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APLICACIN CLINICA DE LA
BIOLOGIA MOLECULAR
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Conceptos bsicos
Objetivos del Mdulo
Al final de este mdulo, los participantes estarn en capacidad de:
Describir la estructura del material gentico
Entender el mecanismo de transmisin y las implicaciones fisiolgicas
Entender la replicacin viral
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Conceptos bsicos
DNA (Acido Deoxyribonuclico)
Provee informacin
gentica para la codificacin de protenas
RNA (cido Ribonuclico)
Provee infromacin
para convertir la informacin genmica en
protenas.
DNA y RNA Son polinucletidos

Componentes de los Nucletidos
Deoxyribosa/Ribosa (5-carbon azucar)
Base nitrogenada unida al azucar
Grupo fosfato

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Conceptos bsicos
Flujo de Informacin Gentica
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Que son las Pruebas de cido nucleicos o
Pruebas Moleculares?
Son pruebas del laboratorio para detectar,
cuantificar o caracterizar un patgeno, utilizando su
material gentico (RNA o DNA)
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Conceptos bsicos HIV
HIV es un virus miembro
de la familia de los
Retrovirus, su material
gentico est compuesto
por RNA.
El Grupo de mayor
prevalencia es el M
(Major) el cual se
subdivide en al menos 11
subtipos.

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Conceptos bsicos HIV
La infeccin por HIV causa SIDA

SIDA es el estado final de la infeccin por VIH

SIDA es una condicin que gradualmente destruye el sistema inmune
haciendo que el cuerpo se vuelva vulnerable a enfermedades por
oportunistas.

El Virus se multiplica en las clulas blancas (CD4) encargadas de proteger
el cuerpo de la enfermedad.

La transmisin del VIH se hace por sangre, semen, secreciones vaginales
y otros fluidos biolgicos de una persona infectada.

La transmisin se da por el uso de material corto punzante contaminado y
existe la transmisin Madre-Hijo.


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Conceptos bsicos HIV
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Modulo 1: Conceptos bsicos
Ciclo de Vida del HIV
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Ciclo de Vida del HIV
Unin e Ingreso a CD4:
Los receptores del virus se unen a las clulas de inmunidad.
Estos receptores estn en la envoltura del virus
Las Glicoprotenas gp120 y gp41 se unen a los receptores celulares de
los CD4.
Despus de la unin, el virin entra a la clula y el RNA viral es
liberado.
Transcripcin Reversa y Sntesis:
El RNA viral es copiado por accin de la transcriptasa reversa en una
cadena doble de DNA
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Ciclo de Vida del HIV
Integracin viral y Transcripcin:
La protena viral integrasa, integra el DNA viral en el ncleo de la clula.
El DNA viral puede ser trascrito en RNA por accin de la RNA
polimerasa de la clula husped.
Sntesis de Protena virales:
En el citoplasma de la clula husped, los ribosomas transcriben el
RNA viral en protenas
Estas protenas son transportadas a la membrana celular con le RNA
viral para el ensamble del nuevo material gentico de las nuevas
clulas.
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Ciclo de Vida del HIV
Ensamble del nuevo virus y liberacin:
Los nuevos componentes virales se renen en la
membrana celular
Los nuevos ncleos que contienen RNA y protenas son
ensamblados formando nuevas partculas virales llamadas
viriones.
El virin se vuelve activo cuando la enzima viral proteasa
rompe las protenas en unidades activas volviendo el virin
infeccioso.
Las partculas virales son liberadas
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Ciclo de Vida del HIV
Replicacin
La vida media de los CD4+ infectados es de 1,6 das
La vida media de los viriones es de 6 Horas.
El Virus se replica logartmicamente (~10 billones/da)


SUPPLEMENTAL INFO FOR TRAINING PURPOSES ONLY Refer to Product Labeling for updated info.

Cmo afecta el HIV-1 / SIDA
clnicamente a los pacientes?

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Cmo afecta el HIV-1 / SIDA
clnicamente a los pacientes?
Objetivos del mdulo:
Al final de ste mdulo los participantes deben estar en capacidad de:
Describir la importancia de la cuantificacin de la carga viral
Describir la correlacin entre carga viral y la progresin a SIDA.
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Cmo afecta el HIV-1 / SIDA
clnicamente a los pacientes?
Los mdicos emplean la carga viral junto con el cuadro clnico del
paciente y otros marcadores de laboratorio como una ayuda en el
manejo de individuos infectados con VIH.

NO es una prueba de diagnstico.

La carga viral se emplea para determinar la progresin de la
enfermedad a SIDA y para monitorear la eficacia de la terapia a con
anti-retrovirales mediante la medicin de cambios en los niveles de
virus circulante durante el curso de la terapia.

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Cmo afecta el HIV-1 / SIDA
clnicamente a los pacientes?
Infeccin por HIV
Infeccin primaria/o Sndrome Agudo retroviral (ARS)
Disminucin de los CD4+
Altos niveles plasmticos de HIV (Carga Viral (VL)
Sntomas clnicos que se solucionan de 1 a 3 semanas y disminucin de la carga viral.
Latencia Clnica
Alta replicacin del virus
Disminucin de los CD4+
Promedio de duracin de 10 aos (Sin intervencin teraputica)
SIDA
El cuerpo se vuelve vulnerable a enfermedades por oportunistas
Muy bajos recuentos de CD4+
Altos niveles de VL.
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Respuesta Virolgica a la
infeccin por VIH

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Tipos de Terapia
La terapia Anti-retroviral bloquea la replicacin viral en las
clulas:
Inhibidores de la Transcriptasa Reversa (RTI), Enzima
encargada de iniciar el ciclo reproductivo del virus, bloquendo la
transcripcin de RNA a DNA.
Son de dos Clases:
NNRTI: Anlogos No-nucleosidos Analogues, se incorporan al
DNA y detienen la replicacin.
NRTI: Anlogos Nucleosidos, se unen directamente a la TR y
previenen la conversin de RNA a DNA.
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Tipos de Terapia
Inhibidores de Proteasa (PI) Bloquean la proteasa
enzima necesaria al final del ciclo reproductivo del HIV
(Inhibe la maduracin de protena y el ensamble viral)
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Tipos de Terapia
Inhibidores de Fusin: Actan sobre la glicoprotena gp41 del VIH-
1

p41 es el nombre para designar la glicoprotena de membrana del
virus VIH. Esta glicoprotena est presente en la infeccin de los
linfocitos CD4 por el virus VIH.

La regin genmica gp41 esta localizada en el gen de envoltura
del VIH ( tambin llamado gene gp160).

Los inhibidores de fusin son una categora de medicamentos
diseados para inhibir la infeccin del virus mediante su capacidad
de bloquear la fusin del virus y las clulas CD4.

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TECNICAS MOLECULARES
PARA EL DIAGNOSTICO
DE ENFERMEDADES
INFECCIOSAS HIV, HCV Y
HBV
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Que ventajas hay en utilizar Tests
de Biologa Molecular ?
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Las pruebas de Biologa Molecular utilizan el
material gentico de clulas como blanco
haciendo los ensayos mas sensibles y
especficos.

En agentes infecciosos ayuda a:
DIAGNOSTICAR
MONITOREAR
GUIAR EL TRATAMENTO.
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Tests de Biologa Molecular

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Los ensayos moleculares detectan cidos
Nucleicos DIRECTAMENTE en una muestra,
diferente a los ensayos inmunodiagnsticos que
detectan protenas (Ag/Ac) especficas.

Rastrear el blanco
no depende de la cantidad para su deteccin.

Los ensayos de Biologa Molecular hacen una
lectura del material gentico revelando
informacin precisa y especfica.
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Ensayos realizados en un Laboratorio de
Biologa Molecular
Examenes Cualitativos TMA / PCR / PCR Tiempo
Real / in house

Examenes Cuantitativos bDNA / PCR / NASBA /
PCR Tiempo Real / in house

Genotipaje LiPA / Secuenciamiento / in house
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Pruebas Disponibles en el
Mercado
b-DNA (Siemens): Amplificacin de seal

PCR (Roche): Amplificacin del cido Nucleico

NASBA (bioMrieux): Amplificacin del cido
Nucleico


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Como funcionan estas pruebas ?
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Transcription mediated amplification
(TMA)
La amplificacin medida por transcripcin, o TMA, se utiliza para
amplificar porciones de RNA y/o DNA.
La transcriptasa inversa crea una copia de DNA (cDNA) del cido
nucleico seleccionado.
La polimerasa del RNA inicia la transcripcin, sintetizando RNA. Algunos
de la amplificacin del RNA sintetizados de nuevo, vuelven a entrar en
el ciclo de TMA sirviendo de molde para nuevos ciclos de
amplificacin. Potencialmente se pueden sintetizar en una hora
billones de copias.
Las sondas marcadas con ster de acridinio (AE), hibridan
especficamente los productos de la amplificacin. El proceso de
ensayo de proteccin de la hibridacin (HPA) inactiva selectivamente
el marcado AE sobre las sondas no hibridadas para reducir al mximo
el ruido de fondo.
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TMA
La presentacin en un solo
tubo simplifica el anlisis y
minimiza la posibilidad de
contaminacin.
El proceso de captura
selectiva no requiere
preparacin de la muestra,
extraccin o
ultracentrifugacin.

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ESQUEMA DE TRABAJO DE
NASBA
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PCR

Esta tcnica utiliza una enzima denominada ADN polimerasa
que copia cadenas de ADN en un proceso que simula la
forma en la que el ADN se replica de modo natural en la
clula.

Este proceso permite a los cientficos obtener gran nmero
de copias a partir de un segmento determinado de ADN.
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FUNDAMENTO DE LA RT -PCR
1. Obtencin de la muestra
2. Transcripcin reversa del ARN ADNc
3. Amplificacin del ADN (PCR)
4. Hibridacin de amplicones con sondas especficas
5. Deteccin colorimetrica de productos amplificados
unidos a la sonda

Gen amplificado: Gen gag, 155 bp de largo
Primers SK 145 / SKCC1B
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CONVENTIONAL PCR
781P, 1137N PRIMERS
379 bp
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PCR en Tiempo Real
Es una PCR convencional en la que los termocicladores
llevan incorporados un sistema de deteccin de
fluorescencia, usando unas molculas especficas
denominadas fluorforos y quenchers.

Monitorea en tiempo real, lo que esta ocurriendo dentro de
cada tubo en cada ciclo de amplificacin y va a sustituir a
los pasos de amplificacin, electroforesis y anlisis de
imagen de una PCR tradicional.

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PCR en Tiempo Real
Los factores que afectan a la PCR cuantitativa son, entre otros:
optimizacin del protocolo de reaccin para maximizar su eficiencia.
Una pequea diferencia en la eficiencia de reaccin por ciclo, tan solo
un 90% tan eficiente como otra, la relacin de producto final entre
ambas reacciones despus de 40 ciclos ser alrededor de 65 a 1
evitar un nmero excesivo de ciclos de amplificacin
adecuado procesamiento de las muestras que asegure la eliminacin de
los inhibidores que pueden disminuir la eficiencia de amplificacin.

Requiere 3 ambientes exclusivos para evitar contaminacin.


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La fluorescencia aumenta con cada
enlace de DNA. Fluorescencia es
observada en tiempo real.
El colorante libre emite muy
poca fluorescencia
Deteccin de DNA con SYBR Green
Alinamiento de los primers
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Fundamento del Monitoreo de PCR con
el Sistema LightCycler
Comparacin con termocicladores convencionales
Ventajas

CUANTIFICACION
MAS RAPIDO
MAS FACIL
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Sondas Taqman
Applied Biosystems
Usan la actividad 5
exonucleasa de la Taq
(Thermus aquaticus)
polimerasa. Estas sondas
tienen un marcador
fluorescente en el extremo 5 y
una molcula que absorbe
("quencher") la fluorescencia
emitida por el marcador en el
otro extremo. La sonda hibrida
con el fragmento especfico (si
est presente) y, a medida
que se sintetiza la hebra
complementaria, la sonda se
va degradando por la accin
exonucleasa, liberando el
marcador emitiendo
fluorescencia.

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Comparacin de Pruebas de
Carga Viral para HIV-1
178-5,000,000
50-1,000,000
No 0.2 mL
1 mL
RT-PCR Abbott HIV-1
50-100,000 No 500 l TMA Gen-Probe HIV-1
50-50,000 (ultra) 23,500g/1 h 500 l
400-750,000
(standard)

200 L RT-PCR Roche Amplicor
Monitor 1.0
50-500,000 23,500g/1 h 1 mL bDNA Siemens VERSANT
(bDNA)
40-10,000,000 No 50 l-2 mL NASBA Organon Teknika
NucliSens
Dynamic Range
(Copies/mL) Ultracentrifugation
Required

Input Volume Method Test
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Caractersticas
Rango amplio
(50 500,000 copies/mL)
Sensibilidad
(50 copies/mL)

Plataforma automatizada:
Versant 440

Precisin y reproducibilidad
Deteccin de subtipo


Mtodo de amplificacin de seal
Beneficios
No necesita dilucin de la muestra
Elimina costo de repeticin
Permite el monitoreo de carga viral
De baja carga para determinar la respuesta de pacientes
a la terapia antiviral
hasta 168 muestras por corrida
Mxima eficiencia
Mnimo tiempo de manipulacin
Provee resultados confiables
Cuantifica subtipos AG
Asegura mayor confianza en los resultados
Reduce riesgo de contaminacin
VERSANT HIV-1 RNA 3.0 Assay (bDNA)
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EXAMEN
CUANTITATIVO (CARGA
VIRAL)
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A cuantificacin de la Carga Viral es considerada o marcador mas
adecuado para o establecimiento del pronstico (evaluacin de la
evolucin de la infeccin) y monitoreo clnico.
La prueba de Carga Viral es uno de los mtodos mas eficientes
para definir el inicio del tratamiento, evaluacin de la eficacia del
tratamiento, alerta de surgimiento de oportunistas.
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MIDE LOS NVELES
PLASMTICOS DE CIDO
NUCLICO DEL AGENTE
INFECCIOSO (HIV, HCV, HBV)
PUEDE SER DEFINIDA COMO:
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HIV - variacin de 0,5 log
Resultado en copias/mL
HCV - variacin de 2 log
1UI/mL = 5,2 copias/mL
HBV - variacin de 1 Log
1UI/mL = 5,6 copias/mL
Respuesta al tratamiento:
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Tecnologa de Amplificacin de Seal
emitido por molcula de DNA ramificado
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bDNA- branched DNA
Metodologa que cuantifica o cido Nucleico viral con
sondas especficamente diseadas que se hibridizan
directamente al blanco, tornando esta molcula
detectable a travs de una reaccin de
quimioluminiscencia.
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Hibridizacin: Una reaccin donde se aparean
las bases nitrogenadas complementarias
(puentes de hidrogeno). Los Hbridos se pueden
formar entre DNA-DNA, DNA-RNA o RNA-RNA.

Forman entre una fila pequea a una fila
grande donde exista una regin para
complementar entre las dos. Una hibridizacin
imperfecta tambin puede ser formada y cuanto
mas imperfecto el pareamiento, menos estable
ser la molcula.
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Que es una Sonda?

Sonda es un termino utilizado para denominar
un trecho de cido Nucleico, de secuencia
previamente conocida, diseada para la
pesquisa del cido Nucleico en cuestin. En
este caso, la secuencia de la sonda es marcada
con una seal de fcil deteccin (radioactivo o
qumico).
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HIV - Caractersticas Bsicas del Ensayo:

Sensibilidad: 50 copias/mL

Linealidad: 500.000 copias/mL

Especificidad: > 98,5 %

Productividad: hasta 168 pruebas por ensayo

No requiere extraccin de RNA pero necesita
formacin de pellet (precipitacin viral)

Incubacin overnight de 16 horas

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gag gene
pol gene
Tamao de regin utilizada para VERSANT HIV bDNA
> 80 sondas
~2700 pares de bases
Deteccin de Subtipos - HIV
Capacidad de detectar equivalentemente los
Subtipos de A K (Grupo M)
2 filas negativas de RNA
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HCV - Caractersticas Bsicas del Ensayo:

Sensibilidad: 3.200 copias/mL

Linealidad: 40.000.000 copias/mL

Especificidad: > 95,0 %

Productividad: hasta 168 pruebas por ensayo

No requiere extraccin de RNA ni formacin de pellet

Incubacin overnight de 15 horas
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gag gene 5UTR
Tamao de la region utilizada en VERSANT HCV bDNA
6 sondas de captura
17 sondas blanco
Deteccin de Subtipos - HCV
Capacidad de detectar Gentipos HCV: 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 4a, 5a e 6a.
1 fila positiva de RNA
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HBV - Caractersticas Bsicas do Ensayo:

Sensibilidad: 2.000 copias/mL

Linealidad: 100.000.000 copias/mL

Especificidad: > 95,0 %

Productividad: hasta 168 pruebas por ensayo

No requiere extraccin do RNA ni formacin de pellet

Incubacin de 1 hora + overnight de 15 horas

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gag gene Fila negativa
Tamao de region utilizada en VERSANT HBV bDNA
Deteccin de Subtipos - HBV
Capacidad de detectar Gentipos HBV: A, B, C, D, E e F
Doble fila de DNA
Page 62

Caractersticas Bsicas del Ensayo

Ensayo overnight realizado en 3 etapas :

1. Preparacin de pellet (HIV) y Lisis

2. Hibridizacin de las Sondas (blanco, captura,
pr-amplificacin, amplificacin y marcado)

3. Lectura en RLU (adicin del substrato)





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System 340 (bDNA Analyzer)
& Data Management Software
- Incubacin / Agitacin
- Lavado
- Lectura - RLUs
(Reaccin de quimioluminiscencia)

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Mdulo de Fludos, ensayo y computador integrados.
Mdulo de fludos
Versant 440 Molecular System
Mdulo de procesamiento del ensayo
Teclado
Monitor LCD
DriveCD-RW
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Versant bDNA 340 System
96 Testes por kit:

- 12 Testes : estndares y controles

6 estndares - A,B,C,D,E,F * (HIV / HBV)
3 controles:
- Negativo
- Positivo Bajo
- Positivo Alto

- 84 pacientes

* HCV: 4 estndares A, B, C, D, E

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Microplacas de pruebas de bDNA
2 microplacas 168 pacientes por rutina
84 pacientes/placa + 12 estndares y controles
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Reactivo de HIV RNA 3.0 bDNA
El Kit esta compuesto de 2 cajas de reactivos:
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Superfcie do poo
Secuencia para fijar el vrus a
la placa
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Superfcie de pozo
c. Nuclico Sonda Blanco
Sonda de Captura
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Superfcie de pozo
c. Nuclico Sonda Blanco
Sonda de Captura
Sonda
Pr-amplificadora
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Superfcie de pozo
Sonda de Captura
Sondas
Amplificadoras
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Sondas Blanco

Pre-amplificadoras
Micropozo
Blanco (vrus)

Sonda de
Captura

Micropozo con Sonda de Captura
Amplificadoras
hibridizadas con
Sondas
Marcadas
Con la adicin del Substrato ocurre la
reaccin de quimioluminiscencia.
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Iso C & Iso G
Bases Nitrogenadas no Naturales Ismeros de Citosina y Guanina

Reduce hibridizaciones no-especficas

Aumento de Especificidad del Ensayo

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CURVA
DE
RESULTADOS
bDNA
Page 75
Pg 1 - Resultado
Page 76
Pg 1 - Grfico da curva generada por los
estandares
Page 77
Pg 2 y 3 Resultados de las Muestras (cpias/ml)
Page 78
Pg 4, 5 e 6 Event Log
Page 79
PRINCIPALES CARACTERSTICAS
Tcnica simples, no necesita de extraccin de RNA
Poco susceptible a contaminacin
Necesita de apenas 01 sala
Reduccin importante en relacin al costo de
insumos consumibles
Reduccin de relacin tcnico / muestra / hora
trabajada
hasta 168 pacientes por tcnico/da
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Mtodos de pruebas de Resistencia al HIV
Genotyping
Sondas de hibridacin, secuenciacin DNA. Detecta mutaciones
genticas especificas sobre el genoma viral que correlaciona con la
resistencia viral a una droga particular.

Phenotyping
Prueba de susceptibilidad a las drogas
Determina a que drogas la muestra del paciente es susceptible o
resistente por exposicin directo a la droga.
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Uso de Genotipificacin para la prueba de
Resistencia del HIV a las drogas
Detectar las variaciones en las secuencias gnicas del virus que son capaces de
alterar la secuencia final o estructura de la enzima de la transcriptasa reversa (RT)
o enzima proteasa
Page 82
Trugene
Nuevo iMAC with OpenGene
Version 4.0
Page 83
El Genoma del HIV
9.8 kb
pol
gag
env
1.3 kb
Protease
Reverse
Transcriptase
TRUGENE target regions:
Page 84
Flujo de trabajo
Page 85
DISTRIBUCIN AREAS DEL LABORATORIO PARA
EL PROCESAMIENTO DE TRUGENE HIV-1




Page 86
Procedimiento
Extraccin y purificacin de Ac.
Nucleico
Trascripcin Reversa
Amplificacin
CLIP secuenciacin bi-direccional
separacin por electroforesis
Anlisis por GeneObjects
Reporte de Resistencia
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TRUGENE HIV-1 Report
(a travs de GeneObjects 4.0)
Anlisis por GeneObjects
Separacion de gel de electroforesis
(50 min/muestra)
Secuenciamento bidirecional Reacion CLIP
(2hs)
Amplificacion (4hs)
Extraccion (1h)
Transcripcion Reversa
Page 88
Preparacin del CLIP
A

C

G

T

A

C

G

T

Sample 1
Sample 2
Sample 3
Sample 4
Positive
Negative
RT Beginning
RT Beginning
RT Beginning
RT Beginning
RT Beginning
RT Beginning
P2
P2
P2
P2
P2
P2
Protease
Protease
Protease
Protease
Protease
Protease
RT-Middle
RT-Middle
RT-Middle
RT-Middle
RT-Middle
RT-Middle
Page 89
Page 90
MicroCel 500
HIV-1
PLACAS DE GEL DE POLIACRILAMIDA
Page 91
Page 92
1 2 3 4
D
i
r
e
c
c
i
o
n

d
e

m
i
g
r
a
c
i
o
n

A C G T
N
N

Migracion de los Fragmentos por Electroforesis
Page 93
Gel Electroforesis y Procesamiento
RT-Beginning
RT-Middle
Protease or P2
Page 94
Page 95
ANALIZANDO LA CORRIDA

Page 96
ANLISIS DE MUTACIONES

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ELABORACION DE REPORTE DE
RESISTENCIA

Page 98
TRUGENE

HIV-1
Reporte Mutacion
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DROGAS ANTI-RETROVIRALES ANALISADAS
Inhibidor de RT Nucleosdo y
Nucleotdo
Zidovudina
Didanosina
Lamivudina/Entricitabina
Estavudina
Abacavir
Tenofovir
Inhibidor de RT no Nucleosdo
Nevirapina
Efavirenz
Inhibidor de Protease
Saquinavir/Ritonavir
Indinavir
Nelfinavir
Amprenavir/Fosamprenavir
Lopinavir + Ritonavir
Atazanavir
Atazanavir + Ritonavir
Tipranavir + Ritonavir
Darunavir + Ritonavir
Page 100
MUCHAS GRACIAS
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Page 102
Esquema del Ensayo de bDNA HIV 3.0
MICROPLACA
Sondas de
Captura al
Microplaca
Sondas de
Captura
ARN del Virus de VIH-1
Sondas Diana
target probe
Sondas del Pre-amplificador
Sonda Marcadora
Substrato
Quimioluminescente