Pr tic Lbortoril 4

Mtodos espectrofotomtricos de
doseamento de protenas
e estudo do efeito de substncias
interferentes


Trabalho Realizado Por:
Beatriz Lopes Dias Vieira da Silva 45517
Cludia Filipa Abreu Miranda-44813
Hugo Daniel dos Santos Videira-44804
2

ndice
Sumrio
1. Resumo ...................................................................................................................................... 3
2.Procedimento Experimental ...................................................................................................... 4
3. Apresentao, Tratamento e Discusso dos Resultados .......................................................... 5
3.1.Estudo do Efeito de Alguns Tampes Comuns, Agentes Desnaturantes de Protenas,
Agentes Quelantes e Agentes Redutores no Mtodo de Lowry ............................................. 15
3.2.Resumo comparativo dos dois mtodos utilizados no doseamento das protenas ............. 19
4. Bibliografia .............................................................................................................................. 20


3

1. Resumo
Neste trabalho pretendeu-se quantificar a concentrao proteica de uma amostra de
clara de ovo utilizando-se dois mtodos espetrofotomtricos de doseamento de protenas
(mtodo do Biureto e de Lowry) e ainda avaliar a suscetibilidade do mtodo de Lowry
presena de substncias interferentes.
Estes dois mtodos baseiam-se em reaces coradas envolvendo protenas que
produzem compostos corados. A medio da absorvncia das solues de concentrao
conhecida permite traar uma recta de calibrao e atravs desta recta possvel determinar a
concentrao da soluo desconhecida sendo que a amostra padro e amostra que se
pretende estudar so sujeitas ao mesmo tratamento.
Os mtodos espectrofotomtricos so muito utilizados em Bioqumica poia so muito
sensveis sendo possvel trabalhar-se com amostras onde a concentrao do composto em
estudo muito reduzida. Entre os dois mtodos utilizados neste trabalho, o mtodo de Lowry
tem uma sensibilidade maior logo a concentrao de protena obtida com este mtodo estar
mais prxima do valor real.
Relativamente ao estudo das substncias interferentes no mtodo de Lowry, verificou-
se que o Tampo Hepes-KOH (pH 8.0) 50 mM, o Tampo de Fosfatos (pH 8.0) 50 mM, o SDS
0.1%, a Sacarose 10% (m/v), o EDTA 50 mM e o EDTA 100 mM provocaram alteraes na
absorvncia da soluo em estudo. Esperar-se-ia que a ureia tambm provasse alteraes na
absorvncia, pois um agente desnaturante de protenas, mas como foi usada em
concentrao baixa no provocou nenhuma variao.
Na comparao dos dois mtodos verificou-se que o mtodo de Lowry se utiliza
quando a quantidade de protena reduzida e h possibilidade de verificar se existem agentes
interferentes e o mtodo do Biureto utiliza-se quando a quantidade de protena elevada.

4

2.Procedimento Experimental

Materiais e Reagentes

Soluo padro de albumina de soro bovino (BSA) 3,0 mg/mL
Soluo padro de albumina de soro bovino (BSA) 0,3 mg/mL
Reagente de Biureto
Reagente de Lowry A
Reagente E
Tampo Tris-HCl (pH 8,0) 50 mM
Tampo Hepes-KOH (pH 8,0) 50 mM
Tampo de fosfatos (pH 8,0) 50 mM
Sacarose 10% (m/v)
EDTA 50 mM
EDTA 100 mM
SDS 0,1% (m/v)
Ureia 50 mM
-mercaptoetanol 0,5% (v/v)
Espectrofotmetro UV-Vis
Clulas de quartzo e de vidro (ou plstico)
Tubos de ensaio
Gobels
Bales volumtricos
Vrtex
Pipetas de Pasteur
Micropipetas
Pipetas volumtricas
Pompete


Fluxogramas

Preparao das amostras desconhecida
1- Filtrar uma clara de ovo atravs de uma camada dupla de gaze para um copo
de 100 mL.
2- Diluir 5 mL do filtrado num balo de 50 mL com gua destilada e identificar
para o mtodo do Biureto.
3- Diluir 0,2 mL do filtrado num balo de 50 mL com gua destilada e identificar
para o mtodo do Lowry.



5

Mtodo do biureto

1- Ler a absorvncia da soluo padro de BSA 3,0 mg/mL a 280 nm com cuvettes
de quartzo
2- Preparar os 12 tubos de ensaio (de acordo com o protocolo experimental)
3- Misturar no vrtex
4- Deixar repousar temperatura ambiente durante 30 minutos
5- Ler absorvncia de cada amostra a 540 nm


Mtodo de Lowry
1- Ler a absorvncia de BSA 0,3 mg/mL a 280 nm com cuvettes de quartzo
2- Preparar os 11 tubos de ensaio (de acordo com o protocolo experimental)
3- Aps a adio do reagente C, esperar 10 minutos
4- Adicionar o reagente E
5- Misturar imediatamente no vrtex
6- Aguardar 30 minutos
7- Ler absorvncia de cada amostra a 750 nm

Estudo do efeito de alguns tampes comuns, agentes desnaturantes de
protenas, agentes quelantes e agentes redutores no mtodo de Lowry
1- Preparar os 10 tubos de ensaio (de acordo com o protocolo experimental)
2- Aguardar 10 minutos aps adio do reagente C
3- Adicionar o reagente E
4- Misturar imediatamente no vrtex
5- Aguardar 30 minutos
6- Ler absorvncia de cada amostra a 750 nm

3. Apresentao, Tratamento e Discusso dos Resultados

Espectros de absoro das vrias cuvettes
Tipo de cuvette Espectro de absoro
Plstico 380nm-780nm(visvel)
Vidro 380nm-780nm(visvel)
Quartzo Menos de 380 nm(ultravioleta)
Tabela 1-Espectros de absoro das cuvettes
6

Tendo em conta os espectros de absoro apresentados no quadro, conclui-se que
para substncias que aborvam na regio do utravioleta, neste caso, as solues padro,
utilizam-se cuvettes de quartzo. Para substnicas que absorvam na zona do visvel utilizam-se
cuvettes de plstico ou de vidro, sendo que as de plstico so mais usuais visto que so mais
baratas.
Clculo da concentrao exacta das solues padro de BSA

280
(BSA) = 6,58
L (percurso ptico)=1 cm
Mtodo do Biureto
Abs
280
= 0,573
Abs
280
=
280
x L x c c = (0,573) / (6,58 x 1) c = 0,087
Mtodo de Lowry
Abs
280
= 0,028
C = 4,25 x 10
-3

Mtodo do Biureto
Concentraes finais de BSA
Ci = 3,0 mg/mL
Tubo 2
Vi = 0,3 mL
Vf = 6 mL
Vi x Ci = Vf x Cf
0,3 x 3 = 6 x Cf
Cf = 0,15 mg/mL
Tubo 3
Vi = 0,6 mL
Vf = 6 mL
Cf = 0,3 mg/mL
Tubo 4
Vi = 0,9 mL
Vf = 6 mL
7

Cf = 0,45 mg/mL
Tubo 5
Vi = 1,2 mL
Vf = 6 mL
Cf = 0,6 mg/mL
Tubo 6
Vi = 1,7 mL
Vf = 6 mL
Cf = 0,85 mg/mL
Tubo 7
Vi = 2,3 mL
Vf = 6 mL
Cf = 1,15 mg/mL
Tubo 8
Vi = 3 mL
Vf = 6 mL
Cf = 1,5 mg/mL


Tabela 2-Absorvncia e concentrao no mtodo do Biureto






Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8
Absorvncia (540
nm)
- 0,057 0,120 0,169 0,219 0,222 0,315 0,326
Concentrao
(mg/mL)
- 0,15 0,3 0,45 0,6 0,85 1,15 1,5
8

y = 0.2165x + 0.0432
R = 0.9195
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
A
b
s
o
r
v

n
c
i
a
(
5
4
0

n
m
)

Concentrao(mg/mL)






Grfico 1- Absorvncia vs concentrao no mtodo do Biureto
Y=0,2165x + 0,0432
R
2
=0,9195(quadrado do coeficiente de correlao linear)
Atravs do grfico obtido e do valor de R
2
pode-se concluir que existe uma relao
linear entre a concentrao proteca da soluo e a absorvncia medida, logo possvel
calcular a concentrao de protena atravs da equao da recta, em que y a absorvncia e x
a concentrao.
Tubo 9
Abs540=0,098
Y=0,2165x + 0,04320,098=0,2165x + 0,0432x=0,253
Tubo 10
Abs540=0,193
X=0,692
Tubo 11
Abs540=0,277
X=1,080
Tubo 12
Abs540=0,362
X=1,472
Estes valores de absorvncia e de concentrao calculados para os tubos que tinham
soluo proteca tambm podem ser incluidos no grfico dos valores da soluo padro. Desta
forma possvel verificar se os valores se encontram na recta de calibrao.
9

y = 0.2165x + 0.0432
R = 0.946
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
A
b
s
o
r
v

n
c
i
a
(
5
4
0

n
m
)

Concentrao(mg/mL)








Clculo da concentrao de protena na soluo inicial (sem estar diluda)
Tubo 9
[Protena]
f
=0,253 mg/mL
Vf=6 mL
Vi=0,1 mL
Vi x Ci = Vf x Cf
0,1 x Ci = 6 x 0,253
Ci = 15,18 mg/mL
Esta concentrao corresponde soluo de protena que foi diluida em 50 mL, ou seja, ainda
no a concentrao inicial.
Vf=50 mL
Cf=15,18 mg/mL
Vi=5 mL
Ci=151,8 mg/mL
Para os restantes tubos, os clculos realizados foram semelhantes.

Tubo 10
[Protena]
f
=0,692 mg/mL
Vf=6 mL
Vi=0,3 mL
10

Ci = 13,84mg/mL
Esta concentrao corresponde soluo de protena que foi diluida em 50 mL, ou seja, ainda
no a concentrao inicial.
Vf=50 mL
Cf=13,84 mg/mL
Vi=5 mL
Ci=138,4mg/mL
Tubo 11
[Protena]
f
=1,080mg/mL
Vf=6 mL
Vi=0,5 mL
Ci = 12,96mg/mL
Esta concentrao corresponde soluo de protena que foi diluida em 50 mL, ou seja, ainda
no a concentrao inicial.
Vf=50 mL
Cf=12,96mg/mL
Vi=5 mL
Ci=129,6mg/mL
Tubo 12
[Protena]
f
=1,472mg/mL
Vf=6 mL
Vi=0,7 mL
Ci = 12,62mg/mL
Esta concentrao corresponde soluo de protena que foi diluida em 50 mL, ou seja, ainda
no a concentrao inicial.
Vf=50 mL
Cf=12,62mg/mL
Vi=5 mL
Ci=126,17mg/mL
11

Calculando a mdia dos 4 valores:

=136,49mg/ml

Mtodo de Lowry
Concentraes finais de BSA
Ci = 0,3 mg/mL
Tubo 2
Vi = 0,1 mL
Vf = 6,5mL
Cf = 4,62 x 10
-3
mg/mL
Tubo 3
Vi = 0,2 mL
Vf = 6,5 mL
Cf = 9,2 x 10
-3
mg/mL
Tubo 4
Vi = 0,3 mL
Vf = 6,5 mL
Cf = 1,38 x 10
-2
mg/mL
Tubo 5
Vi = 0,4 mL
Vf = 6,5 mL
Cf =1,85 x 10
-2
mg/mL
Tubo 6
Vi = 0,5mL
Vf = 6,5 mL
Cf = 2,31 x 10
-2
mg/mL
Tubo 7
Vi = 0,6 mL
Vf = 6,5 mL
12

y = 18.731x + 0.0038
R = 0.9675
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03
A
b
s
o
r
v

n
c
i
a
(
7
5
0

n
m
)

Concentrao (mg/mL)
Cf = 2,77 x 10
-2
mg/mL
Tabela 3-Absorvncia e concentrao no mtodo de Lowry







Grfico 2-Absorvncia vs Concentrao do mtodo de Lowry
Y=18,731x + 0,0038
R
2
=0,9675
Tubo 8
Abs750=0,147
x=7,64x 10
-3

Tubo 9
Abs750=0,289
X=0,012
Tubo 10
Abs750=0,514
X=0,027

Tubo 1 2 3 4 5 6 7
Absorvncia (750
nm)
- 0,111 0,183 0,195 0,394 0,444 0,515
Concentrao
(mg/mL)
- 4,62 x
10
-3

9,2 x
10
-3

1,38 x
10
-2

1,85 x
10
-2

2,31 x
10
-2

2,77 x
10
-2

13

y = 18.683x + 0.0114
R = 0.9687
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03
A
b
s
o
r
v

n
c
i
a
(
7
5
0

n
m
)

Concentrao (mg/mL)
Tubo 11
Abs750=0,483
X=0,025
Estes valores de absorvncia e de concentrao calculados para os tubos que tinham
soluo proteca tambm podem ser incluidos no grfico dos valores da soluo padro. Desta
forma possvel verificar se os valores se encontram na recta de calibrao.








possvel verificar que o valor da absorvncia desceu do tubo 10 para o tubo 11 e,
consequentemente, o valor da concentrao tambm desceu, apesar de se ter colocado um
maior volume de BSA. Esta descida pode estar relacionada com um possvel erro na medio
de volumes.
Clculo da concentrao de protena na soluo inicial (sem estar diluda)
Tubo 8
[Protena]
f
=7,64x 10
-3
mg/mL
Vf=6,5 mL
Vi=0,1 mL
Ci = 0,4966mg/mL
Esta concentrao corresponde soluo de protena que foi diluida em 50 mL, ou
seja, ainda no a concentrao inicial.
Vf=50 mL
Cf=0,4966mg/mL
14

Vi=0,2 mL
Ci=124,15mg/mL
Para os restantes tubos, os clculos realizados foram semelhantes.

Tubo 9
[Protena]f =0,012 mg/mL
Vf=6,5 mL
Vi=0,2 mL
Ci = 0,39mg/mL
Esta concentrao corresponde soluo de protena que foi diluida em 50 mL, ou
seja, ainda no a concentrao inicial.
Vf=50 mL
Cf=0,39mg/mL
Vi=0,2 mL
Ci=97,5mg/mL
Tubo 10
[Protena]f =0,027 mg/mL
Vf=6,5 mL
Vi=0,3 mL
Ci = 0,585mg/mL
Esta concentrao corresponde soluo de protena que foi diluida em 50 mL, ou
seja, ainda no a concentrao inicial.
Vf=50 mL
Cf=0,585mg/mL
Vi=0,2 mL
Ci=146,25mg/mL
Tubo 11
[Protena]f =0,025 mg/mL
15

Vf=6,5 mL
Vi=0,4 mL
Ci = 0,406mg/mL
Esta concentrao corresponde soluo de protena que foi diluida em 50 mL, ou
seja, ainda no a concentrao inicial.
Vf=50 mL
Cf=0,406mg/mL
Vi=0,2 mL
Ci=101,56mg/mL
Calculando a mdia dos 4 valores:

=117,365mg/ml

A concentrao de protena final, sem estar diluda, obtida no teste do biureto foi de
136,49 mg/mL, enquanto que no teste de Lowry obteve-se a concentrao de 117,365 mg/mL.
Conclui-se que a concentrao deste segundo teste estar mais prxima do valor real, pois o
teste de Lowry tem uma maior sensibilidade (10-200 g de protena) comparativamente ao
teste do biureto (1-10mg de protena).
3.1.Estudo do Efeito de Alguns Tampes Comuns, Agentes
Desnaturantes de Protenas, Agentes Quelantes e Agentes
Redutores no Mtodo de Lowry
Tabela 4. Resultados obtidos no estudo do efeito de alguns tampes comuns, agentes desnaturantes de
protenas, agentes quelantes e agentes redutores no mtodo de Lowry.
Tubo N Agentes Potencialmente Interferentes Absorvncia Resultado
1 gua Destilada 0.000 Controlo
Negativo
2 BSA (0.3 mg/ml) 0.162 Controlo
Positivo
3 Tampo Tris-HCl (pH 8.0) 50 mM 0.201 Negativo
4 Tampo Hepes-KOH (pH 8.0) 50 mM 0.446 Positivo
5 Tampo de Fosfatos (pH 8.0) 50 mM 0.266 Positivo
6 SDS 0.1% 0.242 Positivo
7 Sacarose 10% (m/v) 0.230 Positivo
8 EDTA 50 mM 0.340 Positivo
9 EDTA 100 mM 0.388 Positivo
10 Ureia 50 mM 0.210 Negativo
11 mercaptoetanol 0.5% (m/v) 2.543 Positivo

16


Grfico 3. Valores das absorvncias dos agentes potencialmente interferentes em funo da concentrao final
medidos a 750 nm, no mtodo de Lowry.
O mtodo de Lowry apresenta um elevado grau de sensibilidade, cerca de (10 200 g
de protena), este mtodo tem uma grande exatido e muito verstil. Por outro lado, o
mtodo de Lowry pode comportar interferncias por substncias que so adicionadas
soluo de modo a estabilizar, atenuar ou aumentar algumas das caractersticas da substncia
em estudo, conforme a necessidade da experincia em questo.
A medio da absorvncia de solues que contm as solues do mtodo de Lowry e
as substncias possivelmente interferentes em funo da sua concentrao permite avaliar a
suscetibilidade do mtodo de Lowry sofrer alteraes ou no e quais as substncias que so
responsveis por essas alteraes.
Os resultados cujos valores de absorvncia no correspondem aos valores que a
protena, sujeita ao mtodo de Lowry sem a presena das substncias possivelmente
interferentes apresentaria, constituem falsos positivos. O que indica que a presena dessas
substncias na soluo altera os resultados do mtodo de Lowry.
Nesta prtica laboratorial o mtodo de Lowry foi efetuado em 11 tubos de ensaio e
foram adicionados BSA ou soluo padro de albumina de soro bovino, gua Destilada,
Reagente C e Reagente E ou reagente de Folin comercial e gua Destilada e a absorvncia foi
medida a 750 nm.
O tubo 1 contm gua destilada, reagente C, reagente E e no contm BSA, ou seja
no contm amostra de protena. Como tal, o tubo 1 o tubo controlo do ensaio e a sua
reao nunca pode ser positiva sendo denominado controlo negativo. O tubo de controlo
0.000
0.162
0.201
0.446
0.266
0.242 0.230
0.340
0.388
0.210
2.543
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
A
b
s
o
r
v

n
c
i
a

Tubo N
Absorvncia dos Agentes Potencialmente
Interferentes em Funo da Concentrao
Final
Absorvncia
17

funciona como meio de comparao em relao aos outros tubos de ensaio onde ocorreu
reao e na leitura da absorvncia dos tubos de ensaio, o tubo 1 funciona como zero ou
branco e tem uma leitura de (0,000).
O tubo 2 contm BSA ou soluo padro de albumina de soro bovino, gua destilada,
reagente C e reagente E, o que faz do tubo 2 o controlo positivo da experincia. O controlo
positivo da experincia tem obrigatoriamente de apresentar reao, pois o que est em
soluo a protena em estudo e os solventes, neste caso os reagentes C e E e gua destilada
que no interfere com a reao. O tubo 2 vai funcionar como controlo positivo e
consequentemente como meio de comparao em relao aos outros tubos de ensaio. Este
tubo teve uma leitura de absorvncia de (0,162).
Uma substncia considerada um agente interferente no mtodo de Lowry quando a
absorvncia medida num tubo de ensaio apresenta uma variao superior ou inferior a 30% do
valor de absorvncia do controlo positivo.
A absorvncia do controlo positivo que corresponde ao tubo 2 foi de (0,162), 30% de
(0,162) (0,0486). Deste modo, se os valores das absorvncias medidos nos tubos de ensaio 3
a 11 tiver desvios de mais ou menos (0,0486), respetivamente (0,211) e (0,113), ento as
substncias presentes nesses tubos de ensaio so consideradas substncias interferentes no
mtodo de Lowry.
Nos tubos 3 a 11 est presente BSA, Reagentes C e E, gua destilada e respetivamente
a substncia em anlise. Os tubos que no apresentaram variaes superiores ou inferiores a
30% do valor de absorvncia do controlo positivo foram os tubos 3 e 10.
O tubo 3 contm o tampo Tris-HCl a (pH 8,0) 50 mM e o valor da sua absorvncia foi
de (0,201), este valor inferior ao valor do limite superior de (0,211) e superior ao valor limite
inferior de (0,113), o que torna o tampo Tris-HCl uma substncia que no interfere com o
mtodo de Lowry.
O tubo 10 contm Ureia a 50 mM e o valor da sua absorvncia foi (0,210), que tambm
inferior ao limite superior de (0,211) e superior ao limite inferior de (0,113). Deste modo, a
Ureia uma substncia que no interfere com o mtodo de Lowry. Era de esperar que a
Ureia, como agente desnaturante de protenas fosse interferir com o mtodo de Lowry.
Porm, a concentrao de Ureia utilizada nesta prtica laboratorial foi muito baixa, 50 mM.
Como o valor da concentrao da Ureia presente em soluo era muito baixo, a protena no
foi significativamente afetada e os valores de absorvncia encontram-se dentro do esperado
para as substncias que no afetam o mtodo de Lowry.
Os tubos que apresentaram variaes superiores ou inferiores a 30% do valor de
absorvncia do controlo positivo foram os tubos 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 11.
O tubo 4 contm tampo Hepes-KOH (pH 8,0) 50 mM e a sua absorvncia foi (0,446).
Uma vez que o valor de absorvncia do tampo Hepes-KOH foi muito superior ao limite
superior do controlo positivo da experincia (0,211), podemos afirmar que esta uma
substncia que interfere com o mtodo de Lowry.
18

O tampo Hepes-KOH pode formar radicais e funciona como um agente redutor,
reagindo com o reagente de Folin do Reagente E. No mtodo de Lowry a reduo do reagente
de Folin d-se pela ao dos resduos de Tirosina e Triptofano presentes na protena. Quando
se adiciona mais um agente redutor, como o tampo Hepes-KOH, a concentrao do reagente
de Folin diminui muito, o que faz aumentar o valor de absorvncia.
O tubo 5 contm tampo de Fosfatos (pH 8,0) 50 mM e o valor da sua absorvncia foi
(0,266). O valor de absorvncia do tampo de Fosfatos foi superior ao valor limite do controlo
positivo (0,211), o que, segundo estes dados, o torna uma substncia que interfere no mtodo
de Lowry. Este resultado no era esperado, uma vez que o tampo de fosfatos tem uma ao
reguladora do pH do meio da soluo e no interfere com a estrutura ou funo da protena,
no alterando a sua conformao nativa. Assim, consideramos que ocorreu um erro na
preparao do tubo 5, pois o tampo de fosfatos uma soluo que conserva dentro de um
intervalo de valores de pH a estabilidade de uma protena, em vez de provocar alteraes na
sua atividade e consequentemente nos valores de absorvncia.
O tubo 6 contm SDS ou dodecil sulfato de sdio 0,1% e o valor da sua absorvncia foi
(0,242). O valor de absorvncia do SDS superior ao valor limite do controlo positivo (0,211),
segundo este valor de absorvncia o SDS uma substncia que interfere no mtodo de Lowry.
O dodecil sulfato de sdio um agente desnaturante de protenas. Um agente desnaturante
de protenas afeta a estrutura e funo da protena provocando a perda da sua conformao
nativa. Uma vez que a estrutura e funo da protena ficam comprometidas de esperar que o
valor de absorvncia tambm esteja alterado.
O tubo 7 contm Sacarose 10% (m/v) e o valor da sua absorvncia foi (0,230). O valor
de absorvncia da sacarose superior ao valor limite do controlo positivo (0,211), o que torna
a sacarose numa substncia que interfere no mtodo de Lowry. A sacarose um glcido de
tamanho considervel, pelo que em meio aquoso menos solvatada por molculas de gua,
isto pode levar a que reaja com a protena alterando os valores de absorvncia.
O tubo 8 e 9 contm ambos EDTA ou cido etilenodiamino tetra-actico, o tubo 8 a 50
mM e o valor da sua absorvncia foi (0,340) e o tubo 9 a 100 mM e o valor da sua absorvncia
foi (0,388). Tanto para o tubo 8 como para o tubo 9, os valores de absorvncia do EDTA foram
superiores ao valor limite do controlo positivo (0,211), o que torna o EDTA uma substncia que
interfere no mtodo de Lowry, quer a 50 mM ou a 100 mM. O EDTA uma substncia
quelante que forma complexos estveis com ies metlicos, tal como o cobre. O EDTA
complexa os ies Cu pelas ligaes peptdicas da protena. Desta forma, passam a existir mais
complexos de cobre na soluo o que faz com que a absorvncia aumente. Tambm se nota
um aumento da intensidade da cor da soluo.
O tubo 11 contm mercaptoetanol 0,5% (m/v) e o valor da sua absorvncia foi
(2,543). O valor de absorvncia do mercaptoetanol muito superior ao valor limite do
controlo positivo (0,211), o que torna o mercaptoetanol numa substncia que interfere no
mtodo de Lowry. O mercaptoetanol uma substncia redutora que tem a capacidade de
quebrar ligaes de persulfureto nas protenas. Apesar de estar em baixa concentrao, a sua
ao redutora muito forte, como se pode verificar pela anlise do valor de absorvncia
obtido.
19

Atravs da anlise cuidada dos resultados da Tabela 4. e Grfico 3 e da anlise dos
resultados obtidos, podemos atestar que o mtodo de Lowry pode ser facilmente afetado pela
adio de substncias ou pela alterao da concentrao dessas substncias. Os agentes
redutores, quelantes, desnaturantes e alguns tampes provocam alteraes no mtodo de
Lowry. Embora o mtodo de Lowry seja muito sensvel e consequentemente um mtodo de
grande exatido h um grande limite de substncias e concentraes destas que podem ser
utilizadas sem afetar a atividade da protena.

3.2.Resumo comparativo dos dois mtodos utilizados no
doseamento das protenas
Aspetos de Comparao Mtodo do Biureto Mtodo de Lowry


Reaes base do mtodo

Coordenao das ligaes
peptdicas com cobre alcalino
e formao do complexo.
Coordenao das ligaes
peptdicas com cobre alcalino
(reao do biureto). Reduo
do reagente de Folin de
tirosina e triptofano.



Exatido


Baixa variao da
absortividade especfica para
diferentes protenas.
Elevada variao da
absortividade especfica para
diferentes protenas devido
variao do contedo de
tirosina e triptofano nas
protenas.

Especificidade
Pouco suscetvel a
substncias interferentes.
Suscetvel a vrios tipos de
interferentes.
Rapidez de execuo Reduzida (1-10mg) Elevada (10-200g)
Preciso Reprodutvel Menos reprodutvel
Necessidade de
equipamento especial
Micropipetas, cuvettes,
espetrofotmetro e vrtex
Micropipetas, cuvettes,
espetrofotmetro e vrtex
Sensibilidade
Reduzida (1-10mg)

Elevada (10-200g)


O biureto, em contacto com substncias que contenham mais de duas ligaes
peptdicas, inclusive, forma um complexo planar de forma quadrada e de cor violeta. Esta
colorao deve-se coordenao dos tomos de azoto, isto pelo io Cu
2+
.

Ilustrao 1-Mtodo do Biureto


20


A formao deste complexo depende das cadeias polipeptdicas presentes nas protenas.
Deste modo no se consta uma elevada variao da absortividade especfica para protenas
diferentes. Este mtodo rpido, a estabilizao da colorao da soluo dura perto de 30
minutos. At 1 hora aps a realizao do processo podemos efectuar leitura dos valores de
absorvncia uma vez que as alteraes no so muito significativas. Isto uma vantagem
relativa ao mtodo de Lowry, pois este segundo apresenta um tempo muito reduzido em que a
amostra fivel. Por outro lado este mtodo menos sensvel, cerca de 100 vezes menos que
o mtodo de Lowry, sendo uma vantagem deste ltimo, sendo tambm um fator
determinante na escolha do mtodo a usar, uma vez que por norma usamos solues com
concentraes muito reduzidas.
O mtodo do Biureto, ao contrrio do mtodo de Lowry no suscetvel a vrios
agentes interferentes, nomeadamente solues tampo, agentes quelantes, desnaturantes e
redutores, que podem originar falsos negativos ou positivos.

J no mtodo de Lowry, as rees tm colorao num tom azul intenso que se deve
coordenao das ligaes peptdicas com o cobre e a reduo do reagente de Folin por
resduos presentes nas protenas de tirosina e triptofano. A colorao dependente do
contedo dos resduos de aminocidos sendo assim a colorao vai diferir com diferentes
protenas em iguais concentraes. Por este motivo a absortividade especfica varia para
diferentes tipos de protenas (o que no acontece no mtodo do biureto).
Neste ultimo mtodo verifica-se que a lei de Beer-Lamber vlida numa pequena faixa
de concentrao de protenas, sendo necessrio a diluio da amostra para que a
concentrao pertena a um intervalo possvel de efectuar a medio da absorvncia.

Condies de aplicabilidade dos mtodos
Atendendo elevada diferena na aplicabilidade dos mtodos em estudo, o mtodo
de Lowry deve ser utilizado quando a amostra em estudo apresenta concentraes proteicas
muito baixas, visto que este mtodo significativamente mais sensvel que o mtodo do
biureto.
Na impossibilidade de se eliminarem certos agentes interferentes e dado que o
mtodo de Lowry mais susceptvel a estes agentes, deve ser utilizado neste caso o mtodo
do biureto.
Concluindo, o mtodo de Lowry deve ser aplicado no caso de se estudar uma
quantidade reduzida de protena, havendo disponibilidade para se testar se no existem
agentes interferentes. O mtodo do biureto deve ser aplicado se, em estudo, tivermos uma
amostra com elevada quantidade de protena.

4. Bibliografia
Lehninger Principles of Biochemistry , 6th Edition David L. Nelson, Michael M. Cox
Quintas, A., Halpern, M.J., Freire, A.P. Eds., Bioqumica Organizao Molecular da
Vida, Lidel, Lisboa, 2008
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