You are on page 1of 35

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola.

Apndice 1
Apndice
Gua de trabajos prcticos
CONTENIDO

1. Medios de cultivo y esterilizacin
2. Aislamiento y cultivo de microorganismos
3. Fijacin simbitica de N2 en leguminosas
4. Microorganismos del suelo
5. Inhibidores y desinfectantes
6. Digestin anaerbica de residuos agrcolas
7. Morfologa microscpica de hongos
8. Identificacin de mohos toxignicos
9. Micorrizas
10. Microorganismos del agua











Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 2
TRABAJO N 1. Medios de cultivo y esterilizacin
Objetivo. Preparar los substratos o medios de cultivo, cuya composicin varia segn el tipo de
organismos y la selectividad esperada, para estudiar los microorganismos en el laboratorio.
Esterilizar estos materiales para eliminar los microorganismos que pudieran alterarlos antes del
uso.
Introduccin
Nutricin
Los microorganismos toman del ambiente circundante los materiales o nutrientes que son el
punto de partida para las reacciones metablicas que los convierten en constituyentes celulares.
Hay nutrientes necesarios sin los cuales una clula no puede crecer, y otros tiles pero no
indispensables.
La primera divisin en las categoras nutricionales tiene en cuenta dos parmetros: la
naturaleza de la fuente de energa y la naturaleza de la fuente principal de carbono. Los
organismos que usan la luz como fuente de energa se denominan fottrofos y los que utilizan
fuentes de energa qumica se denominan quimitrofos. Los que emplean CO2 como principal
fuente de carbono se definen como auttrofos, pero los que utilizan compuestos orgnicos para
el mismo fin se llaman hetertrofos. Los microorganismos necesitan una diversidad de
minerales para su crecimiento, y los ms comunes son el potasio, sodio, magnesio, calcio e
hierro. Los factores de crecimiento son compuestos orgnicos especficos requeridos en muy
pequeas cantidades y no puede ser sintetizados por la clula.
Diseo de un medio de cultivo
En el cuadro siguiente se consideran tres medios de distinta complejidad.

Medio 1 Medio 2 Medio 3
agua 1 L agua 1 L agua 1 L
cloruro de amonio 1 g peptona o triptona 5 g peptona de soja 10 g
fosfato dipotsico 1 g extracto de carne 3 g glucosa 10 g
carbonato de calcio 1 g agar 15 g extracto de levadura 2,5 g
sulfato de magnesio 10 mg agar 15 g
sulfato ferroso 10 mg
cloruro de calcio 10 mg
sales inorgnicas de 0,02 mg
Mn, Mo, Cu, Co, Zn de cada uno

Al elaborar un medio de cultivo para un organismo cualquiera, el objetivo pricipal consiste en
proporcionar una mezcla equilibrada de los nutrientes requeridos, en concentraciones que
permitan un buen crecimiento. El punto de arranque es componer una base mineral que
proporcione las sales inorgnicas que pueden suministrarse a cualquier organismo. Esta
solucin puede suplementarse luego, si es necesario, con una fuente de carbono, una de energa,
una de nitrgeno y algn factor de crecimiento requerido.
El medio 1 puede permitir el crecimiento de bacterias nitritantes auttrofas que usan el
dixido de carbono como fuente de carbono y oxidan amonio para obtener energa. El medio 2
es un medio complejo que favorece el desarrollo de muchas bacterias hetertrofas que obtienen
energa y tambin carbono de aminocidos y pptidos, pero no requieren factores de
crecimiento. El 3 contiene glucosa, varios constituyentes nitrogenados orgnicos y factores de
crecimiento como para cubrir las necesidades nutricionales de mohos y levaduras.
Cualquier medio adecuado para el crecimiento de un organismo especfico es, en cierto modo,
selectivo para l. Los microorganismos deseados pueden obtenerse de los ambientes naturales
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 3
tales como el suelo, empleando medios selectivos.
Como agente gelificante de los medios de cultivo se utiliza comnmente el agar que es
obtenido de algas pero no es nutriente para la mayora de los microorganismos. El gel de agar
es firme a las temperaturas de incubacin pero se convierte en lquido (sol) cuando se calienta a
la temperatura de ebullicin del agua, gelificando nuevamente cuando se enfria a 45C. Otra
manera de proporcionar una superficie nutritiva es utilizar un filtro de membrana de esteres de
celulosa depositado sobre un disco de absorbente embebido con el medio de cultivo. El medio
traspasa los poros permitiendo el desarrollo de los microorganismos que estn en la superficie.
El extracto de carne es un extracto acuoso de msculo de bovino, concentrado hasta una
consistencia pastosa o desecada hasta polvo, que contiene compuestos solubles tales como
azcares, aminocidos y sales. El hidrolizado de protena se obtiene por digestin de msculo
con pepsina (peptona) o tripsina (triptona) o de casena (casitona, tripticase) o de proteina de
soja (peptona de soja). Los medios complejos deshidratados contienen algunos componentes
cuya concentracin vara con cada partida y suelen tener una baja capacidad reguladora del pH.
Esterilizacin
Esterilizar significa eliminar toda clase de microorganismos. Esto puede realizarse de
diferentes modos. Pueden eliminarse las bacterias del aire por filtracin, como en las cmaras de
flujo laminar estril, y de los lquido a travs de membranas fltrantes u otro filtro. La
destruccin de las bacterias puede hacerse mediante calor seco o hmedo para el tratamiento de
la mayora de los materiales, o rayos ultravioletas para el caso de superficies, o con radiaciones
ionizantes para esterilizar plsticos deseartables.
El calor seco se utiliza en estufa de aire caliente, pero
no es un mtodo eficaz de calentamiento porque el
aire es un mal conductor del calor. En ausencia de
humedad las formas ms resistentes (endosporos
bacterianos) requieren temperaturas por sobre 160C
durante una hora y media para morir.
El vapor a presin es el procedimiento ms efectivo
de esterilizacin por calor hmedo. El vapor a una
presin absoluta de 2,066 kg/ cm
2
proporciona una
temperatura de 120,6C que es mortal para los
endosporos bacterianos en pocos minutos, pero el
tiempo de aplicacin vara segn el tiempo necesario
para homogeneizar la temperatura en el material
tratado.
La presin absoluta a la que est sometido el
material dentro del autoclave es igual a la presin
leda en el manmetro sumada a la presin
atmosfrica del lugar. Como esta ltima varia con la
altura sobre el nivel del mar, debe calcularse la
presin manomtrica necesaria para llevar a cabo la
esterilizacin en cada localidad, haciendo caso omiso
de las graduaciones en temperaturas adicionadas al
manmetro por los fabricantes a nivel del mar. En la figura 1 se ven las curvas de temperaturas
alcanzadas en funcin del tiempo en un autoclave con distinto grado de purgado del aire. La
figura 2 muestra el tiempo requerido para esterilizar distintos volmenes a 120,6C.
La temperatura de ebullicin del agua puede ser usada para esterilizar materiales nutritivos
que se alteraran a temperaturas mayores, mediante el si guiente artilugio: el material es tratado
durante 30 minutos el primer da e incubado a la temperatura ambiente, vuelto a calentar 30
minutos el segundo da y otra vez incubado, para finalmente calentarla otros 30 minutos el
tercer da. El tratamiento durante el primer da destruye las formas vegetativas, el perodo de
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 4
incubacin permite la
germinacin de muchos
endosporos y las formas sensibles
originadas mueren con el
segundo calentamiento. Los
endosporos que persistieron
germinarn durante el segundo
perodo de incubacin y las
clulas formadas morirn con el
tercer calentamiento. Como se ve,
la tindalizacin es efectiva
nicamente cuando el medio a
esterilizar es favorable para la
germinacin de los esporos. No
destruir los endosporos de
anaerobios si la incubacin no se
lleva a cabo en condiciones de
anaerobisis y tampoco destruir a
los endosporos del grupo
termoflico.
Teniendo en cuenta la cintica
microbiana el fin prctico de la
esterilizacin mediante un agente
letal es lograr que la probabilidad
de que el material tratado
contenga tan slo un
superviviente, sea muy
pequea. Los procedimientos habituales de esterilizacin se proyectan siempre de forma que
proporcionen un amplio margen de seguridad.
Filtracin
Los microorganismos quedan retenidos por el pequeo tamao de los poros del filtro y con
algunos tipos de materiales filtrantes por adsorcin sobre los mismos, adems de la influencia
del pH del lquido sobre las cargas de los microorganismos y el filtro. Comnmente en el
laboratorio se usan membranas de esteres de celulosa con porosidades de 0,45 m 0,2 m,
pero tambin suelen usarse en otros casos unos filtros de porcelana o vidrio fritado
(sinterizado).
Procedimiento
Preparacin del material de vidrio
Obturar con algodn la extremidad no aguzada de las pipetas con la ayuda de un punzn.
Colocar dos o tres de ellas en un sobre de papel y cerrarlo con broches metlicos, o bien
envolverlas separadamente en una tira de papel. Envolver con papel cada caja de Petri cerrada.
Tapar los tubos de ensayo con algodn prensado de tal modo que, se pueda quitar y colocar el
tapn sin deformarlo. Reunir unos diez tubos en un paquete.
Esterilizacin por aire caliente
El material limpio y bien seco, una vez tapado con algodn y/ o envuelto con papel, se ubica
en el interior de la estufa (horno o esterilizador). Luego se calienta hasta que la temperatura
alcance 170C y se la mantiene durante 30 a 60 minutos enfriar segn la carga. Se deja enfriar el
aparato antes de abrir, para evitar la rotura del vidrio por el contacto brusco con el aire fro. Al
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 5
terminar la operacin, el algodn y/ o el papel de diario tendrn un color tostado plido. Desde
los 150C ambos comienzan a amarillear, pero a los 180C pierden la propiedad de detener las
bacterias y se forman residuos carbonosos ms o menos antispticos.
Control de la eficacia de la esterilizacin
Se coloca en la estufa, junto con el material de vidrio, un tubo con endosporos bacterianos
(cultivo seco o suelo tamizado). Una vez sometido al tratamiento trmico, se le agrega un medio
nutritivo lquido y se incuba a 30C durante 48 horas. Si se ha logrado la esterilizacin, no habr
desarrollo bacteriano.
Preparacin de medios de cultivo
La mayora de las bacterias hetertrafas pueden multiplicarse en el medio 2 denominado "
agar nutritivo". Para disolver el agar se calienta el recipiente en un bao de agua hirviente o en
el autoclave a vapor fluente. El pH del medio debe estar prximo a 7. Si se prepara sin agar se
obtiene el medio llamado "caldo nutritivo".
Los hongos suelen crecer ms lento que las bacterias y toleran mejor la acidez, por lo que suele
usarse para su cultivo el medio 3 conocido como "agar micolgico" cuyo pH es
aproximadamente 5,6, al que se le aadi extracto de levadura para que desarrollen aun los
organismos exigentes en vitaminas.
Los medios se distribuyen en tubos de ensayo o en matraces de Erlenmeyer ocupando slo un
tercio de su capacidad. Tanto los tubos como los matraces llevan tapones de algodn, excepto
cuando tienen tapa a rosca esterilizable. Los tubos se renen en cestos y se los cubre con dos o
tres hojas de papel poroso donde se escribe con lpiz el nombre del contenido. Se cubren los
matraces con un capuchn de papel y un hilo atado de tal forma que pueda quitarse fcilmente.
Los medios de cultivo se esterilizan en autoclave.
Esterilizacin por vapor de agua a presin
En el autoclave se logra que la temperatura del vapor de agua sea superior a la ebullicin
(96C a 1300 m s.n.m.) por medio de un aumento de la presin, luego de la eliminacin del aire
por la espita o vlvula de purga. Si funciona a 1,18 kg/ cm
2
por sobre la presin atmosfrica
promedio local (0,88 kg/ cm
2
=884 HPa), el agua hervir a 121C.
Al mantener esta temperatura durante 15 minutos se logra la destruccin de toda forma de
vida en volmenes menores a 100 mL. El mismo resultado se alcanza prcticamente en
materiales poco contaminados, calentando a 115C (0,84 kg/ cm
2
de presin manomtrica)
durante 20 minutos. Los slidos o liquidos muy viscosos deben ser calentandos a 121C durante
30 minutos. Si el autoclave est muy cargado, o los volmenes son mayores, es necesario
prolongar el tiempo de calentamiento.
Con estas condiciones de tratamiento pueden sobrevivir los endosporos de bacterias
termoflicas, pero stas no crecen a las temperaturas comunes de incubacin (25 - 37C).
Colocar agua hasta la rejilla, ubicar los recipientes y cerrar el autoclave, ajustando las
mariposas opuestas para que la tapa quede bien apoyada sobre la junta de goma. Encender el
mechero. Cerrar la espita, o vlvula de purga, recin cuando sale un chorro de vapor continuo
pues entonces se ha logrado purgar el aparato. A partir de este momento comienza a aumentar
la presin, la que se regula y mantiene con la altura de la llama. Vigilar el autoclave durante la
esterilizacin.
Cumplido el tiempo, cerrar la llave de gas y esperar hasta que la aguja del manmetro vuelva
a cero, antes de abrir la espita para igualar las presiones, interna y externa. Luego abrir la tapa.
Si se abriera la espita durante el enfriamiento, la brusca descompresin producirla la ebullicin
violenta de los lquidos y los proyectarla fuera de los recipientes. Por otra parte si se abre
demasido tarde, el vapor se habr condensado sobre los papeles y algodones, y se habr
acelerado el deterioro de la junta de goma por el vacio formado.
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 6
Control de la temperatura de esterilizacin
Se coloca un tubito con cido benzoico en polvo (p.f. 121C) junto al material a esterilizar.. Si
se alcanza la temperatura de fusin durante el proceso de esterilizacin, luego del enfriamiento
quedar una masa homognea de cido benzoico.
Tambin se usan mezclas indicadoras adheridas sobre cartn u otro material, tal como la
compuesta por carbonato de plomo +azufre precipitado +carbonato de litio (10 +1+3). Esta
mezcla vira al gris despus de 30 minutos a 100C, en 3 4 minutos a 110C y en 30 segundos a
121C. Toma color negro si est expuesta ms de 30 minutos a 110C y
en 5 minutos a 121C.
Esterilizacin por filtracin
Se eliminan los bacterias de las soluciones que se descomponen o
inactivan al someterlas a la temperatura del autoclave, pasndolas a
travs de membranas con poros de 0,2 0,45 m u otros filtros. La
membrana o disco filtrante se coloca sobre una superficie porosa rgida,
en una suerte de embudo desmontable adaptado a un matraz de
Kitasato (ver figura 3) mediante un tapn de goma, para poder hacer un
vacio parcial con una bomba o una trompa de agua. La tubuladura
lateral del matraz se conecta a un tubo engrosado en su parte media,
donde se coloca algodn. Se envuelve el conjunto con papel y se
esteriliza en el autoclave. Despus se ubica el disco filtrante en el
embudo desmontable cumpliendo con las reglas de asepsia y se conecta
el matraz de Kitasato a la trompa de agua o la bomba de vaco.
Control de la eficiencia de la filtracin
Dos porciones del material nutritivo filtrado se transfieren en condiciones de asepsia a
recipientes estriles y se incuban, uno a 30C y otro a 45C, durante 48 horas. Si se logr la
esterilizacin no debe haber desarrollo microbiano.

Bibliografia
o Madigan TM et al. Brock- Biologa de los Microorganismos. Prentice Hall, Madrid, 1998
o Stanier RY et al. Microbiologa. Revert, Barcelona, 1984
o Carpenter P, Microbiologa, Interamericana, Mxico, 1979
o Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962













Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 7
TRABAJO N 2. Aislamiento y cultivo de microorganismos
Objetivo. Separar por mtodos fsicos los microrganismos, provenientes de un ambiente natural,
de tal manera que al multiplicarse sobre un substrato nutritivo se obtenga una poblacin (en el
caso de bacterias o levaduras) o un individuo (en el caso de un moho).
Reconocer al microscopio las caractersticas generales de los microorganismos mediante
preparaciones en fresco o coloraciones de extendidos del material.
Introduccin
Microbios uni y pluricelulares
Los organismos ms sencillos son aqullos que estn constituidos por una sola clula. Como
las clulas se miden en micrmetros (m) estos organismos unicelulares caen dentro de la
categora general de microbios o microorganismos. La organizacin unicelular se observa en
protozoos, algunas algas, levaduras y la mayora de las bacterias. Un tipo ms complejo de
organizacin biolgica es la de los organismos pluricelulares. Aunque surgen en general a partir
de una sola clula, en estado maduro constan de varias clulas permanentemente unidas unas a
otras de un modo caracterstico, lo cual le confiere una forma tpica al organismo. As un moho
esta compuesto por filamentos ramificados. Cada filamento se denomina hifa y al conjunto de
hifas se lo llama micelio.
Aislamiento, cultivo
Dos clases de operaciones fundamentales en la microbiologa clsica son el aislamiento o
separacin de un microorganismo determinado de las poblaciones mixtas que existen en la
naturaleza, y el cultivo o crecimiento del microorganismo en medios artificiales bajo
condiciones de laboratorio. Estas operaciones son bsicamente iguales para el estudio de las
bacterias, los hongos, las algas, los protozoos y las lineas de clulas vegetales o animales (cultivo
de tejidos).
Para el aislamiento directo se emplean medios gelificados. Cuando un inoculo mixto que
contiene una cierta variedad de organismos diferentes se extiende directamente sobre la
superficie de un medio gelificado, todos aqullos que puedan crecer sobre el mismo producirn
colonias. La dispersin de los microbios sobre el medio elimina gran parte de la competencia
por los nutrientes y por ello algunos que crecen lentamente son capaces de multiplicarse en el
mismo ambiente de los que crecen rpidamente.
Como consecuencia del aislamiento aparecen luego de la incubacin, poblaciones de bacterias
y levaduras e individuos fngicos sobre la placadel medio de cultivo. Se los puede mantener
vivos en el laboratorio mediante transplantes a otros medios de cultivo.
Ambiente
Los principales ambientes naturales de los microorganismos son el suelo y el agua. Muchos
organismos se encuentran en una capa delgada de suelo de algunos decmetros de espesor. Los
microrganismos de las masas de agua, por ejemplo lagos, estn concentrados en la superficie y
en el fondo por encima del cieno. Los microorganismos transportados por el aire son seres que
accidentalmente se encuentran en este medio y provienen del suelo, agua u otros organismos
vivos.
Es necesario que haya ciertas condiciones en el ambiente para que sirva como reservorio de los
microorganismos. El crecimiento depende del abastecimiento adecuado del agua y las
substancias nutritivas, el pH conveniente, la tensin de oxigeno suficiente, la temperatura
necesaria y otros factores.
Oxgeno
Muchos organismos requieren oxigeno molecular pues dependen de la respiracin aerobia
para cubrir sus necesidades energticas y se los denomina aerobios obligados. Entre stos,
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 8
algunos crecen mejor a presiones parciales de oxigeno menores que la presente en el aire y se los
conoce como microaerfilos. Hay microorganismos son anaerobios facultativos, pues pueden
crecer tanto en presencia como en ausencia de aire. Comprende dos subgrupos: uno, el de las
bacterias que tienen un metabolismo productor de energia exclusivamente fermentativo pero no
los afecta la presencia de aire; otro, el de las levaduras o bacterias que pueden pasar del
metabolismo respiratorio al fermentativo. En cambio los anaerobios estrictos slo fermentan y
son sensibles al oxigeno.
Crecimiento, colonia
En cualquier sistema biolgico el crecimiento puede definirse como el aumento ordenado de
todos los constituyentes qumicos de un organismo. El crecimiento determina la multiplicacin
celular y en los organismos unicelulares motiva un aumento del nmero de individuos,
mientras que en los
multicelulares lleva al
aumento del tamao
del individuo.
En el aislamiento se
tom una pequea
cantidad de clulas
microbianas y al
deslizar el asa sobre el
agar se las distribuy
por la superficie.
Durante la incubacin
la clula aislada se
dividi repetidamente hasta formar una masa visible llamada colonia sobre el medio de cultivo.
El crecimiento de las poblaciones bacterianas est normalmente limitado por la desaparicin de
los nutrientes accesibles o por la acumulacin de productos metablicos txicos. Al describir
una colonia se usan distintos vocablos para describir forma, elevacin y borde de la misma
como se muestra en la figura 4.
Bacterias
La mayora son organismos unicelulares que se multiplican por escisin binaria transversal. Se
distinguen varios tipos respecto a su forma y agrupacin como se esquematiza en la figura 5.
Algunas bacterias forman clulas de reposo, conocidas como endosporos, que tienen bajo
contenido de agua, son muy refringentes y se tien con dificultad.










Los endosporos soportan el calor, la desecacin y algunas substancias qumicas, muchos
resisten a 100.C durante unas 20 horas, otros slo unos minutos a 90C
Las bacterias mviles tienen uno o varios flagelos. Para verlos con el microscopio ptico se los
debe engrosar mediante un mordiente antes de la coloracin. Suele observarse el movimiento
bacteriano cuando se coloca una gota de un cultivo en medio lquido entre cubre y portaobjetos.
Los actinomicetos son un grupo de bacterias filamentosas, ramificadas, que forman un micelio
delgado y en la mayora de los casos clulas de multiplicacin llamadas esporos.
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 9
Coloraciones
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resulta difcil de ver con el
microscopio ptico. La principal dificultad es el poco contraste entre la clula y el medio que la
rodea, y la manera ms simple de aumentarlo es utilizando colorantes.
Las clulas generalmente son tratadas de diversa manera, antes de teirlas, para coagular el
protoplasma en un proceso que se llama fijacin. En el caso de las bacterias, la fijacin por calor
es lo ms corriente, aunque tambin puede emplearse formaldehido, metanol o cidos. La
fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido secadas sobre un portaobjetos. Luego le
sigue la tincin.
La mayora de los colorantes usados son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad
especifica con los materiales celulares. El azul de metileno es un buen colorante que acta
rpidamente sobre las bacterias y es til para detectar bacterias en medios naturales, puesto que
no tie la mayor parte del material extrao.
Tincin de Gram
Es un mtodo diferencial de tincin para bacterias. Luego del tratamiento con cristal violeta
todas las clulas estn coloreadas. Al agregar iodo se forma un complejo con el colorante en el
interior de las mismas. Despus de aadir etanol o acetona algunos organismos se decoloran
(Gram-negativos) y otros no (Gram-positivos) segn la estructura fsica de la pared, no por los
constituyentes qumicos pues las levaduras son gram-positivas aunque tienen una pared
qumicamente distinta a las de las bacterias.
Para poner de manifiesto las clulas incoloras se utiliza una coloracin de contraste, tal como
safranina o fucsina bsica que tien de rojo a las clulas gram-negativas mientras las gram-
positivas permanecen violetas.
Procedimiento
Aislamiento de microorganismos del polvo ambiental
La tcnica depende del material a partir del cual se intenta aislar los microorganismos y de las
caractersticas de estos ltimos. Vertir unos 15 mL de agar nutritivo, licuado en bao da agua
hirviente, en una caja de Petri e igual cantidad de agar de
Sabouraud licuado en otra. Dejar gelificar y luego exponer las placas
al aire dejando sedimentar el polvo ambiental durante 30 minutos.
Incubar a 2730C durante 48 horas la caja con agar nutritivo y a
25-27C por 5 das la del agar de Sabouraud. Al cabo de ese tiempo
examinar las colonias microbianas presentes.
Aislamiento de bacterias esporuladas
del suelo
Calentar una suspensin de suelo por 10
minutos en un bao de agua a 80C.
Flamear el asa hasta que tenga color rojo
brillante y dejar que se enfre dentro de la
zona de conveccin del mechero. Tomar
una gota de la suspensin y extenderla sobre la superficie de una placa de agar nutritivo
haciendo las primeras estras como se muestra en la figura 6. Flamear el asa y hacer la segunda
serie de estrias con el asa vacia. Flamear otra vez el asa y hacer la tercera serie de estras con el
asa vaca. Incubar las cajas con la tapa hacia abajo (invertidas) a 25-30C durante 48 horas.
Aislamiento de rizobios de ndulos radicales de leguminosas
Lavar la raz para quitar el suelo adherido. Elegir los nodulos de mayor tamao, separarlos y
colocarlos en un tubo o frasquito. Lavarlos nuevamente, agitando con fuerza para eliminar la
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 10
mayor parte de los residuos. Poner los nodulos durante 30 segundos en etanol 95% y luego
sumergir en lavandina concentrada diluida al 1/ 10 durante 3 a 6 minutos. Lavar tres o cuatro
veces, agitando enrgicamente, en sendos tubos de agua estril. Para transferir los nodulos de
un recipiente a otro usar una pinza con la punta previamente mojada en alcohol y flameada.
Tomar un nodulo y colocarlo entre dos portaobjetos cuyas caras enfrentadas haban sido
flameadas. Aplastarlo y tomar el material del nodulo con el asa para hacer estras sobre la placa
del medio de cultivo especifico como se muestra en la figura 6. Incubar a 25-30C.
El medio de cultivo para rizobios contiene manitol 10 g, extracto de levadura 4 g, carbonato de
calcio 3 g, fosfato dipotsico 0,5 g, sulfato de magnesio 0,2 g, cloruro de sodio 0,l g, agar 15 g,
rojo Congo 25 ppm o verde brillante 125 ppm, agua 1 litro; pH 7,0. Se esteriliza a 115C durante
20 minutos.
Observacin de las placas de aislamiento
El inoculo fue diluido progresivamente en cada estra sucesiva de tal manera que, despus de
la incubacin en la estufa, el crecimiento es confluente en los trazos iniciales y las colonias estn
bien aisladas a lo largo de las ltimas estras. Observar las caractersticas macromorfolgicas de
las colonias y registrarlas en la planilla de informes correspondiente. Tomar con un asa material
de una colonia y hacer un extendido sobre un portaobjetos. Luego de secar y fijar por calor,
hacer una coloracin de Gram para observar las clulas somticas o de Wirtz para ver los
endosporos.
Tincin de Gram
Poner el portaobjetos sobre un soporte y cubrirlo con una solucin de violeta cristal. Luego de
1 minuto agregar solucin de iodo. Despus de 1 minuto, lavar con agua. Decolorar con alcohol
96. Lavar con agua y cubrir con una solucin de safranina durante 1 minuto. Lavar con agua y
secar. Colocar una gota de aceite para inmersin. Llevar el portaobjetos a la platina de un
microscopio. Mirar a travs del objetivo de bajo aumento (10x) y una vez enfocado el objeto
colocar el objetivo de inmersin en aceite (100x) moviendo el revlver. Levantar el condensador
pues la intensidad de la luz debe ser mayor con los objetivos de mayor aumento. Ajustar el
enfoque mediante el tornillo micromtrico. Regular la cantidad de luz por medio del diafragma.
Las bacterias Gram-negativas se tien de rojo anaranjado y las Gram-positivas adquieren color
violeta. Dibujar lo observado manteniendo la proporcin respecto al campo microscpico .
La solucin de violeta cristal contiene 1 g de colorante disuelto en 20 mL de alcohol 96 y 80
mL de agua. La de safranina se prepara de igual manera usando 0,25 g de colorante. La solucin
de iodo segn Lugol contiene 1 g de iodo y 2 g de ioduro de potasio en 100 mL de agua.
Coloracin de endosporos
Cubrir el extendido con solucin de verde de malaquita. Encender un hisopo embebido en
alcohol y calentar el portaobjetos por debajo del soporte. Apagar y repetir la operacin luego de
un minuto. Repetir el calentamiento dos veces
ms. Lavar con agua. Cubrir con solucin de
safranina durante 1 minuto. Lavar con agua y
secar. Colocar una gota de aceite para
inmersin. Los endosporos se vern verdes y las
clulas somticas de color rojo anaranjado.
Dibujar lo observado.
La solucin de verde de malaquita contiene 2 g
de colorante disuelto en 20 mL de alcohol 96 y
80 mL de agua.
Seleccin y transplantes de colonias
Elegir colonias de bacterias y hongos en las
placas anteriores y repicarlas como se muestra
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 11
en la figura 7. Incubar los cultivos de bacterias a 30-35C en la obscuridad, si se trata de hongos
colocarlos a 25-27C preferentemente donde reciban una iluminacin diurna difusa para
favorecer la esporulacin.
a) cultivo de bacterias en aerobiosis
sobre medios gelificados . Flamear el asa hasta que tenga color rojo brillante. Tomar el tubo con
la mano izquierda. Quitar el tapn de algodn sostenindolo con el dedo meique de la mano
derecha. Pasar la boca del tubo por la llama
del mechero. Introducir el asa, estril y fra, en
el tubo y extraer un poco de material
microbiano. Volver a flamear la boca del tubo
y colocar el tapn. Tomar el tubo con medio
estril, destapar y flamear como el anterior.
Introducir el asa y depositar los
microorganismos rayando en zig-zag la
superficie del medio gelificado, con mucha
suavidad. Sacar el asa, flamear la boca del
tubo y tapar. Flamear el asa.
en medios lquidos. Proceder igual que en el
caso anterior y depositar los
organismos dentro del medio
lquido.
b) cultivo de hongos
El procedimiento para sembrar
levaduras es similar al empleado
para bacterias. Para cultivar
hongos se emplea un gancho,
inserto en el mango de Kolle, que
permite tomar los filamentos para
transferirlos al nuevo medio.
microcultivo. Colocar sobre un portaobjetos, previamente flameado y
enfriado, un trozo de medio gelificado de 1 cm de lado y 2 a 3 mm de
espesor, tomado de una placa estril. Sembrar en los bordes libres del
trozo de agar como se muestra en la figura 8. Colocar un
cubreobjetos, tambin flameado y enfriado. Incubar los microcultivos
en una cmara hmeda, lograda poniendo algodn mojado bajo el
soporte de los portaobjetos dentro de un recipiente cerrado.
Observacin de los cultivos en tubos
macroscpica
Despus de la incubacin observar los cultivos a simple vista o con
ayuda de la lupa y registrar en el informe las caractersticas
morfolgicas (ver figura 9). Evitar la agitacin del medio lquido
pues si ha crecido una pelcula superficial, esta puede caer
confundindose con el sedimento.
microscpica
Hacer un preparado de las bacterias (ver figura 10), fijar por calor en
la llama o microondas, y colorearlo segn el mtodo de Gram.
Suspender los hongos en agua, lquido de Patterson o colorante de
Guegun al hacer el preparado en fresco y con ayuda de dos agujas
separar los filamentos.
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 12
El colorante de Guegun contiene 0,1 g de azul de algodn y 0,1 g de Sudn III en 100 g de
cido lctico, adems de 10 gotas de tintura de iodo. El lquido de Patterson se prepara
mezclando 50 mL de solucin acuosa de acetato de potasio al 2%, con 20 mL de glicerina y 30
mL de etanol 96
Observar el microcultivo con el objetivo de menor aumento, luego de enfocar un objeto
adherido a la cara inferior del cubreobjetos se podr utilizar el siguiente objetivo.
Medida del tamao de los microorganismos
El mtodo ms prctico usa un ocular
autoenfocable, con una escala arbitraria
dividida en cien pequeas partes iguales, a
veces numeradas, la que debe calibrarse con la
escala de 1 mm con cien divisiones de diez
micrmetros cada una, grabada en un
portaobjetos llamado micro-mtrico (ver figura
11). Enfocar al portaobjetos y mover ste de
modo que su escala quede paralela a la del
ocular.
Observar cual nmero de las pequeas
divisiones de 10 m grabadas en el portaobjetos
coincide con un nmero entero de las
contenidas en el ocular. Calcular el valor en
micrmetros correspondiente a una divisin
pequea de la escala del ocular mediante la
regla de tres simple.
Calibrar la escala del ocular para cada
aumento del microscopio. Tener en cuenta que
las rayas del ocular siempre tendrn el mismo
espesor mientras que las del portaobjetos irn
engrosndose al cambiar los objetivos.


Bibliografia
o Hall GS et al. Methods for the Examination of Organismal Diversity in Soils and Sediments. CAB International,
Wallingford, 1996
o Seeley HW & Van Demarck PJ. Microbios en Accin. Blume, Madrid, 1973
o Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962














Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 13
TRABAJO N 3. Fijacin simbitica de N
2
en leguminosas
Objetivo. Observar las caractersticas macro y micromorfolgicas de los ndulos radicales de
leguminosas. Comprobar la capacidad de nodular de la cepa de rizobio aislada.
Introduccin
Fijacin simbitica del nitrgeno molecular
Una de las simbiosis ms importantes es la que se da entre
leguminosas y bacterias de los gneros Rhizobiumy Bradyrhizobium.
La infeccin de las races con una cepa adecuada de la bacteria (hay
especificidad de husped) conduce a la formacin de ndulos
radicales que tienen distinta forma segn la planta hospedadora
(figura 12).
Los rizobios especficos entran en la raz por el extremo de los
pelos absorbentes que se retuercen en forma de bculo. Se forma en
el pelo uno o varios tubos de infeccin dentro de los cuales los
rizobios se hallan dispuestos en fila. El tubo de infeccin penetra en
las clulas del crtex de la raz. Algunas clulas de la raz se
dividen activamente produciendo un meristema.
Los rizobios contenidos en el tubo de infeccin son liberados en el
citoplasma de estas clulas meristemticas donde adquieren una
forma distinta al rizobio de vida libre y se los llama bacteroides.
stos son capaces de fijar el nitrgeno molecular. En los ndulos la
presin parcial de oxgeno es muy baja, si se eleva la enzima
nitrogenasa quedara inhibida y no se producira la fijacin. Sin embargo el ndulo consume
oxigeno provisto por la leghemoglobina, una molcula transportadora de O2 que contiene grupo
hemo y da a los ndulos color rojizo.
Nodulacin de leguminosas
Ndulos efectivos
o pocos y situados sobretodo en la raz primaria
o voluminosos, con superficie lisa o rugosa
o actividad meristematica y nodular prolongada
o infeccin generalizada, zona bacteriana grande con muchos bacteroides
o interior pigmentado de rojo por la leghemoglobina.
Nodulos inefectivos
o numerosos y repartidos en todo el sistema radicular
o pequeos con superficie lisa
o actividad meristematica y nodular corta
o pocas clulas infectadas, pocos o sin bacteroides y granulos de almidn
o interior no coloreado de rojo.
Inoculante para leguminosas
La bsqueda y seleccin de buenas cepas de rizobios puede resultar intil si las leguminosas
nodulan eficientemente con las cepas nativas, situacin frecuente en especies tropicales. Pero, en
muchos suelos el nivel y la eficiencia de las cepas nativas pueden no ser los adecuados y la
nodulacin y la fijacin de nitrgeno resultan insuficientes para satisfacer las demandas del
cultivo.
La inoculacin artificial resulta imprescindible cuando se introducen nuevas leguminosas,
sobre todo si son hospedadores de alta especificidad o cuando la deficiencia en nitrgeno limita
Figura 12
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 14
el desarrollo vegetal. El mtodo y las condiciones de inoculacin deben permitir la
supervivencia de los rizobios, adems la semilla inoculada debe poseer la especie de rizobio
adecuada y en nmero suficiente. Las condiciones del suelo prximo a la semilla deben
favorecer la colonizacin de la rizsfera por la bacteria para lograr la formacin de los nodulos y
su funcionamiento efectivo.
Para determinar la necesidad de
inoculacin se suele emplear un ensayo
simple de tres tratamientos:
- la inoculacin con una cepa de rizobio
conocida para saber si es efectiva en el
hospedador,
- la fertilizacin para asegurar un buen
desarrollo del hospedador si no hay
inhibidores en el suelo,
- el control no inoculado para observar la
presencia o ausencia de rizobios nativos
y su efectividad.
Las cepas usadas en los inoculantes
deben ser cuidadosamente seleccionadas
y mantenidas, y probarse anualmente
para minimizar la posibilidad de cambio
en las propiedades simbiticas.
La eficencia de la fijacin se evala por
el nmero de ndulos, la masa nodular,
el peso seco de la planta y el contenido de nitrgeno de la parte area. Son bacterias eficaces las
que, por intermedio de los ndulos radicales, aportan nitrgeno reducido a la planta
hospedadora produciendo un aumento de peso de la misma.
Procedimiento
Examen de los ndulos y bacteroides
Tomar un ndulo de la raz de una leguminosa, medirlo y dibujar su forma. Cortarlo y
observar el color. Si la fijacin de nitrgeno era efectiva se lo ver rosado o rojo, a veces pardo.
Aplastarlo entre dos portaobjetos. Extender el material interno mezclado con una gota de agua,
haciendo movimientos circulares con el asa. Secar cerca de una llama. Fijar pasando tres veces el
portaobjetos por dentro de la llama.
Colocar el portaobjetos sobre un soporte colocado en una bandeja o la pileta. Cubrirlo la
solucin colorante (fucsina bsica 0,3 g, etanol 96 10 mL, fenol 5 g, agua destilada 90 mL).
Luego de un minuto lavar con agua. Secar cerca de una llama. Depositar una gota de aceite de
inmersin, apoyar un cubreobjetos y sobre ste poner otra gota de ese aceite.
Observar al microscopio los bacteroides coloreados y dibujarlos tratando de mantener la
proporcin respecto al campo microscpico. Anotar el aumento.
Germinacin de semillas de leguminosas
Colocar las semillas necesarias, de buen poder germinativo, en un matraz de Erlemeyer con
etanol al 70% v/ v y agitar durante 3 a 5 minutos. Volcar y aadir agua lavandina al 10% v/ v,
agitando por igual tiempo. Lavar varias veces con agua destilada estril. Depositarlas sobre
agar-agua estril y dejar germinar.
Preparacin del inoculante
Sembrar en matraces con 50 mL de medio de cultivo con la cepa aislada de ndulos durante el
desarrollo del trabajo n2. El medio de cultivo contiene: fosfato monopotsico 0,5 g, fosfato
Testigo
Ensayo
Figura 13
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 15
dipotsico 0,5 g, cloruro de sodio 0,1 g, nitrato de potasio 0,8 g, sulfato de magnesio 0,2 g,
extracto de levadura 4 g, fosfato diamnico 0,3 g, glicerol 10 g, agua 1 L, pH 6,8. Esterilizar a
121C durante 15 minutos.
Inoculacin de leguminosas
Escoger de las placas de germinacin las dieciseis plntulas de mejor aspecto y trasladarlas al
medio mineral inclinado en tubos grandes. Dejar en lugar iluminado y ventilado. Uno o dos
das despus verter 1 mL del cultivo homogeneizado de rizobio sobre la radcula de ocho
plntulas cultivadas.
El medio mineral contiene: fosfato dipotsico 0,5 g, sulfato de magnesio 0,2 g, cloruro
de sodio 0,1 g, cloruro frrico 0,01 g, fosfato triclcico 2 g, agua 1 L, agar 15 g, pH 7. Esterilizar
a 110C durante 20 minutos.
Control de las leguminosas inoculadas
Medir la longitud de las plantas inoculadas y las testigo. Observar y registrar la ubicacin,
tamao y forma de los ndulos. Controlar la humedad del substrato.
Bibliografa
o Balatti AP & Jardim Freire JR. Legume Inoculants. Selection and Characterization of Strains. Production, Use and
Management. Kingraf, La Plata, 1996
o Frioni L. Ecologa Microbiana del Suelo. Universidad de la Repblica, Montevideo, 1990
o Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962



















Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 16
TRABAJO N 4. Microorganismos del suelo
Objetivo. Demostrar la biodiversidad de los grupos fisiolgicos de microorganismos del suelo
mediante cultivos selectivos que provean las condiciones ambientales y disponibilidad de
nutrientes adecuadas.
Introduccin
Los microoganismos juegan un papel significativo en la mayora de los procesos naturales que
afectan al ambiente. Un ejemplo es la fijacin del nitrgeno molecular por los organismos de
vida libre y los simbiticos, otro es el reciclado de materiales orgnicos. La materia orgnica que
llega al suelo a travs de residuos de cosechas, la cada del follaje, las races y sus productos de
descamacin y exudacin, los restos animales y microbianos sufren una serie de procesos de
degradacin que asegura la continuidad de los ciclos biogeoqumicos.
Empleando medios sel ectivos se puede lograr cultivos enriquecidos en microorganismos con
una caracterstica fisiolgica determinada, por ejemplo si carece de una fuente de nitrgeno
soluble slo crecern las bacterias capaces de reducir el nitrgeno gaseoso disuelto, procedente
de la atmsfera.
Amonificacin
El nitrgeno orgnico de los productos de hidrlisis de protenas y polinucletidos, se
convierte en amonaco por el proceso de desaminacin. La urea se hidroliza rpidamente a
amonaco y dixido de carbono por la enzima ureasa producida por muchos microorganismos.
La evolucin de la microbiota vara segn la materia nitrogenada transformada. En general,
primero aparecen bacilos, esporulados o no, y cocos. Despus se observan actinomicetos y ms
tarde mohos.
La demostracin de la amonificacin se basa en investigar amonaco mediante el reactivo de
Nessler en el medio acuoso con aminocidos (peptona, etc). La solucin de yodo-mercuriato
potsico alcalinizada origina desde un color amarillo hasta un precipitado rojo ladrillo segn la
cantidad de amoniaco presente.
El amoniaco formado puede ser asimilado directamente por otros microrganismos o ser
convertido en nitrato por las bacterias especficas. Si se aade a un suelo materiales tales como
estircol, aumenta en consecuencia la velocidad de nitrificacin.
Nitrificacin
El nitrgeno tiene tres formas estables de oxidacin en la naturaleza (nitrgeno molecular,
amonaco, nitrato) cuya interconversin est dada casi exclusivamente por bacterias. Algunos
organismos pueden usar directamente amonio para sintetizar sus aminocidos y otras
molculas nitrogenadas de la clula, pero otros, incluyendo las plantas, prefieren nitrato. La
oxidacin del amonio a nitrato se denomina nitrificacin y unas bacterias auttrofas aerobias las
llevan a cabo en dos etapas:
1) oxidacin del amonio por Nitrosomonas, Nitrosococcus
2) oxidacin del nitrito por Nitrobacter, Nitrococcus
Tanto la formacin de nitrito como la de nitrato por los microorganismos quimioauttrofos
constituyen procesos metablicos aerbicos generadores de energa. Ocurre rpidamente en
suelos bien drenados a pH neutro. Aunque el nitrato es fcilmente asimilado por las plantas,
como es muy soluble en agua resulta rpidamente lavado de los suelos que reciben una gran
cantidad de lluvia. Por el contrario, el amonio queda fuertemente adsorbido a las arcillas.
Desnitrificacin
Es el proceso en el cual algunos organismos que pueden usar el nitrato como aceptor final de
electrones durante la respiracin anaerbica producen molculas reducidas gaseosas (xido de
dinitrgeno, nitrgeno molecular) que desaparecen del ecosistema. Existen otros
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 17
microorganismos que pueden reducir nitrato hasta amonio, manteniendo el nitrgeno en el
ecosistema (reduccin asimilatoria del nitrato).
Si un suelo queda anegado se producen condiciones anaerbicas y ocurre la desnitrificacin,
principalmente si es rico en materia orgnica. Tambin sucede cuando se originan puntos de
anaerobiosis por otras causas. Como los productos de la desnitrificacin son gaseosos se
escapan del suelo disminuyendo el contenido en nitrgeno del mismo. En el laboratorio tales
gases quedan atrapados en la campanita del medio de cultivo.
Fijacin de nitrgeno molecular
La utilizacin de este como fuente de nitrgeno es una propiedad que poseen ciertas bacterias
y cianobacteras. A continuacin se da una lista abreviada de organismos fijadores de nitrgeno
de vida libre.

Algunos gneros de bacterias con especies fijadoras de nitrgeno
Aerobios Anaerobios
Heterotrficos Fotosintetizadores Heterotrficos Fotosintetizadores
Azotobacter cianobacterias Clostridium Chromatium
Klebsiella Chlorobium
Beijerinckia Rhodospirillum
Bacillus Heliobacterium
Azomonas
Azospirillum (microaerfilo)

El nitrgeno es reducido a amonio en el proceso de fijacin catalizado por el complejo
nitrogenasa, uno de cuyos componentes protenicos contiene molibdeno, los otros hierro. La
enzima es inactivada por el oxgeno. El nitrgeno molecular es muy inerte y su reduccin
requiere mucha energa.
Azotobacter crece en un medio liquido sin agitacin, en forma de una pelcula superficial. Es
bastante sensible a la acidez pues no suele crecer por debajo de pH 6. Al microscopio se
observan bacilos gram-negativos, grandes, de 4 a 6 m de largo, acompaados de clulas de
mayor tamao con paredes gruesas y apariencia de levadura, conocidas como cistos. Esta
bacteria tiene una gran capacidad respiratoria, medida como velocidad de consumo de oxigeno,
para proveer la energa requerida por la fijacin.
Los clostridios fijadores no slo son incapaces de crecer en presencia de aire sino que
generalmente son muertos por el oxgeno, a menos que se encuentren en forma de endosporos,
pero pueden crecer por debajo de la pelcula de Azotobacter, generando burbujas de gas por la
fermentacin de azcares.
Sulfo-oxidacin
El sulfuro de hidrgeno, el azufre elemental y el ion sulfato son tres formas estables
importantes del azufre. El sulfuro de hidrgeno es txico para la mayora de los organismos y
los sulfuros son oxidados a sulfato por bacterias aerobias del gnero Thiobacillus y azufre
elemental por bacterias fotosintetizadoras anaerobias de ambientes acuticos, el que se acumula
en la clula, sufriendo una posterior oxidacin en algunos casos. La mayora de los
microorganismos oxidantes del azufre son auttrofos obligados.
Sulfato-reduccin
El sulfato y otros compuestos oxigenados del azufre, pueden ser reducidos a sulfuro de
hidrgeno por bacterias heterotrficas anaerobias. Esta actividad microbiana es muy evidente
en los barros del fondo de estanques y lagos. Suelen usar hexosas, alcoholes o cidos orgnicos
como fuente de carbono, pero algunas especies crecen autotrfi camente con hidrgeno
molecular y tiosulfato, por ej. Desulfovibrio.

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 18
Celulolisis, amilolisis
El almidn y la celulosa estn compuestos por unidades de glucosa, pero conectadas de
diferente manera: uniones 1,4 - y 1,4 -glucosidicas respectivamente, lo que afecta a sus
propiedades. La celulosa es insoluble y se digiere a mucho menor velocidad que el almidn
soluble. La celulosa forma largas fibrillas a las que se encuentran intimamente asociados los
microorganismos que la degradan. Muchos hongos son celulolticos, pero entre las bacterias
esta propiedad est restringida a unos pocos grupos: mixobacterias, clostridios y actinomicetos.
El almidn, en cambio, es hidrolizado por muchos hongos y bacterias.
Las bacterias celulolticas predominan en la zona radicular y su densidad decrece en
muestras tomadas a cierta distancia de la planta. Por otra parte, es el proceso fundamental
que ocurre durante el compostaje de residuos agrcolas, donde predominan los
microorganismos termfilos.
Solubilizacin de fosfatos
Algunos mohos comunes, por ej. Penicillium, Aspergillus, Fusarium, pueden solubilizar fosfatos
insolubles como polvo de huesos y apatita. Aproximadamente un dcimo de las bacterias del
suelo tambin los solubilizan. La solubilizacin de fosfato de calcio se aprecia como zonas claras
que rodean las colonias y generalmente se produce cuando los microorganismos forman cidos
orgnicos tales como cido 2-ceto-glucnico (bacterias), c. citrico u oxlico (hongos), pero stos
son rpidamente degradados por otros organismos del suelo. Los fosfatos de hierro y aluminio
pueden ser solubilizados por los microorganismos productores de sulfuro de hidrgeno.
Procedimiento
Fijacin de nitrgeno molecular
El medio contiene: manitol 10 g, carbonato de calcio 0,5 g, solucin salina 50 mL, solucin de
oigoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en matraces de Erlenmeyer de 250 mL de
capacidad, a razn de 50 mL en cada uno y se esteriliza a 110C durante 20 minutos. Sembrar
unos granulos de suelo e incubar a 25-27C durante 7 das.
La solucin salina contiene: fosfato dipotsico 5 g, sulfato de magnesio heptahidrato 2,5 g,
cloruro de sodio 2,5 g, sulfato ferroso heptahidrato 0,05 g, agua 1 L, pH 7 - 7,5.
La solucin de oigoelementos contiene 0,05 g/ L de las sales siguientes: molibdato de potasio,
borato de sodio, nitrato de cobalto, sulfato de cadmio, sulfato de cobre, sulfato de zinc, sulfato
de manganeso, cloruro frrico.
Hacia el tercer da el medio se enturbia ligeramente y en la superfiie aparece un velo grisceo.
Los das siguientes el velo se pliega, dando una superficie rugosa y mamelonada que se vuelve
parduzca. Finalmente caen trozos de velo dentro del liquido. A su vez el liquido se enturbia
cada vez ms y suelen aparecer burbujas en el fondo. La observacin microscpica del velo
muestra clulas bacilares, ovales, cocoides y a veces cistos esfricos, mientras que el material
tomado del fondo permite ver bacilos esporulados Gram-positivo o variable.
Medio para Azotobacter: sacarosa 20 g, fosfato dipotsico 0,05 g, fosfato monopotsico 0,15
g, cloruro de calcio 0,01 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,2 g, molibdato de sodio 0,002 g,
cloruro frrico 0,01 g, azul de bromotimol (al 0,5% p/ v en etanol) 2 mL, carbonato de calcio 1 g,
agua 1 L, pH 6,8. Esterilizar a 110C durante 20 minutos.
Medio para Derxia: Reemplazar la sacarosa por almidn o glucosa y omitir el carbonato de
calcio.
Medio para Azospirillum: cido mlico 5 g, fosfato dipotsico 0,5 g, sulfato de magnesio
heptahidrato 0,2 g, cloruro de sodio 0,1 g, cloruro de calcio 0,02 g, molibdato de sodio 0,002 g,
sulfato de manganeso 0,01 g, etiln-diamino-tetra-acetato frrico (al 1,64% p/ v) 4 mL, azul de
bromotimol (al 0,5% p/ v en etanol) 3 mL, biotina 0,1 mg, agua 1 L, pH 6,8.
Medio para Clostridium pasteurianum: glucosa 10 g, fosfato monopotsico 0,75 g, solucin
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 19
salina 50 mL, solucin de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Distribuir en tubos con campanita de
Durham. Luego de sembrar cubrir con agar al 1,5% fundido o vaselina estril.
Desnitrificacin
El medio de cultivo contiene: nitrato de potasio 2 g, carbonato de calcio 5 g, glucosa 10 g,
solucin salina 50 mL, solucin de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Los tubos llevan dentro una
campanita de vidrio y se esterilizan a 110C durante 20 minutos. Inocular unos grnulos de
suelo sin agitar e incubar una semana a 25-27C.
Si se ha reducido el nitrato hasta el estado de nitrgeno molecular u xido de nitrgeno
quedarn retenidos en la campanita inmersa en el tubo. La formacin de nitritos se comprueba
agregando 1 mL del reactivo de Griess al tubo de cultivo. Aparecer un color rosado si hay
nitritos.
Preparar el reactivo de Griess en el momento de usarlo, mezclando partes iguales de las
soluciones siguientes:
o Disolver 0,05 g de naftilamina en 100 mL de cido actico al 30% (v/ v) en agua.
o Disolver 0,32 g de cido sulfanilico en 100 mL de cido actico al 30% (v/ v) en agua.
Nitrificacin
El medio de cultivo para formadores de nitritos contiene: sulfato de amonio 0,5 g, carbonato
de calcio 1 g, solucin salina 50 mL, agua 1 L. Se distribuye en matraces de Erlenmeyer de 250
mL de capacidad, a razn de 50 mL en cada uno.
El medio para productores de nitratos contiene 1 g de nitrito de sodio en lugar del sulfato de
amonio. Esterilizar a 110C durante 20 minutos.
Sembrar unos grnulos de suelo en ambos matraces e incubar a 25-27C durante dos semanas.
Formadores de nitritos. Volcar 5 mL del cultivo en un tubo de ensayo y agregar 1 mL del
reactivo de Griess recien preparado. Aparecer un color rosado si se han formado nitritos por
accin microbiana.
Formadores de nitratos. Transferir unos 5 mL del cultivo a un tubo de ensayo y agregar 1 mL
del reactivo de Griess. Si esta reaccin da negativa los microorganismos han oxidado los nitritos
a nitratos. Colocar otros 5 mL de cultivo en un tubo, agregar unos 50 mg de urea y 10 gotas de
acido sulfrico. Calentar para eliminar los nitritos. Luego aadir 1 mL de reactivo difenilamina
por las paredes del tubo. Si en la zona de contacto aparece un color azul hay nitratos formados
por accin microbiana.
El reactivo difenilamina contiene: difenilamina 1 g, agua destilada 20 mL, cido sulfrico 100
mL. Colocar en frasco obscuro.
Amonificacin
El medio de cultivo contiene peptona 0,2 g, solucin salina 50 mL, solucin de
oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en tubos y se esteriliza a 110C durante 20
minutos. Sembrar unos grnulos de suelo e incubar una semana a 25-27C.
Despus agregar 1 mL de reactivo de Nessler a cada tubo a ensayar. La aparicin de un color
ladrillo indica la presencia de amoniaco.
El reactivo de Nessler consta de dos soluciones que se mezclan en partes iguales en el
momento de usar.
o Colocar en un mortero 5 g de ioduro mercrico y 3,65 g de ioduro de potasio, aadir un
poco de agua destilada y triturar hasta disolver. Completar a 100 mL con agua.
o Disolver 15 g de hidroxido de potasio en lentejas en 100 mL de agua destilada.
Celulolisis
El medio de cultivo contiene: nitrato de amonio 1 g, solucin salina 50 mL, solucin de
oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en tubos con tiras de papel de 1 x 10 cm y esteriliza
a 110C durante 20 minutos. Sembrar unas gotas de una suspensin de suelo, que haya sido
abonado con estircol, e incubar dos a tres semanas a 25-27C.
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 20
Donde el papel sobresale del lquido se acumulan las bacterias celulolticas aerobias y suelen
colorearlo. Sacar la tira de papel y colocarla en un portaobjetos para observar el ataque de las
fibras bajo la lupa. Comprobar si se disgrega con facilidad al tocarla con el asa.
Medio para clostridios : sulfato de amonio 0,5 g, cloruro de sodio 0,1 g, fosfato dipotsico 0,7
g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,05 g, cloruro de calcio 0,05 g, celulosa en polvo 3 g,
carboximetilcelulosa 1 g, extracto de levadura 1 g, azul de metileno (0,005% p/ v) 1 mL, agar 15
g, agua 1 L, pH 7,0; esterilizar a 121C durante 15 minutos. Agregar 0,5 mL de clorhidrato de
cistena (al 1% p/ v) a cada tubo con 10 mL de medio estril fundido, sembrar de inmediato con
unas gotas de la suspensin de suelo y colocar en agua fra para una rpida gelificacin.
Amilolisis
El medio de cultivo contiene: almidn soluble 2 g, nitrato de amonio 1 g, solucin salina 50
mL, solucin de oligoelementos 1 mL, agar 15 g, agua 1 L. Esterilizar a 110C durante 20
minutos. Distribuir en cajas de Petri. Sembrar con unos grnulos de suelo e incubar a 25-27C.
Cubrir la superficie con solucin acuosa de yodo, por ejemplo la de Lugol. La zona de
hidrlisis alrededor del crecimiento microbiano aparece clara sobre un fondo azul.
Sulfato-reduccin
El medio de cultivo contiene: cloruro de amonio 1 g, fosfato dipotsico 0,5 g, sulfato de
magnesio heptahidrato 2 g, sulfato de sodio 0,5 g, cloruro de calcio 0,1 g, lactato de sodio (al
60% p/ v) 6 mL, extracto de levadura 1 g, tioglicolato de sodio 1 g, agua 1 L. Repartir en tubos
colocando 10 mL en cada uno. Esterilizar a 110C durante 20 minutos. Sembrar con unos
grnulos de suelo e introducir un clavo previamente pasado por la llama y enfriado. Cubrir con
agar al 1,5% fundido o vaselina. Incubar dos o tres semanas a 25-27C. Ver si el clavo se ha
ennegrecido por la formacin de sulfuro de hierro debido a los microorganismos.
Sulfo-oxidacin
El medio de cultivo contiene: fosfato dipotsico 0,25 g, cloruro de magnesio 0,1 g, cloruro de
sodio 0, 1 g, nitrato de amonio 2 g, carbonato de calcio 5 g, agua destilada 1 L. Repartir en tubos
a razn de 5 mL en cada uno y esterilizar 20 minutos a 110C. Agregar a cada tubo 1 mL de una
solucin a 10% de monosulfuro de sodio y sembrar unos grnulos de suelo. Incubar a 25-27C
durante dos a tres semanas.
Volcar 2 mL del cultivo en otro tubo, acidificar con dos gotas de cido clorhdrico concentrado
y aadir 5 gotas de solucin acuosa de cloruro de bario al 5%. p/ v. La aparicin de una
opalescencia indica que se han formado sulfatos por la actividad microbiana.
Solubilizacin de fosfatos
El medio de cultivo contiene: extracto de levadura 2 g, glucosa 20 g, agar 15 g, agua 1 L,
fosfato triclcico 2 g. Se esteriliza a 110C durante 20 minutos y se distribuye en caja de Petri.
Sembrar unos grnulos e incubar a 25-27C.
Observar la formacin de una zona transparente alrededor de las colonias.
Bibliografa
o Fenchel T et al. Bacterial Biogeochemistry: The Ecophysiology of Mineral Cycling. Academic Press, San Diego,
1998.
o Alef K & Nannipieri P. Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press, London, 1995.
o Frioni L. Ecologa Microbiana del Suelo. Universidad de la Repblica, Montevideo, 1990.








Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 21
TRABAJO N 5. Inhibidores y desinfectantes
Objetivo. Determinar la concentracin inhibitoria mnima y la concentracin letal mnima de
productos comerciales usados en el campo.
Introduccin
Los agentes que producen efectos reversibles causan inhibicin sin
accin mortal inmediata. Los bacteriostticos actan sobre las
bacterias y los fungistticos sobre los hongos. Los compuestos de
accin irreversible causan la muerte rpida. Los bactericidas y
fungicidas matan bacterias y hongos, respectivamente (figura 14).
La diferencia es cuantitativa ms que cualitativa. La adicin de 0,3%
de fenol impide el crecimiento de Escherichia coli, pero no mata las
clulas en varias horas mientras que 1% las elimina en minutos
(figura 15).
La palabra desinfeccin se emple para expresar la
eliminacin de cualquier agente que pudiera causar
infeccin o enfermedad. Los desinfectantes son agentes de esterilizacin. Las
clulas activas jvenes tienen una notable sensibilidad a estas substancias. La
desinfeccin es ms rpida al aumentar la temperatura del sistema. El medio en
que se encuentran los microrganismos puede alterar la eficacia de la
desinfeccin, por combinacin del material orgnico con el agente activo.
Tambin el pH modifica los mecanismos de desinfeccin.
Los endosporos bacterianos son ms difciles de destruir que las clulas
vegetativas. Tambin presentan cierta resistencia los organismos encapsulados.
Otro factor que posibilita la desinfeccin es un contacto eficaz. La humedad es
esencial y los agentes tensoactivos mejoran dicho contacto.
Las pruebas de la concentracin inhibitoria mnima (CIM) y la concentracin letal mnima
(CLM) son tiles para comparar la eficacia de diversos productos qumicos contra un organismo
determinado, o la sensibilidad de diferentes organismos a un mismo producto.
Los microorganismos comnmente usados son cepas de coleccin de Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, para establecer la accin
frente a organismos coliformes, seudomnadas, clostridios y otros aerobios, respectivamente.
El tamao del inculo suele ser de 10
4
a 10
6
/ mL, segn el microorganismo y la substancia
estudiada.
Procedimiento
Concentracin inhibitoria mnima
Preparar una solucin al 1/ 10 p/ v v/ v del compuesto en agua destilada estril. Si se trata de
un curasemillas con un principio activo poco soluble, usar alcohol o acetona al 1/ 2 v/ v en esta
primera dilucin.
Poner 1 mL de la solucin 1/ 10 en cada uno de los 9 tubos de ensayo estriles. Aadir al
primer tubo 1 mL de agua destilada estril, al segundo 2 mL, al tercero 3 mL y as
sucesivamente hasta agregar al noveno 9 mL, obteniendo diluciones que van desde 1/ 20 a
1/ 100.
Transferir 1 mL de la dilucin original al 1/ 10, y 1 mL de cada una de las otras diluciones a
sendos tubos con 9 mL de caldo nutritivo (en el caso del desinfectante) o agua estril (en caso
del curasemillas), comenzando por la ms diluida.. Las diluciones obtenidas van de 1/ 100 a
1/ 1000.
Figura 15
Figura 14
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 22
Bacterias
Aadir 0,1 a 0,2 mL de un cultivo de 24 hs en caldo, de Staphylococcus aureus o Escherichia coli, a
un tubo con 9 mL de caldo nutritivo de tal manera que se obtenga un suspensin de turbiedad
poco apreciable a simple vista. Luego transferir 0,2 mL de esta suspensin bacteriana a cada uno
de los tubos con diluciones de desinfectante en caldo. Incubar a 35C durante 48 hs.
Hongos
Agregar agua estril (con 0,05% v/ v de Tween 80) al tubo de cultivo de 5 das a 25C en medio
de Czapek o Sabouraud, de Penicillium expansum, Aspergillus flavus o Cladosporium
cladosporioides, agitando para suspender los esporos. Aadir 0,5 a 1 mL de la suspensin de
esporos a un matraz con 50 mL de agar de Sabouraud, fundido y enfriado a 45-50C. Mezclar y
volcar en cuatro cajas de Petri estriles.
Una vez gelificado, se depositan discos de papel de filtro de 4 mm de dimetro previamente
humedecidos con las diluciones del producto, a razn de tres discos por placa. Se incuba a 25-
28C durante 5 das.
Concentracin letal mnima
Preparar, como se indic arriba, una serie de tubos con 10 mL de cada una de las diluciones
del compuesto, que van desde 1/ 100 a 1/ 1000, utilizando agua estril en lugar de caldo.
Adicionar a cada dilucin 0,2 mL de una suspensin bacteriana preparada como se describi
arriba. Anotar la hora a la cual se agreg al primer tubo, y a intervalos de 2, 5, 10 y 15 minutos
cargar un asa (con un dimetro interno de 4 mm) de cada dilucin y llevar a un tubo de caldo
nutritivo que contiene 0,1 % p/ v de cido tiogliclico para neutralizar la accin del
desinfectante remanente. Incubar a 35C durante 48 hs.
Bibliografa
o Collins CH, Lyne PM, Grange JM. Collins and Lynes Microbiological Methods. 7 ed. Butterworth Heinemann,
Oxford, 1999
o Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962













Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 23
TRABAJO N 6. Digestin anaerbica de residuos agrcolas
Objetivo. Transformar los residuos agrcolas en biogas y un lodo til como fertilizante.
Introduccin
Se emplea estircol, paja y lodo procedente de otro digestor. El gas formado en la
fermentacin metanica es una mezcla de metano y dixido de carbono. Las denominadas
bacterias metnicas implicadas pertenecen a los gneros Methanococcus, Methanobacterium,
Methanosarcina y otros. Dependiendo de la composicin del material de partida, se puede
producir biogas con alrededor de 70%. de metano. Estas bacterias son anaerobias estrictas y
reducen al dixido de carbono.
Las bacterias metnicas se diferencian de las dems debido a su peculiar estructura de la
pared y la membrana celular, y forman parte de las arqueobacterias junto a las termfilas y las
halfilas. Se encuentran en el rumen, los sedimentos de aguas estancadas y en los digestores de
las depuradoras de aguas residuales.
Las metanobacterias slo podrn desarrollarse cuando por accin de las bacterias facultativas
se haya consumido todo el oxgeno, y las fermentadoras hayan producido suficiente dixido de
carbono e hidrgeno a partir de almidn, celulosa o aminocidos.
Las bacterias metnicas son sensibles al descenso del pH producido por los cidos orgnicos
formados por los clostridios. Pero en un sistema en equilibrio consumen los cidos a medida
que aparecen manteniendo un ambiente neutro.
Las instalaciones pequeas de biogs permiten la obtencin de energa en zonas rurales.
Procedimiento



















Equipo de digestin: 1 fermentador, 2 mecanismo de agitacin con varilla, 3 material a fermentar, 4 bao
de agua, 5 acuario, 6 calentador conectado a una bomba de circulacin, 7 termmetro y termostato, 8
depsito de gas (neumtico de bicicleta), 9 frasco lavador (indicador de gas y lavado de CO2), 10 frasco
lavador abierto (para equilibrar la presin), 11 llave de triple va, 12 tubo de vidrio con virutas de hierro
(arrestallamas), 13 mechero.

Colocar en un frasco de 1 L, unos 200 g de estircol fresco de vaca, 25 g de paja cortada en
trozos pequeos y agua hasta unos 5 cm de la boca. Poner un tapn atravesado por un agitador
y un tubo para la salida de los gases.
Instalar el fermentador en un bao de agua a 37C. Unir la salida a un frasco lavador y ste a
otro frasco abierto para equilibrar la presin, y a una llave de triple via que est conectada al
Figura 16
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 24
depsito de gas y al mechero. Entre el mechero y la llave de triple via se coloca un tubo de
vidrio lleno con virutas de hierro para evitar el retroceso de la llama. Controlar la hermeticidad
de todos los cierres.
Agitar diariamente la mezcla en descomposicin. Luego de uno o dos das vaciar la cmara
para eliminar la mezcla explosiva de biogs y aire. Dejar hasta que se llene nuevamente el
depsito y comprobar cmo arde el biogs a la salida del mechero. Controlar diariamente el
nivel de agua del bao, la temperatura y la cantidad de gas.
Bibliografa
o Madigan TM et al. Brock- Biologa de los Microorganismos. Prentice Hall, Madrid, 1998
o Jagnow G, Dawid W. Biotecnologa. Acribia, Zaragoza, 1991






















Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 25
TRABAJO N 7. Morfologa microscpica de hongos
Objetivo. Conocer las estructuras microscpicas de mohos, levaduras y setas.
Introduccin
Micelio es el cuerpo filamentoso de un hongo y un trozo del mismo se denomina hifa. Las
hifas pueden presentar septos y entonces el micelio est tabicado. Si los tabiques estn ausentes
es un micelio contnuo. Rizoides son las hifas de succin que penetran en el substrato.
Apresorios son unas hifas achatadas de sostn que se adhieren al hospedador o substrato.
Cuando el cuerpo del hongo es una sola clula se lo llama levadura. Los cortos filamentos
formados por las clulas brotantes de la levadura se conocen como pseudomicelio.
Plectnquima es un conjunto de hifas que se asemeja a un tejido. Esclerocio es un plectnquima
generalmente macroscpico que puede permanecer largo tiempo con vida latente.
Clamidospora es una clula de resistencia, terminal o intehifal, con pared gruesa y substancias
de reserva. Las esporas son los elementos de multiplicacin de los hongos. De acuerdo a su
forma y origen reciben distinto nombre como se observa en la figura 17 .
Anamorfo es el hongo con reproduccin asexuada o mitosprica. Los conidios son mitosporas
que se hallan ssiles o sobre un
conidiforo (simple o ramificado), o
dentro del plectnquima de un picnidio.
Un esporangio contiene numerosos
mitosporas dentro de una membrana
peridial simple.
Teleomorfo es el hongo con
reproduccin sexuada o meiosprica.
Las ascosporas son meiosporas que se
encuentran dentro de los ascos libres de
las levaduras, o los ascos encerrados en
el plectnquima de un ascoma o sobre el
mismo. Las basidiosporas surgen de los
esterigmas del basidio donde ocurri la
meiosis. Los basidios generalmente se
encuentran sobre laminillas, tubos o
espinas del basidioma.
Las figuras 17 y 18a muestran
esquemas de diversas estructuras
fngicas. Los conidiforos simples son cortos filamentos que generalmente nacen
perpendiculares a la hifa y originan en su extremo el o los conidios. Los ramificados suelen
terminar en ramas con forma de botelln (filides) de donde surgen los conidios. Algunas
estructuras son tpicas de gneros comunes y llevan su nombre: cabeza aspergilar, penicilio.
Tambin los conidiforos simples o ramificados suelen estar reunidos en: coremio (como un
fsforo), esporodoquio (como una almohadilla), picnidio (dentro de un plectnquima con forma
de pera).
Un esporangio contiene innumerables esporas, pero un esporangiolo slo contiene tres o
cuatro y se encuentra en el pice de una rama lateral del esporangiforo. La columela es la
punta dilatada del esporangiforo y est dentro de la esfera del esporangio. En algunos casos,
unas pocas esporas estn reunidas en merosporangios (bolsitas como dedos de guante) que se
asientan sobre la columela.
Los ascomas tienen distinta forma: cleistotecio (cerrado) que se rompe al madurar las esporas,
peritecio (forma de pera) con abertura u ostolo por donde salen las esporas maduras, apotecio
(forma de copa) con los ascos expuestos.
Figura 17
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 26
Los basidiomas ms conocidos
son: el champin con laminillas
en la parte inferior del sombrero
donde se originan las esporas, el
boleto con poros en vez de
laminillas, la bola de nieve que al
romperse libera las esporas
maduras (figura 18b). Hay otras
formas como el basidioma
excntrico de los pleurotos, los
estantes rgidos que crecen sobre
troncos, las formas gelatinosas.


Procedimiento
Microcultivos
Observar los microcultivos con el objetivo 4x y una vez enfocada una estructura prxima al
cubreobjetos o adherida al mismo, pasar al objetivo 10x. Luego para ver detalles se puede pasar
al objetivo seco de mayor aumento, si la distancia focal de la lente lo permite.
Preparaciones
Hacer preparaciones en fresco colocando un trozo de micelio en una gota de lactofenol, o
colorante de Guegun, y desagregar con ayuda de dos agujas, montadas en sendos mangos.
Poner un cubreobjetos y observar al microscopio. Dibujar las estructuras vistas.
El lactofenol contiene: cido lctico 100 mL, fenol 20 g, glicerol 50 mL, agua 40 mL.
Bibliografa
o Deacon JW . Introduccin a la Micologa Moderna. Limusa-Noriega, Mxico, 1993
o Alexopoulos CJ. Introduccin a la Micologa. EUDEBA, Buenos Aires, 1966






Figura 18a
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 27
TRABAJO N 8. Mohos toxignicos
Objetivo. Reconocer los mohos comunes que deterioran los granos y forrajes almacenados pues
suelen producir toxinas que afectan al hombre y los animales.

Introduccin
Los problemas causados por los hongos en alimentos y forrajes son numerosos. Los causados
por micotoxinas son, con frecuencia, costosos debido a que se descubren muy tarde para
prevenir las prdidas econmicas.
Una herramienta importante en el control micolgico de cereales y especias, es el uso de
mtodos simples de identificacin especfica que se realiza en base al aspecto de las colonias y la
micromorfologa en varios medios de cultivo a distintas condiciones de incubacin.

















Procedimiento
Hacer repiques de un cultivo puro en tres puntos equidistantes de cada placa con los medios:
agar malta, agar Czapeck, agar Czapeck glicerol, agar papa sacarosa, e incubar a 25C durante 7
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 28
dias. Adems repicar en estras sobre dos tubos de agar malta o Czapeck e incubar uno a 5C y
el otro a 37C. El cultivo en agar papa sacarosa se incuba a la temperatura ambiente con luz
solar indirecta.
La composicin de los medios de cultivo es la siguiente:
Agar malta: extracto de malta 20 g, peptona 1 g, glucosa 20 g, agar 20 g, agua destilada 1 litro;
esterilzar a 121C durante 15 minutos.
Solucin concentrada de Czapeck: nitrato de sodio 30 g, cloruro de potasio 5 g, sulfato de
magnesio 5 g, sulfato ferroso 0, l g, agua destilada 100 mL; mantener a la temperatura ambiente.
Agar Czapeck: fosfato dipotasico 1 g, solucin de Czapeck 10 mL, extracto de levadura 5 g,
sacarosa 30 g, agar 15 g, agua destilada 1 litro; esterilizar a 121C durante 15 minutos.
Agar Czapeck glicerol: disolver las sales y extracto, como el anterior, en una mezcla de 250
mL de glicerol y 750 mL de agua destilada; esterilizar de igual manera.
Agar papa sacarosa: hervir 200g de papa rallada en 1 L de agua, durante media hora, y
completar el volumen a un litro, aadir 10 g de sacarosa y 15 g de agar, esterilizar a 110C
durante 20 minutos.
Observar y registrar el aspecto macromorfolgico de las colonias. Hacer preparaciones en
fresco con lquido de Patterson o colorante de Guegun. Observar al microscopio y dibujar las
estructuras. Si es necesario prolongar la incubacin.
Consultar las claves de la bibliografa para identificar el gnero (si es posible la especie) y
cules son las micotoxinas que producen.
Bibliografa
o Pitt JI, Hocking AD. Fungi and food spoilage. Blackie A&P, London, 1997
o Carrillo L. Los hongos de los Alimentos y Forrajes. 2002 http:/ / www.unsa.edu.ar (material
bibliogrfico)













Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 29
TRABAJO N 9. Micorrizas
Objetivo. Observar los hongos asociados con plantas herbceas y rboles constituyendo las
micorrizas. Preparar un inoculante para ectomicorrizas.
Introduccin
Las plantas parecen totalmente autnomas, pero la mayora estn asociadas con hongos, en
sus races formando micorrizas o, endfitos dentro del tallo.
Endomicorrizas
Cuando el hongo penetra en el interior de las clulas de la raz, formando minsculas
arborescencia y vesculas, se las llama endomicorrizas vesculo - arbusculares. Los arbsculos
suelen tener una vida efmera, de algunos das a pocas semanas, siendo luego digeridos por el
hospedador. Los hongos de este tipo de micorrizas, generalmente presente en la vegetacin
herbcea, pertenecen a la familia de la endogonceas.
Hay otros tipos de endomicorrizas como las que forman ovillos intracelulares en las orqudeas
Cada una de las diferentes especies de orqudeas tiene una alta especificidad por un hongo
particular que generalmente es un zigomiceto. El grado de interdependencia es tal que en
muchos casos ninguno de los asociados puede ser cultivado sin el otro, pues forman una
verdadera simbiosis.
Las races se infectan con hongos de las micorrizas vesculo-arbusculares por las hifas
desarrolladas a partir de propgulos presentes en el suelo, los que pueden ser esporos o
estructuras de resistencia presentes en las races muertas.
Ectomicorrizas
En ellas el hongo rodea la raz con un manto de filamentos y una red miceliar penetra entre las
clulas radicales pero no dentro de ellas. Los hongos que forman ectomicorrizas en rboles son
macrocrpicos y tpicamente basidiomicetos superiores, por ejemplo Amanita, Boletus, Pisolithus,
Suillus. Ms raramente los ascomicetos forman micorrizas, por ejemplo Tuber. Es poca la
especificidad de estas asociaciones ya que varios rboles pueden formar micorrizas con un
hongo dado y viceversa. Algunas especies de rboles, por ej. los eucaliptos, poseen a la vez ecto-
y endo-micorrizas.
Inoculacin
La falta de micorrizacin acarrea problemas en el transplante de las plntulas de rboles y
plantas ornamentales, excepto en los casos en que el suelo contenga especies fngicas. Para
inocular con cultivos puros, el substrato (suelo, turba) debe ser previamente pasterizado con el
fin de disminuir la poblacin fngica nativa competitiva.
Los hongos son incorporados al substrato de siembra como trozos de races micorrizadas,
pedazos de ascoma o basidioma, o micelio obtenido in vitro. El agregado de micelio ofrece
mayores garantas en el caso de hongos que se desarrollan bien en cultivo axnico. El primer
paso de toda inoculacin consiste en la seleccin del hongo. Los siguientes obtener el cultivo y
multiplicarlo para aadirlo al suelo donde se coloca la plntula crecida en condiciones aspticas.
Procedimiento
Observacin de micorrizas
Lavar la raz con agua corriente. Observar su aspecto y seleccionar un trozo. Cortar en
porciones de un centmetro de largo y colocarlos en solucin de hidrxido de sodio o potasio al
10% p/ v. Calentar a 90C durante 30 minutos o ms si es necesario. Cuando el material es
obscuro sumergirlo en agua oxigenada de 10 volmenes durante 15 minutos, sino omitir este
paso. Lavar 4 veces con agua corriente. Poner los trozos en solucin de cido clorhdrico 0,1 N
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 30
durante 10 minutos. Colorear con azul -lactofenol a 90C por 5 minutos. Pasar a lactofenol.
Colocar un trozo de la raz tratada entre dos portaobjetos y aplastarla. Observar al
microscopio entre porta y cubreobjetos.
El lactofenol contiene: cido lctico 100 ml, fenol 20 g, glicerol 50 mL, agua 40 ml. La
solucin colorante se prepara mezclando 5 mL de solucin acuosa de azul de algodn o azul
tripn o azul de metilo al 1% p/ v, con 95 mL de lactofenol.
Preparacin del inoculante para ectomicorrizas
Cortar el basidioma con un instrumento previamente mojado en alcohol y encendido. Con un
gancho o pinza estril tomar porciones del interior del sombrero y depositarlas sobre la
superficie de una placa de agar malta levadura. Incubar a 25-27C, dos o ms semanas en la
obscuridad.
El agar malta levadura contiene: extracto de malta 20 g, extracto de levadura 2 g, agar 20 g,
agua 1 L. Se esteriliza a 121C durante 15 minutos.
Repicar en 50 ml de medio lquido de Melin Norkrins modificado en un matraz de Erlenmeyer
de 250 mL e incubar a 25-27C con una agitacin de 100 rpm y en la obscuridad, el tiempo
requerido para un buen crecimiento.
El medio lquido de Melin Norkins modificado contiene cloruro de calcio 0,05 g, cloruro de
sodio 0,025 g, fosfato monopotsico 0,5 g, fosfato diamnico 0,25 g, sulfato de magnesio
heptahidrato 0,15 g, cloruro frrico (al 1% p/ v) 1,2 mL, extracto de malta 1,5 g, sacarosa 10 g,
agua 1 litro. Esterilizar a 110C durante 20 minutos.
Homogeinizar el cultivo, mezclar con suelo pasterizado previamente con vapor de agua a
60C. Llenar unas macetas pequeas y colocar los plantines. Llevarlos al invernculo.
Bibliografa
o Deacon JW Introduccin a la Micologa Moderna. Limusa-Noriega, Mxico, 1993
o Frioni L. Ecologa Microbiana del Suelo. Universidad de la Repblica, Montevideo, 1990


























Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 31
TRABAJO N 10. Microorganismos del agua
Objetivo. Conocer la probable contaminacin del agua con patgenos, a travs de la bsqueda de
microorganismos indicadores y otros.
Introduccin
El agua es un sistema ecolgico en equilibrio que constituye la base de todas las comunidades
vivas. Como es indispensable se procura aumentar sus recursos, especialmente almacenndola,
y mejorar su calidad mediante purificacin. El anlisis biolgico del agua para determinar la
calidad sanitaria utiliza mtodos que indican el grado de contaminacin con excrementos. Se
emplean tcnicas para la deteccin y recuento de organismos indicadores, porque
principalmente interesa conocer el peligro potencial de la transmisin de patgenos a travs del
agua, antes que la bsqueda de stos.
Coliformes
Los coliformes son bacterias de origen entrico que son capaces de fermentar la lactosa con
produccin de gas. Los gneros de enterobacterias incluidos en el grupo de los coliformes a
efectos de anlisis de aguas son Citrobacter, Enterobacter, Escherichiay Klebsiella. Este grupo es el
principal indicador de la conveniencia del agua para uso domstico, industrial u otro.
La prueba de fermentacin en una serie de tubos (caldo bilis lactosa verde brillante, caldo
McConkey, etc.) con determinacin del nmero ms probable (NMP) fue la primera usada,
luego se incorpor la tcnica de filtracin por membrana que, con algunas limitaciones, es
comparable a la anterior, y fi nalmente se introdujo el substrato cromognico ONPG (o-
nitrofenil--D- galactopiransido) al medio liquido para NMP. Comnmente para determinar
el NMP se realiza una prueba presuntiva basada en la fermentacin de la lactosa con
produccin de gas que queda atrapado en la campanita. La ausencia de gas se interpreta como
ausencia de coliformes, pero su presencia es una posibilidad de presuncin pero no de
seguridad puesto que algunas bacterias lcticas suelen producir gas. El medio de cultivo liquido
lleva un indicador de pH para facilitar la lectura y sales biliares para inhibir el desarrollo de las
bacterias no entricas. Los coliformes presentes en el intestino y las heces de animales de sangre
caliente, incluido el hombre, son capaces de producir gas al fermentar lactosa a 44,5C.
Ms especifica es la bsqueda de Escherichia coli por cultivo sobre placas de medios que
permiten la deteccin en 7 horas (m-7hFC) o en 2448 horas (EMB, Endo y otros), o bien un
medio liquido con el substrato fluorognico MUG (4-metilumberiferil--D-glucurnido)
especifico para bacterias con la enzima -glucuronidasa (24 hs a 44,5C). En los casos que se
requiere confirmar la presencia de E. coli se emplean las pruebas de: fermentacin de lactosa,
sorbitol y celobiosa, hidrlisis de ONPG, produccin de indol, viraje del rojo de metilo,
produccin de acetona, uso del citrato, motilidad, descarboxilacin de lisina y ornitina, oxidasa
y formacin de pigmento amarillo; las que permiten clasificar las especies de enterobacterias
presentes en aguas.
El significado de estos anlisis se basa en que la falta de coliformes implica una ausencia de
contaminacin fecal prxima o remota,mientras que su presencia no certifica una contaminacin
de aguas con materias fecales. En cambio, la presencia de Escherichia coli demuestra una
contaminacin fecal reciente.
Enterococos
Constituyen un grupo de estreptococos fecales que incluye S. faecalis, S. faecium, S. gallinarum y
S. avium. Se diferencian de los otros estreptococos por su capacidad para crecer en presencia de
6,5% cloruro de sodio, a pH 9,6, entre 10 y 45C. Son bacterias esfricas, gram positivas,
fisiolgicamente relacionadas con las bacterias lcticas que dan negativa la prueba de catalasa.
Como tienen requerimientos nutricionales ms complejos que otras bacterias difcilmente se
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 32
multiplican en el agua aunque resisten mejor la cloracin que Escherichia coli.
Los enterococos tambin son indicadores fecales, y para su anlisis se emplean pruebas de
cultivo en una serie de tubos de medio selectivo (caldo glucosa azida) para determinar el NMP
y la filtracin por membrana (agar mE, etc), siendo confirmado por repiques en agar bilis
esculina u otro medio especial, adems de la prueba de catalasa y la coloracin de Gram.
Los enterococos son indicadores que permiten determinar el grado de la contaminacin fecal.
Una relacin entre el nmero de coliformes fecales al nmero de enterococos, mayor que cuatro
indica contaminacin fecal humana, mientras que si es menor que uno sugiere otra fuente.
Clostridios
Clostridium perfringens tiene el mismo significado que los enterococos y una supervivencia
mucho mayor que cualquier otro indicador bacteriano de polucin fecal, debido a su capacidad
formadora de endosporos. En aguas naturales superficiales, no contaminadas, no se suele
detectar la presencia de estos microorganismos ni en grandes volmenes de muestra, aunque se
lo pueda observar en agua profundas.
La proporcin de clostridios frente a otros indicadores fecales es muy reducida. La deteccin
simultnea de Cl. perfringens y coliformes o E. coli constituye una clara evidencia del origen
fecal de la contaminacin. En cambio la presencia exclusiva de los clostridios debe interpretarse
como un indicio de contaminacin fecal remota. La existencia de endosporos de clostridios en
aguas tratadas carece de significado.
El ensayo se funda en el sistema enzimtico de la sulfito-reductasa que en el caso de Cl.
perfringens es estrictamente endocelular, y la reduccin de sulfito a cido sulfhdrico solo tiene
lugar en contacto con la colonia y el ennegrecimiento en una zona muy prxima ella, si en el
medio existen sales solubles de hierro. Otros esporulados tambin suelen reducir el sulfito.
Pseudomonas spp.
En las aguas se suele buscar Pseudomonas aeruginosa, un organismo asociado al tracto
respiratorio superior o la piel, que se comporta como patgeno oportunista. Su presencia es
poco favorable para la calidad del agua.. Es un indicador primario de la eficiencia de la
desinfeccin, mientras que los coliformes son indicadores de la contaminacin de las
superficies.
Se emplea tanto el mtodo de siembra en una serie de tubos de medio lquido (caldo
asparagina u otro) para determinar el NMP, como la tcnica de filtracin por membrana (agar
M-PA). Para la confirmacin se suele usar caldo acetamida, agar leche, agar King A y B, agar
King A- cetrimida. El bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio (Cetrimide) es un agente
antibacteriano de amplio espectro que no afecta a la especie citada por lo que se adiciona en
cantidades de 0,1 - 0,3 g/ L de medio King A para el aislamiento.
Las colonias tpicas de estos bacilos Gram negativos son de bordes generalmente irregulares
que tiene tendencia a difundirse, las cepas no pigmentadas dan colonias translcidas, las otras
pueden estar teidas de verde o parduzco. El pigmento colorea a la porcin del medio que
rodea a la colonia.
Pseudomonas aeruginosa forma piocianina que tiene un color azul-verdoso y difunde en el
medio cuya produccin se ve favorecida en un medio (King A) que contiene sulfato de potasio,
cloruro de magnesio y glicerol y no incluye nitratos ni sales de sodio pues actan como
inhibidores. Este pigmento es soluble en agua y cloroformo. La solucin azulada se colorea de
rojo por el agregado de cidos.
La produccin de un compuesto fluorescente por especies de Pseudomonas se favorece en un
medio que contiene fosfatos y sulfatos (King B). Es soluble en agua y cido actico e insoluble en
cloroformo. La solucin acida es incolora y no fluorescente; la neutra alcalina es amarillenta a
parda y fluorescente.
Otros microorganismos
En las aguas industriales suele ser conveniente conoer la incidencia de bacterias del azufre y el
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 33
hierro, debido a que intervienen en los procesos de corrosin.
Los olores desagradables, como a moho, que ocasionalmente suelen presentarse en aguas
potabilizadas pueden deberse a la presencia de geosmina y 2-metilisoborneol producidos por
actinomicetos en aguas superficiales. Suele hacerse un recuento de estas bacterias ramificadas
en agar almidn casena con cicloheximida.
Los protozoos patgenos de importancia transmitidos por las aguas son quistes de Entamoeba
histolytica y Giardia lamblia, as como ooquistes de Cryptosporidium parvum. Este ltimo puede
encontrarse en aguas cloradas.
Procedimiento
Nmero ms probable de coliformes
Sembrar tres tubos de caldo-lactosa doble
concentracin con 10 mL de muestra, tres tubos de
medio simple con 1 mL y los tres restantes con 0,1 mL
cada uno. Incubar a 35C durante 24-48 hs. Para
coliformes fecales usar el medio EC e incubar a 44,5C.
El caldo-lactosa simple contiene: extracto de carne 3 g,
peptona 5 g, lactosa 5 g, prpura de bromocresol (al
0,5%) 4 mL, agua 1 L, pH 7,2. Repartir en tubos con
campanita. El medio doble concentracin contiene los
mismos ingredientes en 500 mL de agua.
El medio EC simple contiene: peptona 20 g, lactosa 5
g, sales biliares 1,5 g, fosfato dipotasico 4 g, fosfato
monopotsico 1,5 g, cloruro de sodio 5 g, agua
destilada 1 L. Para el medio doble concentracin se
disuelven los slidos en 500 mL de agua. Se reparte en
tubos con una campanita (ver figura 19).
Observar los tubos que presentan gas en cada una de
las series. Obtener el nmero caracterstico donde la
primera cifra corresponde a los tubos de positivos
sembrados con 10 mL de muestra, la segunda a los
positivos que recibieron 1 mL y la tercera a los
positivos con 0, 1 mL de agua. Consultar la tabla para
obtener el nmero ms probable de coliformes o
coliformes fecales en 100 mL de la muestra.
Escherichia coli
Sembrar 1 asa de cada uno de los tubos positivos para coliformes fecales en sectores de las
placas de agar Levine (EMB). Este medio contiene peptona 10 g, lactosa 5 g, sacarosa 5 g, fosfato
dipotsio 2 g, agar 15 g, eosina 0,4 g, azul de metileno 0,065 g, agua 1 L, pH 7,2. Incubar a 35C
durante 48 horas. En este medio las colonias son negras con brillo metlico.
Nmero ms probable de enterococos
Sembrar cada uno de los tres tubos de caldo-azida doble concentracin con 10 mL de muestra.
Agregar 1 mL a cada uno de tres tubos de caldo-azida simple y 0,1 mL a los tres restantes. Se
incuban a 35.C y se observan a las 24 y 48 horas.
El caldo-azida simple contiene peptona 15 g, extracto de carne 4,5 g, glucosa 7,5 g, cloruro de
sodio 7,5 g, azida de sodio 0,2 g, agua destilada 1 L. El medio doble concentracin se prepara
agregando la misma cantidad de slidos a 500 mL de agua. Se reparten a razn de 10 mL en
cada tubo.
Se consideran positivos los tubos que presentan turbiedad debido al crecimiento microbiano.
Figura 19
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 34
Consultar la tabla para obtener el nmero ms probable de enterococos en 100 mL de muestra.

Nmero ms probable por mL de muestra, utilizando series de tres tubos inoculados
con 10 mL, 1 mL y 0,1 mL

Nmero ndice Nmero ndice
caracterstico NMP caracterstico NMP
0 0 1 3 2 0 0 9
0 0 2 6 2 0 1 14
0 0 3 9 2 0 2 20
0 1 0 3 2 0 3 26
0 1 1 6,1 2 1 0 15
0 1 2 3,2 2 1 1 20
0 1 3 12 2 1 2 27
0 2 0 6,2 2 1 3 34
0 2 1 9,3 2 2 0 21
0 2 2 12 2 2 1 28
0 2 3 16 2 2 2 35
0 3 0 9,4 2 2 3 42
0 3 1 13 2 3 0 29
0 3 2 16 2 3 1 36
0 3 3 19 2 3 2 44
1 0 0 3,6 2 3 3 53
1 0 1 7,2 3 0 0 23
1 0 2 11 3 0 1 39
1 0 3 15 3 0 2 64
1 1 0 7,3 3 0 3 95
1 1 1 11 3 1 0 43
1 1 2 15 3 1 1 75
1 1 3 19 3 1 2 120
1 2 0 11 3 1 3 160
1 2 1 15 3 2 0 93
1 2 2 20 3 2 1 150
1 2 3 24 3 2 2 210
1 3 0 16 3 2 3 290
1 3 1 20 3 3 0 240
1 3 2 24 3 3 1 460
1 3 3 29 3 3 2 1100

Clostridios sulfito-reductores
Repartir, a razn de 20 mL por tubo, un medio que contine caldo nutritivo 1 L, glucosa 20 g,
agar 30 g y esterilizar 30 minutos a 110C.
Preparar una solucin de 1 g sulfito de sodio y 4 gotas de alumbre frrico (al 5%) en 10 mL de
agua destilada estril. Calentar a ebullicin 25 mL de muestra.
En el momento de usar fundir cinco tubos de medio en bao de agua hirviente, agregar 1 mL
de la solucin de sulfito y 5 mL de la muestra tratada, evitando la incorporacin de aire. Enfriar
bajo chorro de agua e incubar a 35C durante 48 horas.
Contar las colonias negras en cada tubo sembrado con 5 mL de muestra, sumar y calcular el
nmero de organismos presentes en 100 mL de muestra
Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Apndice 35
Pseudomonas spp.
Sembrar 0,1 mL de la muestra o diluciones de la misma (1/ 10 1/ 100 en agua estril) en
sendas placas de los medios King A y King B. Incubar el medio A durante 48 hs a 37C y el
medio B durante 24 hs a 37C y luego 3-4 das a temperatura ambiente.
El medio King A, que exalta la produccin de piocianina, contiene: peptona 20 g, glicerina 10
mL, cloruro de magnesio 1,4 g, sulfato de potasio 10 g, agar 15 g, agua 1 L, pH 7,2.
El medio King B, que favorece la produccin del pigmento fluorescente, contiene: proteosa-
peptona 20 g, glicerina 10 mL, fosfato monopotsico 1,5 g, sulfato de magnesio 1,5 g, agar 15 g,
agua 1 L, pH 7,2. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.
Observar las colonias con pigmentos solubles y/ o fluorescentes bajo luz visible y ultravioleta.
Bibliografa
o Eaton AD, Clesceri LS, Greenberg AE. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 19 ed.
parte 9000: Microbiological Examination. APHA, Washington, 1995
o Guinea J, Sancho J, Pars R. Anlisis Microbiolgico de Aguas. Omega, Barcelona, 1979

You might also like