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REPORTE (MARCO TERICO)

En muchos aspectos, el pequeo tamao de los microorganismos los hace sujetos ideales para la
experimentacin. Se pueden cultivar millones de organismos en un solo mililitro de medio para su estudio.
La rpida multiplicacin de estas diminutas criaturas constituye tambin una ventaja experimental, ya que
se puede trabajar con muchas generaciones en un solo da, Es ms, los conocimientos adquiridos en el
estudio de los microorganismos pueden ser, a menudo, generalizados a los sistemas celulares, plantas y
animales, incluida la especie humana. Para llevar a cabo experimentos con microorganismos es
usualmente necesario cultivarlos en el laboratorio.

La esterilizacin

La esterilizacin es un proceso a travs del que se puede lograr la destruccin total de los
microorganismos viables presentes en un determinado material. Este procedimiento es de gran utilidad
dentro del campo farmacutico, ya que existen muchos procesos que requieren la utilizacin de
materiales estriles. Entre stos podemos destacar:

La esterilizacin de equipos quirrgicos y otros materiales de uso mdico con el propsito de reducir
el riesgo de infecciones en pacientes.
El acondicionamiento del material (pipetas, tubos, placas de Petri, pinzas, etc.) que va a ser utilizado
en los laboratorios de microbiologa.
La preparacin de medios de cultivo que sern empleados con diferentes propsitos (cultivo de
microorganismos, control de ambiente, equipos o personal, anlisis microbiolgico de medicamentos,
cosmticos, alimentos, etc.)

Existen diversos mtodos de esterilizacin. La seleccin del mtodo a aplicar en cada caso est
determinada por el tipo de producto a esterilizar.

Clasificacin de los mtodos de esterilizacin:

En la siguiente pgina se presenta un esquema de los principales mtodos de esterilizacin, clasificados
de acuerdo al tipo de agente que acta.

1) Agentes fsicos

El calor se puede aplicar como agente esterilizante de dos formas: el calor hmedo el cual destruye a los
microorganismos por desnaturalizacin de las protenas y el calor seco que destruye a los
microorganismos por oxidacin de sus componentes celulares. El calor es considerado como el mtodo
de esterilizacin por excelencia siempre y cuando el material a esterilizar soporte altas temperaturas sin
sufrir ningn tipo de dao.
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La radiacin, o emisin y propagacin de la energa a travs
de un medio, puede ser utilizada como agente para la
eliminacin de microorganismos. As tenemos que las
radiaciones ionizantes se pueden utilizar para la esterilizacin
de materiales termolbiles, como por ejemplo materiales
plsticos, y las radiaciones no ionizantes, como la luz
ultravioleta, puede ser empleada en el control de reas
cerradas.

a) Esterilizacin por calor:

El calor es el mtodo de eleccin para esterilizar el material de
laboratorio resistente a las altas temperaturas. La temperatura
y el tiempo requeridos para esterilizar un material dependen
de que se est utilizando calor seco o calor hmedo.

Esterilizacin con calor seco: La accin bactericida del calor
seco se debe a la oxidacin fsica de un procedimiento lento o
coagulacin de la protena bacteriana por quemadura. En
ausencia de humedad se necesita una temperatura ms alta,
ya que en esta forma los microbios son destruidos al absorber
el calor. Pueden ser dos tipos:
Directa: flameado o incineracin ms utilizada en
laboratorios y en algunos hospitales pequeos.
Indirecto: aire caliente u horno de Pasteur con
temperatura de 160C a 180C por 1 a 2 horas siendo
el ms eficaz y seguro el elctrico.
Ventajas:
El aire caliente penetra ciertos materiales que no se
pueden esterilizar en el autoclave
Puede utilizarse en laboratorios para la esterilizacin de
artculos de vidrio
El calor seco da proteccin en esterilizacin de
instrumentos delicados con punta o filo al que daara
el vapor
El acero no se corroe o decolora
Desventajas:
Se requiere ms tiempo de accin, porque el aire
penetra con lentitud y uniformidad
El tiempo y la temperatura varan segn el tipo de
material.
La sobre exposicin puede daar algn producto
Destruye telas o material de caucho

Esterilizacin con calor hmedo: El calor hmedo es la forma de vapor saturado a presin es eficaz para
la destruccin de todas las formas microbianas, incluso espora. La muerte de las bacterias es causada
por la desnaturalizacin y coagulacin de su protena o su sistema intercelular enzima-protena. Estas
reacciones son catolizadas por medio del agua. Estas pueden de dos tipos:

Calor hmedo discontinuo: algunos medios de cultivo que contiene carbohidratos como la
gelatina, leche, etc. no soportan temperaturas elevadas y se realiza mediante los siguiente
procedimientos:
o Tindalizacin: hace uso del calor hmedo, para una buena esterilizacin se debe
realizar a 100C por hora (por tres veces discontinuas) durante 1 da.
o Ebullicin: es el paso de un lquido al estado de vapor. El agua en ebullicin representa
en forma eficaz y prctica de proporcionar una desinfeccin de alto nivel de
instrumentos y guantes que entren en contacto de las membranas mucosas, si bien al
hervirlos por 20 minutos se aniquilan todas las formas vegetativas de las bacterias, los
virus, las levaduras y los hongos, pero no destruye a las esporas.
o Pasteurizacin: elimina a todos los microorganismos no esporulados se puede variar las
temperaturas por ejemplo: 62C por 30 min.; 70C por 15 min. Se utiliza para preservar
alimentos como ser leche, cerveza.
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Vapor a presin: conocido como autoclave, que posee todos los requisitos indispensables como
grados de temperatura y tiempo de exposicin, que junto con el tamao del autoclave y el flujo del
vapor, la densidad y el tamao de la carga en la cmara aumentan la tasa se muerte de los
microorganismos, en una temperatura de 121C 132C durante 15 minutos o ms.
Ventajas:
Es ms fcil segura y eficaz
El uso del vapor es el procedimiento ms rpido, el ciclo total de tiempo es ms corto
Es ms barato y de obtencin ms fcil
La mayora de las autoclaves poseen controles automticos y dispositivos de control
Desventajas:
Se requiere mucho cuidado en la preparacin y confeccin de bultos, en la carga y manejo del
autoclave, as como el secado de los artculos
Los artculos a esterilizar deben estar limpios, sin grasa ni aceite
El vapor tiene que estar en contact directo con todas las partes de los artculos
Los ciclos de tiempo se ajustan segn el tipo de material y tamao de la carga
El vapor puede no ser puro

La cmara presurizada utilizada normalmente en el laboratorio es el autoclave. En muchos aspectos una
autoclave se parece a una olla de presin casera. De hecho, en algunos pequeos laboratorios de
microbiologa se utilizan estas ollas en lugar de autoclaves. Ambos son recipientes de metal con paredes
suficientemente fuertes para resistir la presin de vapor.

Las autoclaves son grandes cmaras de acero inoxidable que funcionan automticamente. Los objetos
deben ser colocados de manera que el vapor de agua entre en contacto con todas las partes de cada uno
de ellos, y el aire no quede atrapado en su interior. El aire que no es reemplazado por vapor crea una
bolsa seca, donde la esterilizacin no ser efectiva.

b) Esterilizacin por radiacin: La ionizacin por radiacin genera iones al liberar electrones de los
tomos, estos se desprenden violentamente con tomos adyacentes y se une a ellos, o bien se
desprenden del segundo tomo. La energa liberada se transforma en energa trmica o qumica la cual
causa la muerte de los microorganismos al romper la molcula del ADN e impide la divisin molecular y la
propagacin de la vida. Las principales fuentes de radiacin ionizante son las partculas Beta y rayos
gamma.

Ventajas:
Penetra la mor parte de todos los materiales para esterilizarlos con confiabilidad
Es el mtodo de esterilizacin ms eficaz
No genera radiacin residual
Penetran en objetos grandes y voluminosos

2) Agentes mecnicos

La filtracin permite la remocin de todos los microorganismos presentes en un lquido o un gas
retenindolos sobre la superficie de un material.

Filtracin: Las clulas microbianas pueden retirarse de los lquidos o gases por filtracin. La filtracin es
lenta y cara (debe usarse un filtro nuevo cada vez); por esta razn, se utiliza slo para los lquidos
termolbiles, que no se pueden esterilizar en el autoclave. Los slidos termolbiles tambin se pueden
esterilizar por filtracin, si previamente se disuelven en un lquido. Tcnicamente, la filtracin no esteriliza
porque los virus pueden pasar a travs de los filtros, pero el proceso es suficiente para la mayora de los
estudios de rutina que se llevan a cabo en el laboratorio.

Los filtros utilizados se denominan filtros de membrana. Estas membranas estn compuestas de
nitrocelulosa, con un poro de dimetro constante. La nitrocelulosa es un derivado qumico de la celulosa,
que tambin se utiliza como explosivo. El dimetro de poro es aproximadamente 0,45 m; este tamao es
lo suficientemente pequeo como para eliminar todos los microorganismos, con excepcin de los virus y
algunas bacterias muy pequeas. Un lquido se filtra hacindolo pasar a travs de un filtro de membrana
acoplado a un matraz especial. Para hacer pasar el lquido por el filtro se utiliza una bomba de vaco; los
microorganismos quedan en la superficie de la membrana. La filtracin es el mtodo de eleccin para
esterilizar soluciones de vitaminas, antibiticos v otros compuestos termolbiles, que son aadidos a los
medios.

3) Agentes qumicos
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Algunas sustancias qumicas pueden ser usadas como agentes esterilizantes porque tienen la capacidad
de promover una o ms reacciones qumicas capaces de daar los componentes celulares de los
microorganismos (protenas, membranas, etc.)

Esterilizacin por gas oxido de etileno: Este es un gas incoloro, soluble en agua y en solventes
comunes, se emplea para esterilizar objetos sensibles al calor, este proceso es relativamente lento. El
poder bactericida depende de la concentracin del mismo gas, temperatura, humedad y tiempo de
exposicin. La actividad esporicida se produce por aniquilacin de los grupos terminales hidroxilo,
carboxilo, amino y sulfridrilo.

Ventajas:
Es un buen sustituto eficaz cuando los artculos no pueden ser esterilizados por calor
Es anticorrosivo y no daa el material
Penetra totalmente todo el material poroso
No deja pelcula sobre los instrumentos
Desventajas:
Es un proceso complicado por lo que se debe usarse indicadores biolgicos
La esterilizacin lleva ms tiempo, es un proceso lento y largo
Necesita equipo especial y costoso
Puede formar productos secundarios txicos
Necesita ser ventilado por lo menos 24 horas
Por frecuentes esterilizaciones pueden formar y aumentar residuos totales de gas en artculos
porosos
En contacto con la piel produce vesculas y an quemaduras
Si se inhala puede ser irritante para las mucosas

Esterilizacin por glutaraldehido: La solucin acuosa de glutaraldehido activado y amortiguado al 2%,
destruye a los microorganismos por desnaturalizacin de la protena. Es preferida para esterilizar
instrumentos que no pueden esterilizarse al vapor o no se cuenta con otro mtodo de esterilizacin.

No es absorbible por caucho ni plstico
Es poco voltil de modo que puede reutilizarse
Es eficaz a la temperatura ambiente
Es anticorrosivo, no mancha y eficaz para esterilizar instrumentos
Tiene una tensin superficial baja

Ventajas Grado de desinfeccin Tiempo de inmersin
Amplio espectro esterilizante 12 horas

nivel alto 30 min.

nivel bajo 10 min.

Desventajas:
Puede ser irritante, por lo tanto se debe enjuagar exhaustivamente con agua estril
Es una solucin con olor
Es costoso

Control del proceso de esterilizacin:

Todos los procesos de esterilizacin se deben controlar para poder asegurar que han sido efectivos. Para
ello se pueden utilizar indicadores fsicos, qumicos y/o biolgicos, los cuales deben ser colocados en
cada carga de esterilizacin.

Indicadores fsicos

Entre los principales indicadores fsicos se encuentran los medidores de presin y los termmetros los
cuales permiten constatar las condiciones fsicas dentro de la cmara de esterilizacin. Tambin existen
los termgrafos los cuales, adems de registrar la temperatura alcanzada en el proceso, permiten conocer
durante cunto tiempo sta se mantuvo.

Indicadores qumicos
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La mayora de estos indicadores son cintas adhesivas que se adhieren al material a esterilizar. Estas
cintas estn impregnadas con una sustancia qumica que cambia de color cuando el material ha sido
sometido al proceso de esterilizacin. Este tipo de cintas no son completamente confiables debido a que
muchas veces slo indican que se lleg a la temperatura deseada, pero no indican por cuanto tiempo sta
se mantuvo. Tambin existen cintas diseadas de manera que el cambio de color es progresivo, estas
cintas son un poco ms seguras porque permiten estimar si el tiempo de esterilizacin fue el adecuado.
Indicadores biolgicos

Son preparaciones de una poblacin especfica de esporas de microorganismos, las cuales son altamente
resistentes a un proceso de esterilizacin en particular.
Estos indicadores se deben colocar junto con la carga de esterilizacin, en el sitio que se considera que
es ms difcil que llegue el vapor y despus del proceso, se deben incubar durante 24 horas en
condiciones adecuadas. Si despus de este periodo hay evidencia de crecimiento microbiano (por
ejemplo cambio de color del medio de cultivo), el proceso de esterilizacin no fue satisfactorio.

Cuando se utilizan indicadores biolgicos se debe verificar:
Tipo de microorganismo
Tipo de proceso de esterilizacin
Nmero de lote Fecha de
expiracin Medio de
cultivo utilizado
Condiciones de incubacin del indicador despus de aplicado el proceso de esterilizacin
Mtodos de descontaminacin para evitar la diseminacin de esporas en el medio ambiente

Con este tipo de indicadores se controlan la esterilizacin por vapor a presin, por calor seco y la
esterilizacin con xido de etileno.

Almacenamiento del material estril:

Una vez que un material est estril puede mantener esta condicin si est protegido en la forma
apropiada. Es decir, la duracin de la esterilidad de un material no est relacionada directamente con el
tiempo, sino con factores que comprometen su exposicin al medio ambiente.
Los materiales estriles pierden su esterilidad:

Cuando se produce cualquier ruptura, accidental o no, del material que lo recubre durante su
transporte o almacenamiento.
Al humedecerse el material de empaque.

Es importante no manipular los materiales estriles con las manos hmedas, ni colocarlos sobre
superficies mojadas. Al almacenar los materiales estriles se deben tomar una serie de precauciones,
tales como:

Controlar el acceso a las reas de almacenamiento de materiales estriles.
Mantener el rea de almacenamiento limpia, libre de polvo, sucio e insectos.
Controlar la temperatura y la humedad de las reas de almacenamiento.
La temperatura ideal debe estar por debajo de los 26C y la humedad relativa entre 30 y 60%.
Los periodos prolongados de almacenamiento en lugares tibios y hmedos, pueden producir
condensacin de humedad sobre el material de empaque.
Utilizar, preferiblemente, estantes cerrados para colocar el material.
Dejar que los materiales que salen del horno o el autoclave alcancen la temperatura ambiente antes
de ser almacenados; de esta forma se evita la condensacin dentro del empaque.

Medios de cultivo

Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en condiciones
fsicas ptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son esenciales en el
Laboratorio de Microbiologa por lo que un control en su fabricacin, preparacin, conservacin y uso,
asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos.

Clasificacin de los medios de cultivo

En los laboratorios de microbiologa se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser
preparados en forma lquida o en forma slida. Usualmente para preparar un medio slido se parte de un
medio lquido al que se le aade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la slicagel.
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Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en:

Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las
que son usualmente complementadas por la adicin de minerales y otras sustancias. En ellos no se
conocen todos los componentes ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.
Medios definidos o sintticos: son los medios que tienen una composicin qumica definida
cualitativa y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigacin. (Para bacterias
como: Echerichia coli y Leuconostoc citrovorum)

De acuerdo al uso del medio de cultivo, stos se clasifican en:

Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de
microorganismo en particular. Permiten aumentar el nmero de microorganismos de ese tipo.
Usualmente contienen una o ms sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con
excepcin de los que se quieren cultivar.
Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios slidos y
estn diseados para el aislamiento de microorganismos especficos. (Para bacterias como
Salmonella typhi y Clostridium botulinum)
Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad
microbiana de los microorganismos. No contienen ningn tipo de sustancia con actividad
antimicrobiana. Permiten revelar caractersticas fisiolgicas de los microorganismos. ( para bacterias
como: Streptococcus pyogenes y Escherichia coli)

Por su composicin los medios de cultivo se clasifican en:

Lquidos: conocidos como caldos, estos son especialmente tiles para hacer diluciones, para
homogenizar mezclas de microorganismos, para enriquecer cultivos y para rehidratar cepas
liofilizadas.
Slidos: Para separar microorganismos y favorecer el desarrollo de las colonias aisladas en las que
es posible observar las caractersticas tpicas de un solo tipo de microorganismo.
Semislidos: Son aquellos medios lquidos a los que se adiciona agar en concentraciones de 0.4 a
0.8%. Estos se emplean para determinar la movilidad de los microorganismos microaeroflicos.

Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes
bsicos o por simple rehidratacin de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo
deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, adems
de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.
Para su preparacin se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:

Prepararlos slo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren
productos de calidad.
Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiolgica y fisicoqumica adecuada.
Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada.
Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilizacin.
Nunca se deben exceder las condiciones sealadas por el fabricante.

Almacenamiento de los medios de cultivo:

Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que
seale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25_), con poca humedad
y protegidos de la luz solar di recta. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra
fuente de calor o vapor; Los medios de cultivo deshidratados se deben descartar cuando se hidraten o
decoloren.

Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe almacenar entre 2 y 8_C, a
menos que el medio requiera alguna condicin diferente. Se deben mantener en recipientes bien cerrados
para evitar su deshidratacin. Cuando se usa tapn de algodn se debe colocar por encima una envoltura
de papel (Craft).

Definiciones:

Asepsia: es la ausencia de microorganismos, un estado libre de grmenes. Conjunto de procedimientos
que impiden la llegada de microorganismos a un medio, por ejemplo: tcnicas de aislamiento, etc.
Antisepsia: proceso de destruccin de los microorganismos contaminantes de los tejidos vivos. Conjunto
se procedimientos destinados a destruir a los grmenes patgenos o no patgenos, por ejemplo:
antispticos, etc.
Contaminado: se refiere a toda superficie, animado o inanimada, que se sabe aloja microorganismos.
Desinfeccin: es el uso de procedimientos fsicos o qumicos para destruir a la mayora de los
microorganismos: bacterias y otros microorganismos relativamente resistentes por ejemplo
mycobacterias, virus lipdicos, hongos.
Esterilizacin: la esterilizacin es la destruccin total de todos los microorganismos, incluso de las formas
ms resistentes como esporas bacterianas, virus no lipdicos y hongos. Con el uso de los procedimientos
fsicos o agentes qumicos.
Limpieza: reduccin sustancial del contenido microbiano, sin que llegue a la desaparicin completa de los
microorganismos patgenos
Sptico: presencia de microorganismos patgenos en los tejidos vivos.