INTRODUCCION

Desde hace muchos siglos, los microorganismos probioticos han sido utilizados de forma
empirica, en la produccion de alimentos como por ejemplo diversos p`roductos lacticos y
vegetales fermentados (Chukeatirote. 2003). Estos alimentos aportan caracteristicas
organolepticas, en base a la presencia de determinados microorganismos.
En los ultimos aos se ha demostrado un interes especifico sobre estos microorganismos
debido a que su utilizacion puede mejorar la salud y prevenir enfermedades (Felley et al.,
2001; Reid, 2008).
Antiguamente los alimentos se conservaban mediante un proceso de secado o de
fermentacin natural entre otros. Los hombres aprendieron a producir la gran mayora de
alimentos fermentados, como cerveza, vino, aceitunas, etc.(Rodrguez 2009).
El acido lctico es un producto de la fermentacin dada por las bacterias del gnero
Lactobacillus y es de amplio uso en la industria debido a sus caractersticas benficas,
utilizndosele as en la industria alimentaria (en bebidas y como conservante), en
farmacia, medicina, textilera, en la industria del cuero y para la produccin de plsticos
biodegradables (Estela et al., 2007).
En esta experiencia de laboratorio conoceremos metodologas para el aislamiento, la
seleccin y caracterizacin de especies de bacterias del cido lctico (gnero
Lactobacillus), as como el fundamento de las pruebas bioqumicas que nos permitirn la
diferenciacin bacteriana.






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OBJETIVOS
Objetico general:
Aislar, seleccionar y caracterizar, mediante pruebas bioqumicas, bacterias del gnero
Lactobacillus.
Objetivos especficos:
Aislar bacterias procedentes de muestras de alimentos y bebidas obtenidas por
fermentacin espontanea y comercial.
Describir e identificar las caractersticas culturales de las colonias bacterianas
crecidas.
Diferenciar y caracterizar las bacterias lcticas mediante pruebas bioqumicas.

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PROCEDIMIENTO
1) Aislamiento primario
Procedimiento a partir de muestras de alimento:
La muestra biolgica fueron una salchicha huachana, chicha de jora artesanal y
tocosh; todas estas muestras se consiguieron de lugares donde eran manipuladas sin
condiciones de esterilidad.
De cada una de las muestras se tom aproximadamente 1g que se trituro y se
homogenizo en 9mL de solucin salina, obteniendo una dilucin 1/10, luego se
realizaron diluciones sucesivas hasta la dilucin 1/1000.
Con la ayuda de una pipeta se inocularon 0.1 ml de la dilucin 1/1000 en Agar Man
Rogosa Sharpe y Agar LAPTg y se sembr por diseminacin con una esptula de
Drigalsky.
Se incubaron a 30 C por 48 horas en condiciones de microaeroflia.
2) Diagnostico presuntivo:
Se observ las colonias y se describieron las caractersticas culturales de cada una.
Se eligieron colonias que presentaban un crecimiento similar al que, por teora, se
conoca de las bacterias lcticas (seleccin de colonias tpicas).
Se realiz una coloracin Gram a cada una de las colonias elegidas.
Se realizo la prueba de catalasa colocando un poco de inoculo en una lmina con una
gota de perxido de hidrgeno.
Se sembraron las colonias tpicas en caldo MRS y se incubaron a 30C durante 24h.
Se tom un inculo del crecimiento en caldo y se sembr en la batera bioqumica
preparada para la caracterizacin de las colonias aisladas.
3) Seleccin de colonias tpicas:
Se seleccionaron dos colonias tpicas de Lactobacillus de cada muestra y se
sembraron en caldo MRS y se incubaron por 24h a 30C.
4) Pruebas diferenciales
Obtener los cultivos en caldo de las cepas tpicas en fase exponencial.
Lavar las clulas bacterianas con solucin salina esteril (0.85%) por dos veces. La
centrifugacin se realizara a 3500 rpm por 10 minutos.
A partir del paquete celular, preparar la suspensin bacteriana (D.O. : 0.6 a 560 nm).
Agregar a 5mL de medio de fermentacin de carbohidratos y al medio Gluconato de
Potasio, 300uL (0.3mL) de la suspensin celular. En este ultimo medio de cultivo,
aadir VASPAR (2mL) para crear condiciones anaerbicas y observar la produccin
de gas.
Incubar a 30C por 24-96h.
Hacer la lectura y verificar el perfil bioqumico de acuerdo a las tablas de
diferenciacin bioqumica del manual de Bergueys.

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RESULTADOS
Caractersticas culturales de las colonias de las bacterias lcticas:
MUESTRA DE SALCHICHA HUACHANA:
En agar Man Rogosa Sharpe: Colonias translucidas (claras), circulares, en forma de
roco, borde entero, lisas, opacas y elevada. (fig.1)
En agar LAPTg: Colonias circulares, translucidas/claras, en forma de roco, borde entero,
lisas, cremosas y elevada. (fig.2)
MUESTRA DE TOCOSH
En agar Man Rogosa Sharpe: No hubo crecimiento de colonias de ningn tipo. (fig. 3)
En agar LAPTg: No hubo crecimiento de bacterias lcticas. (fig.4)
MUESTRA DE CHICHA DE JORA
En agar Man Rogosa Sharpe: Colonias translucidas (claras), circulares, en forma de
roco, borde entero, lisas, opacas y elevada. (fig.5)
En agar LAPTg: Colonias circulares, translucidas/claras, en forma de roco, borde entero,
lisas, cremosas y elevada. (fig.6)
En los medios de cultivo provenientes de las muestras de Chicha de Jora y salchicha
huachana, adems de bacterias lcticas, crecieron levaduras: las caractersticas
culturales de las levaduras son: colonias circulares de 1-2mm de dimetro de color
crema, convexas, mucosas, opacas y olor rancio.
Diagnostico presuntivo:
De las placas con medios de cultivo.
Agar MRS Agar LAPTg
Gram Bacilos finos + Bacilos finos + Salchicha
huachana catalasa - -
Gram Bacilos + Bacilos + Chicha de
jora catalasa - -

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Crecimiento en caldo MRS:
El caldo se torno turbio, lo que nos indicaba que hubo crecimiento de las bacterias
sembradas.
Diagnstico diferencial:
Muestras experimentales
Fuentes
carbonadas
Medio de fermentacin de carbohidratos
(aerobiosis)
Medio de fermentacin de carbohidratos
(anaerbiosis)
fructosa + +
glucosa + +
Lactosa + +
ino + +

Muestras patrn:
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3
Fuentes
carbonadas
Medio de fermentacin
de carbohidratos
(condiciones aerbicas)
Medio de fermentacin
de carbohidratos
(condiciones aerbicas)
Medio de fermentacin
de carbohidratos
(condiciones aerbicas)
Galactosa + + +
Maltosa + + +
Lactosa + + +
Rafinosa + + +
Ribosa + - +
Sacarosa + + +
Arabinosa + - +
Glucosa + + +
Amigdalina - - -
Manitol - - +

Medio Gluconato
de Potasio
Sin gas Sin gas Con gas

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DISCUSIN
Las caractersticas de los medios de cultivo en los que se hizo el aislamiento primario
inhiba el crecimiento de la mayora de microorganismos debido a que El Agar MRS y el
LAPTg son medios con un pH cido (6.5) y tienen componentes como el monoleato de
sorbitn, magnesio, manganeso y acetato, que pueden inhibir el desarrollo de algunos
microorganismos y el citrato de amonio que acta como agente inhibitorio del crecimiento
de bacterias Gram negativas. Es as como la mayora de los microorganismos
acompaantes quedan inhibidos dejndose crecer solamente las bacterias lcticas y las
levaduras (que soportan el pH del medio de cultivo). Pero no todos los microorganismos
son inhibidos, es por eso que en la placa con muestra de Tocosh crecieron tres colonias
que no eran ni bacterias lcticas ni levaduras.
En las placas sembradas con muestras de Chicha de jora y salchicha huachana hubo
crecimiento masivo de colonias, entre ellas las que ms eran notorias por el tamao y la
abundancia eran las de las levaduras, pero no obstante, hubo crecimiento regular de
colonias tpicas del genero Lactobacillus. Luego se comprob mediante la identificacin
presuntiva por pruebas de catalasa y coloracin Gram.
De las placas sembradas con muestras de Tocosh solo una mostr crecimiento de
bacterias, pero estas eran distintas a Lactobacillus y levaduras; esto debido a que la carga
bacteriana era pobre porque la muestra no estaba homogenizada al momento de tomar el
inculo. Otra causa puede deberse a que la esptula de Drigalsky estril se contamin al
momento de retirar la envoltura y no la flameamos en el mechero porque se supona que
se encontraba estril, lo cual favoreci a la aparicin de las tres colonias contaminantes.
La lectura de nuestros resultados en los medios para las pruebas bioqumicas fue errnea
debido a que el indicador del pH no reaccionaba adecuadamente, por este motivo se
usaron muestras patrn que nos permitan diferenciar la actividad de las bacterias del
genero Lactobacillus frente a diversos azucares.
El indicador de pH que se uso fue el purpura de bromocresol, el cual en basicidad y en
estado normal es purpura/morado y en acides es amarillo. La acides significa que esa
bacteria ha sido capaz de metabolizar el carbohidrato y producir acido lctico.
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Con estos resultados y comparando con las tablas de diferenciacin de especies del
genero Lactobacillus segn el metabolismo de los azucares llegamos a la conclusin de
que la muestra patrn 1 puede corresponder a Lactobacillus fermentum.

BIBLIOGRAFIA
Libros:
1. Madigan, M et al. 2009. Brock Biologa de los microorganismos. Pearson educacin,
S.A. 12 edicin. Madrid, Espaa. Pp 492-493.
2. Koneman, E. et al. 2006. Diagnostico microbiolgico texto atlas en color. Editorial
Mdica Panamericana S.A. 6 edicin. Argentina. Pp 593-630.
Sitios en internet:

3. Agar Man Rogosa Sharpe. En Britanialab.com. Febrero 2010. [Consultado: abril
2014],
http://www.britanialab.com/productos/404_hoja_tecnica_es.pdf
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[Consultado: Abril 2014],
http://www.britanialab.com/productos/580_hoja_tecnica_es.pdf
Artculos:
5. Sobrino O. 1993. Caracterizacin parcial, bioqumica e inmunolgica, de una
sustancia antimicrobiana producida por Lactobacillus sake 148. Universidad
Complutense De Madrid. Departamento de Nutricin y Bromatologa III (Higiene y
Tecnologa de los Alimentos). Facultad de veterinaria. Tesis doctoral.
6. Rodrguez M. 2009. Aislamiento y seleccin de cepas del genero Lactobacillus con
capacidad probitica e inmunomoduladora. Facultad de biociencias, Departamento de
gentica y microbiologa. Universidad autnoma de Barcelona. Tesis doctoral.
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7. Ortiz M. 2006. Identificacin bioqumica de bacterias acido lcticas aisladas a partir
de productos lcteos en el estado de Hidalgo. Instituto de ciencias bsicas e
ingeniera. Universidad del Estado de Hidalgo. Tesis doctoral.
8. Chukeatirote E. 2003. Potential use of probiotics. Songklanakarin Journal of Science
Technology. 25(2): 275-282.
9. Felley C.p., Corthesy-Theulaz I., Rivero J., Sipponene p., Kaufmann B., Wiesel
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acidified milk (LC-1) on Helicobacter gastritis in man. European Journal of
Gastroenterology and Hepatology. 13 (1): 25-29.
10. Estela W., Rychtera M., Melzoch K., Quillama E. & Egoavil E. 2007. Produccin de
acido lctico por Lactobacillus plantarum L10 en cultivos batchy continuo.