Profa.

Rafaela Ferreira
Biologia molecular
Farmcia e Biomedicina Noturno - UFMG
Replicao e Reparo do DNA

Watson and Crick, Nature 1953:
'It has not escaped our notice that the specific
pairing we have postulated immediately suggests a
possible copying mechanism for the genetic
material'
Watson, Crick and Wilkins
Nobel Prize in Phisiology and Medicine, 1962
A replicao do DNA semiconservativa
As novas hlices geradas so compostas por uma filha
velha e uma fita recm sintetizada

A replicao do DNA semiconservativa
Cada fita funciona como molde
para uma nova fita

Experimento (1957):

DNA inicial marcado com
15
N

Meio contendo
14
N
A replicao comea em um ponto de origem e
prossegue bidirecionalmente
Origem de replicao: ponto onde a replicao iniciada
Geralmente so ricas em A=T

Experimento: Bactrias em meio com timidina marcada
radioativamente
Nos eucariotos h mltiplas origens de replicao
DNA mais longo e processo de replicao mais lento

Um cromossomo humano demoraria cerca de 800 h para
replicar a partir de apenas uma origem
Mecanismo de elongao da fita de DNA
A replicao ocorre no sentido 5-3
Apenas uma das fitas pode ser
sintetizada continuamente
Fita contnua:
filamento sintetizado inteiro.

Fita descontnua
filamento que sintetizado em
pedaos que depois so ligados
(cada pedao comea por 5 e
termina em 3)


DNA Ligase:
liga os fragmentos de Okazaki
Apenas uma das fitas pode ser
sintetizada continuamente
http://cnx.org/content/m47204/latest/Figure_09_02_03.png
O DNA sintetizado por DNA polimerases
DNA Polimerase I
O processo de elongao pela DNA polimerase
1) Necessita dos 4 precursores ativados + o Mg
2+
O processo de elongao pela DNA polimerase
2) A DNA polimerase necessita de
um primer para iniciar a sntese

Geralmente o primer RNA,
adicionado pela DNA primase

Porque adicionar RNA se este tem
que ser posteriormente removido?

Diversos mecanismos garantem a fidelidade de
replicao
Apenas 1 erro a cada 10
9
nucleotdeos copiados
1 erro a cada 10
4
tanto na transcrio quanto na traduo

Baixa taxa de erro,
considerando que bases
podem parear erroneamente...
Diversos mecanismos garantem a fidelidade de
replicao
1 mecanismo: a ligao covalente de um novo nucleotdeo
favorecida quando o pareamento est correto
Diversos mecanismos garantem a fidelidade de
replicao
2 mecanismo: atividade
exonucleoltica
Diversos mecanismos garantem a fidelidade de
replicao
3 mecanismo: reparo de pareamento incorreto
Tipos de DNA polimerase em E. coli
-1957 - A primeira polimerase foi isolada de E. coli por
Kornberg e foi chamada DNA polimerase I.
-Funes : remoo de primer de RNA, preenchimento
da lacuna resultante e reparao do DNA

- 1970s DNA polimerases II e III
- DNA polimerases II: reparo do DNA
- DNA polimerase III: principal enzima da polimerizao

- 1999 DNA polimerases IV e V
- tipo especial de reparo do DNA

Caractersticas de DNA polimerases de E. coli

Propriedades
DNA polimerase
I II III
Iniciao de sntese da cadeia - - -
Nmero de subunidades 1 7 10
Polimerizao 5-3 + + +
Atividade de exonuclease 3 5 + + +
Atividade de exonuclease 5 - 3 + - -
N de molculas / clula
400 ? 15
Taxa de polimerizao
(nucleotdeos por segundo)
16-20 40 250-1.000
Processividade
3-200 1.500 > 500.000
Nos eucariotos existem outras DNA polimerase
anlogas s dos procariotos
DNA Polimerase em
eucariotos
Funo
DNA Polimerase Replicao do cromossomo nuclear (fita
lagging)
DNA Polimerase Reparo de DNA no preenchimento de
espaos do cromossomo nuclear. Anloga
a Polimerase I
DNA Polimerase Replicao de DNA mitocondrial
DNA Polimerase Replicao do filamento leader a da
lagging do cromossomo nuclear
DNA Polimerase Reparo do DNA do cromossomo nuclear
DNA Polimerase Aparentemente reparo de DNA
Diversas enzimas so necessrias para
a sntese do DNA
Mais de 20 tipos de enzimas e outras protenas envolvidas
Diversas enzimas so necessrias para
a sntese do DNA
As helicases utilizam a
energia da hidrlise do
ATP para impulsionar a
separao das fitas
As topoisomerases
aliviam o estresse
topolgico da dupla
hlice
As protenas ligadoras de
fita simples estabilizam as
fitas e impedem a
formao de grampos
http://classconnection.s3.amazonaws.com/579/flashcards/997579/jpg/41323336959417.jpg
DNA polimerase I :
atividade exonuclesica
5-3

Diversas enzimas so necessrias para
a sntese do DNA
DNA ligase
Diversas enzimas so necessrias para
a sntese do DNA
A finalizao da replicao feita com a formao de estruturas
complexas nas extremidades dos cromossomos, os telmeros

Os telmeros so replicados com a ajuda das telomerases
As telomerases so importantes para a
replicao da poro final dos cromossomos
A sequncia de DNA nos telmeros repetitiva
A telomerase carreia seu prprio molde de RNA
http://cnx.org/content/m47204/latest/Figure_09_02_04.jpg
a extremidade 3 dos telmeros mais longa,
formando a ala T

importante para evitar a juno dos cromossomos
Nas extremidades dos cromossomos forma-se
uma ala T
Diversas enzimas so necessrias para
a sntese do DNA
Sistema de reao:
DNA molde (100 ng)
Iniciadores (5 mM)
dNTPs
Tampo com MgCL
2
Taq polimerase
Protocolo de amplificao:
Desnaturao: 95 C
Anelamento: 50 C
Extenso: 72 C

25x
Amplificao de DNA por PCR
Sequenciamento de DNA:
o mtodo de Sanger (1975)
Polimerizao do DNA a ser sequenciado (molde)
na presena de:
DNA polimerase
primer
dNTPs
ddNTPs

Frederick Sanger Nobel de Qumica
1958 estrutura da insulina
1980 estudos sobre DNA
(com Walter Gilbert)
Sequenciamento de DNA: o mtodo de Sanger
Reparo de DNA
O DNA pode sofrer diversas leses
Oxidao
Hidrlise
Metilao
Dmeros de timina
Quebra de fita dupla
O DNA pode sofrer diversas leses
As leses podem ser mutagnicas
As leses podem ser mutagnicas
Reparo direto da leso
Metil removido por metiltransferase
Reparo de bases mal pareadas
Como possvel saber
qual a fita lesionada?
Em bactrias, fitas recm sintetizadas so
distinguveis por no serem metiladas
Telomerases
Reparo de bases mal
pareadas em procariotos
MutL-MutS se liga ao par mal
pareado

MutH se liga a uma sequncia
GATC metilada (at 1000 pb de
distncia!)

A fita no metilada clivada e
marcada para reparo
Reparo de bases mal pareadas
Telomerases
Reparo de bases mal pareadas em eucariotos
MutS se liga ao par mal pareado

MutL realizada uma varredura,
buscando falhas na fita nova

No h anlogo a MutH.

Mecanismo de reconhecimento
da nova fita ainda no bem
compreendido.
A desaminao produz nucleotdeos no fisiolgicos
Por que temos timina, e
no uracila, no DNA?
adenina hipoxantina
guanina xantina
citosina uracila
timina
Grande parte das mutaes de ponto ocorrem
em citosinas metiladas
Apenas 3% da citosinas so metiladas, mas mutaes nestas
bases correspondem a um tero das mutaes de ponto
Reparo de bases
danificadas
endonuclease remove a base
nitrogenada modificada

nucleotdeo correspondente (e
outros ao redor) so removidos

insero de novos nucleotdeos
Reparo de quebra de fita dupla