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Cromatografa
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Cromatografa
1) Introduccin
La cromatografa es la
tcnica que separa una
mezcla de solutos basada
en la velocidad de
desplazamiento
diferencial de los mismos
que se establece al ser
arrastrados por una fase
mvil (liquida o gaseosa)
a travs de un lecho
cromatogrfico que
contiene la fase
estacionaria, la cual
puede ser slida o lquida.
Hay que indicar que el
nombre de la tcnica es
incorrecto, ya que no
consiste en escribir con colores. Este nombre proviene de la primera experiencia cromatogrfica
realizada, la cual se utilizo para separar pigmentos coloreados de plantas. La cromatografa fue
descubierta por el botnico ruso de origen italiano Mijail Tswett en 1903. Tswett separo los
pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de hojas verde en ter de petrleo sobre
una columna de carbonato de calcio en polvo en el interior de una probeta. No obstante, no
existen datos sobre la utilizacin de esta tcnica hasta 1930 cuando Kun y Lederer separaron
tambin pigmentos de las plantas usando como adsorbentes almina y carbonato de calcio. Fue
a partir de ah cuando se inicio el verdadero desarrollo de la cromatografa.
Para explicar el fenmeno cromatorgafico es necesario establecer dos tipos de fundamento, uno
remoto y otro prximo
2) Fundamento
Este fundamento se encuentra en alguna o algunas propiedades fsicas o fsico qumicas de los
analitos: solubilidad, adsorcin (tendencia a ser retenidos en slidos finamente divididos),
volatilidad, tamao, carga, reactividad qumica o bioqumica, etc. La mezcla de sustancias a
separar se coloca en una situacin experimental dinmica donde exhiben dos de estas
propiedades, o bien una de ellas pero por duplicado tal como la solubilidad en dos lquidos
diferentes como ocurre en cromatografa liquido - liquido. Deben cumplirse las condiciones
siguientes:
- Los componentes de los sistemas empleados deben estar en intimo contacto entre si.
- El equilibrio establecido entre esos componentes debe ser lo mas completo posible.
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Fundamento prximo: Se encuentra en el hecho de que es muy improbable que dos especies
presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades fsicas o fsico - qumicas frente a un
sistema cromatogrfico dado. Por tanto, en estas diferencias, que pueden ser muy pequeas, se
basa la separacin cromatogrfica.
Si se transforma la idea del equilibrio esttico establecido entra las dos fases en un equilibrio
dinmico, se tiene la realidad del fenmeno cromatogrfico. Como se ha indicado
anteriormente, una de las fases, denominada fase mvil, fluye a travs de la otra, a la que se
denomina fase estacionaria, que permanece inmvil, y que, al menos en una extensin esta en
equilibrio con la fase mvil.
Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan so movilidad entre si y con
respecto a la fase mvil. Se eligen las condiciones experimentales y las fases cromatogrficas para
que los componentes de la mezcla se muevan a distinta velocidad. La base de la separacin
cromatogrfica ser, por tanto, la diferencia en la velocidad de migracin de los mismos.
La cromatografa es probablemente la ms verstil de las tcnicas de separacin: es aplicable a
cualquier mezcla soluble o voltil. De hecho las tcnicas de separacin suelen dividirse en dos
grandes grupos: cromatograficas y no cromatograficas. La eleccin de una tcnica
cromatogrfica concreta depender de la naturaleza y cantidad de la muestra, del objetivo de la
separacin y de las limitaciones del tiempo y equipo asequible
Puede hacerse una primera distincin entra las tcnicas cromatogrficas atendiendo a la
integracin continua o no del sistema de deteccin. As, la cromatografia no conlleva a un
sistema de deteccin, mientras que cualquier cromatgrafo de lquidos o gases lleva incorporado
dicho sistema siendo, por tanto, autnticos instrumentos.
3) Clasificacion del Anlisis Cromatogrfico
Para clasificar globalmente los procesos cromatogrficos es necesario atender a dos criterios
bsicos:
Fundamento del proceso cromatogrfico, lo que
conduce a los tipos de cromatografias
Forma de realizar el proceso cromatogrfico, es decir, lo
que constituye las distintas tcnicas cromatogrficas.
Tipos de cromatografia
Si es un slido, cabe distinguir entre:
Cromatografa de adsorcin: El slido adsorbe al
componente que inicialmente estaba en fase mvil
(liquida o gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals)
Cromatografia de cambio inico: el slido es un
cambiador de iones (fuerzas electrostticas)
Cromatografia de exclusin (o de geles), el slido es un
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gel formado por polmeros no inicos porosos que retienen a las molculas de soluto segn su
tamao.
Cromatografia de afinidad: es un tipo especial de cromatografia de adsorcion,
utilizadaespecialmente en bioqumica, en la que un slido tiene enlazado un llamado ligando de
afinidad que puede ser por ejemplo, un indicador enzimtico o un anticuerpo
Si es un lquido que se encuentra soportado en un slido inerte, se trata de la Cromatografia de
particin. El soluto se reparte entra la fase mvil (liquido o gas) y la fase estacionaria.
Segn la naturaleza de la fase mvil, la tcnica cromatogrfica correspondiente recibe el nombre
de dicha fase mvil:
Si es un lquido, cromatografa liquida, cabe distinguir:
Comatografa liquido-liquido (CLL) en la que ambas fases son liquidas y, por tanto, se trata de
una cromatografa de particin.
Cromatografa liquido-slido (CLS) en la que la fase estacionaria es slida (adsorcin, cambio
inica, exclusin, afinidad).
Si es un gas, cromatografa de gases, puede ser:
Cromatografa gas-liquido (CGL), que es una cromatografa de particin.
Cromatografa gas-slido (CGS), que es una cromatografa de adsorcin.
Si es un fluido supercrtico, (fluido calentado a una temperatura superior a la temperatura critica,
pero simultneamente comprimido a una presin mayor que su presin critica), se trata de la
cromatografa de fluidos supercrticos (CFS), que puede ser de particin o de adsorcin.

Diferencias entre cromatografia plana y en columna
Aunque con algunas modificaciones, los principios tericos de la cromatografia en columna
pueden ser aplicados, en general, a la cromatografa plana. Las diferencias entre estas tcnicas
hay buscarlas en la distinta configuracin de ambos sistemas cromatogrficos ya que la
cromatografia plana se realiza en un sistema de lecho abierto, mientras que la cromatografia en
columna es un sistema de lecho cerrado. Sobre esta base pueden indicarse las diferencias
siguientes
En la cromatografa plana la separacin se realiza por distancias mientras que en columna se
hace por tiempos ( o volmenes ).
En cromatografia plana la velocidad de la fase mvil solo puede controlarse indirectamente ya
que esta gobernada por fuerzas capilares que son las que permiten el paso de dicha fase a
travs del lecho cromatogrfico. Por el contrario, en cromatografa en columna la velocidad
de la fase mvil puede controlarse fcilmente, dependiendo del gradiente de presin
mantenido a travs de la columna.
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El tiempo que dura la separacin esta determinado por el tiempo necesario para que el frente
del disolvente llegue a una zona determinada del lecho cromatogrfico y es independiente
del camino recorrido por los componentes de la muestra. En cromatografa en columna, cada
soluto debe atravesar completamente la longitud de la columna, por lo que el tiempo que
dura la separacin esta determinado por el tiempo que tarda el componente mas lento en
llegar al detector.
En lo que se refiere a la forma de llevar a cabo el proceso de separacin, en cromatogrfia en
columna la separacin de varias muestras, se realiza de forma secuencial, es decir, cada una
de ellas debe someterse individualmente al mismo proceso de introduccin en la columna,
separacin y deteccin, adems de proceder a reequilibrar la columna antes de introducir la
siguiente muestra. En cromatografa plan por el contrario, la separacin de varias muestras se
realiza de forma simultnea, siendo todas ellas sometidas al mismo tiempo al proceso
separativo. Esto supone un ahorro de tiempo considerable ya que en cromatografa en
columna la duracin de separacin de varias muestras ser la suma de los tiempos parciales
necesarios para cada separacin individual.
La eleccin de la fase mvil en cromatografa plana se realiza d forma que de la separacin
requerida, no importando que algunos componentes de la muestra queden en el origen, ya
que las placas se desechan despus de cada separacin. En cromatografa en columna, la fase
mvil debe elegirse de forma que eluya todos los componentes de la muestra para que no se
produzca el envenenamiento de la columna. Este envenenamiento puede suponer una
perdida de tiempo considerable hasta que se logra eluir completamente aquellos
componentes que hayan podido quedar acumulados al comienzo de la columna. Si es
irreversible, el aspecto econmico puede ser de gran importancia.
Otra diferencia bsica entre ambas tcnicas se encuentra en la forma de llevar a cabo la
deteccin. Mientras que en cromatografa en columna este es un proceso dinmico, pasando
cada soluto eluido por el detector, en cromatografa plana es un proceso esttico. Esta
diferencia da lugar a que la deteccin en la cromatografa plana sea mas difcil de automatizar
que en columna, pero tambin, que sea un proceso ms flexible y variable. As, en lo que se
refiere a los disolventes utilizados como fase mvil, la pureza o propiedades (Absorbentes,
cido base, etc.) de los mismos no son tan crticos como en columna, ya que estos se
evaporan completamente entre el desarrollo y la medida. Por ejemplo, si en columna se utiliza
un detector U.V., la fase mvil no debe contener disolventes o impurezas que absorban en
esta zona del espectro, mientras que esto no supone un problema en cromatografa plana.
Por otra parte, en esta tcnica, es posible aumentar la sensibilidad del proceso de deteccin
mediante una seleccin adecuada de las reacciones utilizadas para mejorar la seal medida. El
sistema de deteccin esttico permite, por ejemplo, registrar espectros de cada soluto por
separado y seleccionar la longitud de onda de mxima respuesta de cada uno de ellos.
En general, los solutos mas retenidos en cromatografa plana forman manchas compactas,
por lo que se detectan con mayor sensibilidad. Por el contrario, los solutos mas retenidos en la
columna son los que dan picos ms anchos menos resueltos y sensibles
Aunque normalmente se considera que la cromatografa plana es una tcnica ms simple que la
de columna, no es posible en la actualidad proceder a un desarrollo profundo de este proceso
separativo al igual que el realizado en cromatografa en columna. El motivo de ello es que en
cromatografa plana tanto la fase mvil como la estacionaria no estn bien definidas y se
encuentran en un estado dinmico con la fase de vapor que rodea el sistema cromatogrfico.
Las condiciones experimentales ptimas para realizar la separacin son, por tanto, difciles de
controlar experimentalmente. Se producen los cambios siguientes
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La fase estacionaria puede modificar sus propiedades antes y durante el proceso
cromatogrfico adsorbiendo la fase de vapor antes de ser mojada por la fase mvil, o
evaporndose si dicha fase estacionaria es liquida.
Si la fases mvil y de vapor no estn equilibradas, la evaporacin puede producir una
alteracin en la composicin de la fase mvil.
La porosidad de la fase estacionaria no es uniforme, por lo que la velocidad de la fase mvil no
es constante. As, las fuerzas capilares son mas fuertes en las zonas interparticulares mas
estrechas, producindose en las mismas un flujo mas rpido de la fase mvil

4) Introduccin a la cromatografa en columna
La cromatografa es una
tcnica que se emplea en el
fraccionamiento de protenas.
Consiste en la aplicacin de
una muestra compleja de
protenas a una columna de
cristal en la que se ha situado
una matriz slida porosa que
est inmersa en el solvente. A
continuacin se bombea una
gran cantidad de solvente a
travs de la columna. Las
diferentes protenas se van
retrasando de manera distinta
segn sus interacciones con la
matriz, por lo que pueden ser
recogidas separadas a medida
que son eluidas por el fondo
de la columna. Segn la
matriz escogida, las protenas
se pueden separar de
acuerdo a su carga, su
hidrofobicidad, su tamao o
su capacidad de unirse a
grupos qumicos particulares.
La pureza de las fracciones
obtenidas se suele comprobar
mediante la electroforesis en geles de poliacrilamida.
En toda cromatografa hablaremos de los siguientes trminos :
matriz de la columa. Sustancia que est empapada de solvente y que se empaqueta en
la columna. Tambin se denomina el lecho de la columna.
longitud de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna. Es
importante en algunos tipos de cromatografa como la de filtracin en gel y poco
importante en otras como la cromatografa de afinidad.
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volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en una columna
cromatogrfica.
volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la
columna para asegurar que se ha reemplazado
completamente. Coincide con el volumen de solvente que sale de la columna desde que
se aplica la muestra hasta que empieza a salir la primera protena. En general, y
dependiendo del tipo de cromatografa puede ser de 1 a varias veces el volumen de la
columna.
'Run Throught'. Es, en columnas de intercambio inico o de afinidad, el volumen de
solvente ms protenas que atraviesa la columna sin quedar retenido en ella.
Correspondera en el caso de la cromatografa de afinidad al volumen de solvente que
contiene las protenas no afines al ligando.
Tipos de cromatografa en columna
El principio de separacin de la cromatografa es la aplicacin de un criterio de separacin a las
protenas que se desplazan a lo largo de una matriz slida porosa. Este criterio de separacin se
basa en alguna propiedad que es diferentes entre las protenas que se quieren separar: peso
molecular, carga elctrica, afinidad de una de ellas
por alguna otra, etc... En funcin de cual sea el
criterio de separacin que se aplique
diferenciamos tres tipos de cromatografa en
columna.

5) Cromatografa de Filtracin en Gel
Este tipo de cromatografa, tambin llamado de
tamizado molecular, se utiliza para separar
biomolculas, principalmente protenas, en base al
distinto peso molecular de sus componentes, y no
en base a la hidrofobicidad, como en TLC. Como
los aminocidos son semejantes en tamao, no se
pueden separar en este tipo de cromatografa. Las
sustancias de tamao muy diferente s.
La fase estacionaria suele ser un extrao
polimrico denominado Sephadex, de tamao de
poro controlado. Como es un polisacrido, sus
propiedades hidroflicas le permiten un hinchado
fcil que le da el aspecto de un gel con el que se
pueden rellenar las columnas de cromatografa.
Fsicamente, la separacin se produce cuando la
mezcla disuelta en la fase mvil fluye a travs de la
fase estacionaria y se encuentra con los poros del
gel. De forma simplista, las molculas ms grandes
no pueden entrar por esos poros y por tanto
pasan por la columna a travs del espacio vaco
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entre las partculas de gel, que se denomina volumen muerto de la columna. Las molculas
pequeas si pueden entrar por esos poros, por lo que se adentran en el entramado de
microcanales de cada partcula de gel, recorriendo un camino mayor y retrasndose respecto a
las molculas de tamao mayor. As pues, existe una relacin inversa entre tamao molecular y
volumen de elucin de cada sustancia desde la columna.
Los parmetros ms importantes para tratar este tipo de cromatografa desde un punto de vista
cuantitativo son:
a) Volumen muerto (Vo): Es el volumen de la columna que no ocupa las partculas del gel, y por
tanto no tiene poder separador. Puede determinarse experimentalmente con una sustancia que
por su gran tamao sea excluda de todos los poros de las partculas del gel.
b) Volumen total (Vt): Es el volumen total de lecho, es decir el que ocupan las partculas mas el
volumen muerto. Puede calcularse geomtricamente o bien con una sustancia de peso
molecular pequeo, que se introduzca en todos los poros.
c) Volumen de elucin (Ve): Es el volumen al que eluye una sustancia desde que se introduce en
el gel.
Obviamente, Vo y Vt son constantes de la columna, mientras que Ve depende de cada
sustancia. En funcin de estos parmetros se puede definir el Kav, que es semejante al coeficiente
de reparto de la sustancia, y cuya expresin matemtica es:
Kav = (Ve - Vo) / (Vt - Vo)
Para cada tipo de Sephadex, existe un rango de pesos moleculares donde la relacin entre Kav y
el logaritmo de estos pesos es lineal. Por tanto, una columna de este tipo puede servir para
separar sustancias, y tambin para determinar su peso molecular si se compara con otras de
peso molecular conocido en ese rango lineal.


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6) Cromatografa en Papel

Es una tcnica utilizada para anlisis inorgnico cualitativo, permite llevar acabo la separacin e
identificacin de iones, trabajando con cantidades mnimas de sustancias.
Pertenece al tipo Cromatografa de particin se fundamenta en que las sustancia problema,
puedan tener diferentes coeficientes de reparto en dos disolventes de inmiscibilidad limitada, uno
permanece fijo en la superficie del papel fase estacionaria generalmente en agua, la fase mvil
constituida generalmente por una mezcla de
disolventes parcialmente miscibles en ella.

Hay varios tipos de Cromatografa la
ascendente (papel hacia arriba), descendente
(papel invertido), radial y de separacin de
zonas y sectores.
Las cmaras cromatogrficas son de varios
tipos, de forma cilndrica, de unos 30-40 cm
de altura deben cerrar perfectamente, para
evitar la evaporacin del disolvente que satura
la atmsfera, se trabaja con papel
cromatogrfico (Schleider, Schull, Whatman,
etc.)
Al las sustancias a analizar estas al entrar en
contacto con los disolventes empiezan su fase
de movilidad, produciendo unas manchas
caracteristicas ricas para cada sustancia, las
cuales dependern de la cantidad de
compuestos que las compongan.
Generalmente, estas manchas no son coloreadas de por s y se ponen de manifiesto por su
posible fluorescencia a la luz ultravioletafrecuente en sustancias orgnicaso mediante
reactivos qumicos que pueden dar una reaccin coloreada y que se reparten en gran estado de
divisin.
Los contornos de las manchas as reveladas se sealan con lpiz y constituyen la referencia
para la identificacin de las sustancias aisladas. Como medida en cromatografa sobre papel se
emplea el Rf (del ingls: Retention factor).
Se define como el cociente de dividir el recorrido de la sustancia por el del disolvente, o sea la
distancia que media desde el origen hasta el centro de la mancha (X) dividida por la distancia
que media desde el origen hasta el frente del disolvente (S). Rf = X/S.




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7) Cromatografa en Capa Fina
Es una de las ms sencillas. Se denomina as porque la fase estacionaria es una capa fina de una
sustancia hidroflica (slice, almina o acetato de celulosa) colocada sobre un soporte inerte. La
fase mvil es una mezcla de disolventes en diferentes proporciones que migra por la fase
estacionaria en base a capilaridad dentro de una cubeta cerrada y que se encuentra saturada de
vapor de la fase mvil.
En este tipo de cromatografa se utiliza un parmetro
relacionado con el coeficiente de reparto, que se
denomina Rf. Se define como la relacin entre la
distancia recorrida por la sustancia y la distancia
recorrida por la fase mvil. En el caso de esta prctica,
es directamente proporcional con la solubilidad de la
sustancia en la fase mvil. Sus valores oscilan entre 0,
para las sustancias insolubles, y 1 para las sustancias
muy solubles en la fase mvil y que no interacciona
con la fase estacionaria.
Es una de las ms sencillas. Se denomina as porque
la fase estacionaria es una capa fina de una sustancia
hidroflica (slice, almina o acetato de celulosa)
colocada sobre un soporte inerte. La fase mvil es
una mezcla de disolventes en diferentes proporciones
que migra por la fase estacionaria en base a capilaridad dentro de una cubeta cerrada y que se
encuentra saturada de vapor de la fase mvil.
En este tipo de cromatografa se utiliza un parmetro relacionado con el coeficiente de reparto,
que se denomina Rf. Se define como la relacin entre la distancia recorrida por la sustancia y la
distancia recorrida por la fase mvil. En el caso de esta prctica, es directamente proporcional
con la solubilidad de la sustancia en la fase mvil. Sus valores oscilan entre 0, para las sustancias
insolubles, y 1 para las sustancias muy solubles en la fase mvil y que no interacciona con la fase
estacionaria.
La fase estacionaria puede ser variada. Puede ser de papel, de celulosa o de un gel de silicato
(vidrio molido bien fino) unido a una superficie slida (una placa de vidrio, aluminio, plstico o
papel). Esta superficie slida puede ser rgida o flexible. El tipo de fase estacionaria que se utilice
en un experimento depender del tipo de molculas que se quieran separar. Incluso vienen
algunas placas con indicadores fluorescentes. La fase estacionaria consiste de un solvente que
puede ser agua, un solvente orgnico o una mezcla de ambos.

El procedimiento es sencillo: Se colocan las muestras a un centmetro del borde en uno de los
extremos de la placa, se deja secar, se coloca la placa en un envase (tanque de desarrollo) que
ya contiene una pequea cantidad del solvente, se tapa y se deja correr por un rato. El solvente
subir por capilaridad e ir arrastrando las molculas, las cuales se movern segn la afinidad
que muestren por la fase estacionaria. Si la mezcla de muestras que se est analizando presenta
color, se vern los distintos colores migrando a distintas velocidades. Si son incoloras hay que
someter la placa a algn tratamiento con una sustancia desarrolladora (developer) para poder
determinar la presencia de sustancias sobre el silicato. El tipo de desarrollador depender del tipo
de molculas que se analizan.

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8) Cromatografa de Intercambio Inico
La cromatografa de intercambio inico est basada en la atraccin entre iones del soluto y
puntos cargados que existen en la fase estacionaria. En el caso de intercambiadores aninicos,
grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen aniones del soluto. Los
intercambiadores catinicos contienen puntos cargados negativamente que atraen cationes del
soluto.










Los intercambiadores inicos se clasifican en cidos o bsicos,
fuertes o dbiles. Las resinas cidas fuertes siguen ionizadas
incluso en disoluciones muy cidas, en cambio las resinas
cidas dbiles se protonan a un pH prximo a 4 y pierden su
capacidad de intercambio catinico. Los grupos muy bsicos
de amonio cuaternario siguen siendo catinicos a cualquier
valor de pH. Los bsicos dbiles de amonio terciario se
desprotonan en disoluciones moderadamente bsicas y
pierden entonces su capacidad.
Las resinas de intercambio inico tienen aplicacin en estudios
donde intervienen molculas pequeas (PM=500) que
pueden penetrar en los poros pequeos de la resina. Los
intercambiadores inicos de poliestireno son tan grandes que
las macromolculas muy cargadas, como las protenas, se
pueden enlazar irreversiblemente a ellos. Los de celulosa y
dextranos sirven para intercambio inico de macromolculas.
Los geles de intercambio inico se usan en el caso de
molculas grandes (protenas y cidos nucleicos). Cuando las separaciones exigen condiciones
qumicas fuertes se emplean intercambiadores inicos inorgnicos.
La electroforesis es una tcnica analtica de separacin de fundamento cintico basada en el
movimiento o migracin de las macromolculas disueltas en un determinado medio (solucin
tampn de electroforesis), a travs de una matriz o soporte reticulado como resultado de la
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accin de un campo elctrico. El comportamiento de la molcula viene dado por su movilidad
electrofortica y sta por la carga, tamao y forma de la misma. Cuanto mayor es la relacin
carga/tamao ms rpido migra un in en el seno del campo elctrico.


9) Cromatografa de Gases

La cromatografa de gases es una
tcnica cromatogrfica en la que la
muestra se volatiliza y se inyecta en la
cabeza de una columna
cromatogrfica. La elucin se produce
por el flujo de una fase mvil de gas
inerte. A diferencia de los otros tipos
de cromatografa, la fase mvil no
interacciona con las molculas del
analito; su nica funcin es la de
transportar el analito a travs de la
columna. Existen dos tipos de
cromatografa de gases (GC): la
cromatografa gas-slido (GSC) y la
cromatografa gas-lquido (GLC),
siendo esta ltima la que se utiliza ms
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ampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografa de gases (GC). En la GSC la fase
estacionaria es slida y la retencin de los analitos en ella se produce mediante el proceso de
adsorcin. Precisamente este proceso de adsorcin, que no es lineal, es el que ha provocado
que este tipo de cromatografa tenga aplicacin limitada, ya que la retencin del analito sobre la
superficie es semipermanente y se obtienen picos de elucin con colas. Su nica aplicacin es la
separacin de especies gaseosas de bajo peso molecular. La GLC utiliza como fase estacionaria
molculas de lquido inmovilizadas sobre la superficie de un slido inerte.

Diagrama de un cromatgrafo de gases
Gas portador
El gas portador cumple bsicamente dos propsitos: Transportar los componentes de la muestra,
y crear una matriz adecuada para el detector.
Un gas portador debe reunir ciertas condiciones:
Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la fase
estacionaria)
Debe ser capaz de minimizar la difusin gaseosa
Fcilmente disponible y puro
Econmico
Adecuado al detector a utilizar
Generalmente se emplean gases como el helio, argn, nitrgeno, hidrgeno o dixido de
carbono.



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Sistema de inyeccin de muestra
La inyeccin de muestra es un
apartado crtico, ya que se debe
inyectar una cantidad adecuada, y
debe introducirse de tal forma
(como un "tapn de vapor") que
sea rpida para evitar el
ensanchamiento de las bandas de
salida; este efecto se da con
cantidades elevadas de analito. El
mtodo ms utilizado emplea una
microjeringa (de capacidades de
varios microlitros) para introducir
el analito en una cmara de
vaporizacin instantnea. Esta
cmara est a 50C por encima
del punto de ebullicin del
componente menos voltil, y est
sellada por una junta de goma de
silicona septa o septum.

Inyector de muestra para un GC

Columnas y sistemas de control de temperatura
En GC se emplean dos tipos de columnas: las empaquetadas o de relleno y las tubulares abiertas
o capilares. Estas ltimas son ms comunes en la actualidad (2005) debido a su mayor rapidez y
eficiencia. La longitud de estas columnas es variable, de 2 a 50 metros, y estn construidas en
acero inoxidable, vidrio, slice fundida o tefln. Debido a su longitud y a la necesidad de ser
introducidas en un horno, las columnas suelen enrollarse en una forma helicolidal con dimetros
de 10 a 30 cm, dependiendo del tamao del horno.
La temperatura es una variable importante, ya que de ella va a depender el grado de separacin
de los diferentes analitos. Para ello, debe ajustarse con una precisin de dcimas de grado. Dicha
temperatura depende del punto de ebullicin del analito o analitos, y por lo general se ajusta a
un valor igual o ligeramente superior a l. Para estos valores, el tiempo de elucin va a oscilar
entre 2 y 30-40 minutos. Si tenemos varios componentes con diferentes puntos de ebullicin, se
ajusta la llamada rampa de temperatura con lo cual sta va aumentando ya sea de forma
continua o por etapas. En muchas ocasiones, el ajustar correctamente la rampa puede significar
separar bien o no los diferentes analitos. Es recomendable utilizar temperaturas bajas para la
elucin, pero conforme la temperatura es mayor la elucin es ms rpida, pero corriendo el
riesgo de descomponer el analito.
Detectores
El detector es la parte del cromatgrafo que se encarga de determinar cundo ha salido el
analito por el final de la columna. Las caractersticas de un detector ideal son:
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Sensibilidad: Es necesario que pueda determinar con precisin cundo sale analito y
cuando sale slo el gas portador. Tienen sensibilidades entre 10
-8
y 10
-15
g/s de analito.
Respuesta lineal al analito con un rango de varios rdenes de magnitud.
Tiempo de respuesta corto, independiente del caudal de salida.
Intervalo de temperatura de trabajo amplio, por ejemplo desde temperatura ambiente
hasta unos 350-400C, temperaturas tpicas trabajo.
No debe destruir la muestra.
Estabilidad y reproducibilidad, es decir, a cantidades iguales de analito debe dar salidas
de seal iguales.
Alta fiabilidad y manejo sencillo, o a prueba de operadores inexpertos.
Respuesta semejante para todos los analitos, o
Respuesta selectiva y altamente predecible para un reducido nmero de analitos.
Algunos tipos de detectores:
Detector de ionizacin de llama (FID, Flame Ionization Detector).
Detector de conductividad trmica (TCD, Thermical Conductivity Detector).
Detector termoinico (TID, ThermoIonic Detector).
Detector de captura de electrones (ECD, Electron-Capture Detector).
Detector de emisin atmica (AED, Atomic Emission Detector).
Otros detectores minoritarios son el detector fotomtrico de llama (PFD), empleado en
compuestos como pesticidas e hidrocarburos que contengan fsforo o azufre. En este detector
se hace pasar el gas eluido por una llama hidrgeno/oxgeno donde parte del fsforo se
convierte en una especie HPO, la cual emite a = 510 y 526 nm, y simultneamente el azufre se
convierte en S2, con emisin a = 394 nm. Dicha radiacin emitida se detecta con un fotmetro
adecuado. Se han podido detectar otros elementos, como algunos halgenos, nitrgeno,
estao, germanio y otros.
En el detector de fotoionizacin (PID), el gas eluido al final de la columna se somete a una
radiacin ultravioleta con energas entre 8,3 y 11,7 eV, correspondiente a una = 106-149 nm.
Mediante la aplicacin de un potencial a la celda de ionizacin se genera una corriente de iones,
la cual es amplificada y registrada.
Columnas y tipos de fases estacionarias
Columna
Es el lugar donde ocurre la separacin. Se dice que es el corazn de un cromatgrafo.
Los materiales con los cuales generalmente se pueden elaborar las columnas son: cobre,
aluminio, acero inoxidable, vidrio tefln.
El relleno puede ser un slido, un lquido recubriendo un slido.
Podemos clasificar las columnas segn el propsito del proceso cromtografico:
Empacadas
o Analtica
o Preparativas
Capilares
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Cromatografa
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o W.C.O.T. (Wall Coated Open Tubular)
o S.C.O.T. (Support Coated Open Tubular)
Factores que Afectan la Eficiencia de una Columna
Longitud de la Columna
Dimetro de la Columna (1/4", 1/8", 1/16" de dimetro externo)
Tamao de las partculas del relleno
Naturaleza de las fases
Cantidad de fase estacionaria
Temperatura de la columna
Velocidad del gas portador
Cantidad de muestra inyectada
Material del cual est elaborada la columna
Enrollado de la columna
Soporte
La funcin bsica del soporte es la de "mantener" (sostener, retener) la fase estacionaria.
Idealmente debera ser un material inerte que "mantiene" la fase estacionaria sobre su superficie
como una pelcula delgada.
La mayora de los soportes cromatogrficos est hecha de diatomita. Qumicamente es casi todo
slice, con algunas impurezas. Tambin se conoce como Tierras Diatomceas Kiselguhr (palabra
alemana). Domina el campo de los soportes debido a su estructura, superficie y disponibilidad.
Hay que tener en cuenta dos cosas a la hora de escoger un soporte:
La Estructura, Caractersticas Fsicas (contribuye a la eficiencia de la columna
cromatogrfica):
o Tamao de partcula
o Dimetro del poro
o Densidad
o rea Superficial
y
la Qumica de Superficie Caractersticas Superficiales (gobierna la participacin del
soporte en los resultados de la separacin).
o Grupos silanoles activos
o Iones metlicos
Adems de las caractersticas anteriores, la seleccin del soporte va a depender tambin de:
la naturaleza de la muestra
la naturaleza de la Fase Lquida
el uso que se le va a dar a la columna:
o General
o Especfico
Precio
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Cromatografa
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Podemos resumir que un buen soporte debe reunir las siguientes caractersticas:
Elevada Superficie por unidad de volmen
Estabilidad Trmica
Dureza mecnica suficiente para que pueda resistir los procedimientos de revestimientos
y relleno
Inactividad qumica o de adsorcin
Baja resistencia al paso de la fase mvil
La eliminacin reduccin de los sitios activos de adsorcin (tambin conocido como
Desactivacin de la Supeficie) de un soporte cromatogrfico puede efectuarse de varias
maneras:
Remocin por lavado con cido (NAW AW)
Eliminacin Remocin por reaccin del Grupo Silanol
Saturacin de la superficie con una fase lquida
Impregnando recubriendo con material slido inerte
Fase Estacionaria Lquida
Al hablar de fase estacionaria lquida entramos en contacto con dos palabras trminos:
Polaridad y Selectividad.
Las fases lquidas podemos clasificarlas segn sus polaridades cromatogrficas, nos valemos de
unas constantes que determinan dicha polaridad. Existen dos sistemas:
Constante de Rohrchneider
Constante de McReynolds
Existen muchas discusiones sobre este tema para poder definir y describir el parmetro polaridad
en cromatografa, podemos decir que la polaridad de una fase estacionaria lquida se refiere a las
interacciones intermoleculares que involucra dipolos permanentes.
Selectividad es definida como las diferentes atracciones intermoleculares
Varias cualidades ha de reunir un lquido para servir como fase estacionaria:
Viscosidad
Tensin Superficial
Tensin de Vapor
Selectividad respecto a los componentes de la fase mvil
Reversibilidad del Reparto
Estabilidad Trmica
La fase estacionaria
Las propiedades necesarias para una fase estacionaria lquida inmovilizada son:
1. Caractersticas de reparto (factor de capacidad ' y factor de selectividad ) adecuados
al analito.
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Cromatografa
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2. Baja volatilidad, el punto de ebullicin de la fase estacionaria debe ser al menos 100C
mayor que la mxima temperatura alcanzada en el horno.
3. Baja reactividad.
4. Estabilidad trmica, para evitar su descomposicin durante la elucin.
Existen como mucho una docena de disolventes con estas caractersticas. Para elegir uno, debe
tenerse en cuenta la polaridad del analito, ya que a mayor polaridad del analito, mayor polaridad
deber tener la fase estacionaria. Algunas fases estacionarias utilizadas actualmente (2005) son:
Polidimetilsiloxano, fase no polar de uso general para hidrocarburos, aromticos,
polinucleares, drogas, esteroides y PCBs.
Poli(fenilmetidifenil)siloxano (10% fenilo), para steres metlicos de cidos grasos,
alcaloides, drogas y compuestos halogenados.
Poli(fenilmetil)siloxano (50% fenilo), para drogas, esteroides, pesticidas y glicoles.
Poli(trifluoropropildimetil)siloxano, para aromticos clorados, nitroaromticos, bencenos
alquilsustituidos.
Polietilenglicol, para compuestos como glicoles, alcoholes, teres, aceites esenciales.
Poli(dicianoalildimetil)siloxano, para cidos grasos poliinsaturados, cidos libres y
alcoholes.
Aplicaciones
La GC tiene dos importantes campos de aplicacin. Por una parte su capacidad para resolver
(separar) mezclas orgnicas complejas, compuestos organometlicos y sistemas bioqumicos. Su
otra aplicacin es como mtodo para determinar cuantitativa y cualitativamente los
componentes de la muestra. Para el anlisis cualitativo se suele emplear el tiempo de retencin,
que es nico para cada compuesto dadas unas determinadas condiciones (mismo gas portador,
rampa de temperatura y flujo), o el volumen de retencin. En aplicaciones cuantitativas,
integrando las reas de cada compuesto o midiendo su altura, con los calibrados adecuados, se
obtiene la concentracin o cantidad presente de cada analito.