacina,
naranja de acridina.
- Cultivos en medios Lowenstein-Jensen, Coletsos o caldo Middlebrook, donde se puede
observar el aspecto de las colonias, su velocidad de crecimiento y la presencia de
pigmentos.
- Pruebas bioqumicos: niacina- (la diferencia de Mycobacterium tuberculosis), catalasa+,
nitratasa+.
- Pruebas serologcas de ELISA

Actualmente en grandes laboratorios, se utilizan medios de cultivos radiomtrico (Bactec
TB)de deteccion mas rapida que contiene liquido de soporte (agar Middlebrook) con
ATB para inhibir los demas grmenes y el sustrato marcado con un istopo del carbono
C14; las micobacterias al crecer metabolizan el sustrato y liberan gas CO2
marcado radioactivamente que es detectada automticamente por el Bactec y una vez que
se ha detectado crecimiento en alguno de los medios, se realiza la tincin de Ziehl-Neelsen
para ver si lo que ha crecido son BAAR o no.


Baciloscopias - las extensiones para baciloscopias se deben hacer previamente a
la descontaminacin (CHNa 2-4%) de las muestras y homogenizacin (N-acetil cisteina) ,
posteriormente su concentracin por centrifugacin; la preparacin del frotis del esputo ha
de hacerse seleccionando la parte mas purulenta que es donde hay mas micobacterias;
cuando se lleva acabo la tincin de los frotis, se debe evitar el contacto fsico entre las
portas para evitar contaminacin cruzada; es importante cuantificar el numero de bacilos
encontrados ya que esta directamente relacionado con el grado de contagiosidad del
paciente y con la gravedad de la infeccin.


El genero Nocardia - corresponde a actinomicetos aerobios que forman micelio
vegetativoque tiende a fragmentarse originando estructuras bacilares o coco-bacilares;
Gram+ inmovil,aerobios estrictos y
AAR+ (tiene caractersticas anlogas al Mycobacterium) poseen gran cantidad de acidos
micolicos de cadena larga en su pared bacteriana; poseen ademas glicolpidos y
fosfolpidos que sirve para su identificacion y diferenciacin; algunas especies
son patgenas para el hombre.

Accin patgena e inters clnico
Gran parte de nocardiosis son infecciones de carcter oportunista; no produce toxinas,
pero contiene en su pared bacteriana alta proporcin de lpidos que le confiere una
resistencia a los sistemas de defensa (macrfagos, linfocitos, etc.); tiene capacidad
de crecer y multiplicarse en el interior de los tejidos (macrfagos)
como parsito intracelular y solo crece cuando las defensas del individuo se encuentran
bajas; las manifestaciones clnicas mas frecuentes son:
A. Nocardiosis pulmonar - causada sobretodo por Nocardia asteroides que produce
lesiones pulmonares con abscesos, inflamacin diseminada semejante a la tuberculosis;
pueden surgir reas de necrosis y diseminarse por sangre a otros rganos provocando
septicemia.
B. Micetomas (lesiones granulomatosas) de carcter crnico originadas en
eltejido subcutneo donde se producen tumefaccin, abscesos y pstulas y/o ndulos que
al abrirse presentan exudados sero-sanguinolentos; generalmente causados por Nocardia
brasiliensis y es frecuente en las extremidades inferiores y superiores; presenta periodos
de remisin y es caracterstico de climas tropicales;


Tema 23 - Bacterias anaerobias (patologa e identificacin)

Anaerobias - todas aquellas bacterias incapaces de crecer y/o mantenerse en contacto
con O2 a la presion atmosfrica; presentan un metabolismo anoxibitico => incapaz
de utilizar O2 de la atmsfera como aceptor final de electrones; en su lugar utilizan
sustratos orgnicos como aceptores finales de
electrones(respiracin anaerbica /fermentacion); la presencia de O2 puede
ser (1) bactericida /toxica /letal directa o bacteriosttico (crecern de nuevo cuando las
condiciones son favorables); (2) inhibir ciertos sistemas enzimticos o
la funcin reguladora primordial del metabolismo celular; (3) generan producto txicos al
interaccionar sus componentes propios con O2; los anaerobios son las
bacterias predominantes en la flora normal humana y en algunas partes p.ej. boca o
intestino estn en proporcin de 1000:1 con respecto a la flora aerobia, por
tanto, la mayora de la infeccin que provoca los anaerobios son endgenas; dentro de los
anaerobios se distingue => anaerobios estrictos y anaerobios aero-
tolerantes/microaeroflicos (puede crecer a 2-8% de O2).

Genero Clostridium - bacterias anaerobias esporuladas; son bacilos Gram+, anaerobios
estrictos, forman esporas a nivel terminal o subterminal,
presentan flagelacin pertrica, mviles, no presentan capsulas excepto Clostridium
perfringes; ampliamente distribuidas en el suelo, agua, etc. y altamente resistente a
medios externos; responsable de infecciones e intoxicaciones muy graves (ttanos,
botulismo, gangrena gaseosa, etc.); las especies mas patgenos actan mediante
la formacin de toxina con poder toxico sobre el husped; algunos podran formar parte de
la flora normal del hombre y animales.


Las especies mas importantes
A. Clostridium que originan toxinas cuyo mecanismo de accin es neuro-
toxico =>Clostridium tetanii - el agente etiolgico de ttanos y Clostridium botulinum -
agente etiolgico del botulismo.
B. Clostridium que originan toxinas que actan sobre tejidos provocando histo-
toxicidad =>Clostridium perfringes - agente etiolgico de la gangrena gaseosa; para
su penetracin en el organismo se requieren lesiones previas.
C. Clostridium que originan toxinas que actan sobre el tracto digestivo (clostridios
entero-toxicos) => Clostridium difficile - responsable de trastornos gastrointestinales no
graves.
D. Clostridium responsables de cuadros purulentos (clostridios pigenos) => Clostridium
perfringes; es frecuente la presencia ademas, de otras bacterias anaerobias.

Accin patgena e inters clnico
A. Clostridium que ejercen accin neuro-toxica sobre las personas (C.tetanii y
C.botulinum)
Clostridium tetanii - es un bacilo Gram+ pequeo, formadora de esporas (aspecto de
tambor o cerilla), habitan la tierra y el intestino del hombre y animales; produce 3 toxinas
responsables del cuadro tpico del ttanos que son transportadas va sangunea o humoral
hasta SNC bloqueando la liberacin de neurotransmisores, originan hiperactividad de las
neuronas motoras que da lugar a convulsiones y parlisis espstica o espasmo muscular a
nivel perifrico; se ve alterado el sistema muscular variando el ciclo de contraccin-
relajacin de forma que este entra en fase de contraccin y no se
recupera (rigidez tetnica / episttonos).

Para que se produzca el ttanos es necesario una serie de condiciones tales como que el
microorganismo germine (condiciones adecuadas de anaerobiosis); tras una herida
profunda (cortante, punzante, mordeduras, araazos, partos, abortos, quemaduras, ulceras
por decubito) o herida superficiales (rozaduras) se pueden infectar y formar costra que
facilita la infeccin anaerobia; en las condiciones favorables de anaerobiosis, las esporas
deClostridium tetanii en el ambiente pasan a la herida, germinan y tras un periodo
de incubacin (5-7 das), se origina su accin patgena; es rara que se produzca de forma
local en la zona de entrada; la forma generalizada es mas habitual y mas grave; es
importante la deteccin precoz y medidas profilcticas (vacunacin se renueva cada 10
aos).


Clostridium botulinum - bacilos Gram+ anaerobios estrictos, grandes, mviles por
su flagelacin y presentan esporas; es capaz de formar neuro-toxinas peligrosas y potentes
sobre las personas que originan parlisis o debilidad muscular; las esporas son distribuidas
ampliamente en el aire, suelo, ciertos alimentos (conservas, pescados, etc.); si las
condiciones en el ambiente son de anaerobiosis, germinaran; su accion patgena sobre el
organismo seraneuro-paralizante y con una dosis de 10 elevado a -8 (10 nanogramos) de su
toxina es suficiente para causar la muerte (es el veneno mas potentes hasta ahora), que
solo se producen en condiciones adecuadas de anaerobiosis, temperatura en torno a
30C, pH neutro o ligeramente acido y permiten que germine la espora; sus toxinas son
de carcter proteico y termolbiles (se destruyen a temperatura 100C durante 5 minutos o
70C de 30-60 minutos).

El mecanismo de accin de las toxinas botulnicas => a traves de los alimentos
contaminadosllega esta neuro-toxina al tubo digestivo del hombre y producir toxinfeccin
alimentariainicialmente; de aqu via sangunea y linftica llega hasta sistema
nervioso perifrico donde acta en las terminaciones nerviosas, originando parlisis en el
musculo esqueltico y otras manifestaciones neurolgicas como visin borrosa, fotofobia,
sequedad de boca, lengua y faringe, disfagia, disartria (dificultad al hablar), debilidad de
los musculos (flacidez) incluyendo los respiratorios que puede llegar mortal por fallo
respiratorio y arritmias cardacas (depende de la cantidad de toxina o del germen);
su periodo de incubacin en torno 18-36 horas despus de la ingestin del alimento
contaminado y los cuadros mas graves se originan en un periodo de incubacin inferior a
24 horas.

B. Clostridium que ejercen accin histo-toxica en mltiples tejidos
Clostridium perfringes - ejercen un efecto toxico importante pero no actan sobre
SNC; son Gram+, anaerobia estricta, la nica especie capsuladas, ampliamente distribuida
en el suelo; de aqu a traves de heridas profundas, puede pasar al hombre
produciendo gangrena gaseosa; tambin puede encontrarse en la flora intestinal; capaz de
formar toxinas que actan sobre los tejidos, entero-toxina, hemolisina, neuroaminidasa.

El mecanismo de accin => tras la va de entrada (heridas) en condicin anaerobiosis
adecuadas, germinan las esporas y proliferan; es frecuente que se contaminen con otro tipo
de bacterias aerobias que consiguen agotar el oxigeno aumentando las condiciones de
anaerobiosis, se disminuye el pH aumentando el acido lctico y facilitando la liberacin de
las enzimas proteolticas y sustancias toxicas; se producirn los efectos lesivos y graves
sobre los tejidos extendindose a los vecinos, se rompern las estructuras celulares a nivel
de sus membranas, se destruirn las celulas hemticas, las celulas endoteliales, las
membranas de las celulas musculares originando procesos de dermo-necrosis con dao
tisular (gangrena).

Ademas de provocar la gangrena gaseosa a traves de heridas infectadas, C.perfringes
es tambin el agente etiolgico de una toxo-infeccin alimentaria producida por
la ingestin de carne contaminada provocando cuadros diarreicos y dolor abdominal leve;
existen otros casos mas excepcionales y graves que da lugar a cuadros diarreicos muy
acuosos y sanguinolentos, vmitos y estado de shock producido por C.difficile.


Aislamiento - caracteres bioqumicos - diagnostico
- Toma de muestra representativa, adecuada y estril en medios especficos de transporte
anaerobiosis con sustancias reductoras (bolsas generadoras de CO2) que
crean atmsferas sin O2 o en una jeringa sin aire (tapando la aguja).
- Se har un examen directo (tincin de Gram) donde se pueden apreciar las formas de
esporas (palillos de tambor); tambin se puede realizar tincin de esporas.
- Se cultivaran en medios de cultivos especficos como ASA (agar sangre
anaerobio); incubacin a 37C en 48 horas en condicin anaerobisis, utilizando
unacampana con un sobre generador de gas CO2, da lugar a la liberacin de H y CO2; el
O2 que existe en el anterior de la campana, se une al H, forman H2O que se depositan en
forma de gotitas en las paredes, tambin hay que introducir un indicador de anaerobiosis
(una tira reactiva).
- Pruebas bioqumicas => cuando existe crecimiento en el medio anaerobio, se monta
directamente el API en un recipiente/ una caja, tambin anaerobio.


Bacterias anaerobias no formadoras de esporas - crecen en ambientes de bajo
potencial oxido reductor o ambientes microaerfilos; son ampliamente distribuidos en la
naturaleza y muy pocas capaces de producir cuadros patgenos graves al hombre; gran
parte de ellos forman parte de la flora gastrointestinal, vaginal o bucal del hombre, no
ejerciendo efecto patgeno alguno.

Las especies mas importantes
A. Bacilos Gram+ no esporulados:
- Lactobacillus => microaerfilos, crecen mejor en anaerobiosis; son flora habitual de
laboca, vagina e intestino del hombre; son de gran utilidad a nivel industrial (produce
acido lctico para los yogures); no intervienen en ningn proceso patgeno para el hombre.
- Propionibacterium => son anaerobios, pueden crecer en ambientes microaerfilos;
forman parte de la flora normal intestinal, tracto urinario y piel.
- Bifidobacterium => es flora intestinal del hombre y no son patgenos.

B. Bacilos Gram- no esporulados:
- Bacteroides => son flora intestinal, vaginal y bucal del hombre y se ha asociado en
ocasiones a procesos gastrointestinales, especialmente Bacteroides
fragilis que acta comooportunista.
- Fusobacterium => solo la especie Fusobacterium nucleatum se asocia a
algunosprocesos patgenos en el aparato respiratorio y tracto genital femenino,
de carcter oportunista.

C. Cocos Gram+ no esporulados:
- Ciertos Streptococcus anaerobios que se encuentran frecuentemente en la
floragastrointestinal y bucal; no son patgenos.
- Peptococcus => no produce efecto patgeno sobre el hombre

D. Cocos Gram- no esporulados:
- Veillonella => forma parte de la flora intestinal y bucal y no son patgenos para el
hombre.

Accin patgena e inters clnico
Salvo excepciones, no son relacionados con procesos patgenos y la patogenicidad que
pudiera desencadenar alguno de ellos depende sobre todo de las circunstancias
del husped (oportunistas); pueden producir infecciones post-quirrgicas, complicaciones
de escaras o ulceras por decubito, complicaciones de herida en general.



Aislamiento - caracteres bioqumicos - diagnostico
- Toma de muestra en condiciones adecuada (anaerobiosis)
- Examen directo (tincin de Gram)
- Se aislaran en medios anaerobiosis (ASA/ANA - agar sangre anaerobio)
- Pruebas bioqumicas se realiza con API en condicin anaerobia

Tema 24 - Espiroquetas (Treponema, Borella y
Leptospira); patologa e identificacin

La familia Espiroquetaceas (con inters clnico para el hombre) - Treponema, Borrelia
y Leptospira; corresponden a especies bacterianas cuya morfologa es filamentosa,
helicoidal o espiral con filamentos axiales relacionados con su movilidad; presenta una
pared celular fina y flexible de lipo-polisacrido y lipo-proteica donde se encuentran
la mayora de Ags especficos de estas; son Gram- (difcilmente se tie), tambin se
pueden visualizar por el microscopio de contraste de fases; presentan un metabolismo
oxidativo y/o fermentativo(aerobias o anaerobias facultativas); difundidas en las aguas, el
suelo y como agentescomensales en las mucosas del hombre y animales.

La familia Espiroquetaceae se divide en 5 generos:
- Genero Espiroqueta => espiroquetas mas grandes y no existen especies patgenas para el
hombre.
- Genero Cristispira => son de tamao algo menor que el Espiroqueta y no
es patgeno para el hombre.
- Genero Treponema => son espiroquetas muy helicoidales, muy finas,
pequeas y mviles; son microaeroflicas y presentan un metabolismo fermentativo;
existen especies patgenas para el hombre - Treponema pallidum (el agente etiolgico de
la sfilis).
- Genero Borrelia => son espiroquetas mas grandes que Treponema;
son microaeroflicas y presentan pocas espiras que son amplias e irregulares;
su metabolismo es fermentativo y son difciles de cultivar en medios artificiales;
pueden provocar fiebres recurrentes al hombre transmitido por artrpodos.
- Genero Leptospira => son espiroquetas largas, muy finas y con numerosas espiras,
profundas y regulares; es difcil su visualizacin aunque se suele utilizar microscopia de
contraste de fases; son aerobias con un metabolismo oxidativo; se cultivan con facilidad en
medios artificiales; ampliamente distribuidas en la naturaleza, especialmente en las aguas;
pueden parasitar al hombre provocando leptospirosis.


Genero Treponema - son espiroquetas pequeas, finas con un numero de espiras entre
5-20 distribuidas de forma regular, con gran movilidad; se tie difcilmente con Gram y se
tie mejor con Giemsa o tincion de plata y se visualiza con la microscopia de campo oscuro
y de contraste de fases; no crece en medios de cultivo in vitro y requiere un medio de
cultivo in vivo para crecer (testculo de conejo); crece bien en situaciones de bajo potencial
oxido-reductor (microaerofila), presentando en ocasiones una respiracin anaerobia y un
metabolismo fermentativo; el especie patgena para el hombre es Treponema
pallidum que transmite la sfilis por contacto directo; existen dentro del
genero Treponema especies comensales de las mucosas, tracto urinario, vaginal, tubo
digestivo, etc. que no son patgenos para el hombre y se pueden cultivar.

Treponema pallidum es la especie mas importante por su difusin cosmopolitana; es el
agente causal de sfilis; no son capaces de vivir fuera del organismo humano, ya que
mueren por desecacin; su transmisin es por contacto directo (va sexual) y si no se
detecta a tiempopuede durar toda la vida; mecanismo de accin:
- Periodo primario de la sfilis => comienza tras un primer contacto con lesiones ricas
en treponemas presentes en las mucosas; periodo de incubacin 10-90 das (termino
medio de 21 das) aparece en la zona genital un chancro primario con abundantes
treponemas, se van diseminando va hemtica y linftica a otras
localizaciones convirtiendo-se en unaenfermedad sistmica; es frecuente
su multiplicacin en ganglios prximos a la zona genital originando pequeas
tumoraciones (adenopatias); transcurrido un tiempo corto de 2-6 semanas estos signos
desaparecen espontneamente y entra en una fase silente.
- Periodo secundario o sfilis florida => surge despus de un tiempo entre 2 meses y
2 aos de la fase silente; de forma sbita se produce una espiroquetemia en general muy
florida por las manchas en la piel y en las mucosas, muy ricas en treponemas y altamente
infecciosas; tambin puede surgir excepcionalmente una forma eruptiva como lesiones en
otros rganos, fiebre en ocasiones, pstulas o ppulas muy ricas en treponemas; este
cuadro clnico de carcter sistmico remite a las pocas semanas (2-6 semanas), volviendo a
entrar en una nueva fase de latencia.
- Periodo terciario o sfilis terciaria => surge tras la fase de latencia entre 3-30 aos,
una forma muy grave con mal pronostico; el numero de treponemas en sangre es muy
escaso y muy abundante en ganglios, bazo, huesos, sistema nervioso (neuro-sfilis) y
aparato cardiovascular; es frecuente la formacin de granulomas, necrosis,
gomas, parlisis general progresiva, aneurisma artico, etc.

Resumen de la evolucin de sfilis => Incubacin 10-90 das (termino medio 21 das)
- Periodo primario (2-6 semanas) - fase silente (2 meses - 2 aos) - Periodo
secundario/ sfilis florida (2-6 semanas) - fase latente (3-30 aos) - Periodo terciario/
Neuro-sfilis forma muy grave con mal pronostico.

Aislamiento - caracteres bioqumicos - diagnostico del genero Treponema
pallidum
- Treponema pallidum se asla muy difcilmente, no crece en medios in vitro, solo lo hace
en medios in vivo (testculos de conejo) y el diagnostico de la infeccin se establece durante
los periodos primario y secundario mediante muestras de exudados, condilomas, etc.
- Examen directo al microscopio de campo oscuro o microscopio de contraste de fases o
microscopio de fluorescencia de una tincin de Giemsa o tincin Nitrato de plata (sales de
plata; es una tcnica difcil de efectuar, reservada a los laboratorios especializados, til en
la deteccin de Pneumocytis carinii, Legionella, Treponema, hongos, Rickettsias).
- Pruebas serologcas => se realiza la prueba de la presencia de Acs anti Treponema
pallidum en el suero del paciente con Ags especficos de Treponema pallidum que
presentan una sensibilidad y fiabilidad del 100%; los resultados dependen del periodo
de sfilis en el que se encuentre; tambin se incluyen las inmunofluorescencia
indirecta, as como las de hemo-aglutinacin pasiva partiendo de hemates tratados con
Treponema pallidum que es muy sensible y econmica.


Diagnostico serolgico de las sfilis - existe 2 tipos de pruebas (no treponmicas y
treponmicas)
a) No treponmicas => son de gran sensibilidad y fcil de hacer; se usa para prueba de
screening y si resulta (+), hay que confirmar con pruebas treponmicas; tambin se utiliza
como un seguimiento de la enfermedad; se le llama tambin prueba de WASSERMANN;
consiste en enfrentar el suero del paciente con sustancia lipdica "cardiolipina" que no es
Ags treponmicos; si existen Acs anti Tp en el suero, reaccionaran con la cardiolipina (+);
pero al no ser la cardiolipina un Ags treponmicos, puede dar lugar falsos positivo con
otras enfermedades; 2 tipos de pruebas => VDRL (Venereal Disease Research
Laboratory) y RPR (reagina plasmtica rpida) son pruebas
de aglutinacin con partculas de carbn (darn grumitos grises).
b) Treponmicas => se utilizan como prueba confirmativas con
varias tcnicas: (1) FTA(tcnica fluorescencia de Acs anti Tp) enfrentando Ags de Tp con
posibles Acs anti Tp en el suero del paciente; (2) FTA abs donde previamente se absorben
posibles Acs naturales anti Tp saprofitos; (3) TPHA (Tp Haemagglutination Assay) que
tiene como base hemaglutinacin y sencillo de realizar (no se necesita microscopio
fluorescencia); (4) tambin se puede utilizar pruebas de ELISA para detectar IgM y IgG;
todas son pruebas muy especificas; no se utilizan para el seguimiento, porque sera siempre
resulta (+).

Genero Borrelia - son espiroquetas de mayor tamao con espiras mas amplias e
irregulares con extremos afilados y son mviles; las especies patgenas para el hombre y
los animales,originan fiebres recurrentes endmicas y epidmicas; es microaeroflica con
un metabolismo fermentativo; se tien con facilidad de Gram- y se puede cultivar in vitro,
pero requiere medios muy especficos; las especies mas importantes del genero Borrelia, se
transmiten por piojos y por garrapatas.

Accin patgena e inters clnico - las fiebres recurrentes son una enfermedad muy
cosmopolita, en ocasiones endmica a condiciones de salubridad muy baja; tras la picadura
del vector, ya sea garrapata o piojo, pasan las borrelias a la sangre del husped, ayudadas
por el rascado que provoca el aplastamiento del piojo /garrapata, que dar lugar a micro-
traumas en la piel y facilitan el paso de dichas borrelias; despus de
unos7 das de incubacin se originan fiebres, dolores musculares, cefalea,
etc; clnica que dura unos 10 das y luego desaparecer, produciendo posteriormente
recurrencias; no es una enfermedad grave y es fcil de tratar, especialmente con
tetraciclinas.


Genero Leptospira - son espiroquetas muy finas con espiras regulares, muy numerosas
y apretadas, con sus extremos ligeramente incurvados y mviles; se tien dbilmente con
Gram, tambin se pueden teir con Giemsa; su metabolismo es
oxidativo (crecimientoaerobio); existe en la naturaleza leptospiras saprofitas y parsitas;
puede originar de forma casual leptospirosis en el hombre con cuadros febriles; el
reservorio son animales, consideradas como zoonosis.

Tema 25 - Rickettsias, Chlamydias y Micoplasmas (patologa e identificacin)

Genero Rickettsia - son parsitos celulares estrictos (porque su dotacin enzimtica es
muy escasa) de los artrpodos (crecen muy bien en el citoplasma); son coco-bacilos Gram-;
producen en el hombre enfermedades transmitidas por piojos, garrapatas, pulgas y caros.

Especies mas importantes de la familia Rickettsiaceae - hay 3 gneros importantes
=>Rickettsia, Rochalimaea y Coxiella (Coxiella burnetti es coco-bacilo Gram+ que
origina la fiebre Q).

Accin patgena e inters clnico:
(1) Tifus exantemtico epidmico - producido por R.prowazekii; mediante
la picadura de piojo; tras el periodo de incubacin de 1-2 semanas, aparecen escalofros,
fiebres altas (40C), cefaleas, dolores generalizados, ndulos inflamatorio de los capilares,
arteriolas, vnulas, la piel y musculos (dificulta la corriente sangunea y en casos
graves puede provocar gangrena en las extremidades); es frecuente
la formacin de maculas rosadas y posteriormente ppulas y petequiales.

(2) Tifus murino o endmico - producido por R.typhi mediante la picadura de la
pulga, garrapatas y caros; tras el periodo de incubacin de 4-15 das, se produce fiebres
altas, cefaleas, artralgias y mialgias generalizadas con un cuadro clnico leve sin
complicaciones ni recidivas como el tifus exantemtico.

(3) Fiebres manchadas de las montaas rocosas - producida
por R.rickettsiitrasmitidas por las garrapatas; tras el periodo de incubacin de 3-6 das,
aparecen fiebres altas, mialgias generalizadas y una mancha negra en la zona de la
picadura; en Espaa la especie mas extendidas es R.conorii, el agente de la fiebre
botonosa o exantemtica mediterrnea, transmitida al hombre por la garrapata (sobre
todo del perro); tras el periodo de incubacin de 2-6 das provoca una mancha negra a
modo de botn en el lugar de la picadura, fiebre, artralgias, mialgias generalizada y
manchas maculo-papulosas; no se suelen complicar y responden bien al tratamiento.

(4) Fiebre Q - producida por Coxiella burnetii mediante inhalacin de esta u
otras(presencia de artrpodos), la va de entrada no se conocen hasta la fecha; tras el
periodo de incubacin de 3 semanas, se produce un estado febril con mialgias
generalizadas ycuadro clnico leve.

Aislamiento - caracteres bioqumicos - diagnostico del genero Rickettsia
Se toma 2 muestras de sangre en estadios febriles (cuando hay mas Rickettsia):
- La 1 se centrifuga para obtener un sedimento sanguneo (concentracin alta de
Rickettsia); se usa para realizar varias tinciones p.ej. May-Grunwald-Giemsa (las
rickettsias aparecen de color purpura), tincin Gram (resulta negativo para Rickettsia y
positiva para Coxiella burnetii), tincin inmunofluorescencia y estudios de
microscopia electrnica (para observar); el sedimento tambin se usa para sembrar en
medios de cultivo celular o embriones.
- De la 2 se obtiene sueros para pruebas serologcas (buscando ttulos de Acs), con
tecnicas inmunofluorescencia, seroaglutinacin o ELISA.




Genero Chlamydia - se consideran mas prximos a virus que a bacterias;
son parsitos intracelulares estrictos (carecen de mecanismo biosinttico auto-suficiente)
del hombre y animales; son cocos pequeos de Gram-, inmviles; poseen ADN y ARN y
su multiplicacin es por divisin binaria (a diferencia de virus); es capaz de vivir en medios
intracelulares durante mucho tiempo sin presentar una sintomatologa clara lo que facilita
la cronificacin de procesos infecciosos.

Especies mas importantes - dentro de la familia Chlamydiaceae:
- Chlamydia psittaci => parsito intracelular de animales y excepcionalmente del
hombre(tras la inhalacin de heces de pjaros infectados),
provocando brotes neumnicos de distinta gravedad.
- Chlamydia trachomatis => parsito intracelular del hombre,
provocandoinfecciones sistmicas o locales de distinta gravedad y afectando especialmente
a los genitales y a los ojos.

Accin patgena e inters clnico - se multiplican en el citoplasma de
la clula que parsita, presentando un ciclo con 2 tipos celulares diferentes:
- En 1er periodo formara una clula densa o corpsculo elemental con gran resistencia a
la sequedad, lo que permitir la dispersin de Chlamydia; es la forma infectiva.
- En 2nd periodo formara una clula mas grande de menor densidad
o corpsculo reticulado, que es responsable de la divisin binaria y por tanto
de crecimiento clamidias.
El proceso del ciclo => la forma infectiva (corpsculo elemental) penetra en la clula que
va a parasitar ayudado por los Ags especficos, se produce infeccin celular, se forma
una vescula citoplasmtica que bloqueara los mecanismos de defensa de la propia clula; a
partir de aqu este corpsculo elemental aumenta su tamao, su pared se hace mas fina y
permeable permitiendo el paso de complejos enzimticos, ATP y otras sustancias que van a
necesitar de la clula que parasitan; el citoplasma de la clamidia se hace mas denso y
esponjoso y aparece la segunda forma, donde comienza a multiplicarse
por divisin binaria.

Cuadros clnicos de Chlamydia trachomatis:
- Tracoma => tras un contacto directo se produce una infeccin crnica en el epitelio
conjuntival y corneal, siendo frecuentes las recadas y sobre infecciones con evolucin lenta
hacia la ceguera; frecuente en edades infantiles.
- Conjuntivitis neonatal => aparece entre la primera y la segunda semana despus del
nacimiento; surge una conjuntivitis purulenta al neonato, asociada a infecciones genitales
por clamidias en la madre; puede evolucionar positivamente o hacia
lesiones anlogas al Tracoma.
- Linfogranuloma venreo => es una infeccin que se trasmite por contacto venreo.

Aislamiento - caracteres bioqumicos - diagnostico del genero Chlamydia
Debido al elevado riesgo de infeccin en el laboratorio al manipular clamidias se suelen
utilizar metodos indirectos (serolgicos) a veces tambien se realiza examenes citologicos en
cultivos especficos.
- Se toman muestras de secreciones oculares y/o genitales
- Se realiza un examen directo que incluyen una tincin de Giemsa y de Gram.
- Se realizan tcnicas citolgicas
- Se realizaran exmenes indirectos mediante tcnicas serologcas (la mas frecuente
ELISA) que son mas seguras y fiables; existe un kit para buscar clamidias.




Genero Micoplasma - es uno de los microorganismos mas pequeos existentes
en bacteriologa y se caracteriza por no contener pared celular => sensible a
la presin omotica del medio (se lisan facilmente),
su morfologa es pleomorfismo y resistente a ciertos antibiticos cuya mecanismo
de accin se establece en la pared bacteriana; se dividen por divisin binaria y vivir de
forma independiente y crece bien in vitro a partir de medios artificiales enriquecidos; se
encuentra extendidos en la naturaleza; son comensales de la mucosa del hombre; existe
especies patgenas como Micoplasma pneumoniae que afecta al aparato respiratorio.

Especies mas importantes - dentro de la
familiaMicoplasmataceae estn los gneros Micoplasma y Ureaplasma; solo unas 10
especies pueden producir algn efecto patgeno en las membranas celulares de las
mucosas oro-farngeas y uro-genitales; la mas importante para el hombre es Micoplasma
pneumoniae(produce neumonas); el Ureaplasma urealyticum es otra
especie patgeno que se asocia a ETS junto con el Micoplasma hominis.

Accin patgena e inters clnico
- Su infectividad se relaciona con su adherencia (debido a una glicoprotena especifica) a
los epitelios de las mucosas; su pleomorfismo puede adoptar formas filamentosas y
alargadas que aumenta la superficie de contacto a las estructuras epiteliales a las que se
une; una vez adherida, los cilios de las celulas epiteliales que tapizan la mucosa se
paralizan y provoca alteraciones metablicas en dichas celulas epiteliales.
- Cuadros clnicos => cuadro pulmonares y mas raramente cuadros genitales o uro-
genitales, siendo Micoplasma pneumonia es mas importante como el agente causal mas
frecuente de las neumonas atpicas.
- En casos excepcionales se han podido aislar Micoplasma hominis y Ureaplasma
urealyticum en procesos uretrales y genitales como salpingitis, vaginitis, prostatitis,
cervicitis, etc. (son casos muy raros)

Aislamiento - caracteres bioqumicos - diagnostico
- Se toman muestras de la mucosa farngea, secreciones uretrales, exudados, muestras de
esputo, de sangre, etc segn la patologa.
- Se realiza un frotis de la muestra que se puede observar en campo oscuro con nigrosina,
al microscopio de contraste de fases o con la tincin de Giemsa (se tie dbilmente).
- Se siembra en medios especficos y con un alto grado de humedad para evitar
la desecacin.
- Se realiza pruebas bioqumicas => fermentacion de glucosa, prueba de arginina, ureasa,
etc.; existe un kit de la deteccin micoplasmas.
- Metodos serolgicos son mas rpidos, mas fiables y mas utilizados en la actualidad
(inmunofluorescencia y ELISA).




Genero Campylobacter - son bacilos Gram- cortos con forma de coma, espiral o alas de
gaviota (en cultivos jvenes); son microaeroflicos, mviles por un nico flagelo polar; no
fermentan los carbohidratos, oxidasa+ y catalasa+; habitan el tracto gastrointestinal de
muchos animales; en el hombre se asocian a infecciones gastrointestinales (via de entrada
oral/ digestiva), fundamentalmente, y cada vez en mayor grado a infecciones extra-
intestinales (meningitis, endocarditis, artritis sptica), especialmente en pacientes con
SIDA.

Especies clnicamente importantes para el hombre - C.jejuni, C.coli y C.
laridis sonagentes etiolgicos de diarrea; C.fetus subsp. fetus produce septicemia en
pacientes inmuno-suprimidos.

Aislamiento a partir de "heces" - la siembra inmediata en medios selectivos a la toma
de muestra; si se tiene que posponer, se utilizaran medios de transporte especiales (Cary-
Blair o Campy-Thio) donde se mantiene viables; el cultivo de campylobacter tiene que
cumplir 3 requisitos =>
(1) empleo de medios selectivos p.ej. "Campylosel" contiene sangre de cordero con ATB
y antifngico o "Skirrow" contiene sangre de caballo con ATB
(2) uso de atmsfera reducida de O2/ microaeroflica se consigue mediante sistema
de evacuacin-reemplazo hasta lograr 5% de O2, 10% de CO2 y 85% de N2 o campanas
anaerobios con sobres comerciales que generan la atmsfera deseada.
(3) temperatura de 42C en aislamiento inicial entre 24-48 horas (para inhibir la flora
fecal acompaante), despus pasa a 37C el 3 da; las placas han de incubar hasta 72
horas antes de descartarse como negativas; a esta temperatura se consigue
el mximo aislamiento deC.jejuni y C.coli.
Si pretende aislar otras especies de campylobacter distintas a C.coli y C.jejuni => ha de
emplear medios selectivos sin cefalosporinas, incubacin a
37C, atmsfera microaeroflica, incubacin de 7 das.

Identificacin - los campylobacter termoflicos dan lugar a colonias grises, incoloras,
mucosa y no hemolticas; se les hace una tincin Gram (bacilos Gram- con forma de S en
cultivo joven y en cultivo viejo pueden dar formas cocoideas); se monta un fresco para
observar la movilidad; son oxidasa y catalasa positivos; para diferenciar entre las
especies se puede montar un API o se realizan varias pruebas => (1) crecimiento a
distintas temperaturas, (2) sensibilidad al acido nalidixico y a la
cefalotina (3) hidrlisis del hipurato (se introduce una tableta dentro de un tubo
inoculado, dar + si cambia a color amarillo).
Campylobacter jejuni => crecimiento a 42C, hipurato+, sensibilidad a Nalidixico y
resistente a Cefalotina
Campylobacter coli => crecimiento a 42C, hipurato-, sensibilidad a Nalidixico y resistente
a Cefalotina
Campylobacter fetus => no crecen a 42C, hipurato-, resistente a Nalidixico y sensible a
Cefalotina
Campylobacter laridis => crecimiento a 42C, hipurato-, resistente a ambos Nalidixico y
Cefalotina

Patogenia y patologia - C.jejuni es la especie con mayor frecuencia se asocia a infeccion
en el hombre (gastroenteritis con eliminacin de sangre en heces), se adquiere por via oral
(comida y bebidas contaminadas) o por contacto con animales infectados; sensible a
pH gstrico (debe ingerirse una concentracin elevada de ellos para que se produzca
infeccion); se multiplica en el intestino delgado, invade el epitelio y produce inflamacin;
en ocasiones puede pasar al torrente circulatorio y desarrollarse un cuadro de
fiebre entrica; la diarrea acompaada de dolor abdominal agudo, dolor de cabeza y
fiebre; la infeccin es autolimitada resolviendose en una semana sin necesidad de ATB; los
casos graves se trata con eritromicina.


Helicobacter Pylori - se aislaron por 1 vez (1982) del estomago de pacientes con
lesiones gstricas y ulcera pptica; son bacilos curvados Gram- con forma de espiral y gran
actividad ureasa; se les denomino Campylobacter pyloridis, posteriormente se rectifico a
Campylobacter pylori y cuando demostraron que difera morfologicamente del genero
Campylobacter, se propuso la creacin de un nuevo genero Helicobacter que se incluyo la
especie de Helicobacter pylori; se trata de una especie de reciente descubrimiento,
implicada en procesos de infeccin gstrica.

Metodos de deteccin de H.pylori
- Metodos directos => las muestras mas idneas para el aislamiento de H.pylori son las
biopsias de las zonas pliegues de la mucosa gstrica del antro, cuerpo y fundos;
se remitirn directamente al laboratorio para proceder a su cultivo inmediato en
medios especficos para H.pylori; una porcin de la biopsia se invertir en la realizacin de
un frotis para la tincin Gram o Giemsa.
- Incubacin => las placas deben incubarse en condiciones reducidas de O2 (5%), de 10%
CO2 y 85% N2. Se consigue mediante sistema de evacuacin-reemplazo o usando jarras de
anaerobios con sobres comerciales que generan dicha atmsfera; la temperatura optima es
de 37C (no se desarrolla a 25C, 30C ni 42C); en aislamiento primario, es conveniente
incubar las placas hasta 7 das; Las colonias son de 1-2 mm de dimetro, translucidas y
poco hemolticas.
- Identificacin => son oxidasa+, catalasa+, ureasa+, hipurato- (algunas cepas son
capaces de virar la urea de Christensen en minutos); es sensible a la cefalotina y resistente
al nalidixico (algunas cepas pueden ser sensibles); no son fermentadora de carbohidrato;
crece a 37C.

Metodos indirectos:
- Prueba de la urea rpida (de Christensen) => un trozo de biopsia se inocula en un medio
con alta concentracin de urea y un indicador de pH.
- Prueba de la urea respiratoria => el paciente ingiere urea marcada y tras un periodo de
tiempo se mide el nivel de CO2 espirado; se puede emplear urea marcada con C13, que se
detecta con un espectrofotmetro de masas y urea marcada con C14 detectada con un
contador de centelleo (un mtodo diagnostico rpido y no invasivo, pero requiere un
equipo especial par al lectura).
- Prueba serologa => para detectar Acs utilizando la tcnica de ELISA.

Patologa - existen pruebas claras de que H.pylori esta implicado en
diversas patologas gstricas, pero se cuestiona como la causa de dichas infeccin; parece
claro que es agente etiolgico de gastritis aguda; se piensa que tambin pueda tener un
papel en la gastritis crnica activa; en las ulceras ppticas se asla 100% de pacientes con
ulcera duodenal y 77% de ulcera gstrica; parece ser que su presencia no es suficiente para
desarrollar la ulcera; no esta claro el papel que desempea en la dispepsia no ulcerosa, en
el reflujo gastro-esofgico y en el carcinoma gstrico; hasta 50% de la poblacin adulta de
>60 aos es portadora de este microorganismo; se desconoce su modo de transmisin; se
ha propuesto una posible adquisicin del mismo por contacto con
animales, regin periodontal y transmisin persona-persona (ninguno estn demostrados)

Sensibilidad antibitica - H.pylori es sensible in vitro a un gran numero de ATB, pero,
el tratamiento in vivo es difcil; nunca se emplea mono-terapia porque no es eficaz, suelen
administrarse varios frmacos juntos y aun as no se consigue erradicar al m.o. por lo que
son frecuentes las recadas tras la supresin de la terapia.


Tema 26 - VIROLOGA CLNICA (caractersticas generales de los virus)

Introduccin - virus es un parsito intracelular estricto que requiere infestar
una clula para sintetizar sus componentes y ensamblar nuevos viriones; son de muy
pequeos tamaos (filtrables) y se caracteriza por su mecanismo
de replicacin, organizacin y composicion; virologa clnica se remonta al siglo XX y la
composicion de un virus fue determinada por Schlesinger en 1933; en los ltimos aos se
han descubierto otros agentes infecciosos mas simples como los viroides y los priones;
- los viroides => moleculas circulares de ARN de bajo Pm sin cubierta proteica que
causan enfermedades a las plantas, infectar a los hombres y animales;
- los priones => son protenas que parecen estar codificadas por genes celulares
y actan como seales reguladoras en las celulas que invaden, resistentes a los
procesos fsico-qumicos que inactivan a los virus y no producen respuesta inmune o
inflamatoria en el husped; provocan prurigo lumbar de las ovejas y cabras
(scrapie), encefalopata espongiforme en las vacas y enfermedades neuro-
degenerativastransmisibles en el hombre (p.ej. Creutzfeldt-
Jacob /encefalopata espongiforme progresiva y sndrome de Gerstman-Straussler-
Streinker y el kuru); la patogenia (de todas) se caracterizan por desordenes progresivos
como ataxia (dificultad motrica), demencia, deterioro cognitivo y motor; tras un periodo
de incubacin largo (meses o aos), aparecer los sintomas clnicos; el tropismo de la
infectividad es SNC, seguido por el bazo y ndulos linfticos; en el cerebro se
detecta acumulacin anormal de protena-prion en el genoma del husped; los priones son
resistentes a las proteasas e induce una degeneracin neuronal.


Concepto de virus - es un bloque de material gentico (ADN o ARN) rodeado de una
cubierta protena (cpside) que le sirve como vehculo para su transmisin; algunos
presenta membrana lipdica (envuelta) que se adquieren de la
membrana citoplasmtica de la clula infectada durante el proceso de salida; los virus
envueltos tienen un matriz proteica que sirve como puente entre la nucleocpside y la
envoltura; carecen de organelas citoplasmticas para crecer y multiplicarse, por lo que
necesitan la maquinaria de una clula husped, pero si poseen algunos enzimas (nucleasas,
transcriptasas, etc.); virines la partcula viral completa (genoma + nucleocpside); se
clasifican por el tipo de husped que parasitan (virus animales, vegetales, bacterifagos)


Estructura y morfologa de los virus - son de tamao entre 20-25 nm hasta 200-300
nm; su observacin requiere un microscopio electrnico.
- Estructura del genoma => ADN o ARN mono-catenario o bicatenario; la mayora de
virus ARN tienen genomas mono-catenaria excepto los reovirus/rotavirus (bicatenario);
los virus ADN suelen ser bicatenario, excepto parvovirus (mono-catenario); los genomas
(core o ncleo) pueden ser moleculas lineales o circulares nicas o segmentadas en varios
fragmentos.
- Estructura de la cpside => su funcin es de proteger el genoma del medio
extracelular y facilitar la entrada al interior de la clula; estn compuestas de subunidades
proteicas repetidas (capsmeros) que a su vez estn compuestas de moleculas proteicas
(protmeros); segn la disposicin que adopten los capsmeros /la cpside, se
clasifican en virus de simetra helicoidal (normalmente son virus ARN), icosaedrica (20
caras triangulares y 12 vrtices) y compleja.
- Estructura de la envoltura => los lpidos de la envoltura es lipoprotica y procede de
la membrana clula infectada, pero las protenas suelen ser virales desplazados a
las protenas celulares originales; en algunos casos, las protenas incluyen una matriz
(protena M) que contacta/ engancha con la nucleocpside; los virus envueltos tienen
estructuras glucoproticas (espculas) importantes para los procesos
de adsorcin y penetracin al interior de la clula.




Ciclo vital de los virus - las estrategias de replicacin varan dependiendo de la
estructura del virus y de su material genmico, pero en general conlleva pasos de
=> adsorcin/ adherirse - penetracin - decapsidacin - replicacin - ensamblaje -
liberacin.
- Adsorcin => la unin de la partcula viral a la superficie de la clula; no
requiere energa y no depende de la temperatura; intervienen moleculas proteicas de la
superficie del virin (protenas de unin) y protenas de la superficie de la membrana de
la clula diana (protenas receptoras); en los virus envueltos, la protena de adherencia
viral son las espculas de la capa externa de la envoltura.
- Penetracin => tras ser adherido, se penetra el virin completo o solo el genoma y las
polimerasas entran en el citoplasma celular, esto se lleva a cabo por 3
mecanismos: penetracin directa, endocitosis o fusin; penetracin directa => la
membrana solo permite la entrada del genoma viral (ocurre en virus sin envuelta p.ej.
fagos); endocitosis=> los viriones adsorbidos, quedan rodeados por la
membrana citoplasmtica de
la clula husped formndose una vescula endosmica (mecanismo mas utilizados de
losvirus sin envuelta); fusin => utilizado por los virus envueltos; existen 2 maneras
de fusin: en los paramyxovirus, su envuelta se fusiona con la
membrana citoplasmtica directamente y la nucleocpside se libera al interior del
citoplasma; en el resto de virus envueltos, la envoltura viral se fusiona con la membrana
celular formndose una vescula endosmica que posteriormente libera la partcula viral
hacia el citoplasma.
- Decapsidacin => se degrada la cpside viral para que el genoma viral pueda liberarse
e iniciar la transcripcin y la traduccin; en la mayora la penetracin y la decapsidacin se
produce a la vez.


- Replicacin => es la fase donde se produce la sntesis de todas las macro-moleculas
virales; la clula husped debe proporcionar la energa y los medios suficientes que a veces
puede afectar su propio metabolismo celular, pero en otros casos apenas se alteran; es
esencial que los ARNm transcriban la informacin viral y la replicacin de
la informacin gentica y que posteriormente mediante los componentes celulares se
traducen para fabricar protenas que se necesitan.

a. Replicacin de virus ADN bicatenario => tras la adsorcin y la penetracin, el
ADN viral es liberado y penetra en el ncleo + ARN polimerasas celulares => ARNm
transcrito y traducido para la sntesis ADN viral; para el proceso de traduccin => ARNm
emigra al citoplasma celular y es traducido para formar las protenas de la cpside => que
posteriormente son transportadas al ncleo para ensamblar el virin completo
que sern liberados por lisis celular; la excepcin dar al virus ADN poxvirus (grande y
de simetra compleja) que realiza el proceso de transcripcin y traduccin en el citoplasma
celular utilizando su propia ARN polimerasa dependiente del ADN viral, ya que no pueden
utilizar ARN de la clula husped que se localiza en el ncleo.

b. Replicacin de virus ADN mono-catenario (fagos, parvovirus) => necesitan
un intermediario replicativo para formar ADN bicatenario que puede transcriben el ARNm
(ARN polimerasa celular necesita como plantilla una ADN bicatenario); como resumen:
ADN mono-catenario + ADN polimerasas de la clula husped => produce ADN
bicatenario + ARN polimerasas celulares => forma ARNm

c. Replicacin de virus ARN mono-catenario de polaridad (+) => ARN
viralpenetrado en el citoplasma de la clula husped es reconocida de inmediato como
ARNm por los ribosomas, los cuales la captan e inician su traduccin a protenas virales
y tambin un enzima RNA polimerasa (transcriptasa); RNA polimerasa producida + ARN
viral (se utiliza como molde) => replicacin del ARN viral (todo ocurre en el citoplasma
independientes del ADN del husped).

d. Replicacin de virus ARN mono-catenario de polaridad (-) => su ARN de
polaridad (-) complementa el ARNm que es de polaridad (+); mediante su propio ARN
polimerasas sintetizara el ARNm que despus le servir de molde para la sntesis de nuevo
ARN de polaridad (-) y tambin para la traduccin de sus protenas utilizando la
maquinaria celular.

e. Un caso especial de Retrovirus => virus ARN mono-catenario de polaridad (+)
queposeen un enzima transcriptasa de reversin (transcriptasa inversa / retro-
transcriptasa); su genoma ARN + retro-transciptasa => produce ADN de polaridad (-) +
(la misma) retrotranscriptasa => origina ADN bicatenario que se integran al ADN celular y
permanece alli durante tiempo prolongado; En un momento dado el ADN integrado se
reactiva y es transcrito a ARNm vrico por la polimerasa del husped y entonces, se
completa el ciclo replicativo.


- Ensamblaje y liberacin => se puede producir tanto en el ncleo como en el
citoplasma, tras la replicacin del genoma viral y la transcripcin de las protenas virales,
los viriones se ensambla y se libera de la clula husped; consiste en la unin ordenada del
acido nucleico y de las protenas para formar la nucleocpside, dando lugar a
un virin viable; la liberacin de los virus sin envuelta (desnudos) se produce por lisis
celular; en caso de virus envueltos, salen al exterior por gemacin de una zona de la
membrana nuclear o citoplasmtica (depende si son virus ADN o ARN); la zona de la
membrana por donde se producir la gemacin, adquiere primero las espculas y
las protena de la matriz (codificadas por el virus), que atrae a
la nucleocpside, fusionndose a la membrana, formndose la envuelta
y liberndose el virin al exterior; en caso de poxvirus(mas grandes y complejos),
estos pueden sintetizar sus propias envueltas; en caso deretrovirus, el virus no se libera de
la clula sino que se integra en su genoma y permanecer as largo tiempo o de por vida; el
proceso de ensamblaje y liberacin es a veces ineficaz, formndose partculas no infectivas.


Taxonoma vrica - los virus se dividen en familias, genero, especie o tipo y segn su
forma del genoma, tamao, forma, estructura, sintomatologa clnica que producen,
tropismo celular, etc; segn el tipo de genoma que contienen y su estructura => se clasifica
en virus ARN y virus ADN.

Virus ARN
1. De simetra cubica o icosaedrica sin envuelta - mono-catenario de polaridad (+)
que utiliza su propio ARN como mensajero (pueden ser inmediatamente traducidos por la
clula husped ya que no se necesita transcribir ARNm) con
la excepcin de Reoviridae(bicatenarios) que utilizan su propia ARN polimerasa para
transcribir ARNm; todos se ensamblan en el citoplasma de la clula husped y
son resistentes al ter.
- Familia Reo-viridae => tamao intermedio (60-80 nm de dimetro),
los nicos bicatenarios; el mas importante para el hombre es el Rotavirus (provoca
problemas diarreicos), tiene forma redonda.


- Familia Calici-viridae => son pequeos (35-39 nm), tienen poca importancia en
microbiologa clnica; el mas importante /patgeno para el hombre es el virus de
Norwalk(productor de gastroenteritis) y el virus de Hepatitis E (su inclusin no es
definitiva)


- Familia Picorna-viridae => son pequeos (20-30 nm); los gneros mas importantes son
losEnterovirus (>70 enterovirus que incluyen el Poliovirus, Echovirus, Cosxackievirus y
el virus de la hepatitis A) y los Rhinovirus (>100 rhinovirus).


2. De simetra cubica o icosaedrica con envuelta - mono-catenario de polaridad
(+), todos se ensamblan en el citoplasma de la clula husped y son sensibles al ter.
- Familia Retro-viridae => son grandes +/- 100nm, de elevado Pm, contienen trazas de
ADN y poseen transcriptasa inversa (retro-transcriptasa) en su dotacin; adquieren su
envoltura en la membrana citoplasmtica de la clula husped; se engloban todos los virus
ARN tumorales; se divide 3 subfamilias: Oncoviridae (causan tumores y
canceres), Spumaviride yLentiviridae (dentro de esta estara VIH).


- Familia Toga-viridae => son de 40-70 nm y adquieren su envoltura en la
membrana citoplasmtica; se incluyen la mayora de los arbovirus (transmitidos
por artrpodos - los arbovirus pertenecen a numerosas familias como Togaviridae,
Flaviviridae, Arenaviridae, Reoviridae); se incluyen tambin los no
arbovirus: Alphaviruscon virus Sindbis su principal tipo, Pestivirus con el virus de la
diarrea mucosa como su principal tipo y Rubivirus con rubeolavirus su principal tipo.


- Familia Flavi-viridae => son de 40-50 nm y adquieren su envoltura en las membranas
intra-citoplasmticas (antes se incluyen dentro de la familia Togaviridae y los han
separado por su menor tamao y por el lugar de su ensamblaje que ocurre en
el retculo endo-plasmtico); incluyen 2 gneros de importancia clnica:
(1) Flavivirus (antes llamados arbovirus del grupo B) que destaca el virus de la fiebre
amarilla y del dengue; (2) virus de la Hepatitis C; actualmente se incluye de manera
no definitiva al virus de la hepatitis G.


3. De simetra helicoidal - todos son envueltos, mono-catenario de polaridad (-) que
utiliza su propia transcriptasa (ARN polimerasa) para transcribir ARNmensajero; se
ensamblan en el citoplasma y son sensibles al ter.
- Familia Rhabdo-viridae => de forma bala o bastn; el dimetro del cilindro +/- 70nm con
longitud de 175nm; adquieren su envuelta en la membrana citoplasmtica; el genero mas
importante es virus de la rabia.


- Familia Paramyxo-viridae => de tamao 150-300nm,
son pleomrficos predominandoformas esfricas rugosas y filamentosas; adquieren su
envuelta en la membrana citoplasmtico; se incluyen 3 gneros: Paramyxovirus (virus
de la parotiditis/paperas, parainfluenza tipos 1,2,3,4A,4B...), los Morbilivirus (virus
del sarampin, entre otros) y losPneumovirus (virus sincitial respiratorio - causan
bronquiolitis en nios pequeos).


- Familia Orthomyxo-viridae => morfolgicamente semejante a la familia
Paramyxoviridaepero mas pequeos 80-120nm, parecidos tambin a la familia
Rhabdoviridae (los 3 proceden de un ancestro comn); adquieren su envoltura en la
membrana citoplasmtica; se incluyen2 gneros: los virus de la influenza o de la gripe tipos
A, B y C.


- Familia Arena-viridae => de tamao 50-300nm, adquieren su envoltura de la
membrana citoplasmtica; algunos producen infecciones virales "lentas"; el mas
importante es virus de la fiebre de Lassa (en Africa).


- Familia Bunya-viridae => de tamao 80-100nm, de forma esfrica, adquieren su
envoltura en el aparato de Golgi; la mayora de los gneros son arbovirus.


- Familia Corona-viridae => de tamao 80-130nm, morfolgicamente se parecen a
Orthomyxovirus, pero sus proyecciones en la superficie a modo de ptalos o "corona solar";
adquieren su envoltura en las membranas intra-citoplasmticas; la mayora de
los gneros son virus respiratorios de vas altas.




Virus ADN
a. De simetra cubica o icosaedrica sin envuelta - su genoma es ADN bicatenario
con excepcin de Parvo-viridae (mono-catenario); todos se ensamblan en el ncleo y
sonresistentes al ter
- Familia Adeno-viridae => de tamao mediano 70-90nm; se conocen 34 tipos que afectan
al hombre y mucho de ellos afectan el tracto respiratorio.


- Familia Parvo-viridae => de tamao muy pequeo 18-26nm con genoma ADN mono-
catenario; la mayora no tienen importancia clnica, excepto parvovirus B19, pertenece
al genero Parvovirus que causa eritema infeccioso.


- Familia Papova-viridae => son de tamao pequeos 45-55nm con ADN de tira circular; el
genero mas importante es el Papilomavirus o virus de las verrugas con 66 tipos
depapilomavirus humanos (PVH); los Papovavirus en general producen enfermedades
latentes y crnicas y algunos son oncognicos.


b. De simetra cubica o icosaedrica con envuelta - son bicatenarios y todos se
ensamblan en el ncleo con excepcin de Irido-viridae que se ensamblan en el citoplasma.
- Familia Herpes-viridae => de tamao medio +/-100nm, adquieren su envoltura en la
membrana nuclear y son sensibles al eter; de los 80 virus que existen, solo 8
tienen inters clnico para el hombre y se divide en 3 subfamilias:
(1) Alphaherpesviridaecon gneros importantes el virus Herpes simples tipo 1 y 2 y el
virus Varicella-zoster; (2)Betaherpesviridae con gneros Citomegalovirus al
citomegalovirus humano (Herpesvirus humano tipo 5) y al Herpesvirus humano tipo6, y al
genero Roseolovirus con elherpesvirus humano tipo 7; (3) Gammaherpesvirus que
incluyen virus de Epstein-Barr(herpesvirus humano tipo 4) que provoca enfermedad de
Beso, pertenece al generoLimphocriptovirus.


- Familia Hepadna-viridae => de tamao 40-50nm, adquieren su envoltura en el
citoplasma, son resistentes al ter y poseen un genoma ADN parcialmente bicatenario; el
mas importante es el virus de la hepatitis B.


- Familia Irido-viridae => de tamao grande 130-300nm, sensibles al ter, adquieren su
envoltura en la membrana citoplasmtica y tambin se ensamblan en el citoplasma (a
diferencia de otros); no tienen importancia clnica para el hombre, pero si en
veterinariacomo el virus de la fiebre porcina africana.


c. De simetra compleja
- Familia Pox-viridae => son virus animales mas grandes 230x400nm de forma ladrillo o
ovoide; se caracteriza como la nica familia de virus ADN que se replica y ensambla en el
citoplasma, pues contienen una RNA polimerasa ADN dependiente (no necesita la
maquina nuclear), de hecho su replicacin es posible en celulas a-nucleadas (sin ncleo);
sonresistentes al ter y poseen una doble envuelta (una la adquieren en el aparato Golgi y
la otra en la membrana citoplasmtica; los mas importante son virus de la viruela, virus de
la vacuna o vaccinia y virus del molluscum contagiosum.




Principales familias de virus de inters clnico
1. Virus ARN (mono-catenario)
1.1. Familia Reo-viridae (tamao mediano 60-80nm - icosaedrico - sin envuelta - se
ensamblan en el citoplasma) - contiene 6 gneros, nicamente cabe destacar Rotavirus)
Rotavirus (forma de rueda - el nico bicatenario) => descubiertos en 1973 en nios con
gastroenteritis; el nico con importancia clnica (agente causal
degastroenteritis espordica y epidmica en lactantes y nios; la infeccin suele
ser asintomtica en neonatos; afecta principalmente a nios entre 6-24 meses; la
prevalencia mxima en invierno y raramente en verano; periodo de incubacin 1-3 das,
precediendo los vmitos a la diarrea que suele mantenerse de 4-5 das; el virus se detecta
en heces (dura bastante horas fuera del husped)

1.2. Familia Calici-viridae (pequeos 35-40 nm - icosaedrica - sin envuelta - de
polaridad+) - se ensamblan en el citoplasma) => tiene poca importancia
en clnica, posibles agentes causales de gastroenteritis en cualquier da del ao y a
cualquier edad; es el agente Norwalk (virus que causan gastroenteritis en EEUU) que
ahora esta dentro de Parvovirus - Parvoviridae; se incluye de forma no definitiva el virus
de Hepatitis E.

1.3. Familia Picorna-viridae (virus muy pequeos 20-30nm - icosaedrica - sin envuelta
- de polaridad+) - es una familia importante y una de las que mayor numero de virus
presenta, destacando 2 gneros Enterovirus y Rhinovirus.

Enterovirus - se asocian con distintos sndromes clnicos como parlisis,
meningitis asptica, encefalitis, miocarditis, pericarditis, pleurodinia, herpangina,
infecciones agudas del tracto respiratorio y fiebre aftosa; son habitantes transitorios del
tracto digestivo humano; existen >70 sero-tipos, siendo el tipo 72 es el virus de la Hepatitis
A; todos se diseminan por va fecal-oral y la mayora son asintomticas; los mas
importantes sonPoliovirus, Echovirus y Coxsackievirus;
- Los virus de poliomielitis /Poliovirus son tres (tipos 1,2 y 3), mas temidos normalmente
por la parlisis flcida (de cintura para-bajo) y deformidades aunque
son complicacin infrecuente; la vacuna es de Sabin (virus atenuados), tambin Salk (virus
inactivados); la vacuna de poliomielitis se administra a los nios de 2-4-6-18 meses.


- Los virus Echo y Coxsackie tienen distintas manifestaciones (muy ubicuo/ de todo tipo).
Para el diagnostico debe recurrirse al cultivo; el aislamiento de un enterovirus de heces o
de faringe no indica necesariamente una relacion causal con el cuadro clnico, y deben
descartarse otras causas; por el contrario si se trata de LCR.

Rhinovirus - agentes etiolgicos mas frecuentes del resfriado comn (rinitis agudas);
existen >100 tipos

1.4. Familia Toga-viridae y Familia Flavi-viridae (toga=envuelta - icosaedrica - de
polaridad+ - se ensamblan en el citoplasma); ambos son de forma icosaedrico, virus de
RNA mono-catenario con envuelta; se incluyen la mayora de los arbovirus;
losv.Togaviridae (pequeo 40-70 nm, adquiere su envuelto en la
membrana citoplasmtica de la clula mientras los v.Flaviviridae (40-50 nm, lo adquieren
de retculo endo-plasmtico; dentro de Togaviridae estn los arbovirus y los gneros no
arbovirus como Alphavirus(sindbis), Pestivirus y Rubivirus (rubeola) dentro de
Flaviviridae esta el virus Hepatitis C y otros que producen enfermedades como fiebre
amarilla, dengue, de genero flavivirus que pertenecen a los arbovirus tipo B (transmitidos
por artrpodos).

Virus de la Rubeola del genero Rubivirus (no es un arbovirus) - descrito hace >200
aos; consta la importancia como agente causal de malformaciones congnitas desde la
epidemia de 1940 en Australia (un oftalmlogo australiano constato un elevado numero
decataratas congnitas y ceguera asociados a esta enfermedad); la infeccin suele
ser benigna y auto-limitada; sintomas => procesos respiratorios superiores
leves, erupcin eritematosa y linfadenopata sub-occipital y retro-auriculares; en adultos se
puede complicar con artritis transitoria o artralgias; rara vez produce encefalitis o
purpura trombocitopnica; muy importante la infeccin en gestantes por
posibles aparicin de sordera neuro-sensitiva, alteraciones cardacas, cataratas, retraso del
crecimiento y sintomas encefalticos; la incubacin dura 14-
21 das; diagnosticopor mtodo serolgico (tcnica de ELISA) para detectar IgG y sobre
todo IgM en las embarazadas y un resultado positivo indica inmunizacin frente al virus;
actualmente es poco frecuente debido a la vacuna obligatoria que se incluye en
latriple vrica (paperas, sarampin y rubeola) que se pone a los nios de15 meses (suele
dar inmunidad permanente) y una dosis de recuerdo a los 6 aos (solo las nias); a los 11
aos solo se dan vacuna de varicela.
Clnica de Rubeola => empieza con eritema en la cara y se extiende hacia abajo (es un
eritema maculo papuloso); es menos llamativo que de la sarampin; dura +/- 3 das y
puede haber enantema palatino.


1.5. Familia Retro-viridae (de tamao grande +/- 100nm - icosaedrica - con envuelta -
de polaridad+ - se ensamblan en el citoplasma) => poseen enzima transcriptasa inversa /
retro-transcriptasa; a esta familia pertenece el virus de la inmuno-deficiencia humana
VIHque se estudia aparte.

1.6. Familia Orthomyxo-viridae (de tamao 80-120nm - helicoidal - envuelta - de
polaridad (-) y se ensamblan en el citoplasma) - en1918 tras la Guerra Mundial, mato mas
personas que la propia guerra; esta compuesta por los distintos tipos de virus influenza/
Gripe (tipo A, B y C).

Virus Influenza /la gripe espaola (empez en Espaa) - causan
gripe, infeccin respiratoria aguda epidmica normalmente durante mes de noviembre-
abril; la va de transmisin es area, periodo de incubacin 1-4 das, seguido
de clnicas tipo respiratorias superior, mas grave en los ancianos; se realizan campaas
de vacunacin todos los aos (sobre todo a los ancianos y pacientes bronco-pulmonares),
ya que presentan gran variabilidad antignica segun el serotipo que causa la epidemia
(tiene gran poder mutagnico); existe 3 tipos => A, B y C (A y B causan epidemias de
importancia); los influenza A se subdividen segn la diferente composicion antignica (en
la envoltura) de la hemaglutinina y la neuraminidasa; el diagnostico es clnico;
recientemente se introduce metodos de diagnostico de
muestras clnicas de antgenos virales; el de mayor importancia clnica es virus respiratorio
sincitial (VRS); para el diagnostico rpido se usa la inmuno-fluerescencia directa en
aspirados naso-faringeos, esputos o biopsia de pulmn;existe un kit con Ags virales para
detectarlos.

1.7. Familia Paramyxo-viridae (de tamao grande 150-300nm - helicoidal - envuelta -
de polaridad (-) y se ensamblan en el citoplasma) => morfolgicamente parecida al de
anterior/ Orthomyxoviridae; todos ellos son causas importantes de enfermedad
respiratoria en los nios; se incluyen 3 gneros Paramyxovirus (virus de la
parotiditis/paperas y parainfluenza), Morbilivirus (virus
del sarampin), Pneumovirus (virus sincitial respiratorio)

Virus Parainfluenzae (VPI) del genero Paramyxovirus - los 5 tipos de VPI producen
infecciones del tracto respiratorio, siendo el 1 y el 2 los principales causantes de laringo-
traqueobronquitis, el 3 de bronquiolitis y neumnia en nios (segundo agente despus del
VRS), el 4 y el 5 causan infecciones mas suaves; el diagnostico es clnico.

Virus respiratorio sincitial (VRS) del genero Pneumovirus - es la causa mas
importante de neumnia y bronquiolitis en nios y recin nacidos; produce un amplio
espectro de infecciones, siendo la mas frecuente es el resfriado comn con abundante
rinorrea; VRS esmuy contagioso y se manifiesta en forma de brotes invernales; la
inmunidad no es completapor lo que se dan las re-infecciones (mas suaves); Es importante
que la excrecin de virus se mantenga durante 2 o 3 semanas (mas tiempo para los
inmunodeprimidos), por lo que al ingresar un nio en el hospital durante 1 o 2 semanas,
puede ser contagioso todava (es el agente mas frecuente de infeccin nosocomial
en pediatra); las infecciones graves se trata con la ribavirina (inhibe
la sntesis del ARN viral); el diagnostico rpido es la inmunofluorescencia en secreciones
respiratorias.

Virus del Sarampin - causa una enfermedad aguda, febril, exantemtica, de gravedad
variable que afecta a nios de 5-9 aos, se contagia por va respiratoria y
conjuntival;sintomas clnico => los primeros das como un catarro naso-oculo-faringo-
laringeo, luego aparece fiebre, cara rubicunda, congestin de mucosa y a los 3-
4 das aparece "manchas Koplik" (manchas blanquecinas diminutas delante del 1 y 2
molar) dura un par de das; empieza aparecer exantema, primero retro-auricularmente,
despues se extiende a todo el cuerpo, las palmas y las plantas de los pies mas tenue en
zonas distales, sube a la fiebre y el exantema tenue se hace muy eritematoso; tras 2-
3 das mejora bruscamente y desapareciendo los signos en el orden del aparecimiento
(dar inmunidad permanente); el diagnostico es por metodos serolgicos.


Virus de la parotiditis - es una enfermedad endmica con incidencia todo el ao; es
rara en nios < 1 ao, gracias a la inmunidad de la madre; afecta a nios de 5-14 aos, se
transmite por va area y por objetos introducidos a la boca (dar inmunidad
permanente); clnica => tras 24horas de clnica inespecifica, aparecern dolor
y tumefaccin de retro-parotidia y odo, aumento de fiebre, puede haber afectacin de
nervio facial leve y bilateral; complicacin => meningitis, orquitis, pancreatitis o artritis;
diagnostico es por va serolgico; el diagnostico es por metodos serolgicos.


1.8. Familia Rhabdo-viridae (de tamao grande en forma de bastn, dimetro 70nm y
longitud 175nm - helicoidal - con envuelta - de polaridad (-) y se ensamblan en el
citoplasma) => caracterstica tpica de su morfologa es forma de "bala"; el mas importante
es el causante de la rabia o hidrofobia (se atraganta con el agua).

Virus de la rabia - causa enfermedad infecciosa aguda del SNC, de gran
importancia histrica por los trabajos de Pasteur; existe la obligacin de vacunar todos los
aos a perros y gatos, ya que es una zoonosis en la que el hombre es un eslabn irrelevante;
existen 2 formas epidemiolgicas => urbana (lo adquieren perros y gatos no
inmunizados) y salvtica (los zorros); normalmente el virus esta presente en la saliva de
animales rabiosos, transmitindose por mordeduras (son fuentes de infeccin humana); el
diagnostico sola realizarse postmortem, mediante la observacin de los cuerpos de Negri
(cerebro); tambin se pueden cultivar en laboratorio; clnica de animales => cambian
de carcter, se vuelven caprichosos, pierden apetito, ingerir objetos no engullibles autllan
con ronca, irritabilidad creciente y muerden a personas y animales; mueren en 2
semanas; clnica de humanos => la incubacin 1-3 meses depende del lugar de la
mordedura; el virus se propaga por los nervios a una velocidad 1mm/hora; comienza con
la alteracin del sueo, dolor de la mordedura, tambin parestesias/ hormigueos de la
zona, trastornos respiratorios (en la voz), posteriormente aparece espasmos farngeos tras
la ingestin de lquidos o solo de verlo (hidrofobia), salivacin espumosa y espasmos en las
extremidades (basta con pequeos estmulos de luz o ruidos, para provocar lo); las
personas suelen morir por parlisis en pocas horas tras la afectacin de bulbo-raqudeo; el
cuadro normal es de 3-6 das, despus mueren.


1.9. Familia Corona-viridae (de tamao 80-130nm - helicoidal - envuelta - de
polaridad (-) y se ensamblan en el citoplasma) => adquieren su envoltura (con
proyecciones a modo de ptalos/ corona solar) en las membranas intra-
citoplasmticas; escasa importanciaen patologa, nicamente causan el resfriado comn y
pueden estar involucrados en cuadros de gastroenteritis.

2. VIRUS ADN (bicatenario)
2.1. Familia Parvo-ridae (de tamao muy pequeo 18-26nm - icosaedrico - sin envuelta
- se ensamblan en el ncleo - resistentes al eter) => son de tamao muy pequeo y
sonlos nicos que presentan ADN de una sola hebra (mono-catenario); algunos tienen
importancia en veterinaria y solo destaca uno como patgeno humano (Parvovirus B19).

Parvovirus B19 (estaban incluidos en virus Norwalk) - fue vinculado al eritema
infecciosoen 1983; es benigna y afecta nios en edad escolar; presentan
una erupcin eritematosa en las mejillas (cara enbofetada) y un exantema en extremidades
y tronco (respeta a las palmas, las plantas y los labios); los adultos son propensos a
artropata asociada, que se resuelve en 2-4 semanas; diagnostico por mtodo serolgico y
metodos de ELISA.


2.2. Familia Papova-viridae (de tamao pequeo 45-55nm - ADN de tira circular -
icosaedrico - sin envuelta - se ensamblan en el ncleo - resistente al ter) => son
unos viruses oncognicos (efecto cancergeno), producen enfermedades latentes
y crnicas, causantes verrugas genitales o condilomas (se asocian a carcinoma de crvix)
y papilomas(Papilomavirus/ virus Papiloma humano); el diagnostico es de
tipo clnico y serolgico; prevencin => se vacunan a las nias de < 14 aos.

2.3. Familia Adeno-viridae (de tamao mediano 70-90nm - icosaedrico - sin envuelta -
se ensamblan en el ncleo - resistente al ter) => producen principalmente patologa al
tracto respiratorio, ocular y gastroenteritis; las infecciones respiratorias solo son
significativas en nios <6 aos; el diagnostico se realiza
mediante clnicas y tcnicas serologcas.

2.4. Familia Hepadna-viridae (de tamao pequeo 40-50nm - ADN parcialmente
bicatenario - icosaedrico - envueltos - se ensamblan en el ncleo - resistentes al ter) => su
envuelta se adquiere en la membrana citoplasmtica y se ensamblan en el ncleo; en esta
familia se encuentra virus hepatitis B que se estudiara a parte.

2.5. Familia Herpes-viridae (de tamao medio +/-100nm - icosaedrico - envueltos - se
ensamblan en el ncleo - sensibles al ter) => adquiere su envuelta de la membrana
nuclear y se ensamblan en el ncleo; destaca 3 subfamilias => Alphaherpesviridae (VHS
1y2, virus Varicella-Zooster), Betaherpesviridae (CMV y Roseolovirus), Gammaherpesvirus
(VEB/Limphocriptovirus); todos los virus producen infecciones latentes, capaces de
reactivarse.

Virus Herpes Simple (VHS) - producen infecciones latentes que se reactivan con o sin
lesiones que sirven de fuente de infeccin para individuos susceptibles (los virus de Herpes
no se cura, solo se acantona y se puede reactivar); existen 2 tipos => VHS-1 (tropismo
por lesiones por encima de la cintura y suele ser leve) y VHS-2 (se encuentra
principalmente en los genitales, transmitindose por va venrea); cada individuo tiene un
tropismo estable;suele ser bucal, comienza con hormigueo y luego aparecen vesculas,
costra y desaparece en +/- 1 semana; VHS-1 se transmite por secrecin oral, infeccin a
nivel peri-oral, tambin otras zonas como los ojos; VHS-2 normalmente
daran infeccin genital y se contrae por va sexual; en EEUU en ciertas capas sociales, es la
enfermedad venrea mas frecuente; en mujer gestante se puede transmitir al
bebe va placenta o canal de parto o en los primeros das de vida; en general estos virus
tienen capacidad oncognicos como VEB (virus Epstein-Barr), puede
producir cncer cervical; el diagnostico se realiza mediante la tincin de Giemsa de celulas
raspadas de lesiones herpticas, para observar las caractersticas de las celulas gigantes
multi-nucleadas; tambin se cultivan en SHELL-VIAL.


Citomegalovirus (CMV) - producen infeccin asintomtica, pero con gran importancia
en huspedes inmuno-comprometidos; las infecciones se pueden clasificar
en congnitas, peri-natales o pos-natales (antes o despus del parto); es la causa mas
frecuente de infeccin congnita; el CMV se ha detectado en saliva, orina, leche materna,
semen, por lo que su transmisin es variada; tambin se transmite por transfusiones
o trasplantes; en pacientes inmuno-competentes, normalmente son asintomtica, si
da clnica va a ser semejante a mononucleosis infecciosa (virus Epstein-Barr),
comofiebre, adenopatias, hepatomegalia; en paciente inmunodeprimidos es diferente, en
general dar fiebre, neumonitis, colitis, esofagitis, hepatitis, infeccin congnita y
perinatal, puede dar retraso mental, ictericia y sordera; el diagnostico =>
por serologa buscando Acs anti CMV (metodos ELISA), cultivo en SHELL-
VIAL (artificial) ya que no se pueden cultivar en celulas vivas.

Virus Varicela-Zster (VVZ) - la varicela y el herpes zster representan diferentes
manifestaciones clnicas de un mismo virus; la varicela es mas frecuente en nios y se
caracteriza por fiebre y exantema vesicular generalizado; es una infeccin primaria
mientras su re-activacin producir el herpes zster, aparece normalmente en
adultos (cuando hay una disminucin de la inmunidad) que consiste en
una erupcin dolorosa circunscrita de lesiones vesiculares, acompaada de inflamacin de
las races dorsales de los nervios raqudeos o de los ganglios sensitivos craneales; los
estadios son => macula - ppula - vescula - umbilicacin -
costra; caractersticamente existe estados evolutivos todos mezclado a la vez y prurito
sobre todo en el tronco y cara (menos en las extremidades); el diagnostico sera
tipo clnico y tambin por los distintos metodos en laboratorio => examen directo
previa tincin Giemsa por microscopio electrnica, por serologa (ELISA) y por cultivo
celular.


Virus de Epstein-Barr (VEB) - es uno de los virus humanos
mas ubicuos, linfotrpico y oncognico; la infeccin primaria suele pasar en la infancia,
aumentando su sero-prevalencia 60-70% en jvenes y 80-90% en
adultos; el sndrome clnico mas frecuente es lamononucleosis infecciosa (enfermedad
de beso) que presenta fiebre, adenopatias, faringitis y linfocitosis con
linfocitos atpicos; VEB tambin se ha asociado a carcinoma naso-farngeo y al linfoma de
Burkitt; diagnostico => la prueba de Paul Bunnell es la deteccin de Acs heterofilos
y tambin por mtodo de ELISA.


Herpesvirus Humano 6 (HHV-6) - es un virus de muy reciente aparicin, se ha
aislado en sndromes linfo-proliferativos y se ha vinculado
al exantema sbito (elevacin brusca de la temperatura hasta 40C de 2-4 das, seguida de
un descenso rpido que coincide con la aparicin de un exantema maculo-papular que
persiste 1-2 das; el diagnostico sera clnico y serolgico.

Herpesvirus Humano 7 - se descubri en 1989 (reciente); tiene tropismo por los
linfocitos T, provocando exantema sbito; se investiga si tiene relacion con sndrome de
fatiga crnica (que lo padecen sobre todo mujeres mayores).

2.6. Familia Pox-viridae (ADN bicatenario - doble membrana) - son de tamao grande
230-400nm, con forma de ladrillo, se replica en citoplasma y se ensamblan en el
citoplasma;el mas importante es el virus de la viruela, virus de Moluscum Contagiosum y
virus de la Vaccinia;
- Viruela se contagia por inhalacin y tras 15 das aparece fiebre, mialgias
y erupcin ppula vesicular dura y luego evoluciona a pstulas y a la curacin; a veces
puede provocar muerte por exantema hemorragica o una sobre infeccin bacteriana.


- Virus de la Vaccinia es muy prximo al virus de la viruela; en individuos
inmunodeprimidos puede provocar complicaciones, pero en los inmuno-competentes
es auto-limitado; es importante en los principios de
la vacunacin (Jennen); ltimamente se investiga su utilizacin como vector para actuar
como vacuna contra virus de Hepatitis B, Herpes simple y VIH, ya que su genoma es
susceptible de poder insertarle secuencias de genes que codifiquen protenas de otros virus
y que se expresaran posteriormente cuando el virus se replique, con lo
cual tendramos Acs contra estos virus.


- Virus de Moluscum Contagiosum - provoca enfermedad cutnea benigna,
contagiosa que pueda adquirir por compartir objetos o contacto sexual; aparece en
epidermis lesiones nodulares blancas de aspecto nacarado de 2-10 mm que son indoloras;
cualquier traumatismo provoca su contagio; desaparece entre 2 meses y 1 ao.


Esquema de Virus Respiratorio



HEPATITIS VIRAL - es una enfermedad sistmica que afecta fundamentalmente el
Hgado; se conocen 7 virus de la hepatitis, denominados A,B,C,D,E,F y G que pertenecen
cada uno a familias y gneros distintos, pero que tienen todos un tropismo heptico (no
tienen relacin taxonmica); existen adems otros virus que producen hepatitis,
comoCitomegalo virus y el virus de Epstein-Barr; se pueden clasificar segn la
principal va de transmisin y la tendencia a la cronicidad en 2 grandes
grupos(1) transmisin fecal-oral y no cronifican: VHA, VHE y
VHF (2) transmisin parenteral y pueden cronificar: VHB, VHC, VHD y VHG.

Virus de la Hepatitis A (VHA) - aislado en 1973, pero se sospech mucho antes; virus
ARN de la familia Picornaviridae (de pequeo tamao 20-30nm, icosadrica, sin envuelta,
polaridad+) dentro del gnero Enterovirus, el tipo 72; la mayora de infecciones son aguda
sin cronificarse (<1% fulminante); se encuentra en las heces durante el periodo de
incubacin(hasta 2 semanas).

Transmisin - se disemina por la ruta fecal-oral (estrecho contacto persona-persona)
con la implicacin de agua y alimentos que pueden causar brotes epidmicos; la mayor
excrecin del virus en heces se da en las semanas previas a la aparicin de la ictericia,
sobre todo en la fase tarda de la incubacin; otras vas de transmisin del virus son
posibles pero poco probables; existe casos durante todo el ao, con un pico en otoo.

Sintomatologa clnica suele ser menos grave que la hepatitis B; en general, la
infeccin es asintomtica y la gravedad aumenta con la edad; el periodo de incubacin 20-
45 das, a continuacin suele aparecer fiebre, mialgias, fatiga, ictericia, anorexia, dolor de
cabeza o dolor en epigastrio y aumento de las transaminasas (GPT, GOT) y hepatomegalia.

Diagnostico requiere la confirmacin del laboratorio; se observ el virus por la
primera vez por Feinstone en 1973 y es cultivable, pero se utiliza la serologa basada en la
respuesta inmunitaria; el mtodo ms utilizado es ELISA detectando Acs IgMVHA en su
fase aguda; tambin se pueden detectar Ags virales en heces (detectar Acs total de IgG y
IgM no tiene utilidad clnicamente); IgM suele durar 6 meses; IgG confiere inmunidad y la
mayor parte de nuestra poblacin de >40 aos los tienen; hasta la fecha no se han descrito
casos de cronicidad.

Prevencin las medidas ms importantes son la higiene personal, lavado y
desinfeccin de manos y objetos contaminados; no es necesario el estricto aislamiento del
paciente mientras se mantiene las medidas de desinfeccin-esterilizacin, cloracin y nivel
higinico-sanitarias; inmunizacin pasiva => se dispone una inmunoglobulina eficaz tanto
paraprofilaxis pre-exposicin (se estudia la relacin coste-eficacia antes de utilizarla/ solo
si viajan a zonas endmicas) como post-exposicin; inmunizacin activa => existe
una vacuna con buenos resultados (virus inactivados) que se pone al mes, 6 meses y al
ao (3x).


Virus de la Hepatitis B (VHB) es un virus ADN de la familia Hepadnaviridae (ADN
parcialmente bicatenario, icosadrica con envuelta, resistentes al ter), de gran
importancia socio-sanitaria y distribucin mundial (250 millones portadores
asintomtico 1% desarrollan cirrosis heptica o carcinoma hepato-celular que son
complicaciones ms importantes); primeros casos se describieron en 1833 en Bremen
(Alemania), por la administracin de la vacuna de la viruela que contiene suero humano,
pero hasta los aos 40-50 no se distingui de la hepatitis A; en 1965 Blumberg descubri el
Ag Australia y se identific el virus.

Estructura se distinguen una serie de estructura del virus que dan lugar a
los marcadores serolgicos:
-Ag de superficie => HBsAg o Ag Australia (marcador de infecciosidad, codificado por el
gen S) que induce a la formacin de HBsAc o anti-HBs que confiere inmunidad.
-Ag del core o nucleo-cpside => HBcAg codificado por el gen C que no se detecta en
sangre pero si su HBcAc (marcador epidemiolgico que se mantiene de por vida); IgM-
HBcAc se detecta como marcador ms fiable de hepatitis B aguda.
-Ag soluble => HBeAg que induce al HBeAc (HBeAg es el marcador de pronstico de la
enfermedad, ya que se correlacionan con el nivel de replicacin del virus; HBeAc es
unmarcador de buena evolucin).
-Adems se distinguen su genoma ADN y una polimerasa.
- El virin completo se denomina partcula de Dane, ya que existen formas incompletas en
sangre (como p.ej. HBsAg).

Infeccin por VHB la mayora son sub-clnicas/ asintomtica (50-80%) y solo se
detectan en controles serolgicos; la mayora de las infecciones sintomticas son auto
limitadas y se resuelven en menos de 6 meses (Hep.aguda); la lesin heptica puede ser
nula o leve o llegar a casos de hepatitis fulminante (> de 6 meses se pueden cronificar);
lasintomatologa clnica es similar a la de Hepatitis A; un periodo de incubacin es de 1-6
meses; entre 5-10% de las infecciones se hacen persistentes y se mantiene de por vida
(como portador asintomtico o sintomtico); en la mayora de ocasiones la funcin
heptica y la histologa son normales, pero en otras ocasiones dan lugar a sndromes
hepatitis crnica persistentes (HCP) y hepatitis crnica activa (HCA); HCP es menos
progresiva que HCA (puede ser ms grave y desembocar en cirrosis).


Epidemiologia existen reas hiper-endmicas, endemia media y baja (Espaa est en
baja); el nico reservorio importante es el hombre que transmite el virus por contacto
ntimo (va sexual, parenteral y vertical-perinatal) y mediante objetos personales o
materiales de hospitales (familiares y personal sanitario corre un mayor riesgo); la
existencia de HCP presenta un reservorio estable para el virus y asegura su supervivencia
indefinida que se detecta en lquidos corporales (sangre, heces, orina, bilis, lagrimas,
semen, leche materna, sudor, secreciones vaginales, LCR, liquido sinovial y sangre de
cordn);

Marcadores en la infeccin aguda auto-limitada (en el orden de aparicin):
-HBsAg (aparece antes del 1 mes y desaparece antes de 6 mes)
-HBeAg (aparece el 1 mes y desaparece antes del 3 mes)
-DNA viral (aparece despus del 1 mes y desaparece al 3 mes)
-Anti HBc (aparece entre 1-2 mes; Anti-HBc IgM desaparece antes del 5 mes =>
Hepatitis aguda)
-Anti HBe (aparece al 3 mes)
-Anti HBs (aparece antes del 7 mes)

Prevencin es la medida ms eficaz para combatir la infeccin; es un virus muy
contagioso cuando hay exposicin parenteral; existe inmunizacin
pasiva (gammaglobulina hiper-inmune eficaz en situaciones de pre y post-exposicin )
y inmunizacin activa (vacuna de HBsAg que se administra universalmente a 0-1-6 meses
que produce respuesta inmunitaria de 90-95%).


Virus de la Hepatitis D (VHD) descubierto en 1977; es un virus ARN
incompleto /defectivo que requiere HBsAg para su replicacin (adquieren su envuelta del
virus B y si no hay infeccin de por VHB no la hay por VHD).

Tipos de infeccin:
1-Coinfeccin => infeccin simultneamente por ambos virus (VHB y VHD); el curso
natural de VHB no se modifica; al resolverse la infeccin de VHB, re resuelve tambin la de
VHD; clnicamente la hepatitis es ms grave y la tasa de hepatitis fulminantes es mayor
(hasta 20%).
2-Sobreinfeccin => cuando el VHD sobre infecta a portadores crnicos de VHB; aqu si se
modifica el curso natural de VHB y la mayora de las sobreinfecciones (70%) desembocan
en hepatitis crnica y acaban en cirrosis entre 15-20 aos.
El pronstico de VHD depende de marcadores de replicacin del virus (anti-HBe) =>
puede acabar en hepatitis crnica o cirrosis; cuando no hay marcadores de replicacin =>
puede evolucionar a la curacin.


Virus de la Hepatitis C (VHC) es de reciente descubierto (1988 - aunque se sospech
desde hace mucho tiempo) del que quedan an muchos interrogantes por resolver; en
actualidad se sabe que VHC es responsable del 80-90% de los casos de hepatitis post-
transfusional y del 20-50% de los hepatitis espordica; es un virus del tamao medio
dentro de la familia Flaviviridae (virus ARN icosadrica pequeo de tamao 40-50nm con
envuelta, de polaridad+ y sensibles al ter); se distingue regiones para la envoltura (E), el
core (C) y otras no estructurales (NS).

Infeccin por VHC se diseminan fundamentalmente por la va parenteral; es la causa
ms frecuente de hepatitis post-transfusional, hepatitis espordica y ampliamente
distribuido entre ADVP (adicto a la droga de va parenteral), pacientes en dilisis y
hemoflicos; se puede transmitir por contacto sexual o convivencia con portadores (menor
importancia que Hep.B);la clnica es similar a la de la hepatitis B; 25% cursan
con ictericia y la tasa de mortalidad es <1%; el curso es indolente y prolongado; el inicio no
es muy brusco, es frecuente las recurrencias, 50-70% tienden a cronificar y 20-25% acaban
desarrollando cirrosis.

Prevencin tratar todo tipo liquido corporal como potencialmente infeccioso; todava
no se dispone inmuno-profilaxis; un paciente con VHC negativa no significa que no lo
padece, porque la sensibilidad de las tcnicas ms utilizadas no es 100% fiable; si se sufre
un accidente en el laboratorio o en la prctica clnica con sangre anti-VHC+, se debe
realizar un protocolo de seguimiento serolgico de la persona; existen evidencias de que
VHC puede estar implicada en cncer heptico.


Virus de la Hepatitis E (VHE) se descubri en 1983 y es responsable de la epidemias
por transmisin fecal-oral en India, Paquistn, frica del Norte y Mjico (pases de baja
salubridad); el curso es corto y parece ser que se puede transmitir parenteralmente, pero
no transfusional-mente; el virus todava no est catalogado, se parece ms a los calcivirus
da lafamilia Calciviridae (virus ARN icosadrica de tamao pequeo 35-40nm sin
envuelta, de polaridad+); clnica => aunque no se cronifica al igual que VHA, tiene un
pronstico peor (la mortalidad 1-2%), ms grave en gestantes del 3 trimestre del
embarazo (mortalidad de 20%); la habitual va de transmisin es a travs del agua de
bebida.


Virus de la Hepatitis G (VHG) se transmite por va parenteral; esta relacionado con
virus de la familia Flaviviridae (virus ARN icosadrica de tamao pequeo 40-50nm, con
envuelta de polaridad+); provoca aisladamente un cuadro benigno, pero puede dar una
coinfeccin con el VHB y VHC con mayor tendencia a la cronicidad.

Virus de la Hepatitis F (VHF) se transmite por va entrica (fecal-oral)

SEROLOGIA DE LAS HEPATITIS VIRICAS (1993)

Marcadores serolgicos para el diagnstico de la hepatitis A la mayora de
infecciones son aguda sin cronificarse (<1% se fulmina); se encuentra en las heces durante
el periodo de incubacin (hasta 2 semanas); su deteccin con fines diagnsticos no se
emplea rutinariamente.
-Ac Anti-VHA IgM => siempre es positivo en el inicio de la sintomatologa clnica (hasta 3-
6 meses); se usa como marcador de infeccin aguda; en Ag viral es detectado solamente en
el hgado y no se utiliza para el diagnstico.
-Ac Anti-VHA IgG => su presencia demuestra un contacto previo con el virus (se mantiene
durante largos periodos de tiempo).

Marcadores serolgicos para el diagnstico de la hepatitis B la evolucin
clnica es variable (desde asintomtica y anictrica hasta una enfermedad aguda que se
puede complicar hacia la cronicidad, la cirrosis o forma fulminante fatal); es evidente su
relacin con el carcinoma hepato-celular; la determinacin cualitativa y cuantitativa de
ciertas protenas virales (Ags) y de los Acs nos sirve para evaluar la situacin actual y
pronosticar el futuro de la infeccin.
-Ag de superficie HBs Australia (HBsAg) => se sintetiza en el citoplasma del hepatocito;
debido a que los hepatocitos fabrica un exceso de estos, una parte es liberada a la sangre y
puede ser detectada durante el periodo de incubacin (es el 1 marcador que aparece,
incluso 2-6 semanas antes de que aparezca los sntomas, aunque pueda haber de 5-10% de
hepatitis aguda sin este marcador), en la fase aguda de la enfermedad y en el estadio
crnico; si la evolucin es favorable desaparecer a los 3-6 meses de la enfermedad; por el
contrario, si se mantiene ms de 6-8 semanas despus o si no existe una disminucin
significativa de su ttulo, es indicio de mal pronstico y de evolucin a la cronicidad.
-Ac anti-HBs => es el indicador de recuperacin de la enfermedad y el ultimo en
aparecer(+/- a los 3 meses de su evolucin); persiste durante mucho tiempo neutralizando
al virus y confiriendo proteccin; en los individuos vacunados es el nico marcador
presente.
- Ac anti-HBc => Ag HBc pertenece a la cpside y no se detecta serolgicamente, ya que no
se encuentra libre, sino en el virus entero; solo se detecta Anti-HBc; es el 1 Ac que aparece
en la enfermedad, detectable con los primeros sntomas de la enfermedad en la fase aguda
y en la crnica (entre 3-5 semanas despus de Ag Australia y es el 4 marcador en hacerse
positiva); puede significar una infeccin pasada o curada dada la larga persistencia de estos
Acs en el suero (su positividad confirmada en solitario no asegura la proteccin frente a la
enfermedad).
-Ag e (HBeAg) => es parte del Ag core; proteolticamente degradado y antignicamente
diferente; es el 2 marcador, detectable en la fase aguda y en algunas formas de
enfermedad crnica en las que histolgicamente se corresponde con hepatitis crnica
activa (HCA); su valor clnico se funda en su excelente correlacin con la presencia de
replicacin viral y viremia; la sangre con HBeAg (+) se debe considerar como infecciosa; su
estudio es obligatorio en todos los sueros de HBsAg (+).
-Ac anti-HBe => es el 5 marcador; su aparicin indica buena evolucin y una baja
infectividad del paciente; en la mayora de los casos es detectable poco antes de que
desaparezca HBsAg, pudiendo encontrarlo (+) durante varios aos despus de la infeccin.
-DNA viral libre (VHB-DNA) => es el 3 marcador; su deteccin en el suero mediante la
hibridacin no es una tcnica de rutina, a pesar de tratarse de un marcador muy sensible
tanto de la presencia del virus como de su actividad replicativa; el VHB-DNA es positivo en
un elevado nmero de pacientes HBeAg (+).


Marcadores serolgicos para el diagnstico de la hepatitis D
1- Antgeno delta (HDcAg) => aparece fugazmente en sangre en la primo infeccin y su
utilizad clnica es muy limitada.
2- Anticuerpos Anti-Delta (Anti-HD IgM) => es el marcador ms importante que aparece
despus de la aparicin del Ag y se mantiene positivo a bajos ttulos a un tiempo limitado si
la evolucin es favorable; persistir su positividad a ttulos altos en casos que evolucionan
a la cronicidad.
3- Anticuerpos Anti-Delta IgG (Anti-HD IgG) => aparecen ms tarda y se mantiene
positivo durante largos periodos de tiempo; su deteccin indica solamente contacto con el
virus.
Esquema evolutivo:
-Coinfeccin de VHB y VHD = Ag Australia (+), Anti-HBc IgM (+) y AntiHD IgM (+)
-Sobre infeccin de VHD en paciente con VHB = Ag Australia (+), Anti-HBc IgM (-) y Anti-
HD IgM (+)
4- RNA Viral (HD-RNA) => la positividad por tcnicas de hibridacin o PCR indica
presencia del virus.

Marcadores serolgicos para el diagnstico de la hepatitis C
-Anticuerpos Anti-VHC => se detecta empleando Ags sintticos o recombinantes; pruebas
confirmatorias de Acs Anti-VHC => se detectan por mtodo Western Blot para ver las
bandas.
-RNA viral (VHC-ARN) => no se suele hacer porque la epidemia es corta.

Marcadores serolgicos para el diagnstico de la hepatitis E se estn
comercializando pruebas que detectan Ag y Acs especficos (IgG y IgM) mediante tcnica
de ELISA.

DIAGNOSTICO DE LA INFECCION
A-Hepatitis Aguda
Marcadores de rutina (los que se suelen pedir al laboratorio):
VHA => anti-VHA IgM
VHB => HBsAg o Ag Australia y HBc IgM
VHC => anti-VHC (totales)
VHD => anti-VHD IgM (en pacientes ADVP)

Criterios generales de interpretacin:
-La presencia de anti-VHA IgM => es diagnostica de infeccin aguda por VHA.
-La presencia de HBsAg y anti-HBc IgM => es diagnostica de infeccin aguda por VHB;
-La presencia simultnea de anti-VHD IgM y anti-HBc IgM asociada a hepatitis aguda =>
se considera diagnostica de coinfeccin aguda por ambos VHB y VHD; la presencia de anti-
VHD IgM y HBsAg en ausencia de anti-HBc IgM => indica sobre infeccin por VHD en un
portador crnico de VHB. En cualquier caso, dada la situacin epidemiolgica actual en
Espaa, no parece recomendable la bsqueda rutinaria de la infeccin delta en pacientes
ADVP.
-La seroconversin de anti-VHC es un criterio fiable para un diagnstico de infeccin
aguda por VHC (cambio de negativo a positivo); la seroconversin suele retrasarse mas de
3 meses desde el comienzo de los sntomas, por lo que requiere el estudio de muestras de
seguimiento al menos hasta el 6 mes; no se ha demostrado que la deteccin de anti-HVC
IgM sea de utilidad en el diagnstico de la hepatitis C aguda.

Criterios de interpretacin en pacientes ADVP las tasas de seropositividad para
VHB (anti-HBc total) y VHC (anti-VHC) en individuos ADVP superan el 80%; entre los
ADVP crnicamente infectados por VHB (positivos para HBsAg), la seropositividad para
VHD (anti-VHD total) se aproxima a dicho porcentaje; es frecuente que los ADVP se hallen
crnicamente infectados por uno o ms de dichos agentes en un episodio de hepatitis
aguda, resultando imposible precisar su etiologa.


B-Hepatitis Crnica
Marcadores de rutina:
VHB => HBsAg y anti-HBc total (IgM + IgG)
VHD => anti-VHD total (en pacientes ADVP positivos para HBsAg)
VHC => anti-VHC

Criterios de interpretacin:
-La presencia de HBsAg y anti-HBc total asociada a hepatitis crnica => es diagnostica de
hepatitis B crnica; la presencia adicional de anti-VHD total => indica una sobre infeccin
crnica por ambos VHB y VHD.
-La presencia de anti-VHC asociada a hepatitis crnica => es altamente indicativa de
hepatitis C crnica, aunque no es un diagnostico seguro; la deteccin de ARN viral en suero
mediante PCR ayuda a establecer el diagnostico, pero un resultado negativo aislado no lo
descarta, ya que la viremia es intermitente en muchos casos; dado el alto costo de mtodos
de confirmacin de anti-VHC, se considera que una re comprobacin del resultado positivo
mediante un segundo mtodo de cribado (mtodo screening con tcnica de ELISA) que
utilice Ags obtenidos por tecnologa diferente, es suficiente para establecer la presencia de
anti-VHC en pacientes con hepatitis crnica.

VIH o SIDA

Descubrimiento del virus se sospech desde 1981 en 5 casos de neumona
porPneumocystis carinii en varones homosexuales previamente sanos y va aumentando el
nmero de casos y se fue asociando esta inmunodeficiencia adquirida al sarcoma de
Kaposi; en junio de 1982 se contabilizaron 439 casos y en EEUU se emite un informe para
definir los casos de SIDA; en febrero del mismo ao Montagnier expone la hiptesis de un
retrovirus linfotropico pudiera ser el agente causante del sndrome; en Mayo de 1983 se
aislo por primera vez el virus por Montagnier en Francia a partir de un ganglio linftico de
un paciente con linfadenopatia persistente (LAV) y Gallo en EEUU de un enfermo de SIDA
(HTLV-III).


El virus es un virus ARN de la familia Retroviridae, subfamilia
Lentiviridae (=incubacin lenta >10 aos) con tipos 1 y 2; esta familia de virus se
caracteriza por sintetizar ADN a partir de ARN viral, mediante una retro-transcriptasa;
consta de nucleo-cpside y envoltura; es muy sensible a los agentes qumicos y calor; sus
principales genes son:
a) Estructurales:
-Gen GAG (Core) => protenas 24
-ENV (Envoltura) => glicoprotenas 41, 120 y 160
-POL (Polimerasa) => es importante

b) Reguladores => genes que regulan la replicacin viral y el papel de todos ellos no est
completamente dilucidado


Patogenia en la infeccin aguda, el virus se une principalmente a receptores CD4
gracias a gp41 y gp120; por lo tanto, sus clulas diana fundamentalmente son los linfocitos
T4 (aunque tambin se unir a los linfocitos B que tiene CD4, a los macrfagos, a las
clulas cerebral, y a los precursores de hemates); este episodio se manifiesta como un
cuadro pseudogripal; es importante saber que la respuesta inmunitaria en forma de Acs
frente al virus se puede demorar 6-8 semanas (periodo de ventana +/- 3 semanas); a
continuacin el ARN se copia a ADN por accin de la transcriptasa inversa, se pone en
circulacin y se integra en el ADN de la clula (periodo de latencia); latencia o crecimiento
es clave de la patogenia de la enfermedad; normalmente la fase de latencia se prolonga
durante periodos largos de tiempo (2-8 aos incluso ms), pero en un momento dado
puede progresar la enfermedad con un progresivo deterioro de la inmunidad hasta
desarrollar el SIDA; el ciclo biolgico se resumen=>
Entrada de virus transcripcin de ARN al ADN integracin en la genoma de T4
formacin de nuevos viriones tras periodo de latencia (al salir, el virin tomara en su salida
parte de la membrana celular para utilizarla como su envuelta, esto hace que se destruye
los T4, se paraliza el sistema inmunolgica y acaba provocando el SIDA.


Epidemiologia las vas de transmisin del virus => por sangre, sexual y vertical-
perinatal; en Espaa la tasa de transmisin por sangre es importante (el principal grupo
afectado sonlos UDVP/ ADVP y homosexual), a diferencia de Francia o EEUU, donde los
mas afectados son homosexuales; en cuanto a las tasas de transmisin madre-hijo oscilan
15-50%, cobrando una especial importancia en frica; la transmisin al personal sanitario
o similar es 0,2% y requiere contacto con mucosas de la sangre o liquido corporal
infeccioso (o tambin de lquidos donde se haya cultivado al virus).

Sintomatologa clnica de SIDA desde que una persona se infecta hasta que se
desarrolle la enfermedad, suele transcurrir 6-10 aos; el estudio de la evolucin de SIDA
puede realizarse por las manifestaciones clnico que van apareciendo o por marcadores
bioqumicos (el descenso de la cifra de linfocitos T4); a partir del 1996 la determinacin de
la cantidad de virus circulante en la sangre de la persona infectada (carga viral) se ha
convertido en principal marcador de la evolucin de la enfermedad.

Fases de la enfermedad
(1) fase de la infeccin aguda => la mayora de los pacientes experimentan al cabo de unas
3 semanas de haber infectado con el virus una serie de sntomas pseudogripales como
fiebre, cefalea, eritema, adenopatas y sensacin de mal estar, desaparecen despus de 1-2
semanas; durante esta fase, el VIH se multiplica a gran velocidad; en un primer momento
se produce un descenso de la cifra de linfocitos (total), pero dentro de poco alcanzan las
cifras normales en respuesta de una activacin del sistema inmunolgico; los individuos
son altamente contagiosos durante esta fase;
(2) fase asintomtica que puede durar 10 aos o incluso mas; durante este periodo, el
virus continua replicndose, causando destruccin progresiva del sistema inmune; durante
esta fase, el recuento de los linfocitos es normal;
(3) fase sintomtica precoz, se suele iniciar el desarrollo del sntoma clnico caracterstica
de la enfermedad; apareciendo infecciones oportunistas de carcter leve p.ej. de tipo viral
=>CMV, Herpes zoster, de tipo bacterianas => Mycobacterium, Legionella, infestacin de
parsitos => Pneumocystis carinii, Cryptosporidium, algunos hongos
=> Aspergillus yCndida;
(4) fase avanzada en la que aparecen infecciones y tumores, definitorios del
SIDA (sarcoma de Kaposi) que adems, puede complicarse con un cuadro neurolgico
(demencia del SIDA)con alteraciones motoras y del rea cognitiva, debido a la accin
directa del virus sobre SNC;la supervivencia media de los pacientes con la SIDA ya
desarrollado suelen ser 18-125 semanas, dependiendo del tipo de infeccin que tenga; en
ningn caso habr supervivencia cuando estn en esta fase.


Diagnstico de laboratorio de la infeccin por VIH en
Espaa fundamentalmente serolgico, por la importancia y las implicaciones que conlleva;
se realiza mediante tcnicas de ELISA en primera instancia (tcnica de cribado), aplicando
a los positivos, mtodos de confirmacin => Western Blot (WB), inmunofluorescencia
(IFI) o radioinmuno-precipitacion (RIPA).

**) El Western Blot es ms utilizado y permite diferenciar los Acs frente a las distintas
protenas del virus; tiene distintos criterios para la interpretacin de los resultados (OMS,
CDC, Cruz Roja) y los resultados se clasifiquen en:
-Positivos => lo ms aceptado es que haya bandas de envoltura (g41, gp120 y gp160) y
adems bandas del core (p24, p31 y p66) o de la polimerasa o de ambos.
-Indeterminados => se detecta la presencia de alguna banda frente a alguna protena del
virus (solo algunas protenas del core en pacientes con lupus y factor reumatoide).
-Negativo => ausencia de banda o que no se corresponde a ninguna del virus (a estas
personas se hace un seguimiento durante 6 meses, para descartar que no sean falsos
negativos).
La tcnica de WB consiste bsicamente en la incubacin de unas tiras de nitrocelulosa en
los que sean transferido las protenas de los virus, bsicamente las estructuras con el suero
del problema durante un tiempo que oscila 2-4 horas hasta los 18 horas; tras cual se revela
la presencia de Acs frente a diferente protenas del virus mediante diferentes tcnicas
inmuno-enzimticas dependiendo del fabricante; el resultado ser la aparicin de bandas
coloreadas de mayor o menor intensidad en el lugar de la tira donde estn situadas las
protenas de VIH contra las cuales existen Acs en el suero del problema; la lectura puede
hacerse de manera manual, comparando las bandas con un control (+) o de manera
automatizada por densitometra; recordar en valores absolutos, la cifra de CD4 900-1500
linfocitos/m3 de sangre (en valores relativos 35-45%); las de CD8 600-900 linfocitos/m3
de sangre; cuando la cifra de CD4 disminuye por debajo de las 200-400 linfocitos/m3 de
sangre, ser indicativo de SIDA.


*) Los mtodos de cribado (ELISA) son ms sensibles y ms especficos, siendo lo ms
novedoso los de 3 generacin con capacidad de detectar IgG e IgM, acortando el periodo
de ventana.

*) Tambin existen mtodos rpidos, aplicables en situacin de urgencia como la
aglutinacin con partculas de ltex o los que utilicen Ags fijados a soportes solidos o
membranas (se llamaDot-Blot).

*) Las tcnicas de centros especializados => cultivo y PCR; la PCR es una tcnica con
mucho futuro que presenta una enorme sensibilidad y especificidad, pero no estn al
alcance de la mayor parte de los laboratorios; una importancia aplicacin de estas tcnicas
es el diagnostico de hijos y madres portadoras del VIH.

*) Marcadores de monitorizacin o seguimiento de la enfermedad (deteccin del Ag p24);
en fases tardas, se puede observar el declinar de los Acs anti p24 que se pueden utilizar
con el mismo fin.

*) De todos modos, el que ms se utiliza para un diagnstico de SIDA es el recuento celular
de los linfocitos CD4 o T4 (o el cociente respecto a los T8).

MTODOS DIAGNSTICOS EN VIROLOGA CLNICA

Objetivo de laboratorio - proporcionar el diagnstico etiolgico y orientar
correctamente el tratamiento en el menor tiempo posible; de manera simultanea se intenta
practicar 2 tipos de diagnostico =>
- D directo (visualizar o aislar el germen mediante el cultivo e identificarlo =>
en virologa clnica no es posible, por las caractersticas fsicas y biolgicas del virus,
porque se ha de hacer mediante la deteccin de sus componentes, p.ej. Ags o
cidos nucleicos).
- D indirecto (la identificacin de los componentes de la respuesta inmune
especifica/ Acs generados).
Metodos de diagnostico directos:
a) Examen directo de la muestra (macroscpica /a simple vista) => aspecto
purulenta (en una infeccin viral nunca hay pus), presencia de sangre, moco, etc.

b) Microscpia => con la Microscpia ptica solo se puede identificar los cambios
celulares (efecto citoptico) sufrido por las celulas infectadas y con la Microscpia
electrnica se puede visualizar el virus (en laboratorios de experimentacin).

c) Cultivo => los virus se multiplican exclusivamente en el interior de las celulas vivas,
por ello debemos preparar previamente un soporte celular que permita su crecimiento in
vitromediante siguientes tcnicas:
- cultivo de rganos => las secciones de algunos rganos pueden ser viables varias semanas
y nos permiten cuidadosamente aislar por ej. virus sincitial respiratorio (VRS) mediante
secciones de tejido respiratorio.
- cultivo de tejidos => fragmentos de tejidos en suspensin (cultivar adenovirus en
un tejido adenoideo)
- cultivos celulares => celulas aisladas obtenidas por disociacin mecnica y con
enzimas proteolticas a partir de tejidos; las celulas disociadas y separadas se colocan en un
frasco de cristal o de plstico; las celulas se adhieren a las paredes del frasco y se cubren
con medios nutritivos para mantenerlas viables; en condiciones optimas, las celulas se
multiplican hasta que cubran la pared formando una capa continua de crecimiento sobre
las que se podrn replicar los virus del problema; tipos de cultivos celulares:
*) cultivos primarios => es el primer pase in vitro, tomados directamente de un
organismo vivo; las celulas se siembran en un frasco con medio de crecimiento, conservan
el numero de cromosomas, tienen un periodo de vida corto y permiten el crecimiento de
gran variedad de virus (p.ej. celulas del rion de conejo y mono, embrin de pollo).
*) lineas diploides => son celulas de un solo tipo (somticas) que se pueden cultivar
durante un tiempo limitado, conservan el numero de cromosomas (46) y con ventaja de
quese mantiene durante mas tiempo que cultivo primario.
*) lineas celulares continuas => se cultivan in vitro indefinidamente y tiene un
cariotipo heteroploide (numero menor que las celulas somticas); se originan de tejido
maligno o por mutacin de una clula diploide; el cultivo se multiplican de forma
indefinida y suelen presentar aberraciones en el numero de cromosomas; estas celulas se
pueden mantener a -70C o -90C indefinidamente (p.ej. lineas celulares Hep-2 y Vero).
*) Shell-vial => es una tcnica de cultivo celular que se ha desarrollado en
los ltimos aos y que permite obtener el crecimiento de numerosos virus y ciertas
bacterias en un corto periodo de tiempo (24-48 horas); sobre un vial se coloca una mono
capa de celulas con 1ml de medio de crecimiento, y sobre ello se coloca 0,2 ml de la
muestra problema; el mtodo se basa en la centrifugacin (suave) de la muestra sobre la
mono capa, y tras un corto periodo de incubacin se pone de manifiesto la expresin de los
Ags virales en la mono capa mediante tincin inmunolgica; la ventaja => la rapidez
de obtencin de resultados en 24-48 horas, detectamos los Ags a las pocas horas de
iniciarse la infeccin; tiene una sensibilidad superior al cultivo celular, porque inoculamos
el mismo volumen de muestra en un rea mas pequea y mas fcil la observacin al
microscopio de fluorescencia.

Identificacin del crecimiento en el cultivo celular - las mas frecuentes y
disponibles en el laboratorio:
1). Efecto citoptico - los virus al multiplicarse provocan cambios en la clula donde se
replican que se manifiesta por una modificacin en la morfologa celular que se pueden
observar (p.ej. inclusiones dentro de las celulas, hinchazn del citoplasma, formacin de
celulas gigantes multi-nucleadas) en la clula sin teir o teidas (se ve mas detalladas);
cada virus presenta un tipo de efecto citoptico caracterstico que puede ser identificado en
menos de 1 semana (p.ej. enterovirus, herpesvirus, adenovirus o poxvirus tienen como
efecto citoptico la destruccin o lisis celular en 24-48 horas;
la fusin celular/ formacin de sincition son caracterstico de herpes virus, CMV, virus
herpes zster, etc.)
2). Formacin de cuerpos de inclusin - son cambios histolgicos que se producen en las
celulas por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares; pueden
localizarse en el ncleo, en el citoplasma o en ambos y se clasifican segn su tincin en
eosinfilos o basfilos; cada virus produce unos cuerpos de inclusiones caractersticos.
3). Hem-adsorcin - es la capacidad que adquieren las celulas infectadas por un virus para
adherir a su superficie los hemates de diversas especies (p.ej.aves, carnero).
4). Hem-aglutinacin - la capacidad que adquieren las celulas infectadas por el virus de
aglutinar diversos tipos de hemates, por la formacin en su membrana de este tipo
de protenas, las hemaglutininas.
5). Deteccin mediante metodos inmuno-enzimticos o por inmunofluorescencia, de los
Ags virales mediante Acs especficos para los cuerpos de inclusin celular.

Las muestras para el aislamiento de virus se deben recoger lo antes posible, no despus de
los 3-7 primeros das del inicio de la enfermedad; se pueden conservar a 4C durante 24
horas y si no, se deben congelar a -70C porque muchos virus son lbiles a -20C; las
muestras que se utilizan con mayor frecuencia son secreciones nasales, frotis farngeo,
exudado conjuntival, lquidos vesiculares, raspados de piel, heces, orina, LCR, etc.

d) Deteccin de los componentes estructurales virales - las tcnicas mas usadas
que permiten detectar Ags en suero y lquidos orgnicos (cuando existe una
alta concentracin viral, sera fcil detectarlos) son:
- Aglutinacin en ltex => a las moleculas de ltex se les une varias molculas de Acs
conocidos y cuando se pone en contacto con una solucin que contiene el Ag (la muestra
problema) se origina una aglutinacin que puede visualizarse; es una tcnica sencilla,
sensible, re-producible y barata. Su sensibilidad depender de la pureza del Ac utilizado.
- Contra-inmunoelectroforesis => esta basada en el principio de que los Ags virales (o
bacterianos en su caso) suelen tener carga (-) y los Acs (+), en medio alcalino; con este
fundamento se colocan las soluciones de Acs conocidos y del Ag problema en unas
cavidades realizadas en un gel de agarosa de tal manera que puedan difundir libremente;
se colocan unas mechas en los extremos de la capa de agarosa, que conectan con unas
cubetas que contienen un buffer con una composicion diferente dependiendo del sistema
Ag-Ac; cuando se aplica una corriente elctrica, las molculas de Ags con carga (-) migran
hacia el nodo que esta en el extremo opuesto de la placa; los Acs son arrastrados por el
buffer levemente alcalino y, en el punto en que ambas lineas se encuentran, se forma una
banda de precipitacin visible; es una tcnica de alta sensibilidad pero laboriosa, que
precisa una alta concentracin de Ag y Ac.
- Enzimoinmunoensayo => se basa en la deteccin de Ags mediante el empleo de un Ac
unido a una enzima, que mantiene la capacidad de canalizar la reaccin Ag-Ac; el enzima
utilizado puede ser peoxidasa de rabano, Beta-galactosidasa o fosfatasa alcalina; la
presencia del inmuno-complejo es detectada por una reaccin coloreada que se produce al
aadir el sustrato; el empleo de enzimas tiene una serie de ventajas:
*) el enzima se une al Ac pero deja libre los lugares de unin al Ag
*) el enzima no se modifica con la reaccin Ag-Ac y queda unido al inmuno-complejo junto
con el sustrato amplificando la reaccin y aumentando la posibilidad de deteccin
*) los conjugados con enzimas son muy estables
*) la lectura de la reaccin se realiza en un espectrofotmetro y la cantidad de sustrato
liberado es directamente proporcional a la cantidad de Ag fijado en la reaccin
*) la lectura tambin puede hacerse cualitativamente de forma manual, "de visu".
La reaccin tiene lugar en 2 fases => en la 1- en unos pocillos sobre los que se ha fijado un
Ac especifico; al agregarle la muestra que puede contener los Ags, se unen formando el
complejo Ag-Ac; posteriormente se hace un lavado para eliminar el resto de Ags no unidos
a los Acs de la placa y otras partculas que pudieran interferir, en la 2- se agrega un Ac
marcado con un enzima que se une a los sitios de unin del Ag y al aadirse un sustrato, da
lugar a una reaccin coloreada, que procederemos a medir en un espectrofotmetro; es
una tcnica que necesita varias horas para su realizacin.

- Radioinmunoanalisis => tiene el mismo fundamento que el ELISA, pero en vez de unir
un enzima al Ac, se le une un radioistopo, y lo que se mide en ultima instancia es
la radiactividad que estar en proporcin directa a la cantidad de Ag que haba en la
muestra problema; es una tcnica con la misma sensibilidad que el ELISA, pero es mas
costosa y se necesita trabajar con material radioactivo, lo que plantea problemas en cuanto
al personal y las instalaciones; esta tcnica se utilizo por primera vez para detectar el Ag de
superficie del virus de la hepatitis B.
- Inmunofluorescencia directa (IFD) => el Ag unido a una fase solida, en este caso un
portaobjetos, se pone en contacto con el Ac marcado con una sustancia fluorescente (p.ej.
isocianato de fluoresceina, rodamina, europio, etc.); tras un periodo de incubacin, se lava
para eliminar el exceso de Acs y se observa al microscopio de luz ultravioleta;
esta tcnica nos permite demostrar no solo la reaccin Ag-Ac,
sino tambin la localizacin exacta donde se produce (superficie celular,
citoplasma, ncleo...).