UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMAN

QUMICA ORGANICA

INGENIERA BIOMDICA



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TRABAJO PRCTICO N 7: AISLAMIENTO DE ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO


Objetivos:
-Aislar el complejo desoxirribonucleoproteico (ADN-protena) a partir de timo de
ternera
-Disociar el complejo en sus dos componentes: DNA y protenas
-Precipitar desoxirribonucleato de sodio.
-Disolver desoxirribonucleato de sodio obtenido.



Introduccin


ELECCION DEL TEJIDO

Con el objeto de elegir tejido biolgico adecuado para la obtencin del ADN, se deben
considerar algunos requisitos, entre los que se puede mencionar los siguientes:

1) Elevada concentracin de ADN.
2) Mnima relacin ARN/ADN
3) Baja actividad de ADNasa.
4) Elevado contenido ADN/rgano.
5) Fcil disponibilidad.
6) Bajo costo.


1) Elevada concentracin de ADN.

Casi todas las clulas contienen ADN; excepcionalmente, algunas de ellas carecen de
ncleo y tambin de ADN, como en el caso de los glbulos rojos de los mamferos.
En las clulas nucleadas, la cantidad de ADN vara notablemente en los diferentes
tejidos. Como ejemplo, consideremos el contenido de ADN de los diferentes tejidos de una
rata adulta:




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En esta tabla se observa que, en la rata adulta el rgano ms rico en ADN es el timo
(concentraciones algo menores se encuentran en la mdula sea, el bazo y el intestino
delgado.).


2) Mnima relacin ARN/ADN:

La presencia de elevadas concentraciones de ARN dificulta el aislamiento del ADN por
tratarse de compuestos estrechamente relacionados desde el punto de vista qumico.
En general las clulas vivas contienen una cantidad de ARN considerablemente mayor que
la de ADN. Un caso extremo lo constituye el ovocito de los anfibios en el que la relacin
ARN/ADN es 31,76; en el extremo opuesto podemos ubicar a las clulas espermticas que
estn casi exclusivamente constituidas por ADN. En la siguiente tabla vemos como vara
esta relacin en los diferentes tejidos de la rata adulta:

TEJIDO ARN/ADN
hgado 3,68
glndula sub-maxilar 1,73
rin 1,08
bazo 0,335
tejido linfoide 0,285
timo 0,195

Bajo este aspecto, tambin el timo se encuentra en las mejores condiciones.


3) Baja actividad de ADNasa

Los extractos de distintos tejidos como el hgado, bazo y timo tienen la propiedad de licuar
los geles de ADN debido a la presencia de la desoxirribonucleasa, enzima que interviene
especficamente en la degradacin del ADN; la ADNasa es una fosfodiestearasa altamente
TEJIDO g de ADN/100 mg de tejido fresco

msculo esqueltico 57
cerebro 123
testculo 230
hgado 240
vescula seminal 254
corazn 306
rin 324
pncreas 480
pulmn 710
intestino delgado 1290
bazo 1400
mdula sea 1530
timo 2760



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especfica. Para su accin esta enzima requiere la presencia de cationes bivalentes; los
activadores ms especficos son los iones magnesio, manganeso, hierro y cobalto; todos
ellos son muy parecidos con respecto a la intensidad de la accin que producen.
Los inconvenientes derivados de la presencia de desoxirribonucleasa en los tejidos
puede evitarse mediante el empleo de inhibidores de esta enzima. Entre ellos se
encuentran las sustancias que extraen los cationes como los aniones citrato y fluoruro, los
agentes quelantes como el EDTA (etilen diamino tetraacetato) los iones cobre y arseniato,
fuertemente inhibidores a una concentracin de 0,001 M y el borato a 0,02 M.


4) Elevado contenido en ADN/rgano.

Es muy importante que la concentracin del ADN en el tejido sea elevada; pero desde el
punto de vista prctico, el material biolgico ser ms ventajoso si la cantidad total del ADN
en el rgano es tambin alta. Daremos un ejemplo:
Por lo que se ha visto hasta ahora, el timo es el rgano de la rata que rene las mejores
condiciones para la obtencin de ADN; pero ste es un rgano pequeo: pesa
aproximadamente 33 mg, por lo tanto se obtiene menos de 1 mg de ADN. En el timo de
ternera la concentracin del ADN es aproximadamente la misma (2250 g ADN/100 mg de
tejido), pero tiene un tamao mucho mayor: pesa aproximadamente 500 g y se pueden
obtener de l ms de 100 mg de ADN, cantidad para la cual se deberan sacrificar unas 100
ratas adultas.


5) Fcil disponibilidad:

No basta con que el material biolgico rena todas las caractersticas que vimos
anteriormente; es necesario tambin que sea fcil de obtener en el momento que se
necesite. Por ejemplo, el esperma de salmn tiene casi exclusivamente ADN y constituye
una excelente materia prima, pero no es fcil de conseguir. A su vez, el timo de ternera se
consigue con mucha facilidad en nuestro pas que es tpicamente ganadero, pero en EEUU
no ocurre lo mismo y resulta ms sencillo de conseguir el bazo de cerdo. Es decir, que la
eleccin del tejido depende del lugar donde se trabaja por las posibilidades que se ofrecen
de conseguirlo con mayor facilidad.

6) Bajo costo:

En nuestro pas el timo de ternero puede conseguirse gratuitamente en los mataderos,
porque constituye un material de desecho.


CONCLUSION: para obtener ADN en nuestro laboratorio elegimos el timo de ternera
vulgarmente llamado molleja de cuello porque rene todos los requisitos enumerados.






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AISLAMIENTO DEL DESOXIRRIBONUCLEATO DE SODIO DEL TIMO DE TERNERA

El mtodo consta de los siguientes pasos:

1) Aislamiento del complejo desoxirribonucleoproteico (ADN-protena).
2) Disociacin del complejo en sus dos componentes: DNA y protenas.
3) Eliminacin de las protenas.
4) Precipitacin del desoxirribonucleato de sodio.
5) Disolucin del desoxirribonucleato de sodio obtenido.


FUNDAMENTO.

1) Aislamiento del complejo desoxirribonucleoproteico (ADN-protena).

El propsito de esta primera etapa es aislar, en fracciones diferentes, los complejos
nucleoproticos que se encuentran presentes en el timo de la ternera: la ribonucleoprotena
(RNP) y la desoxirribonucleoprotena (dRNP).
Esta separacin se consigue homogeneizndo el tejido en una solucin salina de baja
fuerza inica (NaCl: 0,05 a 0,25 moles/litro), que favorece la estabilidad de ambos
complejos y disuelve a la mayor parte de las molculas que se encuentran presentes en el
timo (incluso la RNP) pero no disuelve a las dRNP. En el mtodo elegido se utiliza una
solucin isotnica (NaCl 0,15 M = 0,9 %).
Los mtodos de baja fuerza inica son adecuados para el aislamiento de las dRNP; sin
embargo presentan una gran desventaja: favorecen la liberacin de las nucleasas; estas
enzimas producen la degradacin enzimtica parcial de los cidos nucleicos y requieren,
para su actividad la presencia de ciertos cationes bivalentes (Mg
++
, Mn
++
, Fe
++
y Co
++
). Para
evitar este inconveniente, la homogeneizacin se realiza en presencia de agentes quelantes
como el EDTA, o de ciertos aniones como el fluoruro o el citrato, que extraen del medio los
cationes bivalentes que son necesarios para la actividad de estas enzimas. En el mtodo
que elegimos se utiliza el citrato para complejar los cationes (citrato de sodio 0,015 M).
Si se quiere mantener la integridad de la molcula de ADN es necesario verificar que las
soluciones que se emplean en su aislamiento se encuentren a pH 7. Es tambin sabido que
los cidos, a pH inferior a 2 producen la ruptura del enlace N-glucosdico de las purinas
dando orgen al cido apurnico. A pH alcalino se produce la desnaturalizacin del ADN o
sea la ruptura de los puentes hidrgeno que mantienen unidas las dos cadenas
polinucleotdicas.
Tambin se recomienda agregar algunas gotas de alcohol octlico normal, porque evita
la formacin de espuma y produce hemlisis con lo cual se facilita la eliminacin de la
hemoglobina del tejido.
Otro factor muy importante es la temperatura; a bajas temperaturas (0 a 5C) se inhibe la
ADNasa y otras enzimas que se producen en el metabolismo de la glndula y que actan
sobre el DNA produciendo la degradacin de su molcula. Por ese motivo en esta primera
etapa todos los pasos deben realizarse en fro (0 a 5C), aunque se trabaje en presencia de
inhibidores.
Los dos tipos de nucleoprotenas (RNP y dRNP) que se encuentran presentes en el
homogenato, diferenciables por su distinta solubilidad, pueden separarse por centrifugacin
en fro; se obtiene un precipitado formado por el material insoluble en la solucin salina
(dRNP) y un sobrenadante que contiene el material soluble en esa solucin (RNP).



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En conclusin:



(SSC-1X)
Timo ______________Homogenato ____________________ Centrifugado





(RNP y dRNP) RNP (sol.) dRNP (insol.)




susp. y homogenizacin



SSC-1X = (Solucin de ClNa 0,15 M- Citrato de Na 0,015 M a pH 7).

2) Disociacin del complejo en sus dos componentes : DNA y protenas.

La homogenizacin del tejido con solucin SSC-1X y la centrifugacin posterior
posterior, realizadas en la primera etapa, han permitido aislar el DNA del timo de ternera
combinado por protenas en forma de un complejo: Desoxirribonucleoprotenas (dRNP).
El propsito de esta segunda etapa es disociar el complejo aislado, liberando el DNA
(como desoxirribonucleato de sodio) de las protenas que lo acompaan.
Esta disociacin se consigue mediante el empleo de SDS (Lauril sulfato de sodio o
dodecil sulfato de sodio) reactivo que en presencia de clorurode sodio, disocia el complejo
desoxirribonucleoprotico y precipita las protenas liberadas sin producir la depolimerizacin
del nucleato.

3) Eliminacin de las protenas.

Las protenas que quedan en el sobrenadante luego del tratamiento con SDS se
eliminan con una mezcla de cloroformo y alcohol isoamlico (24:1), que las desnaturaliza y
coagula.
La preparacin cruda de ADN se agita vigorosamente con cloroformo-alcohol isoamlico.
La emulsin resultante se centrifuga en fro para acelerar la separacin de las fases. Se
separan dos faces bien definidas separadas por una interfase slida; ellas son:

1-Fase Orgnica: (Cloroformo - alcohol isoamlico) se separan en el fondo del tubo
y contiene los compuestos lipdicos.
2-Fase acuosa: sobrenada en la parte superior del tubo y contiene la sal de sodio
del ADN y nucleoprotena.
Precip (dRNP)
Sobrenad (RNP)
Resuspender y trabajar
a volumen total



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3-Interfase slida: es de color blanco y se interpone entre las dos anteriores; est
constituda por el gel que se forma entre el clorhidrato de protena y la mezcla de
cloroformo - alcohol isoamlico.

4) Precipitacin del desoxirribonucleato de sodio.

El etanol al 95 % precipita al ADN bajo la forma de un material fibroso que puede
ovillarse alrededor de una varilla de vidrio. Esta propiedad permite separar el ADN de otras
macromolculas que coagulan de una manera no fibrosa, como por ejemplo el RNA y las
protenas.

5) Disolucin del desoxirribonucleato de sodio obtenido.

La sal de sodio del ADN es fcilmente soluble en agua destilada y en soluciones de baja
fuerza inica.


ACIDOS NUCLEICOS II: ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (ADN)

OBJETIVOS:

1) Separar el cido desoxirribonucleico del cido ribonucleico a partir de un tejido animal, a
travs de sus propiedades diferenciales de solubilidad.

2) Obtener el ADN puro por precipitacin.

I- AISLAMIENTO DEL COMPLEJO DESOXIRRIBONUCLEOPROTEICO

Pesar 15 gr. de timo en una cpsula de Petri y cortar con un cuchillo o navaja en lminas
delgadas; colocar el tejido desmenuzado en un vaso homogeneizador de 100 ml de
capacidad y se le agregar 45 c.c. de citrato de sodio 0,015 M y 45 c.c. de cloruro de sodio
0,15 M. Tomar el pH y elevar a pH 7 con Tris. Enroscar el vaso en la tapa que lleva la
cuchilla (ver figura) hacindola girar en sentido contrario a las agujas del reloj. Todo el
equipo se hace descender (aflojando el tornillo 2) hasta que el vaso queda bien sumergido
en hielo picado.
Mover el control de velocidad (tornillo 1) lentamente hasta llegar a 5.000 r.p.m. y en ese
punto dejar durante 3 minutos. Una vez cumplido el tiempo, llevar el control a cero, elevar
todo el equipo, hasta que el vaso queda fuera del hielo y desenroscar el vaso. Se obtiene
una suspensin de color rosado con resto de tejido de aspecto fibroso.


Centrifugacin:

Verter el homogeneizado en tubos de centrfuga y centrifugar en fro (5C) durante 5
minutos a 5.000 r.p.m.. Se obtiene un precipitado adherente blanquecino (dRNP) y un
sobrenadante de color rosado (RNP). Desechar el sobrenadante y trabajar con el
precipitado.




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II-DISOCIACION DEL COMPLEJO DESOXIRRIBONUCLEOPROTEICO:

Colocar en un Erlenmeyer de 200 ml el precipitado obtenido y agregar 30,75 ml de
Citrato de Sodio 0,015 M y dispersar con varilla de vidrio a temperatura ambiente. Agregar
0,77 ml. de solucin de SDS (dodecil sulfato de sodio) al 5% en etanol al 45%.
Sucesivamente agregar siguiendo el orden que se indica y mezclar bien despus de cada
adicin, 9,72 ml de SDS al 45% en etanol al 45%, 52,50 ml. de ClNa 2 M y 3,78 ml de
Citrato de Sodio 0,015 M (para completar 105 ml.)


III-ELIMINACION DE LAS PROTEINAS:

En una ampolla de decantacin colocar la suspensin obtenida y agregar el mismo
volumen de cloroformo-alcohol isoamlico (24:1), agitar vigorosamente durante 30
segundos. Distribuir la emulsin resultante en tubos de centrfuga y se centrifuga en fro
(5C) durante 10 minutos a 5000 r.p.m.. Retirar los tubos suavemente de la centrfuga para
mantener la separacin de las fases. Con una pipeta
capilar retirar la capa acuosa superior que contiene la sal de sodio del DNA tratando de no
perturbar la fase proteica.

IV-PRECIPITACION DEL DESOXIRRIBONUCLEATO DE SODIO:

En un recipiente de telgopor colocar hielo picado y sobre el mismo, un vaso de
precipitacin que contiene la capa acuosa desproteinizada. Medir dos volmenes de etanol
al 95% fro y vertir lentamente sobre las paredes del vaso tratando de formar una capa
alcohlica sobre la fase acuosa viscosa. Con una varilla de vidrio gruesa agitar la solucin
de ADN con un movimiento de rotacin suave y contnuo hasta que las dos fases se
mezclen y todas las fibras del material gelatinoso rico en ADN se hallan enroscado sobre la
varilla.
Cuando el etanol se vuelve lmpido, signo de que ya se ha enroscado todo el ADN,
retirar la varilla del lquido y presionar las fibras de ADN sobre las paredes del vaso de
precipitacin para exprimir el exceso de solvente.
Eliminar el lquido residual apoyando la varilla sobre un papel de filtro. Lavar el
precipitado introduciendo la varilla que contiene el ADN en un tubo que contenga etanol al
95% y luego en otro que contenga ter etlico. Retirar el ADN de la varilla y colocar en un
vidrio de reloj dejar secar 10 minutos para eliminar por completo el solvente.
BIBLIOGRAFIA
QUIMICA ORGANICA DE FINAR, VOL II.
BIOQUIMICA DE LEHNINGER.
BIOQUIMICA DE STRYER, VOL I.
BIOQUIMICA DE NIEMEYER, VOL I.-