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PRCTICAS DE PROTEMICA
GRADO EN BIOTECNOLOGA
CURSO 3

NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD

Consideraciones previas. En cada laboratorio es necesario prever que cualquier
incidente que pueda afectar al funcionamiento de la Universidad, tenga una incidencia
nula o mnima sobre las personas, las instalaciones y/o la continuidad de las actividades.
La organizacin del laboratorio debe permitir la correcta gestin de la prevencin del
riesgo, imbuida en los propios procedimientos de trabajo, prcticas y actividades.

Cualquier persona que realice sus actividades en el laboratorio debe conocer:
Reglamento de funcionamiento del laboratorio.
Riesgos para la seguridad y la salud de los productos qumicos existentes.
Riesgo biolgico de los agentes biolgico empleados.
Manual de Autoproteccin de emergencias de la UMH.
Itinerarios y salidas de emergencia generales y particulares.
Localizacin y sealizacin de lavaojos y/o duchas de seguridad, extintores (su
funcionamiento y adecuacin) e interruptores de suministro elctrico.
Localizacin de los botiquines.
Riesgos para el medio ambiente de los productos qumicos existentes.
En esta introduccin se pretende que el alumno tome contacto con el laboratorio, para lo
cual se le indicarn las normas generales de comportamiento en el mismo, las reglas de
seguridad que hay que observar, las normas especficas en caso de accidente, as como
las normas generales para la realizacin de las prcticas de la asignatura.

Normas generales del laboratorio

1. El alumno tiene la obligacin de leer y estudiar con anticipacin las experiencias a
realizar en el laboratorio. El fundamento terico, si lo desconoce, deber buscarlo en los
libros adecuados.
2. A la hora sealada para el comienzo de las prcticas el alumno deber estar en el
lugar correspondiente y en su puesto. Ser obligatorio usar una bata blanca. No disponer
de la bata blanca implica no poder realizar la prctica de ese da.
3. Durante el horario de prcticas no se podr salir del laboratorio sin permiso del
profesor.
4. Est prohibido realizar pruebas diferentes a las indicadas en este cuaderno de
prcticas. El alumno se ceir escrupulosamente al mismo.
5. Se valorar la actitud y el comportamiento general que cada alumno adopte durante
la realizacin de las prcticas, aspecto ste determinante de la nota final.

Reglas de seguridad
Cuando se trabaja en el laboratorio, tanto de prcticas como de investigacin, uno se
puede exponer a una serie de sustancias cuya caracterstica ms importante, desde el
punto de vista de la seguridad, es su toxicidad y peligrosidad. Una actitud de vigilancia
y atencin es imprescindible en todo momento, aunque no se est haciendo nada. Pensar
y actuar de forma segura es parte integral de la educacin qumica. No debe realizarse
ningn experimento antes de estar seguro de que se comprende bien lo que se va a
hacer, y tras dar respuesta a estas dos preguntas: Qu es lo peor que puede pasar?
Cmo lo puedo solucionar? Preguntar a los profesores, en caso de duda, es una buena
costumbre. Para evitar accidentes e incidentes desagradables es necesario el extremar
las precauciones. El seguimiento estricto de las siguientes normas evitar al mximo la
posibilidad de accidentes en el laboratorio.

1. En primer lugar mantener en todo momento las batas y los vestidos abrochados
(proteccin frente a salpicaduras y derrames).
2. No llevar pulseras, colgantes o mangas anchas que puedan engancharse en los
montajes. Debern lavarse las manos antes y despus de entrar y salir del laboratorio y
siempre que hubiera contacto con algn producto qumico.
3. Se evitar llevar, pantaln corto, faldas cortas, sandalias, zapatos abiertos, etc.; por
razones de proteccin de la piel.
4. En el laboratorio est prohibido comer, beber o fumar. No se debe encender ninguna
llama ni mechero en el laboratorio.
5. No conectar aparatos elctricos sin asegurarse de que no hay peligro de vapores de
disolventes prximos. No colocar jams productos inflamables cerca de fuentes de
calor. Muchas sustancias orgnicas inflamables originan vapores ms densos que el aire,
capaces de desplazarse distancias considerables por encima de la mesa de laboratorio.
6. Se tomarn las precauciones necesarias al trabajar con cidos, bases o sustancias
peligrosas para evitar accidentes. Si se utilizan sustancias en forma de polvo fino, se
deber de utilizar mascarilla fundamentalmente en el momento de la pesada para evitar
su inhalacin. Como norma general, para pipetear disoluciones o sustancias nocivas
lquidas o en caso de duda, se utilizar una propipeta. Los disolventes orgnicos no se
vertern por las pilas, sino que se almacenarn en los recipientes dispuestos para tal fin.
Los cidos y bases concentrados se neutralizarn, y la disolucin salina resultante se
verter con los grifos abiertos.
7. Una norma general para la preparacin de disoluciones de cidos fuertes es que
siempre se adicionar el cido sobre el agua o disolucin acuosa, al fin de evitar la
proyeccin de esta ltima como consecuencia del calentamiento brusco al mezclarse
ambas disoluciones. Si fuera necesario calentar el contenido de un tubo de ensayo a la
llama, se har con el tubo algo inclinado, agitando suavemente y con la boca del tubo
dirigida hacia un lugar en que no haya ninguna persona.
8. Evitar el contacto fsico con disolventes orgnicos. No respirar vapores de
disolvente. (Ver apartado sobre "riesgos asociados a los disolventes"). Cuando se
utilicen sustancias voltiles (disolventes orgnicos como el cloroformo, ter, etc.) se
manipularn en la campana de gases utilizando, si es necesario, una mascarilla.
9. Las gafas de proteccin son obligatorias cuando el profesor as lo indique. No usar
nunca lentes de contacto (los vapores orgnicos podran daarlas; por otro lado, los
reactivos custicos no pueden ser eliminados del ojo si las lentillas estn puestas). Fjate
dnde estn situados los baos lavadores de ojos.
10. Usar guantes protectores cuando el profesor lo indique. En caso de contacto de
productos corrosivos o irritantes ver indicaciones ms abajo.
11. El material del laboratorio ha de estar siempre limpio y seco, sin restos de sustancias
anteriores. Los residuos se tratarn de la siguiente forma:
A) Material de cristal roto, papeles y otros. Se tirar en los recipientes destinados
especialmente a este fin.
B) Productos qumicos txicos. Se tirarn en contenedores especiales para este fin. No
tires directamente al fregadero los productos especialmente txicos.
C) Sustancias lquidas o disoluciones. Los que puedan verterse al fregadero, se
diluirn previamente, sobre todo si se trata de cidos y de bases. No tires al fregadero
productos o residuos slidos que puedan atascarlas. En estos casos deposita los residuos
en recipientes adecuados.
En el caso que se genere un derrame de residuos peligrosos durante la realizacin de la
prctica, el papel que se utilice para su recogida tambin ser depositado en el
contenedor establecido para ese grupo de residuos peligrosos. En caso de duda,
preguntar a algn responsable cmo proceder.
12. Una norma general que se aade a las citadas y que contribuye a la seguridad en el
laboratorio es la del rigor y orden en el laboratorio. Con ello queremos resaltar que en
todo momento se ha de mantener una limpieza y orden adecuados en el laboratorio.
13. Ante cualquier duda o si se produce algn accidente, avisar rpidamente al profesor.

Normas de actuacin
Orden y limpieza. El orden es fundamental para evitar accidentes. Mantener el rea de
trabajo ordenada, sin libros, abrigos, bolsas, exceso de botes de productos qumicos y
cosas innecesarias o intiles. Mantener las mesas siempre limpias. Se tienen que limpiar
inmediatamente todos los productos qumicos derramados. Limpiar siempre
perfectamente el material y aparatos despus de su uso.
Responsabilidad. Trabajar sin prisas, pensando en cada momento lo que ests
haciendo, y con el material y reactivos ordenados. No se debe gastar bromas, correr, etc.
en el laboratorio. No realizar un experimento no autorizado. Un comportamiento
irresponsable puede ser motivo de accidentes no deseados y comportar la expulsin
inmediata del laboratorio.
Atencin a lo desconocido. No utilizar ni limpiar ningn recipiente de reactivos que no
lleve etiqueta. Entregadlo inmediatamente al profesor. No sustituir nunca, sin
autorizacin previa del profesor, un producto qumico por otro en un experimento. No
utilizar un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento. No usar una
pipeta directamente con la boca, sino a travs de un sistema de aspiracin.
Manipulacin del vidrio. No forzar un tubo de vidrio, ya que, en caso de ruptura, los
cortes pueden ser graves No usar nunca equipo de vidrio que est agrietado o roto.
Depositar el material de vidrio roto en un contenedor para vidrio, no en una papelera.
Manipulacin de productos qumicos.
- Los productos qumicos pueden ser peligrosos por sus propiedades txicas, corrosivas,
inflamables o explosivas. Muchos reactivos, particularmente los disolventes orgnicos,
arden en presencia de una llama.
Transporte de reactivos. No transportar innecesariamente los reactivos de un sitio a
otro del laboratorio. Las botellas se transportan siempre cogindolas por el fondo, nunca
del tapn.

Actuaciones en caso de accidente
1. En caso de accidente, avisar inmediatamente al profesor. En caso de gravedad
llamar al 112, o al telfono de la universidad 8665. No llevar a cabo actuaciones
inseguras; si se realizan primeros auxilios, hay que estar seguro/a de no empeorar el
estado del accidentado (proteccin) y asegurarse uno mismo de no sufrir riesgo
(autoproteccin).
2. Fuego en el laboratorio. Evacuad el laboratorio, de acuerdo con las indicaciones
del profesor y la sealizacin existente en el mismo. Si el fuego es pequeo y
localizado, apagadlo utilizando un extintor adecuado, arena, o cubriendo el fuego con
un recipiente de tamao adecuado que lo sofoque. Retirad los productos qumicos
inflamables que estn prximos fuego. No utilizar nunca agua para extinguir un fuego
provocado por la inflamacin de un disolvente. En caso de que el fuego sea importante,
accionar el pulsador de alarma
3. Fuego en la ropa. Si se incendia la ropa, pedir ayuda inmediatamente. Tumbarse en
el suelo y rodar sobre ti mismo para apagar las llamas. No correr (al hacerlo se aviva el
fuego) ni intentar llegar a la ducha de seguridad si no est muy cerca. Ayudad a alguien
que se est quemando. Cubridle con una manta anti fuego, conducidle hasta la ducha de
seguridad, si est cerca, o hacedle rodar por el suelo. No utilizar nunca un extintor sobre
una persona. Una vez apagado el fuego, mantener a la persona tendida, procurando que
no coja fro y proporcionarle los primeros auxilios hasta la llegada de la asistencia
mdica.
4. Quemaduras. Las pequeas quemaduras producidas por material caliente, baos,
placas o mantas calefactoras, etc., se trataran lavando la zona afectada con agua fra
durante 10-15 minutos. Desinfectar (por ej. con yodo) y cubrir con gasas. No aplicar
ungentos o sustancias (pasta de dientes, leja, etc.) ni punciones o retirar las ampollas
si aparecen. Las quemaduras ms graves requieren atencin mdica inmediata.
5. Cortes. Los cortes producidos por la rotura de material de cristal son un riesgo
comn en el laboratorio. Se deben lavar bien, con abundante agua corriente, durante 10
minutos como mnimo. Si son pequeos y dejan de sangrar en poco tiempo, lavadlos
con agua y jabn, aplicar un antisptico y taparlos con una venda o apsito adecuados.
Si son grandes o muy profundos y no paran de sangrar, solicitar asistencia mdica
inmediata. No retirar ni manipular un posible cuerpo extrao enclavado.
6. Actuacin en caso de inhalacin de productos qumicos. Conducir
inmediatamente a la persona afectada a un sitio con aire fresco. Requerir asistencia
mdica inmediata. Al primer sntoma de dificultad respiratoria debe iniciarse la
respiracin artificial boca a boca. Identificar, si es posible, el gas causante, usar la
mscara adecuada y si no la hay, aguantar la respiracin mientras se extingue el vapor
(abriendo ventanas, usando campanas, etc.). Tratar de no exponerse en cualquier caso.
7. Actuacin en caso de ingestin de productos qumicos. Antes de cualquier
actuacin concreta pedir asistencia mdica. Si el paciente est inconsciente, ponerlo
tumbado, con la cabeza de lado. Taparlo con una manta para que no tenga fro. No
dejarlo slo. No darle lquidos, ni provocar el vmito.
8. Derrame o proyeccin de productos qumicos sobre la piel. Los productos
qumicos que se hayan vertido sobre la piel han de ser lavados inmediatamente con agua
corriente abundante, como mnimo durante 15 minutos. En el caso de productos
corrosivos, adems de lo anterior, tambin se retirar o cortar lo ms rpidamente
posible la ropa, evitando salpicaduras a otras partes del cuerpo. Las duchas de seguridad
instaladas en los laboratorios sern utilizadas en aquellos casos en que la zona afectada
del cuerpo sea grande y no sea suficiente el lavado en un fregadero. Es necesario sacar
toda la ropa contaminada a la persona afectada lo antes posible mientras est bajo la
ducha. Recuerda que la rapidez en el lavado es muy importante para reducir la gravedad
y la extensin de la herida. Proporcionar primeros auxilios hasta la llegada de asistencia
mdica a la persona afectada. Avisar a tu profesor. Si un producto qumico entra en
contacto con tus ojos, el tiempo es esencial, sobre todo si el producto es corrosivo
(actuad en menos de 10 segundos). Cuanto antes se lave el ojo, menos grave ser el
dao producido. Lava los dos ojos con agua corriente abundante durante 15 minutos
como mnimo en una ducha de ojos, y, si no hay, con un frasco para lavar los ojos. Es
necesario mantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el lavado
debajo de los prpados. Es necesario recibir asistencia mdica, por pequea que parezca
la lesin. Cuidado: no usar demasiada potencia de chorro de agua, para evitar lesiones al
ojo.

Normas generales para la realizacin de las prcticas
1 Antes de comenzar la prctica deber revisar que dispone de todo el material y
productos necesarios para la misma, y que se encuentra todo limpio y en orden. Se
notificar al profesor cualquier anomala. Al finalizar la prctica dejar todo el material
perfectamente limpio y ordenado, avisando al profesor de haber terminado antes de
abandonar el laboratorio.
2 Las pipetas deben estar bien limpias y secas antes de ser utilizadas. Pipetear siempre
con la propipeta adecuada. No pipetear entre varias personas.
3 Todos los frascos, botellas, etc., han de estar correctamente etiquetados y cerrados,
evitando que se confundan los tapones. Los recipientes donde se almacenan sustancias y
disoluciones se deben marcar adecuadamente utilizando rotuladores, lpices de cera o
etiquetas. En cada caso se indicar la sustancia de que se trata y su concentracin, as
como la fecha de preparacin.
4 Se deben de anotar en el cuaderno de prcticas las disoluciones preparadas y su
concentracin, as como el volumen preparado de cada una.
5 Todos los frascos y botellas que contienen los reactivos preparados debern situarse
en el fondo de la bancada o mesa de trabajo, evitando dejarlos en los bordes.
6 Cada alumno (con independencia de que haya formado parte de un grupo de varias
personas) deber presentar un informe de resultados de cada prctica en la forma
indicada por el profesor.
7 Ante cualquier duda preguntar al profesor de prcticas.
8 Se recuerda que para APROBAR la asignatura es necesario superar las prcticas.
Las prcticas son obligatorias y la no asistencia a las mismas, salvo causa de fuerza
mayor, implica la necesidad de superarlas en una PRUEBA TERICA Y/O
PRCTICA, DE ACUERDO CON LAS DIRECTRICES DE LA ASIGNATURA.

Riesgos asociados a los disolventes
Es esencial recordar que la mayora de los disolventes orgnicos son inflamables, y
arden si estn expuestos a una llama. Adems, muchos son txicos o carcingenos. Por
ejemplo, muchos disolventes clorocarbonados, si se acumulan en el organismo, causan
un deterioro del hgado similar a la cirrosis originada por uso excesivo de etanol. El
cloroformo y el ter son anestsicos, causando somnolencia y nuseas. En otras
palabras, los disolventes orgnicos son tan peligrosos como los compuestos qumicos
corrosivos (p. ej. el cido sulfrico). A continuacin se citan algunos ejemplos:

cido actico glacial: es suficientemente corrosivo para causar quemaduras. Sus
vapores pueden irritar los ojos y los conductos nasales.
Acetona: no es muy txica comparada con otros disolventes. Sin embargo es MUY
inflamable.
Benceno: se absorbe fcilmente a travs de la piel, y puede afectar a la mdula sea y
provocar leucemia. Est considerado como agente carcingeno y afecta al hgado y los
riones. Adems es muy inflamable.
Diclorometano: no es inflamable y no est considerado como carcingeno. Si se
ingiere puede deteriorar el hgado, y sus vapores pueden originar somnolencia y
nuseas.
Etanol: es un conocido agente txico y es extremadamente inflamable.
ter etlico: es extremadamente inflamable y puede originar explosiones (presencia de
perxidos). No es particularmente txico, pero en grandes concentraciones puede
originar somnolencia y nuseas.
Hexano, pentano, ter de petrleo: pueden irritar el tracto respiratorio y la piel.
Tambin pueden actuar como txico y depresivos del sistema nervioso central. Son
altamente inflamables.
Metanol: ms txico que el etanol, provoca por ingestin ceguera y muerte. Es muy
inflamable.
Tolueno: no est considerado como agente carcingeno, pero es tan txico como el
benceno. Puede actuar como anestsico, y afectar al sistema nervioso central.


He ledo y entiendo las Normas de Seguridad y los Riesgos
Asociados al laboratorio

Nombre:_________________ _____________
Apellidos: _____________________________
DNI: _________________________________
Curso Acadmico:__________ ____________
Grado:___________________ _____________


Firma:



NORMAS ESPECFICAS EN CASO DE ACCIDENTE

1) En caso de que ocurra cualquier accidente AVISA, o haz avisar, inmediatamente AL
PROFESOR DE PRCTICAS ms cercano. Si se precisa ayuda externa recordar que el
telfono de emergencia de la Universidad es: 966 658665 (8665 para llamada interna).

2) Si un producto qumico entra en contacto con tus ojos, corre al bao lavador de ojos ms
prximo, y lvalos con abundante cantidad de agua. Ten cuidado de no usar demasiada
potencia de chorro de agua, para evitar lesiones al ojo. Avisa, o haz avisar, inmediatamente
al profesor de prcticas ms cercano.

3) Si se declara un incendio, el mejor consejo es apartarse de l y dejar que el profesor de
prcticas se encargue de la situacin. No te dejes dominar por el pnico, razona!. Si el
fuego es pequeo puede apagarse poniendo encima una manta ignfuga. Si el fuego est
concentrado en el interior de un matraz o vaso de precipitados, puede ser asfixiado
simplemente tapando la boca del matraz/vaso de precipitados con un vidrio de reloj o un
vaso ms grande. Si estas soluciones no funcionan, o si el fuego es de amplias
proporciones hay que recurrir a los extintores de CO2. Nunca uses agua. Siempre avisa, o
haz avisar, inmediatamente al profesor de prcticas ms cercano.

4) Si tu ropa se incendia no corras (avivaras las llamas). Avanza decididamente hacia la
manta ignfuga o ducha ms cercana. Envolver la zona en llamas con la manta bastar para
zanjar el incidente. Avisa, o haz avisar, inmediatamente al profesor de prcticas ms
cercano.

5) Si sufres pequeas quemaduras por haber tocado objetos calientes "refrigera" la zona
con abundante agua fra. Acude a un profesor de prcticas, pues en el botiqun hay cremas
para estos casos.

6) En caso de quemadura por producto qumico, este habr de ser neutralizado. Si el
responsable ha sido un cido se puede emplear una disolucin diluida de bicarbonato
sdico; en caso de haber sido una base, se puede usar cido actico al 2%. Avisa, o haz
avisar, inmediatamente al profesor de prcticas ms cercano.

7) En caso de corte, lavar la herida con abundante agua. Avisa, o haz avisar,
inmediatamente al profesor de prcticas ms cercano.

Riesgos asociados a los disolventes

Es esencial recordar que la mayora de los disolventes orgnicos son inflamables, y arden
si estn expuestos a una llama. Adems, muchos son txicos o carcingenos. Por ejemplo,
muchos disolventes clorocarbonados, si se acumulan en el organismo, causan un deterioro
del hgado similar a la cirrosis originada por uso excesivo de etanol. El cloroformo y el ter
son anestsicos, causando somnolencia y nuseas. En otras palabras, los disolventes
orgnicos son tan peligrosos como los compuestos qumicos corrosivos (p. ej. el cido
sulfrico), aunque manifiestan sus efectos de manera ms soterrada. A continuacin se
citan algunos ejemplos:

Acido actico glacial: es suficientemente corrosivo para causar quemaduras. Sus vapores
pueden irritar los ojos y los conductos nasales.
Acetona: no es muy txica comparada con otros disolventes. Sin embargo es
extremadamente inflamable.
Benceno: se absorbe fcilmente a travs de la piel, y puede afectar a la mdula sea y
provocar leucemia. Est considerado como agente carcingeno. Tambin afecta al hgado y
los riones. Adems es muy inflamable. Siempre se sustituir por tolueno.
Diclorometano: no es inflamable y, a diferencia de otros disolventes clorocarbonados, no
est considerado como carcingeno. Es menos txico que el cloroformo y el tetracloruro de
carbono, aunque si se ingiere puede deteriorar el hgado, y sus vapores pueden originar
somnolencia y nuseas.
Etanol: es un conocido agente intoxicante y es extremadamente inflamable.
Eter etlico: es extremadamente inflamable (est considerado como el disolvente habitual
ms inflamable que existe, debido a su volatilidad y a que sus vapores son ms densos que
el aire) y puede originar explosiones (debido a la presencia de perxidos). No es
particularmente txico, pero en grandes concentraciones puede originar somnolencia y
nuseas.
Hexano, pentano, ter de petrleo: pueden irritar el tracto respiratorio y la piel. Tambin
pueden actuar como intoxicantes y depresivos del sistema nervioso central. Son altamente
inflamables.
Metanol: es ms txico que el etanol, pudiendo provocar, por ingestin, ceguera y
muerte. Es extremadamente inflamable.
Tolueno: no est considerado como agente carcingeno, pero es tan txico como el
benceno. Puede actuar como anestsico, y afectar al sistema nervioso central.



Grado en Biotecnologa. Curso 3. PROTEMICA
PRCTICAS DE LABORATORIO. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
Profesores: M Isabel Martnez-Lacaci y Vicente Micol
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Electroforesis Bidimensional de Protenas (2DE)
1. Introduccin
La combinacin de las tcnicas de isoelectroenfoque y la electroforesis en geles
desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS) supone una tcnica poderosa para conseguir
separaciones de mezclas complejas de protenas. Los geles de isoelectroenfoque en tubo
o en capilar han sido utilizados clsicamente pero presentan problemas relacionados con
la difusin del gradiente de pH o la variabilidad en su formacin. En cambio, el uso de
las tiras de gel en gradiente de pH inmovilizado (IPG strips) elimina estos problemas.
Estas tiras estn compuestas por derivados de acrilamida tamponada con grupos
carboxilo y aminas terciarias que estn copolimerizados en la red de acrilamida. A
diferencia de los clsicos anfolitos, este gradiente de pH no difunde durante la
electroforesis obtenindose separaciones de isoelectroenfoque bastante reproducibles y
baratas.
En la presente prctica se pretende la familiarizacin del alumno con la utilizacin del
equipo ProteanIEF cell (Biorad) y el manejo correcto de las tiras de poliacrilamida
para realizar con xito una electroforesis bidimensional (2DE). Las muestras a utilizar
sern protenas extradas de un cultivo de una cepa de Escherichia coli (CECT 515) que
se lisarn para la extraccin de la protena, y sern comparadas con un patrn de
protena de E. coli defuente comercial.
2. Material y Reactivos

Material
- Micropipetas y puntas
- Pipetas de vidrio
- Gradillas
- Tubos Corning
- Probetas
- Vaso de precipitados
- Peso
- Centrfuga
- Sonicador de bao
- Vortex
- Espectrofotmetro
- Cubetas
- Tubos de vidrio
- Strip IPG 7cm pH 3-10
- Gel de poliacrilamida 2-D PAGE
- Fuente de electroforesis
- Cubetas de electroforesis Mini-Protean
- Equipo ProteanIEF cell y accesorios



Reactivos
- Tampn de lisis
- Tampn de rehidratacin
- Disolucin de equilibrado
- Reactivo de Bradford
- Tampn PBS 1X
- Albmina de suero bovino (BSA)
0.1mg/mL
- Tampn de nodo
- Tampn de ctodo
- Metanol
- cido actico
- Azul Coomassie
- Patrn de peso molecular
- Extracto de protena de E.coli

Grado en Biotecnologa. Curso 3. PROTEMICA
PRCTICAS DE LABORATORIO. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
Profesores: M Isabel Martnez-Lacaci y Vicente Micol
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NOTA IMPORTANTE: Llevar siempre guantes cuando se manejen las tiras IPG, las
soluciones o las partes del equipo en contacto con las tiras para evitar contaminaciones
debido principalmente a la queratina de la piel.


3. Procedimiento
3.1. Primera Sesin. Extraccin de protena e isoelectroenfoque
(IEF)
Preparacin de la muestra (da previo a la prctica)
Preparar un preinculo de cultivo sembrando una colonia bacteriana en 5 mL de medio
LB e incubar durante toda la noche con agitacin a 37C.
Al da siguiente coger los 5 ml del inculo y diluirlos en 50 mL de LB. Incubar durante
3 horas a 37C para obtener un cultivo bacteriano en fase exponencial.
Centrifugar el cultivo bacteriano a 1000xg (1500 rpm en la centrfuga de prcticas)
durante 15 min y conservar el precipitado de bacterias para la realizacin de la prctica.
Guardar uno de los precipitados despus de escurrir todo el sobrenadante para liofilizar
y realizar los clculos posteriores relativos al rendimiento de protena.

DA 1

Lisis bacteriana
Se proceder a realizar la lisis bacteriana mediante un tampn de lisis y varios ciclos de
sonicacin para provocar la ruptura de la pared bacteriana. Los grupos de prcticas se
repartirn en dos bloques para llevar a cabo dos tipos de lisis bacteriana (consultar con
el profesor).
Grado en Biotecnologa. Curso 3. PROTEMICA
PRCTICAS DE LABORATORIO. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
Profesores: M Isabel Martnez-Lacaci y Vicente Micol
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Protocolo de lisis:
- Aadir 2 mL de tampn PBS 1X al precipitado de bacterias y centrifugar a 1000xg
durante 10 min en una centrfuga de mesa. Eliminar el sobrenadante y aadir 2 mL
de tampn de lisis A o B (*preguntar al profesor de prcticas sobre el tampn de
lisis a utilizar).
- Sonicar en el bao de utrasonidos durante 10 min y despus agitar vigorosamente la
muestra en el vortex durante 5 min (realizar este ciclo al menos 2 veces).
- Centrifugar a 1000xg durante 10 min.
- Guardar el sobrenadante en fro y descartar el precipitado. Comprobar el volumen
total de protena para la determinacin posterior de la concentracin de protena.
*Tipos de buffer de lisis:
Tampn de lisis A: Tris 20 mM, pH 7.0
Tampn de lisis B: Urea 3M, CHAPS 0.5% (3-[(3-
colamidopropil) dimetilamonio]-1-
propanosulfonato), DTT 5 mM.
Rehidratacin de las IPG strips mediante el mtodo de rehidratacin pasivo
Segn el grupo de prcticas, se realizar el isoelectroenfoque con una de las tres
muestras diferentes. Por una parte se procesarn dos tipos distintos de lisis (muestra A,
tres grupos; y muestra B, tres grupos) de un cultivo bacteriano de E. coli CECT 515 y
una tercera muestra proceder de un patrn de E. coli de fuente comercial (muestra C),
cuatro grupos.
Muestra A y B. Poner 50 L del sobrenadante de protenas de la lisis en un tubo
eppendorf y llevarlo hasta un volumen final de 130 L con tampn de rehidratacin
(Urea 8M, CHAPS 2%, 50 mM DTT, 0.4% de disolucin de anfolitos [Bio-Lyte 3-10],
trazas de bromofenol). El tampn de hidratacin utilizado consiste en una disolucin
1X. Las trazas de azul de bromofenol sirven para visualizar la muestra en el gel.
Mezclar suavemente y centrifugar durante unos segundos para perder el mnimo
volumen al tomar con la pipeta.







Grado en Biotecnologa. Curso 3. PROTEMICA
PRCTICAS DE LABORATORIO. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
Profesores: M Isabel Martnez-Lacaci y Vicente Micol
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Muestra C. En un tubo eppendorf poner 15 L del patrn de protenas de E. coli (1.59
g/L) y aadir 120 L de tampn de rehidratacin. Mezclar suavemente y
centrifugar durante unos segundos para perder el mnimo volumen.
Comentar con el profesor de prcticas cmo se va a realizar la distribucin de las
muestras en la cubeta de hidratacin/equilibrado del equipo Protean IEF.
Visualizar el tutorial de uso de las IPGs strips en:
http://www.bio-rad.com/prd/es/ES/LSR/PDP/56994cbe-ea1b-48d8-b7e9-
bc17726c0d70/ReadyStrip-IPG-Strips

Tomar el total de cada una de las muestras con una micropipeta (P200) y distribuirlo
cuidadosamente a lo largo de cada una de las calles de la cubeta de equilibrado, con
cuidado de no invadir el resto de las calles. La muestra debe ocupar toda la calle de
manera uniforme y sin formar burbujas pues stas pueden interferir con la distribucin
de la muestra en el strip.
Quitar cuidadosamente el plstico del IPG strip con la ayuda de unas pinzas. Posicionar
la tira con la cara de acrilamida hacia abajo y depositarlo lentamente sobre la disolucin
de protena evitando la formacin de burbujas, tal y como se observa en la figura
(preguntar al profesor de prcticas por el modo correcto de hacerlo). Observar la
posicin del polo + y el rango de pH marcados en la tira. Evitar que la disolucin de
protena sobrepase el plstico de la tira pues esta porcin no se absorber en la
acrilamida. Evitar la formacin de burbujas debajo de la tira, si esto ocurriera, levantar
la tira y depositarla de nuevo para eliminarlas.
Almacenar a temperatura ambiente durante un mnimo de 1 hora para que la tira absorba
completamente la protena (en la prctica utilizaremos 1,5 hr). A veces se requieren
hasta 12 h para una rehidratacin completa de las tiras y la incorporacin de la protena
a las mismas. En estos casos se utilizar aceite mineral para eliminar evaporaciones.









Grado en Biotecnologa. Curso 3. PROTEMICA
PRCTICAS DE LABORATORIO. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
Profesores: M Isabel Martnez-Lacaci y Vicente Micol
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Isoelectroenfoque (IEF)
Sacar la tira cuidadosamente de la cubeta de equilibrado y escurrir el aceite mineral
apoyndola de forma vertical sobre un papel de filtro durante unos segundos. Lavar la
cubeta cuidadosamente para reutilizarla despus del IEF. Alternativamente situar la tira
con el plstico hacia arriba para drenar el aceite sobre papel de filtro y poner otra lamina
de papel de filtro suavemente para eliminar el exceso de protena (opcional).
Colocar sobre los electrodos de la cubeta de isoelectroenfoque unos filtros de celulosa
precortados empapados en 10 L de agua bidestilada para facilitar la transmisin de la
corriente. Dichos filtros son importantes como receptculo de sales y otros
constituyentes no anfteros, lo que permite una mejora en la calidad de los resultados y
una conduccin ms eficaz de la corriente. Asegurarse de que la cubeta est
perfectamente limpia.
Situar la tira IPG en la cubeta de IEF con la acrilamida hacia abajo y sobre los filtros de
manera que el polo positivo de la tira
quede orientado hacia el nodo (+) de la
placa de electroforesis.
Aadir 2 mL de aceite mineral sobre el
IPG strip para evitar la evaporacin de la
muestra durante el transcurso del
isoelectroenfoque. Aadir el aceite
lentamente depositndolo sobre el
plstico de la tira trasladando lentamente
la pipeta.

Protocolo de voltaje del equipo Protean IEF cell
El isoelectroenfoque se realiza mediante una
combinacin de distintas rampas de voltaje. A
continuacin se citan los parmetros
programados en el equipo para la realizacin
del isoelectroenfoque y el programa de rampas
de voltaje:

Condiciones
- Voltaje mximo: 4000 v
- Voltaje por horas: 10500v-h
- Lmite de corriente: 50 A por strip IPG para prevenir sobrecalentamiento.
- Temperatura de isoelectroenfoque: 20C
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Etapas
1. Etapa de acondicionamiento: 250 v durante 20 min (esta etapa inicial se utiliza para
eliminar cargas contaminantes de sales e iones).
2. Rampa de voltaje:
1 h a 500 voltios con gradiente rpido
1 h a 2000 voltios con gradiente rpido
1 h a 4000 voltios con gradiente rpido
3. Etapa final del electroenfoque:
1 h a 4000 voltios con gradiente linear
4. Etapa de mantenimiento: se mantiene a 500 v hasta que se detiene el equipo para
evitar la difusin de las protenas.

Realizar el isoelectroenfoque durante 5-6 horas (el profesor de prcticas terminar el
isoelectroenfoque). Despus del isoelectroenfoque, si no se va a efectuar la segunda
dimensin de forma inmediata, se sacan las tiras de la cubeta, se escurre el exceso de
aceite mineral durante unos segundos y se almacenan las tiras en la cubeta de
equilibrado (limpia, seca y cubierta por plstico transparente a -80 C) con la cara que
contiene la acrilamida hacia arriba. Al da siguiente se proceder a realizar la etapa de
equilibrado antes de llevar a cabo la segunda dimensin.


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DA 2

3.2. Segunda dimensin. Gel de poliacrilamida desnaturalizante
(SDS-PAGE)

Preparacin del gel de poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE) para
electroforesis

Para realizar esta electroforesis no es necesario preparar un gel concentrador puesto que
las protenas se encuentran concentradas en una tira de reducido tamao, por tanto, se
proceder directamente a realizar un gel separador del 12% de acrilamida mediante el
siguiente protocolo:
- Aadir los siguientes reactivos en un vaso de precipitado de 25 mL, dejando el
persulfato amnico y el TEMED para el final (las cantidades de la siguiente
tabla son para la preparacin de un gel).









- En esta fase de la prctica se utilizarn cubetas Mini-Protean Tetra cell, capaces
de alojar hasta cuatro geles de poliacrilamida cada una (4 grupos). Consultar con
el profesor de prcticas el modo de ensamblaje de los cristales en cada una de
ellas (pag. 10).
- Preparar el sistema de cristales con sus espaciadores en el sistema MiniProtean
Tetracell para proceder a la polimerizacin del gel entre los cristales. Una vez
montados los cristales, aadir un poco de agua destilada para asegurarse de que
el sistema no pierde.
- Mientras se agita suavemente, agregar 70 L de PSA a la mezcla de preparacin
del gel y, a continuacin, aadir 7 L de TEMED. Mezclar y verter
cuidadosamente entre los cristales con una pipeta hasta aproximadamente 0,5 cm
desde el borde superior del cristal pequeo. Aadir lentamente agua destilada
para cubrir todo el molde y obtener una superficie superior rectilnea.
Gel separador de 12% de acrilamida
Agua (mL) 3.25
Tris 1,5 M (mL) pH 8.8 2.5
SDS 10% (L) 100
Acrilamida (mL) 4.08

PSA (L) 70
Temed (L) 7
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- Dejar polimerizar durante al menos 20 min. Una vez polimerizado el gel,
eliminar bien el agua destilada utilizando un poco de papel de filtro (eliminar el
agua justo antes de introducir la tira de IEF).


Equilibrado de la tira IPG

En algunos casos, despus de terminar el IEF, las tiras pueden ser teidas con azul de
Coomassie R-250 para comprobar si el isoelectroenfoque ha transcurrido de forma
adecuada.


Sacar la tira IPG del congelador y atemperar durante unos 10 minutos en la cubeta de
rehidratacin/equilibrado (no sobrepasar este tiempo para evitar la difusin de las
protenas). Confirmar que la tira tiene la cara de acrilamida hacia arriba. Cuando estn
congeladas, las tiras son opacas debido a la precipitacin de la urea en fro.
Una vez atemperada la tira, se procede al equilibrado de la misma. Para ello, se aaden
sobre la tira 2 mL de disolucin de equilibrado I (Urea 6 M, Tris-HCl 0.375 mM pH
8.8, SDS 2%, Glicerol 20%, DTT 2% (p/v)). Esta disolucin ha de ser preparada fresca
previamente a su utilizacin. Agitar lentamente durante 15 min en un agitador orbital.
Eliminar la disolucin de la cubeta mediante
decantacin volcando lentamente sobre el extremo
cuadrado de la cubeta para evitar que se salga la tira y
eliminar las ltimas gotas de disolucin golpeando
suavemente.
Aadir la disolucin de equilibrado II (Urea 6 M,
Tris-HCl 0.375 mM pH 8.8, SDS 2%, Glicerol 20%,
iodoacetamida 0.025 mg/mL) e incubar durante 15
min, eliminando la disolucin al final de este paso de
la misma manera que la anterior.

Dimensin desnaturalizante (SDS-PAGE)
Lavar durante unos seg la tira en una probeta lo suficientemente alta para
cubrirla con tampn 1X Tris-Glicina-SDS, dejar la tira apoyando su cara de
plstico sobre el cristal ms grande de los dos (trasero) con la acrilamida hacia
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arriba.
- Calentar la agarosa de bajo punto de fusin (0.5%) en un microondas (45-60
seg). Dejar enfriar hasta que no queme al tacto.
- Verter la agarosa lquida lentamente entre los dos cristales con una pipeta
pasteur hasta que rebose y no se vean irregularidades en el gel.
- Con unas pinzas fina o una esptula,
empujar lentamente la tira IPG hacia
abajo hasta que penetre entre los dos
cristales y toque la acrilamida, con
cuidado de no formar burbujas.
Empujar sobre el plstico y no sobre
la acrilamida de la tira.
- Impregnar un papel de filtro de
celulosa precortado con 5L del patrn de peso molecular e introducirlo en uno
de los lados hasta tocar la tira (preferiblemente junto a la marca del polo (+)
situada en la tira. Esta disolucin lleva azul de bromofenol con el objetivo de
visualizar el curso de la electroforesis. Dejar solidificar la agarosa durante 5-10
min. Si se observan burbujas, presionar con una esptula o punta para
eliminarlas.
- Montar los geles en la cubeta Mini-Protean y aadir los tampones de
electroforesis (consultar con el profesor de prcticas el volumen de tampn a
preparar de cada uno en funcin del n de geles y el tipo de cubeta). Preparar
tampn de ctodo a partir de un stock 10X suficiente para llenar el
compartimento interno (Tris-HCl 12 mM pH 8.3, Glicina 186 mM, SDS 0.1%).
Aadir el tampn de ctodo en el compartimento interno. Preparar el volumen
necesario de tampn de nodo y aadirlo en el compartimento externo (Tris-HCl
366 mM, pH 8,8). Consultar con el profesor qu grupos preparan cada uno de los
tampones.
Posicin Composicin
Tetracell
4 geles
Tetracell
2 geles
Buffer ctodo (-) Interior Diluir 10X 1X 2x100 mL 100 mL
Buffer nodo (+) Exterior
(366 mM, pH 8,8)
MW : 121,14
1 L 0,5 L
- Conectar a la fuente y programar la electroforesis a un voltaje constante de 200 v
durante 40 min.
- Despus de acabar la electroforesis, desconectar la fuente de alimentacin,
separar los cristales con cuidado, sacar el gel y ponerlo en un recipiente de
lavado. Fijarse en la marca +de la Strip que corresponde que el valor de pH ms
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bajo y marcar adecuadamente el gel en esa posicin.
- Lavar con abundante agua bidestilada y dejar toda la noche sumergido en 100
mL de metanol al 50% y cido actico al 10% (disolucin de fijacin).








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CUBETA Mini-Protean Tetra Cell





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DA 3

3.3. Tincin del gel bidimensional. Determinacin de la
concentracin de protena mediante ensayo Bradford.












Revelado del gel mediante tincin con azul de Coomassie

Existen diversos protocolos de tincin de geles bidimensionales con diferente
sensibilidad. En el presente protocolo utilizaremos Azul de Coomassie brillante R-250.
Proceder a la tincin y desteido de los geles utilizando el protocolo siguiente:

A. Lavado
Lavar el gel con abundante agua destilada durante 15 min. Realizar un par de
cambios de agua durante este periodo. Preparar suficiente disolucin de tincin
para el paso siguiente con el objetivo de que se cubra abundantemente el gel.
B. Tincin
Sumergir el gel durante 30 min en la disolucin de tincin. La disolucin de
tincin est compuesta por:
- Azul de Coomassie: 1g/L
- Metanol: 40%
- cido actico: 20%
C. Lavado
Realizar un breve lavado con agua destilada (2-3 min). Preparar la disolucin de
revelado/ desteido.
D. Revelado
Sumergir el gel en la disolucin de revelado durante un mnimo 2 horas,
realizando al menos un par de cambios (aadir algodn para acelerar el proceso
de desteido):
- Metanol: 20%
- cido actico glacial: 20%
- Glicerol: 1%

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Cuantificacin de la protena extrada del cultivo de E. coli mediante ensayo
Bradford

- El ensayo Bradford se basa en la interaccin qumica entre el azul de Coomassie
G-250 y aminocidos bsicos (Arg) y aromticos de la protena. La unin del
colorante a la protena desplaza el mximo de su espectro de 465 nm (rojo) a
azul (595 nm), longitud de onda a la que se mide finalmente el complejo. Estos
cambios del color se deben a la variacin de la carga neta de la molcula debido
a la relacin entre los grupos amino (+) y sulfonato (-) entre las formas libre y la
asociada a la protena debido a las diferencias de pH en los entornos en los que
se encuentra el colorante.
- Preparar una serie de 11 tubos eppendorf y completarlos segn la tabla adjunta,
siete tubos para la recta patrn y cuatro tubos para la muestra. El patrn utilizado
es BSA (albmina de suero bovino) y est preparado a una concentracin de 0,1
mg/mL.


Tubo
Patrn /
Muestra
(L)
PBS (L) ABS
P
A
T
R

N

1 0 800
2 10 790
3 25 775
4 50 750
5 100 700
6 150 650
7 200 600
M
U
E
S
T
R
A
8 10 790
9 10 790
10 20 800
11 20 800

- Aadir 200 L de reactivo comercial de Bradford y esperar 15 min.
- Medir la absorbancia a 595 nm de todos los tubos en una cubeta de plstico.
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4. Preguntas
1) Obtener la recta patrn con los valores obtenidos del estndar de protena. Hacer
la media de los cuatro valores de la muestra y determinar la concentracin de la
protena en el sobrenadante de la lisis a partir de la recta de calibrado.
Determinar el porcentaje de protena en las bacterias frente al peso seco total
(preguntar al profesor el peso despus de liofilizar).
2) Explicar brevemente las diferencias entre la electroforesis bidimensional (2DE)
y la electroforesis bidimensional diferencial (2DIGE).

3) Sobre qu rangos de pH aproximados se sitan los spots ms intensos
observados?, entre qu pesos moleculares oscilan aproximadamente las
protenas ms intensas que se observan?

4) Con qu tipo de lisis se obtiene una mayor cantidad de protenas en el gel
bidimensional? Cul puede ser la causa?

5) Explicar el fundamento molecular de la tincin con azul de Coomassie.

6) Cul es la finalidad del proceso de reequilibrado despus del IEF?

7) Visitar el servidor sobre bases de datos de 2DE para comprobar las numerosas
bases de datos libres existentes http://world-2dpage.expasy.org/list/

8) Entrar en la base de datos SWISS- 2DPAGE (http://world-
2dpage.expasy.org/swiss-2dpage/ ). Entrar en Maps / Graphical interface y
elegir el primer gel 2D de E. coli. Identificar la protena ms abundante en el gel
bidimensional (Access protein entry, punto isoelctrico y peso molecular). Elegir
Protein list en el men de la izquierda y elegir de nuevo el gel bidimensional de
E. coli hasta que aparezca la lista completa de protenas identificadas. Buscar la
protena anterior y describir su funcin. Si es posible, intentar encontrar
similitudes entre el gel que se ha obtenido en la prctica y el gel que aparece en
la base de datos.

9) Visualizar los ejemplos sobre posibles problemas en geles bidimensionales
http://www.bio-
rad.com/evportal/destination/solutions?catID=LUSQRG30E#gel8
- Cmo se manifiesta normalmente una sobrecarga de protena?
- Qu se observa en el gel cuando una zona de la tira no queda en
contacto con la disolucin de rehidratacin?.
- Qu efectos produce un tiempo de isoelectroenfoque insuficiente?

10) Escanear el gel realizado en prcticas e intentar explicar el resultado obtenido en
funcin de la forma y distribucin de los spots obtenidos. Indicar de forma
aproximada el peso molecular y el pI de la protena ms abundante.