UNIVERSIDAD NACIONAL DE UCAYALI

FACULTAD DE MEDICINA
HUMANA

FARMACOLOGIA

PRACTICA:


DISCOSENSIBILIDAD - ANTIBIOTICOS



Dr. RICHARD MELENDEZ OROZCO

ALUMNO (A):

LICAS AYSANOA XIOMARA CHERLY

2014 - I
CICLO V
PUCALLPA PER 2014


I. INTRODUCCIN:
La determinacin de la sensibilidad a los agentes antimicrobianos es una
de las principales funciones de un laboratorio de enfermedades
infecciosas. Esta funcin se vuelve de especial relevancia en una poca
como la actual, en la que las resistencias a los agentes antimicrobianos
son elevadas y existe una gran discusin sobre la utilizacin de antibiticos
en los animales. Por ello es fundamental que el laboratorio pueda aportar
la informacin necesaria para llevar a trmino un tratamiento adecuado.
El principal objetivo de cualquier prueba de sensibilidad antimicrobiana es
predecir cul ser el resultado de un tratamiento. En muchas ocasiones los
resultados se expresan, para un patgeno aislado y analizado, de forma
cualitativa: como sensible (en cuyo caso se supone que un tratamiento
estndar con aquel compuesto producir la curacin), resistente (el
antimicrobiano examinado no ser eficaz en aquella patologa) o
intermedio (la efectividad de aquel compuesto depender de su
localizacin o de la dosificacin utilizada).
Un segundo objetivo de las pruebas de sensibilidad antimicrobiana es la
de obtener series histricas que permiten predecir el comportamiento de
un tratamiento cuando ste se hace de forma emprica.












I. DESARROLLO DEL TEMA:

La determinacin de la Concentracin Mnima Inhibidora (CMI) es la
medida de la sensibilidad de una bacteria a un antibitico. Es la mnima
cantidad de antimicrobiano que es capaz de impedir el crecimiento de un
microorganismo en unas condiciones normalizadas. Es el mtodo habitual
utilizado en los laboratorios de Microbiologa Clnica. Para llevarlo a cabo
es necesario utilizar cepas control (de referencia) con el fin de que los
resultados sean reproducibles y comparables.
Este mtodo nos ofrece informacin sobre la sensibilidad de las bacterias
S (sensible), I (intermedia) y R (resistente).

Sensible, si existe una buena probabilidad de xito teraputico en
el caso de un tratamiento a la dosis habitual.
Resistente, si la probabilidad de xito teraputico es nula o muy
reducida. No es de esperar ningn efecto teraputico sea cual
fuere el tipo de tratamiento.
Intermedia, cuando el xito teraputico es imprevisible. Se puede
conseguir efecto teraputico en ciertas condiciones (fuertes
concentraciones locales o aumento de la posologa).

Existen diferentes tcnicas de laboratorio que permiten medir o calcular
de forma rutinaria, y de manera semicuantitativa, las CIM (mtodos
manuales y mtodos automatizados o semiautomatizados).
Se puede realizar mediante:

a) Difusin en agar: Disco placa y E test

b) Dilucin: Medio slido y Medio lquido (micro/macrodilucin)

c) Mecanizados y Automatizados

La Concentracin Mnima Bactericida (CMB) es la mnima cantidad de
antibitico capaz de destruir el 99,9% de una muestra inoculada en
condiciones estandarizadas.
Mtodos

En un primer momento, el mtodo estndar utilizado para las pruebas in
vitro fue el de dilucin en caldo, que proporcionaba un resultado
cuantitativo. Actualmente existen varios mtodos que se utilizan para
llevar a cabo los estudios de sensibilidad a los antibiticos y todos ellos se
realizan bajo condiciones entandarizadas por organismos internacionales.

a) Dilucin en caldo

Se colocan concentraciones decrecientes del agente antimicrobiano,
generalmente diluciones 1:2, en tubos con un caldo de cultivo que
mantiene el desarrollo del microorganismo. Los antibiticos se preparan
en "soluciones madre" concentradas y luego se diluyen en caldo hasta
obtener las concentraciones apropiadas.

Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como control negativo de
crecimiento. Despus de un periodo de incubacin adecuada se observa la
turbidez de los tubos que indica el desarrollo bacteriano. El
microorganismo crecer en el tubo control y en todos los que no
contengan suficiente antibitico que sea capaz de inhibir su desarrollo. La
concentracin de antibitico que presente ausencia de crecimiento es la
Concentracin Mnima Inhibitoria.

Para medir la CMB se debe realizar la prueba de actividad bactericida, que
emplea el mismo sistema de dilucin en caldo que para medir la
sensibilidad.

A partir de la CMI, se siembra una cantidad conocida de inculo de cada
uno de los tubos de caldo que no tienen turbidez en placas de agar, y el
nmero de colonias que crece en estos subcultivos, despus de incubar
durante la noche, se compara con el nmero de UFC/ml del cultivo
original. La mnima concentracin del agente antibacteriano que permite
sobrevivir a menos de 0,1 % del inculo original se denomina
concentracin bactericida mnima (CBM).

b) Difusin en agar

Este mtodo incorpora el antimicrobiano a discos de papel de filtro. Su
introduccin permiti agilizar la determinacin de la sensibilidad de las
cepas bacterianas frente a un nmero importante de antimicrobianos de
forma simultnea. El empleo de los discos de papel de filtro para las
pruebas de sensibilidad est estandarizado y se correlaciona con las CMIs.
Durante muchos aos, y a pesar de ser una tcnica puramente cualitativa,
el mtodo de difusin por disco (o mtodo Kirby-Bauer), en funcin sobre
todo de su comodidad, economa y fiabilidad, ha sido uno de los ms
utilizados en los laboratorios.

El microorganismo a investigar se inocula en una o varias placas de agar y
sobre su superficie se disponen los discos correspondientes a varios
antibiticos. Se incuban las placas durante 16-24 horas y se estudia el
crecimiento en ellas. Se valora el dimetro de la zona de inhibicin que se
forma alrededor de cada disco y se compara con las referencias oportunas
publicadas por la NCCLS. De esta manera se sabe si el microorganismo es
Sensible, Intermedio o Resistente a cada uno de los antibiticos.




Mtodo de E-test

Es un mtodo ms reciente, es una combinacin de caractersticas de los
mtodos anteriores. Se trata de una tcnica cuantitativa en placa que
permite obtener una lectura directa de CMI en g/ml, ya que se emplean
tiras plsticas impregnadas en concentraciones crecientes de antibitico.

El microorganismo se inocula en una placa y sobre ella se deposita la tira
del antibitico (o antibiticos) a ensayar. Se incuba durante 16-24 horas a
35C y se valora la zona de inhibicin alrededor de cada tira. La CMI se lee
directamente observando el punto ms bajo de la elipse que presente el
crecimiento.




Mtodos automatizados

La mayora de estos mtodos utilizan sistemas de microdilucin en medio
lquido sobre microplacas con pocillos en "U" e interpretan el crecimiento
bacteriano en los diferentes pocillos por medio de un autoanalizador
(mediciones por turbidez o fluorescencia). Anteriormente se haca por
lectura ptica del tcnico a travs de un espejo invertido.
Son sistemas fciles y rpidos, generalmente automatizada o
semiautomatizada. Son mtodos ideales para grandes volmenes de
trabajo. Una de sus grandes limitaciones es que slo ofrecen garanta para
investigar microorganismos de crecimiento rpido y que no tengan
requerimientos especiales.
Preparacin de los discos impregnados de antibitico para realizar un
antibiograma.

En las casas de productos de laboratorio pueden adquirir se los discos que
se emplean para hacer un antibiograma. Sin embargo, como aprendizaje, y
con bastante fiabilidad, es fcil prepararlos a partir de las cpsulas,
comprimidos grageados o viales de 250 mg 500 mg de los antibiticos
que expenden en las farmacias.

Para que la concentracin de antibitico que impregna los discos no sea ni
excesiva ni insuficiente, y sea posible distinguir los halos de inhibicin, se
puede proceder del siguiente modo, realizando un banco de diluciones.
La concentracin de 0,1 mg/cl ya es adecuada para trabajar.
Para evaluar, aproximadamente, el volumen de una gota se pueden
colocar en una probeta graduada 100 gotas calculando el volumen que
ocupan; dividiendo por 100 tendremos el volumen que corresponde a una
gota. Suponiendo que el volumen hallado para una gota sea de 0,003 ml,
la expresin 0,1 x 0,003 nos dar la concentracin de antibitico en mg/
gota. De este modo sabremos la concentracin de antibitico con que
impregnamos los discos de papel secante, que se acostumbran a tomar de
6,5 m m de dimetro. Repitiendo la operacin con cpsulas de distintos
antibiticos podremos preparar diferentes discos.

II. MATERIALES Y METODOS

Medios de cultivo, reactivos, microorganismos de control de calidad
y equipo de laboratorio necesario, descriptos en el procedimiento
para realizar la prueba de sensibilidad a los antimicrobianos por el
mtodo de difusin con discos.
Para llevar a cabo el objetivo propuesto se escogieron 3
antibiticos: Cloranfenicol, Gentamicina y Ampicilina. El medio
empleado fue Agar Mueller Hinton ya que de buena
reproducibilidad en los diferentes lotes. La cepa control utilizada fue
Escherichia coli (ATCC 25922). Para preparar los discos se utiliz
papel secante y se codific arbitrariamente marcndolos a mquina
con las primeras letras del antibitico, esto por cuanto en el
comercio slo existir un color de papel secante. El papel marcado
fue preparado y perforado con un sacabocados, obtenindose
discos de 6 mm de dimetro los que se colocaron en recipientes de
vidrio y luego fueron esterilizados.
En la preparacin de las soluciones madres de antibiticos se
procedi de la siguiente manera:
Solucin madre de Ampicilina: Se disolvi una ampolla de 500 mgs
de ampicilina sdica (Laboratorio Bristol) en 100 ml de agua
destilada estril, obtenindose una concentracin de 500 mg/dl.
Solucin madre de Cloranfenicol: se disolvi una cpsula de 250 mg
de cloranfenicol en 25 ml de alcohol metlico, se centrifug y se
tom del sobrenadante cuya concentracin final corresponda a 100
mg/dl.
Solucin madre de Gentamicina: una ampolla inyectable de
Laboratorio Fursterg S.A., de 400 mg/dl se diluy 1: 10 con agua
destilada estril resultando una concentracin final de 400 mg/dl. A
partir de las soluciones madres se realizaron diluciones para
impregnar los discos, lo que se hizo con 10 ul de las diluciones, en
forma estril y con una micropipeta SMI (Scientific Manufacturing
Industries) de 50 ul con graduaciones cada 10 ul.
Se colocaron los discos en cajas de Petri estriles distribuidos a una
distancia adecuada entre ellos y se impregnaron con el antibitico.
La suspensin fue rayada con una torunda estril en tres planos
sobre agar Mueller Hinton de 4 mm de profundidad. Una vez seco el
inculo (3-5 minutos despus) los discos fueron colocados sobre el
agar con pinzas flameadas y presionados sobre la superficie del gel.
Luego los platos fueron incubados inmediatamente a 37 C. Despus
de incubar por una noche, los dimetros de los halos de inhibicin
fueron medidos con una regla.

III. RESULTADOS A OBSERVAR

Se pudo determinar que la presencia de inhibidores en el papel y en
la tinta usada en los discos era negativa. Al probar las diferentes
diluciones y preparadas a partir de las soluciones "madre" de cada
antibitico, se escogi aquella con la cual se obtena los halos
establecidos en Manual of Clinical Microbiology correspondiendo a
la Ampicilina de dilucin 1:5, el Cloranfenicol 1:5 y a la Gentamicina
la dilucin 1:8.
Lectura del antibiograma.
Una vez sembrada una placa de un medio de cultivo adecuado y
colocados los distintos discos im pregnados de antibitico y una vez
colocada a incubacin en la estufa durante unas horas, se procede a
la lectura de los resultados, que puede hacerse a intervalos
peridicos, basada en la medi cin del halo de inhibicin. Segn la
amplitud de este halo los grmenes se clasifican en:
Sensible > = 18 mm
intermedio 13 17 mm
resistente < =12 mm.
Agente Antimicrobiano Contenido
del disco
Dimetro de la zona de inhibicin
en mm
Resistente
< =
Intermedio Sensible
> =
ANTIMICROBIANOS
Cloranfenicol 30 g 12 13-17 18
Clindamicina 2 g 14 15-20 21
Fosfomicina Trometamol 200 g 12 13-15 16
Nitrofurantona 300 g 14 15-16 17
Rifampicina 5 g 16 17-19 20
Sulfonamidas 300 g 12 13-16 17
Trimetoprima Sulfametoxazol 1.25/23.75
g
10 11-15 16

Dimetro de halo de inhibicin n (en mm) obtenida para cada antibitico con el
organismo control


Agente antimicrobiano
Contenido
del disco
E.coli
ATCC
25922
mm
S.aureus
ATCC 25923
mm
P.aeruginosa
ATCC 27853
mm
E.coli
ATCC
35218
mm
AMICACINA 30 g 19 26 20 26 18 26 ****
AMPICILINA 10 g 16 22 27 35 **** ****
AMPICILINA-SULBACTAMA 10/10 g 19 24 29 37 **** 13 19
AZITROMICINA 15 g **** 21 26 **** ****
AZTREONAM 30 g 28 36 **** 23 29 ****
CEFACLOR 30 g 23 27 27 - 31 **** ****
CEFAZOLINA 30 g 21 27 29 35 **** ****
CEFEPIME 30 g 31 37 23 29 24 30 ***
CEFIXIMA 5 g 23 27 **** **** ****
CEFOPERAZONA 75 g 28 34 24 33 23 29 ****
CEFOTAXIMA 30 g 29 35 25 31 18 22 ****
CEFOXITINA 30 g 23 29 23 29 **** ****
CEFTACIDIMA 30 g 25 32 16 20 22 29 ****
CEFTIZOXIMA 30 g 30 36 27 35 12 17 ****
CEFTRIAXONA 30 g 29 35 22 28 17 23 ****
CEFUROXIMA 30 g 20 26 27 35 **** ****
CEFALOTINA 30 g 15 21 29 37 **** ****
CLORANFENICOL 30 g 21 27 19 26 **** ****
CIPROFLOXACINA 5 g 30 40 22 30 25 33 ****
CLINDAMICINA 2 g **** 24 30 **** ****
ERITROMICINA 15 g **** 22 30 **** ****
FOSFOMICINA-TROMETAMOL 200 g 22 30 25 33 **** ****
GENTAMICINA 10 g 19 26 19 27 16 21 ****
IMIPENEM 10 g 26 32 **** 20 28 ****
LEVOFLOXACINA 5 g 29 37 25 30 19 26 ****
KANAMICINA 30 g 17 25 19 26 **** ****
MEROPENEM 10 g 28 34 29 37 27 33 ****
MINOCICLINA 30 g 19 25 25 30 **** ****
ACIDO NALIDIXICO 30 g 22 28 **** **** ****
NETILMICINA 30 g 22 30 22 31 17 23 ****
NITROFURANTOINA 300 g 20 25 18 22 **** ****
NORFLOXACINA 10 g 28 35 17 28 22 29 ****






IV. CONCLUSION:
La prueba de sensibilidad a los antimicrobianos por el mtodo de difusin
con discos permite categorizar a las bacterias aisladas en un proceso
infeccioso en: sensible, resistente o de sensibilidad intermedia a una gran
variedad de agentes antimicrobianos. Para realizar la prueba, discos o
multidiscos de papel de filtro impregnados con una cantidad especfica del
agente antimicrobiano, se aplican sobre la superficie de un medio con
agar que ha sido inoculado con el microorganismo en ensayo. La droga en
el disco, difunde a travs del agar. A medida que la concentracin de
agente antimicrobiano se aleja del disco disminuye en forma logartmica,
creando un gradiente del antibitico en el medio con agar alrededor del
disco. Concomitantemente con la difusin de la droga, la bacteria que fue
inoculada en la superficie del medio de cultivo y no fue inhibida por la
concentracin del agente antimicrobiano, contina multiplicndose y
formando un crecimiento visible. En las reas donde la concentracin de la
droga es inhibitoria, no hay crecimiento, formando una zona de inhibicin
alrededor de cada disco. El tamao de la zona de inhibicin est
influenciado por la difusin del agente antimicrobiano a travs del agar y
vara con las diferentes drogas. El tamao de la zona, sin embargo, es
inversamente proporcional a la CIM (Concentracin Inhibitoria Mnima).
Los criterios recomendados para interpretar los dimetros de las zonas de
inhibicin, se observan en las tablas de las pruebas de sensibilidad.











V. BIBLIOGRAFIA
campus.usal.es/~micromed/Practicas_odontologia/.../Antibiograma.html
videosdigitals.uab.es/cr-vet/www/21273/Practica%202.2009-10.pdf
www.apcontinuada.com/es/el-antibioigrama-interpretacion.../80000504/
www.higiene.edu.uy/cefa/2008/BacteCEFA36.pdf