UNIVERSIDADE ESTADUAL DO MARANHO

CENTRO DE EDUCAO CINCIAS EXATAS E NATURAIS

DEPARTAMENTO DE QUMICA E BIOLOGIA
CURSO DE CINCIAS BIOLGICAS LICENCIATURA




























RELATRIOS DAS AULAS PRTICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
So Lus
2014
































YURI JORGE ALMEIDA DA SILVA - 1217118
RELATRIOS DAS AULAS PRTICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

Trabalho apresentado para obteno de nota na disciplina
Biologia Molecular do curso de Cincias Biolgicas
Licenciatura, Universidade Estadual do Maranho.

Prof. Dr. Jos Maurcio Dias Bezerra
So Lus
2014



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RELATRIO I: CONHECENDO O LABORATRIO

1 INTRODUO

O Laboratrio de Gentica e Biologia Molecular Warwick Estevam Kerr (LabWick) do
Curso de Biologia do Centro de Educao, Cincias Exatas e Naturais (CECEN), da
Universidade Estadual do Maranho (UEMA), foi inaugurado em 16 de dezembro de 2002.
Criado com objetivo de difundir a pesquisa e o ensino de Gentica e Biologia Molecular, com
nfase no desenvolvimento de trabalhos relacionados Gentica animal e da conservao.
A equipe do Laboratrio de Gentica e Biologia Molecular - LABWICK, tem
desenvolvido trabalhos utilizando marcadores moleculares que avaliam diversidade gentica,
relaes evolutivas, melhoramento gentico, mutaes associadas a variaes melnicas e
disperso de espcies invasoras. Os projetos em andamento abordam diversos grupos animais:
Roedores, Aves, Carnvoros, Tubares, Mamferos Aquticos, Tamandus, Tubares,
Abelhas, Camares e Moluscos. O Grupo tem a Coordenao e superviso dos professores:
Prof. Dr. Jos Maurcio Dias Bezerra. O laboratrio conta ainda com a parceria de instituies
como a UFPA e UFRGS.
O Labwick recebe o nome do professor, pesquisador, geneticista e ex-reitor da
Universidade Estadual do Maranho (UEMA), doutor Warwick Estevam Kerr, considerado o
maior especialista em gentica de abelhas do mundo. O professor Kerr assumiu a Reitoria da
UEMA em maio de 1987, e deixou o cargo em fevereiro de 1988, ficando frente da
instituio, portanto, durante 9 meses (PORTAL UEMA, 2013).

2 OBJETIVOS

Nesta foi tomado cincia das normas de segurana, vidrarias e equipamentos bsicos de
um laboratrio de Qumica, bem como aprender a manuse-los corretamente tornando-os
aptos a desenvolverem quaisquer procedimentos experimentais futuros. Os pontos
importantes a serem assimilados so:
Utilizao de equipamentos;
Procedimento adequado de lavagem de vidrarias.
Normas de segurana no laboratrio;
Associar o nome de cada material/ equipamento com seu uso especfico;



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Reconhecer os diversos materiais de um laboratrio;
Aplicar corretamente a tcnica de utilizao de cada material.

3 REGRAS DE SEGURANA

Use sapatos fechados, jaleco e calas sempre que estiver no laboratrio.
Use sempre guarda-p, de algodo com mangas compridas.
No fume, no coma ou beba no laboratrio.
Evite trabalhar sozinho, e fora das horas de trabalho convencionais.
No jogue material insolvel nas pias (slica, carvo ativo, etc). Use um frasco de
resduo apropriado.
No jogue resduos de solventes nas pias. Resduos de reaes devem ser antes
inativados, depois armazenados em frascos adequados.
No entre em locais de acidentes sem uma mscara contra gases.
Nunca jogue no lixo restos de reaes.
Realize os trabalhos dentro de capelas ou locais bem ventilados.
Em caso de acidente (por contato ou ingesto de produtos qumicos) procure o mdico
indicando o produto utilizado.
Se atingir os olhos, abrir bem as plpebras e lavar com bastante gua. Atingindo outras
partes do corpo, retirar a roupa impregnada e lavar a pele com bastante gua.
No trabalhar com material imperfeito, principalmente o de vidro que contenha pontas
ou arestas cortantes.
Fechar com cuidado as torneiras de gs, evitando o seu escapamento.
Realize todo o trabalho com substncias volteis na capela
Trabalhe longe de chamas quando manusear substncias inflamveis

Figura 1. Laboratrio de Gentica, Labwick.



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4 MANUSEIO DE PRODUTOS QUMICOS

Nunca manusear produtos sem estar usando o equipamento de segurana adequado
para cada caso.
Usar sempre material adequado. No faa improvisaes.
Esteja sempre consciente do que estiver fazendo.
Comunicar qualquer acidente ou irregularidade ao seu superior.
No pipetar, principalmente, lquidos custicos ou venenosos com a boca. Use os
aparelhos apropriados.
Procurar conhecer a localizao do chuveiro de emergncia e do lava-olhos e saiba
como us-lo corretamente.
Nunca armazenar produtos qumicos em locais imprprios.
No fumar nos locais de estocagem e no manuseio de produtos qumicos.
Figura 2. Bancadas Labwick.
Figura 3. Sala do Brometo, Labwick.



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No transportar produtos qumicos de maneira insegura, principalmente em recipientes
de vidro e entre aglomeraes de pessoas.
Ler o rtulo antes de abrir a embalagem.
Verificar se a substncia realmente aquela desejada.
Considerar o perigo de reao entre substncias qumicas e utilizar equipamentos e
roupas de proteo apropriadas.
Abrir as embalagens em rea bem ventilada.
Tomar cuidado durante a manipulao e uso de substncias qumicas perigosas,
utilizando mtodos que reduzam o risco de inalao, ingesto e contato com pele,
olhos e roupas.
Fechar hermeticamente a embalagem aps a utilizao.
Evitar a utilizao de aparelhos e instrumentos contaminados.
No comer, beber ou fumar enquanto estiver manuseando substncias qumicas.
Lavar as mos e as reas expostas regularmente.
Tratar dos derramamentos utilizando mtodos e precaues apropriadas para as
substncias perigosas.
Primeiros Socorros
Cortes e ferimentos devem ser desinfetados e cobertos.
Queimaduras leves com fogo ou material quente, tratar com GUA FRIA/ GELADA
ou PICRATO DE BUTESIN ou CIDO PCRICO.
Queimaduras cutneas:
COM CIDOS - lavar com bastante gua e sabo e, em seguida, neutralizar com
LEITE DE MAGNSIA ou BICARBONATO DE SDIO.
COM BASES - lavar com muita gua e, em seguida, com soluo diluda de CIDO
ACTICO (0,1N).
COM FENOL - lavar abundantemente com LCOOL ETLICO.
Queimaduras oculares com substncias cidas ou bsicas devem ser lavadas com gua
(usar lava - olhos) e tratadas com colrio estril.
I ngesto:
DE CIDOS - tomar HIDRXIDO DE CLCIO, LEITE DE MAGNSIA ou
LEITE. No tomar bicarbonato de sdio ou carbonato de clcio. Estes produtos so
contra-indicados porque produzem distenso e facilitam a perfurao.
DE BASES - tomar soluo de cido actico 1/100 ou vinagre 1/10 ou gua de limo.



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DE SAIS DE CHUMBO - lavar com gua em abundncia. Aps, beber grande
quantidade de gua seguida de duas colheres de SULFATO DE MAGNSIO (sal de
Epson).
I ntoxicao por gases:
REGRA GERAL: remova o paciente da exposio, fazendo-o respirar profundamente e
mantendo-o aquecido.

5 RESULTADOS E DISCUSSES

Foi realizado no laboratrio, a observao dos equipamentos de vidro, porcelanas e
equipamentos diversos, com isso foi aprendido a associao correta dos materiais ou
equipamentos com o seu uso apropriado, familiarizando cada vidraria a sua funo no
laboratrio.
Alm de relembrar algumas noes bsicas de normas de segurana com o intuito de
precaver acidentes ocorridos nos laboratrios, tornando assim um ambiente mais seguro.

6 CONCLUSO

Com as prticas realizadas, podemos associar corretamente cada material com o seu uso
especfico, facilitando a compreenso de cada experincia e evitando equvocos.
Normas de segurana devem-se ser seguidas para que no possam ocorrer futuros acidentes
provenientes pela falta de conscientizao dos mesmos a respeito de como se deve proceder
no mbito do laboratrio.
Manuseios de vidrarias deve-se ter muito cuidado, na lavagem dessas vidrarias deve-se
ter os devidos cuidados tambm.

REFERNCIAS

LENZI, Ervim et all. Qumica Geral Experimental. Rio de Janeiro: Freitas Bastos, 2004.
390p. Qumica, uma cincia experimental, 1 ed., Edart, 1967, v. 1, Apndice 3 (trabalho com
vidro).






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RELATRIO II: PIPETAGEM

1 INTRODUO

O mtodo de pipetagem considerado o meio mais eficaz para a transferncia de
reagentes e/ou amostras. Em corantes e reagente mais comum a observao de meniscos
superiores. A utilizao da pipeta eficiente uma vez que possui pluralidade em volumes o
que permite a transferncia de valores exatos e precisos para realizao de testes e exames que
exigem quantidades precisas.
Quando a pipeta for manuseada, jamais deve-se coloc-la na bancada ou segur-la de
maneira incorreta, pois assim a pipeta pode se contaminar e consequentemente contaminar o
reagente, interferindo no resultado.
Deve-se observar tambm a subdiviso das pipetas, pois cada exame exige uma escala
diferente, sendo assim a seleo errnea das pipetas em relao a escala e ao volume interfere
no resultado.
Geralmente em laboratrios so utilizadas com mais frequncia valores de nmeros
inteiros, sendo assim usa-se as pipetas graduadas que permitem mais facilidade de manuseio,
isso se deve pois, com uma mesma pipeta possvel realizar mais de um exame.


2 OBJETIVOS

Objetivo Geral
Pipetar para preparo de solues

Objetivos Especficos
Avaliar todo o processo da pipetagem;
Aprender a forma correta da utilizao de pipetas;
Conhecer os tipos de pipeta existentes e as diferenas entre elas.

3 MATERIAIS UTILIZADOS
Pipetas automticas
Pipetas Graduadas
Ponteiras (azul, branca e amarela)



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Papel absorvente
Balo de fundo chato
Bquer
gua
Pera


4 PROCEDIMENTO

Primeiramente foi observado se o lquido era transparente ou opaco que logo foi
apresentado lquidos de colorao roxa e rosa, porm permaneciam translcidos, dando
origem a meniscos inferiores.
Logo aps adicionou-se pera uma pipeta graduada e foi utilizada a pipeta automtica,
ambas aleatoriamente para que estes mesmos lquidos fossem pipetados. Houve a verificao
do volume das pipetas graduadas e tambm foi possvel observar que para cada determinado
volume na pipeta automtica existe uma ponteira especfica, onde a ponteira amarela ou
branca usada para medies de volumes entre 1 e 200m, a ponteira branca maior
utilizada em medies de 200 a 250m e azul para medies acima de 250m.
Ento, para que a ponteira seja fixada, deve-se coloca-la na ponta da pipeta e torcer, o
encaixe das ponteiras so devidamente corretas s pipetas, no momento do encaixe a pipeta
foi segurada na parte superior e as letras voltadas para frente.
Aps a preparao das pipetas, foi pipetado altura dos olhos os reagentes preparados, o
lquido foi aspirados at posicionar o menisco na altura dos olhos e ento o mbulo foi soltado
lentamente at o 1 estgio e em seguida o 2 estgio.
Logo, foi observado pelo T1 a semelhana e/ou diferena entre duas pipetas graduadas de
volumes diferentes.

5 RESULTADO

Foi possvel observar que, as pipetas analisadas pelo T1, apesar de transparecerem
idnticas ou com caractersticas semelhantes, possuam diferenas.
Foi observado que a pipeta marrom possua volume de 0,2L e uma subdiviso de 1/1000-
1L, enquanto a amarela continha volume de 1mL e subdiviso de 1/100- 0,01L.



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Outra observao realizada, foi que a pipetagem exige tcnica, objetividade e
pacincia. A pipetagem dos reagentes foi realizada com xito deixando alguns pontos a
desejar, como por exemplo levar altura dos olhos, que aps ser corrigido pelo professor, o
erro no foi cometido novamente.

6 DISCUSSES
1 Porque ao transferir 12l voc utilizou uma micropipeta de 20 ou de 50 e no uma
de 100?
R- Pois as micropipetas de 20 e de 50 esto mais prximas para transferir uma substncia
com volume de 12l, do que uma micropipeta de 100, que no caso teria que alterar muito o
volume, correndo o risco de at danificar essa micropipeta.

2- Foi solicitado que voc retirasse 150l de uma soluo. No entanto acontece que as
micropipetas disponveis so P1000 e P100. Qual a micropipeta voc usaria? Justifique
sua metodologia.
R- Usaria a micropipeta de P100, pois precisaria usa-la apenas duas vezes para obter 150l. J
na micropipeta de P1000, acabaria me atrapalhando, j que tem um volume permitido de 200
a 1000l.

3 Qual a importncia do rigor nos procedimentos de medio com micropipeta?
R- Pois qualquer falha, excesso de amostra ou reagente, poder influenciar nos laboratrios de
pesquisa, de controle de qualidade e at mesmo clnicos.

4 Descreva em que momento se utiliza o primeiro e o segundo estgio na
micropipetagem?
R- O primeiro estgio utilizado quando pressiona-se suavemente o mbolo da micropipeta
at emergir a ponteira no lquido, assim libera o mbolo lentamente at a posio de repouso e
espera-se um segundo para permitir que o liquido se acomode denro da ponteira. O segundo
estgio utilizado quando coloca-se a ponta da ponteira a um ngulo de 10 a 45, contra a
parede interna do recipiente e pressiona-se o mbolo suavemente at o 1 estgio, e pressiona-
se o mbolo at o final, deslizando a ponteira na parede para remover o restante de amostra.

5 Pipetas de grande volume devem se imersas de 5 a 6mm e em pequenos volumes de 2
a 3. Qual a importncia de mergulhar a pipeta na profundidade correta?



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R- Para que haja coleta corretamente do lquido ou substncia.

6 Foi solicitado que voc verifisse em l a graduao de uma micropipeta que marcava
como a figura ao lado. Como voc leria essa regulagem?
R- Cinquenta e trs microlitros. 53l.
0
5
3


7 CONCLUSO

Aps a realizao de todos os procedimentos exigidos nesta tcnica, pode-se concluir
que, a pipetagem de reagente e/ou solues extremamente importante e eficiente, tanto para
a exatido de vrios exames, quanto para a excelncia de resultados que utilizam reagentes de
volumes exatos.
A tcnica de pipetagem primordial em testes bioqumicos e em gentica pois
permitem a anlise de amostras especficas que necessitam de valores precisos.

REFERNCIA

PORTAL QUMICA UFPA. Operaes volumtricas.
<http://www.quimica.icen.ufpa.br/operacoes%20volumetricas.htm> acessado em
022/07/2014 s 18:37



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RELATRIO III - EXTRAO DE DNA DE ERVILHAS

1 INTRODUO

O DNA o responsvel pelo armazenamento e transmisso da informao gentica
que expressa pela produo das variadas protenas que compem um ser vivo. Esta
informao copiada ou transcrita nas molculas de RNA, cujas seqncias contm o cdigo
para a ordenao especfica de aminocidos de uma cadeia polipeptdica que formaro as
protenas.
Uma molcula de DNA constituda por duas cadeias que se organizam em uma
estrutura de dupla-hlice, sendo que cada cadeia simples de DNA formada por uma
molcula do acar desoxirribose, uma base que pode ser adenina, guanina, citosina ou timina
e um grupo fosfato. Existem apenas esses quatro tipos de bases no DNA: adenina e guanina
pertencem ao grupo das purinas, enquanto que timina e citosina so do grupo das pirimidinas.
As molculas de DNA so encontradas dentro das clulas de todos os seres vivos,
incluindo plantas, fungos e bactrias. Com exceo das bactrias, nas quais o DNA fica solto
dentro da clula, em muitos outros seres vivos ele fica acomodado dentro de um
compartimento existente, denominado ncleo. No caso de organismos eucariotos (aqueles que
possuem ncleo individualizado por ser envolto por uma membrana, como, por exemplo,
seres humanos, outros animais e vegetais), grande parte do DNA est justamente dentro do
ncleo das clulas.
Para comprovar que realmente existe DNA em todas as clulas vias, temos que tentar
retir-lo e visualiz-lo. Protocolos similares so usados nas extraes de DNA de vrias
fontes, como amostras de sangue, tecidos, frutas, saliva, etc., e consistem de:
Ruptura (fsica e qumica) das membranas celulares para liberao do material
gentico;
Desmembramento dos cromossomos em seus componentes bsicos: DNA e protenas;
Separao do DNA dos demais componentes celulares.
Para que haja a ruptura da parede celular, expondo o material gentico das clulas,
realiza-se o corte ou esmagamento do material. Para o desmembramento, as molculas de
detergente desestruturam as molculas de lipdios presentes nas membranas celulares e o
aquecimento favorece a reao, desnaturando as molculas de DNA. A adio de sal ajuda a
manter as protenas dissolvidas no lquido extrado, impedindo que elas precipitem com o
DNA. Finalmente, para conseguir isol-lo dos demais componentes, utiliza-se o lcool, pois o



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DNA insolvel nele e tem menor densidade que os outros constituintes celulares. Quanto
mais gelado estiver o lcool, menos solvel o DNA vai estar. Por isso to importante que o
etanol seja mantido no freezer ou em um banho de gelo at o momento do experimento.
A estrutura de dupla-hlice s pode ser enxergada de modo indireto e com o auxlio de
aparelhos sofisticados. Milhares de fitas emaranhadas de DNA podem ser observadas em um
experimento de extrao de material gentico de plantas ou frutas.

2 OBJETIVO

Verificar como acontece a extrao do DNA da ervilha e identificar a funo de cada
um dos reagentes utilizados no procedimento de extrao.

3 MATERIAL

-Ervilhas verdes -Papel de filtro de caf -Proveta
-Sal (NaCl) -Funil -TBE
-Alcool Absoluto -Colheres -Eppendorf
-Detergente lquido neutro -Becker -Centrifuga
-gua -Tubos de ensaio -Pipeta Pasteur
-Liquidificador -Bastes de vidro - Proveta.

4 METODOLOGIA

1) Congelar 150g de ervilhas em freezer;
2) Colocar 300ml de gua gelada em um liquidificador para macerar as ervilhas;
3) Aps triturar as ervilhas coloca-las em um Becker de vidro;
4) Em um outro Becker misturar 150ml de gua gelada, uma colher de sopa de detergente
neutro e uma colher de ch de sal (NaCl) e, em seguida, mexer a mistura bem devagar com
um basto de vidro, formando assim, a soluo de extrao;
5) Colocar uma proporo de 3:1 (33ml soluo de extrao: 100ml triturado de ervilhas) de
soluo de extrao sobre o triturado de ervilhas;
6) Misturar levemente a soluo com o basto de vidro;
7) Incubar em temperatura ambiente por 30 minutos, mexendo, de vez em quando a mistura,
com o mesmo basto;



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8) Filtrar o sobrenadante no papel filtro de caf com a ajuda de um funil em um outro Becker
de vidro;
9) Colocar 15ml do liquido filtrado (sobrenadante) em um tubo de ensaio;
10) Despejar, delicadamente, sobre a soluo, 30ml de lcool gelado, dobrando o volume;
11) Observar a cada dois minutos a aglutinao do DNA e o seu aparecimento, durante 12
minutos;
12) Transferir 10ml do volume total (45ml) para um outro tubo de ensaio e centrifugar por 5
minutos a 7000rpm;
13) Observar a formao do pellete de DNA no fundo do tubo;
14) Acrescentar 200ul de TE a 1% e vortexar;
15) Retirar 100ul da soluo e colocar em um tubo de eppendorf e acondicionar em freezer.

5 RESULTADOS

O DNA da ervilha foi extrado e pde ser visualizado conforme as figuras 1, 2 e 3.



Foram feitas 3 amostras com propores diferentes, sendo as seguintes: 1:1, 3:1 e 4:1.
Aps as etapas do mtodo para extrao de DNA de clulas de ervilhas o resultado obtido foi
formao de um emaranhado branco de filamentos que, no caso do isolamento com lcool
gelado, ficou mais prximo superfcie do tubo de ensaio de todas as amostras, entretanto a
velocidade da reao foi
diferente em cada uma, a
expresso mais marcante da nuvem de DNA foi na amostra 3:1 pois esta seguiu o protocolo.
Isto evidencia que o DNA , de fato, menos solvel no lcool gelado, pois a formao do
emaranhado mais prximo superfcie do tubo de ensaio indica que o DNA est mais
Figura 1 Ervilha macerada em 3
amostras.
Figura 2 Filtrao do
sobrenadante.
Figura 3 Formao da nuvem de
DNA de 3 amostras.



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separado dos demais componentes celulares, os quais so mais densos e carregam o DNA
para o fundo quando associados a ele.
A utilidade prtica de cada um dos reagentes utilizados no experimento foi
identificada. O detergente aplicado com a finalidade de desconstruir as molculas de
lipdeos que constituem as membranas celulares e, desta forma, o contedo das clulas de
ervilha, incluindo as protenas e o DNA, liberado. Em outras palavras, os lipdeos formam
complexos com o detergente e precipitam. O sal ajuda a manter as protenas dissolvidas no
lquido extrado, evitando que as mesmas precipitem junto com o DNA. As molculas de
DNA possuem carga negativa devido presena do grupo fosfato; logo, as molculas
individuais de DNA tendem a se repelir. O sal tambm atua fornecendo ons de carga positiva
que neutralizam a carga negativa das molculas de DNA, permitindo que estas se condensem
quando em contato com uma soluo alcolica. O lcool, por sua vez, atua na separao do
DNA, que menos denso, dos demais componentes celulares, pois o DNA
praticamente insolvel no lcool.
O procedimento experimental seguido relativamente simples e permite a
visualizao clara do emaranhado de filamentos de DNA que se forma. Entretanto, a estrutura
de dupla-hlice s pode ser visualizada de modo indireto e atravs de aparelhos sofisticados.
O que se observou a olho nu foram milhares de fitas de DNA juntas.

6 DISCUSSES

1 - Qual a importncia da triturao e do congelamento das ervilhas?
R- A s ervilhas precisam ser trituradas para quebrar os tecidos e clulas, deixando assim o
DNA exposto. O congelamento inibe a ao de endonucleases.

2 - O que ocorreu aps a adio da soluo de extrao ao macerado de ervilhas?
R- Ocorreu precipitao.

3 - Em que fase se encontra o DNA aps a adio da soluo de extrao?
R- Na fase alcolica (sobrenadante).

4 - Qual a funo da gua gelada?
R- Para que continue a ocorrer a inibio de endonucleases.




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5 - Qual a funo do detergente?
R- O detergente influencia a permeabilidade das membranas, que so constitudas em sua
maioria por lipdios. Com a ruptura das membranas os contedos celulares incluindo o DNA,
so liberados e acabam se dispersando na soluo.
6 - Qual a funo do sal?
R- O sal contribui com ions positivos e negativos. Os positivos neutralizam a carga negativa
do DNA, e os negativos, as histonas, permitindo que o complexo DNA + Histonas se enovele.
Se o sal estivesse ausente, ele poderia desintegrar-se. O sal ainda aumenta a densidade do
meio, facilitando a migrao do DNA para o lcool.

7 - Qual a funo do lcool e por qu ele deve estar gelado?
R- O lcool etlico permite uma maior desidratao das molculas.

8 - Onde inicia a formao dos filamentos de DNA no tubo de ensaio?
R- Na parte lquida da soluo.

9 - Aps o perodo de 12 minutos em que fase da soluo o DNA permanece?
R- Na fase aquosa.
10 - Qual a importncia da centrifugao da soluo?
R- Para que ocorra a separao da parte slida e lquida para observao melhor dos gomos
de DNA.
11 - Descreva de que forma o DNA aparece no tubo de ensaio.
R- Formando um precipitado branco, como se fosse nuvens de DNA.

12 - Quando a proporo do triturado de ervilhas em relao a soluo de extrao
modificada para 1:1 e 4:1, o que acontece com o resultado final da extrao de DNA?
R- Demora mais para formar o precipitado de DNA.

7 CONCLUSO

O resultado obtido evidenciou que o DNA das clulas de ervilha menos solvel no
lcool gelado do que no lcool temperatura ambiente, e que propores diferentes da
soluo de extrao influenciaro no tempo de reao das amostras. O emaranhado branco de
filamento de DNA que se forma fica mais prximo superfcie do tubo de ensaio no caso da
extrao com lcool gelado.



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Existem diversos mtodos de extrao de DNA e pudemos realizar um desses mtodos
de forma simples e satisfatria com materiais que podem ser encontrados em qualquer
cozinha e podem ser elaborados em sala de aula.

REFERNCIAS

ABUD, A. K. S. Notas de Aula de Laboratrio de Engenharia Qumica II. Universidade
Federal de Alagoas. Macei-AL, 2011.

BIOINFO. Extrao de DNA de Morangos. Disponvel em:
<http://www.bioinfo.ufpb.br/difusao/pdf/extracaodednademorango.pdf>. Acesso em: 24 de
Junho de 2014 s 21h30min.

CIENCIAMAO. Extrao do DNA do morango. Disponvel em:
<http://educar.sc.usp.br/licenciatura/2003/siteprojeto/2003/2_extracao_DNA_cebola_com_pl
ano.pdf>. Acesso em 24 de Junho de 2014 s 21h15min.

EDUCAR. Extrao do DNA da cebola. Disponvel em:
<http://educar.sc.usp.br/licenciatura/2003/siteprojeto/2003/2_extracao_DNA_cebola_com_pl
ano.pdf>. Acesso em 24 de Junho de 2014 s 21h.








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RELATRIO IV: ELETROFORESE DE DNA EM GEL DE AGAROSE A 1%

1 INTRODUO

A eletroforese consiste na separao de molculas ionizadas, de acordo com suas
cargas eltricas e pesos moleculares em campo eltrico. Molculas orgnicas como RNA,
DNA e protenas so separadas pela migrao destas em um gel durante a aplicao de um
potencial eltrico. O princpio da eletroforese utilizada para separao de DNA, por exemplo,
baseia-se na carga total negativa do DNA (conferida pelos grupamentos fosfatos). Sendo
assim, as molculas de DNA tendem a migrar em direo ao plo positivo (ctodo).
Uma molcula de DNA, quando exposta a um campo eltrico, migra para o eletrodo
na velocidade ou mobilidade eletrofortica, proporcional a fora do campo e a carga lquida
da molcula. A mobilidade eletrofortica tambm inversamente proporcional ao coeficiente
friccional da molcula, que, por sua vez, funo do tamanho e forma da molcula, e da
viscosidade do meio.
Nessa tcnica utilizada uma cuba com dois compartimentos, eletrodos, soluo
salina para conduo de eletricidade. Entre os compartimentos da cuba encaixado o gel que
deve ficar submerso. Pequenos poos so feitos no gel durante sua preparao com pentes. As
amostras so pipetadas nesses poos. Essas amostras devem ser previamente misturadas a um
corante, chamado gel loading buffer. Esse corante uma soluo composta de azul de
bromofenol (e/ou xileno cianol) e glicerol e utilizado para aumentar a densidade das
amostras, impedindo que elas saiam dos poos, alm de dar a colorao que serve como
indicador do progresso eletrofortico. Para a migrao, aplica-se voltagem e corrente eltrica
ao sistema.
A distncia que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicao, comparada
com a distncia que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel.
Esses fragmentos so os ladders (marcadores de peso molecular), misturas de segmentos de
DNA de tamanhos variveis e eqidistantes entre si, e que so aplicados em um poo no gel
no incio do processo.
A eletroforese pode ser conduzida em soluo com gradiente de densidade ou em
diferentes meios-suporte, tais como papel de filtro, slica gel, membranas de acetato de
celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida, entre outros. O suporte deve ser qumica e
fisicamente inerte, de modo a no interferir na mobilidade das molculas. No caso de
eletroforese em gis, como poliacrilamida e agarose, a migrao das molculas



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profundamente influenciada pelas malhas porosas. Em relao a gis de poliacrilamida ou
agarose, a porosidade do gel determina o poder de resoluo das bandas, sendo este
geralmente decorrente do grau de polimerizao entre os monmeros. Gis de poliacrilamida
so frequentemente usados para anlises de alta resoluo (seqenciamento de DNA/RNA)
em anlises proticas e isoenzimticas que requeiram maior definio das bandas. Gis de
agarose tambm so amplamente usados na separao de DNA/RNA, especialmente para
fragmentos maiores.
A eletroforese em gel de agarose o mtodo padro usado para separar, identificar,
analisar, caracterizar e purificar fragmentos de DNA. A tcnica capaz de separar misturas de
fragmentos de DNA que no podem ser separados por outros meios, tais como centrifugao
com densidade de gradiente ou por velocidade de sedimentao. A localizao do DNA no gel
pode ser determinada diretamente.
Os gis de agarose so, geralmente, corados com solues de brometo de etdio (EtBr),
uma substncia intercalante que revela os cidos nuclicos ao fluorescer sob luz ultravioleta.
Concentraes de at 1ng de DNA podem ser visualizadas por exame direto do gel na luz
ultravioleta.

2 OBJETIVO
Observar como feito e utilizado o gel de agarose em laboratrio.

3 MATERIAL

-Agarose
-TBE 1 X
-Brometo de Etdeo
-Blue
-Amostra
-Eppendorf

- Tampo carregador de
DNA
- Film plstico
-Ponteira
-Becker
-Placa de petri
-Luvas descartveis em
ltex
-Fonte Eltrica
-Cuba Pequena
-Pente
-Micropipetas
-Balana de Preciso
-Fita adesiva
-Transluminador
-Mquina Fotogrfica

4 METODOLOGIA




20
1) Colocar tampo TBE 1 X na cuba de eletroforese at o mesmo atingir o nvel timo
para a realizao da corrida do DNA;
2) Passar fita adesiva nas extremidades da cama;
3) Colocar os pentes no encaixe da cama;
4) Pesar 0,5g de agarose em balana de preciso;
5) Misturar a agarose em 50ml de tampo TBE 1X em um becker;
6) Passar film plstico tampando o becker e furar o plstico com a ajuda de uma ponteira;
7) Colocar o becker em cima de uma placa de petri;
8) Levar a mistura ao mcroondas e ferver por 30s;
9) Retirar o film plstico do becker;
10) Misturar 1 de brometo de etdeo;
11) Esperar o gel esfriar um porco;
12) Derramar o gel em cima da cama;
13) Esperar o gel esfriar totalmente at a sua completa solidificao (o que demora,
aproximadamente, 30min.;
14) Retirar os pentes e a fita adesiva;
15) Colocar a cama dentro da cuba de modo que os pocinhos fiquem prximos ao polo
negativo;
16) Completar a cuba com tampo TBE 1X at que este preencha todos os poos e
encubra completamente o gel;
17) Colocar de 2-3 de tampo carregador em uma placa, em ordem linear de acordo
com o nmero de amostra a ser analisada;
18) Misturar de 1-10 de DNA ao tampo carregador, at a sua completa
homogeneizao;
19) Inserir o DNA de cada amostra homogeneizada nos diferentes pocinho do gel;
20) Fechar a cuba de modo que os eletrodos negativo e positivo da fonte encaixem,
correspondentemente, com os eletrodos da cuba negativo e positivo;
21) Ligar a fonte a 100V, 70W e 80mA e deixar correr o DNA no gel por,
aproximadamente, 20min;
22) Desligar a Fonte e abrir a cuba para a retirada do gel junto com a cama;
23) Colocar o gel sobre o transluminador com luz UV, utilizando a proteo de acrlico;
24) Ligar o transluminador e verificar a qualidade do DNA e o padro de bandas no gel;
25) Fotografar o gel no transluminador;



21
26) Desligar o transluminador e retirar o gel, acondicionando-o em ambiente seguro at o
seu descarte final.


5 RESULTADOS

As protenas apresentam agrupamentos de cargas positivas e negativas, provenientes
dos aminocidos que as constituem.
As cargas so resultadas da ligao ou perda de prtons
Os prtons (H
+
) so ons com carga positiva. Alguns grupos so neutros e ao
receberem um prton, tornam-se positivos ( o caso do grupo -NH
2
, que, ligando-se a prtons,
convertido a -NH
3
+
). Outros grupos so neutros, mas, ao perderem um prton, tornam-se
negativos ( o caso do grupo-COOH, que se converte em -COO
-
). Estas perdas e adies
dependem do pH do meio em que a protena se encontra.
Uma propriedade das cargas eltricas em soluo que quando uma diferena de
potencial aplicada soluo - ou seja, quando os polos de uma bateria so conectados
soluo as cargas positivas so atradas pelo polo negativo e as cargas negativas, pelo polo
positivo, deslocando-se em direo a eles.
A principal motriz para o movimento das cargas em soluo a diferena de potencial.
Consequentemente, quanto maior a intensidade da voltagem aplicada, maior ser a velocidade
com que as cargas se dirigem ao polo de sinal oposto.
Dessa forma, quanto maior for a carga da macromolcula, maior ser a sua velocidade de
migrao eletrofortica.
O tamanho da macromolcula tambm influi decisivamente na sua velocidade de
migrao. Isso porque existe um componente friccional entre a macromolcula, o solvente, o
suporte e os demais ons em soluo que faz com que quanto maior a macromolcula, menor a
sua velocidade de migrao em direo ao polo de sinal oposto.

6 DISCUSSES

1 - Explique qual a funo da fonte e do gel de agarose na eletroforese de DNA?
R- A fonte fornece as cargas eltricas necessrias para a realizao da eletroforese; a Agarose
forma uma rede que prende as molculas durante a migrao.




22
2 - Explique qual a funo do Brometo de Etdeo e do transluninador?
R- O brometo de etideo far o DNA brilhar quando exposto ao UV; o translumiador
utilizado para visualizao com segurana, de bandas de DNA em gis de agarose obtidos
com o brometo de etdeo.
3 - Explique qual a funo do tampo TBE 1X?
R- O tampo TBE da melhor resoluo de DNA e diminui sua mobilidade.

4 - Por que os pocinhos devem estar posicionados prximos ao polo negativo?
R- Porque o DNA tambm tem carga negativa, assim ser repelido para o gel mais facilmente.

5 - Por que o DNA deve ser misturado com o tampo carregador?
R- A soluo tampo carregador tem uma maior concentrao de ons, ou seja uma maior
fora inica, de maneira que consegue carregar muito mais corrente, logo mais molculas de
DNA.

6 - Por que utilizou-se o gel de agarose a 1% e no um mais concentrado?
R- Porque dependendo da concentrao de agarose, vai haver uma maior diferena no
gradiente de separao.


7 CONCLUSO

A aula foi satisfatria, pois conseguimos realizar a atividade proposta e conclui-se que:
Os mtodos de eletroforese convencionais so baseados na habilidade de um gel separar
molculas, com base no tamanho, sob a influncia de um campo eltrico unidirecional. Em
contraste, utilizam-se sucessivos campos eltricos alternados que foram as molculas a
mudarem continuamente a direo de migrao.
A separao baseada, provavelmente no fato que as molculas maiores mudam de direo
mais lentamente que as menores. Entretanto, o mecanismo preciso da separao ainda no
totalmente conhecido, embora seja objeto de numerosos estudos.



REFERNCIAS



23

ELETROFORESE Apostila. Disponvel em:
<http://web.cena.usp.br/apostilas/Figueira/2008/Apostila%2006%20Eletroforese.doc>.
Acesso em 24 de Julho de 2014.

ELETROFORESE Gentica molecular. Disponvel em:
<http://genetica.ufcspa.edu.br/biomedic/conteudo/genetica_molecular/eletroforese.pdf>Acess
o em 24 de Julho de 2014.




24
RELATRIO V: QUANTIFICAO DE DNA EM ESPECTROFOTMETRO

1 INTRODUO

A quantificao do DNA aps a sua extrao importante para o aperfeioamento da
qualidade do produto de DNA resultante da PCR (Internacional Society for Forensic
Haemogenetics, 1992). O excesso de DNA em uma amostra de PCR poder saturar a reao,
fazendo com que aparea artefatos de tcnica e amplificaes inespecficas que podem
dificultar a sua anlise. J a sua falta, poder acarretar na perda de um dos alelos, quando o
indivduo heterozigoto, ou mesmo na no amplificao dos mesmos (Butler, 2005).
A qualidade e quantidade de DNA devem ser examinadas aps a extrao, alm de
verificar a possibilidade de degradao (JUNG et al, 1991; HOFF-OLSEN et al, 1999). O
DNA pode ser quantificado por espectrofotometria em espectrofotmetro a 260 nm, sua
pureza pela relao 260/280 nm e a sua integridade pode ser avaliada em gis de agarose. No
entanto, esses mtodos avaliam a quantidade geral de DNA, seja ele humano ou de outro tipo.
Quando se refere s amostras utilizadas em investigao criminal ou passveis de degradao
e contaminao, recomenda-se a utilizao da quantificao de DNA de humano
(INTERNACIONAL SOCIETY FOR FORENSIC HAEMOGENETICS - ISFH, 1992).
A amostra biolgica sendo preservada adequadamente e realizada em condies
timas de extrao e quantificao, obtm-se quantidades maiores ou menores de DNA.

2 MATERIAIS
Amostra de DNA;
gua destilada;
Piceta;
Leno de papel;
Espectrofotmetro;
Cubeta de quartzo;
Luvas descartveis em ltex



25

3 METODOLOGIA
Lavar a cubeta com gua destilada, com a ajuda de uma piceta, segurando
sempre a cubeta pelas suas extremidades e/ou pela parte opaca;
Enxugar a cubeta utilizando leno de papel;
Adicionar 2000 de gua destilada (branco);
Tampar a cubeta com a tampa plstica;
Inserir a cubeta no espectrofotmetro de modo que o Q fique posicionado a sua
direita e o feixe luminoso atravesse a parte transparente da cubeta;
Quantificar o branco a 230nm, 260nm e 280nm no espectrofotmetro;
A leitura deve ser zero para as trs faixas de absorvncias. Caso no d esse
resultado volte ao item 1
Retirar a cubeta do espectrofotmetro e descartar a gua;
Enxugar a cubeta com papel de filtro;
Colocar 1980l de gua e 20l de DNA na cubeta;
Colocar a cubeta no espectrofotmetro e l a amostra a 230nm, 260nm e 280nm;
Anotar a concentrao Total e os resultados das absorvncias a 230nm, 260nm e
280nm;
Retirar a cubeta do espectrofotmetro e descartar a amostra;
Calcular a quantidade de DNA de cada amostra, em ng, aplicando-se a seguinte
equao: (DNAug/ml)=ABS
(260)
x50x diluio da amostra;
Diluir o estoque de DNA das amostras para 50ng/l aplicando a seguinte
equao: C
1
V
1
= C
2
V
2.


4 RESULTADOS







26
5 DISCUSSO

1 - Por que de uma leitura para a outra deve ser sempre lida o branco?
R- Porque o grau de erro menor.

2 - Qual a melhor faixa de leitura para as protenas, RNA e DNA,
respectivamente?
R- 80, 230 e 260.

3 - Para que se deve quantificar o DNA das amostras obtidas da extrao de DNA?
R- Para verificar se h concentrao de DNA adequada, se no, implicar em falhas nas
etapas subsequente.

4 - Qual a importncia da razo 260/230 e da razo 260/280, respectivamente?
R- Verificar a pureza e mostrar se h contaminao por protenas.

5 - Compare os resultados da corrida de DNA no gel de agarose com os resultados
obtidos da anlise espectrofotomtrica comentando sobre a pureza e integridade
do DNA, quantidades de RNA e Protenas;
R-
6 - Por que as razes 260/230 e 260/280 devem ser superiores a um?
R- Pois superiores a 1 indicam pureza da amostra.

7 - Em uma amostra de extrao de DNA total possui o volume de 60 l. A partir
desse material foi realizada anlise espectrofotomtrica. Observou-se que a
absorvncia de DNA a 260nm foi de 0,141. Qual a concentrao de DNA na
amostra? Quanto de gua deve ser adicionada na amostra de DNA total para
obtermos uma concentrao final de 50ng/l.
R- Concentrao: 141x 60x1=8,46ng/l.







27

EXERCCIOS: REAO EM CADEIA DA POLIMERASE PCR

1 - Qual a funo da realizao do mix da PCR?
R- O mzix mais econmico, caso ele no seja utilizado, haver gasto de materiais e
risco de contaminao.

2 - Qual a funo do controle negativo?
R- O controle negativo tem funo de no deixar aparecer as bandas, porque caso
aparea, sinal de contaminao.

3 - Qual a funo do MgCl
2
na reao da PCR?
R- Funciona como um co-fator.

4 - Por que se deve colocar leo mineral na superfcie da PCR?
R- Porque impede a evaporao de gua e substncias.

5 - Por que a temperatura de anelamento de 56
o
C e no inferior?
R- Para amplificar regies nicas do genoma.

6 - Por que o primeiro e o segundo ciclo da PCR de Desnaturao?
R- Para ocorrer a dissociao das cadeias de DNa e facilitara ancoragem dos primes de
DNA.

8 Qual das extremidades dos primers deve estar orientada para a parte interna
da regio alvo do DNA a ser amplificada?
R A regio 3, j que as extremidades so amplificadas na 3.



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