Estudante do Curso de Biomedicina; e-mail: agadacrist@hotmail.com
1 Estudante do Curso de Biomedicina; e-mail: le_cs@click21.com.br 2 Professor da Universidade Estadual de Campinas; e-mail: cabral@fea.unicamp.br 3 Professor da Universidade Bandeirante de So Paulo; e-mail: mribeiro@uniban.br 4 ATIVIDADE ANTIOMICROBIANA E ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS DE PRPOLIS OBTIDOS ATRAVS DA EXTRAO POR FLUIDO SUPERCRTICO Juliana Cristina Pereira Calado 1 ; Leticia Cavalcanti dos Santos 2 ; Fernando Antonio Cabral 3 ; Maria Cristina Marcucci 4 rea do Conhecimento: Cincias da Vida. Palavras-chaves: prpolis; atividade entimicrobiana; atividade antioxidante; extrao supercrtica INTRODUO A prpolis uma resina natural produzida pelas abelhas e utilizada pela populao para o tratamento de inmeras condies mdicas, incluindo infamao, dor e infeces bacterianas. Quimicamente, a prpolis apresenta diversos compostos, sendo que na denominada de verde esto presentes vrios compostos fenlicos. Recentemente, foi demonstrada a tipifcao das amostras de prpolis no Brasil, associando-as a atividades biolgicas especfcas. A tipifcao um processo importante que emprega marcadores qumicos para caracterizar amostras de prpolis provenientes de regies geogrfcas distintas. A fnalidade deste projeto quantifcar os marcadores qumicos da prpolis verde e de fraes obtidas atravs da extrao por fuido supercrtico, empregando-se a CLAE. Concomitantemente, ser avaliado o teor de Artepillin C, o principal marcador da prpolis em questo, em amostras de alecrim, a principal fonte vegetal para a elaborao desta prpolis. Paralemente, ser avaliada a atividade biolgica desta prpolis, fraes e de amostras de alecrim em ensaios biolgicos, tais como ao antioxidante e atividade antimicrobiana, entre outros. Para isso, sero utilizados mtodos qumicos atravs de CLAE, e mtodos e ensaios biolgicos in vitro, alm da quimiometria que ser empregada para estabelecer correlaes entre a composio qumica e as atividades antioxidante e antimicrobiana. Midorikawa et al (2001) identifcaram a presena de Artepillin C, cido 4-hidroxi-3-prenilcinmico, cido p-cumrico e canferide em amostras de prpolis brasileira. Sawaya et al (2004) usaram cromatogramas obtidos por electrospray ionization mass spectrometry para caracterizar e identifcar amostras de prpolis oriundas da Europa, EUA, frica e das diferentes regies do Brasil, identifcando os seguintes componentes: cido p-cumrico, 3-metoxi-4- hidroxicinamaldeido, 2,2-dimetil-6-carboxietenil-2H-1- benzopirano, cido 3-prenil-4-hidroxicinmico, crisina, pinocembrina, cido 3,5-diprenil-4-hidroxicinmico (Artepillin C), cido dicafeoilqumico, entre outros. Pelo exposto, baseando-se no fato de que a prpolis um produto de alto valor no mercado internacional e o Brasil possui um grande potencial para a sua produo, j que produz prpolis de excelente qualidade (considerada hoje a melhor do mundo), verifcou-se a no existncia no Brasil de nenhuma pesquisa usando CO 2 supercrtico para fracionar a prpolis. Porm, esta tcnica que emprega a propriedade anti-solvente para o fracionamento da prpolis j realidade no Japo (JAFRA, 2004), produzindo assim um produto diferenciado e de altssimo valor agregado. Considerando tambm a possibilidade de encapsular os princpios ativos de prpolis usando o dixido de carbono como solvente ou anti-solvente, os objetivos que sero especifcados no prximo item foram estabelecidos como proposta para este trabalho. OBJETIVOS Avaliar o contedo de substncias fenlicas atravs da cromatografa lquida de alta efcincia (CLAE) quantitativa dos extratos de prpolis obtidos atravs da tcnica de extrao por fuido supercrtico. Comparativamente, determinar o teor de Artepillin C em amostras de alecrim, a fonte vegetal para a elaborao da prpolis verde. Verifcar a atividade antimicrobiana e antioxidante das amostras. -2- Atividade antimicrobiana in vitro Os microrganismos empregados nos testes foram: Staphylococcus aureus (S.aureus) ATCC 29213, Salmonella ATCC 33277, Escherichia coli (E.coli) ATCC 25922, Candida albicans (C.albicans) ATCC 10231 e Bacillus cereus (B.cereus). As culturas de bactrias foram mantidas a 20C em TSB + 15% de glicerol e reativadas em meio apropriado para cada cepa. Difuso em disco A atividade antimicrobiana da amostra de prpolis e das fraes dela obtidas e dos extratos de alecrim foi avaliada pelo mtodo de difuso em disco (ensaio preliminar) para confrmar suas atividades contra os microrganismos C. albicans, E. coli e S. aureus, sendo estipulada qualitativamente pelo mtodo de difuso em disco preconizado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2005). As placas foram incubadas a 37 o C, exceto para a C.albicans (24 o C) por 24 horas e, em seguida, o halo de inibio (em mm) foi medido com um paqumetro. Diluio em agar O mtodo de diluio em agar, descrito pelo CLSI (2005), foi utilizado para ser comparado com o da macrodiluio descrita a seguir. A concentrao inibitria mnima (CIM) da amostra de prpolis, das fraes dela obtidas e dos extratos de alecrim foi avaliada como se segue. As concentraes fnais dos extratos hidroalcolicos, a partir do estoque a 1%, foram 0,005%, 0,010%, 0,015%, 0,020%, 0,025%, 0,030% e 0,035%. Estas foram individualmente diludas em meio de cultura gar Muller- Hinton (Merck). O inculo (C. albicans, E. coli, S. aureus, Salmonella e B. cereus) foi preparado atravs de suspenso direta de colnias com turvao equivalente a 0,5 da escala de McFarland em 5,0 ml de soluo salina a 0,85%. Em seguida, foi diludo 1/10 para ser obtida uma concentrao de 10 7 UFC/ml (unidades formadoras de colnias por mililitro). 1 l de cada inculo foi distribudo na superfcie do gar, sendo que a concentrao fnal do inculo foi de aproximadamente 10 4 UFC. Uma placa contendo somente meio de cultura e os inculos bacterianos foi utilizada como controle. Todas as placas foram incubadas a 35 o C por 20h. A CIM foi determinada a partir da placa em que no houve crescimento bacteriano. Este teste foi realizado somente com o material que apresentou halo de inibio, conforme descrito no item anterior. Leitura e interpretao dos resultados Para o mtodo de difuso em disco, os resultados foram interpretados de acordo com halo de inibio alcanado pela prpolis para cada microrganismo sendo a leitura dos resultados realizada a partir da medio do dimetro dos halos em milmetros. Para o mtodo METODOLOGIA Uma amostra de prpolis bruta do tipo verde, de boa qualidade, proveniente da regio sudeste do Brasil foi fornecida pela Bioessens Ltda. A amostra contm 8,2 mg/ g de cido p-cumrico e 44,0 mg/g de Artepillin C. Esta amostra foi fracionada no Laboratrio Extrae (Laboratrio de Extrao Termodinmica Aplicada e Equilbrio) da Faculdade de Engenharia de Alimentos da Unicamp. As amostras de alecrim (Baccharis dracunculifolia) foram cedidas pelo Centro Plurisdisciplinar de Pesquisas Qumicas, Biolgicas e Agrcolas (CPQBA) da Unicamp. Metodologia para a Obteno do Extrato Etanlico da Prpolis (EEP) O extrato etanlico de prpolis foi obtido atravs da mistura de 3 gramas de prpolis bruta com 10 ml de lcool etlico p.a. (ou na mesma proporo) em agitador magntico na temperatura ambiente por 1 dia. Aps esse procedimento, a amostra foi fltrada para a separao da poro insolvel, o fltrado armazenado em freezer por 24 horas e fltrado novamente para a reduo do teor de gordura no extrato. O solvente foi evaporado em estufa a temperatura de 50C at a obteno do extrato seco de prpolis. Clculo do teor de slidos solveis Para cada um dos extratos, tanto o etanlico como os obtidos por extrao supercrtica com CO 2 , foi observado o seguinte procedimento: foi pesado um becker de 25 ml e anotado o peso. 5 ml do extrato foram pipetados no becker e este levado estufa a 60 C at a secura. O becker foi retirado e resfriou-se o que nele havia no dessecador. Pesou-se e repetiu-se a operao at peso constante. O procedimento foi realizado em triplicata. Anlise da prpolis por CLAE Uma quantidade de aproximadamente 50mg da prpolis bruta e de todas as fraes obtidas por extrao em fuido supercrtico foram solubilizadas com 5ml de metanol a quente, fltrada em papel de fltro e passada por um fltro Millipore (0,45, Sartorius) para a anlise por cromatografa lquida de alta efcincia em fase reversa (CLAE). A composio qumica das amostras da prpolis foi avaliada por CLAE (cromatgrafo LaChrom, modelo D-7000, Fapesp proc. 95/09306-5) empregando-se uma coluna C18 em fase reversa e um gradiente linear (fuxo de 1 ml/min) composto de metanol e gua acidifcada com 5% de cido frmico. Foi utilizado um detector de rede de diodos na deteco dos picos. Atividade biolgica e antioxidante A atividade antioxidante foi avaliada empregando- se o radical difenil-picril-hidrazila, conforme o mtodo descrito por Hatano et al, 1989 e Banskota et al, 2000. -3- de diluio em Agar, a CIM foi determinada a partir da placa em que no houve crescimento bacteriano, sendo os resultados expressos como positivo (houve inibio) e negativo (no houve inibio). RESULTADOS E DISCUSSO Com respeito atividade antioxidante, empregando-se o DPPH, as amostras se comportaram de maneira distinta, isto , algumas apresentaram boa atividade antioxidante, quando comparada com a da prpolis bruta. O valor de CE 50% expressa a concentrao que elimina 50% dos radicais livres, isto , quanto menor esta concentrao, maior a atividade. A amostra C3 foi a que apresentou a melhor atividade antioxidante (CE 50% = 7,91) sendo comparada a da prpolis bruta (CE 50% = 7,58). Os valores so mostrados na tabela 1. A atividade antimicrobiana das fraes foi avaliada contra alguns microrganismos. A maioria das fraes da prpolis no inibiu os microrganismos testados, sendo que as amostras C1 a C9 apresentaram halo de inibio, empregando-se o mtodo de difuso em disco. A amostra PB101 foi a que apresentou o maior halo de inibio (10 mm). Outras amostras da srie Pb e SC tambm apresentaram halos de inibio. O extrato etanlico de prpolis avaliado, apresentou halo de inibio somente contra S.aureus (10 mm) sendo que no foi possvel realizar o ensaio com o microrganismo E.coli pois foi necessria a sua reativao. As amostras C5 e C9 apresentaram atividade antimicrobiana na concentrao de 50 g/ml contra o B.cereus. A amostra Pb101 aprensentou atividade comprovada contra B.cereus e S.aureus na concentrao de 100 g/ml, bem como o EEP contra os mesmos microrganismos nesta concentrao. Nenhuma das amostras apresentou atividade antimicrobiana contra C.albicans. A amostra C5 inibiu a Salmonella numa concentrao de 300 g/ml. A tabela 6 mostra o controle microbiano, indicando a ausncia do crescimento da E.coli, motivo pelo qual no foi realizado o ensaio de diluio em agar. As amostras de alecrim foram avaliadas quanto sua atividade antioxidante e antimicrobiana (difuso em disco). As amostras testadas no apresentaram boa atividade antioxidante, quando comparadas com a prpolis (resultados no mostrados). Estas amostras tambm no apresentaram atividade antimicrobiana. CONCLUSES Os resultados encontrados mostram um caminho promissor para o uso da extrao supercrtica na obteno de fraes de prpolis ricas em compostos fenlicos, com atividade antioxidante e antimicrobiana, conforme indicam os resultados. Os dados foram incorporados ao projeto com prpolis do laboratrio Extrae do Prof. Dr. Fernando Cabral da Faculdade de Engenharia de Alimentos da Unicamp. A parceria frmada com o prof. Cabral foi consolidada atravs dos resultados mostrados no presente relatrio. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS BANSKOTA, A. H., TEZUKA, Y., ADNYANA, I.K., MIDORIKAWA, K., MATSUSHIGE, K., MESSAGE, D., HUERTAS, A. A. G.,KADOTA, S. (2000). Journal of Ethnopharmacology 72, 239-246. CLSI (2008). Clinical Laboratory Standards Institute. www.clsi.org. HATANO, T., EDAMATSU, R., MORI, A., FUJITA, Y., YASUHARA, T., YOSHIDA, T., OKUDA, T. (1989). Chemical and Pharmaceutical Bulletin 37, 2016-2021. JAFRA (2004) http://jafra.gr.jp/propolis-e-html SAWAYA, A.C.H.F., TOMAZELA, D.M., CUNHA IBS, BANKOVA, V.S., MARCUCCI, M.C., CUSTODIO, A.R., EBERLIN M.N. (2004). Analyst, 129, 739-744. Tabela 1 Resultados da atividade antioxidante expressos em CE50 (concentrao que elimina 50% dos radicais livres em g/ml)