VALIDACIN DEL MTODO DE DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN
AGUA POTABLE UTILIZANDO AGAR CHROMOCULT
AUTORES: ELISA MARCELA CARRILLO ZAPATA AURA MARA LOZANO CAICEDO
TRABBAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar el titulo de MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL BOGOTA D.C. DICIEMBRE DE 2008
NOTA DE ADVERTENCIA:
Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral catlica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia
VALIDACIN DEL MTODO DE DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN AGUA POTABLE UTILIZANDO AGAR CHROMOCULT
AUTORES ELISA MARCELA CARRILLO ZAPATA AURA MARA LOZANO CAICEDO
VALIDACIN DEL MTODO DE DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN AGUA POTABLE UTILIZANDO AGAR CHROMOCULT
AUTORES: ELISA MARCELA CARRILLO ZAPATA AURA MARA LOZANO CAICEDO
APROBADO
INGRID SCHULER JANETH ARIAS Biloga, Ph D. Bacteriloga, Msc. DECANA ACADEMICA DIRECTORA CARRERAS MICROBIOLOGIA
DEDICATORIA
A Dios, porque nunca nos abandono en el largo andar de nuestro aprendizaje, porque cuando mas necesitamos de su ayuda, el estuvo all, sostenindonos entre sus brazos para que no nos doliera el caminar en los momentos difciles.
A nuestras familias porque gracias a su eterno amor para cada una de nosotras, llenaron nuestros corazones de fortaleza para que este largo andar, se hiciera mas corto y placentero; por su apoyo incondicional sin importar las circunstancias, porque pece a todos los momentos vividos, siempre estn presentes para brindarnos el amor que reconforta nuestro ser.
Aura y Marcela
A mi padre que esta en el cielo porque mientras estuvo a mi lado fue un ejemplo de sabidura y superacin, un apoyo incondicional, un padre lleno de esperanza y amor para conmigo y porque ahora que esta en el cielo se que desde all ilumina todos mis caminos, ayudndome a seguir siempre por el mejor y porque se que este donde este siempre velara mis sueos.
Aura M
AGRADECIMIENTOS
A Dios por acompaarnos siempre y por estar a nuestro lado en los buenos y malos momentos.
A la Dra. Janeth Arias, asesora, por su entrega, compromiso, comprensin y apoyo incondicional.
Al Dr. Juan Carlos Jimnez, Director Administrativo de INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda., por brindarnos la oportunidad de compartir en su empresa los conocimientos adquiridos y por el prstamo de las instalaciones y recursos econmicos para llevar a cabo este trabajo de grado.
A la Dra. Jeinny Romero, nuestra directora por aceptar guiarnos en la realizacin de este trabajo, por llenarse de paciencia, por transmitirnos su conocimiento y experiencia, por ser mas que una amiga, por su colaboracin y apoyo durante el desarrollo de este trabajo.
A INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda., especialmente al rea de microbiologa, a Diana, Consuelo y Zamaira por su colaboracin y apoyo.
RESUMEN
La validacin realizada en este trabajo de grado tuvo como propsito utilizar el agar Chromocult, como mtodo alternativo en la deteccin de microorganismos indicadores de la calidad del agua potable, gracias a su fcil manejo y rpida recuperacin para reducir costos y desarrollar procedimientos con mayor eficacia y seguridad en el laboratorio INTHERPHARM DE COLOMBIA Ltda, basados en la USP 31, realizando un anlisis que garantice resultados confiables y la disminucin de los riesgos de reanlisis que aumentan el tiempo de anlisis y los costos.
Se realiz una revisin y recopilacin bibliogrfica, para obtener toda la informacin necesaria y se verific que el programa de calibracin y mantenimiento de los equipos, estuviera vigente, para de esta manera poder garantizar el procedimiento realizado y los resultados obtenidos. Luego se realizaron pruebas preliminares en donde se llevo a cabo la estandarizacin de los inculos, realizando diluciones de un cultivo de 24 horas y comparando con el tubo 1 de la escala de Mac farland para E.coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Enterobacter aerogenes ATCC 13048, posteriormente se estandariz la tcnica filtracin por membrana con tres muestras de tres replicas cada una y despus de obtener los resultados esperados (30 UFC\ml aproximadamente) se realiz la metodologa para la validacin de la tcnica filtracin por membrana, analizando diez muestras de agua potable diferentes, con tres replicas para cada una, mediante las cuales se realizaron recuentos de cada uno de los microorganismos con los cuales fueron contaminadas las muestras de agua, bajo condiciones alternadas, variando los analistas y los das de anlisis; se llevo acabo el anlisis de una prueba estndar (agua estril para inyeccin, inoculada con cada uno de los microorganismos a evaluar Escherchia coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028 y Enterobacter aerogenes ATCC 13048), una solucin de prueba (agua potable inoculada con los microorganismos utilizados como prueba: Escherchia coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028 y Enterobacter aerogenes ATCC 13048), un control negativo (agua potable con tiosulfato de sodio al 1% y sin inocular) y una prueba combinando la muestra de agua con los microorganismos a evaluar (agua potable + Escherchia coli ATCC 8739 + Salmonella typhimurium ATCC 14028; agua potable + Escherichia coli ATCC 8739 + Enterobacter aerogenes ATCC: 13048; agua potable + Escherichia coli ATCC 8739 + Enterobacter aerogenes ATCC 13048 ) de esta manera se obtuvieron, 30 recuentos por da para un total de 300 recuentos por analista, por lo tanto se obtuvieron 600 datos en total, por los dos analistas, luego de obtener todos los datos, se procedi a realizar el anlisis y se determinaron los parmetros cuantitativos para la validacin del mtodo.
La metodologa se llevo a cabo con muestras de agua potable, provenientes del acueducto de Bogot que cumplen con las especificaciones descritas segn la resolucin 2115 de 2007 Finalmente se logro concluir que el mtodo es reproducible y repetible, tambin se logro establecer que el mtodo es especifico para la demostracin de coliformes Fecales, debido a que para este grupo de microorganismos indicadores se logro obtener un porcentaje de recuperacin superior al 96%, comparado con los otros microorganismos.
ABSTRACT
The corroboration undertook in this examination paper pretended to utilize the agar chromocult as an alternative method in the detection of indicating micro-organisms of drinking waters quality thanks to its handling capability and short period ability to recuperate in order to reduce costs and to develop more efficient and safer procedures at INTHERPHARM DE COLOMBIA Ltda. laboratories, based on the USP 31, and developing the montage which warranties reliable results and a decrease in repetition risks which generate an increase in analysis time and costs.
As a start up, a bibliographic revision and compilation took place in order to obtain the required amount of information. The tune-up and maintenance of the equipment was also verified aiming to warranty the undertook procedure and the obtained results. Then, some preliminary testing were developed for the standardization of the inocules, also effecting dilutions of a 24 hours crop with Pipe 1 of Mac Falrlands scale for E.coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC: 14028, Enterobacter aerogenes ATCC: 13048. Later, the set up of the membrane filtration technique was standardised analyzing ten different samples of drink water with three replicas for each one in which it was determined the keeping of the contaminating micro-organisms in the membrane filters with a pore size of 0.45um under alternated conditions, with variation of annalists and days; it also took place the analysis of and standard test (sterilized water, inoculated with each of the micro-organisms to be evacuated Escherchia coli, Salmonella typhimurium y Enterobacter aerogenes), a test solution (drinking water inoculated with the micro-organisms used for the test Escherchia coli, Salmonella typhimurium y Enterobacter aerogenes ), a negative control (Drinking water with 1% thiosulfate without inoculation) and a test combining the sample water with the micro-organisms to be examined (drinking water + Escherchia coli + Salmonella typhimurium; drinking water + Escherichia coli + Enterobacter aerogenes; drinking water + Escherichia coli + Enterobacter aerogenes ) in which way 30 recounts were obtained for an aggregated amount of 310 recounts per analyst, amounting to a total data of 620, between the two analysts. After obtaining all the data, the next step consisted in determining the quantitative parameters for the validation of the method.
The methodology was undertaken with drinking water samples taken from Bogotas water purification plant which follow the specifications prescribed by Resolution 2115/07. Finally, it was possible to conclude that the utilized method is reproducible and repeatable; in addition, it was ascertained that the method is specific for the demonstration of fecal coliforms, ought to the fact that for this group of indicating micro-organisms it was possible to obtain a recuperation percentage superior to 96%, compared with other micro-organisms.
I
TABLA DE CONTENIDO
PAG. 1. INTRODUCCIN..1 2. MARCO TERICO Y REVISIN DE LITERATURA..2 2.1. AGUA POTABLE.2 2.1.1 Caractersticas del agua potable..3 2.1.2. Anlisis microbiolgico del agua..3 2.1.3. Proceso de potabilizacin del agua.4 2.1.3.1 Inactivacin del cloro en el agua potable4 2.2. MICROORGANISMOS INDICADORES DE LA CALIDAD DEL AGUA.5 2.2.1. Coliformes Totales..5 2.2.1.1. Enterobacter aerogenes..6 2.2.2. Coliformes Fecales....7 2.2.2.1. Escherichia coli..8 2.2.3. Salmonella spp9 2.3. TCNICA DE FILTRACIN POR MEMBRANA PARA DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES10 2.3.1. Filtros de membrana..11 2.3.2. Tipos de filtros de membrana...12 2.3.2.1. Filtros de profundidad..12 2.3.2.2. Filtros de superficie o membrana..12 2.3.2.2.1. Membrana de nitrato de celulosa..13 2.3.2.2.2. Membrana de acetato de celulosa...13 2.4. MEDIOS DE CULTIVO.14 2.4.1. Medios cromgenos.15 2.4.1.1. Medio Chromocult para Coliformes..15 2.4.1.2. Ventajas de los medios cromgenos frente a los convencionales...16 2.5. VALIDACIN..16 2.5.1. Parmetros de desempeo de la validacin ..............17 2.5.1.1. Especificidad.17 2.5.1.2. Eexactitud 18 2.5.1.3. Precisin ......18 2.5.2 Datos requeridos para la validacin....18
II 2.6. VALIDACIN Y SELECCIN DE MTODOS DE ENSAYO MICROBIOLGICO.19 2.6.1. Pruebas cualitativas para detectar la presencia o Ausencia de microorganismos.20 2.6.2. Pruebas cuantitativas para microorganismos..20 2.6.3 Mtodos normalizados..21 2.6.4. Mtodos desarrollados por el laboratorio..21 2.6.5. Mtodos normalizados con modificaciones..21 2.7. PRERREQUISITOS DE LA VALIDACIN21 2.7.1. Monitoreo ambiental.21 2.7.2. Escala de Mc Farland..24 2.7.3. Medios de cultivo..24 2.7.3.1. Esterilizacin del medio de cultivo24 2.7.3.2. Incubacin25 2.7.3.3. Control de autoclave..25 2.7.4. Documentacin.26 2.7.5. Desarrollo del protocolo de validacin..26 2.7.6. Informe Final de Validacin27 3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN..28 3.1. FORMULACIN DEL PROBLEMA....28 3.2. JUSTIFICACIN DEL PROBLEMA...28 4. OBJETIVOS..29 4.1 OBJETIVO GENERAL...29 4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS.29 5. MATERIALES Y MTODOS.30 5.1 DISEO EXPERIMENTAL.....30 5.2. POBLACIN DE ESTUDIO Y MUESTRA POBLACION DE ESTUDIO..30 5.3. VARIABLES DE ESTUDIO..31 5.4. PRUEBAS PRELIMINARES32 5.4.1. Recopilacin de la informacin...32 5.4.2. Calibracin y mantenimiento de equipos..32 5.4.3. Preparacin del inoculo32 5.4.4. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo ..33 5.4.5. Prueba de promocin de crecimiento33 5.5. MATERIALES Y METODOS EN LA EVALUACION DE PARAMETROS CUANTITATIVOS...34 5.5.1. Materiales..34 5.5.2. Microorganismos Estndar.35 5.5.3. Mtodos.35 5.5.3.1. Control de ambiente, superficie y operarios.....35 III 5.5.3.2. Control negativo-muestra..36 5.5.3.3. Prueba Estndar37 5.5.3.4. Solucin de prueba38 5.5.3.5. Solucin de prueba combinando los microorganismos39 5.6. VARIABLES DE ESTUDIO..41 5.7. RECOLECCION DE LA INFORMACION..41 5.8. ANALISIS DE LA INFORMACION.42 5.8.1. Anlisis de datos...42 5.8.1.1. Media....42 5.8.1.2. Desviacin Estndar..42 6. RESULTADOS.44 6.1. ESTANDARIZACION DE LOS INOCULOS DE TRABAJO..44 6.2. VERIFICACION DE PROGRAMA DE CALIBRACION Y MANTENIMIENTO DE EQUIPOS.46 6.3. PRUEBAS PRELIMINARES46 6.3.1. Prueba de Esterilidad de los medios de cultivo...46 6.3.2. Prueba de Promocin de crecimiento47 6.3.3. Controles microbiolgicos durante el proceso.47
6.4. METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA PARA DETECCION DE COLIFORMES FECALES Y TOTALES..49 6.5. RECUENTO COMBINADO DE LOS MICROORGANISMOS EVALUADOS EN EL ENSAYO.61 7. DISCUSIN DE RESULTADOS...70 8. CONCLUSIONES75 9. RECOMENDACIONES...76 10. BIBLIOGRAFA.77 11. ANEXOS.82 ANEXO 1...82
IV
LISTA DE TABLAS
PAG. TABLA 1. Caractersticas fsicas del agua potable...3 TABLA 2. Caractersticas qumicas de sustancias presentes en el agua.3 TABLA 3. Caractersticas microbiolgicas del agua.4 TABLA 4. Comparacin de pruebas bioqumicas de E. coli y E. aerogenes...7 TABLA 5. Caractersticas de coliformes totales y E. coli.9 TABLA 6. Aplicaciones de los filtros de membrana14 TABLA 7. Datos requeridos para la validacin19 TABLA 8. Parmetros de validacin por tipo de prueba microbiolgica.20 TABLA 9. Lmites microbiolgicos ambientales, rea de recuentos de INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda...22 TABLA 10. Lmites microbiolgicos de superficies, rea de recuentos de INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.23 TABLA 11. Lmites microbiolgicos de dotacin guantes, rea de recuentos de INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda....23 TABLA 12. Caractersticas morfolgicas y enzimticas de los microorganismos evaluados..41 TABLA 13. Estandarizacin de inculos: Escherichia coli ATCC 8739, Enterobacter aerogenes ATCC: 13048 y Salmonella typhimurium ATCC 14028 Analista 1.....44 TABLA 14. Estandarizacin de inculos: Escherichia coli ATCC 8739, Enterobacter aerogenes ATCC 13048 y Salmonella typhimurium ATCC 14028 Analista 2...45 TABLA 15. Programa de Calibracin y mantenimiento de los equipos utilizados en la validacin..46 TABLA 16. Prueba de promocin de crecimiento......47 TABLA 17. Resultados del control microbiolgico de ambiente, superficie y analista durante los ensayos realizados. Analista 1 .47 TABLA 18. Resultados del control microbiolgico de ambiente, superficie y analista durante los ensayos realizados. Analista 2. 48 TABLA 19. Resutados control Negativo. Analista 1.....49 TABLA 20. Resultados control Negativo. Analista 2....49 TABLA 21. Porcentaje de recuperacin de E. coli ATCC 8739en la solucin de prueba (analista 1) .....50 TABLA 22. Porcentaje de recuperacin de E. aerogenes ATCC: 13048 en la solucin de prueba (Analista 1).52 TABLA 23. Porcentaje de recuperacin de S. typhimurium ATCC 14028 en la solucin de prueba (Analista 1)...54 TABLA 24. Porcentaje de recuperacin de E. coli ATCC 8739 en la solucin de prueba V (Analista 2)...56
TABLA 25. Porcentaje de recuperacin de E. aerogenes ATCC: 13048 en la solucin de prueba (Analista 2) 58 TABLA 26. Porcentaje de recuperacin de S. typhimurium ATCC 14028 en la solucin de prueba (Analista 2)......60 TABLA 27. Recuento de E. coli ATCC 8739 y S. typhimurium ATCC 14028 en la solucin de prueba (analista 1)...62 TABLA 28. Recuento de E. aerogenes ATCC: 13048 y S. typhimurium ATCC 14028 en la solucin de prueba (Analista 1) .......................63 TABLA 29. Recuento de E. aerogenes ATCC: 13048 y E. coli ATCC 8739 en la solucin de prueba (analista 1) ......64 TABLA 30. Recuento de E. coli ATCC 8739 y S. typhimurium ATCC 14028 en la solucin de prueba (analista 2)...65 TABLA 31. Recuento de E. aerogenes ATCC: 13048 y S. typhimurium ATCC 14028 en la Solucin de prueba (Analista 2)... .....66 TABLA 32. Recuento de E. aerogenes ATCC: 13048 y E. coli ATCC 8739 en la solucin de prueba (analista 2)...67
VI
LISTA DE FIGURAS
PAG. FIGURA 1. Fuente de agua..2 FIGURA 2. Enterobacter aerogenes..6 FIGURA 3. E. coli en agar EMB..9 FIGURA 4. Salmonella en agar XLD....10 FIGURA 5. Trampa de filtracin....11 FIGURA 6. Filtros de profundidad.12 FIGURA 7. Filtros de membrana o superficie..13 FIGURA 8. Preparacin de inoculos ....33 FIGURA 9. Diagrama de flujo de Control negativo-muestra.36 FIGURA 10. Diagrama de flujo de la Prueba estndar..37 FIGURA 11. Diagrama de flujo de la solucin de Prueba 38 FIGURA 12. Diagrama de flujo de la solucin de prueba combinando los Microorganismos.40 FIGURA 13. Porcentaje de recuperacin de E. coli (analista 1)..51 FIGURA 14. Porcentaje de recuperacin de E. aerogenes (analista 1).53 FIGURA 15. Porcentaje de recuperacin de S. typhimurium (analista 1).....55 FIGURA 16. Porcentaje de recuperacin de E. coli (analista 2)...57 FIGURA 17. Porcentaje de recuperacin de E. aerogenes (analista 2).59 FIGURA 18. Porcentaje de recuperacin de S. typhimurium (analista 2)..61 FIGURA 19. Prueba de promocin de crecimiento de E. coli en agar chromocult....68 FIGURA 20. Prueba de promocin de crecimiento de E. aerogenes en agar chromocult..68 FIGURA 21. Prueba de promocin de crecimiento de S. typhimurium en agar chromocult69 FGURA 22. Solucin de prueba: E coli....69 FIGURA 23. Solucin de prueba S. typhimurium69
VII
1
1. INTRODUCCIN
El agua es una de las principales fuentes de vida en nuestro planeta, son infinitos los usos del agua, para consumo humano, para labores domesticas y en la industria farmacutica, es utilizada en las diferentes actividades como el lavado de materiales, utensilios, reas accesorias, de anlisis, y como base para la preparacin de medicamentos y/o cosmticos, en este caso el agua debe cumplir unos estndares mas estrictos y su sistema de purificacin debe ser muy eficiente, para obtener un alto grado de pureza y estar libre de contaminantes que puedan afectar la calidad del producto terminado y ms an, la salud del paciente a quien se le suministren los medicamentos elaborados. (Walter, J. 2003).
As mismo, el agua puede ser uno de los principales transmisores de enfermedades entricas si se llegara a consumir en estado contaminado; entre los microorganismos indicadores del agua potable, se pueden encontrar las bacterias del grupo coliforme, perteneciendo a este grupo, gneros como: Escherichia coli, Enterobacter spp, Klebsiella spp y Citrobacter spp; los cuales, generalmente se pueden encontrar en la capa superficial del agua o en los sedimentos del fondo (OMS, 1995).
Es por esto, que los laboratorios de anlisis microbiolgico, buscan validar las tcnicas desarrolladas para el anlisis de este tipo de aguas, que en la mayora de los casos buscan detectar bacterias coliformes totales y fecales, mediante la tcnica de filtracin por membrana, tcnica que es aceptada y utilizada a nivel nacional e internacional por entes reguladores, debido a su fcil manejo y empleo y de esta manera contribuir a que el agua suministrada al consumo humano sea de excelente calidad y que su sistema de potabilizacin logre eliminar la mayor cantidad de organismos contaminantes que puedan llegar a afectar la salud de los consumidores. (Walter, J. 2003).
Con el fin de cumplir con las reglamentaciones gubernamentales y ayudar a mejorar la calidad del agua para consumo humano, en el presente trabajo de grado se realiz la validacin del mtodo de deteccin de coliformes totales y fecales en agua potable utilizando agar chromocult gracias a su fcil manejo y rpida recuperacin como un mtodo alternativo para reducir costos y mejorar tiempos en el laboratorio INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
2 2. MARCO TERICO Y REVISIN DE LITERATURA
2.1. AGUA POTABLE
Es aquella que por cumplir las caractersticas fsicas, qumicas y microbiolgicas, es apta para el consumo humano; se utiliza en bebida directa, en la preparacin de alimentos o en la higiene personal (Resolucin 2115, 2007).
Puede provenir de distintas fuentes, incluyendo los servicios pblicos de agua, un suministro etc. El agua potable se puede usar en las primeras etapas de limpieza de los equipos de fabricacin farmacutica y de componentes en contacto con los productos, tambin es usada en la preparacin de sustancias oficiales y otros ingredientes farmacuticos a granel (USP 31, 2007)
El peligro mas comn y ms difundido relativo al agua potable es el de su contaminacin, sea esta directa o indirecta, debido al efecto de aguas servidas, de otros desechos o de las excretas del hombre o de los animales. Si dicha contaminacin es reciente y entre los factores que contribuyen a ella se hallan agentes portadores de enfermedades entricas transmisibles, es posible que estn presentes algunos de los organismos vivos causales de las mismas. Beber agua contaminada o emplearla en la preparacin de soluciones puede producir mayor nmero de casos de infeccin. (OPS, 1997)
El agua potable no debe contener en ningn caso microorganismos considerados patgenos y debe estar libre de bacterias indicadoras de contaminacin fecal (OPS, 1997). En el caso de plaguicidas la concentracin mxima aceptable presente en el agua deber ser de 0.0001mg/L. No debe contener substancias o cuerpos extraos de origen biolgico, orgnico, inorgnico o radiactivo en cantidades tales que la hagan peligrosa para la salud. Deber presentar sabor agradable y ser prcticamente incolora, inodora, lmpida y transparente. (Resolucin 2115, 2007) Tabla 1. Caractersticas fsicas del agua potable
Fuente: Resolucin 2115 de 2007
Tabla 2. Caractersticas qumicas de sustancias presentes en el agua
Fuente: Resolucin 2115 de 2007.
2.1.2. Anlisis microbiolgico del agua
Se define anlisis microbiolgico a cada uno de los procedimientos de laboratorio que se efectan a una muestra de agua para el consumo humano para evaluar la presencia o ausencia, tipo y cantidad de microorganismos. (Resolucin 2115/ 2007) En cuanto a microorganismos indicadores, ninguna muestra de agua podr contener E.coli en 100cm 3 , independientemente del tipo de anlisis utilizado. Como prueba complementaria se recomienda realizar la determinacin de microorganismos mesfilos cuyo valor mximo ser de 100 UFC/ 100cm 3 (Resolucin 2115, 2007).
4 Tabla 3. Caractersticas microbiolgicas del agua potable
Tomado de: Resolucin 2115 de 2007.
2.1.3. Proceso de potabilizacin del agua
El cloro fue descubierto en 1774 por el qumico sueco Karl Wihellm Scheele como producto de la reaccin entre cido hipoclorhdrico y dixido de manganeso. Es una sustancia tan energtica y activa que solo existe en la naturaleza en combinacin con otros elementos, es aplicado en exceso de manera que pueda satisfacer la demanda para oxidar compuestos como nitritos, iones de hierro, plomo, sulfuros y eliminar bacterias, de manera que as se reste una cantidad de cloro residual en los ductos del agua; parte de este cloro residual queda para continuar desinfectando el agua desde que sale de la planta de tratamiento hasta que llega al consumidor.
Debe ser aplicado en el agua a tratar en forma gaseosa o como un slido ionizado; al ser adicionado al agua, este reacciona con el amonaco y materia orgnica formando cloraminas y compuestos rgano clorados, los cuales son reducidos a un valor mnimo y queda como resultado el cloro residual libre (Ocasio, N et al., 2004).
Segn la resolucin 2115 de 2007, el valor aceptable del cloro residual en cualquier punto de la distribucin del agua potable, debe ser comprendido entre 0.3 y 2.0 mg/L.
2.1.3.1 Inactivacin del cloro en el agua potable La cloracin de aguas de suministro sirve principalmente para destruir o desactivar microorganismos que pueden causar enfermedades.
El compuesto utilizado para inactivar el cloro en el agua es el tiosulfato de sodio, el cual esta compuesto por tiosulfato, que a su vez se compone de sales de cido tiosulfrico, estables en medios con pH bsico y neutro; se descomponen bajo formacin de azufre elemental, dixido de azufre trazas de otros compuestos azufrados en presencia de cido (Walter, J. 2003).
5
2.2. MICROORGANISMOS INDICADORES DE LA CALIDAD DEL AGUA
Varios organismos patgenos de transmisin fecal-oral pueden estar presentes en el agua cruda (agua natural que no ha sido sometida a proceso de tratamiento para su potabilizacin), entre ellos bacterias como Salmonella sp, Shigella sp, coliformes totales y fecales, los cuales han sido encontradas en abastecimientos de aguas. (Ocasio y Lopez, 2004)
Las bacterias coliformes, son el principal indicador de la adecuacin del agua para uso domstico, industrial, o de otro tipo. La experiencia ha demostrado que la densidad del grupo de los coliformes es un indicador del grado de contaminacin y por tanto, de la calidad sanitaria (APHA - AWWA - WPCF, 2000)
Desde hace tiempo, se reconoce que los organismos del grupo coliforme son un buen indicador microbiano de la calidad del agua potable, debido principalmente a que son fciles de detectar y enumerar en el agua. La presencia de E. coli en muestras de agua potable, indica la existencia de fallas en la eficacia de tratamiento de aguas, integridad, sistema de distribucin y por tanto es una evidencia de contaminacin de diferentes orgenes: suelo, superficies de agua dulce y tracto digestivo (Organizacin Panamericana de la Salud, 1987)
Cabe sealar sin embargo, que aunque se reconoce que la determinacin de la concentracin de estas bacterias en el agua es un elemento crtico para determinar el riesgo de enfermedades relacionadas al consumo de la misma, no existe una relacin simple entre el nivel de coliformes en el agua con la presencia de patgenos en la misma y el riesgo de enfermedades. (Perdomo C.H. et al. 2001)
2.2.1. Coliformes Totales
El grupo coliforme se define como todas las bacterias Gram negativas en forma bacilar que fermentan la lactosa a temperatura de 35 a 37 C, produciendo cido y gas (CO 2 ) en 24 horas, aerobias o anaerobias facultativas, son oxidasa negativa, no forman esporas y presentan actividad enzimtico de la B-galactosidasa (Ministerio de salud, 1998). Entre ellos se encuentran los diferentes Escherichia coli, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella. (Organizacin Panamericana de la Salud, 1987)
La prueba mas relevante utilizada para la identificacin del grupo Coliformes, es la hidrlisis de la lactosa. El rompimiento de este disacrido es catalizado por la enzima B-
6 D- Galactosidasa. Ambos monosacridos (la galactosa despus es transformada en glucosa por reacciones bioqumicas) posteriormente son metabolizados a travs del ciclo glicoltico y ciclo del citrato. Los productos metablicos de estos ciclos son cidos y/o CO 2 . Para la determinacin de la B- Galactosidasa se utilizan medios cromgenos tales como chromocult. (MANAFI, 1998).
2.2.1.1. Enterobacter aerogenes Genero de bacterias Gram negativas, anaerobias facultativas, de la familia de Enterobacterias, muchas son patgenas y son causa de infecciones oportunistas en huspedes comprometidos generalmente hospitalizados, causa infeccin del tracto urinario y de tracto respiratorio. (Loessner M, et al. 1993)
Se encuentra en el tracto digestivo humano, aunque tambin libremente en el suelo y agua; sus colonias son grandes y mucosas, algunas cepas llegan a formar cpsula, como fuente de carbono pueden utilizar glucosa y lactosa, no forman sulfato de hidrogeno. (Shekhar N.C
Escherichia coli y Enterobacter aerogenes, son dos bacterias idnticas en muchas formas superficiales, ambas fermentan lactosa produciendo cido y gas, son bacilos Gram negativos pero en agar EMB, E.coli produce un subproducto del metabolismo de dicho azcar que reacciona produciendo un brillo metlico en la luz reflejada y Enterobacter aerogenes no lo hace, en cuanto a pruebas bioqumicas se presenta la siguiente comparacin:
7
Tabla 4. Comparacin de pruebas bioqumicas de E.coli y E. aerogenes Prueba Bioqumica E.coli Enterobacter aerogenes Produccin de Indol + - Rojo de Metilo + - Voges Proskauer - + Citrato - + Lisina descarboxilasa + Hidrlisis de la esculina + Utilizacin de malonato - + Arginina deshidrolasa + Fuente: Gamazo .C, et al. 2005
2.2.2 Coliformes Fecales
Los coliformes fecales tambin denominados coliformes termotolerantes, llamados as porque soportan temperaturas hasta de 45C, comprenden un grupo muy reducido de microorganismos los cuales son indicadores de calidad, ya que son de origen fecal. En su mayora estn representados por el microorganismo E. coli pero se pueden encontrar, entre otros menos frecuentes, Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae estos ltimos hacen parte de los coliformes termotolerantes, pero su origen se asocia normalmente con la vegetacin y solo ocasionalmente aparecen en el intestino. (HAYES; 1993)
Los coliformes fecales integran el grupo de los coliformes totales, pero se diferencian de los dems microorganismos que hacen parte de este grupo, en que son indol positivo, su rango de temperatura ptima de crecimiento es muy amplio (hasta 45C) y son mejores indicadores de higiene en alimentos y en aguas, la presencia de estos indica presencia de contaminacin fecal de origen humano o animal, ya que las heces contienen dichos microorganismos, presentes en la flora intestinal y de ellos entre un 90% y un 100% son E. coli mientras que en aguas residuales y muestras de agua contaminadas este porcentaje disminuye hasta un 59%. (GOMES; 1999).
8 2.2.2.1 Escherichia coli Originalmente llamada Bacterium comune, fue aislada por primera vez en 1985 a partir de heces de nios; son bacilos estrechos de 1,1 a 1,5 m de dimetro y de 2 a 6 m de longitud, se encuentran solos o en parejas, Gram negativos, mviles por flagelos pertricos o inmviles, anoxignicos facultativos, poseen metabolismo respiratorio y fermentativo. (LEMINOR, 1994).
Perteneciente a la familia Enterobariaceae, son coliformes capaces de producir indol a partir de triptfano, en 21 +/- 3 horas a 44 +/- 0.5C. Tambin poseen la enzima B- Galactosidasa, que reacciona positivamente en el ensayo del rojo de metilo y pueden descarboxilar el cido L- glutmico, pero no son capaces de utilizar citrato como nica fuente de carbono o de crecer en un caldo con cianuro de potasio (KCN). (MILLIPORE; 2005).
E. coli es la nica especie dentro de las Enterobacterias que presenta la enzima B-D- Glucoronidasa, que degrada el sustrato 4-metilumberiferil--D-glucornico (MUG), formando 4-metilumbeliferona, este producto tiene la propiedad de emitir fluorescencia azul/verde cuando se ilumina con luz ultravioleta. (MANAFI, 1998).
E.coli presenta caractersticas bioqumicas importantes que permiten la diferenciacin con otros coliformes, como ser positivo para la prueba de indol.
El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptfano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo del reactivo de Kovacs descrito ms adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptfano (HOPKINS,K.L y HILTON, A.C. 2000)
Tabla 5. Caractersticas de Coliformes Totales y E. coli COLIFORMES TOTALES E. COLI Bacterias Gram Negativas Bacterias Gram negativas No esporulados No esporulados Anaerobios facultativos Anaerobios facultativos Fermentadores de la lactosa con produccin de cido y gas a 36+/- 1C en 24-48 horas Fermentadoras de la lactosa con produccin de cido y gas a 36 +/- 1C en 24-48 horas y 44.5 +/- 0.2C en 24 horas Hbitat: Tracto gastrointestinal de animales de sangre caliente (bacterias entricas) son comunes en otros ambientes (suelos, vegetales, agua) Caractersticas de heces de animales homeotermos Fuente: Memorias seminario internacional: El agua y los riesgos para la salud
2.2.3. Salmonella spp. Bacilo corto (1.2 um). Gram negativo, no esporulado y generalmente mvil con flagelos pertricos. El gnero Salmonella contiene unas 2000 cepas distintas (denominadas serovares o serotipos) de acuerdo a sus antgenos O y H.
Salmonella spp se caracteriza bioqumicamente por su capacidad de fermentar la glucosa con produccin de cido y gas y por su capacidad de hidrolizar la lactosa y la sacarosa. Su temperatura ptima de crecimiento, como la de la mayora de las bacterias causantes de toxiinfecciones alimentarias esta prxima a los 37C; son relativamente
10 fotosensibles y se destruyen a 60C en unos 15 20 minutos, siendo incapaces de crecer por debajo de los 7 u 8C (Doyle; et al.; 1997)
Figura 4. Salmonella spp en agar XLD
Fuente: bioinfo.bact.wisc.edu/.../Salmonella.html
2.3. TCNICA DE FILTRACIN POR MEMBRANA PARA DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES
Para la determinacin de coliformes totales y fecales en agua potable, la legislacin colombiana en la resolucin 2115 de 2007, recomienda entre otras tcnicas, la de filtracin por membrana.
La tcnica de filtracin por membrana utiliza un mecanismo mediante el cual se atrapan en la superficie de una membrana microorganismos cuyo tamao es mayor que el tamao del poro (0.45 um); esto gracias a una bomba elctrica que ejerce una presin diferencial sobre la muestra de agua haciendo que se filtre. Los microorganismos de tamao menor que el especfico del poro pasan la membrana o quedan retenidos en su interior, las bacterias quedan en la superficie de la membrana y luego esta es llevada a un medio enriquecido, selectivo o diferencial, quien a travs de intercambio metablico y una incubacin, evidencian el crecimiento de microorganismos y Unidades Formadoras de Colonia. (APHA - AWWA - WPCF, 2000).
Esta tcnica es altamente reproducible y proporciona resultados numricos, es una manera rpida y simple de estimar las poblaciones bacterianas en el agua, y especialmente til al evaluar grandes volmenes o al realizar diariamente muchas pruebas de Coliformes (HACH, 2000).
11
El equipo de soporte del filtro (Fabricado en vidrio, plstico resistente a autoclave, porcelana o acero inoxidable) consiste en un embudo, unido a una base por un artefacto de cierre que se mantiene en su lugar mediante una fuerza magntica. El diseo debe permitir que la membrana se mantenga con seguridad sobre la placa porosa, sin que sufra dao mecnico, de manera que todo el lquido pase a travs de la membrana durante la filtracin. (APHA, 1992)
Se deben utilizar filtros de membrana con un dimetro de poro que permita una completa retencin de las bacterias coliformes. Solo se emplean filtros en los que se haya comprobado, mediante una adecuada prueba de control de calidad y por garanta del fabricante, que permita una retencin de las bacterias coliformes. (APHA, 1992).
Se debe tener en cuenta, que dichos filtros deben ser libres de qumicos susceptibles de inhibir el crecimiento y desarrollo bacteriano, que posean una velocidad de filtracin satisfactoria, ausencia de influencias significativas sobre el pH del medio (no mas de +/- 0.2 unidades) y que no produzcan un aumento en el nmero de colonias confluentes o expansivas, en comparacin con los filtros de membrana de control (APHA, 1992).
Se recomienda utilizar filtros de membrana preesterilizados cuyos fabricantes garanticen que la tcnica de esterilizacin no ha inducido toxicidad ni alterado las propiedades fsicas o qumicas de la membrana, si estas se esterilizan en el laboratorio se deben someter al autoclave por 10 minutos a 121C. (APHA, 1992).
El mecanismo de accin es muy simple: retienen todas las partculas que posean un tamao mayor que los poros, estos poros quedan formados por los espacios que
12 resultan de la superposicin de las fibras de las distintas capas que forman la membrana, as algunas partculas de menor tamao son retenidas por otros mecanismos como las fuerzas de Van der Waals o por la suma de partculas retenidas previamente (PEARCE, 2007)
2.3.2. Tipos de filtro de membrana
2.3.2.1 Filtros de profundidad Estn elaborados por un material fibroso (papel, asbesto o fibra de vidrio) dispuesto al azar, de manera que dentro de la estructura del filtro se crean vas tortuosas donde pueden quedar retenidos la mayora de los contaminantes presentes.
Presenta ventajas como la alta capacidad de retencin de partculas sobre su superficie y a travs de toda su estructura y que permiten filtrar grandes volmenes. Presenta desventajas en cuanto a que no presentan un tamao de poro uniforme y existe la liberacin, hacia el material filtrado, de partculas y microorganismos que hayan crecido dentro del filtro. (http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf) Figura 6. Filtros de profundidad
2.3.2.2 Filtros de superficie o membrana Elaborados generalmente de acetato de celulosa o nitrato de celulosa, contienen poros de tamao uniforme. Se pueden saturar rpidamente y la velocidad de filtracin a travs de ellos es lenta. (http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf)
2.3.2.2.1 Membrana de nitrato de celulosa La nitrocelulosa es un material utilizado de manera habitual para la fabricacin de filtros de membrana. Estas membranas son de naturaleza hidroflica, con una microestructura muy uniforme lo que permite excelentes niveles de retencin de partculas y un comportamiento perfecto en pruebas microbiolgicas. (http://fanoia.com/filterlab/micro-8- 15.pdf)
Tienen una estructura de poro muy uniforme, lo que asegura una excelente retencin y un ptimo crecimiento microbiolgico en muestras de agua, bebidas, frmacos (PEARCE, 2007).
2.3.2.2.2 Membrana de acetato de celulosa Son de naturaleza hidroflica, presentan una excelente estabilidad trmica, permiten gran capacidad de carga y altas velocidades de flujo, por lo que resultan apropiados para la esterilizacin y clarificacin de soluciones acuosas, alcohlicas y aceites. Las partculas ms grandes que el tamao del poro son rechazados por la superficie de la membrana y el remanente permanece o se concentra all. El volumen del fluido y otras partculas finas de menor tamao del poro pueden pasar a travs de la membrana al sitio de filtrado (PEARCE, 2007).
14 Tabla 6. Aplicaciones de los filtros de membrana Filtros de nitrato de celulosa Filtros de acetato de celulosa Filtracin de aguas Esterilizacin de muestras de protenas Anlisis microbiolgico Esterilizacin de fluidos biolgicos Anlisis gravimtrico Filtracin de alcoholes Anlisis cualitativos de partculas Filtracin de aceites Esterilizacin de muestras Filtracin de muestras de aguas Determinacin de protenas Identificacin de cidos nucleicos Pre filtracin de muestras Clarificacin de muestras Fuente. http://www.fanoia.com/filterlab/micro-8-15.pdf
2.4. MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es un sustrato o solucin de nutrientes en donde crecen, y se multiplican los microorganismos, con el objetivo de aislar diferentes especies de microorganismos que induzcan al desarrollo de estrategias complementarias de identificacin, cuantificacin, caracterizacin de la microflora (Tortora, G. 1993). De la inocuidad y de la capacidad de recuperacin del medio de cultivo, as como de su posterior manipulacin dependen en gran medida los resultados de una prueba microbiolgica. (Tortora, G. 1993).
Los medios de cultivo se pueden clasificar de la siguiente manera: Segn su estado fsico: lquidos, semislidos y slidos Segn su finalidad: No selectivos: contienen los nutrientes suficientes para soportar el crecimiento de gran variedad de microorganismos. Selectivo: permite el crecimiento de solo un tipo de microorganismo Enriquecido: son medios no selectivos a los que se le agregan sustancias como sangre, suero, albumina, etc., para microorganismos exigentes. Diferenciales: son medios de cultivo que permiten establecer diferencias entre diferentes tipos de microorganismos. (ISO\TS 11133-2: 2003)
La composicin qumica del medio de cultivo debe proveer los requerimientos nutricionales bsicos para el crecimiento de microorganismos, sin embargo un medio de cultivo debe cumplir con dos caractersticas muy importantes. La selectividad y la
15 productividad. Su productividad se refiere a la formulacin bsica del medio de tal forma que favorezca el crecimiento de microorganismos con las caractersticas macroscpicas y microscpicas esperadas. (Tortora, G. 1993).
Adems de las caractersticas anteriormente mencionadas, existen otras pruebas de control de calidad que se realizan a los medios de cultivo, entre ellas podemos encontrar: propiedades bioqumicas (diferenciales y diagnosticas), propiedades fsicas (pH, volumen) y la especificidad (cuando se trate de medios con caractersticas de diferenciales) (ISO\TS 11133-2: 2003)
2.4.1. Medios cromgenos
Basados en sustancias qumicas que aadidas al medio dan un precipitado coloreado que demuestra la presencia de una enzima especifica, si el microorganismo posee el sistema enzimtico para utilizar el sustrato, se produce un cambio de color visible en las colonias. Son medios rpidos, sencillos y fiables para detectar actividades enzimticas especificas de varios organismos. (Tortora, G. 1993).
2.4.1.1. Medio Chromocult para Coliformes Es un agar selectivo para el crecimiento de coliformes totales y E. coli en muestras de aguas y alimentos. Por la accin conjunta de peptonas selectivas, piruvato y tampn de fosfatos se garantiza un rpido crecimiento tambin de coliformes con daos sublaterales. El contenido de lauril sulfato inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas sin tener influencias negativas sobre el crecimiento de los coliformes. La formacin simultnea de coliformes totales y E. coli se hace posible por la nueva formacin de dos sustratos cromgenos: el sustrato Salmon Gal es separado por la enzima -D-galactosidasa caracterstico de coliformes y provoca una coloracin roja de las colonias de coliformes. (MERCK, 1998).
La formacin de la -D-Glucoronidasa caracterstica para E. coli tiene lugar mediante el sustrato X- glucornido, que al ser cortado por la encima produce una coloracin azul para las colonias positivas. Ya que E. coli separa tanto Salmon-Gal como X- Glucornido, las colonias se tien de violeta azul oscuro y debido a ellos se pueden diferenciar de los coliformes restantes que se presentan de color rojo. (MERCK, 1998).
El contenido de triptfano mejora la reaccin de indol para la confirmacin adicional de E. coli que se d con el reactivo de kovacs y aumenta con ello la confirmacin de la reaccin Salmon -Gal y la reaccin X-Glucornido (MERCK, 1998).
16
2.4.1.2. Ventajas de los medios cromgenos frente a los convencionales. La identificacin bacteriana se basa generalmente en una extensa batera de pruebas bioqumicas convencionales, que permiten determinar sus caractersticas de desarrollo y de metabolismo; estos mtodos requieren una colonia bacteriana pura, tomada de una placa de aislamiento primario, su siembra en diferentes medios y su posterior lectura e interpretacin. En la mayora de los casos el diagnstico lleva tiempo y varios pasos de manipulacin.
Los sustratos enzimticos sintticos realizan la identificacin de microorganismos por medio de la formacin de color que ponen de manifiesto la presencia de enzimas especficas para cada especie.
En general se distinguen grupos de compuestos cromognicos que han sido usado en reacciones bioqumicas para estudiar la cintica de enzimas especificas, de acuerdo al principio, que el sustrato es hidrolizado por la enzima especifica, liberando un cromforo, permiten identificar un microorganismo especfico en un tiempo, evitando una cantidad de pasos que hacen mas tedioso el trabajo de identificacin, logrando visualizar de forma rpida especies diferentes en una misma muestra analizada. (Moreno. C. 2004)
2.5. VALIDACIN
Validar es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia documentada que un proceso especifico producir de forma consistente productos que reunirn las caractersticas de calidad predefinidas (CORTES, 2002; FDA, 1987). Este proceso adems ofrece evidencia de que un mtodo es capaz de servir para su propsito planteado, para tal fin se deben reflejar las condiciones reales de ensayo, esto puede conseguirse usando productos contaminados o productos inoculados con un nmero conocido de microorganismos (ENAC, 2002; GTC 84, 2003).
El proceso de validacin se inicia con las actividades de pre validacin, las cuales consisten en la recopilacin de la informacin relacionada con el proceso, en la revisin de las evaluaciones de riesgos, la calificacin tcnica a las instalaciones locativas y a los equipos, existencia de procedimientos para las tareas u operaciones y el entrenamiento a los trabajadores. Posteriormente se procede a elaborar los protocolos en donde se define los objetivos especficos de las evaluaciones a efectuar, las responsabilidades de cada una de las reas involucradas en la validacin, se establecen las variables de
17 inters que se quieren monitorear y el plan de monitoreo respectivo, adems de incluir los criterios de aceptacin que no son otra cosa que la comparacin de los resultados con los niveles permisibles o los resultados esperados. (Estrada C, 1999)
A continuacin se desarrolla la validacin propiamente dicha en donde se realiza una evaluacin de una muestra representativa, en nmero de lotes de produccin si la produccin es por lotes o en tiempo si esta es continua. Durante esta fase se recopilan las muestras de las variables que se desean medir y se realizan los anlisis o clculos respectivos. Finalmente con los resultados arrojados por el proceso anterior se hacen las recomendaciones respectivas y conclusiones, que despus de cumplir un plan de accin se cierran y se procede a declarar el proceso como validado. (Estrada C, 1999)
Para la recuperacin e identificacin microbiana, los anlisis microbiolgicos, son ajustables a veces, a mtodos alternativos a los descritos en la USP por diversas razones: econmicas, de produccin, y tiempo. Por tanto estos mtodos requieren ser validados. (USP 31, 2008) En Los mtodos microbiolgicos alternativos es importante tener en cuenta un cierto grado de variabilidad. Cuando se llevan a cabo pruebas microbiolgicas por conteo en placa convencional, se puede llegar a encontrar resultados con porcentajes de desviacin estndar relativa de 15 a 35 ya que muchos mtodos microbiolgicos convencionales estn sujetos a errores de muestreo, de dilucin, de incubacin y del operador. (USP 31, 2008).
Incluso cuando se haya realizado la validacin, el laboratorio tendr que verificar peridicamente que se cumplen los parmetros documentados, utilizando por ejemplo muestras inoculadas o materiales de referencia incorporados a las matrices ms representativas. (ENAC, 2002).
2.5.1. Parmetros de Desempeo de la Validacin
Son las propiedades, caractersticas o capacidades del mtodo.
2.5.1.1. Especificidad Capacidad de un mtodo de determinar inequvocamente un analto/parmetro en presencia de los otros componentes de la muestra. La especificidad puede ser afectada por la presencia de interferentes (como precursores de sntesis, impurezas, productos de degradacin, entre otros). (OGA-016,2004).
18 2.5.1.2. Exactitud La exactitud, es la cercana de un resultado al valor verdadero por comparacin con los valores de referencia de un material caracterizado (material de referencia). Los valores de referencia deberan ser trazables a las normas internacionales; los materiales de referencia certificados (MRC) generalmente se aceptan como trazables. Es ideal que el material de referencia sea de matriz natural lo mas similar posible a las muestras de inters. (RODRGUEZ, 2004). Usualmente, la exactitud se expresa como el porcentaje de recuperacin de los microorganismos mediante el mtodo de validacin. (USP 31, 2008).
2.5.1.3. Precisin Las dos medidas ms comunes de la precisin, que generalmente se define en trminos de desviacin estndar o el coeficiente de variacin (desviacin estndar relativa) son la repetibilidad y la reproducibilidad. La repetibilidad, da una idea de la variabilidad que se espera cuando un proceso es aplicado por un solo analista en un equipo durante un periodo corto (anlisis por duplicado). La reproducibilidad, es la que representa la variabilidad que se obtiene cuando un proceso es analizado por diferentes analistas, lo cual tiene un valor ms amplio. La precisin intermedia y ms til en casos especficos se obtiene cuando se evala reproducibilidad entre analistas en un mismo laboratorio. (RODRGUEZ, 2004).
2.5.2. Datos requeridos para la validacin
Los requisitos de las pruebas farmacopeicas varan desde valoraciones analticas muy rigurosas hasta evaluaciones subjetivas de atributos. Considerando esta amplia variedad, es lgico que diferentes procedimientos de prueba requieran diferentes esquemas de validacin. Las categoras ms habituales para las que se exigen datos de validacin son: Categora I: Los procedimientos analticos para la cuantificacin de componentes principales de frmacos a granel o ingredientes activos (incluyendo conservantes) en productos farmacuticos terminados. Categora II: Los procedimientos analticos para la determinacin de impurezas en frmacos a granel o productos de degradacin en productos farmacuticos terminados. Estos procedimientos incluyen anlisis cuantitativos y pruebas de lmite. Categora III: Los procedimientos analticos para la determinacin de las caractersticas de desempeo. Categora IV: Pruebas de identificacin
19 Para cada categora, se requiere de diferente informacin analtica. La validez de un procedimiento analtico puede verificarse slo mediante estudios de laboratorio. Por lo tanto, la documentacin final de dichos estudios constituye un requisito bsico para determinar si un procedimiento es adecuado para sus aplicaciones previstas. (USP 31, 2008)
Tabla 7. Datos requeridos para la validacin
DATOS REQUERIDOS PARA LA VALIDACIN Categora II Caractersticas de Desempeo analtico Categora I anlisis cuantitativa Prueba de lmite Categora III Categora IV Exactitud Si Si * * No Precisin Si Si No Si No Especificidad Si Si Si * Si Lmite de deteccin No No Si * No Lmite de Cuantificacin No Si No * No Linealidad Si Si No * No Fuente: USP 31, 2008.
2.6. VALIDACIN Y SELECCIN DE MTODOS DE ENSAYO MICROBIOLGICO
El anlisis microbiolgico tiene como fin proporcionar informacin confiable acerca de la inocuidad y calidad sanitaria de una muestra cualquiera. Es por ello que es indispensable la eleccin de un mtodo de ensayo adecuado.
Para decidir si un mtodo es apropiado o no, se debe tener en cuenta: si ese mtodo es aplicable a la muestra analizar a analizar, la cantidad de muestra necesaria para el ensayo, si usando esta metodologa se puede evaluar el cumplimiento de las exigencias requeridas para el analto. El laboratorio debe elegir los mtodos que mejor se adecuen a sus objetivos y debe documentarlos debidamente. (GUARNIZO, 2005).
20 Existen tipos principales de determinaciones propias de las pruebas microbiolgicas, entre las que se incluyen: Pruebas para determinar si los microorganismos estn presentes en una muestra y pruebas para cuantificar el nmero de microorganismos. (USP 31, 2008)
2.6.1. Pruebas cualitativas para detectar la presencia o ausencia de microorganismos
Este tipo de pruebas se caracteriza por el uso de turbidez en un medio lquido de crecimiento como evidencia de la presencia de microorganismos viables en la muestra de la prueba. (USP 31, 2008)
2.6.2. Pruebas cuantitativas para microorganismos
El mtodo de recuento en placa es el ejemplo ms comn de esta clase de pruebas que se emplean para estimar el nmero de microorganismos viables en la muestra. (USP 31, 2008) Tabla 8. Parmetros de Validacin por tipo de prueba microbiolgica. Parmetro Pruebas cualitativas Pruebas cuantitativas Exactitud No Si Precisin No Si Especificidad Si Si Lmite de deteccin Si Si Lmite de cuantificacin No Si Linealidad No Si Robustez Si Si Repetibilidad Si Si Fuente: USP 31, 2008.
Un laboratorio debe validar los mtodos no normalizados, los mtodos que disea o desarrolla, los mtodos normalizados empleados fuera del alcance previsto, as como las ampliaciones y las modificaciones de los mtodos normalizados, para confirmar que son aptos para el fin previsto. La validacin debe ser tan amplia como sea necesario para satisfacer las necesidades del tipo de aplicacin o del campo de aplicacin dados. El laboratorio debe registrar los resultados obtenidos, el procedimiento utilizado para la
21 validacin y una declaracin sobre la aptitud del mtodo para el uso previsto. (ENAC, 2002).
2.6.3. Mtodos normalizados
Son mtodos que el laboratorio aplica como ya esta descrito en un procedimiento o en una norma, en este caso tambin es necesario anexar o volver a escribir bajo forma de procedimientos las especificaciones reconocidas que tengan suficiente informacin para realizar los ensayos (G-ENAC. 1997) .
El laboratorio debe confirmar que puede operar correctamente los mtodos normalizados antes de introducir los ensayos. Si el mtodo normalizado cambia se debe repetir la confirmacin.
2.6.4. Mtodos desarrollados por el laboratorio
Elaborados en el laboratorio y no se encuentran en ningn documento oficial, debe ser una actividad planificada y debe ser asignada a personal calificado y proveer los recursos necesarios (G-ENAC. 1997)
2.6.5. Mtodos normalizados con modificaciones
Son mtodos tomados de una norma, pero con alguna modificacin, tal es el caso de una filtracin con membrana utilizando otro medio de cultivo diferente; aqu se debe realizar lo mismo a como si se estuviera realizando la validacin de un mtodo desarrollado por el laboratorio, debido a que ya existe una modificacin sobre el mtodo normalizado (G-ENAC. 1997).
2.7. PRERREQUISITOS DE LA VALIDACIN
2.7.1. Monitoreo ambiental
La calidad microbiolgica del aire y las superficies de laboratorio son un indicador de la efectividad de las tareas realizadas segn el programa de limpieza y desinfeccin.
22 El programa de muestreo para monitoreo ambiental incluye:
Determinacin cuantitativa de microorganismos presentes en el ambiente (recuento total de determinado tipo de microorganismos, por ejemplo: hongos y levaduras, mesfilos). Determinacin cualitativa dependiendo de los ensayos que realiza el laboratorio (ejemplo: Enterobacterias, coliformes, Salmonella spp). El laboratorio debe definir los recuentos mximos de microorganismos que considere aceptable y disponer de un procedimiento documentado en el que se describan las acciones a tomar para corregir las situaciones en que sobrepasen estos lmites.
Se recomienda realizar como mnimo los siguientes controles microbiolgicos, aunque es importante resaltar que existe variedad de mtodos para llevarlos a cabo:
Monitoreo de la calidad del aire por exposicin de placas o equipos muestreadores Monitoreo de la calidad microbiolgica de las superficies de trabajo, por frotacin con hisopos o por placas rodac Control de dotacin y de personal (VILLOCH, C.A. 2002)
Tabla 9. Lmites microbiolgicos ambientales, rea de recuentos INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
Ambiente del rea / 60 minutos
No. De microorganismos viables bacterias UFC/placa
No. De microorganismos viables hongos y levadura UFC/placa Cabina flujo laminar clase 100
0
0 rea Max. 12 Max. 12 No: Nmero
23 Tabla 10. Lmites microbiolgicos superficies, rea de recuentos INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
Superficie del rea / 25cm 2
No. de microorganismos viables bacterias UFC/ 25 cm 2
No. de microorganismos viables hongos y levaduras UFC/ 25 cm 2
Tabla 11. Lmites microbiolgicos dotacin - guantes, rea de recuentos INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
Superficie del rea /placa
No. de microorganismos viables bacterias UFC/placa
No. de microorganismos viables hongos y levaduras UFC/placa Guantes inicio Max. 3 Max. 1 Guantes final Max. 7 Max. 5 No: Nmero
Se debe limpiar y desinfectar el espacio de ambiente controlado, en el cual se desarrolla el procedimiento. Este permitir a la empresa mantener un nivel mnimo consistente de contaminacin, en pisos y mesn de muestras, es importante siempre tener en cuenta que en las cabinas se exige cero contaminacin. Un mtodo eficiente es la desinfeccin apropiada mediante un sistema de rotacin de desinfectantes, usando generalmente los de tipo fenlicos, amonios cuaternarios, aldehdos, perxidos y haluros.
En el caso de algunos equipos que no se pueden esterilizar por los diversos mtodos como: Equipos elctricos y electrnicos, balanzas, bateras, etc.; la desinfeccin de estos equipos debe ser ms rigurosa debido a su potencial de contaminacin con un gran nmero de microorganismos. (CARLENTON, 1999)
24 2.7.2. Escala de Mc Farland
La escala de Mc Farland, es utilizada como estndar de turbidez en la preparacin de suspensiones de microorganismos. Los estndares de turbidez son preparados por la mezcla de qumicos que se precipitan para formar una solucin de turbidez reproducible. Son realizados adicionando cido sulfrico a una solucin acuosa de cloruro de bario, del cual resulta la formacin de un precipitado de sulfato de bario (ZIMBRO Y POWER, 2003) Esta escala de turbidez es elaborada con una mezcla de BaCl 2 de 0.048 M y H 2 S0 4 0.6 M, la turbidez la da el BaCl 2, el cual va en cantidad creciente mientras al cido sulfrico va disminuyendo la proporcin. (ESCOBAR, 2002)
Cada uno de los tubos del patrn de acuerdo con la turbidez, representa un nmero de bacterias, para suspensiones de igual turbidez, que ha sido determinado por recuentos de colonias. De esta forma al comparar una emulsin de bacterias con el tubo del patrn de Mc farland que ms se asemeje se puede saber aproximadamente el numero de bacterias en la emulsin (ESCOBAR, 2002)
2.7.3. Medios de cultivo
Los medios de cultivo seleccionados debern ser evaluados con la prueba de promocin de crecimiento de bacterias, mohos y levaduras. Las unidades de promocin de crecimiento deben ser inoculadas con un nmero menor de 100 UFC. Si las pruebas de promocin de crecimiento fallan, se debe investigar el origen de cualquier contaminacin encontrada durante la simulacin y repetir la prueba. (ROGANTI, 2004)
2.7.3.1. Esterilizacin del medio de cultivo El medio seleccionado debe ser esterilizado por uno de los dos mtodos primarios, filtracin o esterilizacin por vapor. La esterilizacin por filtracin requiere que el medio pase por un filtro de 0.22m a un contenedor previamente esterilizado; este mtodo presenta dificultad debido a que los medios de cultivo son mezcla de varios materiales naturales y una cantidad considerable de estos son slidos no solubles que se encuentran presentes en la mezcla acuosa. (CARLENTON, 1999)
El proceso con vapor (autoclave) emplea la esterilizacin terminal del medio en un contenedor del cual ser dispensado para el envase, este procedimiento terminal reduce la necesidad de manipulacin post-esterilizacin que puede comprometer la esterilidad del medio. (CARLENTON, 1999)
25 Despus de la esterilizacin del medio este debe ser manejado realizando las mismas practicas usadas para las operaciones de produccin rutinarias. Algunas empresas siguen algunos pasos adicionales como la preincubacin del medio antes de empezar la corrida de la prueba, para asegurarse de la esterilidad del medio antes del envase de este. (CARLENTON, 1999)
2.7.3.2. Incubacin Los medios se deben incubar en condiciones adecuadas de modo que se puedan evidenciar los microorganismos que podran de otra manera ser difciles de cultivar. Se deben establecer las condiciones de incubacin de acuerdo con las siguientes pautas generales:
La temperatura y el tiempo de incubacin debe ser conveniente para la recuperacin de la carga microbiana, en ningn momento deben estar fuera del rango de 20-35; y se debe mantener dentro de +/- 2.5C de la temperatura requerida. (CARLENTON, 1999)
2.7.3.3. Control de autoclave Para verificar que el proceso de esterilizacin se realiza en forma adecuada, se realiza un control por cada ciclo introduciendo un vial que contiene esporas de Bacillus stearothermophilus en el autoclave. (I-DCM 008 USO Y MANEJO DE BIOINDICADOR EN PROCESO DE ESTERILIZACIN Codificacin correspondiente al Sistema de Gestin de Calidad de INTERPHARM de COLOMBIA Ltda.) Esta prueba consiste en introducir en el autoclave viales de Bacillus stearothermophilus en posiciones establecidas, junto con el material que se esta esterilizando en los parmetros normales, cuando finaliza el proceso se incuba y se determina el crecimiento o no por medio del cambio en el indicador de pH que se encuentra en la ampolleta. (NTC - 4543, 1998). Adicionalmente el autoclave debe estar calificado (se debe tener en cuenta la ultima fecha de la calificacin del autoclave), para de esta manera asegurar la adecuada distribucin de calor para cargas y volmenes definidos, usualmente se recomienda que se use un ciclo de autoclave de 121 durante 15 minutos (USP 31, 2008). Para llevar a cabo la calificacin del autoclave existen tres etapas fundamentales: certificacin de la instalacin (CI), certificacin operativa (CO) y certificacin funcional (CF).
En el caso de la certificacin de la instalacin, se debe registrar toda la informacin de identificacin (nombre del equipo, descripcin, nmero de modelo e identificacin,
26 certificados de compra), ubicacin, requisitos de servicios bsicos y cualquier caracterstica de seguridad del equipo (fcil acceso a todos los planos, manuales, listas de repuestos, direccin del vendedor y numero telefnico de contacto).
En cuanto a la certificacin operativa: se debe describir toda la informacin necesaria en la que conste que todos los componentes del equipo (autoclave), funcionan segn lo especificado; esto se obtiene sometiendo a prueba todos los controles de operacin normal, todos los puntos de alarma, todos los interruptores y dispositivos visualizadores.
Para finalizar el proceso de calificacin del autoclave, se realiza la certificacin funcional, en la cual se describe el procedimiento necesario para demostrar que el sistema del equipo funciona uniformemente y cumple las especificaciones exigidas bajo la operacin cotidiana (OMS, 1998)
2.7.4. Documentacin
Es esencial que el programa de validacin este documentado y que la documentacin sea mantenida correctamente. Es importante registrar los detalles del proceso (ej. tiempo, equipo usado) y registrar los cambios que hayan ocurrido. Un registro del mantenimiento puede ser til en la ejecucin de investigaciones de fallas referentes a un lote especfico de fabricacin. Los datos de la validacin (junto con datos de pruebas especficas) pueden tambin determinar la variacin prevista en las caractersticas del producto o el equipo (RODRGUEZ, 2004).
2.7.5 Desarrollo del protocolo de validacin
El propsito del protocolo de validacin es demostrar que el proceso es reproducible y est normalizado de manera que los resultados que provee sern comparables a los de otro proceso en un lugar diferente y viceversa. (RODRGUEZ. 2004) El protocolo consta de: Identificacin del proceso que se va a validar Criterios objetivos y que se pueden medir para una validacin exitosa Duracin de la validacin Turnos, operadores, equipo que se va a usar en el proceso Identificacin de servicios para el equipo de proceso y la calidad de los servicios Consideracin del mantenimiento y reparaciones de equipo de fabricacin Identificacin de los operadores y calificacin del operador requerido Descripcin completa del proceso
27 Cualquier control o condicin especial que se coloque en los procesos precedentes durante la validacin Parmetros de proceso que se van a monitorear, y mtodos para controlar y monitorear Caractersticas de producto o proceso que se van a monitorear y mtodos para monitorear Mtodos estadsticos para recoleccin y anlisis de datos
Se deben tener en cuenta las causas de variacin controlables en un proceso de validacin como son: temperatura, humedad, variaciones de suministro elctrico, vibracin, contaminantes ambientales, pureza del agua usada en el proceso, luz, variabilidad de los materiales, desgaste del equipo, factores humanos (entrenamiento, factores econmicos, tensin, etc.) (RODRGUEZ. 2004)
2.7.6 Informe Final de Validacin
Este informe resume y presenta todos los protocolos, resultados y deriva conclusiones relacionadas con el estado de validacin del proceso. Debe ser revisado y aprobado por el equipo de validacin y la administracin. (RODRGUEZ. 2004)
28
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN
3.1 FORMULACIN DEL PROBLEMA
En el presente trabajo se realizo la validacin del mtodo de deteccin de coliformes totales y fecales en agua potable utilizando agar chromocult segn POE DCM 046 DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN AGAR CHROMOCULT (codificacin correspondiente al Sistema de Gestin de Calidad de INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.) estableciendo parmetros estndares de validacin tales como especificidad, exactitud, precisin, repetibilidad, reproducibilidad. Todo lo anterior teniendo en cuenta la necesidad de reducir tiempos y costos, adems de cumplir con los requisitos tanto de la normatividad gubernamental como aquellos que puedan llegar a dar reconocimiento al laboratorio.
3.2 JUSTIFICACIN DEL PROBLEMA
La validez en los resultados de los anlisis microbiolgicos se ven afectados por factores como: La preparacin del inculo, la naturaleza de los microorganismos utilizados, las condiciones especficas de la prueba, las condiciones de recuperacin, entre otros. Por lo anterior, todos los mtodos y especialmente los relacionados con el anlisis microbiolgico del agua potable, dada la importancia como materia prima, ingrediente y disolvente en el procesamiento, formulacin, fabricacin de productos farmacuticos y para el consumo humano, deben ser validados.
Por esta razn, en este trabajo de grado se demuestra que el mtodo de filtracin por membrana utilizado por el laboratorio INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda, para la deteccin de coliformes totales y fecales en agua potable utilizando agar chromocult, es confiable, reduce costos y tiempo.
29
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL Realizar la validacin del mtodo de filtracin por membrana para la deteccin de coliformes totales y fecales en agua potable utilizando agar chromocult, tcnica empleada en el laboratorio de INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
Comprobar la efectividad del agar chromocult como un mtodo de deteccin eficaz para coliformes totales y fecales en agua potable.
Demostrar mediante pruebas de enumeracin y recuperacin de los microorganismos evaluados que el mtodo de filtracin por membrana para la deteccin de coliformes fecales y totales, es apropiado para analizar muestras de agua.
Comprobar si el mtodo cuantitativo de filtracin por membrana para la deteccin de coliformes totales y fecales en agua potable es especifico, exacto, reproducible, repetible y preciso.
Elaborar el protocolo de validacin del mtodo de deteccin de coliformes totales y fecales en agua potable utilizando agar chromocult.
30
5. MATERIALES Y MTODOS
5.1 DISEO EXPERIMENTAL
En el presente trabajo se realiza un estudio experimental, para obtener la validacin del mtodo de filtracin por membrana para la deteccin de coliformes totales y fecales en agua potable utilizando agar chromocult en el laboratorio INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
5.2 POBLACIN DE ESTUDIO Y MUESTRA POBLACIN DE ESTUDIO
El estudio se realiza en el laboratorio de anlisis microbiolgico de la empresa INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda. Ubicado en la Carrera 68 A # 19-79 de la ciudad de Bogot, con muestras de agua potable del laboratorio, inoculadas con un nmero conocido de microorganismos contaminantes.
Se utiliza agua potable, proveniente del acueducto de Bogot, a la cual el laboratorio le realiza pruebas fisicoqumicas, para determinar el cumplimiento de las especificaciones descritas para agua potable segn la resolucin 2115 de 2007 y segn el programa de controles internos establecido en el laboratorio.
Se utilizan tres microorganismos: Escherichia coli ATCC 8739 Salmonella typhimurium ATCC 14028 Enterobacter aerogenes ATCC 13048
Las cepas utilizadas corresponden al cuarto pase, (cepas de trabajo) segn POE DCM 013 MANEJO DEL CEPARIO (Codificacin correspondiente al Sistema de Gestin de Calidad de INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.)
Para la validacin del mtodo de deteccin de coliformes totales y fecales, se analizan diez (10) muestras diferentes de agua potable, provenientes de la misma fuente (llave de agua - rea de lavado- laboratorio INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda) las cuales se analizan por dos analistas, en das diferentes. Cada da se evala una muestra de agua diferente con tres rplicas, para cada prueba, realizando una prueba estndar(control positivo), en la cual se evalu cada microorganismo por separado (agua estril para inyeccin, inoculada con cada uno de los microorganismos a evaluar Escherchia coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028 y Enterobacter aerogenes ATCC
31 13048), una solucin de prueba (agua potable inoculada con los microorganismos utilizados como prueba: Escherchia coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028 y Enterobacter aerogenes ATCC 13048 ), un control negativo (agua potable con tiosulfato al 1% y sin inocular) y una prueba combinando la muestra de agua con los microorganismos a evaluar (agua potable + Escherchia coli ATCC 8739 + Salmonella typhimurium ATCC 14028); (agua potable + Escherichia coli ATCC 8739 + Enterobacter aerogenes ATCC 13048 ) y (agua potable + Salmonella typhimurium ATCC: 14028 + Enterobacter aerogenes ATCC 13048 ) de esta manera se obtienen, 30 recuentos por da para un total de 300 recuentos por analista, por lo tanto se obtienen 600 datos en total por los dos analistas, para determinar posteriormente parmetros cuantitativos para la validacin del mtodo.
Para llevar a cabo el anlisis de las muestras de agua se desarrolla la tcnica de filtracin por membrana llevando a cabo el montaje del equipo de filtracin segn instructivo I DCM 013 ARMADO DEL EQUIPO DE FILTRACIN (Codificacin correspondiente al Sistema de Gestin de Calidad de INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.) y se utilizan membranas de nitrato de celulosa, con poro de 0.45um y dimetro de 47 mm.
5.3 VARIABLES DE ESTUDIO
Para la validacin del mtodo de deteccin de coliformes totales y fecales en agar chromocult se determinan los siguientes parmetros cuantitativos:
Para obtener toda la informacin que puede influir en la validez de la prueba se realiza una revisin de los siguientes factores: personal, equipos e instalaciones, medios de cultivos utilizados en la prueba, reactivos, entre otros.
5.4.2 Calibracin y mantenimiento de equipos
Se verifica que los equipos utilizados en la prueba, se encuentran calibrados y dentro de los parmetros establecidos de funcionamiento. ( Ver tabla 15)
Los equipos utilizados fueron los siguientes: Cabina de flujo laminar horizontal Bomba de vaco Balanza de platillo externo Autoclave horizontal Incubadora de 20-25C Incubadora de 30-35C Microscopio Nevera
5.4.3 Preparacin de inculos
Se realizan aislamientos de los tres microorganismos prueba (Escherchia coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028 y Enterobacter aerogenes ATCC 13048) en agar casoy, incubando los medios durante 24 horas en un rango de temperatura entre 30 - 35 C, para luego obtener en cada caso colonias aisladas. Con las cepas obtenidas, se realiza una suspensin de 9 ml en solucin salina, de cada uno de los microorganismos de acuerdo al tubo N 1 de la escala de Mc Farland, el cual corresponde a una concentracin de 3 x 10 8 UFC/ml. A partir de cada suspensin se realizan diluciones seriadas hasta 3x10 -8 (segn figura 8).
De las tres ltimas diluciones (10 -6 , 10 -7 y 10 -8 ) se siembra en superficie 0.1 ml y por duplicado en Agar Casoy, incubando en un rango de temperatura entre 30-35C por 24 horas, transcurrido este periodo de tiempo, se realiza recuento y se busca la dilucin en la se encuentran menos
33 de 100UFC\ml, para de esta manera iniciar la estandarizacin del inoculo con el cualk se trabajar en la diferentes pruebas realizadas en la validacin; segn POE - DCM 043 PREPARACIN Y MANEJO DE INCULOS A PARTIR DE LA ESCALA DE MC FARLAND (Codificacin correspondiente al Sistema de Gestin de Calidad de INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.).
Figura 8. Preparacin de inculo
5.4.4 Prueba de esterilidad de los medios de cultivo
Se realiza la prueba de esterilidad a cada medio de cultivo preparado (agar chromocult) para el desarrollo de la prueba. Tomando una muestra equivalente al 10% de cada medio y llevndola a incubar por 24 horas (tiempo presuntivo en cual pueden crecer los microorganismos contaminantes) a una temperatura entre 30-35C y de esta manera evidenciar que no existe crecimiento alguno y que efectivamente el medio se encuentra en condiciones optimas para su uso; cabe destacar que luego de transcurridas las 24 horas de incubacin, as no se evidencie crecimiento, las cajas con medio permanecen en incubacin por otras 24 horas.
5.4.5. Prueba de promocin de crecimiento
La prueba de promocin de crecimiento se realiza a cada medio de cultivo preparado (agar chromocult), para garantizar que el medio utilizado en la prueba, contiene los nutrientes necesarios para los microorganismos evaluados logrando un ptimo crecimiento; se realiza un aislamiento de la cepa de trabajo de cada microorganismo en una caja de petri que contiene el medio a evaluar (agar chromocult), adems de Patrn 9.0 ml 9.0 ml 9.9 ml 9.9 ml 9.0 ml 9.0 ml Cultivo de 24 horas 1ml 0.1ml 0.1ml
1ml
1ml
1 2 3 4 5 3X10 -1
UFC/ml 3X10 -2 UFC/ml
3X10 -4 UFC/ml
3X10 - 6
UFC/ml
3X10 -7 UFC/ml
3X10 -8
UFC/ml
34 evidenciar las caractersticas tpicas de crecimiento de cada microorganismo, tambin se realizan pruebas cuantitativas para evidenciar la recuperacin de las colonias, esta fase de la prueba se realiza en la preparacin de cada inoculo de trabajo; en la cual se inocula 0.1 ml de cada suspensin a utilizar (tubo # 5 que contiene una concentracin de 30 UFC\ml), tanto en agar chromocult, como en agar casoy.
5.5 MATERIALES Y MTODOS EN LA EVALUACIN DE PARMETROS CUANTITATIVOS
La evaluacin de los parmetros cuantitativos, se obtiene a partir de procedimientos establecidos y estandarizados, para el mtodo de filtracin por membrana para la deteccin de coliformes totales y fecales en agua potable, se utiliza el POE DCM 046 DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN AGAR CHROMOCULT, del LABORATORIO INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
5.5.1. Materiales Tiosulfato de Sodio al 0.1N Colorantes de tincin de Gram. Reactivo de Kovacks Aceite de Inmersin Alcohol al 70% Alcohol al 96% Frascos Schott por 250ml Frascos Schott por 500ml Pipetas graduadas de 1, 2, 5 y 10ml Cajas de petri desechables estriles Bolsas de polietileno resistentes al calor Membranas para filtracin con poro de 0,45 m y dimetro de 47mm Guantes estriles Pera pipeteadora Agar Chromocult Agar Casoy Cepa de Escherichia coli ATCC 8739 Cepa de Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Cepa de Salmonella typhimurium ATCC 14028 Papel kraft Pinzas de acero inoxidable estriles
35 Asa redonda Asa recta Cabina de flujo laminar horizontal Microscopio Incubadora de 20-25C Incubadora de 30-35C Equipo de filtracin Bomba de vaco Contador de colonias Mangueras Tijeras estriles Vasos de filtracin Autoclave
5.5.3.1 Control de ambiente, superficie y operarios. Para la realizacin de la validacin del mtodo filtracin por membrana para agua potable en agar chromocult se evaluaron inicialmente los controles del proceso, realizando monitoreo ambiental por sedimentacin por exposicin de placas durante 60 minutos en agar casoy y en agar saboureaud en la cabina de flujo laminar en donde se realizo la prueba y sobre el mesn en el cual se ubican las muestras, tambin se llevo a cabo el control del analista al inicio y al final de cada anlisis mediante la impresin de los guantes en agar letheen; adicionalmente se desarrollo un control de superficies mediante la impresin de placas rodac sobre la cabina de flujo laminar y la pare del rea de recuentos.
36 5.5.3.2. Control negativo - muestra Se toma una muestra de 100 ml de agua potable en frasco schott estril de 250 ml segn I DCM 007 MUESTREO DE AGUA PARA EL CONTROL MICROBIOLOGICO procedente del rea de lavado del laboratorio INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda. Posteriormente se lleva al rea de recuentos y bajo cabina de flujo laminar se adiciona tiosulfato de sodio al 1% (para inactivar el cloro procedente del proceso de potabilizacin) y se deja actuar durante 30 minutos. A continuacin se adiciona la muestra (100 ml) a la copa de filtracin y se hace pasar a travs de la membrana y una vez filtrado todo el lquido se coloca la membrana sobre la superficie de una caja petri con agar chromocult y se lleva a incubar durante 24 horas a una temperatura entre 30- 35C. Este procedimiento se realiza tres veces, por cada operario.
FIGURA 9. Diagrama de flujo del control negativo
Fuente: Autor Control Negativo Filtrar 100 ml Armar equipo de filtracin Colocar membrana sobre superficie de caja de agar chromocult Para microorganismo por separado Incubar 24 horas 30 35C Realizar recuento Informar resultados Realizar coloracin de Gram Frascos schott de 250 ml con 100 ml de agua potable cada uno Adicionar Tiosulfato de sodio al 1% Adicionar Tiosulfato de sodio al 1%
Adicionar Tiosulfato de sodio al 1%
Filtrar 100 ml Filtrar 100 ml
37 5.5.3.3. Prueba estndar Para la prueba estndar, a 100 ml de agua estril para inyeccin se adiciona 1 ml de la dilucin 3x10 -8 (30 UFC/ml) para cada uno de los microorganismos utilizados: Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Escherichia coli ATCC 8739 y Salmonella typhimurium ATCC 14028, para cada microorganismo por separado; seguidamente se filtra y se coloca la membrana sobre la superficie de agar plate count, se lleva a incubar durante 24 horas a una temperatura entre 30-35C, luego de este tiempo se realiza el recuento, se evidencian las caractersticas tpicas de crecimiento y se realiza coloracin de Gram a las colonias; este procedimiento se realiza por triplicado.
FIGURA 10. Diagrama de flujo de la prueba estndar
Fuente: Autor Prueba estndar (Control positivo) Filtrar 100 ml tres veces Armar equipo de filtracin Colocar membrana sobre superficie de caja de agar plate count Para cada microorganismo por separado Incubar 24 horas 30 35C Realizar recuento Informar resultados Realizar coloracin de Gram Frascos schott con 100 ml de agua estril para inyeccin cada uno Adicionar 1 ml de 3x10 -8 (30 UFC/ml) de la suspensin de Escherichia coli ATCC 8739 Adicionar 1 ml de 3x10 -8 (30 UFC/ml) de la suspensin de Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Adicionar 1 ml de 3x10 -8 (30 UFC/ml) de la suspensin de Salmonella typhimurium ATCC 14028 Filtrar 100 ml tres veces Filtrar 100 ml tres veces
38 5.5.3.4. Solucin de prueba Para llevar a cabo la solucin de prueba, se toma una muestra de 100 ml de agua potable en frasco schott estril de 200 ml y se adiciona tiosulfato de sodio al 1% (para inactivar el cloro procedente del proceso de potabilizacin) y se deja actuar durante 30 minutos, transcurrido el tiempo, se adiciona 1 ml de la dilucin 3x10 -8 (30 UFC/ml), de los microorganismos a evaluar por separado: Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Escherichia coli ATCC 8739 y Salmonella typhimurium ATCC 14028; este procedimiento, se realiza por separado para cada uno de los microorganismos utilizados y por triplicado.
A continuacin, se realiza la filtracin de 100 ml y se coloca cada una de las membranas sobre la superficie de una caja petri con agar chromocult (para un total de 3 cajas de agar chromocult para cada microorganismo, por cada muestra analizada). Finalmente se lleva a incubar durante 24 horas a una temperatura entre 30-35C, transcurrido este tiempo se realiza el recuento, se realiza la prueba de Indol, coloracin de Gram y se informan los resultados.
FIGURA 11. Diagrama de flujo de la solucin de prueba
Frascos Schott de 250 ml con 100 ml de agua potable cada uno Adicionar tiosulfato de sodio 1% Dejar actuar durante 30 minutos Armar equipo de filtracin Solucin de prueba Adicionar 1 ml de dilucin 3x10 -8 (30 UFC/ml) de la suspensin de E. coli Adicionar tiosulfato de sodio 1% Adicionar tiosulfato de sodio 1% Dejar actuar durante 30 minutos Dejar actuar durante 30 minutos Adicionar 1 ml de dilucin 3x10 -8 (30 UFC/ml) de la suspensin de E. aerogenes Adicionar 1 ml de dilucin 3x10 -8 (30 UFC/ml) de la suspensin de S. typhimurium
39
Fuente: Autor
5.5.3.5. Solucin de prueba combinando los microorganismos Para llevar a cabo la solucin de prueba combinando los microorganismos, se toma una muestra de 100 ml de agua potable en frasco schott estril de 200 ml y se adiciona tiosulfato de sodio al 1% (para inactivar el cloro procedente del proceso de potabilizacin) y se deja actuar durante 30 minutos, transcurrido el tiempo, se adiciona 0.5 ml de la dilucin 3x10 -8 (30 UFC/ml), de los microorganismos a evaluar por separado: (Enterobacter aerogenes ATCC 13048 + Escherichia coli ATCC 8739); (Salmonella typhimurium ATCC 14028 + Enterobacter aerogenes ATCC 13048) y (Escherichia coli ATCC 8739 + Salmonella typhimurium ATCC 14028); este procedimiento, se realiza por separado para cada una de las combinaciones utilizadas y por triplicado.
A continuacin se realiza la filtracin de 100 ml y se coloca cada una de las membranas sobre la superficie de una caja petri con agar chromocult (para un total de 3 cajas de agar chromocult para cada combinacin, por cada muestra analizada). Finalmente se lleva a incubar durante 24 horas a una temperatura entre 30-35C, transcurrido este tiempo se realiza el recuento, se realiza la prueba de Indol, coloracin de Gram y se informan los resultados.
Filtrar 100 ml, tres veces Colocar membrana sobre superficie de caja de agar chromocult Incubar 24 horas 30 35C Realizar recuento Informar resultados Realizar la prueba de Indol y coloracin de Gram Filtrar 100 ml, tres veces Filtrar 100 ml, tres veces
40 FIGURA 12. Diagrama de flujo de la solucin de prueba combinando los microorganismos
Fuente: Autor
Frascos Schott de 250 ml con 100 ml de agua potable cada uno Adicionar tiosulfato de sodio 1% Dejar actuar durante 30 minutos Armar equipo de filtracin Solucin de prueba combinada Adicionar 0.5 ml de dilucin 3x10 -8 de la suspensin de E. coli y 0.5 ml de dilucin 3x10 -8 de la suspensin de E. aerogenes Filtrar 100 ml, tres veces Colocar membrana sobre superficie de caja de agar chromocult Incubar 24 horas 30 35C Realizar recuento Informar resultados Realizar la prueba de Indol y coloracin de Gram Adicionar tiosulfato de sodio 1% Adicionar tiosulfato de sodio 1% Dejar actuar durante 30 minutos Dejar actuar durante 30 minutos Adicionar 1 ml de dilucin 3x10 -8 de la suspensin de E. coli y 0.5 ml de dilucin 3x10 -8 de la suspensin de S. typhimurium Adicionar 1 ml de dilucin 3x10 -8 de la suspensin de S. typhimurium y 0.5 ml de dilucin 3 x10 - de la suspensin de E. aerogenes Filtrar 100 ml, tres veces Filtrar 100 ml, tres veces
41 5.6 VARIABLES DE ESTUDIO
Para llevar a cabo la validacin del mtodo de filtracin por membrana para la deteccin de coliformes totales y fecales en agua potable, utilizando agar chromocult y teniendo en cuenta su carcter cuantitativo se analizan variables como: exactitud, repetibilidad, reproducibilidad, especificidad.
Se determina la precisin de las tcnicas en trminos de reproducibilidad, repetibilidad, a travs de la desviacin estndar y el coeficiente de variacin La repetibilidad se evala en el proceso cuando este es desarrollado por un solo analista en un equipo durante un perodo corto, y la reproducibilidad se evala por la variabilidad que se obtiene cuando el proceso es llevado a cabo por diferentes analistas para un mismo proceso en diferentes das. De esta manera se lleva a cabo una rotacin entre dos analistas en dos das diferentes. Se realizan controles microbiolgicos de ambientes, superficies y personal durante y al finalizar el proceso. Con esto se puede encontrar la precesin, repetitividad y la reproducibilidad.
Tabla 12. Caractersticas morfolgicas y enzimticas de los microorganismos evaluados Microorganismo Color de la colonia Salmon-GAL X-glucoronido Indol Escherichia coli Azul oscuro/violeta + + + Enterobacter aerogenes Rojo/rosado + + + Salmonella typhimuium Incoloro - - - Fuente: MERCK (Manual de medios de cultivo)
5.7. RECOLECCIN DE LA INFORMACIN
Se realiza una revisin bibliogrfica en la farmacopea oficial vigente de Estados Unidos (USP 31), libros, artculos cientficos, revistas especializadas en el tema y normas relacionadas con el control de calidad microbiolgico de aguas para uso farmacutico (para nuestro caso agua potable, que es utilizada en la primera fase de produccin), especficamente en la deteccin coliformes totales y coliformes fecales. As mismo, la preparacin de reactivos, medios de cultivo y el desarrollo de los mtodos se realizan segn Procedimientos Operativos Estndar de INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
42 5.8 ANLISIS DE INFORMACIN
Para determinar el control del proceso, se realiza un anlisis de los resultados obtenidos a lo largo de la validacin de la tcnica, adems de tener en cuenta los recuentos obtenidos en los anlisis microbiolgicos de ambientes, superficies y personal.
5.8.1 Anlisis de datos
Los datos de los recuentos se analizan segn la media y desviacin estndar.
5.8.1.1 Media. ( ) Se define como un valor representativo de una serie de mediciones de un parmetro determinado. Estas mediciones deben ser tomadas bajo las mismas condiciones de modo tal que el valor resultante represente en forma objetiva dicho parmetro. Este concepto seala la tendencia de centralizacin de los datos con respecto al valor nominal de la especificacin. (Montgomery, 1991)
Numricamente se obtiene el coeficiente entre la sumatoria de todos los valores de la serie y el nmero total de mediciones, es decir
= sumatoria = media N = nmero de elementos X = valores o datos
5.8.1.2 Desviacin Estndar () Es una medida de la dispersin de una serie de mediciones de un determinado parmetro, esto significa que no es un indicador de la variacin entre cada valor y la media, se visualizan mejor cuando se presentan los datos en forma de una distribucin de Frecuencia, es decir, ordenados por clase segn su magnitud (Montgomery. 1991)
Numricamente la desviacin estndar se obtiene de la raz cuadrada de la sumatoria de todas los N cuadrados de la diferencia entre cada valor de una serie y su media, dividido por el nmero total de mediciones, es decir:
43
: sumatoria X: valor de la serie : Media N: nmero total de mediciones
44 6. RESULTADOS
6.1. ESTANDARIZACIN DE INCULOS DE TRABAJO Analista 1: Aura Lozano Analista 2: Marcela Carrillo
Tabla 13. Estandarizacin de inculos Escherichia coli ATCC 8739, Enterobacter aerogenes ATCC 13048 y Salmonella typhimurium ATCC 14028, La cantidad de inoculo utilizada para el recuento fue de 0.1ml segn La figura 8 Analista 1
45 Tabla 14. Estandarizacin de inculos Escherichia coli ATCC 8739, Enterobacter aerogenes ATCC 13048 y Salmonella typhimurium ATCC 14028, La cantidad de inoculo utilizada para el recuento fue de 0.1ml segun La figura 8 Analista 2
46 6.2. VERIFICACIN DE PROGRAMA DE CALIBRACIN Y MANTENIMIENTO DE EQUIPOS DE INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
Tabla 15. Programa de Calibracin y mantenimiento de los equipos utilizados en la validacin.
EQUIPO
MARCA/ MODELO
ULTIMA VERIFICACION
PROXIMA VERIFICACION
PROVEEDOR Incubadora Hongos Rango 20-25 C
MEMMERT / U40 M: 06-08-08 M: 06-02-09 Tecnibsculas y balanzas E. U. Incubadora Bacterias Rango 30-35 C PRECISION SCIENTIFIC / CAT 31468 M: 06-08-08 M: 06-02-09 Tecnibsculas y balanzas E. U.
Nevera 2-8 C ICASA / NE M: 06-08-08 M: 06-02-09 Tecnibsculas y balanzas E. U.
Cabina de flujo laminar PAF / NE CF: 19-02-08 CF: 19-02-08 Interpharm de Colombia Ltda.
Balanza mecnica OHAUS / 700-800 M:06-08-08 M: 06-02-09 Tecnibsculas y balanzas E. U.
Microscopio CARL ZEISS JENA / BINOCULAR M:05-03-08 M: 05-03-09 Tecnibasculas y balanzas E. U.
pH-metro
SCHOTT / CG 820 M: 06-08-08 M: 06-02-09 Tecnibsculas y balanzas E. U. Fuente: INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
M: MANTENIMIENTO C: CALIBRACIN CF: CALIFICACIN N.E: NO EXISTE
6.3 PRUEBAS PRELIMINARES
6.3.1. Prueba de esterilidad del medio de cultivo
Para evaluar la prueba de esterilidad del agar chromocult, se escoge el 10% del medio preparado y se lleva a incubar a temperatura 30-35 o C, durante 24 horas, pasado el tiempo de incubacin, no se observ ningn tipo de crecimiento microbiano, asegurando el cumplimiento de la prueba de esterilidad para el agar chromocult.
47 6.3.2 Prueba de promocin de crecimiento
En la siguiente tabla se puede apreciar los resultados de la prueba de promocin de crecimiento, segn el ensayo realizado de tipo cualitativo, los resultados del ensayo de tipo cuantitativo, son los mismos de las tablas 13 y 14 en las cuales se encuentran tabulados los resultados de la prueba de estandarizacin del inoculo.
Tabla 16. Prueba de promocin de crecimiento MICROORGANISMO CARACTERSTICAS MACROSCPICAS EN AGAR CHROMOCULT
Escherichia coli Colonias pequeas, con pigmentacin morada debida a corta el sustrato X-glucoronido y Salmon GAL. Enterobacter aerogenes Colonias rosadas, pequeas, con pigmentacin rosada debido a que solo corta el sustrato Salmon- GAL.
Salmonella typhimurium Colonias pequeas, puntiformes y de coloracin blanca debido a que no corta ningn sustrato del medio.
6.3.3. Controles microbiolgicos durante el proceso
Tabla 17. Resultados del control microbiolgico de ambiente, superficie y analista durante los ensayos realizados. Analista 1 ENSAYOS AMBIENTE UFC/ hora SUPERFICIE UFC/25cm 2 ANALISTA UFC/placa Cabina rea Cabina Pared Guantes Guantes Recuentos Inicio Final M HyL M HyL M HyL M HyL M HyL M HyL
Tabla 18. Resultados del control microbiolgico de ambiente, superficie y analista durante los ensayos realizados. Analista 2 ENSAYOS AMBIENTE UFC/ hora SUPERFICIE UFC/25cm2 ANALISTA UFC/placa Cabina rea Cabina Pared Guantes Guantes Recuentos Inicio Final M HyL M HyL M HyL M HyL M HyL M
Los resultados obtenidos para el control microbiolgico de ambientes, superficies y dotacin de analistas CUMPLEN con las especificaciones establecidas por el laboratorio INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda
49 6.4. MTODO DE FILTRACIN POR MEMBRANA PARA DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES
6.4.1. Control negativo.
Los resultados del control negativo en la prueba, fueron satisfactorios, debido a que en ningn anlisis realizado se presento crecimiento.
Tabla 19. Resultados control negativo. Analista 1
Muestras
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Recuentos UFC/100ml 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tabla 20. Resultados control negativo. Analista 2
Muestras
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Recuentos UFC/100ml 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
6.4.2. Prueba estndar y solucin de prueba
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 1, para el ensayo de la solucin prueba mas E. coli ATCC 8739, comparados con los resultados de la prueba estndar (agua estril), tambin llamada control positivo
50
Solucin de prueba: Agua potable + E.coli ATCC 8739 Analista 1: Aura Mara Lozano Solucin de prueba Replica Solucin de prueba UFC/100ml Prueba estandar UFC/100ml Porcentaje de recuperacin (%) Desviacin estndar Coeficiente de variacin 1 1 32 34
100
2.5
7.0 2 29 31 3 34 31 Promedio 32 32
2 1 30 35
97
1.1
3.0 2 32 32 3 30 30 Promedio 31 32
3
1 28 31
92
2.0
6.0 2 27 33 3 31 30 Promedio 29 31
4
1 29 31
93
1.0
3.0 2 28 30 3 30 29 Promedio 29 30
5
1 31 28
100
1.5
5.0 2 29 29 3 28 30 Promedio 29 29
6
1 16 18
94
1.0
5.0 2 17 18 3 18 19 Promedio 17 18
7
1 30 31
97
1.5
5.0 2 31 33 3 28 29 Promedio 30 31
8
1 29 30
97
1.5
5.0 2 27 30 3 30 31 Promedio 29 30
9
1 30 31
97
1.0
3.0 2 31 33 3 29 29 Promedio 30 31
10
1 31 33
97
1.0
3.0 2 33 33 3 32 35 Promedio 32 33 Tabla 21. Comparativo del porcentaje de recuperacin E.coli ATCC 8739 en la solucin de prueba y prueba estndar
51
FIGURA 13. Porcentaje de recuperacin de E.coli ATCC 8739
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 1, para el ensayo de la
solucin prueba mas Enterobacter aerogenes ATCC 13048, comparados con los resultados
de la prueba estndar (agua estril), tambin llamada control positivo.
52
Solucin de prueba: Agua potable + Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Analista 1: Aura Mara Lozano Solucin de prueba Replica Solucin de prueba UFC/100ml Prueba estndar UFC/100ml Porcentaje de recuperacin (%) Desviacin estndar Coeficiente de variacin 1 1 29 30
88
1.0
3.4 2 30 35 3 28 33 Promedio 29 33
2 1 31 31
93
2.0
6.8 2 27 30 3 29 32 Promedio 29 31
3
1 30 30
93
2.5
10 2 25 30 3 28 31 Promedio 28 30
4
1 28 30
93
0.5
1.7 2 27 31 3 28 28 Promedio 28 30
5
1 29 32
93
1.1
3.9 2 29 29 3 27 28 Promedio 28 30
6
1 29 30
96
0.5
1.7 2 29 30 3 30 30 Promedio 29 30
7
1 32 36
90
1.5
5.0 2 30 35 3 29 30 Promedio 30 33
8
1 31 33
93
2.0
6.8 2 27 30 3 29 30 Promedio 29 31
9
1 30 30
93
2.0
7.0 2 26 29 3 29 30 Promedio 28 30
10
1 29 33
93
0.5
1.7 2 30 31 3 29 29 Promedio 29 31 Tabla 22. Comparativo del porcentaje de recuperacin de Enterobacter aerogenes ATCC 13048 en la solucin de prueba y prueba estndar
53
FIGURA 14. Porcentaje de recuperacin de E. aerogenes ATCC 13048
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 1, para el ensayo de la solucin prueba mas Salmonella typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados de la prueba estndar (agua estril), tambin llamada control positivo.
54
Solucin de prueba: Agua potable + Salmonella typhimurium ATCC 14028 Analista 1: Aura Mara Lozano Solucin de prueba Replica Solucin de prueba UFC/100ml Prueba estndar UFC/100ml Porcentaje de recuperacin (%) Desviacin estndar Coeficiente de variacin 1 1 26 31
87
1.5
5.5 2 27 29 3 29 33 Promedio 27 31
2 1 29 29
93
1.5
5.0 2 30 31 3 27 33 Promedio 29 31
3 1 27 31
93
1.0
3.5 2 29 30 3 28 29 Promedio 28 30
4
1 29 31
93
1.0
3.5 2 27 29 3 28 30 Promedio 28 30
5
1 30 30
100
1.5
5.0 2 29 29 3 27 28 Promedio 29 29
6
1 26 29
93
1.5
5.0 2 29 31 3 28 29 Promedio 28 30
7
1 27 30
93
1.0
3.5 2 29 32 3 28 29 Promedio 28 30
8
1 25 27
93
2.0
7.4 2 27 29 3 29 32 Promedio 27 29
9
1 29 30
90
1.7
6.2 2 26 31 3 26 28 Promedio 27 30
10
1 26 30
96
2.0
7.0 2 30 31 3 29 27 Promedio 28 29 Tabla 23. Comparativo del porcentaje de recuperacin de Salmonella typhimurium ATCC 14028 en la solucin de prueba y prueba estndar
55
FIGURA 15. Porcentaje de recuperacin de S. typhimurium ATCC 14028
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 2, para el ensayo de la solucin prueba ms E.coli ATCC 8739, comparados con los resultados de la prueba estndar (agua estril), tambin llamada control positivo
56
Solucin de prueba: Agua potable + E.coli ATCC 8739 Analista 2: Marcela Carrillo Solucin de prueba Replica Solucin de prueba UFC/100ml Prueba estndar UFC/100ml Porcentaje de recuperacin (%) Desviacin estndar Coeficiente de variacin 1 1 35 31
100
3.4
10.9 2 29 32 3 29 30 Promedio 31 31
2 1 26 32
82
2.0
7.1 2 29 35 3 30 34 Promedio 28 34
3
1 29 30
93
0.5
1.7 2 29 32 3 30 30 Promedio 29 31
4
1 29 30
100
0.5
1.7 2 29 29 3 28 28 Promedio 29 29
5
1 27 29
93
1.0
3.5 2 28 29 3 29 31 Promedio 28 30
6
1 18 18
95
0.5
2.6 2 19 20 3 19 21 Promedio 19 20
7
1 29 30
97
1.0
3.4 2 28 29 3 30 32 Promedio 29 30
8 1 26 29
93
2.0
7.1 2 30 29 3 29 31 Promedio 28 30
9
1 29 30
100
1.0
7.1 2 30 30 3 28 28 Promedio 29 29
10
1 30 32
94
1.5
5.0 2 29 33 3 32 30 Promedio 30 32 Tabla 24. Comparativo del porcentaje de recuperacin de E. coli ATCC 873 en la solucin de prueba y prueba estndar
57
FIGURA 16. Porcentaje de recuperacin de E. coli ATCC 8739
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 2, para el ensayo de la solucin prueba mas Enterobacter aerogenes ATCC 13048, comparados con los resultados de la prueba estndar (agua estril), tambin llamada control positivo
58 Solucin de prueba: Agua potable + Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Analista 2: Marcela Carrillo Solucin de prueba Replica Solucin de prueba UFC/100ml Prueba estndar UFC/100ml Porcentaje de recuperacin (%) Desviacin estndar Coeficiente de variacin 1 1 28 32
91
1.5
5.0 2 31 32 3 30 34 Promedio 30 33
2 1 29 30
93
1.1
3.7 2 27 31 3 29 33 Promedio 29 31
3
1 26 30
90
2.0
7.1 2 30 32 3 27 29 Promedio 28 30
4
1 29 30
93
1.1
4.0 2 29 29 3 27 30 Promedio 28 30
5
1 30 31
96
2.0
7.1 2 26 28 3 27 29 Promedio 28 29
6
1 32 36
91
2.0
6.4 2 33 35 3 29 30 Promedio 31 34
7
1 29 30
91
1.0
3.4 2 28 32 3 30 33 Promedio 29 32
8
1 31 33
94
1.1
3.6 2 31 33 3 29 31 Promedio 30 32
9
1 29 32
93
0.5
1.7 2 29 30 3 28 32 Promedio 29 31
10
1 29 30
93
1.1
3.7 2 27 33 3 29 30 Promedio 29 31 Tabla 25. Comparativo del porcentaje de recuperacin de Enterobacter aerogenes ATCC 13048 en la solucin de prueba y prueba estndar
59
FIGURA 17. Porcentaje de recuperacin de E. aerogenes ATCC 13048
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 2, para el ensayo de la solucin prueba mas Salmonella typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados de la prueba estndar (agua estril), tambin llamada control positivo.
60 Solucin de prueba: Agua potable + Salmonella typhimurium ATCC 14028 Analista 2: Marcela Carrillo Solucin de prueba Replica Solucin de prueba UFC/100ml Prueba estndar UFC/100ml Porcentaje de recuperacin (%) Desviacin estndar Coeficiente de variacin 1 1 35 31
91
4.3
14.3 2 28 33 3 27 34 Promedio 30 33
2 1 26 31
87
1.5
5.3 2 28 30 3 29 34 Promedio 28 32
3
1 27 30
93
0.5
1.7 2 28 31 3 28 29 Promedio 28 30
4 1 27 30
93
1.5
5.5 2 26 27 3 29 31 Promedio 27 29
5 1 29 29
96
2.0
7.1 2 26 28 3 30 30 Promedio
28 29
6
1 27 28
97
1.5
5.1 2 29 30 3 30 32 Promedio 29 30
7
1 28 32
85
1.0
3.4 2 29 35 3 30 34 Promedio 29 34
8
1 33 34
97
2.0
6.4 2 30 32 3 29 31 Promedio 31 32
9
1 30 30
93
1.1
3.7 2 30 33 3 28 29 Promedio 29 31
10
1 29 29
97
0.5
2.5 2 29 32 3 30 30 Promedio 29 30 Tabla 26. Comparativo del porcentaje de recuperacin de Salmonella typhimurium ATCC 1402852 en la solucin de prueba y prueba estndar
61 FIGURA 18. Porcentaje de recuperacin de S. typhimurium ATCC 14028
6.5. RECUENTO COMBINADO DE LOS MICROORGANISMOS EVALUADOS EN EL MEDIO.
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 1, para el ensayo de recuentos combinados, en donde se adicion al agua potable 0.5 ml de la dilucin 3x10 -8 (30 UFC/ml) de Escherichia coli ATCC 8739 y 0.5 ml de la dilucin 3x10 -8 de Salmonella typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados de la prueba estndar (agua estril), tambin llamada control positivo
62 Analista 1: Aura Lozano Solucin de prueba Replica Solucin de prueba E. coli UFC/100ml Prueba estndar UFC/100ml Recuento
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 1, para el ensayo de recuentos combinados, en donde se adicion al agua potable 0.5 ml de la dilucin 3x10 -8 (30 UFC/ml) de Enterobacter aerogenes ATCC 13048 y 0.5 ml de la dilucin 3x10 -8 de Salmonella typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados de la prueba estndar (agua estril), tambin llamada control positivo.
63
Analista 1: Aura Lozano Solucin de prueba Replica Solucin de prueba E. aerogenes UFC/100ml Prueba estndar UFC/100ml Recuento
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 1, para el ensayo de recuentos combinados, en donde se adicion al agua potable 0.5 ml de la dilucin 3x10 -8 (30 UFC/ml) de Enterobacter aerogenes ATCC 13048 y 0.5 ml de la dilucin 3x10 -8 de Escherichia coli ATCC 8739, comparados con los resultados de la prueba estndar (agua estril), tambin llamada control positivo.
64
Analista 1: Aura Lozano Solucin de prueba Replica Solucin de prueba E. aerogenes UFC/100ml Prueba estndar UFC/100ml Recuento
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 2, para el ensayo de recuentos combinados, en donde se adicion al agua potable 0.5 ml de la dilucin 3x10 -8 (30 UFC/ml) de Escherichia coli ATCC 8739 y 0.5 ml de la dilucin 3x10 -8 de Salmonella typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados de la prueba estndar (agua estril), tambin llamada control positivo.
65
Analista 2: Marcela carrillo Solucin de prueba Replica Solucin de prueba E. coli UFC/100ml Prueba estndar UFC/100ml Recuento
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 2, para el ensayo de recuentos combinados, en donde se adicion al agua potable 0.5 ml de la dilucin 3x10 -8 (30 UFC/ml) de Enterobacter aerogenes ATCC 13048 y 0.5 ml de la dilucin 3x10 -8 de Salmonella typhimurium ATCC 14028, comparados con los resultados de la prueba estndar (agua estril), tambin llamada control positivo.
66 Analista 2: Marcela carrillo Solucin de prueba Replica Solucin de prueba E. aerogenes UFC/100ml Prueba estndar UFC/100ml Recuento
La siguiente tabla indica los recuentos obtenidos por el analista 2, para el ensayo de recuentos combinados, en donde se adicion al agua potable 0.5 ml de la dilucin 3x10 -8 (30 UFC/ml) de Enterobacter aerogenes ATCC 13048 y 0.5 ml de la dilucin 3x10 -8 de Escherichia coli ATCC 8739, comparados con los resultados de la prueba estndar (agua estril), tambin llamada control positivo.
67 Analista 2: Marcela carrillo Solucin de prueba Replica Solucin de prueba E. aerogenes UFC/100ml Prueba estndar UFC/100ml Recuento
68 FIGURA 19. Prueba de promocin de crecimiento de E. coli en agar chromocult
Fuente: Autor
FIGURA 20. Prueba de promocin de crecimiento de E. aerogenes
Fuente: Autor
69 FIGURA 21. Prueba de promocin de crecimiento de S. typhimurium
Fuente: Autor FIGURA 22. Solucin de prueba: E. coli en agar chromocult
Fuente: Autor FIGURA 23. Solucin de prueba: S. typhimurium en agar chromocult
70
7. DISCUSIN DE RESULTADOS
Durante el procesamiento de las muestras, los resultados del control microbiolgico de ambientes, superficies y dotacin de los analistas, fueron confiables. En las tablas 17 y 18, se observa que los controles microbiolgicos de ambientes y superficies para la cabina de flujo laminar y el rea, cumplen con las especificaciones establecidas por INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda., lo que asegura que las condiciones de trabajo en las pruebas evaluadas, fueron ptimas. Al realizar las pruebas bajo condiciones ambientales controladas se reducen falsos positivos por contaminacin microbiana cruzada, esto se garantiza con el proceso de limpieza y desinfeccin para el rea de recuentos y el laboratorio, siendo primordial para obtener resultados confiables durante la validacin.
La calificacin y verificacin de equipos es de suma importancia dentro de la metodologa por lo cual se evidenci que los equipos utilizados en la validacin y etapa experimental con relacin a la fecha de calibracin, calificacin y verificacin, se encontraban vigentes; por consiguiente se puede asegurar que los equipos utilizados funcionan de acuerdo con sus especificaciones operacionales establecidas. (Tabla No.15).
Para evaluar la prueba de esterilidad en cada uno de los medios de cultivo preparados y utilizados, se escogi el 10% de los medios de cultivo preparados en cada prueba (USP, 31) y se llev a incubar a la temperatura y tiempo especficos (24 h a 30-35 o C) para cada uno de los medios, pasado el tiempo de incubacin no se observ ningn tipo de crecimiento microbiano, asegurando que los resultados obtenidos en la prueba de esterilidad de los medios es confiable dentro del proceso de validacin.
El control de calidad en la preparacin y evaluacin de los medios de cultivo es considerado como parte esencial y buena prctica de laboratorio, la cual es necesaria para mantener el nivel y la ejecucin de cualquier tcnica microbiolgica. Por est razn, se le confiere una gran importancia y est considerado como uno de los puntos crticos de control en el anlisis microbiolgico, del cual depende la seguridad de los resultados que emiten los laboratorios de ensayo. De esta manera un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios, adems de estar exento de todo microorganismo contaminante, ya que de la inocuidad y capacidad del medio de promover el crecimiento de los microorganismos depende un buen resultado en el anlisis microbiolgico. (Ligthfood, 2002). Es as, como la prueba de promocin de
71 crecimiento demostr que el medio de cultivo (agar chromocult) contiene los nutrientes necesarios para el desarrollo y crecimiento de coliformes totales y fecales debido a que se obtuvo una recuperacin mayor del 70% de los microorganismos que fueron inoculados; (tablas 21- 26) esto concuerda con lo establecido en la USP 31 (Seccin 1227 validacin de mtodos de neutralizacin comparaciones de recuperacin), en la que se detalla claramente que el numero de UFC recuperadas del producto (para nuestro caso muestras de agua) no debe ser menor del 70% del numero recuperado del control del inoculo (prueba estndar control positivo); por otro lado como se puede ver en cada una de las figuras los limites oscilan entre 50 y 200, debido a que segn la USP 31 en su capitulo 61 EXAMEN MICROBIOLOGICO DE PRODUCTOS NO ESTERILES: PRUEBAS DE RECUENTO MICROBIANO, especifica que para medios slidos, el crecimiento obtenido no debe diferir en un factor mayor de dos a partir del valor calculado para un inoculo estandarizado, lo cual concuerda con los resultados obtenidos debido a que ningn recuento obtenido se sale se los limites establecidos, de acuerdo con el limite de tendencia central obtenido gracias a los recuentos de nuestro control positivo (prueba estndar 100%), los cuales sirvieron como base para la comparacin con los recuentos obtenidos en la solucin de prueba, como se puede ver en cada una de las graficas, los porcentajes de recuperacin en cada una de las pruebas estn muy cercanos al valor central lo que nos indica que los resultados con muy coherentes con los obtenidos en la prueba estndar.
Igualmente, al inocular las cepas ATCC sobre el agar chromocult se obtuvieron las caractersticas macroscpicas tpicas de cada una (Ver tabla No 16) y tambin se realiz coloraciones de Gram a las colonias para evaluar las caractersticas microscpicas. Adems, el crecimiento de los microorganismos se obtuvo en un tiempo de 24 horas, de esta manera, se establece que los medios cromognicos poseen una ventaja sobre los medios tradicionales, debido a que la deteccin de coliformes totales y fecales se obtiene de una manera rpida (M.A YANEZ et al., 2005); esto gracias a que los sustratos que presenta el medio son los especficos para que las enzimas que presentan tanto E.coli como Enterobanter aerogenes, sean escindidos y de esta manera se puede, se produzca un reaccin rpida y sensible (Rompre,A et al., 2001).
En los ensayos estndar (control positivo) del mtodo de recuento para coliformes fecales, (Escherichia coli ATCC 8739), coliformes totales (Enterobacter aerogenes ATCC 13048) y Salmonella typhimurium ATCC 14028, la recuperacin de los microorganismos fue de 16-36 UFC/100ml, tal como se puede ver en las tablas 21 26, donde se compara la prueba estndar y la solucin de prueba. Cabe destacar que para la prueba estndar, el vehculo de transporte de los microorganismos evaluados fue agua estril
72 para inyeccin, debido a que es un agua en la que no se va a encontrar ninguna interferencia (como cloro u otros elementos) que impida el crecimiento, lo que nos llevara a reportar falsos positivos y para la solucin de prueba se utiliz agua potable.
Debido a que validar es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia documentada que un proceso especifico producir de forma consistente productos que reunirn las caractersticas de calidad predefinidas (CORTES, 2002; FDA, 1987) para tal fin, se identificaron los factores que influyen en la validez de la prueba y los pasos a seguir para el desarrollo de la validacin del mtodo de filtracin por membrana empleado para la deteccin de coliformes totales y fecales en agar chromocult para agua potable, en donde se emple una serie de datos para determinar que realmente es eficaz y se obtienen resultados confiables; para esto se evaluaron parmetros cuantitativos de validacin como: especificidad, precisin (repetitividad y reproducibilidad), y exactitud.
La especificidad se obtuvo al comparar las medias y los datos del porcentaje de recuperacin entre la prueba estndar y la solucin de prueba, para el recuento de coliformes fecales (Escherichia coli ATCC 8739 ), el porcentaje de recuperacin es de 96.4%; para el recuento de coliformes totales (Enterobacter aerogenes ATCC 13048) es del 92.5% y para Salmonella typhimurium ATCC 14028 el porcentaje de recuperacin es de 93.7%; los resultados anteriormente obtenidos concuerdan con los obtenidos en el estudio de MAHEUX. A. et al. (2008), en el cual se obtuvieron porcentajes de recuperacin para E .coli semejantes, por tanto se puede concluir que la recuperacin de los coliformes fecales fue mayor que la de los otros dos microorganismos, lo anterior se debe a que Escherichia coli es la nica especie dentro de las enterobacterias que presenta la enzima B-D- Glucoronidasa, que degrada el sustrato 4-metilumberiferil--D- glucornico (MUG) y el contenido de triptfano revela la reaccin de indl y aumenta con ello la identificacin, en combinacin con la reaccin X-GAL y la reaccin MUG, siendo esta una ventaja para el crecimiento de este microorganismo.
Los porcentajes de recuperacin anteriormente citados son reportados gracias a los recuentos de colonias obtenidos por el conteo de colonias caractersticas para cada especie gracias al color que tomaron las colinas, para este estudio la cepa de Enterobacter aerogenes que fue el coliforme total seleccionado, tomo una coloracin rosada roja; la colonia de E. coli tomo una coloracin azul-violeta y la colonia de Salmonella typhimurium tomo una coloracin blanca, esto concuerda con los resultados encontrados en el estudio realizado por M.A YANEZ et al. (2005), en el cual se escogieron los mismos microorganismos y se presentaron las mismas coloraciones en las colonias; las coloraciones caractersticas se deben principalmente a que los
73 coliformes totales solo pueden escindir uno de los sustratos, mientras que E. coli puede escindir los dos sustratos.
Segn la USP 31, 2008 la repetibilidad es la medida de la precisin del mtodo cuando ste se realiza por el mismo analista, el mismo da, mismos reactivos y mismo instrumento, y la reproducibilidad se mide cuando el ensayo se realiza por diferentes analistas, diferentes das y diferentes instrumentos, por lo tanto estos parmetros nos indican la precisin del mtodo de recuento, la cual se mide con la dispersin de la medida alrededor de un valor medio o central y mide la concordancia entre ensayos individuales cuando el mtodo se aplica repetidas veces a muestras separadas e idnticas, obtenidas del mismo lote de material homogneo ( en este caso muestras de agua potable obtenidas de la misma fuente, la llave del rea de lavado del laboratorio). De esta manera y de acuerdo a los resultados se determinaron los valores de las medias, las desviaciones estndar y los coeficientes de variacin obtenidos en cada una de los ensayos y con cada uno de los analistas.
Al establecer la reproducibilidad y la repetibilidad del mtodo, se demuestra que no hay diferencia significativa entre los valores de las medias obtenidas por cada analista y microorganismos evaluados, ni tampoco hay diferencia entre los valores de las medias de cada analista, lo que muestra que el mtodo evaluado es reproducible y repetible, y que los resultados no van a diferir si los mtodos son realizados por el mismo analista el mismo da o por analistas diferentes en das diferentes.
De igual manera segn los resultados obtenidos de las medias determinadas por cada muestra de agua y microorganismo, se establece que el mtodo es preciso (Tablas 21 - 26).
La exactitud de un mtodo analtico es la proximidad entre los resultados de la prueba obtenidos mediante el mtodo y el valor verdadero (USP 31, 2008), este parmetro se determin comparando el porcentaje de recuperacin de la solucin de prueba con los porcentajes de recuperacin del ensayo estndar, determinando que en el mtodo de filtracin por membrana para coliformes fecales el porcentaje de recuperacin de los microorganismos inoculados para el agua potable fue mayor al 96% (figura 13), mientras que para los coliformes totales fue menor (90%) (Figura 14). Adems se observ que las desviaciones estndar y los coeficientes de variacin no son muy variables en la solucin de prueba, y aunque existe un solo dato que sale del rango en cada una de las tablas en los que se pueden encontrar los resultados obtenidos, este no tiene mucha relevancia sobre los dems datos, debido a que no hay una dispersin notable; por otro
74 lado el coeficiente de variacin nunca supera un valor de 10, lo cual es un valor aceptado y utilizado en la industria farmacutica (Tablas 21 - 26).
En la solucin de prueba la recuperacin de los microorganismos inoculados se determin por la presencia de caractersticas macroscpicas en agar chromocult, esta recuperacin fue del 96%, lo que indica que la adicin de tiosulfato de sodio al 1% logra inactivar el cloro presente en el agua potable, logrando as, recuperar casi la totalidad de los microorganismos presentes en la muestra de agua (Figuras 22 - 23).
75 8. CONCLUSIONES
Se realiz la validacin del mtodo de filtracin por membrana para la deteccin de coliformes totales y fecales para agua potable, utilizando agar chromocult en el laboratorio INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda. Esta validacin cumple con los parmetros establecidos.
Se demostr que el mtodo de filtracin por membrana para coliformes totales y fecales para agua potable, en el LABORATORIO INTERPHARM DE COLOMBIA Ltda. es repetible, reproducible, exacto y especfico, segn el POE DCM 046 DETECCIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN AGAR CHROMOCULT.
Se comprob la efectividad del agar chromocult como un mtodo alternativo de rpida recuperacin para reducir costos y desarrollar tcnicas con mayor eficacia y seguridad en el laboratorio INTHERPHARM DE COLOMBIA Ltda.
Se demostr que el medio cromognico utilizado en el mtodo validado, contiene los nutrientes necesarios para el desarrollo de los microorganismos evaluados gracias a la ptima recuperacin obtenida en la prueba de promocin de crecimiento.
Se logro evidenciar mediante la realizacin de un pool de microorganismos que el medio presenta los sustratos adecuados para diferenciar el crecimiento de diversos microorganismos mediante la coloracin de las colonias.
76 9. RECOMENDACIONES
Aunque los resultados obtenidos en este trabajo de grado, estaban dentro de los parmetros esperados; se recomienda utilizar inculos con un nmero mayor de UFC/ml con el fin de evitar variaciones muy grandes en los recuentos y por ende en los porcentajes de recuperacin.
Para prximos estudios de validacin del mtodo de deteccin de coliformes totales y fecales, se debe tener en cuenta las pruebas preliminares de promocin de crecimiento y esterilidad, las cuales se le deben realizar tanto al medio que se esta evaluando (para este caso el agar chromocult), como a los que se utilizan para la estandarizacin de los inculos de trabajo y los utilizados en las pruebas de controles positivos.
Es aconsejable realizar una comparacin entre el mtodo a validar y el mtodo oficial, para de esta manera poder comparar los resultados obtenidos entre cada uno de ellos y as establecer las ventajas del nuevo mtodo con respecto al tradicional
Para prximas validaciones seria importante utilizando adems de agar chromocult, un medio de cultivo alterno, para tener una alternativa en caso de que el laboratorio no cuente en un momento dado, con el medio que fue validado el mtodo.
Es importante que para prximos estudios de validacin de este mtodo, se realice adicionalmente pruebas bioqumicas para la identificacin de cada uno de los microorganismos utilizados en los ensayos de validacin
Se aconseja, tener en cuenta algn cambio de los equipos a lo largo de la validacin, ya que seria conveniente realizar una revalidacin, utilizando los equipos cambiados.
77
10. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
ALEEN, H. ZHAO, Y. LORD, S. McCHARTY, T. SHARRATT, P. 2003. Pharmaceutical process validation: an overview. Journal Process Mechanical Engineering. 213: 141-151
AGALLOCO, J.P.; CARLENTON, F. J. 1993. Validacin of Pharmaceutical Processes. Sterile Products. Segunda Edicin. MARCEL DEKKER. New York.
APHA AWWA - WPCF, 2000. Mtodos normalizados para el anlisis de Agua Potable y Residual. 17 Edicin. Editorial Daz de Santos. Madrid, Espaa. 1147 Pgs.
BOEH, R.; ROGANTI, F. 2004. Desing of an Aseptic Process Simulation. Pharmaceutical Technology. United States.
CASANOVA, O.; CIGANDA, V.; PERDOMO, C. 2001. Contaminacin de aguas subterrneas con nitritos y Coliformes en el litoral sudoeste de Uruguay. Vol. V. No 1. AGROCIENCIA. 22 Pgs.
CENICUA. 2005. Seminario Internacional, el agua y los riesgos microbiolgicos para la salud. Bogot D.C Agosto 30 y 31.
CORTS, A.; JANETH, A.; SANDINO, C. 2002. Validacin de la prueba de Esterilidad para vacunas virales preparadas en vehiculo oleoso y acuoso. Microbiologa Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias. Bogota, Colombia. 93 Pgs.
ENAC, 2002. Gua para la acreditacin de laboratorios que realizan Anlisis Microbiolgicos. G-ENAC-04 Rev. 3. Noviembre 2002. 17 Pgs.
ESCOBAR, M. 2002. Fundamentos de Microbiologa. Tercera Edicin. CEJA. Bogot. Colombia. Pgs. 202-204
Estrada Carlos. Los procesos de validacin como herramienta para el control de los riesgos laborales. 1999. [En lnea] http://www.ibermutuamur.es/El- proceso-de-validacion-como.html. [Consulta: 13 de diciembre del 2007].
78
FISHER, R. 1970. Anlisis qumico cuantitativo. Tercera Edicin. Editorial Interamericana. Mxico. Pgs. 478-489. G-ENAC-04 REV. 2 de marzo de 1997. Gua para la acreditacin de laboratorios que realizan anlisis microbiolgicos GAMAZO .C, LPEZ-G.I, DAZ. R. 2005. MANUAL PRACTICO DE MICROBIOLOGIA. Editorial Elsevier. Espaa. GMEZ, M.; PEA, P.; VSQUEZ, M. 1999. Determinacin y diferenciacin Escherichia coli y Coliformes Totales usando un sustrato cromgeno. Laboratorio Central. Aquagest .Galicia, Espaa.
GUARNIZO, Juliana. 2005. Elaboracin y documentacin del programa de gestin documental en los laboratorios del departamento de microbiologa que prestan servicios de la facultad de ciencias en la pontificia Universidad Javeriana, de acuerdo con los requisitos de la norma NTC ISO IEC 17025: 1999. Facultad de Ciencias. Microbiologa Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Bogot.
GUA TCNICA COLOMBIANA 84. 2003. Calidad del Agua. Gua para la orientacin acerca de la validacin de los Mtodos de Anlisis Microbiolgicos. ICONTEC. Instituto colombiano de normas Tcnicas y Cientficas.
HACH, 2000. Manual de Anlisis de Agua. Segunda Edicin. HACH COMPANY. Loveland, Colorado; EE.UU. 217 Pgs.
HAYES, 1993. Microbiologa e Higiene de los Alimentos. ACRIBIA. Zaragoza Espaa.
HOPKINS K.L AND HILTON A.C. 2000. Methods available for the sub-typing of Escherichia coli 0157. Word J. Microbiol. Biotechol, 16.741-748
ICONTEC. NTC 4543. Esterilizacin de productos para el cuidado de la salud, requisitos para validacin y rutina de control, Esterilizacin por calor hmedo industrial, Documento de referencia internacional: ISO 11134:94, Bogota, Noviembre 1998.
79
ISO/ TR 13843: 2000. Calidad del agua Guia para la validacin de mtodos microbiolgicos.
ISO\TS 11133-2:2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Guidelines on preparation and production of culture media -- Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media
JAY, 1997. Microbiologa Moderna de los Alimentos. ACRIBIA. Zaragoza Espaa.
KWANG-PYO KIM, JOCHEN KLUMPP AND MARTIN J. LOESSNER. 2006. Enterobacter sakazakii bacteriophages can prevent bacterial growth in reconstituted infant formula. International journal of food microbiology, 115. 195- 203.
M.A. YANEZ, C. VALOR, V. CATALAN. 2005. A simple and cost-effective method for the quantification of total coliforms and Escherichia coli in potable water. Journal of Microbiological Methods 65. 608611.
MAHEUX. A.; HUPP. V.; BOISSINOT. M.; PICARD. F.; BISSONNETTE. L.; BERNIER. J. and Bergeron. M. 2008. Analytical limits of four -glucuronidase and -galactosidase-based commercial culture methods used to detect Escherichia coli and total coliforms. Journal of Microbiological Methods 75. 506 514
MANAFI, M. 1998. New approaches for the fast detection of indicators, in particular enzyme detection methods (EDM).
Ministerio de la Proteccin Social. 2007 Decreto 1575. Por medio del cual se establece el sistema de la proteccin y control de la calidad del agua para consumo humano.
80 Ministerio de la Proteccin Social. 2007. Resolucion 2115. Por medio de la cual se sealan caractersticas, instrumentos bsicos y frecuencias del sistema de control y vigilancia para la calidad del agua para consumo humano
MONTGOMERY, D. 1991. Introduccin al Control Estadstico de la calidad. Grupo editorial IBEROAMERICANA. Mxico DF, 112 Pgs.
Moreno, C. 2004. http://www.britanialab.com/esp/productos/b04/chromobit.htm [Consulta: 21 abril. 2008].
OCASIO, N Y LPEZ, M. 2004. El uso del Cloro en la Desinfeccin del Agua. http://www.edustatipr.com/proyectos/inv97-98-11-3.pdf [Consulta: 18 octubre. 2008].
ORDEZ, J. 2000. Microorganismos de los alimentos. Vol 1. Segunda Edicin. ACRIBIA. Zaragoza Espaa.
ORGANIZACIN PANAMERICANA DE LA SALUD. 1987. Guas para la calidad del agua Potable. Volumen 2, criterios relativos a la salud y otra informacin base. Organizacin Mundial de la Salud, Publicacin Cientfica N 506 Washington D.C
ORGANIZACIN MNDIAL DE LA SALUD. 1998. Gua sobre los requisitos de las practicas adecuadas de fabricacin. Segunda parte validacin. Ginebra.
PEARCE. 2007. Introduction to membranes: Filtration for water and wastewater treatment. Filtration & Separation. 44(2): 24-27
RODRGUEZ, R. 2004. Validacin de procesos, Taller de validacin OMS, Experta Nacional de Medicamentos FDA, Guatemala. <http://www.paho.org/Spanish/AD/THS/EV/bpm-validacion- procesos-fda.ppt> [Consulta: 21abri. 2008].
ROMPRE. A.; SERVAIS. P.; BAUDART.J.; ROUBIN. M.; AND LAURENT. P. 2001. Detection and enumeration of coliforms in drinking water: current methods and emerging approaches. Journal of Microbiological Methods 49. 3154
81 ST: Standard Methods for examination of water and Wastewater. American Public health Association. 20 th ed. Washington D.C. 2000. EUA. SHEKHAR N.C ; SINGH C.P AND Y LAXMAN N.Y. 2007. Medicinal smoke reduces airborne bacteria. Journal of Ethnopharmacology, 3, 446-451. SENA, 2006. Gestin de la Calidad y normas ISO 9000. Modulo 1, fundamentacin de un sistema de gestin de la calidad. Bogot Colombia. Pg. 1 -11
TORTORA, G. 1993. Introduccin a la microbiologa. Editorial Acribia. Zaragoza. Espaa.
VILLOCH C.A. 2002. Acercamiento a la Acreditacin y a las Buenas Practicas de Laboratorio (BPL) dirigidos a los laboratorios de ensayos de microbiologa y biotecnologa. Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria. La Habana (cuba)
WALTER J. WEBER, JR, W. J. WEBER, JACK A. 2003.Control de la calidad del Agua/ Water Quality control: Procesos fisicoqumicos. Editorial Revert. 684 pginas.
WHO, 1999. Quality assurance of pharmaceuticals. Volumen 2. Good manufacturing practices and inspection. Ginebra, Suiza P: 27- 39
WHO Expert Committe on Specifications for Pharmaceutical Preparations. Reporte 32. genova, world health Organization, 1992 ( WHO Technical Report Series, No 823)
USP. United Status Phamacopeia 31, 2008.
ZIMBRO, M. POWER, D. 2003. Manual of mycrobiological cultura media. Difco y BBL Manual Estados Unidos. Pgs. 590.
82
11. ANEXOS
ANEXO 1. Composicin de los medios de cultivo (g/litro)
Agar Casoy: peptona de casena 15g, peptona de harina de soya 5g, cloruro sdico 5g, agar-agar 15g.
Agar Chromocult: peptona 3.0g, cloruro sdico 5.0g, dihidrogenofosfatopotasico 1.7g, hidrogenofosfato di potsico 3.0g, piruvato sdico 1.0g, triptfano 1.0g, agar-agar 12.0g, laurilsultafo sdico 0.1g, mezcla de cromgenos 0.2g.
Agar Plate Count: peptona de casena 5.0g, extracto de levadura 2.5g, D(+)- glucosa 1.0g, agar-agar 14.0g
VALIDACIÓN DE LA TÉCNICA DE RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y E. Coli POR EL MÉTODO FILTRACIÓN DE MEMBRANA EN EL LABORATORIO DE CONTROL DE CALIDAD DE AGUAS DE CARTAGENA S.A E.S.P.
RobayoChaparroDianaCarolina.2020.Apoyo en el análisis del recurso hídrico de la jurisdicción de la CAR, en la determinación de coliformes totales y escherichia coli mediante la técnica de sustrato definido Coliler.pdf