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Practica # 9 aglutinacion en sangre

INTROCUCCION
EN ESTA PRACTICA APRENDEREMOS A REALIZAR UNA VENOPUNCION, Y A
IDENTIFICAR EL TIPO SANGINEO DEL INDIVIDUO AL QUE LE REALIZAREMOS LA
VENOPUNCION YA MENCIONADA.

OBJETIVO
ESTA PRACTICA TIENE COMO OBJETIVO QUE NOSOTROS LOS ALUMNOS
APRENDAMOS A COMO REALIZAR UNA VENOPUNCION Y A REALIZAR UNA PRUBA DE
TEJIDO SANGINEO (HB) PARA PODER CONOCER, OBSERVAR, IDENTIFICAR Y
FINALMENTE APLICAR LA PRIBA DE AGLUTINACION EN SANGRE QUE DA COMO
RESULTADO EL TIPO SANGINEO DEL INDIVIDUO.

DESARROLLO
MATERIALES:
SANGRE FRESCA 5 ML
TUBO DE TAPON MORADO CON ANTICOAGULANTE
PALILLOS DE MADERA
PLACA DE PORCELANA ESCABADA PARA TIPO SANGINEO
ALGODN CON ALCOHOL
TORUNDAS DE ALGODN SECAS
MASQUEN TAPE
TIPYFICADORES PARA TIPO SANGINEO (REACTIVO) ANTIA,ANTIB Y ANTID
PAPEL SECANTE
PAPEL PARA CUBRIR MESA
MESA LABORATORIO
PIPETA PASTEUR Y BULBO
MICROSCOPIO
GRADILLA

PROCEDIMIENTO

UN INTEGRANTE DEL EQUIPO LE SACO LOS 5 MIL DE SANGRE A OTRO INTEGRANTE
DEL EQUIPO, YA OBTENIDA LA SANGRE DEPOSITAMOS 3ML DE SANGRE EN EL TUBO
DE TAPON ROJO Y EL RESTO DE LA SANGRE (2ML) EN EL TUBO DE TAPON MORADO.


DESPUES DEPOSITAMOS EL TUBO DE TAPON ROJO EN LA CENTRIFUGA A 1500
REVOLUCIONES DURANTE 5 MIN.




PUNTEAMOS CON LA PIPETA PASTEUR 3 GOTAS DE SANGRE EN LA PLACA EXCABADA
Y LES PUSIMOS REACTIVOS A LAS GOTOAS Y LAS MOVIMOS DE IZQUIERDA A
DERECHA Y DE ARRIBA HACIA ABAJO CON LOS PALILLOS DE MADERA.

DESPUES YA OBTENIDA EL PLASMA DE LA SANGRE PIPETEAMOS 6 GOTAS DE PLASMA
EN LA PLACA DE CRISTAL PARA PRUBAS SEROLOGICAS Y LES PUSIMOS REACTIVOS
H, O, A, B, BRUCELLA A., PROTEUS Y DESPUES PASAMOS A OBSERVARLO EN EL
MICROSCOPIO Y SE VIERON VARIOS PUNTITOS.
CONCLUCION
TENEMOS QUE PRACTICAR MAS LA VENOPUNCION YA QUE COMO FUE LA PRIMERA
VEZ EL INTEGRANTE DEL EQUIPO ENCARGADO DE SACAR LA SANGRE ESTABA MUY
NERVIO. TAMBIEN DEBEMOS DE APRENDER A PASAR BIEN EL PLASMA A OTRO TUBO
DE ENSAYE, YA QUE TUVIMOS PROBLEMAS CON ESE PASO.
PRCTICA 1.
AGLUTINACIN EN PORTA (GRUPOS SANGUNEOS) Sistema ABO y anti-D (Anti-Rho)
FUNDAMENTO
La determinacin de grupos sanguneos del sistema ABO se efecta enfrentando los hemates
problema con antisueros de especificidad conocida: anti-A, anti-B y anti-A,B (grupo 0).
La presencia del antgeno D (Rho) se determina enfrentando los hemates problema, en un medio
proteico alto, con suero anti-D (Rho). La aglutinacin o no-aglutinacin de los hemates ensayados,
son indicativos de la presencia o ausencia del correspondiente antgeno en los mismos.
La variante Du , forma dbil del antgeno D (Rho), puede detectarse mejor incubando la
suspensin de hemates con suero anti-D (Rho), efectuando a continuacin la prueba de la
antiglobulina.
MATERIALES
Azulejos limpios
Lancetas
Palillos
Sangre capilar
PROCESO
Tras dividir un azulejo en cuatro partes y haberlos denominado segn el antisuero que acoger
cada uno, se aaden dichos antisueros anti-A, anti-B, anti-A,B y anti-D. Despus se aadirn unas
gotas de sangre en cada recuadro (la obtencin de la sangre se hace por un mtodo higinico y
rpido, Glucolet 2). Mezclar bien la sangre con el reactivo empleando palillos distintos para cada
ensayo. Observaremos macroscpicamente si hay alguna aglutinacin tras hacer reaccionar la
sangre con los antisueros.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Si al trmino del periodo de reaccin ( 2 minutos aproximadamente) no existiese ningn signo
visible de aglutinacin, se interpretara como una reaccin negativa a ese antisuero.
En cambio, si la reaccin es positiva se observa que los hemates aglutinan en segundos. Sin
embargo para detectar los subgrupos ms dbiles de A debe agotarse el trmino de los 2 minutos,
puesto que el suero anti-A puede aglutinar con cierta demora. El empleo rutinario del suero anti-
A,B confirmar las sangres del grupo O.
RESULTADOS
En mi caso, se dio una aglutinacin en la sangre mezclada con suero anti-A y anti-D. Tambin se
observ una leve aglutinacin en el suero anti-A,B.
En conclusin, se deduce que mi grupo sanguneo es A con Rh POSITIVO.
PRACTICA 2.
SISTEMA DE DETECCIN DE AGLUTININAS SRICAS
FUNDAMENTO
En esta prctica trataremos de detectar aglutininas sricas surgidas a partir de algunos procesos
infecciosos. En este caso, se utilizar una bacteria que suele afectar en el organismo de los
bovinos (Brucella color). La determinacin se efecta ensayando diluciones dobles del suero
problema en solucin salina con volmenes iguales de suspensin antignica estandarizada. Tras
su incubacin se determina el ttulo de aglutinacin del suero en presencia del antgeno especfico
correspondiente. Se denomina ttulo de anticuerpos a la ltima dilucin donde la reaccin es
positiva.
MATERIAL
Tubos de ensayo (8)
Pipetas
Solucin salina
Suero
Suspensin bacteriana
PROCESO
stas son las disoluciones a preparar:





:
N tubo 1 2 3 4 5 6 7 8
S.salina 0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Suero 0.1 * * * * * * 0
Ag
Susp.bacteriana
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Dilucin final 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128
CONTROL
NEGATIVO
*Se harn diluciones de la disolucin anterior al 50%
Una vez hechas las disoluciones, se metern en una estufa y se tendrn all a una temperatura de
35C aproximadamente, durante 48 horas.
RESULTADOS
dILUCIN 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256
RESULTADO + + + + + - - -
Titulacin: 1/32
INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Para interpretar los resultados segn los tubos:
Si la reaccin es negativa, el tubo permanece azul (el antgeno utilizado era azul) con un botoncito
de aglutinacin en el fondo, que indica que hay exceso de antgeno.
Si la reaccin es positiva, se produce un aclaracin del medio, que ya no es azul porque el
antgeno est siendo capturado. El tubo ahora contiene una disolucin incolora con un botoncito
azul en el fondo. Este botn azul es una aglutinacin, unos grumos de grandes redes antgeno-
anticuerpo (porque todo el antgeno ha sido capturado por el anticuerpo).
PRCTICA 3.
INMUNODIFUSIN
FUNDAMENTO
Es uno de los mtodos para detectar la unin entre el antgeno y el anticuerpo. Es un mtodo de
precipitacin en el cual encontrndose antgeno y anticuerpo a concentraciones equivalentes
formarn un precipitado, visible macroscpicamente.
En este caso, tenemos un antgeno soluble en un medio medioslido, la agarosa, por lo tanto los
antgenos se difundirn por el medio antes de precipitar. Si las bandas resultantes de estas
precipitaciones estn unidas ser el mismo determinante antignico el reconocido y si se cruzan
sern diferentes, aunque se pueden dar los dos casos.
Hay mtodos para mejorar los resultados como la aplicacin de cargas elctricas
(inmunoelectroforesis), ya que se separan mejor las molculas del antgeno.
Para visualizar mejor los resultados tambin podemos utilizar mtodos de tincin con lo que se
lograr diferenciar las bandas de mejor manera.
MATERIAL
Placa de Petri
Cinta aislante o celo
Pipeta Pasteur de cristal
5 tubos eppendorf
Micropipetas de 50 y 100 l
15 ml de PBS (Tampn Fosfato Salino) + 2%PEG (polietilenglicol) 6000 + 0.05% NaN2
Agarosa
50 l de antisuero anti-BSA diluido 1:1 en PBS + 0.05% NaN2
200 l de PBS + 0.05% NaN2 + 10% BSA (albmina srica bovina)
PROCESO
Se preparan 250 ml (para 15 grupos) de PBS + 2% PEG 6000 + 0.05% NaN2 + 1% Agarosa
Calentar la preparacin en un microondas hasta que la agarosa est completamente disuelta.
Esto suele producirse cuando la solucin alcanza 100C.
Colocar 15 ml (aproximadamente) de esta solucin caliente en las placas de Petri.
Dejar que solidifique la agarosa. Esto requiere al menos 30 minutos.
Colocar la placa sobre la figura dada y realizar agujeros en la agarosa siguiendo dicho modelo.
Para ello se utiliza el extremo ms ancho de una pipeta Pasteur.
Marcar cada pocillo por debajo de la placa siguiendo el modelo de la figura.
Realizar dobles diluciones de la preparacin antignica de BSA. Para ello seguir el siguiente
esquema:
Colocar 50 l de cada reactivo en sus respectivos pocillos. Cubrir
la placa y una vez que se hayan absorbido los reactivos en el gel, sellar la placa de Petri con cinta
aislante o celo.
Dejar la placa incubando a temperatura ambiente durante 24-48 horas.
Examinar las lneas de precipitacin.
RESULTADO
Esto fue lo que se pudo observar tras casi 48 horas de incubacin:
INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Se observa que a medida que la disolucin del antgeno es ms diluida, su banda de precipitacin
se va haciendo ms fina y al observar que dichas bandas no se cruzan, se puede reafirmar que
estamos trabajando con el mismo antgeno.
PRCTICA 4.
RGANOS DEL SISTEMA INMUNE DEL RATN
FUNDAMENTO
En esta prctica se diseccionar a un ratn con el objetivo de observar y diseccionar su timo
(rgano linfoide primario situado encima del corazn) y su bazo (rgano linfoide secundario situado
a mano derecha y detrs del estmago).
MATERIALES
Ratn
Algodn y alcohol
Material de diseccin (tijeras y pinzas)
Plancha de diseccin
Placa de Petri
Buffer (PBS SS)
PROCESO
Eutanizar al ratn por dislocacin cervical
Fijar el ratn a la plancha de diseccin
Aplicar alcohol en el ratn
Retirar el pelo del abdomen con un corte longitudinal
Cortar la piel y los msculos abdominales para exponer los rganos internos
Localizar el bazo y algunos ndulos linfticos
Aislar el bazo y colocarlo en una placa Petri con 10 ml de Buffer.
PRCTICA 5.
AISLAMIENTO DE CLULAS MONONUCLEARES DEL RATN
FUNDAMENTO
En esta prctica intentaremos obtener clulas mononucleares libres de eritrocitos y granulocitos.
MATERIALES
Bazo de ratn
Tubos de centrfuga
PBS
3 ml de Ficoll-Hypaque
Pipeta Pasteur
Pipetas de 10 ml
Centrfuga
PROCESO
Tamizar el bazo disgregndolo sobre un colador.
Recoger la suspensin celular con pipeta y pasarla a un tubo de centrfuga de fondo cnico.
Esperar 2 minutos la sedimentacin del debris.
Recoger el sobrenadante.
Dispensar aproximadamente 9 ml de suspensin celular sobre la columna con 3 ml de Ficoll
dejando resbalar suavemente por las paredes.
Centrifugar 20 minutos a 1750 r.p.m. y temperatura ambiente.
Recoger la interfase de separacin con pipeta Pasteur en la cual se observan tres fases en el
fondo: una zona roja con eritrocitos, otra zona con Ficoll y por ltimo, un anillo denso donde estn
las clulas deseadas.
Disponer las clulas mononucleares en un tubo de centrifugar, suspender en PBS y realizar un
lavado de 10 minutos a 1750 r.p.m.
Resuspender la pastilla en 1 ml de PBS.
PRCTICA 6.
RECUENTO CELULAR Y TINCIN VITAL
FUNDAMENTO
Recontar la poblacin de clulas viables en la suspensin celular obtenida en la prctica anterior.
MATERIALES
Clulas mononucleares de bazo de ratn
Colorante azul de trypan al 0.5%
Hemocitmetro (Neubauer mejorado)
Uso del hemocitmetro o cmara de recuento celular Neubeauer improved
La cmara del hemocitmetro est dividida en 9 cuadros. Las 4 esquinas del cuadrado estn
divididas en 16 cuadrados, y el cuadrado central est dividido en 25 cuadrados, los cuales a su vez
estn divididos en 16 cuadrados pequeos. Los cuadrados grandes, cada uno tiene un rea de 1
mm2. Cuando se pone la muestra entre el cubreobjetos, la profundidad de la cmara es de 0.1
mm. El volumen total en cada cuadrado grande es el siguiente:
1 x 0.1 = 0.1 mm3 = 0.0001 cm3 = 10-4 ml
PROCESO
Tomar 100 l de suspensin celular.
Incorporar igual volumen de colorante vital.
Agitar y poner 10 l de la suspensin en la cmara de recinto
celular. Contar las clulas transparentes y las azules.
Calcular el porcentaje de viabilidad.
RESULTADOS
% viabilidad Nclulas vivas/cuadro nclulas/ml
99% 99 5 x 107
Obtenemos esta cantidad de clulas por mililitro de disolucin, teniendo en cuenta que el producto
se debe multplicar por 2, porque estamos trabajando con una dilucin 1:2 (porque hemos utilizado
colorante al 0.5%).
PRCTICA 7.
TINCIN DE CLULAS SANGUNEAS
FUNDAMENTO
Se utilizar el mtodo de tincin Diff-Quick para hacer un frotis sanguneo.
MATERIAL
2 portaonejtos/persona
Sistema Diff-Quick de coloracin
Microscopio ptico
PROCESO
Se realiza en el porta una extensin de una gota de sangre. Para ello se utilizar otro porta
colocndolo sobre el primero con una inclinacin de unos 45.
Se deja secar la extensin a temperatura ambiente.
Se realizan:
o 5 inmersiones de un segundo cada una en el contenedor con fijador (Fast Green + metanol)
o 5 inmersiones de un segundo en el contenedor con el colorante I (Eosina G)
o 4 inmersiones de un segundo en el contenedor con el colorante II (Tiazina)
o 2 lavados con agua destilada
Se deja secar la preparacin y se observa en el microscopio ptico.
RESULTADOS
Teniendo en cuenta que normalmente se observa un nmero de trescientas clulas para hacer un
frotis de sangre y en nuestro caso se han observado solamente cien clulas, no resultara raro que
algn porcentaje sea ms alto o ms bajo de lo esperado:
clulas porcentaje
Neutrfilos 31%
Linfocitos 52%
Monocitos 17%
Eosinfilos 0%
Basfilos 0%
INTERPRETACIN DE RESULTADOS
En este caso, hemos obtenido un porcentaje anormalmente superior de linfocitos y de neutrfilos,
debido a que el frotis de sangre observado pertenece a un individuo que est sufriendo una
infeccin viral provocada por Herpes Foxter.
Debido a esta infeccin viral, el nmero de linfocitos en sangre aumenta considerablemente, y con
ello, los linfocitos T colaboradores inducen el aumento del nmero de monocitos en sangre.
INDICE
PRCTICA 1.
AGLUTINACIN EN PORTA (GRUPOS SANGUNEOS) Sistema ABO y anti-D (Anti-Rho)
PRACTICA 2.
SISTEMA DE DETECCIN DE AGLUTININAS SRICAS
PRCTICA 3.
INMUNODIFUSIN
PRCTICA 4.
RGANOS DEL SISTEMA INMUNE DEL RATN
PRCTICA 5.
AISLAMIENTO DE CLULAS MONONUCLEARES DEL RATN
PRCTICA 6.
RECUENTO CELULAR Y TINCIN VITAL
PRCTICA 7.
TINCIN DE CLULAS SANGUNEAS


OBJETIVO
: Observar la reaccin antgeno-anticuerpo en la determinacin de gruposanguneos (ABO Y Rh)
INTRODUCCIN
: Es la interaccin entre un anticuerpo y una partcula antignica que sevisualiza porla formacin de
agregados o grumos macroscpicos. En este proceso, elanticuerpo esconocido como aglutinina y el antgeno
como el aglutingeno. Las reaccionesde aglutinacin utilizan el mismo principio de las reacciones
deprecipitacin. Cuando elanticuerpo est en exceso inhibe la reaccin de precipitacin, lomismo ocurre en
lasreacciones de aglutinacin. Esta inhibicin es llamada el efectoprozona. Esta tcnica esampliamente usada para la
identificacin rpida de bacterias, hongos, grupos sanguneosy otros antgenos; tambin es utilizada para la
deteccin deanticuerpos que pueden serindicativos de un estado de enfermedad. La temperatura, el pH, la
concentracin deelectrolitos, son importantes para larealizacin de la prueba. La reaccin final se
evidenciapor la formacin de malla o grumosvisibles macroscpicamente. La unin antgeno-anticuerpo (Ag-
Ac) es una interaccin reversible en la que estninvolucrados enlaces no-covalentes. En la interaccin in Vitro
de un Ag con sucorrespondiente Ac se distinguen 2etapas: la interaccin primaria no visualizable y
lainteraccin secundaria, que sigue a laanterior y se caracteriza por la aparicin de unfenmeno visible como
la aglutinacin o laprecipitacin. Por otro lado, no siempre que seproduce la interaccin primaria Ag-Ac,
seproduce la interaccin secundaria, ya que, paraconseguir fenmenos visibles, sonindispensables
determinadas concentraciones ycaractersticas de los Ags y Acs.
Hemaglutinacin
Las reacciones de aglutinacin son realizadas para la tipificacin de clulassanguneas. Enla tipificacin de
los antgenos del sistema ABO, las clulassanguneas son mezcladas enuna placa con un antisuero especifico
para losantgenos A y B del grupo sanguneo.Si el antgeno est presente en las clulas, stas se aglutinaran,
formando agregadosVisibles en la placa.La determinacin de los antgenos que estn presentes en las clulas
sanguneas deun donador es bsico para clasificar el tipo de sangre para las transfusiones



MA
TERI
AL APA
R
A
TOS

RE
A
CTIVOS
MA
TERI
AL
BIO
L
GICO

Gradilla metlicaCentrifugaAnti sueros (anti-A,B,AB, anti-D o Rh)Sangre total conanticoagulante Tubo de
hemolisisBao MaraSS al 0.9 %Placas excavadas devidrio oportaobjetosH
2
OPalillos de maderaSuero de CoombsLancetas y torundasPipeta pasteurJeringas de 5.0 ml
P
ROCEDI
M
IENTO

TIPIFICACIN
DE GRU
POS

SAN
GU
IN
E
OS:

SIST
EM
A

ABO
Y Rh
A)

Mtodo en placa (directa
)

Obtener 5 ml de sangrey colocar en un tubo,esperar a que retraigael coagulo y centrifugara 3000
rpm/5minRotular una placa de lamanera anti-A, anti-B,anti-AB y testigo y otracon anti-D o Rh.Del tubo que
contienela sangre tomar delfondo con pipetaPasteur eritrocitos ycolocar un gota sobrecada marca de
lasplacasAdicionar a cada gotade sangre el antisuerocorrespondiente y altestigo adicionar gotasde albumina al
25%Buscar la Presencia deaglutinacin antes de25 segundos.

que nuestro paciente dio O aunque al determinar el factor Rh tampoco lax x O-ades autoinmunitarias en la
transfusin de sangre ya que logramoss habitualmente Rh+.o que tiene un Rh negativo ocasionara problemas
al receptor.antgeno ejemplo:Download
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Yosmel Julio Abanto Burgos
si ha estado muy iteresante .pero tengo una pregunta: EN UN RECONOCIMIENTO DE GRUPO
SANGUINEO POR QU UNA VES ESTRAIDA LA SANGRE SE DEBA ACTUAR RAPIDAMENTE?
reply06 / 06 / 2012
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