IV.

Expresin de la Informacin
Gentica
Tema 17: Introduccin a la Ingeniera
Gentica I.
Enzimas de Restriccin
Corte cohesivo Corte romo
EcoRI con DNA unido
Enzimas de Restriccin: Tipos
Enzimas de Restriccin:
Nomenclatura
Gnero
Especie
Cepa
Orden
EcoRI
Secuencias de reconocimiento palindrmicas
Extremo 5 protuberante
Extremo 3 protuberante
Extremo romo
Enzimas de Restriccin
DNA Ligasas
En la clula (eucariota y procariota), tienen como funcin
corregir las discontinuidades en la hebra de DNA causadas en
el mecanismo de replicacin de la hebra retardada del DNA,
por la reparacin de errores en la replicacin o bien por
agresiones externas al DNA: qumicas, fsicas, etc.
Su papel en la biotecnologa es el de catalizar la unin de
fragmentos distintos de DNA, tanto si son romos, como si son
cohesivos. Favorecen la formacin del enlace covalente
fosfodister entre 3-OH y 5-fosfato.
Accin de las DNA ligasas
Si la T de la reaccin es mayor
que la Tm de los extremos
cohesivos, no hay ligacin: T y
t de reaccin habitual: de 16C
2h a 4 C O/N.
DNA Polimerasas
termoestables
Polimerasa
3'->5'
Exonucleasa
Fuente y Propiedades
Taq No
De Thermus aquaticus. Su vida media a 95 C es de
1.6 horas. Mayor tasa de error (10
-4
-10
-5
)
Pfu Si
De Pyrococcus furiosus. Tiene la menor tasa de error
de todas las DNA polimerasas termoestables
conocidas. Menor tasa de error (10
-6
).
Vent Si
De Thermococcus litoralis; Tambin conocida como
Tli polimerasa. Si vida media a 95 C es de
aproximadamente 7 horas. Tasa de error intermedia.
Retrotranscriptasas (DNA Polimerasa RNA dependiente)
1.-Generacin de cDNAs
de doble hebra para
construir genotecas de
expresin.
2.-Generacin de cDNAs
de cadenas sencilla con
los que realizar RT-PCR.
Un experimento de DNA recombinante generalmente
presenta el siguiente esquema:
1.- El DNA de un organismo donador se extrae, se corta con endonucleasas de
restriccin y se liga a otro DNA (vector de clonacin) para formar una nueva
molcula de DNA recombinado (construccin de DNA).
2.- Esta construccin vector de clonacin-DNA insertado se transfiere y mantiene
dentro de una clula hospedadora. La introduccin del DNA en la clula hospedadora
se denomina transformacin.
3.- Aquellas clulas que han tomado la construccin de DNA (clulas transformadas)
se identifican y seleccionan, separndolas de aquellas que no contienen la
construccin.
4.- Si es necesario, la construccin de DNA puede manipularse para asegurarnos que
la protena que es codificada por la secuencia del DNA clonado va a ser producida
por la clula hospedadora.
Plsmidos usados en tecnologa del ADN recombinante
Propsito: clonacin general y construccin de genotecas.
1.- Pequeo tamao (3-5 Kb).
2.- Elementos indispensables: ori, MCS, marcadores (resistencia/metablicos) y otros.
3.- Nmero de copias (control de replicacin estricto/relajado).
4.- Transmisibilidad: Conjugacin (opern traF) y movilidad (oriT).
5.- Compatibilidad de distintos plsmidos en la misma bacteria.
Clonaje cohesivo (Eco RI)
Clonaje romo (HaeII)
5 ACGATGGCCACGAT 3
3 TGCTACCGGTGCTA 5
5 ACGATGG CCACGAT 3
3 TGCTACC GGTGCTA 5
HaeIII
DNA ligasa
5 ACGATGGCCACGAT 3
3 TGCTACCGGTGCTA 5
Bacterifago Bacterifago M13
Bacterifagos
Bacterifago
Bacterifago
Csmidos
Clonaje in silico
Local (software instalado)
Recursos en red (software remoto)
Secuencia
Previamente
descrita
Bibliografa
Banco de datos
Generada en el
laboratorio
Genotecas,
Productos de
PCR, Segmentos
aislado por ERs
y clonados, etc
Anlisis
Algoritmos y filtros
Fiabilidad estadstica
Prediccin
Diseo experimental
Contraste prediccin-resultados
Aplicabilidad
Desnaturalizacin
del dsDNA e hipercromicidad
DNA rico
en A+T
DNA rico
en G+C
DNA rico
en G+C
DNA rico
en A+T
Desnaturalizacin
del dsDNA e hipercromicidad
Integridad de cada cadena e
hipercromicidad a 260 nm
Desnaturalizacin por incremento de
temperatura, o por descenso en la
concentracin de sal
Desnaturalizacin
reversible
Propiedad de
soga rgida
(soluciones
viscosas)
Concepto de Hibridacin
Reaccin en cadena de la Polimerasa
TaqDNA Polimerasa
KaryMullis(Nobel 1993)
Componentes de la PCR:
1. DNA molde.
2. Oligonucletidos.
3. DNA dep.-DNA polimerasa.
4. Desoxinucletidos.
Diseo de oligonucletidos
Caractersticas principales de los oligonucletidos usados en PCR:
1. Tamao entre 15 y 25 nucletidos.
2. Temperatura de meltingentre 50 y 65 C
3. Contenido en G+C entre un 40% y un 60%
4. Sin apareamientos internos por autocomplementariedad.
5. Sin apareamientos 5-3 entre los oligosde la misma pareja por
complementariedad de secuencia en los extremos.
6. Evitar 3 o ms de 3 purinas o pirimidinas seguidas en el extremo
3 del oligo
7. Clculo de Tm: 2x(A+T)+4x(G+C) en grados centgrados.
+ =
:
Ecuacin del
RT-PCR
M C+ C- T1 T2 T3 T4
Completo
Variante 1
Variante 2
Deteccin de variantes de Splicing tejido-especficas
mRNA completo
(variante larga)
Variante de splicing
(variante corta)
Electroforesis en geles de agarosa
Electroforesis en geles de acrilamida
TRANSFERENCIA
RFLP-Southern
Colonias
Northern
Hibridacin In Situ
Estudio de expresin gnica en el desarrollo.
Embrin de pollo, marcado por hibridacin in situ con sondas
cRNA para HNF-17
Estudio de cromosomas