I nstituto Superior de Ciencias de la Salud Carrera de Tcnico de Laboratorio
I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre
1 ENFERMEDADES ASOCIADAS A RETROVIRUS.
Se clasifican como retrovirus porque tienen la particularidad de integrar su material gentico en el DNA nuclear de la clula que infectan transcribiendo primero su genoma de RNA a DNA por accin de una transcriptasa reversa. Los retrovirus patgenos en el hombre pertenecen a las subfamilias lentivirus y oncornavirus. La diferenciacin reside en su mecanismo patognico, los lentivirus matan a las clulas que infectan, mientras que los oncornavirus transforman y tienden a inmortalizar a las clulas infectadas. Su ciclo vital comienza cuando una partcula viral libre en el medio extracelular se une a un receptor de una clula permisiva. Se fusiona con su membrana, pierde su envoltura y su contenido es liberado al citoplasma de la clula infectada. Por accin de la retrotranscriptasa el RNA se copia en DNA, el DNA viral ingresa al ncleo y se incorpora al genoma celular. All puede permanecer como provirus en forma latente por largos perodos hasta expresarse. Las protenas virales sintetizadas por la clula infectada reconstituyen, a nivel de la membrana celular, la nucleocpside y la envoltura dando origen a una partcula infectiva o virin que brota hacia el exterior disponible para la infeccin de nuevas clulas. El genoma de los retrovirus est formado por dos cadenas idnticas de RNA no complementarias. Posee tres genes bsicos para su replicacin: gag, env y pol. Son secuencias que codifican para la sntesis de las protenas estructurales de la cpside y de la envoltura (gag y env) y para la transcriptasa inversa (pol).
I nstituto Superior de Ciencias de la Salud Carrera de Tcnico de Laboratorio I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre 2
Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida. El virus de la inmunodeficiencia humana o VIH es un retrovirus perteneciente a la subfamilia de los lentivirus. Los lentivirus son virus exgenos, es decir infecciosos, que se caracterizan principalmente por tener una organizacin genmica compleja, afectar al sistema nervioso, producir viremia persistente, inmunodeficiencia y largos perodos de infeccin asintomtica. Son virus citolticos y no oncognicos. Se transmiten en forma horizontal de un individuo a otro. El VIH es un virus a RNA formado por dos molculas de cido nucleico de cadena simple. Existen dos tipos principales de VIH denominados VIH1 y VIH 2, a su vez dentro de cada uno de ellos se diferencian varios subgrupos y subtipos. El VIH1 se encuentra ampliamente distribuido en el mundo mientras que el VIH2 es prevalente en frica Occidental y raro en otras zonas geogrficas. Si bien VIH1 y VIH2 difieren levemente en su estructura gentica, ambos son citopticos sobre los linfocitos T y sus caracteres morfolgicos son muy similares. El virus VIH es esfrico y mide alrededor de 110 nm, posee una envoltura externa glucoproteica, proveniente de la membrana de la clula husped, y una parte central llamada nucleocpside o core que contiene las dos copias de su ARN genmico asociado a las enzimas virales transcriptasa reversa, proteasa e integrasa. Su genoma est constituido por los tres genes, comunes a todos los retrovirus, que codifican para la sntesis de protenas de la nucleocpside y de la envoltura viral (genes estructurales gag, pol y env) y por otros responsables de la formacin de protenas con funciones reguladoras capaces de controlar la proliferacin, la replicacin, la liberacin y el grado de infectividad del virus (genes reguladores tat, nef, vpu, vif, rev). Estas protenas son inmunognicas en el husped y permiten distinguir los diferentes antgenos del VIH en tres grupos principales: Protenas gag (antgenos de grupo): las ms importantes son p55, p24 y p17; el nmero hace referencia a los pesos moleculares de 55000, 24000 y 17000 respectivamente (que difieren levemente para VIH2). p55 es un precursor que da origen a otras protenas menores. p24 es el componente principal de la cpside interna que rodea al ARN central. p17: integra la cpside externa, entre el ncleo y la envoltura. Son integrantes de la nucleocpside del virus. Glicoprotenas env (envoltura): son las glicoprotenas gp160, gp120 y gp41. gp160: no es un componente estructural sino una molcula precursora. gp120 y gp41: son los integrantes de la envoltura y se forman por degradacin de gp160 por accin de la proteasa. gp120 es ms externo y tiene la propiedad de unirse al antgeno CD4 de la membrana de los linfocitos y clulas mononucleares fagocticas. gp41 se conoce como glicoprotena de transmembrana; contiene secuencias variables que hacen que pueda ser muy especfico para cada tipo de virus (gp36 en el VIH2). Forman parte de la envoltura externa del virus junto a componentes de la membrana de la clula originalmente infectada. Anticuerpos contra las protenas de envoltura del VIH1 no dan reacciones cruzadas con las protenas de la misma regin del VIH2. S existe reactividad cruzada entre anticuerpos hacia las protenas gag y pol de ambos tipos de virus. Protenas pol (polimerasa): incluyen las protenas p66 (la enzima transcriptasa reversa), p51 (proteasa) y p31 (la integrasa o endonucleasa). Se encuentran situados dentro del ncleo y asociados a los cidos nucleicos y son I nstituto Superior de Ciencias de la Salud Carrera de Tcnico de Laboratorio I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre 3 los que efectan la conversin del ARN en ADN, la integracin del ADN viral al ADN celular y el desdoblamiento de molculas precursoras a componentes activos menores. La va de transmisin preponderante del VIH es la sexual. Sin embargo la diseminacin tambin puede ocurrir por agujas o jeringas compartidas por adictos a drogas intravenosas, por transfusin de sangre o sus derivados contaminados y por va materno fetal, ya sea intratero o perinatal (parto y lactancia). La transmisin sexual y vertical del VIH se da a travs de las mucosas y la piel mientras que en las otras es secundaria al contacto directo con la sangre.
Ciclo de replicacin La infeccin por el VIH comienza cuando la partcula viral se une a la clula blanco a travs de la interaccin de la protena de envoltura gp 120 y el receptor celular CD4. El CD4 es una glipoprotena de superficie que se expresa en una variedad de clulas del sistema hematopoytico. Los linfocitos T CD4(+) constituyen el blanco principal del VIH ya que expresan la molcula CD4 en muy alta concentracin. Los monocitos, macrfagos y clulas dendrticas tambin expresan el CD4 en la superficie pero en menor concentracin que los linfocitos T y constituyen un blanco alternativo en la infeccin. Luego de la unin virus-clula, comienza el proceso de fusin de membranas el cual es facilitado por la glicoprotena de envoltura gp41 y por las protenas celulares recientemente identificadas fusina (CXCR4) y/o CCR5 que participan como correceptores celulares para el virus. Como resultado de la fusin, el genoma viral ingresa al citoplasma celular como parte de un complejo nucleoproteico. En el citoplasma, se inicia el proceso de transcripcin dirigido por la transcriptasa inversa con la sntesis de la primera cadena de ADN utilizando como molde el ARN viral. A medida que el ARN se retrotranscribe es degradado por la ARNasa H (endonucleasa) y reemplazado por una segunda cadena de ADN. El resultado final de este proceso es la obtencin de un ADN de doble cadena con duplicaciones terminales repetitivas (LTR) que no estn presentes en el ARN viral y que se originan durante el proceso de retrotranscripcin del VIH-1. El siguiente paso en el ciclo, es la incorporacin de la molcula de ADN lineal en un complejo de pre-integracin y la subsiguiente migracin al ncleo celular. Una vez dentro del ncleo, la mayor parte del ADN viral se circulariza y permanece no integrado, aunque tambin puede integrarse en forma precisa dentro del genoma celular. El proceso de integracin est mediado por la endonucleasa y la integrasa viral que utilizan dos repeticiones invertidas de ADN ubicadas en los extremos de los LTR como sitios de integracin. Por el contrario, con respecto a las secuencias del ADN del husped, la integracin parecera ser totalmente al azar. Una caracterstica interesante de la transcripcin inversa y la integracin viral, es que son procesos muy poco eficientes en clulas quiescentes como los I nstituto Superior de Ciencias de la Salud Carrera de Tcnico de Laboratorio I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre 4 linfocitos T. En cambio, los macrfagos que son clulas sin divisin pero no quiescentes, son totalmente capaces de realizar estos procesos. La transcripcin del provirus es regulada por factores celulares y virales. Luego de la sntesis de un ARN viral completo se pueden producir varios tipos de ARN mensajeros (ARNm) como resultado de splicing alternativos. La expresin de los distintos tipos de ARNm es controlada por la protena rev. La cantidad de rev determina si se producen ARN de cadena completa (unspliced) o ARNm procesados (multiply spliced). Todos los transcriptos virales son exportados al citoplasma donde ocurre la sntesis de las protenas virales. Los ARN de cadena completa van a originar el ARN genmico viral y los ARNm que codifican para las protenas estructurales y enzimticas (gag, pol, y env), mientras que los ARNm procesados codifican para las protenas accesorias (tat, rev y nef). Luego de la sntesis proteica cerca de la membrana celular se produce el ensamblaje del ARN genmico en la cpside. Finalmente, a medida que los viriones son liberados por brotacin a travs de la membrana celular adquieren la envoltura con la incorporacin de las glicoprotenas virales. El procesamiento de las poliprotenas gag y gag/pol por la proteasa viral puede ocurrir durante o despus de la brotacin generando viriones infecciosos maduros. La liberacin de los viriones puede producirse rpidamente provocando la lisis celular o bien en forma ms lenta manteniendo la integridad de la clula.
I nstituto Superior de Ciencias de la Salud Carrera de Tcnico de Laboratorio I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre 5
LTR GAG POL SOR TAT TRS ENV 3ORF LTR Estructura del genoma del virus VIH
Latencia del virus: Los linfocitos T son invadidos por HIV pero no se replica dentro de las clulas si ellas estn en reposo. La activacin por determinantes antignicos (sobresale el VHS-6, CMV, mycoplasma) al activar a los linfocitos T inducen a la replicacin del virus HIV. Al replicarse el virus protuye de la membrana del linfocito T y sale a invadir otros linfocitos o macrfagos. Dentro del macrfago el HIV se replica y se almacena, pero no sale sino cuando muere el macrfago (reservorio del virus). Las clulas dendrticas quedan comprometidas en su funcionalidad.
Aspectos clnicos Enfermedad inicial: Corresponde a la infeccin aguda (perodo de seroconversin) que puede presentarse con manifestaciones clnicas o ser asintomtico. De presentar manifestaciones estas se caracterizan por un cuadro tipo mononuclesico, hasta en un 30-70% de los casos, aunque a menudo pasan desapercibidas. Las manifestaciones son mltiples e incluyen: fiebre, sudoracin, artralgias, mialgias, linfadenopatas, odinofagia, anorexia, nauseas, vmitos, cefalea, erupcin cutnea, diarrea, meningoencefalitis aguda, mielopata aguda, hepatoesplenomegalia, ulceras orales, trombocitopenia, leucopenia, aumento de las transaminasas. Nefritis, vasculitis, rabdomiolisis, neumonitis, anemia aplsica, son excepcionales. La duracin de este cuadro es de 5-14 das. A lo largo de este proceso agudo puede haber un perodo transitorio de inmunodepresin, capaz de facilitar la aparicin o reactivacin de enfermedades oportunistas, describindose candidiasis oral y aun complicaciones mayores como candidiasis esofgica, enfermedad por CMV y aun neumonitis por P. carinii. La presencia de sntomas y la mayor intensidad de los mismos durante esta etapa se asocia a una progresin ms rpida, en relacin a caractersticas virolgicos e inmunolgicos propias de este perodo. La misma es relativamente independiente del mecanismo de transmisin de la infeccin (sexual, sangunea, vertical). A los 10-20 das de la infeccin y pocos das despus del inicio de los sntomas se pueden detectar antgenos virales, luego de 1-3 meses irn apareciendo los diferentes anticuerpos contra estos antgenos. Enfermedad temprana: Incluye el perodo de infectado asintomtico y la linfadenopata generalizada persistente (simtricas, elsticas, indoloras y no adheridas). Esta etapa dura varios aos, y si bien persiste la actividad proliferativa viral, se alcanza un equilibrio dinmico y el paciente se encuentra asintomtico, en latencia clnica. El sistema inmune se encuentra sometido a una presin que de no revertirse lo llevar al agotamiento y el paciente progresar a etapas ms avanzadas, con aparicin de manifestaciones que evidencian el compromiso. La viremia en este perodo determina la velocidad de descenso de CD4, en promedio 40-80/ao (0-200). Por ello, de no revertirse esta situacin natural, en 10 aos, aproximadamente 50% de los infectados habrn evolucionado a SIDA. Un 10%, no habr progresado, aun conservando un nmero normal de CD4, y con ello una funcin inmune adecuada, a estos pacientes se los denomina no progresores a largo plazo. Estas dos etapas corresponden a la Categora Clnica A (CDC-93). Enfermedad moderada: Comprende a los complejos relacionados y las infecciones menores no marcadoras de SIDA. El sistema inmune esta agotando su capacidad de aclaramiento viral y de I nstituto Superior de Ciencias de la Salud Carrera de Tcnico de Laboratorio I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre 6 reponer los linfocitos CD4 destruidos; los ganglios linfticos ya no atrapan en forma eficiente al virus. Hay entonces un nuevo equilibrio dinmico, pero ahora con una carga viral alta y una reserva de CD4 baja, con tendencia al deterioro y mayor progresin. El paciente presenta enfermedades relacionadas con el VIH o cuya evolucin, manejo o tratamiento puede verse complicado debido a la presencia de este virus. Se incluye al Herpes Zoster monometamrico en los ltimos 5 aos, candidiasis oral o vaginal de ms de un mes de duracin o recurrente, leucoplasia oral vellosa, alteraciones dermatolgicas (molusco contagioso, dermatitis seborreica), prpura trombocitopnica idioptica, ulceras mucosas inespecficas, infecciones bacterianas recurrentes (sinusitis, bronquitis), angiomatosis bacilar, enfermedad pelviana inflamatoria y neuropata perifrica. Corresponde a la Categora Clnica B (CDC-93), de no mediar tratamiento antiviral la enfermedad progresa a estadios ms avanzados. Enfermedad avanzada: Son los pacientes que han presentado una complicacin mayor, un evento definidor de SIDA, Categora Clnica C (CDC-93). Se incluyen: a) Sndrome de adelgazamiento: prdida de peso involuntaria, superior al 10% del peso habitual, fiebre intermitente o continua de ms de 1 mes de evolucin y sin causa aparente o sudores nocturnos, diarrea de ms de 1 mes de evolucin sin causa que la justifique. b) Infecciones y neoplasias: Neumonitis por P. carinii. Tuberculosis, pulmonar y extrapulmonar. Enfermedad diseminada o extrapulmonar por Micobacterias Atpicas. Sepsis por Salmonela, recurrente. Candidiasis esofgica o traqueo- bronco-pulmonar. Criptococosis extrapulmonar. Histoplasmosis Diseminada. Infeccin por Herpes Simple, muco-cutnea o visceral, crnica o recidivante. Infeccin por CMV, retinitis u otra localizacin no hepatoesplnica ni linftica. Coccidioidomicosis Diseminada. Toxoplasmosis del SNC. Leucoencefalopata Multifocal Progresiva. Criptosporidiosis intestinal o extraintestinal. Encefalopata subaguda o Complejo Demencial. Neumona bacteriana recurrente (2 o ms episodios en un ao). Linfoma inmunoblstico, de Burkitt o Primario del SNC. Sarcoma de Kaposi. Carcinoma invasivo de cuello uterino. Enfermedad de Chagas, con localizacin atpica. La gran mayora de estas complicaciones tiene tratamiento, con curacin clnica, persistiendo en general el agente en el organismo, por lo cual se requiere terapia supresiva de por vida en la gran mayora de los casos. Es posible que a partir de algn momento se llegue a una situacin de no retroceso, en el que el sistema inmunolgico es imposible que se recupere, incluso ante la erradicacin del virus. Sin embargo, la capacidad de recuperacin de linfocitos y su ndice de recambio es muy activo, incluso en fases avanzadas. La probabilidad de sobrevida, luego de un evento definidor, en pacientes no tratados es menor de 3 aos, pero en quienes realizan terapia con esquemas potentes, aun en pacientes muy avanzados (menos de 50 CD4) se logra prolongar estos tiempos. I nstituto Superior de Ciencias de la Salud Carrera de Tcnico de Laboratorio I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre 7
Curso de la infeccin con el Virus de la I nmunodeficiencia Humana La primera etapa de la infeccin por el VIH se caracteriza por una activa replicacin viral como tambin por el surgimiento de una respuesta inmunolgica especfica contra el VIH-1 y el control de la viremia. Esta infeccin aguda puede extenderse de cuatro a ocho semanas abarcando dos etapas. Una primera etapa de diseminacin viral que ocurre durante las tres o cuatro primeras semanas posteriores a la infeccin y culmina con el pico de viremia. En este perodo no se detectan anticuerpos especficos contra el VIH-1 y por eso se denomina perodo "ventana". Durante las primeras semanas se observa un descenso pronunciado del nmero absoluto de linfocitos T CD4(+) en sangre perifrica y se producen niveles elevados de virus libre circulante en plasma que puede ser cultivado y cuantificado como copias de ARN viral/ml de plasma. Estos ttulos elevados de carga viral plasmtica estn asociados con altos niveles de antgeno p24. La segunda etapa se caracteriza por el descenso brusco de la viremia que se correspondera con la eliminacin parcial del virus en sangre, concomitantemente con la deteccin de anticuerpos especficos contra el virus, o sea con el perodo de seroconversin. La respuesta humoral especfica aparece entre las 2 semanas y 3 meses postinfeccin. Como en otras infecciones virales la elevacin del nmero de linfocitos T CD8(+) en sangre perifrica es un evento temprano que puede preceder a la seroconversin, pero siempre es posterior a la deteccin del provirus en clulas circulantes. I nstituto Superior de Ciencias de la Salud Carrera de Tcnico de Laboratorio I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre 8
Curso tpico de la infeccin por el VIH-1
I nstituto Superior de Ciencias de la Salud Carrera de Tcnico de Laboratorio I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre 9
El nivel de anticuerpos se mantiene durante el perodo de latencia clnica o sea mientras el paciente permanece libre de sntomas y signos de enfermedad. Con el avance de la enfermedad, el ttulo de anticuerpos puede disminuir y llegar a valores no detectables en el estadio final del SIDA. Durante la primoinfeccin se produce una reduccin moderada del nmero de linfocitos T CD4(+), la cual continua en forma lenta y progresiva durante el perodo asintomtico la cual puede prolongarse por aos. Cuando la deplecin de los linfocitos CD4(+) ocurre en forma acelerada conduce a la aparicin de SIDA temprano. Las etapas finales de la enfermedad se caracterizan por presentar una inmunosupresin severa con recuentos de linfocitos T CD4(+) muy bajos y altos niveles de viremia plasmtica los cuales aumentan con las infecciones oportunistas concomitantes que conducen finalmente a la muerte. Comportamiento de los Ls CD4+, los de memoria y de la Reactividad de los LT-A durante la infeccin por HIV. Linfocitos CD4: Las clulas que presentan este receptor son infectadas por el virus, oscilando sus valores normales en sangre entre 600 y 1400/mm 3 . Evolucionando en forma natural la infeccin, sus niveles descienden en forma progresiva en el tiempo. Es un marcador que predice progresin a SIDA y supervivencia, evidenciando las consecuencias de la infeccin. Su valor se reduce al ser tardo, respecto al que tiene la Carga Viral. Su mayor utilidad actual radica en: a) orientar la toma I nstituto Superior de Ciencias de la Salud Carrera de Tcnico de Laboratorio I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre 10 de decisiones para instituir terapias de profilaxis primaria, b) suspenderla (tanto primaria como secundaria) al recuperarse sus niveles con el tratamiento, c) decidir la terapia antirretroviral y d) para estadificar al paciente. Tiene como utilidad ser orientadora de diagnstico ante complicaciones, ya que de su nivel depende la posibilidad de desarrollarse o no una determinada enfermedad. El sistema de estadificacin utilizado actualmente incluye parmetros clnicos (A, B y C) y nivel de Linfocitos CD4 (1, 2 y 3) aprobada por los CDC en 1993 y aplicados en nuestro pas desde 1996. La estadificacin tiene un valor epidemiolgico, para conocer la marcha de la epidemia y de esta forma realizar una adecuada planificacin sanitaria y un valor pronstico individual.
Infeccin de las clulas T CD4 por VIH I nstituto Superior de Ciencias de la Salud Carrera de Tcnico de Laboratorio I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre 11 Sistema de clasificacin
Categora Clnica
Carga Viral (CV) Mide la cantidad de partculas virales en sangre, molculas que son fracciones del material gentico viral, equivalente a la cantidad de virus circulante y reflejo de la magnitud de la replicacin viral. Constituye el parmetro ms sensible para indicar el xito de la terapia antirretroviral y tambin participar en la decisin del inicio, ya que sus niveles tienen un gran valor predictivo de progresin e independiente de los CD4, cuando los valores son superiores a 100000 copias/ml. A mayor nivel en sangre, mayor induccin de destruccin de linfocitos CD4, deterioro de la inmunidad y progresin a SIDA. Reduciendo sus niveles con la terapia se preserva la integridad del sistema inmune. La determinacin de sus niveles en sangre son de utilidad para indicar el inicio de la terapia y controles posteriores permiten conocer la eficacia y duracin de esta. Se realiza la cuantificacin de cidos nucleicos ARN viral. Existen distintas tcnicas de medicin, la muestra que se utiliza es plasma (sangre anticoagulada con EDTA). Los mtodos utilizados son RT_PCR cuantitativa (amplifica ARN viral con ciclos trmicos con un lmite de deteccin de 400 copias ARN/ml plasma o 50 copias ARN/ml plasma si es el ultrasensible) y NASBA (amplifica ARN viral en forma isotrmica con un lmite de deteccin de 50 copias ARN/ml plasma). Su utilidad es como marcador subrrogante de progresin de la enfermedad y para la evaluacin y monitoreo de la respuesta a la terapia antirretroviral, permitiendo decidir conductas teraputicas.
Estadificacin: Tres categora clnicas y tres por el nivel de linfocitos CD4: Categora clnicas: A: documentada infeccin, asintomtica, o infeccin aguda. B: enfermedad sintomtica, condiciones no listadas en la categora C, incluyendo las siguientes: atribuido al VIH o indicativo de un defecto en la inmunidad mediada por clulas; o, el curso clnico o el manejo est complicado por el VIH. C: condicin indicadora de SIDA.
Diagnstico de laboratorio
El diagnstico de la infeccin por VIH se basa en el aislamiento del virus, la deteccin de sus antgenos o cidos nucleicos circulantes, o en la identificacin de sus anticuerpos especficos.
Mtodos directos Comprenden el aislamiento del virus por cultivo, la deteccin de antgenos virales especficos o de su material gentico. De la vasta extensin y variedad de las pruebas directas se describirn solamente aquellas de mayor utilidad actual.
Antigenemia: mtodo de deteccin del antgeno viral p24. Su mayor problema radica en que se encuentra normalmente formando parte de inmunocomplejos con su anticuerpo, lo que dificulta su visualizacin y disminuye la sensibilidad de las tcnicas. Se usan enzimoinmunoensayos alternativos con sistemas que permiten aumentar la sensibilidad de las pruebas convencionales. Su utilizacin procura el acortamiento del perodo de ventana serolgica en la infeccin aguda. Categora cl. CD4 A B C (1) > 500/mm 3 A1 B1 C1 (2) 200 499/mm 3 A2 B2 C2 (3) < 200/mm 3 A3 B3 C3 I nstituto Superior de Ciencias de la Salud Carrera de Tcnico de Laboratorio I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre 12 Reaccin de la Polimerasa en Cadena (PCR): tcnica de amplificacin de secuencias genticas del virus. Se usa en aquellas situaciones en que la deteccin de anticuerpos no arroja resultados concluyentes en el diagnstico de la infeccin. Permite tambin el diagnstico en el perodo ventana, la deteccin precoz de la infeccin en recin nacidos hijos de madres VIH positivas, la identificacin de subtipos virales y el seguimiento de la terapia antirretroviral. Detecta ADN pro viral y ARN viral. Su utilidad es en infeccin reciente (perodo de ventana), resolucin de Western blot indeterminados y diagnstico peditrico.
Mtodos indirectos o serolgicos T 4 /T 8
Se usa el cociente entre el nmero absoluto de linfocito T 4 y el nmero absoluto de linfocito T 8 como indicador de alteracin. Su valor normal es T 4 /T 8 1. (Linfocito T 8 : funcin supresora de la fisiologa inmunitaria). La linfopenia como el descenso de la relacin T 4 /T 8,
vara segn el tiempo de evolucin y gravedad. Estas anomalas no son especficas de la infeccin por HIV.
Recomendaciones de CDC: Un ensayo de deteccin de anticuerpos se considera positiva cuando resultan dos pruebas consecutivas reactivas por ELISA, seguidas de un examen adicional de Western-Blot (WB). WB: * (+) aparecen por lo menos dos de las siguientes bandas: p24, gp41, gp120/160 como bandas nicas. * (-) ausente todas las bandas. * indeterminado: otro patrn distinto (esperar de tres a seis meses y repetir WB).
El diagnstico de la infeccin a travs de la identificacin de los anticuerpos especficos requiere de un mtodo preliminar de elevada sensibilidad y una prueba suplementaria de rigurosa especificidad.
a) Mtodos de screening.
Aglutinacin pasiva: el vehculo soporte ms utilizado son las partculas de gelatina sensibilizadas con antgenos de origen recombinante o sinttico. Se realizan en microplacas en forma simple y rpida no requiriendo procedimientos de lavado. El antgeno utilizado son partculas de gelatina sensibilizadas con Ags inactivados de VIH-1 y VIH-2 por separado. Partcula sensibilizada I nmunocromatogrfico: Son de gran utilidad por la rapidez del resultado, 10 a 15 minutos. Si bien son ensayos de buena sensibilidad y especificidad, ante un resultado dudoso o positivo debe realizarse un ELISA. Los antgenos son recombinantes y pptidos sintticos y detectan Anticuerpos anti VIH 1/2.
ELI SA: segn el origen del antgeno utilizado estos ensayos analticos se clasificaron en diferentes generaciones.
Test de 1 generacin: los primeros en utilizarse pero en desuso actualmente. Los antgenos sensibilizantes de la fase slida proceden de lisados de virus cultivados en linfocitos. Su principal desventaja es la pobre especificidad evidenciada por la gran cantidad de reacciones falsas positivas por anticuerpos hacia contaminantes celulares, fundamentalmente Ag del sistema HLA. Pruebas de 2 generacin: utilizan antgenos recombinantes originados al insertar una regin seleccionada del genoma del VIH en vehculos biolgicos. Las protenas virales pueden obtenerse en grandes escalas y sin los riesgos asociados a los cultivos del virus. Puede aumentarse la sensibilidad fabricando fases slidas con varios antgenos recombinantes de diferentes regiones genmicas del VIH. Persiste el inconveniente de reacciones inespecficas, I nstituto Superior de Ciencias de la Salud Carrera de Tcnico de Laboratorio I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre 13 aunque en menor grado, y debidas en este caso a la reaccin contra determinantes antignicos del vehculo vector. Mtodos de 3 generacin: incorporan antgenos obtenidos en un sintetizador de protenas que ensamblan un pequeo nmero de aminocidos obteniendo pequeos pptidos sintticos representativos de secuencias primarias de protenas del VIH. No existen reacciones cruzadas y su sensibilidad puede optimizarse usando varios pptidos sintticos en la sensibilizacin del soporte slido. Detectan anticuerpos totales anti VIH1/2 incluido el subgrupo O. Se utilizan microplacas o strips de poliestireno, micropartculas de poliestireno (MEIA), enzimoinmunofluorescencia (ELFIA), etc. Los antgenos utilizados son Ags recombinantes del gen env y gag ms pptidos sintticos de envoltura del VIH-1 y VIH-2. El perodo de ventana serolgico aproximado es de 22 das.
Mtodos de 4 generacin: tienen la capacidad para detectar anticuerpos totales para VIH-1 (incluidos subgrupo O), VIH-2 y el antgeno p24 de VIH-1. La fase slida est recubierta con diversos antgenos recombinantes, pptidos sintticos y con anticuerpos anti p24. Algunos de stos ensayos tienen la ventaja de tener un lmite de deteccin muy bajo (3 pg/ml) para el Ag p24, que acorta la ventana serolgica a 14-16 das.
Tendiendo al mximo de sensibilidad y especificidad, la mayora de los ensayos ELISA actuales utilizan combinaciones adecuadas de antgenos sensibilizantes procedentes de lisados virales, protenas recombinantes y pptidos sintticos.
Existen variados formatos y diferentes diseos posibles con estas pruebas. o ELI SA indirecto: El antgeno viral se une a la fase aslida (en pocillo o placa), se lo enfrenta al suero del paciente. El anticuerpo especfico con el antgeno viral, se se hallara en suero del paciente se unir a la fase slida. Se agrega el anticuerpo anti humano conjugado con enzima. Se agrega el sustrato correspondiente y se hace lectura. Si existe anticuerpo hay seal de color. o ELI SA indirectoo (sandwicho captura de anticuerpo): el anticuerpo del conjugado enzimtico es anti inmunoglobulina humana. Para garantizar la deteccin de todas las clases de anticuerpos antiVIH debe poseer actividad para todas las molculas de inmunoglobulinas (G, M y A). No pueden incubarse simultneamente con la muestra por la inhibicin con las inmunoglobulinas presentes. El desarrollo de color es directamente proporcional a la concentracin de anticuerpos. Las absorbancias de las muestras reactivas son superiores al cut off. o ELI SA competitivo: el conjugado es un anticuerpo antiVIH unido a una enzima. Puede incubarse conjuntamente con la muestra y la concentracin de anticuerpos es inversamente proporcional a la intensidad del color desarrollado. Las reacciones positivas son las de absorbancias menores al cut off. o ELI SA de antgeno sandwich: los mismos antgenos que sensibilizan la fase slida componen el conjugado enzimtico. Es una versin muy ventajosa que permite detectar, aunque no diferenciar, a todas las clases de anticuerpos formados por el paciente (M, G y A) pudiendo, por lo tanto, ser ms til en la infeccin aguda en donde los primeros anticuerpos responden a la clase molecular IgM. Este tipo de conjugado tambin puede incubarse junto a las muestras resultando en ensayos sandwich con una etapa de incubacin y lavado menos. I nstituto Superior de Ciencias de la Salud Carrera de Tcnico de Laboratorio I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre 14 o ELI SA captura de antgeno: Puede ser indirecto o competitivo. Los pocillos de la placa se recubren con anticuerpos monoclonales (AcM) de ratn contra antgeno p24 del ncleo del VIH-1. El amortiguador de ruptura se aade para romper cualquier virin presente en las muestras de pruebas. Con la adicin de una muestra o control apropiado que contenga antgeno VIH-1, se forman complejos inmunes con la interaccin del antgeno en la muestra y el anti-VIH-1 en la fase slida. Seguido de una incubacin, la muestra se aspira y el pocillo se lava con solucin amortiguadora. Posteriormente, se aade el antisuero anti VIH-1 (humano) conjugado con peroxidasa. El anticuerpo marcado se une con los complejos anticuerpo/antgeno previamente formados de la fase slida. Despus de un lavado e incubacin con sustrato-cromgeno H 2 O 2 -tetrametilbencidina (TMB), se produce un color azul que cambia a amarillo cuando la reaccin se detiene con la solucin de parada.
I nmuno dot o dot blot: son pruebas muy fciles de realizar y muy rpidas. No son ensayos ELISA puesto que no utilizan un conjugado enzimtico para la revelacin de la unin antgeno anticuerpo. La fase slida es una membrana de nitrocelulosa sobre la cual se adsorbido pasivamente (blot) un antgeno recombinante o pptido sinttico del VIH formando un crculo (dot). El conjugado que se emplea es Protena A Au coloidal. La protena A, procedente del Staphylococcus aureus, tiene la propiedad de unirse a los sitios Fc de las inmunoglobulinas humanas. La reaccin positiva se visualiza como una zona circular rosada, por el color del oro coloidal, en la regin donde se encuentra inmovilizado el complejo antgeno anticuerpo. Son muy tiles en situaciones de emergencia, salas de autopsias, quirfanos, servicios de transplante de rganos, salas de maternidad, etc. Su mayor ventaja es la de no requerir instrumental. No es recomendable utilizarla como nica prueba de screening.
b) Pruebas suplementarias o de confirmacin.
Western blot (WB): es la prueba confirmatoria ms ampliamente utilizada. Complementa las pruebas de tamizado siendo mucho ms especfica. Permite identificar los anticuerpos involucrados en una reaccin de rastreo positiva, discriminando su especificidad hacia los antgenos del VIH. La mezcla de antgenos VIH procedentes son protenas provenientes de un lisados virales cultivo celular, purificados y separados en una electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio. En estas condiciones de trabajo los antgenos se separan segn sus pesos moleculares. Los antgenos as separados se electrotransfieren a una membrana de nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa con los antgenos adsorbidos sobre su superficie es la fase slida sobre la que se realiza un ELISA. Adems hay pptidos especficos para VIH-2. La visualizacin se da por la formacin de un I nstituto Superior de Ciencias de la Salud Carrera de Tcnico de Laboratorio I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre 15 producto insoluble que precipita en el sitio donde ha ocurrido cada reaccin antgeno anticuerpo (bandas de precipitacin). Conjuda es anti IgG conjugada con fosfatasa alcalina. El tipo viral detectado es VIH-1 includo el subgrupo O + VIH-2. Los resultados se informan como negativos, positivos o indeterminados. Si bien existen muchos criterios de positividad de diferentes organizaciones internacionales, en Argentina se siguen los establecidos por la Cruz Roja Norteamericana que definen a un Western como positivo cuando se detectan al menos un anticuerpo hacia una protena derivada de cada uno de los genes env, gag y pol. La ausencia de bandas origina un resultado negativo. La presencia de cualquier nmero y combinacin de bandas pero sin reunir el criterio de positividad establecido define a un Western indeterminado. Criterios de positividad (CDC: Center for Disease Control) para VIH-1 es dos de las siguientes bandas: gp160/120; p24; gp41.
I nstituto Superior de Ciencias de la Salud Carrera de Tcnico de Laboratorio I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre 16
I nmunoensayos en lnea (LI A): son test confirmatorios de segunda generacin en los cuales se adsorben directamente sobre membranas de nylon o de nitrocelulosa antgenos recombinantes o pptidos sintticos representativos del VIH, y no proviene de una corrida electrofortica. Permite el sembrado de antgenos de mas de un virus en la misma tira de nitrocelulosa, as como tambin la deteccin simultnea de anticuerpos contra distintos tipos virales de un mismo virus. Los anticuerpos detectados son de istotipo IgG. El conjugado es anti IgG conjugada con fosfatasa alcalina. El tipo viral detectado es VIH-1 includo el subgrupo O + VIH-2. El antgeno utilizado son protenas recombinantes y pptidos de VIH-1 y VIH-2. Esta tcnica permite eliminar los problemas de interpretacin o los resultados atpicos generados al emplear lisado de virus. El criterio de positividad ser segn el fabricante. La I nmunofluorescencia indirecta (I FI ) y la Radioinmunoprecipitacin (RI PA) tambin son tcnicas confirmatorias pero menos utilizadas por contener material radioactivo y cultivos celulares con virus VIH. Es una tcnica extremadamente sensible y especfica. Se utilizan aminocidos marcado radiactivamente y se le agrega al medio de cultivo de clulas infectadas con VIH. El virus al replicarse incorpora el aminocido marcado a sus protenas. Luego las partculas virales son lisadas y enfrentadas con el suero a estudiar. El inmunocomplejo formado es precipitado con una protena A, luego se realiza una corrida electrofortica y la protenas marcadas y separadas son visualizadas por autorradiografas.
Diagnstico de la enfermedad viral aguda Obtener la muestra lo antes posible. A los 20 das obtener nueva muestra para ver cambios en la respuesta inmune. I nstituto Superior de Ciencias de la Salud Carrera de Tcnico de Laboratorio I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre 17 Solicitar muestra cada 30 das. Estudiar las clulas que secretan citoquinas (IL-1 estimuladora de linfocito T) tales como macrfagos (procesan el material viral al ser clulas presentadoras de antgeno) y clulas dendrticas (no procesan el antgeno pero amplifica la presentacin del mismo). Para que se liberen sustancias que destruyan las clulas infectadas, los linfocitos T deben portar el marcador CD 8 -CD 28 (Linfocitos T citotxicos) en la superficie, ya que son los ms importantes en la eliminacin de clulas infectadas. L T CD 4 (+) +L TH TH I inflamatoria TH II colaboradores, secretan interleucinas para estimular al linfocito B. CD 8 (+) +L TC supresores relacionados con la tolerancia a antgeno extrao. se asocia a una enfermedad en L T supresores en sndromes autoinmunes.
Los tipos de anticuerpos son contra la estructura externa del virus (neutraliza el virin y dosminuye su infectividad) o detecta protenas virales internas (anticuerpos anti core).
a) Esquema clsico de una enfermedad viral: 1- Clulas infectadas (virus con lisis celukar) provoca respuesta inmune al virus y partculas subvirales. 2- Los virus liberados a sangre quedan expuesto a a los anticuerpos neutralizantes y los sistemas de depuracin captan los inmunocomplejos. 3- Las clulas donde se replican los viriones son sometidas a interferones y si existen antgenos de superficie se provocar la lisis a travs del sistema inmunocomplejo- sistema complemento o por linfocitos T. 4- Terminan con las clulas infectadas que expresaban antgenos de superficie. 5- Comienza la convalecencia. b) Respuesta inmune en infecciones crnicas: No existe lisis celular y los viriones emergen por brotacin de membrana: 1- La destruccin por el proceso inflamatorio es menor. 2- El virus liberado inicia la respuesta y es tomando por macrfagos por lo que no existe contacto con el antgeno (respuesta inmune lenta). 3- Hay pocos anticuerpos neutralizantes. 4- Quedan bloqueados todos los anticuerpos de superficie y los linfocitos no van a reconocer al antgeno. 5- Se instala la cronicidad.
Mtodos serolgicos en el Laboratorio de Banco de Sangre Los parmetros a analizar en las muestras de sangre de los donantes son Antigenemia p24 y Anticuerpos anti-VIH-1y anti-VIH-2. Ag p24: su determinacin no tiene fuerza de ley, su aplicacin responde a una norma recomendada por la Asociacin Argentina de Hemoterapia e Inmunohematologa. Para aumentar la posibilidad de detectar el antgeno p24 en suero deben utilizarse tcnicas de muy alta sensibilidad y que agreguen agentes disociantes de los inmunocomplejos de los cuales forman parte. Una de las variantes ms utilizadas son los ensayos ELISA que incorporan al sistema Avidina Biotina como amplificador adicional de la reaccin antgeno anticuerpo. La fase slida es sensibilizada con anticuerpos monoclonales anti p24. La actividad del conjugado resulta de la accin secuencial de dos conjugados diferentes: el primero est formado por anticuerpos anti p24 I nstituto Superior de Ciencias de la Salud Carrera de Tcnico de Laboratorio I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre 18 biotina y el segundo por avidina enzima. Cada molcula de antgeno unida a la fase slida ser amplificada cuatro veces por las caractersticas de la reaccin entre avidina y biotina. Otro de los mtodos es usar como conjugado anticuerpos anti HVI-1 marcados con peroxidada que se revela con TMB. El Ag p24 es detectado aproximadamente una semana antes que los ensayos que detectan anticuerpos, 14 a 16 das de la infeccin. En el diagnstico peditrico se emplea esta metodologa con la realizacin de la disociacin cida que aumenta la sensibilidad por destruccin de los inmunocomplejos antgeno-anticuerpo. Tambin puede aumentarse la especificidad utilizando el test de neutralizacin. Anticuerpos anti-VI H: los mtodos que deben ser usados para su determinacin son los ELISA o bien las aglutinaciones de partculas de gelatina. Es exigencia que, cualquiera sea el mtodo, permita detectar a los dos tipos de virus, VIH1 y VIH2. Por lo tanto los ensayos deben incluir antgenos provenientes de ambos. La protena antignica representativa del VIH2 es la gp36, codificada por su gen env. Su eleccin para formar parte de la mezcla antignica obedece a que en las regiones env es donde se presenta la mayor variabilidad gentica en el VIH, mientras que las regiones gag y pol son ms conservadas. Actualmente existen pruebas para la deteccin conjunta de antgeno p24 y anticuerpos antiVIH. Su concepcin est orientada a los bancos de sangre contando con la ventaja de reunir ambos procedimientos en uno solo. Sin embargo, ante un resultado positivo, deber determinarse luego si se debe a antigenemia, a anticuerpos o a ambos, con mtodos que permitan su discriminacin. La prevalencia de la infeccin por VIH en la poblacin de banco, medida por la deteccin de Anticuerpos, es igual a 0,06%.
Algoritmo diagnstico de la infeccion por VIH
PRIMERA MUESTRA
TECNICA DE TAMIZAJE (DETECCIN DE ANTICUERPOS VIH-1/VIH-2)
No infectado NO REACTIVO 2da. Muestra REACTIVO (confirmado por repeticin)
Infectado en perodo de ventana REACTIVO
ADN pro viral por PCR cualitativa WESTERN BLOT
NO REACTIVO INDETERMINADO REACTIVO
SEGUIMIENTO Infectado
WB (1, 3, 6 meses) ADN pro viral por PCR cualitativa
Tratamiento
Se basa en: 1- Administracin de antirretrovirales. Existen dos tipos: los inhibidores de la transcriptasa (AZT, DDI, DDC, D4T, 3TC) y los inhibidores de la proteasa (indivovir, saquinovir, ritonavir, nelfinovir). I nstituto Superior de Ciencias de la Salud Carrera de Tcnico de Laboratorio I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre 19 2- Apuntalar el sistema inmunitario: se pretende actuar sobre el VIH bloqueando la sntesis de ADN viral. Son medicamentos txicos que pueden lesionar rin, hgado y sistema hematopoytico. Son foscarnet, HP23, BWA, 509U, ansamycina. Se administra asociados a estimuladores de la inmunidad (IL-2 e INF-gamma), a inmunoterapia adoptiva (transplante de mdula sea y transfuncin de leucocitos) y a inmunomoduladores (isoprinosina, timopectina, azimexon e indometacina). 3- Tratamiento de infecciones oportunistas.
Las vacunas frente al VIH pueden seguir dos estrategias, las dirigidas a crear una vacuna preventiva en individuos no infectados por el virus y las que desarrollan una vacuna teraputica en personas seropositivas. En la actualidad no existe ninguna vacuna preventiva que haya probado ser eficaz contra el virus del sida. Los dos nicos ensayos en fase III realizados hasta el momento que utilizaron la protena gp160 recombinante como base de la vacuna han fracasado. Esta situacin ha generado una polmica en la comunidad cientfica sobre las estrategias adecuadas para desarrollar una vacuna frente al VIH y los requisitos para iniciar estudios en fase III. Las vacunas teraputicas basadas en particulas virales desprovistas de la envuelta viral e inactivadas tampoco han demostrado eficacia clnica.
Virus VIH Virus VIH inactivo atenuado
Subunidades recombinantes
Pptido VIH
Vectores virales Plsmido de Vectores bacterianos recombinantes ADN recombinantes
04 - Unidad 01 - BIBLIOGRAFÍA ADICIONAL Monitorización de Indicadores de Gestión Que Relacionan La Actividad de Urgencias Del Hospital y La Del Laboratorio