Manual de laboratorio de Banco de Sangre

Dr. Jonathan Alfaro Alvarado

Dr. Carlos Cordero Gmez
Dr. Miguel A Rodrguez Pineda.



















Procedimiento 1
Prueba de Antiglobulina Indirecta
v
Principio

La tcnica de inmunoglobulina indirecta fue descrita por primera vez en 1945
por Coombs y colaboradores y permite observar aglutinaciones de anticuerpos que
normalmente no seran evidenciables en condiciones estndar de laboratorio.

La tcnica de antiglobulina indirecta, permite detectar los anticuerpos de tipo IgG, que
no tienen la capacidad de aglutinar de manera espontnea y requiere de una fase de
revelado para poder evidenciarlos. Se utiliza en el fenotipaje de
grupos sanguneos, en los que los antgenos se encuentran en baja densidad
antignica y donde el anticuerpo utilizado es IgG., Igualmente es aplicable en aquellos
casos en los que se buscan anticuerpos de tipo IgG en el suero de una persona.

En esta prueba se utiliza el suero de Coombs, o reactivo de antiglobulina
humana, el cual consiste, en su forma ms simple, en una inmunoglobulina dirigida
contra la porcin Fc de los anticuerpos de tipo IgG. Existen
igualmente reactivos que estn conformados no solamente por inmunoglobulinas anti-
IgG, sino tambin por anticuerpos dirigidas contra la molcula C3 del
complemento, lo que permite reconocer la presencia de anticuerpos fijadores de
complemento. Se han desarrollado asimismo reactivos dirigidos contra fracciones
especficas de complemento, como C3b, C3d, C4b y C4d. En este sentido podemos
encontrar reactivos de antiglobulina humana policlonales (anti IgG + anti C) o
monoespecficos que contienen solo uno de los anticuerpos en mencin

La prueba de Antiglobulina Indirecta cuenta con varias fases, siendo la primera
una fase la centrifugacin, sin previa incubacin en la cual se detectan anticuerpos de
tipo IgM como los del sistema ABO, auto-anti-I, anti-M, anti-N, anti-Lewis, etc. Por
esta razn cuando se esta utilizando esta tcnica, con el objetivo de detectar anticuerpos
irregulares en pacientes, las clulas que se utilizan debern ser de grupo O para evitar a
interferencia del anti A y anti B.

La segunda fase consta en incubar la reaccin a una temperatura de 37C, por un
tiempo que estar definido por el tipo de potenciador que utilicemos, como albmina,
LISS, polietilenglicol o enzimas. En caso de que alguno de estos reactivos sea utilizado,
es necesario apegarse a las instrucciones aportadas por el fabricante. Durante la
incubacin se pretende que ocurra la sensibilizacin del glbulo rojo, que permitir
detectar la reaccin antgeno-anticuerpo en la fase de revelado.

Una vez terminada esta incubacin, se pasa a realizar lavados con el fin de
remover inmunoglobulinas u otro tipo de protenas, que no se unieron al eritrocito y
que pueden interferir con la reaccin. La fase de los lavados es crtica, ya que la
presencia de anticuerpos u otros interferentes en el suero podran llevar a la
neutralizacin del reactivo. Asimismo, es sumamente importante eliminar el exceso de
solucin salina al finalizar estos lavados, ya que de lo contrario, el reactivo de
antiglobulina es diluido, lo cual puede afectar la sensibilidad de la prueba.


Posterior a los lavados, y de haber eliminado la ltima gota de solucin salina se aade
el reactivo de antiglobulina, fase de revelado se centrifuga y se lee la prueba.
De haberse dado sensibilizacin, los anticuerpos adheridos a la superficie eritrocitaria
sern reconocidos por el reactivo de antiglobulina y se podr observar una reaccin de
aglutinacin.

Muestras y reactivos
Solucin salina
Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA.
Bao mara a 37C.
Juego de clulas rastreadoras 3%.
Reactivo de Antiglobulina Humana.
Albmina bovina 22%.
Clulas de control de antiglobulina humana.

Mtodo
1. Rotular tubos para las Clulas I, Clulas II y Clulas III.
2. Mezclar y homogenizar con suavidad el juego de reactivo de clulas
rastreadoras.
3. Aadir al tubo rotulado como clulas I, 50 ul del pool I. Debe tenerse
especial cuidado en no intercambiar las tapas de los goteros y en
minimizar la posibilidad de contaminacin de los mismos.
4. Aadir al tubo rotulado como clulas II, 50 ul del pool II.
5. Aadir al tubo rotulado como clulas III, 50 ul del pool III.
6. Aadir 100 ul del suero en anlisis a cada uno de los tubos.
7. Agregue 100 ul de albmina al 22%.

A partir de este momento se inician las tres fases de una prueba de
antiglobulina:

Fase 1, centrifugacin inmediata o prueba rpida:
1. Centrifugar los tubos 30 segundos a 3000 rpm.
2. Resuspender con suavidad, leer y anotar resultados.

Fase II, incubacin a 37C:
1. Despus de la lectura anterior, colocar los tubos a 37C
por 30 minutos.
2. Centrifugar los tubos 30 segundos a 3000 rpm. Leer y
anotar resultados.
3. Realizar tres lavados con solucin salina fisiolgica.
4. Secar la ltima gota de solucin salina


Fase III, antiglobulina:
1. Aadir 100ul del reactivo de antiglobulina humana
poliespecfico (suero de Coombs).
2. Mezclar y centrifugar 30 segundos a 3000 rpm.
3. A las pruebas que dieron negativo, se les realiza el
control con Clulas Control, agregando 50ul de las
clulas Control de Antiglobulina Humana.
4. Mezclar y centrifugar 30 segundos a 3000 rpm, leer y
anotar resultados.



Procedimiento 2
Prueba de Antiglobulina Directa
v
Principio
La prueba de antiglobulina directa se utiliza primordialmente para determinar si los
eritrocitos del paciente en anlisis estn recubiertos por inmunoglobulinas o fracciones
de complemento. Esto puede llegar a presentarse en diferentes condiciones, como por
ejemplo, la presencia de aloanticuerpos, producto de una reaccin hemoltica tarda o
por enfermedad hemoltica del recin nacido o autoanticuerpos en anemias hemolticas
autoinmunes, dirigidos contra antgenos de propios de la superficie eritrocitaria, de
anticuerpos dirigidos contra drogas que se adsorben a la membrana del glbulo rojo o
por la activacin de complemento en esta superficie.

Por estas razones, la prueba de antiglobulina directa son tiles en el estudio de
anemias hemolticas, y el resultado debe analizarse en el contexto clnico para poder dar
un diagnstico certero.

Normalmente, esta prueba se realiza con el reactivo de Antiglobulina Humana,
que tal como se explic en el procedimiento anterior, usualmente es poliespecfico e
incluye anticuerpos dirigidos tanto contra las IgG humanas como contra fracciones del
complemento. En caso de obtener una reaccin positiva utilizando el reactivo
poliespecfico, se procede a repetir la determinacin utilizando reactivos
monoespecficos con el fin de identificar la especificidad de
las protenas involucradas en la reaccin.

Dado que es posible que exista fijacin de complemento in vitro en muestras no
anticoaguladas, se prefiere realizar esta prueba en muestras con EDTA. De lo contrario,
se puede obtener un resultado positivo debido a la activacin del complemento, durante
la coagulacin.

Tambin se recomienda utilizar eritrocitos lavados para realizar la prueba, ya que
podrn existir protenas o sustancias inespecficas que interferiran con la reaccin.

Muestras y Reactivos
Solucin salina
Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA.
Bao mara a 37C.
Reactivo de Antiglobulina Humana
Clulas de control de antiglobulina humana.

Mtodo
1. Rotular tres tubos con el nmero de muestra por analizar.
2. Tomar una alcuota de la muestra y transferir al tubo correspondiente.
3. Realizar tres lavados con solucin salina fisiolgica.
4. En el segundo tubo hacer una suspensin de trabajo al 3-5% a partir de
la muestra de eritrocitos lavada.
5. Aadir al tercer tubo 50 ul de la suspensin de trabajo realizada.
6. Aadir 100 ul del reactivo de antiglobulina humana.
7. Mezclar y centrifugar por 30 segundos a 3000 rpm
8. Resuspender levemente, leer por aglutinacin y hacer las anotaciones
respectivas.
9. En caso de obtener un resultado negativo, corroborar el mismo
utilizando las Clulas Control.



Procedimiento 3
Estudio de Anticuerpos Irregulares utilizando Clulas
Rastreadoras
v
Principio

Como se mencion anteriormente, la prueba de Antiglobulina Indirecta puede
ser utilizada para la deteccin de la presencia de anticuerpos dirigidos hacia antgenos
de la superficie eritrocitaria. En medicina transfusional es de suma importancia la
deteccin de la presencia de estos anticuerpos, ya que si estn presentes en el suero de
un paciente, por una reaccin de aloinmunizacin previa, permitir definir cual es la
sangre ms indicada para ser transfundida. Por esta razn, el rastreo de anticuerpos se
realiza de rutina a todos los receptores de hemocomponentes, como parte de los estudios
pretransfusionales. Lo anterior con el fin de prevenir reacciones transfusionales
hemolticas leves y graves, reduciendo un acortamiento de la sobrevida de las clulas
transfundidas.

Los anticuerpos irregulares son por lo general del tipo IgG, reactivos a 37C y/o
en la prueba de antiglobulina. Son ejemplos de este tipo de anticuerpos los dirigidos
contra los antgenos de los grupos sanguneos Rh, Kell, Duffy, Kidd y SsU. Se ha
estimado que la incidencia de anticuerpos irregulares, en diferentes poblaciones oscila
entre el 0,78% y el 1,64%. En poblaciones hospitalarias especiales, que por su
condicin de fondo reciben transfusiones de hemocomponentes con frecuencia, esta
incidencia puede ser mucho mayor.

Los mtodos empleados en la deteccin de anticuerpos irregulares pueden
incluir 3 o ms clulas pantalla o rastreadoras. Estas clulas deben de contar con los
antgenos de significancia clnica y se trabajan, al igual que las
suspensiones de trabajo eritrocitarias, a una concentracin de 3 %, para la tcnica en
tubo. Cuando un anticuerpo irregular es detectado, la especificidad debe de ser
definida mediante la confrontacin del plasma del paciente con las clulas del
panel de identificacin de anticuerpos.

Una vez identificada la especificidad del anticuerpo, se debe de buscar un
hemocomponente que no posea dicho antgeno, realizarle la prueba cruzada y solo
una vez obtenido un resultado negativo se procede a transfundir al paciente.



Muestras y reactivos
Solucin salina
Muestras de sangre con EDTA.
Bao mara a 37C.
Juego de clulas rastreadoras 3%.
Reactivo de Antiglobulina Humana
Albmina bovina 22%.
Clulas de control .

Mtodo

1. Rotular tubos para las Clulas I, Clulas II y Clulas III.
2. Mezclar y homogenizar con suavidad el juego de reactivo de clulas
rastreadoras.
3. Aadir al tubo rotulado como clulas I, 50 ul del pool I. Debe tenerse
especial cuidado en no intercambiar las tapas de los goteros y en
minimizar la posibilidad de contaminacin de los mismos.
4. Aadir al tubo rotulado como clulas II, 50 ul del pool II.
5. Aadir al tubo rotulado como clulas III, 50 ul del pool III.
6. Aadir 100 ul del suero en anlisis a cada uno de los tubos.
7. A partir de este momento se inician las tres fases de una prueba de
antiglobulina:

Fase I, centrifugacin inmediata o prueba rpida:
1. Centrifugar los tubos 30 segundos a 3000 rpm.
2. Resuspender con suavidad, leer y anotar resultados.

Fase II, incubacin a 37C:
1. Despus de la lectura anterior, colocar los tubos a 37C
por 30 minutos.
2. Centrifugar los tubos 30 segundos a 3000 rpm. Leer y
anotar resultados.
3. Realizar tres lavados con solucin salina fisiolgica.
4. Secar la ltima gota de solucin salina

Fase III, antiglobulina:
1. Aadir 100ul del reactivo de antiglobulina humana
poliespecfico.
2. Mezclar y centrifugar 30 segundos a 3000 rpm.
3. A las pruebas que dieron negativo, se les realiza el
control con Clulas Control.
4. Mezclar y centrifugar 30 segundos a 3000 rpm, leer y
anotar resultados.







Procedimiento 4
Pruebas de Compatibilidad Sangunea
v
Principio

La transfusin sangunea representa en la actualidad una parte importante de
la prctica mdica y en algunas patologas, la nica terapia existente. Sin embargo, el
xito de este tipo de terapia depende de multiples factores, entre ellos, que se asegure
compatibilidad entre el donador y el receptor de un hemocomponente.

Para que un hemocomponente pueda ser utilizado en un paciente particular,
las normas internacionales indican que debe cumplirse de previo con los
siguientes procedimientos:
- Solicitud del hemocomponente por parte del mdico tratante.
- Muestra de sangre del receptor. Tubo con anticoagulante tipo EDTA
- La identidad del paciente y de la muestra deben
ser corroboradas, con el fin de evitar cualquier tipo de confusin.
- Pruebas al donante: grupo ABO/Rh,
- Pruebas al receptor: grupo ABO/Rh, deteccin de anticuerpos
irregulares.
- Prueba cruzada mayor.
Adems, es necesario incluir diferentes etapas de verificacin que permitan
confirmar que efectivamente se estn trabajando las muestras correspondientes al
hemocomponente y al receptor.

PROCESO DE LAS PRUEBAS PRETRANSFUSIONALES

La Solicitud, identificacin y coleccin de la muestra de sangre:
Las reacciones por transfusin se pueden deber a reacciones hemolticas secundarias,
dado al bajo ttulo de anticuerpos, a errores de tipo clerical por identificacin
equvoca del paciente a transfundir, confusin al momento de extraer la muestra, o en
el laboratorio.
Antes de realizar la extraccin de sangre, el tubo y la solicitud deben de
coincidir con la identificacin del paciente, preguntando directamente cuando sea
factible al paciente o corroborando con brazaletes de identificacin; nunca se debe de
guiar por los nmeros de cama, ya que los pacientes pueden ser cambiados
dependiendo de la necesidad del servicio.

La solicitud debe tener como datos mnimos:
! Identificacin del paciente, nmero de cdula de identidad o pasaporte.
! Nombre completo y edad del receptor.
! Sexo.
! En caso de conocerse se debe de indicar valores como por ejemplo
grupo ABO y Rh, hemoglobina y hematocrito, antecedentes transfusionales,
gestaciones, inmunizacin materno fetal, reacciones adversas que se hubieran
presentando.
! Diagnstico de certeza o de probabilidad, as como el motivo de la
indicacin transfusional.
! Sealar el producto a solicitar incluyendo cantidad de unidades,
volumen o caractersticas requeridas.
! Fecha y hora en que se realizar la transfusin y, de ser necesario el
sealamiento de la urgencia de la transfusin.
! Nombre completo y firma del mdico que indica la transfusin.
! Las solicitudes transfusionales deben ser escritas en forma legible para
evitar al mximo la equivocacin.

Despus de haber realizado una adecuada identificacin del receptor, la
muestra de sangre debe ser obtenida, usando tcnicas muy cuidadosas para evitar
hemlisis, ya que la misma produce activacin del complemento y algunos anticuerpos
pueden ser enmascarados, al requerirse del complemento para visualizar la reaccin
antgeno-anticuerpo.

Si no existen problemas serolgicos (presencia de mltiples anticuerpos) anticuerpos de
fondo son suficientes 5 ml de sangreel receptor para realizar todos los procedimientos
inmunohematolgicos.

Grupo ABO

En la medida de lo posible los receptores debern recibir hemocomponentes
sanguneos ABO idnticos, sin embargo, en ciertas situaciones puede ser necesario
hacer selecciones alternativas.
La determinacin del grupo ABO es el paso ms importante de las pruebas
serolgicas pretransfusionales. Se emplean antisueros anti A y anti B, para determinar
grupo eritroctico y glbulos rojos con antgenos A1 y B para la
prueba srica.
En receptores menores de 4 meses de edad la prueba inversa no se realiza, ya
que en este tipo de pacientes el desarrollo de los anticuerpos naturales todava es
inmaduro.
En caso de discrepancias entre grupo directo e inverso se emplearn tcnicas
adicionales antes de establecer el tipo sanguneo.
Cuando se est en presencia de una urgencia extrema, en la que el grupo ABO
no se puede determinar se podr utilizar glbulos rojos empacados del grupo O para
transfundir.

ESQUEMA DE SELECCION DE HEMOCOMPONENTES POR ABO:
Si se va a transfundir sangre total o sangre total reconstituida no hay
alternativa transfusional, todas debern de transfundirse grupo ABO idntico.

Tabla 1 Esquema transfusional para Sangre total

Grupo del paciente Grupo de la unidad a transfundir
A A
B B
AB AB
O O

Si la solicitud se refiere a Glbulos Rojos Empacados se pueden utilizar
alternativas como se indican en la tabla 2 dependiendo de las existencias y reservas
del Banco de Sangre.
Tabla 2 Esquema transfusional para glbulos rojos empacados

Grupo del
paciente
Opcin 1 Opcin 2 Opcin 3 Opcin 4
A A O - -
B B O - -
AB AB A B O
O O - - -

El grupo sanguneo O, puede utilizarse con cualquier paciente ya que carece de
antgenos, lo anterior solo si no hay existencia de el grupo del paciente y en las
transfusiones subsecuentes inmediatas se debe realizar de la misma manera para evitar
reacciones de tipo hemoltico.
Para los pacientes de grupo AB, se prefiere la utilizacin de unidades del grupo A sobre
B, ya que el anti B del grupo A tiene menor capacidad hemoltica que el anti A del
grupo B.
La identificacin de antgeno Rh D se realiza usando el antisuero anti D, cuando este
reactivo es de alta concentracin proteica, la prueba debe incluir un control, que permita
detectar aquellos pacientes que tiene eritrocitos sensibilizados que puedan dar
reacciones falsas positivas.

Si el grupo Rh no puede ser establecido, dado a que el control tambin
presenta aglutinacin y la transfusin es urgente podr ser utilizado glbulos rojos
empacados Rh negativo.
Los hemocomponentes Rh positivos debern rutinariamente ser enviados a
receptores Rh positivos.
El uso de productos Rh negativos para pacientes Rh positivos es permitido,
aunque en forma ideal, debern de reservarse exclusivamente para pacientes o
receptores Rh negativos. Solo se recomiendan cuando las unidades estn por vencerse.

De forma inversa, los productos Rh negativos pueden no estar disponibles, en
esta situacin se podr optar por otras medidas alternativas, como posponer la
transfusin, hasta que el banco de sangre de manera eficiente solucione dicha situacin
o en caso de que el retardo de la transfusin ponga en peligro la vida del
paciente y siempre que el rastreo de anticuerpos del paciente est negativo se podra
utilizar sangre Rh positiva, con un riesgo de inmunizacin de un 70%.


PRUEBA CRUZADA PARA TRANSFUSIN DE ERITROCITOS

La prueba cruzada nos permite garantizar la compatibilidad ABO y en caso de que el
paciente tenga anticuerpos irregulares permite garantizar que dicho anticuerpo no va a
generar una reaccin hemoltica tarda.
La prueba cruzada en la actualidad ha sido expuesto a una serie de
Interrogantes, en cuanto a si debe ser sustituida solo por el rastreo de anticuerpos, en
aquellos pacientes que no presentan anticuerpos irregulares.
Lo anterior, dado que el rastreo de anticuerpos en los sueros del
receptor y del donador tiene una alta sensibilidad. Lo anterior no aplica para cuando la
transfusin sea destinada a un paciente que presente anticuerpos clnicamente
significativos.
La prueba cruzada mayor se refiere a la tcnica, mediante el cual se demuestra
la ausencia de anticuerpos en el plasma del receptor contra los antgenos del glbulo
rojo del donador.
Por otro lado, la prueba cruzada menor se refera al cruce entre los eritrocitos
del receptor con el suero del donador y ha sido sustituida en la mayora de los bancos
de sangre, por el rastreo rutinario de anticuerpos clnicamente significativos en los
donantes de sangre.
En caso de existir en el donante un anticuerpo en su plasma, el plasma es eliminado y
los remanentes, probablemente no causen una reaccin transfusional, por efecto
dilucional.

PRUEBA CRUZADA EN SITUACIONES ESPECIALES
Urgencias.
La necesidad urgente de transfusin en ciertas situaciones clnicas establece
que la sangre sea liberada antes de que la prueba cruzada sea terminada.
El mdico tratante debe estar enterado, que se le esta entregando una unidad sin prueba
cruzada completa.
En caso de que durante el proceso se determine alguna incompatibilidad en
alguno de los pasos, se dar aviso de inmediato al mdico encargado para que se
administre el tratamiento oportuno.
De acuerdo a la necesidad de liberacin urgente del producto sanguneo el
Banco de Sangre puede optar por:
! Enviar glbulos rojos empacados del grupo O Rh negativo y en caso de
no tener en existencia emplear grupo O Rh positivo cuando se desconozca el grupo
sanguneo del receptor.
! Enviar sangre del mismo grupo ABO y Rh del receptor y donador.
! Siempre que sea posible, realizar la primera fase de centrifugacin
inmediata, antes de enviar el producto sanguneo.
Estas medidas pretender evitar una hemolisis de tipo intravascular.

Prueba de compatibilidad para productos plasmticos
Los plasmas se transfunden solo con corroboracin del grupo sanguneo ABO.
En el caso de la transfusin de plasma no se requiere tomar en consideracin el
tipo Rh del paciente o donante debido a que estas unidades no contienen el antgeno
D. Exceptuando si las unidades estn muy contaminadas con eritrocitos.

Para el caso de la transfusin de plaquetas, estas deben de ser transfundidas
Utilizando el mismo grupo sanguneo ABO en primera instancia, en caso de no disponer
se debe utilizar plaquetas O lavadas .












Tabla 3: Esquema transfusional del plasma

Grupo del
paciente
Opcin 1 Opcin 2 Opcin 3 Opcin 4
A A AB
B B AB
AB AB
O O A B AB



Materiales y reactivos:
Frascos de anti A, anti B, anti AB, anti D, anti A1, Reactivo de antiglobulina
humana, albmina al 22%, clulas A y B al 3%.
Tubos con muestras de eritrocitos a analizar.
Tubos con muestras de suero a analizar.
Clulas rastreadoras.
Tubos de 12 x 75 mm para realizar las reacciones
Solucin salina al 0.85% (Pizetas).
Centrfugas Serolgicas.
Microscopios.
Frascos con clulas control de antiglobulina humana.
Pipetas Pasteur.
Bulbos para pipeta Pasteur.
Baos de Mara a 37C.
Portaobjetos.
Caja de aplicadores.
Gradillas metlicas.
Gradillas madera.
Papel toalla.
Mtodo:
! Rotular los tubos con el nombre Paciente 1, Paciente 2, Paciente 3
y Paciente 4
! Realizar suspensiones de trabajo 3-5% de los donantes 1, 2, 3 y 4.
! Aadir 50ul de la suspensin del donante 1 al tubo rotulado como
Paciente 1.
! Aadir 50ul de la suspensin del donante 2 al tubo rotulado como
Paciente 2.
! Aadir 50ul de la suspensin del donante 3 al tubo rotulado como
Paciente 3.
! Aadir 50ul de la suspensin del donante 4 al tubo rotulado como
Paciente 4.
! Aadir 100ul del suero del paciente 1 al tubo rotulado como
paciente 1.
! Aadir 100ul del suero del paciente 2 al tubo rotulado como
paciente 2.
! Aadir 100ul del suero del paciente 3 al tubo rotulado como
paciente 3.
! Aadir 100ul del suero del paciente 4 al tubo rotulado como
paciente 4.
! Aadir 100 ul de albmina bovina al 22% a todos los tubos.
! Mezcle los tubos, a partir de este momento iniciamos con las tres fases
de la prueba de antiglobulina humana indirecta.
! Fase I: Centrifugacin inmediata o prueba rpida:
Centrifugar los tubos 30 segundos a 3500 rpm. En esta fase se establece la
compatibilidad al sistema ABO, sin embargo, otros anticuerpos (ejemplo: auto-anti-I),
pueden tambin ser detectados en esta fase. Leer y realizar las anotaciones.
! Fase II
Despus de la lectura anterior colocar todos los tubos a 37C por 30 minutos.
Al concluir la incubacin sacar los tubos del bao y centrifugar por 30
segundos a 3000 rpm.
Leer y hacer las anotaciones correspondientes.
Realizar tres lavados con solucin salina fisiolgica.
Secar la ultima gota de salina.

! Fase III o antiglobulina:
Aadir 100ul del reactivo de antiglobulina humana poliespecfico.
Mezclar y centrifugue 30 segundos a 3000 rpm.
Leer y realizar anotaciones.
Las reacciones con resultado negativo confirmar con las clulas control.
Simultneamente debe montar el estudio de anticuerpo para cada uno de los pacientes
de acuerdo a lo detallado en el procedimiento 3.

Durante el perodo de incubacin realizar las determinaciones de grupo
sanguneo eritrocitario a cada una de las suspensiones de los pacientes y donantes.

Recomendaciones:
Los resultados de las pruebas debern ser ledos contra luz blanca.
Se puede utilizar espejos magnificadores, lentes y microscopios que ayuden con la
lectura de las pruebas.
El botn de las clulas se resuspender, se har la lectura y se asignar los
puntajes en cruces en la hoja de trabajo.
En caso de resultados incompatibles debern ser investigados en busca de su
causa.


Procedimiento 5

Identificacin de Anticuerpos

Principio
Una vez que se ha detectado la existencia de un anticuerpo irregular, atravs de un
estudio de anticuerpos positivo, se debe identificar su especificidad y definir su
importancia clnica.
Los paneles de identificacin estn compuestos por juegos de 11 o ms tipos diferentes
de clulas del grupo O, con fenotipo conocido de los principales antgenos de grupo
sanguneo, a saber:
D, C,E, c, e y usualmente f, Cw
M, N, S, s
Fya, Fyb
Jka, Jkb
K, k y usualmente Kpa, Kpb, Jsa, Jsb
Lua, Lub
Lea, Leb
P1
Xga
Otros antgenos de fenotipo poco frecuente, pueden ser incluidos dentro del panel e
incluso pueden estar incluidos dependiendo de la zona geogrfica, donde se encuentre
la investigacin. Lo anterior de acuerdo a la disponibilidad de clulas por parte del
fabricante.
El panel de identificacin dispone de una tabla antignica de reaccin, donde se indica
la positividad de los diferentes antgenos en relacin a la clula que se est
analizando, as como el lote del reactivo, fecha de vencimiento y un lugar destinado
para hacer las anotaciones de los resultados obtenidos y sus interpretaciones.
Para el estudio de anticuerpos es importante tener presente las caractersticas de los
anticuerpos como son:
- rango trmico,
- respuesta a la reaccin de la enzima,
- fuerza de reaccin, (tanto aglutinacin como hemlisis).
- Resultado del autocontrol para la deteccin de autoanticuerpos.
Cuando el patrn de aglutinacin del panel muestra diferencias, se sospecha de mezcla
de anticuerpos.
La aplicacin de tcnicas enzimticas o de reactivos especiales, permite separar los
anticuerpos, en base a sus caractersticas de los antgenos respectivos,
de tal manera que permitan separarlos y diferenciarlos con mayor claridad.
Dentro de estas tcnicas se deben considerar para separar las mezclas de anticuerpos se
pueden mencionar:
absorcin/elucin
variacin de temperaturas de reaccin
uso de medios como el polietileno glicol y enzimas
los medios reductores.
Caractersticas de los anticuerpos en las fases de reaccin:
Fase de Centrifugacin Inmediata:
A 22C reaccionan mejor los anticuerpos del tipo IgM como el M, N, Lewis, y el
P.
El anti I tiene un rango trmico desde 4C hasta fase de antiglobulina, sin
embargo, su temperatura ptima es de 4C.

INCUBACION A 37C:
En este grupo se incluyen los anticuerpos del tipo IgG que tiene la capacidad
de aglutinar sin llegar a la fase de antiglobulina humana. Se pueden mencionar
los anti D, C, c, E, e, que reaccionan ptimamente al ser incubados por 30
minutos.
FASE DE ANTIGLOBULINA HUMANA:
En esta fase se incluyen todos los anticuerpos tipo IgG no aglutinantes como el
anti Duffy, Kidd, Lutheran, S, s, Kell y Cellano.

EQUIPOS Y REACTIVOS:
Solucin salina fisiolgica
Panel de identificacin
Panel de identificacin tratado con enzima
Tubos 12 x 75mm para reaccin.
Centrfugas serolgicas.
Papel toalla.
Pipetas Pasteur.
Bulbos para pipetas Pasteur.
Tubos rotulados como muestra 1 con de suero/plasma a identificar.
Tubos rotulados como muestra 2 con de suero/plasma a identificar.
Mtodo:
Panel de identificacin
! Mezclar con suavidad y homogenizar el juego de reactivos del panel de
identificacin segn corresponda.
! Rotular un juego de 11 tubos con el nmero y la muestra a analizar.
! Aadir 50ul de las clulas reactivo correspondiente 1 al tubo rotulado como
clulas 1. y as sucesivamente hasta completar los 11 tubos.
! Aadir 100ul del suero o plasma a estudiar a los 11 tubos.
! A todos los tubos aadir 100ul del reactivo de albmina bovina al 22%.
! Mezclar y a partir de este momento se inicia con las tres fases de la prueba de
antiglobulina humana indirecta.
! Anotar los resultados obtenidos en la tabla antignica que corresponde al lote
del panel.
! Identificar segn perfil antignico obtenido el antgeno contra el cual va dirigido
el anticuerpo en estudio.


Procedimiento 6
Tcnica de adsorcin de anticuerpos
Principio
En inmunohematologa se habla de adsorcin cuando se utilizan clulas con
fenotipo conocido para provocar que el anticuerpo correspondiente, se pegue a la
superficie del glbulo rojo.
A partir de un proceso de adsorcin se pueden separar a nivel de laboratorio
dos o ms anticuerpos mezclados en un suero.
Como primer punto para seleccionar las clulas a utilizar en la absorcin, se
deben interpretar las reacciones obtenidas en el panel de identificacin y
establecer cules anticuerpos pueden estar involucrados.

Seguidamente se debe buscar clulas cuyo fenotipo posea slo uno de los antgenos que
se sospecha.
Una vez seleccionada la clula, se toma partes iguales de clulas y plasma y se realiza el
proceso de adsorcin, bajo las condiciones ptimas del anticuerpo en estudio.
La parte final del proceso establece una centrifugacin, que sirve para separar
los glbulos rojos sensibilizados del plasma y as obtener los dos anticuerpos
separados.
EQUIPOS Y REACTIVOS:
Solucin salina fisiolgica
Panel de identificacin
Panel de identificacin tratado con enzima
Tubos 12 x 75mm para reaccin.
Centrfugas serolgicas.
Papel toalla.
Pipetas Pasteur.
Bulbos para pipetas Pasteur.
Tubos rotulados como muestra 1 con de suero/plasma a identificar.
Tubos rotulados como muestra 2 con de suero/plasma a identificar.
Tubos con eritrocitos a analizar
Baos a 37C
Tubos 13 X 100 mm.
Tapones rojos.
Pipetas 10 ml.
Pipeteadores.

Mtodo:
- Seleccionar los glbulos rojos adecuada para adsorcin y tomar
estrilmente una alcuota de unos 10 ml.
- Lavar tres veces el paquete con solucin salina fisiolgica.
- Dejar el paquete el mximo posible sin salina despus del ltimo lavado.
- Agregar igual cantidad del suero en estudio.
- Incubar a 37C por 30 minutos.
- Mezclar cada 10 minutos para ayudar al proceso de adsorcin.
- Tomar una muestra de eritrocitos y realizar una prueba de antiglobulina
humana directa.
- Mantener en incubacin a 37C, hasta que se alcance el mximo de
positividad de antiglobulina humana directa, idealmente debe tener una
aglutinacin de 3 a 4 cruces.
- Centrifugar 10 minutos a 2000 r.p.m, para separar el suero adsorbido y los
eritrocitos sensibilizados.
- Rotular un tubo con los datos necesarios y transferir el suero del tubo
centrifugado.
- Al suero realizar el panel de identificacin de anticuerpos.
- Al paquete globular realizar procedimiento de elucin.

Procedimiento 7
Tcnica de Elucin de Anticuerpos
Principio
El trmino elucin significa en Inmunohematologa liberar los anticuerpos unidos a la
membrana del glbulo rojo proveniente de un proceso de adsorcin.
Dependiendo de las necesidades y protocolos de trabajo del Banco de Sangre se
puede:
! Separar el anticuerpo conservando la integridad de la membrana del glbulo
rojo.
! Separar el anticuerpo rompiendo las membranas del eritrocito mediante
agentes qumicos como el ter, cloroformo, digitonina o mediante condiciones
fsicas extremas como la congelacin o el calor.
Una vez liberado el anticuerpo el eluato, se procede a determinar su especificidad a
travs del panel de identificacin de anticuerpos.
EQUIPOS Y REACTIVOS:
Solucin salina fisiolgica
Panel de identificacin
Panel de identificacin tratado con enzima
Tubos 12 x 75mm para reaccin.
Centrfugas serolgicas.
Papel toalla.
Pipetas Pasteur.
Bulbos para pipetas Pasteur.
Tubos rotulados como muestra 1 con de plasma a identificar.
Tubos rotulados como muestra 2 con de eluato a identificar.
Tubos con eritrocitos a analizar
Frascos con cloroformo.
Baos a 37C.
Tubos 13 X 100 mm.
Tapones rojos.
Pipetas 10 ml.
Pipeteadores.
Mtodo:
Tcnica de elucin con cloroformo
- Tomar el paquete de glbulos rojos sensibilidados despus del proceso de
adsorcin.
- Lavar tres veces con solucin salina.
- A un volumen igual de clulas lavadas agregar un volumen de cloroformo.
- Tapar el tubo y agitar fuertemente por 1 minuto. Con cuidado de que el contenido del
tubo sea expulsado sobre algn compaero.
- Centrifugar 10 minutos a 2000 r.p.m,
- El tubo queda dividido en tres capas, una del cloroformo (trasparente), otra de restos
de membrana (turbia) y un eluato o hemolizado (rojo traslcido) donde se encuentra el
anticuerpo separado.
- Transferir el eluato a otro tubo y realizar un panel de identificacin de
anticuerpos.
Recomendaciones:
Para encontrar la especificidad del anticuerpo los resultados positivos por aglutinacin
as como los negativos deben ser comparados con la tabla antignica del panel en su
lote respectivo.
Para trabajar procedimientos de adsorcin/elucin siempre tomar en consideracin la
temperatura ptima de reaccin. Esta va a ser la temperatura donde ocurri la
aglutinacin ms fuerte.



Procedimiento 8
Incompatibilidad materno- fetal
Principio
La enfermedad hemoltica del recin nacido (EHRN) es una enfermedad, en la cual la
madre en gestacin transfiere aloanticuerpos del tipo IgG, via placentaria, contra
antgenos de glbulo rojo del feto.
Debido a esta sensibilizacin, los glbulos rojos fetales sufren una destruccin
acelerada tanto antes como despus del nacimiento.
Para los recin nacidos que padecen la enfermedad hemoltica, la elevacin de los
niveles de bilirrubina se convierte en un problema clnico grave, la prdida de
la capacidad de transporte de oxgeno, as como resultado de la hemlisis, los niveles
altos de bilirrubina indirecta que pueden depositarse a nivel del sistema nervioso
central.
Los antgenos localizados en la membrana de los eritrocitos, se desarrollan en
diferentes etapas de la vida intrauterina o postnatal.
Los antgenos contra el sistema de grupo sanguneo Rh, Kell, MNSs, Duffy por
mencionar algunos, presentan desde el primer de gestacin una potencia antignica
similar a la observada en los eritrocitos de una persona adulta.
Otros, por el contrario, se encuentran poco desarrollados, de ah que su expresin
antignica sea menor que los antgenos de un eritrocito de una persona adulta,
ejemplos de estos antgenos pueden ser los sistemas ABO, P1 y Lutheran.
Estos antgenos estn muy pobremente expresados al nacimiento y es
hasta despus del primer ao de vida cuando logran expresarse completamente.
En estos casos la debilidad o ausencia antignica en el eritrocito del feto, impide que se
inicie o exprese la enfermedad, por lo anterior se puede tener la incompatibilidad
eritrocitaria, sin embargo, no una enfermedad hemoltica.
Las acciones bsicas en el estudio de la EHRN, se ajustan a las circunstancias en que
se ubica el mdico y el paciente.
Una manera de estudiar los casos es dividiendo a los sujetos de estudio en tres
grupos: el feto o neonato, la madre y el padre.
Al feto o neonato se le debe realizar al menos las siguientes pruebas para su estudio:
Grupo ABO/Rh, prueba de antiglobulina directa, fenotipo eritrocitario, (previo elucin
de anticuerpos) rastreo de anticuerpos con las clulas pantallas y con clulas A1 y B.
Que se busca con estos anlisis?
! Demostrar la presencia del antgeno en los glbulos rojos del feto/neonato.
! Demostrar la presencia del anticuerpo en el suero o glbulo del feto neonato.
Anlisis en la madre:
! Determinar grupo ABO/Rh.
! Realizar estudio de anticuerpos.
! Fenotipo
Anlisis al padre:
! Determinar grupo ABO/Rh.
! Determinar el fenotipo eritrocitario.

La enfermedad hemoltica del recin nacido, desde el punto de vista
inmunohematolgico, se puede clasificar en tres categoras principales dependiendo
de la especificidad del anticuerpo sensibilizante:
! Enfermedad Hemoltica por ABO, principalmente por un anti-A,B en mujeres
del grupo O.
! Enfermedad Hemoltica por Rh, debida al anti-D.
! Enfermedad Hemoltica por otros anticuerpos irregulares.

Transfusin intrauterina y del neonato
La sangre para transfusin intrauterina debe ser seleccionada compatible con los
anticuerpos maternos capaces de cruzar la placenta. Se utilizar el suero de la madre
para la pruebas pretransfusionales.
Los glbulos rojos empacados seleccionados para la transfusin intrauterina
debern ser de preferencia O, el Rh que se escoja va a depender si conocemos el
fenotipo del feto, en caso de no saberlo se utilizar Rh negativo.
Para las unidades de exanguneotransfusin debern ser compatibles con
el plasma materno.
Todas las unidades seleccionadas para estos procedimientos, debern ser del
grupo sanguneo O, filtradas, irradiadas, de menos de 5 das de recolectada y en el
caso para las exanguneotransfusin el plasma para su reconstitucin deber ser
del mismo grupo ABO del recin nacido.

Materiales y Reactivos:
Tubos 12 x 75 mm de reaccin.
Pipetas Pasteur.
Bulbos pipetas.
Muestras de suero y eritrocitos a analizar
Solucin salina fisiolgica.
Juego de reactivos anti A, anti B, anti AB, anti D, albmina bovina al 22%,
reactivo de antiglobulina hunana.
Panel de identificacin de anticuerpos.
Frascos con clulas control de AGH.
Juego de clulas rastreadoras 3%.
Baos mara a 37C.
Centrfugas serolgicas.
Gradillas de madera.
Gradillas de metlicas.
Microscopios.
Papel toalla.
Mtodo:
! Realizar a la muestra de sangre rotulada como nio una prueba de
inmunoglobulina directa.
! Determinar el grupo sanguneo ABO/Rh del nio.
! Realizar a la muestra de plasma de la madre un rastreo e identificacin de
anticuerpos.
! Realizar una prueba cruzada entre los eritrocitos del nio y el plasma del donador.


Procedimiento 9
Anemia Hemoltica Autoinmune
Principio
La anemia hemoltica inmune se define como un acortamiento en la sobrevida del
glbulo rojo debido a una desregulacin del sistema inmune, especficamente generado
por autoanticuerpos.
Las anemias hemolticas autoinmune se clasifican en:
! Anemia Hemoltica Autoinmune por anticuerpos calientes
! Sndrome de aglutininas fras
! Hemoglobunuria paroxstica al fro
! Anemia Hemoltica Autoinmune Combinada (Anticuerpos fros y calientes)
! Anemia Hemoltica Inmune inducida por drogas

Cada una de estas se subclasifica en: primaria o secundaria.

La Anemia Hemoltica Autoinmune es designada como primaria si se considera como
una entidad idioptica, es decir, si no est asociada con alguna enfermedad
demostrable que la desencadene.

En contraste, la secundaria est asociada con un desorden primario y con razones
suficientes para sospechar que su asociacin es ms que meramente fortuita.

Estos desordenes son diagnosticados en base a las caractersticas serolgicas de
reaccin.

La mayora de los casos de AHAI son causados por autoanticuerpos cuya reaccin es
en caliente, es decir, anticuerpos cuya reactividad optima con los glbulos rojos
humanos es a 37C y que por lo general es una inmunoglobulina de la clase IgG.

El Sndrome de Aglutininas fras es generalmente causado por un autoanticuerpo de la
clase IgM y que exhibe una reactividad mxima a 4C.

El anticuerpo causante de la Hemoglobinuria Paroxstica Nocturna es una
inmunoglobulina IgG bifsica que difiere en su modo de accin. Este anticuerpo se
detecta in vitro por su habilidad de causar hemlisis de los glbulos rojos normales en
un procedimiento que lleva dos pasos, una incubacin en fro seguido por una
incubacin a 37C en presencia del complemento.

Finalmente, la ingesta de ciertos medicamentos pueden causar anemia hemoltica
pero aqu el anticuerpo siempre posee una especificidad por la droga o sus
metabolitos.

Reactivos y materiales:
Tubos 12 x 75 mm de reaccin
Pipetas Pasteur.
Bulbos pipetas.
Muestras de suero y eritrocitos a analizar
Solucin salina.
Reactivo de antiglobulina humana poliespecfico.
Reactivo de antiglobulina humana monoespecfico IgG.
Reactivo de antiglobulina humana monoespecfico C3
Panel de identificacin eritrocitos.
Frascos con clulas control de AGH.
Juego de clulas rastreadoras 3%.
Baos mara a 37C.
Centrfugas serolgicas.
Gradillas de madera.
Gradillas de metlicas.
Microscopios.
Papel toalla.
Mtodo:
De la muestra en estudio:
Hacer una suspensin de trabajo entre el 3-5% y:
! Realizar una prueba de antiglobulina humana directa utilizando el reactivo
poliespecfico, monoespecfica IgG, monoespecfico C3.

-Realizar un rastreo e identificacin de anticuerpos. Al igual que un eluido de los
eritrocitos con prueba directa de antiglobulina para realizar las conclusiones.