GTC84 Validación de Análisis Microbiológicos

GUA TCNICA GTC
COLOMBIANA 84

2003-02-26

CALIDAD DEL AGUA.
GUA PARA LA ORIENTACIN ACERCA DE LA
VALIDACIN DE MTODOS DE ANLISIS
MICROBIOLGICOS

E: WATER QUALITY. GUIDANCE ON VALIDATION OF
MICROBIOLOGICAL METHODS

CORRESPONDENCIA: esta gua es una adopcin idntica
(IDT) por traduccin de la ISO/TR
13843:2000 Water Quality. Guidance on
Validation of Microbiological Methods.

DESCRIPTORES: microbiologa de agua; anlisis
microbiolgico; calidad del agua.

I.C.S.: 07.100.20

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC)
Apartado 14237 Bogot, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435

Prohibida su reproduccin Editada 2003-03-17

PRLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo
nacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993.

ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.

La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica
est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo
caracterizado por la participacin del pblico en general.

La GTC 84 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2003-02-26.

Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.

A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a
travs de su participacin en el Comit Tcnico 25 Microbiologa.

ACEITES Y GRASAS VEGETALES S.A.
ALPINA S.A.
AQUALAB
ASINAL LTDA
ASOCIACIN COLOMBIANA DE
MICROBIOLOGA
AVESCO
BAVARIA S.A.
BIOCONTROL
BIOMERIUX
BIOQUILAB LTDA
BIOTRENDS
CARULLA VIVERO S.A.
CENICAA
COMPAA NACIONAL DE CHOCOLATES
S.A.
CONGELAGRO
CONSULTOR BLANCA USECHE
COOPERATIVA DE GANADEROS DE
CARTAGENA LTDA.
CREPES & WAFLES
EMPRESA DE ACUEDUCTO Y
ALCANTARILLADO DE BOGOTA E.S.P.
ENZIPAN DE COLOMBIA LTDA
FBRICA DE ESPECIAS Y
CONDIMENTOS EL REY
FRIGORFICO GUADALUPE.
FRIGORFICO SUIZO S.A.
FRIGORFICOS COLOMBIANOS S.A.
COLFRIGOS S.A.
GASEOSAS COLOMBIANAS S.A.
INGENIO PICHICHI S.A.
INGENIO PROVIDENCIA S. A.
INSTITUTO COLOMBIANO
AGROPECUARIO - ICA
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
IVONNE BERNIER LABORATORIO
LTDA.
LABORATORIO BIOCONTROL
LABORATORIO DE SALUD PUBLICA
BOGOTA
LESNIAK E.U
LEVAPAN S.A.
MERCADEO DE ALIMENTOS DE
COLOMBIA S.A.
NULAB LTDA.
PURIFICACIN Y ANLISIS DE
FLUIDOS LTDA.

QUALA S.A.
QUIOS LTDA.
REPRESENTACIONES
BIOTECNOLGICAS
TRES M. COLOMBIA S.A.

UNIVERSIDAD CATLICA DE MANIZALES
INGECAL
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES LEMA
UNIVERSIDAD JAVERIANA

Adems de las anteriores, en Consulta Pblica el Proyecto se puso a consideracin de las
siguientes empresas:

ALGARRA S.A.
ASESORIAS MICROBIOLGICAS
AVESCO
CONSULTORA BEATRIZ DEL PILAR
MACAS
CASA LUKER S.A.
CERVECERA LEONA
COLOMBINA S.A.
CONSULTORAS MICROBIOLGICAS
DISA S.A.
FRESENIUS MEDICAL CARE
CONSULTOR NARDA PABN
CONSULTOR MARIA CLEMENCIA MORA
CONSULTOR ANA MARA MORALES
INGENIO PROVIDENCIA
LABORATORIO PROCALIDAD
LABORATORIOS GRAM
LLOREDA GRASAS S.A.
MINISTERIO DE SALUD
NESTL DE COLOMBIA S.A.
PANAMCO COLOMBIA MANANTIAL
PASSIFLORA COLOMBIANA S.A.
PRODUCTORA DE JUGOS S.A.
RICA RONDO
TECNIMICRO LABORATORIO DE
ANLISIS
UNIDAD ADMINISTRATIVA DE SALUD
PBLICA
UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO
VIKINGOS S.A.

ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales.

DIRECCIN DE NORMALIZACIN

GUA TCNICA COLOMBIANA GTC 84

NDICE
Pgina

1. OBJETO 1

2. TRMINOS Y DEFINICIONES 1

3. ORGANIZACIN DEL DOCUMENTO 9

4. CONCEPTOS BSICOS 10

5. LIMITACIONES Y CARACTERSTICAS PROPIAS DE LOS
MTODOS MICROBIOLGICOS 14

6. MODELOS MATEMTICOS DE VARIACIN 17

7. ESPECIFICACIONES - PRCTICA ACTUAL 25

8. ESPECIFICACIONES - ENFOQUE RECOMENDADO 26

9. DETERMINACIN Y EXPRESIN DE CARACTERSTICAS DE DESEMPEO 28

10. PROCEDIMIENTOS Y PASOS DE VALIDACIN 32

11. DISEOS PARA DETERMINAR LAS ESPECIFICACIONES 34

ANEXOS

ANEXO A PROCEDIMIENTOS ESTADSTICOS Y PROGRAMAS DE COMPUTADOR 36

ANEXO B EJEMPLOS NUMRICOS 40

ANEXO C EJEMPLO DE EXPERIMENTO DE VALIDACIN 50

BIBLIOGRAFA 51


1

CALIDAD DEL AGUA.
GUA PARA LA ORIENTACIN ACERCA DE LA
VALIDACIN DE MTODOS MICROBIOLGICOS

1. OBJETO

Esta gua trata acerca de la validacin de mtodos microbiolgicos, con especial nfasis en
mtodos cuantitativos selectivos en los cuales el clculo cuantitativo se basa en el recuento de
partculas, ya sea directamente, con la ayuda de un microscopio, o indirectamente, sobre la
base del crecimiento (multiplicacin) en colonias o turbidez.

Los principios y procedimientos dentro de este objeto se conocen comnmente como el
recuento de presencia/ausencia (P/A), el nmero ms probable (NMP), recuento de colonias y
recuento directo (microscpico).

Esta gua no aplica a la validacin de los as llamados rpidos y modernos mtodos que
dependen en su mayor parte de la medicin de productos o cambios debidos a la actividad
microbiana pero no tratan la deteccin de partculas individuales.

2. TRMINOS Y DEFINICIONES

Para los propsitos de esta gua se aplican los siguientes trminos y definiciones:

2.1
exactitud de la medicin
grado de correspondencia entre el resultado de un ensayo y el valor de referencia aceptado

NOTA El trmino "exactitud", cuando se aplica a un conjunto de resultados de ensayo, involucra una combinacin
de componentes aleatorios y un error sistemtico o componente de desviacin comn .

[ISO 3534-1:1993, 3.11]

2.2
elemento mensurado
analito
cantidad particular sometida a medicin

NOTA 1 Vase la referencia [5]


2
NOTA 2 En microbiologa, el analito se define idealmente como una lista de especies definidas taxonmicamente. En
muchos casos, en la prctica el analito solo puede definirse por designaciones de grupo menos exactas que las
definiciones taxonmicas.

2.3
porcin de ensayo
porcin analtica
volumen de suspensin de partculas inoculado en una unidad detectora

NOTA Son ejemplos de una unidad detectora: la placa de agar, el filtro de membrana, el tubo de ensayo, la
cuadrcula microscpica.

2.4
intervalo de aplicacin
intervalo de concentraciones de partcula que rutinariamente se someten a medicin mediante un
mtodo.

2.5
caracterstica categrica
caracterstica de desempeo de un mtodo expresada numricamente como una frecuencia
relativa con base en la clasificacin P/A (presencia /ausencia) +/- (positivo/negativo).

2.6
UFC, depreciada
unidad formadora de colonia, depreciada
CFP, depreciado
partcula formante de colonia, depreciada

NOTA El trmino se introdujo originalmente para transmitir la idea de que una colonia puede originarse no slo a
partir de una clula nica, sino de una cadena slida o agregado de clulas, un grupo de esporas, un segmento de
micelio, etc. Equivocadamente se iguala el nmero de colonias observadas con el nmero de entidades vivas
sembradas en el medio. Unidad de crecimiento, partcula viable, propgula (vase el numeral 2.27) y germen (vase
el numeral 2.13) son trminos con significados similares pero transmiten mejor la idea original y no se aplican slo a
mtodos de recuento de colonias, sino tambin a NMP y P/A.

2.7
coeficiente de variacin
CV
desviacin estndar relativa
para una caracterstica no-negativa, es la proporcin de la desviacin estndar al promedio

NOTA 1 La proporcin puede expresarse como un porcentaje.

NOTA 2 El trmino "desviacin estndar relativa" se emplea algunas veces como una alternativa al "coeficiente de
variacin", pero no se recomienda este uso.

[ISO 3534-1:1993, 2.35]

NOTA 3 En esta gua el trmino coeficiente de variacin (CV) se emplea cuando la desviacin estndar relativa se
expresa en porcentaje (CV % = 100 RSD).

2.8
ensayo conjunto
ensayo de desempeo de un mtodo o laboratorio en el que se unen varios laboratorios en un
experimento planeado y coordinado por un laboratorio lder.

NOTA Los ensayos conjuntos son principalmente de dos tipos. Se realizan los ejercicios de intercalibracin para
permitir que los laboratorios comparen sus resultados analticos con aquellos de otros laboratorios participantes.


3
Los ensayos de desempeo de mtodos producen clculos de precisin (repetibilidad, reproducibilidad) de los datos
acumulados cuando varios laboratorios participantes estudian muestras idnticas con un mtodo estrictamente
normalizado.

2.9
recuento de colonia confirmado [verificado]
x
probable recuento de colonia corregido para falsos positivos

c
n
k
pc x
en donde

c es el recuento probable;

p es la tasa positiva verdadera;

n es el nmero de probables positivos aislados de contaminacin;

k es el nmero confirmado.

2.10
grfico de control
diagrama de dispersin bi-dimensional para monitorear el desempeo del mtodo con valores de
control obtenidos mediante un estudio Tipo A.

NOTA En los cuadros de control, el eje horizontal generalmente est en la escala del tiempo o la escala de las
ordenadas y la variable de control es la media o alguna medida de precisin (s, CV. RSD).

2.11
detector
detector de partculas

placa de matriz slida o tubo de lquido que contiene un medio nutriente para el recuento o
deteccin de partculas microbianas vivas.

2.12
conjunto de deteccin
conjunto detector
combinacin de placas o tubos sobre los cuales se basa el clculo cuantitativo de concentracin
microbiana en una muestra.

NOTA El conjunto de deteccin es el conjunto de placas o tubos utilizados para el clculo numrico de un nico valor.

EJEMPLOS Las placas paralelas de una suspensin, las placas de diluciones consecutivas, sistema de NMP de 3 x 5
tubos, placa de microttulo.

2.13
germen
entidad viva capaz de producir crecimiento en un medio con nutrientes

cf. propgula (vase el numeral 2.27)


4
2.14
grfico de orientacin
diagrama de dispersin bi-dimensional que sirve para presentar los datos de desempeo del
mtodo (cantidad o precisin) con valores de gua arbitrarios o valores de gua obtenidos por
razonamiento Tipo B.

NOTA En los grficos de orientacin, por lo general el eje horizontal es el recuento de la colonia por detector.

2.15
distribucin homognea de Poisson
distribucin que se origina cuando la media de una distribucin de Poisson vara aleatoriamente
de vez en cuando.

NOTA 1 Vase la referencia [11].

NOTA 2 Tambin vase la distribucin binomial negativa (vase el numeral 2.19).

2.16
lmite de deteccin
nmero de partculas
x
(por porcin analtica) donde la probabilidad p
0
de un resultado negativo
es igual al 5 %.

NOTA 1 Probabilidad de un resultado positivo p(+) = 1 -p
0

NOTA 2 a) Clculo de x va distribucin Poisson:

00 3 20
05 0
1 1
, ) ln(
,
ln
po
ln x
,
_
,
_

b) Clculo de x va distribucin binomial negativa:

2 2 2
1 20 1 5 0
1
2 2
2
u u
,
u
po (
x
u u
u
,
_

2.17
lmite de determinacin
concentracin de partculas mnima promedio
x
por porcin analtica, donde la incertidumbre
estndar relativa esperada es igual a un valor especificado (RSD)

NOTA a) Clculo de x por la va de distribucin Poisson:

2
1
) RSD (
x


5
b) Clculo de x por la va de distribucin binomial negativa:

2 2
1
u ) RSD (
x

2.18
linealidad
dependencia lineal de la seal en la concentracin del analito

cf. proporcionalidad (vase el numeral 2.28)

2.19
distribucin binomial negativa
distribucin estadstica particular "sobre dispersa" de recuentos

NOTA 1 Su varianza se puede expresar como

2 2
2 + u

en donde

es la media

NOTA 2 En la presente gua el cuadrado del factor de sobredispersin (u) se remplaza por el inverso del exponente
(1/k) de la frmula de la norma para la distribucin binomial negativa.

2.20
sobredispersin
exceso de variacin de la aleatoriedad de Poisson

NOTA Se detecta cualitativamente mediante el ndice de dispersin de Poisson y se mide cuantitativamente
calculando el parmetro u (factor de sobre dispersin) de la distribucin binomial negativa.

2.21
factor de sobredispersin
u
incertidumbre aleatoria adicional de la determinacin excesiva de la distribucin de Poisson,
medida en trminos de desviacin estndar relativa.

2.22
error de sobreposicin (traslapo)
error de apiamiento
depresin sistemtica de recuentos de colonia debido a la confluencia de colonias

NOTA Cuantitativamente, el error de traslapo o apiamiento depende principalmente de la fraccin de espacio de
crecimiento disponible ocupado por el crecimiento colonial.

2.23
recuentos paralelos
cantidades de partculas o colonias en porciones analticas iguales tomadas de la misma
suspensin.


6
2.24
distribucin de Poisson
distribucin completamente aleatoria de cantidades de partculas cuando se muestrea una
suspensin perfectamente mezclada.

NOTA La probabilidad P (k) de observar exactamente unidades k en una porcin de ensayo cuando la media es igual
a se calcula con la siguiente frmula:

e
! k
) k ( P
k

2.25
precisin
grado de concordancia entre resultados de ensayo independientes obtenidos bajo condiciones
estipuladas.

NOTA La precisin no se relaciona con el valor verdadero o el valor especificado. Por lo general, se expresa en
trminos de imprecisin y se calcula como una desviacin estndar de los resultados de ensayo.

2.26
validacin primaria
validacin completa
establecimiento de las especificaciones para el desempeo de un nuevo mtodo y/o verificacin
experimental de que un mtodo cumple criterios de calidad derivados tericamente.

2.27
propgula
entidad viable, clula vegetal, grupo de clulas, espora, grupo de esporas o una parte de micelio
fungal capaz de crecer en un medio nutriente

cf. germen (vase el numeral 2.13)

2.28
proporcionalidad
acuerdo de recuentos de partculas observados con el volumen (o dilucin) de una serie de
porciones analticas de una suspensin de origen comn.

NOTA La proporcionalidad se calcula para evaluacin estadstica como la G
2
estadstica de la relacin de
probabilidad logartmica con n-1 grados de libertad.

2.29
mtodo cualitativo
mtodo de anlisis cuya respuesta es la presencia o ausencia del analito en una cierta cantidad
de muestra

NOTA Vase la referencia [10].

2.30
recuperacin
trmino general empleado para la cantidad de partculas calculada en una porcin de ensayo o
muestra, entendiendo que existe un nmero verdadero (aunque desconocido) de partculas de
las cuales el 100 % o menos son "recuperadas" por el detector.


7
2.31
exactitud relativa
grado de correspondencia entre la respuesta obtenida por el mtodo de referencia y la respuesta
obtenida por el mtodo alternativo en muestras idnticas.

NOTA Vase la referencia [10]

2.32
diferencia relativa
d
diferencia entre dos valores medidos divididos por su media

B A
B A B A
x x
x x
x
x x
d
+
( 2

d % =100 d

NOTA Para todos los propsitos prcticos, el mismo valor resulta del clculo d = In(xA) - In(xB).

2.33
recuperacin relativa
razn (A/B) de recuentos de colonias obtenidos por dos mtodos ensayados sobre la porcin de
ensayo de la misma suspensin, donde B es la referencia (cuando es aplicable)

2.34
recuperacin relativa
RSD
clculo de la desviacin estndar de una poblacin de una muestra de n resultados dividido por
la media de dicha muestra

x
s
RSD

cf. coeficiente de variacin (vase el numeral 2.7)

2.35
repetibilidad
grado de concordancia entre los resultados de mediciones sucesivas del mismo elemento
mensurado realizadas bajo las mismas condiciones de medicin.

NOTA 1 Vase la gua: Guide to the expression of uncertainty in measurement [6]

NOTA 2 La repetibilidad se calcula como r= 2,8 sr, donde sr es la desviacin estndar de la repetibilidad.

2.36
reproducibilidad
grado de concordancia entre los resultados de las mediciones en el mismo elemento mensurado
realizadas bajo condiciones de medicin alteradas.

NOTA 1 Vase la gua: Guide to the expression of uncertainty in measurement [6]

NOTA 2 La reproducibilidad se calcula como R= 2,8 sR,


8
en donde

sR es la desviacin estndar de la reproducibilidad generalmente compuesta por la desviacin estndar
entre laboratorios sL y la desviacin estndar de repetibilidad sr:

2 2
r L
s s sR +

2.37
robustez
insensibilidad de un mtodo analtico frente a pequeos cambios en procedimiento.

NOTA 1 Vase la referencia [23]

NOTA 2 A fin de examinar la robustez, es aconsejable "abusar" del mtodo en forma controlada.

2.38
validacin secundaria
demostracin, mediante experimentos, de que un mtodo establecido funciona de acuerdo con
sus especificaciones, cuando lo emplea el usuario.

2.39
selectividad aparente
F
Proporcin del nmero de colonias objeto de la cantidad total de colonias en el mismo volumen
de muestra

F = lg (t/n)

en donde

t es la concentracin aparente de presuntos tipos objeto calculados por colonias de recuento;

n es la concentracin del total de colonias

2.40
sensibilidad
fraccin de la cantidad total de culturas positivas o colonias correctamente asignadas en la
presunta inspeccin.

2.41
especificidad
fraccin del nmero total de culturas o colonias negativas asignadas correctamente en la
presunta inspeccin.

2.42
incertidumbre estndar
incertidumbre del resultado de una medicin expresada como desviacin estndar



9
2.43 EVALUACIN TIPO A

(de incertidumbre) Mtodo de evaluacin de incertidumbre mediante el anlisis estadstico de una
serie de observaciones.

EJEMPLO Las observaciones pueden ser, por ejemplo, la desviacin estndar, la desviacin estndar relativa.

NOTA 1 Vanse las referencias [5] y [6].

NOTA 2 Con frecuencia se calculan la repetibilidad y la reproducibilidad realizando ensayos de desempeo del
mtodo conjunto cuando varios laboratorios estudian muestras "idnticas" provistas por un organizador central [15].

2.44
evaluacin Tipo B
(de incertidumbre) Mtodo de evaluacin de incertidumbre por medios diferentes al anlisis
estadstico de series de observaciones, por ejemplo, a partir de supuestas distribuciones de
probabilidad con base en la experiencia u otra informacin.

NOTA Vanse las referencias [5] y [6]

2.45
incertidumbre
(de medicin) parmetro, asociado con el resultado de una medicin, que caracteriza la
dispersin de los valores que poda atribuirse razonablemente al elemento mesurando.


2.46
incertidumbre
(de recuento) desviacin estndar relativa de resultados de recuento repetido de las colonias o
partculas de la(s) misma(s) placa(s) o campo(s) bajo condiciones estipuladas.

EJEMPLO Las condiciones estipuladas pueden ser por ejemplo, la misma persona o diferentes personas en un
laboratorio, o diferentes laboratorios.

2.47
intervalo de validacin
intervalo del nmero promedio de partculas por porcin analtica para el cual se ha demostrado
en forma aceptable la obediencia de especificaciones de validacin (en especial la linealidad).

NOTA Por lo general se expresa como el intervalo de recuentos "confiables" de colonias.

3. ORGANIZACIN DEL DOCUMENTO

La primera parte (vanse los numerales 4 a 8) de esta gua contiene material informativo sobre
principios bsicos, caractersticas y limitaciones de mtodos microbiolgicos, lo mismo que sobre
aspectos generales de validacin. La segunda mitad (vanse los Captulos 9 a 11) es el documento
de validacin real, que contiene especificaciones y procedimientos recomendados para su
determinacin.

En el cuerpo de esta gua no se definen por completo los viejos y nuevos conceptos y principios.
Se adjuntan tres anexos. El Anexo A ofrece los detalles de las frmulas estadsticas ms
pertinentes a este documento, el Anexo B contiene ejemplos numricos y el Anexo C ofrece
planes detallados para los dos experimentos de validacin.


10
Los ensayos estadsticos en el sentido ordinario no son centrales para las ideas. Los clculos
matemticos de emplean principalmente con el propsito de ofrecer resmenes convenientes de
datos y las distribuciones estadsticas ofrecen valores de orientacin. La gua que con mayor
frecuencia se consulta es la tabla de distribucin X
2
.

Los dos programas de BASIC presentados en el Anexo A se copian con facilidad en los
computadores de escritorio o calculadoras de bolsillo programables para ayudar a la realizacin
de los clculos bsicos ms frecuentemente requeridos.

4. CONCEPTOS BSICOS

4.1 GENERALIDADES

En lo que se refiere a estadsticas de partculas, los recuentos microscpicos obedecen las
mismas leyes que los recuentos viables pero estn, con la excepcin de los mtodos de micro
colonia, libres de problemas biolgicos asociados con el crecimiento. Los colorantes
diferenciales, complejos rotulados especficamente u otros agentes empleados para hallar el
objetivo no alteran los principios metrolgicos. Se pueden aplicar los mismos principios de
validacin como mtodos de colonia selectivos.

Los recuentos de placa de bacterigrafos son en la mayora de aspectos similares a los
recuentos de colonias bacteriales.

4.2 VALIDACIN

4.2.1 Generalidades

La validacin significa un proceso que ofrece evidencia de que un mtodo es capaz de servir
para su propsito planeado, es decir, para detectar o cuantificar un grupo microbiano o microbio
especificado con adecuada precisin y exactitud. Los mtodos de recuento total no tienen un
grupo objeto definible y slo pueden validarse en relacin con otros mtodos o contra
expectativas tericas de precisin.

La validacin se clasifica como primaria o secundaria de acuerdo con su propsito.

4.2.2 Validacin primaria

La validacin primaria es un proceso exploratorio con la meta de establecer los lmites operacionales
y caractersticas de desempeo de un mtodo nuevo, modificado o caracterizado en forma
inadecuada. Debera originar especificaciones numricas y descriptivas para el desempeo e incluir
una descripcin detallada y precisa del objeto de inters (colonia positiva, tubo o placa)

Caractersticamente, la validacin primaria procede mediante el uso de esquemas de ensayo
especialmente diseados.

Los laboratorios que desarrollan un mtodo "en casa" o una variante de una norma existente
debera realizar los pasos de validacin primaria.

Resulta imperativo que los tcnicos que participan en la validacin primaria cuenten con
considerable experiencia en los otros mtodos microbiolgicos.


11
4.2.3 Validacin secundaria

La validacin secundaria (tambin llamada verificacin) tiene lugar cuando un laboratorio procede
a implementar un mtodo desarrollado en otra parte. La validacin secundaria se centra en la
reunin de evidencia acerca de que el laboratorio est en capacidad de cumplir las
especificaciones establecidas en la validacin primaria. En el presente, no se encuentran
especificaciones para la mayora de mtodos. Es posible que se tengan que emplear los
resultados de aseguramiento de la calidad externo (vase el numeral 4.2.8) como el primer paso
hacia la validacin secundaria completa.

Normalmente, la validacin secundaria emplea formas seleccionadas y simplificadas de los
mismos procedimientos empleados en la validacin primaria, aunque posiblemente extendidas
por un tiempo mayor. Las muestras naturales constituyen el material de ensayo ptimo y el
trabajo slo requiere tratar el procedimiento dentro de los lmites operacionales establecidos por
la validacin primaria.

4.2.4 Control de calidad analtico (CCA)

La aplicacin de mtodos vlidos en sus lmites confiables especificados no asegura
automticamente resultados vlidos. Es necesario el control de calidad analtico (AQC) empleado
en conexin con anlisis de rutinas diarias. Por medio de ste se controla la capacidad de
emplear un mtodo exitosamente.

El AQC es un proceso continuo. Las principales herramientas son los grficos de orientacin, con
lmites derivados de especificaciones de mtodos (a partir de la validacin primaria) o de
consideraciones tericas.

Los mtodos de AQC son extensiones del proceso analtico de rutina, por ejemplo, rplicas a
diferentes niveles, o simplemente clculos que no se realizan ordinariamente en datos de rutina.
Adicionalmente, se emplean materiales de referencia, intercalibraciones y muestras con adicin
conocida.

El control de calidad analtico es necesario en conexin con la validacin primaria y secundaria.
Se deberan emplear slo resultados confiables en el sentido de AQC par ala derivacin de
criterios de validacin y caractersticas de desempeo.

Los grupos de trabajo internacionales y nacionales han producido numerosos documentos sobre
control analtico de la calidad de mtodos microbiolgicos (por ejemplo, las referencias
[1,2,3,4,7,8,20,21,24,26]. Los manuales de normas tambin contienen secciones que tratan el
tema. Aunque son vitales para la validacin, en esta gua no se detallan los mtodos de control
analtico de la calidad. En todo lo que sigue, se supone que los laboratorios cuentan con los
controles analticos apropiados y sistemas de aseguramiento de la calidad internos y externos en
operacin.

4.2.5 Mtodos equivalentes

Es necesario aplicar dos mtodos en forma paralela sobre las mismas muestras al desarrollar un
mtodo en casa y tambin al reunir informacin para justificar el uso de un mtodo alternativo.

El desempeo del mtodo consta de muchos aspectos. No existe un nico ensayo de equivalencia
de mtodo, ni criterios numricos para l. Un mtodo puede ser superior en especificidad, pero
inferior en recuperacin. Para comparaciones de mtodos (ejemplos B.2, B.3, B.4 en el Anexo B) se
puede emplear toda la informacin colectiva acerca de la estabilidad, precisin y especificidad
ganada durante los ensayos de validacin.


12
Obviamente, el mejor es el mtodo que ofrece la ms alta recuperacin de organismos objeto
confirmados, a menos que siempre se requiera confirmacin para el uso rutinario. Puede resultar
preferible un mtodo que ofrezca una recuperacin un poco baja pero no requiera confirmacin,
Si no se pueden corregir altas tasas negativas falsas o tasas positivas falsas observadas en la
validacin primaria, mediante definiciones de colonia objeto ms refinadas, el mtodo debera
considerarse no vlido.

Es una creencia popular que la validacin debera simular la rutina tanto como sea posible. Las
muestras naturales con concentraciones naturales de microbios , por lo tanto, deberan ser los
principales materiales de ensayo. Existen excepciones bajo algunas circunstancias.

Se emplean materiales artificiales (materiales de referencia certificados y muestras con adicin
conocida) en sistemas de aseguramiento de la calidad internos y externos a fin de garantizar la
competencia bsica de los laboratorios que participan en los ejercicios de validacin del mtodo.

La adicin de una sustancia conocida puede ser til e incluso necesaria en la validacin
secundaria siempre que resulte difcil encontrar muestras naturales con organismos objeto. El
personal del laboratorio podr familiarizarse con el objeto.

Las muestras negativas (blancos) deberan limitase al aseguramiento interno de la calidad. Su
inclusin en las muestras estudiadas para equivalencia del mtodo puede conducir a una falsa
impresin de una buena correlacin entre los mtodos. Si fuera posible conocer por anticipado
cules muestras naturales no contienen ningn organismo objeto, stas representaran una
seleccin conveniente para ensayar falsos positivos en ejercicios de validacin real.

El intervalo de concentracin ptima para la validacin de mtodos microbiolgicos es ms angosto
que el intervalo de aplicacin proyectado. No son necesarias altas concentraciones. Dichas muestras
se asemejan a culturas puras y no ponen a prueba el desempeo del mtodo o el laboratorio.

LAS muestras con muy bajo contenido bacterial deben estudiarse por razones de salud pblica,
pero no son adecuadas para comparaciones de mtodo y otros ejercicios de validacin por
razones estadsticas. La mayora de veces, el problema es evitable puesto que los mtodos
microbiolgicos generalmente no son sensibles a la concentracin en el ltimo extremo de la
escala. Cada germen individual reacciona con el medio nutriente casi independientemente de
otras partculas de la muestra. Si un mtodo tiene una baja recuperacin en comparacin con
otro, el hecho se descubre con mayor prontitud con veinte o treinta partculas formadoras de
colonia por placa que con una o un poco.

Los mtodos encontrados vlidos a concentraciones suficientes para validacin son confiables
para trabajar tambin a concentraciones bajas de analito.

4.2.7 Muestras - representatividad y suficiencia

La teora estadstica provee soluciones para el clculo del nmero de muestras requeridas para
diferentes situaciones de ensayo o clculo [3, 13]. Para poder hacer uso de la teora, se debera
definir la dimensin de los efectos de importancia real y el poder para detectarlos. Debera
contarse con un clculo de la incertidumbre (precisin) de la determinacin y debera practicarse
muestreo aleatorio.

Muchos o todos los anteriores requisitos son difciles de cumplir en la planeacin y ejecucin
anticipada de ensayos de desempeo de mtodo microbiolgico. Las tcnicas estadsticas, si se
emplean, se convierten en directrices aproximadas.


13
La cantidad y variedad de muestras examinadas debe ser suficiente para ser convincente. Sin la
ayudad de la estadstica, no existen formas exactas de decidir. En algunos casos, la primera
muestra estudiada podra dar la respuesta de que el mtodo no es lo suficientemente bueno. No
obstante, por lo general, se requieren ms muestras. Se pueden requerir miles de muestras para
"probar" que dos mtodos P/A no son equivalentes. La seleccin de muy pocos ejemplos puede
representar una perdida de tiempo.

4.2.8 Aseguramiento externo de la calidad y otros ensayos de colaboracin

Con la participacin de varios laboratorios en estudios de material "homogneo" se considera
que se realizan ensayos esenciales de tanto el mtodo como el desempeo del laboratorio.
(Despus de haber reconocido y eliminado anmalos, se considera que los datos restantes
ofrecen la informacin necesaria sobre el desempeo y eficiencia del mtodo).

Los ensayos de colaboracin se han convertido en una herramienta ampliamente aplicada para
las caractersticas de precisin de ensayo de mtodos qumicos [34]. Parece un poco prematuro
recomendar plenamente lo mismo en microbologa. Se supone que todos los laboratorios
participantes cuentan con muchos aos de experiencia en los mtodos ensayados y una
comprobada capacidad de emplearlos. Por la experiencia presente sabemos que los
experimentos de colaboracin destinados a ensayos de desempeo de mtodos tienden a
convertirse en ensayos de competencia del laboratorio y ejercicios de formacin.

Numerosos mtodos microbiolgicos han estado en uso durante dcadas (por ejemplo, agar
Endo para colformes totales, mFC para colformes termotolerantes, agar m-Enterococcuspara
enterococos intestinales) por cientos de laboratorios. Por ende, estos mtodos tericamente
seran objetos adecuados para ensayos de desempeo de mtodo de colaboracin.

Al realizar ensayos de competencia de colaboracin para organismos objeto especficos con
medios selectivos, de forma casi imprescindible las muestras deberan tener una adicin
conocida con cultivos puros o mezclas de organismos. Otra solucin consiste en emplear
materiales de referencia certificados. Esta es una situacin simplificada y artificial. Se pueden
omitir las principales dificultades experimentadas por diferentes laboratorios en el uso rutinario de
mtodos en muestras naturales. Ya que las caractersticas de desempeo detalladas de un
mtodo microbiolgico no se han expresado cuantitativamente, estos tipos de esquemas de
aseguramiento externo de la calidad (EQA) pueden, a pesar de todo, ser el medio ms
satisfactorio hacia la validacin secundaria (verificacin) de un mtodo.

4.3 DETECTORES

4.3.1 Generalidades

Con frecuencia resulta conveniente denominar detector (vase el numeral 2.11) al medio nutriente en
su contenedor. Se emplean dos tipos de detectores, slidos y lquidos, en diferentes variantes de
mtodos microbiolgicos. Adems, en la mayora de los casos, se asocian con diferentes principios
de enumeracin o deteccin: lquido con P/A y NMP, y slido con recuentos de colonia.

Todas las formas de validacin en microbiologa se centran en el desempeo de los detectores.

El conjunto de tubos (NMP) o la serie de placas (contables) empleadas para anlisis se
denomina conjunto de deteccin o conjunto detector (vase el numeral 2.12). Cada NMP de tubo
individual es un detector P/A.

EJEMPLO Un pozo individual de una placa de microttulo es un detector de P/A. La placa completa cuando se emplea
como un sistema NMP es el conjunto de deteccin.


14
4.3.2 Comparaciones de detectores

Para la mayora de mtodos de recuento de colonia se puede producir una contraparte lquida
con la misma composicin qumica pero con la matriz slida (agar, filtro de membrana). El efecto
del ambiente slido puede evaluarse comparando recuentos de colonia con el clculo NMP
equivalente siempre que la reaccin para reconocimiento de objeto sea la misma en ambos tipos
de detectores y el nmero de tubos paralelos sea lo suficientemente grande para la precisin
adecuada. Adems se puede evaluar la sensibilidad de los detectores de P/A mediante
comparaciones de lquidos-slidos similares.

4.4 CARACTERSTICAS DE DESEMPEO

Las caractersticas de desempeo deberan ser cuantificables y susceptibles de ensayo para
usarse en validacin.

La terminologa sobre caractersticas de desempeo en esta gua, en su mayor parte, sigue el
uso quimiomtrico. Puesto que las definiciones originales de los trminos no siempre encajan con
los mtodos microbiolgicos a la perfeccin, stas han sido modificadas y adaptadas, de acuerdo
con las necesidades.

Las caractersticas de desempeo tratadas en esta gua se relacionan con el objeto (lista de
situaciones y tipos de muestras donde el mtodo es aplicable), la precisin, linealidad,
recuperacin, lmites de trabajo en trminos del ms bajo y ms alto nmero de colonias
recomendable por placa, selectividad, especificidad y estabilidad (rugosidad). En el Captulo 2 se
pueden encontrar definiciones de estos y otros trminos.

4.5 ESPECIFICACIONES

Las especificaciones son expresiones numricas o cualitativas de caractersticas de desempeo
o de lmites de trabajo derivados de ellas. La validacin primaria debera ofrecer los siguiente:

a) identificacin morfolgica del (presunto) objeto;

b) declaraciones con respecto a las condiciones de incubacin (temperatura, tiempo,
gas, atmsfera, humedad) y caractersticas de los medios (pH, estabilidad);

c) una declaracin en cuanto a los lmites de trabajo confiables en trminos de
colonia o nmeros de placa por detector (placa, numero ms probable , filtro de
membrana) si es posible;

d) expresiones de incertidumbre dentro de lmites confiables especificados;

e) objeto y limitaciones

5. LIMITACIONES Y CARACTERSTICAS PROPIAS DE LOS MTODOS MICROBIOLGICOS

5.1 RECUPERACIN DEL ANALITO

El analito microbiolgico consta de partculas vivas discretas, llamadas de diversas maneras
como: unidades formadoras de colonias (UFC), partculas formadoras de colonia (PCF),
grmenes, propgulas, etc. (vase el Captulo 2). El nmero de colonias observadas es una
aproximacin del nmero de partculas vivas.


15
El arsenal til de los ensayos de desempeo se limita por la casi imposibilidad de conocer la
verdadera cantidad del analito en una muestra o en una porcin analtica. No se pueden verificar
los detectores con una cantidad exactamente conocida de microorganismos.

La viabilidad se define por crecimiento, es decir, por el mtodo mismo. La recuperacin absoluta
es indefinible y la trazabilidad es imposible. Puesto que la viabilidad puede ser diferente con
diferentes detectores y/o con diferente historia de la muestra, la recuperacin relativa (que
involucra el nuevo mtodo y una referencia) es una caracterstica de desempeo posible aun
cuando no se conozca el resultado verdadero.

5.2 VARIANZA DE LA MUESTRA

En el medio ambiente e incluso en las muestras de laboratorio, la distribucin de las partculas es
desigual. La varianza del muestreo del medio ambiente no es una caracterstica del mtodo, si
bien la varianza del submuestreo de una muestra de laboratorio si se puede considerar as.
Probablemente no sea posible emplear prcticas de mezclado suficientes para garantizar la
mezcla perfecta del contenido de una muestra sin cierta prdida de clulas viables. Dentro de la
muestra, con frecuencia la varianza es considerable y causa problemas en la validacin. El
desempeo, especialmente la precisin y los lmites de trabajo superiores, no deben
determinarse por separado para diferentes matrices.

5.3 DISTRIBUCIN DE LAS PARTCULAS Y SOBRE DISPERSIN

La variacin aleatoria debida a la distribucin desigual de las partculas entre muestras paralelas,
incluso en suspensiones perfectamente mezcladas, es una caracterstica propia de los mtodos
microbiolgicos [31].

La variacin aleatoria bsica es inevitable y no tiene nada que ver con las destrezas tcnicas o el
equipo. sta sigue una conocida ley matemtica, la de la distribucin de Poisson [28], y, por
tanto, es confiable.

Las imperfecciones tcnicas y muchas otras causas son responsables de la variacin adicional.
Las determinaciones paralelas varan incluso ms que lo que se explica mediante la distribucin
de Poisson. La situacin se denomina sobredispersin (vase el numeral 2.20).

Muchos argumentos apoyan la distribucin binomial negativa (vase el numeral 2.19) como un
modelo de sobredispersin en microbiologa [11, 14, 15].

5.4 INTERACCIONES EN EL DETECTOR

Surgen considerables dificultades de las interacciones de los factores abiticos y biticos dentro de
los detectores. Los detectores lquidos sufren de posible cohabitacin de una variada microflora en el
mismo tubo. Los detectores slidos sufren de apiamiento y enmascaramiento de colonias objeto por
crecimiento de desechos y de otras colonias no deseadas. La lectura se hace difcil, no confiable o
imposible.

5.5 ROBUSTEZ

Los mtodos microbiolgicos no son robustos. Tanto el analito como la mayora de impurezas
son vivas, lo cual puede causar fenmenos inesperados en los detectores. Los microbilogos
deberan poder reconocerlos y entenderlos. Los efectos de la matriz, el estrs de incubacin, la
calidad y el origen de los ingredientes del substrato, la composicin de la flora microbiana de la
muestra y la capacitacin de los tcnicos son todos factores que pueden afectar el resultado.


16
La falta de robustez se origina en cinco reas principales: la muestra (sus propiedades
fisicoqumicas y la poblacin microbiana), el personal competente, la preparacin de la muestra,
las condiciones de incubacin y el medio de deteccin. De stos, los tres ltimos deberan
normalizarse.

La validacin primaria debera establecer los lmites generales dentro de los cuales se espera
que los mtodos se desempeen bien. El diseo estadstico eficiente para ensayos de robustez
desarrollado por AOAC [34] puede aplicarse tambin en microbiologa.

Considerando la naturaleza viva del analito, la libertad de opcin en cuanto a tiempos de reaccin
(tiempo de incubacin) y temperatura de incubacin con frecuencia es sorprendente. Los
recuentos de colonia son ms sensibles al tiempo que lo que se supone normalmente. Por
ejemplo, las normas internacionales, en su esfuerzo por incluir prcticas actuales en diferentes
pases, frecuentemente involucran la robustez con lmites improbables.

EJEMPLO La descripcin del mtodo para deteccin y enumeracin de organismos coliformes permite la
incubacin durante 18 h a 24 h a36 C t 1 C. Esto implica estabilidad considerable de resultados hacia las variaciones
en el tiempo y temperatura de incubacin; probablemente ms que la realmente verdadera.

Cuando la temperatura es uno de los factores selectivos (por ejemplo, 44 C con coliformes
termotolerantes) incluso la posicin de la placa en el incubador o en la pila de placas pueden
tener marcados efectos en el resultado. Esto se ha reconocido en algunas normas mediante la
especificacin del ms alto tamao de pila permisible (por ejemplo, seis). La eliminacin total del
efecto de apilamiento requerira incubacin en una capa solamente, lo cual se considera
impracticable.

Otra caracterstica importante de la robustez que rara vez se considera es el almacenamiento de las
muestras antes del anlisis. Se considera generalmente vlido que las muestras puedan tolerar
almacenamiento refrigerado durante, por ejemplo, 24 h [9]. El estrs en fro impuesto durante el
almacenamiento refrigerado puede no ser importante para los recuentos totales pero resulta
perjudicial para los mtodos que dependen de mtodos altamente selectivos. Los choques trmicos y
otros cambios adicionales no son generales sino especficos del mtodo.

5.6 ERRORES ESPORDICOS

Una caracterstica tpica de la mayora de mtodos de recuento de colonia microbiolgicos es su
predisposicin a problemas inesperados, con frecuencia en una sola placa. Las diferentes
tcnicas (estriado, dispersin superficial, FM) son bastante diferentes en este aspecto. Los
problemas pueden deberse a la presencia de una sola colonia perturbadora, humedad,
diferencias de temperatura, slidos y otras impurezas en la parte de ensayo, contaminacin, etc.
Tales "accidentes" no reflejan el desempeo del mtodo en general y no son ni cuantificables en
validacin ni predecibles con modelos matemticos, cuando, con mucha frecuencia, emplean un
mtodo incierto. Los mtodos de cultivo lquido son menos susceptibles.

Los partidarios de la "ltima tecnologa" son de la opinin de que los errores espordicos
pertenecen a mtodos microbiolgicos y deberan incluirse en el clculo de incertidumbre del
desempeo. Esto se relaciona con la idea de que los mtodos deben validarse como aparecen
en uso.

La opinin de este Reporte Tcnico es que los errores espordicos son asunto por tratar en el
AQC diario. Aunque su deteccin depende de la competencia de los tcnicos, debera hacerse
todos los esfuerzos por reconocer los valores errneos y eliminarlos. Si se descubre que los
errores espordicos causan fallas de anlisis frecuentes, el mtodo es obviamente inadecuado
par el propsito destinado.


17
5.7 GRFICOS DE CONTROL Y ORIENTACIN

Un procedimiento analtico es un tipo de proceso, y se puede considerar como su producto la
medicin o determinacin resultante. Puede parecer que la idea del grfico de control bsico, surgida
en la industria de procesos, funciona tambin en el control del proceso analtico. Este ayudara a
detectar si han ocurrido cambios repentinos o ms insidiosos en la calidad del proceso. Cuando una
situacin fuera de control es ms o menos cierta, el proceso puede detenerse y repararse.

Las posibilidades de control de proceso en el anlisis son limitadas. Los tipos ms comunes son
el empleo de muestras de referencia para ensayar la constancia de la recuperacin (ausencia de
desviacin sistemtica) y determinaciones duplicadas para verificar la precisin (repetibilidad y/o
reproducibilidad).

Este planteamiento encaja bien con los anlisis qumicos automatizados, pero no es adecuado
para anlisis microbiolgicos. Con ste, se supone que el proceso (es decir el procedimiento
analtico) se encuentra en su mejor desempeo en el inicio y puede daarse repentina o
gradualmente, despus de lo cual todos los resultados son errneos. En microbiologa, no es fcil
indicar cuando un mtodo esta bajo o fuera de control. Es posible que un resultado analtico de
deficiente calidad no est relacionado con ningn otro resultado del mismo da.

Las representaciones grficas son elementos tiles y prcticos no slo en el AQC sino tambin
en algunos contextos de validacin. Por las razones indicadas arriba, su uso en microbiologa
debera estar limitado a ofrecer orientacin en la prctica analtica, No deberan emplearse para
desaprobar el trabajo analtico de un da entero o de una serie de resultados.

Se ha sugerido que el trmino "grfico de control" debera restringirse a situaciones de control
obvio, tales como monitoreo de temperaturas del incubador. Se prefiere el trmino "grficos de
orientacin" al ilustrar grficamente el desempeo de mtodos microbiolgicos. No obstante
pueden escogerse algunos valores de gua para ayudar a la toma de decisiones.

6. MODELOS MATEMTICOS DE VARIACIN

6.1 VARIACIN BSICA INEVITABLE - DISTRIBUCIN DE POISSON

6.1.1 Generalidades

La variacin por azar de las cantidades de partculas entre porciones de ensayo paralelas en la
escala de trabajo ptimo de los detectores microbiolgicos es considerable incluso si la
suspensin se mezcla perfectamente (aleatoriedad completa) y no se involucran incertidumbres
tcnicas de medicin.

Con esto se crea un dilema microbiolgico tpico. Los mtodos de recuento de colonia se encuentran
en su mejor desempeo, en la mayora de aspectos biolgicos y tcnicos, cuando los nmeros son
tan pequeos que la precisin estadstica es inadecuada.

6.1.2 Precisin de los detectores de recuento de colonia

Por lo general, la precisin se expresa en trminos de la desviacin estndar. La variacin
estadstica bsica de recuentos puede modelarse matemticamente por la distribucin de
Poisson.

La varianza (s
2
) de la distribucin de Poisson es numricamente igual a la media (m). (La
igualdad de la media y la varianza no prueban que los datos sigan una distribucin de Poisson).


18
La desviacin estndar relativa (RSD) es una relacin inversa al recuento de la media o en
forma ms general al recuento total (c) del conjunto de deteccin:

c c
c
c
s
RSD
1
(1)

EJEMPLO Un solo recuento de placa de una muestra de una suspensin perfectamente mezclada, digamos 48
colonias, tiene la precisin relativa terica (RSD) de 1/48 = t 0,14 (CV = 14 %). Si el mismo recuento total, 48
colonias, ha resultado de tres placas paralelas 12 + 16 +20 = 48, la desviacin estndar relativa de la media 48/3 = 16
debera ser la misma.

En la Figura 1 se muestra la dependencia de la precisin relativa (CV, coeficiente de variacin)
en el recuento de partculas.

Particula
C
V
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
0
150
125
100
75
50
25

Figura 1. Coeficiente de variacin de nmero de colonias c en una suspensin mezclada
perfectamente siguiendo la ley de distribucin de Poisson

El grfico muestra por qu los nmeros de colonias tales como 20, 25 30 se han considerado
tradicionalmente como los recuentos confiables estadsticamente ms bajos.

El modelo de Poisson puede emplearse para calcular la incertidumbre estadstica terica en
cualquier recuento de colonia y a la inversa para tomar decisiones sobre los lmites de trabajo
inferiores con base en la precisin estadstica estipulada.

La incertidumbre aleatoria se incrementa rpidamente a medida que el recuento de colonia
decrece (vase la Figura 1). En la escala de recuento por debajo de aproximadamente diez, lo
que resulta ser de considerable inters para la salud pblica, las mediciones nicas son tan
imprecisas que difcilmente se pueden caracterizar como mejores que semi-cuantitativas.

La escala de recuento de 1 a 10 corresponde aproximadamente a la escala que determina la
precisin caracterstica del clculo comn de NMP de 3 x 5-tubos. La clasificacin de los
recuentos de colonia por debajo diez como semi-cuantitativos se encuentra en armona con la
opinin de muchos estadsticos de que los mtodos de NMP de acuerdo con los diseos 3 x 3
3 x 5 se consideran ms apropiadamente como ensayos del orden de magnitud en vez de los


19
clculos cuantitativos. (El clculo de NMP de 3 x 5- tubos presenta el intervalo de confianza del
95 % de cerca de t 0,5 unidades logartmicas [12]).

6.1.3 Precisin de los detectores de NMP

La precisin de los clculos de NMP depende del recuento mismo, pero de una manera un poco ms
complicada que la del recuento de colonia. La desviacin estndar del registro de NMP es una curva
ondulatoria. Tiene tantos elementos mnimos locales como niveles de dilucin existentes en el
conjunto de deteccin. Como ejemplo, la desviacin estndar logartmica se calcul para el detector
de NMP de 3 x 10 tubos con la ayuda de un programa de computador [19] (vase la Figura 2).

0
0
0,4
0,3
l
o
g

S
D
10 5
Nmero de positivos
0,2
0,1
15 20 25 30
COCH
SE

Figura 2. Desviacin estndar logartmica de NMP de 3 x 10 tubos

El nmero de tubos positivos en el conjunto completo se encuentra sobre la abscisa. La curva
ondulante muestra la verdadera desviacin estndar. La horizontal recta es la aproximacin de
Cochran [12].

Cochran [12] propuso una desviacin estndar constante aproximada para la escala entera de
NMP. Esta aproximacin se indica mediante la lnea horizontal en la Figura 2. Parece que el
resultado exacto se desva el mximo de la aproximacin cuando la mayora de los tubos en el
conjunto de deteccin son negativos.

De acuerdo con la frmula de Cochran [12], la precisin del clculo de NMP en la escala
logartmica depende de manera sencilla del nmero de tubos (n) y del factor de dilucin (f) entre
diluciones consecutivas. Se escogi la constante 0,58 "al ojo" para diluciones dcuplas a fin de
proporcionar el ajuste ilustrado en la Figura 2. Si el factor de dilucin entre las diluciones es
menor a diez, entonces se puede emplear la constante 0,55 [12].

Desviacin estndar (SD) de lg NMP =
n
f lg
,58 0 (2)

Los lmites de confianza del 95 % en muchas tablas de NMP se basa en la aproximacin de
Cochran en la ecuacin (2), pero se estn remplazando por lmites "verdaderos" ms exactos en
tablas recientemente publicadas.


20
En la actualidad, la desviacin estndar de cualquier valor e NMP individual se obtiene fcilmente
mediante un apropiado programa de computador, por ejemplo, el [19].

A pesar de su naturaleza aproximativa, la frmula de Cochran es til en la planeacin
experimental y las comparaciones de mtodos (vase el ejemplo a continuacin).

EJEMPLO Suponga una determinacin basada en el sistema de deteccin de NMP de 3 x 32 pozos en una placa
de microttulo de 96 pozos. Suponga, adems, un factor de dilucin f = 2 entre diluciones consecutivas. La desviacin
estndar de lg NMP, de acuerdo con la frmula aproximada de Cochran es:

Desviacin estndar (SD) de lg NMP = 2 067 0 9 014 0 55 0
32
3
55 0 , , ,
lg
, (3)

Con nmeros elevados de tubos paralelos y factores de dilucin inferiores a 10, los sistemas de
NMP se vuelven iguales o mejores que los mtodos de colonia debido a las condiciones
superiores de crecimiento, la facilidad de interpretacin y la ausencia de errores de traslapo.

6.1.4 Lmite de deteccin - modelo Poisson

En concentraciones de partculas muy bajas, todos los mtodos microbiolgicos, NMP y recuento
de colonia incluido, se convierten esencialmente en mtodos de P/A (presencia/ausencia). Existe
poco dao, en lo que respecta a salud pblica o evaluacin de la calidad del producto, al
considerar cualquier recuento por debajo de tres o cuatro como simples detecciones positivas de
presencia.

Si el limite de deteccin se define en trminos de la probabilidad de registrar un resultado
positivo, ste no se puede leer en la Figura 1. La probabilidad de un resultado positivo p (+)
cuando la distribucin de Poisson prevalece puede calcularse a partir de

m
e ) ( p

+ 1

en donde

e es la base de logaritmos naturales;

m es el nmero promedio de partculas por porcin analtica.

EJEMPLO Una de las definiciones populares del lmite de deteccin es la concentracin a la cual la probabilidad
de detectar la presencia del analito es igual al 95 % [p(+) = 0,95].

Si se toma p(+) como 0,95, entonces e
-m
= 1 - 0,95 = 0,05. Al solucionar la ecuacin para m se produce m = - ln (0,05) =
3,0. Por lo tanto, en el recuento promedio de 3, las oportunidades de detectar una partcula en una porcin de ensayo
es igual a 0,95 (siempre que prevalezca la distribucin de Poisson).

6.2 SOBREDISPERSIN - EL MODELO BINOMIAL NEGATIVO

6.2.1 Generalidades

La preparacin de la suspensin bsica, la dilucin, inoculacin y recuento de las colonias no
estn totalmente libres de incertidumbre. Cada paso tcnico se agrega a la variabilidad total de la
medicin. No se puede esperar que las determinaciones paralelas que involucran el
procedimiento analtico completo sigan la distribucin de Poisson. Se observar la


21
sobredispersin, es decir la variacin mayor que la aleatoriedad completa (en el sentido de
Poisson), entre determinaciones paralelas.

La sobredispersin es el estado normal de las determinaciones microbiolgicas y la distribucin
de Poisson es una excepcin.

Las causas comunes de la sobredispersin, aparte de los errores espordicos, tienen efectos
aproximadamente proporcionales a la media o en realidad al nmero total de colonias (c)
contadas en el conjunto de deteccin. Ms adelante [11,14] se presentan otros argumentos de
por qu la sobredispersin de recuentos microbiolgicos debera seguir este patrn. Puesto que
la incertidumbre bsica debida a la dispersin aleatoria de las partculas en suspensin sigue la
distribucin de Poisson, la varianza total s
2
puede expresarse como

s
2
= c +u
2
c
2

en donde

u es el factor de sobredispersin, desviacin estndar relativa de incertidumbrre adicional

c es el recuento de colonia en el conjunto entero de deteccin.

La primera parte de la varianza (c) se debe al proceso de Poisson, el resto (u
2
c
2
) se debe al
efecto combinado de todos los factores de sobredispersin aleatorios. Una distribucin
estadstica con este modelo de varianza se denomina una distribucin binomial negativa (tambin
distribucin de Poisson compuesta o heterognea).

Consecuentemente, la desviacin estndar relativa puede expresarse como

2
1
u
c
RSD +

La Figura 3 muestra el efecto de diferentes grados de sobredispersin en la precisin relativa
total (coeficiente de variacin)


22

C
V
,

%
CV15
CV
0
0
125
150
10
Nmero de particulas, C.
CV30
100
75
50
25
20 40 30 60 50 80 70 100 90

NOTA Dependencia del coeficiente de variacin (CV) del nmero (c) de partculas contadas y variacin adicional
moderada. Curva inferior: el modelo de Poisson sin sobredispersin. Curvas superiores: binomiales negativos con
dispersin del 15 % y 30 % (u= 0,15 y 0,30).

Figura 3. Efecto de sobredispersin en CV

El nmero de colonias requerido para alcanzar una precisin total relativa es considerablemente
superior en una situacin de sobredispersin que en el caso aleatorio totalmente (Poisson). Se
puede calcular resolviendo la ecuacin (6) para el nmero de colonia c:

2 2
1
u RSD
c
(7)

EJEMPLO Para lograr la desviacin estndar relativa RSD= 0,2 cuando la sobredispersin es u= 0,15 se requiere, de
acuerdo con la ecuacin (7), el nmero de colonia c = 1/(0,2
2
- 0,15
2
) = 1/(0,04 - 0,022 5) = 57. La misma precisin se alcanza
en una situacin completamente aleatoria (Poisson) con el nmero de colonia c = 1/0,2
2
= 1/0,04 =25.

NOTA Resulta obvio que no se pueda alcanzar la precisin total inferior a la sobredispersin dentro de una sola
determinacin. El procedimiento completo debe repetirse si se requiere mejor precisin. Con n determinaciones
paralelas, la desviacin estndar relativa total puede calcularse aproximadamente a partir de

n
u
c
RSD
2
1
+
(8)

en donde

c es el nmero total de colonias registradas;

u es la constante de sobredispersin;

n es el nmero de determinaciones paralelas.


23
6.2.2 Lmite de deteccin - modelo binomial negativo

El lmite de deteccin, si se define en trminos de la probabilidad de un resultadopositivo puede
calcularse a partir de la probabilidad de negativos. Citando a Anscombe [11] pero cambiando los
smbolos por los empleados en esta gua, la probabilidad de un resultado negativo (probabilidad
de cero) se da por la frmula:

( )
2
1 2
1
u /
c u po

+ (9)

Al resolver c se obtiene el lmite de deteccin cuando se ha dado la probabilidad de negativos y el
factor de sobredispersin.

2
1 0
2
u
p
c
u

Como es evidente en la Figura 2, el lmite de deteccin se ve ms bien poco afectado por la
sobredispersin moderada (vase el ejemplo a continuacin).

EJEMPLO El recuento de colonia promedio requerido a fin de alcanzar un 95 % de probabilidad de un resultado
positivo en una situacin de sobredispersin depende del factor de sobredispersin. Se supone un factor de
sobredisersin u= 0,30. La substitucin directa de la probabilidad de un resultado negativo p0 = 1 - p(+) = 1 - 0,95 = 0,05
en la ecuacin (10) produce c= (0,05
-u2
- 1)/u
2
= 0,05
-0,09
- 1)/0,09 = 3,44. El clculo correspondiente con la distribucin
de Posison (sin sobredispersin) sera c= In(1/0,05) = 3,00 (vase ejemplo en el numeral 6.2.4).

6.2.3 Cuantificacin de la sobredispersin

Existen tres principales formas de calcular el parmetro u [20].

En el intervalo de valores promedio y factores de sobredispersin que son de inters en la
validacin de los mtodos de recuento de colonia, el Mtodo de Anscombe I [11] es eficiente.
Consiste en resolver la ecuacin (5) para u.

Para poder usar el Mtodo de Anscombe I, debe contarse con una serie substancial
(preferiblemente ms de 30) de observaciones independientes en una nica muestra en la que se
base el clculo confiable de la varianza (s
2
) y la media (m). La ecuacin (5) produce, al remplazar
c por m:

2
2
2
m
m s
u

Para que sean eficientes, las observaciones deberan limitarse a recuentos de colonia en el
intervalo de trabajo ptimo. La media nunca debera ser menor que 30. Esto se aplica
especialmente si el propsito es calcular u en un nico experimento.

EJEMPLO Para demostrar la factibilidad de clculos de sobredispersin, se realiz un experimento para introducir
deliberadamente sobredispersin en una serie de recuentos paralelos. Se hicieron 24 filtraciones de membrana con una
suspensin mezclada cuidadosamente de un cultivo puro de Enterococcus faecium de forma tal que se inocularon ocho
placas con 8 ml, 10 ml y 12 ml de la suspensin. Con esto se introdujo una imprecisin de volumen destinado a causar
una cantidad aproximadamente predecible de sobredispersin a los 24 otros recuentos paralelos.


24
El volumen calculado de 8 x 8 ml , 8 x 10 ml y 8 x12 ml tiene una media = 10 y una desviacin estndar = 1,633.
Por lo tanto, la incertidumbre de la desviacin estndar debida a la sobredispersin debera ser u =s/m = 0,163 3(CV =
16,33%), si los volmenes fueran exactamente como los establecidos.

Los 24 recuentos de colonia observados tuvieron una media m = 379,29 y la varianza s
2
= 4 586,54. De acuerdo con la
ecuacin (11), u
2
= (4 586,54 - 379,29)/379,29
2
= 0,029 2. Por lo tanto, el coeficiente de sobredispersin u = 0,029 =
0,171 0 el cual se acerca lo suficiente al valor esperado, considerando que tambin incluye las posibles incertidumbres
de recuento y volumen ignoradas en el esperado u = 0,163 3. (Todas las mediciones de 8 ml, 10 ml y 12 ml se
consideraron exactas).

El estimativo de incertidumbre calculado de la forma antes mencionada por lo general no es
vlido, puesto que se basa en una muestra nicamente.

La segunda solucin tambin se basa en la ecuacin (5) pero considera varias muestras. Al
dividir la ecuacin por c se obtiene

c u
c
s
Y
2
2
1+

Siempre que se cuente con determinaciones paralelas, se pueden realizar los clculos de
varianza y media. Al calcular la proporcin Y = s
2
/c de cada conjunto se obtiene un gran nmero
de pares (Y,c). La pendiente de la lnea de regresin en correspondencia con los puntos ofrece
un clculo de u
2
. La dispersin aleatoria es inevitablemente considerable si los clculos de media
y varianza se basan en pequeas muestras (pequeos nmeros de determinaciones paralelas)
(vase el ejemplo B.7). La ventaja de este mtodo es que el clculo de sobredispersin se basa
en una gran seleccin de diferentes muestras y por lo tanto tiene considerable utilidad general.

NOTA El anterior razonamiento se aplica mejor cuando la media (m) es el nmero de colonias (o partculas) sin
transformar por conjunto de deteccin y los conjuntos de deteccin son en otros aspectos idnticos en todas las
determinaciones paralelas.

6.2.4 Sobredispersin en el nivel del detector

Los recuentos paralelos de una suspensin nica tambin pueden variar ms de lo permitido por
la distribucin de Poisson. Esta es una observacin clsica [16]. En este nivel las nicas causas
de sobredispersin son errores de pipeteo, la incertidumbre del recuento y errores espordicos
("accidentes"). La sobredispersin es una medida til de confiabilidad total. Se puede detectar
mediante los ndices de dispersin (X
2,
G
2
) (vase el ejemplo B.6 en el Anexo B).

6.3 LMITES ESTADSTICOS Y PRCTICOS

6.3.1 Generalidades

Los lmites de trabajo inferiores de mtodos microbiolgicos son en gran medida asuntos de
definicin.

Los lmites superiores se definen mediante los requisitos de espacio y las interacciones
resultantes de las colonias microbianas. Una partcula microbiana se debe multiplicar un milln de
veces para hacerse detectable a simple vista.

6.3.2 Lmite inferior

Cuando se examina slo una porcin analtica (una placa), el lmite estadstico inferior puede
expresarse convenientemente como el recuento "confiable" ms bajo por placa; definiendo la
confiabilidad por la mejor precisin.


25
Habiendo considerado todas las cosas, el lmite inferior debera escogerse en alguna parte
cercana a las 20 colonias por conjunto de deteccin. En dicho nmero de colonia, el coeficiente
de variacin en una situacin completamente aleatoria (Poisson) es ca. t25 % (vase el numeral 6.1.4).
Si se conoce numricamente la sobredispersin, el clculo de lmite inferior de la determinacin puede
basarse en el modelo binomial negativo (vase el numeral 6.2.2).

6.3.3 Lmites superiores

Los anlisis de P/A no tienen un lmite superior. A medida que el nmero de grmenes en la porcin
analtica se incrementa, la probabilidad de detectar su presencia se acerca a la certidumbre.

Con los mtodos de NMP, el lmite superior prctico se ha excedido cuando todos los tubos de todas
las diluciones se encuentran positivos. Estos percances no reflejan el lmite superior del mtodo
mismo, slo la dilucin equivocada. Tampoco puede establecerse ningn lmite superior por razones
estadsticas, puesto que la precisin no depende en forma directa simple del nmero de partculas
introducido en el conjunto de deteccin. Es caracterstico de los procedimientos de NMP que su
precisin pueda mejorarse a voluntad cambiando la configuracin del conjunto de deteccin (vase el
numeral 6.1).

Con los mtodos de recuento de colonia, la precisin tericamente mejora de manera constante
con el nmero de colonias objeto observadas en el conjunto de deteccin. En la prctica, los
mtodos de recuento de colonia tienen un lmite superior por detector que vara con la situacin
de ensayo. El detector de recuento de colonias (plato de agar, filtro de membrana) se "atasca" o
satura por varias razones, de las cuales el nmero de colonias objeto es slo una.

Existen muchas causas y concordantemente muchas formas de determinar el lmite superior. Una
posibilidad es determinar el recuento de colonias por placa cuando la incertidumbre total (incluyendo
los errores sistemticos) se eleva nuevamente al mismo nivel que en el lmite inferior [30].

Otra consideracin es el apiamiento o enmascaramiento de colonias objeto debido a
crecimiento no-objeto. Dicho fenmeno puede vincularse cuantitativamente a la selectividad del
mtodo, o de manera ms cientfica a la "cobertura", es decir, la fraccin de espacio disponible
que ocupan las colonias. Incluso los cultivos puros tienen un lmite superior que depende del
cubrimiento [25].

Un tercer aspecto es la prdida de proporcionalidad (prdida de linealidad) que ocurre con la alta
congestin de la placa.

6.4 ENSAYOS GENERALES DE ALEATORIEDAD - DETECCIN DE SOBREDISPERSIN

La desviacin de aleatoriedad (presencia de sobre o sub-dispersin) puede detectarse
efectivamente por uno de los dos ensayos clsicos de bondad de ajuste, a saber, el ndice de
dispersin de Poisson (X
2
, D
2
) o la estadstica de relacin de probabilidad logartmica (G
2
). En el
Anexo A se presenta el clculo de los ndices.

En los pocos casos (por ejemplo, placas paralelas) donde la sobredispersin general no tiene
razones tcnicas aceptables se puede emplear la concordancia con la distribucin de Poisson
como un ensayo de mtodo o desempeo del analista [16,33]. Debido a su sencillez, esta
caracterstica es especialmente til como una herramienta de AQC.

7. ESPECIFICACIONES - PRCTICA ACTUAL

Un ejemplo de cmo el mejor de los protocolos normativos expresa caractersticas de
desempeo del mtodo puede encontrarse en la forma como los mtodos normativos para el


26
anlisis de agua y desechos de agua, Standard Methods for the Analysis of Water and
Wastewater [8] ofrece instrucciones a los usuarios de sus mtodos. En diferentes partes del
procedimiento de filtro e membrana colforme total, el usuario encontrar las siguientes
declaraciones relacionadas con las especificaciones:

a) Objeto

El objeto del mtodo puede inferirse de una tabla que presenta volmenes de
muestra recomendados para diferentes tipos de aguas. Esta tabla incluye todos
los tipos de aguas potables y recreacionales lo mismo que de desechos de agua.

b) Robustez de la incubacin y sensibilidad al tiempo

La regla principal se presenta as: "Se incuba durante 20 h a 22 h a (35 t 0,5) C".
En otra parte del documento se presentan las excepciones a la principal regla:
"Las muestras de aguas desinfectadas pueden incluir organismos estresados que
crecen a ritmo relativamente lento y producen mximo resplandor en 22 h a 24 h.
Los organismos de fuentes no perturbadas pueden producir resplandor a 16 h a
18 h, y el resplandor puede desvanecerse posteriormente despus de 24 h a 30 h.

c) Lmites de trabajo confiables

Los lmites de trabajo confiables se pueden inferir de: "Se calcula el recuento,
empleando filtros de membrana con 20 a 80 colonias...". A esto le siguen
posteriores salvedades que vinculan el lmite de trabajo con la selectividad:".. y no
ms de 200 colonias de todos los tipos por membrana". Algunas razones para lo
ltimo se encuentran en otra parte del documento: "El tamao de la muestra se
regir por la densidad bacterial esperada, que en las muestras de agua potable se
limitar slo por el grado de turbidez o por el crecimiento no colforme en el
medio".

d) Definicin de objeto e identificacin

"Todas las bacterias que producen una colonia roja con un resplandor metlico
dentro de 24 h de incubacin a 35 C en un medio tipo Endo- se consideran
miembros del grupo colforme. Este resplandor puede cubrir la colonia entera o
puede aparecer slo en un rea central en la periferia".

Existen consideraciones adicionales : "Los medios de tipo Endo ocasionalmente
pueden producir colonias rojas oscuras atpicas sin un resplandor metlico. La
verificacin de varios tipos de colonias tpicas (con resplandor) y atpicas (sin
resplandor) detectar resultados negativos falsos y proporcionar experiencia en
el reconocimiento de colonias".

e) Otras limitaciones y especificaciones

El documento normativo tambin ofrece consejo y hace exigencias sobre control
de la calidad de los medios y equipos.

8. ESPECIFICACIONES - ENFOQUE RECOMENDADO

Generalmente hablando, en la actualidad las normas brindan poca ayuda para los laboratorios
que buscan asegurarse de aplicar bien los mtodos y obtener resultados vlidos.


27
Lo que parece hacer falta es una presentacin concisa de lo que los laboratorios deberan hacer
para verificar que el mtodo tambin funciona al usarlo ellos mismos y cmo diferenciar el buen
desempeo del mal desempeo.

Se debera agregar una seccin de especificaciones a todas las normas escritas.

El formato para mtodos de recuento de colonia podra incluir lo siguiente:

a) Sensibilidad: con pocas excepciones (casos mencionados) se confirman ms del
90 % de los presuntos positivos.

b) Selectividad: por lo general mejor que - 1 (vase la definicin de selectividad). Los
resultados no son vlidos si la selectividad es inferior a -2.

c) Incertidumbre de recuento: la desviacin estndar relativa del recuento duplicado
(rplica) dentro de un laboratorio es generalmente inferior a u
Z
= 0,05. La
incertidumbre del recuento individual (una persona) permanece normalmente por
debajo de u
Z
= t 0,03.

d) Estriado paralelo: la variacin se encuentra dentro de la distribucin de Poisson.
(Si no, se debera presentar el grado de sobredispersin).

e) La variacin dentro de la muestra tiene un coeficiente de incertidumbre procedimental
adicionada de menos de u
X
= 0,10 en muestras de agua. En muestras slidas, la
incertidumbre adicionada debera permanecer por debajo de 0,15.

f) La proporcionalidad (linealidad) del detector depende de la selectividad. sta es
adecuada hasta los nmeros de colonia limitantes dados a continuacin:

Selectividad Lmite superior de linealidad
(colonias objeto por placa)
0 500 (cultivos puros)
-0,5 a -1 200 a 100
-1 a -2 100 a 25
por debajo de 2 deteccin P/A solamente

Con el crecimiento excesivo de colonia, el lmite funcional superior puede alcanzarse ms pronto.
Sin importar el valor de la selectividad, los recuentos no son vlidos si ms de 1/3 del espacio
disponible se ocupa por crecimiento (objeto y no- objeto).

Lo anterior es slo un ejemplo de cmo se podran presentar las especificaciones concretas del
desempeo del mtodo. Dichas especificaciones se pueden ensayar con diseos apropiados.
Los valores numricos se presentan como ilustracin y no se deben entender como valores
estndar en el presente.

Si se cuenta con informacin acerca de la recuperacin relativa comparada con una referencia
normativa, sta debera presentarse.

Si se cuenta con datos de reproducibilidad de ensayos de desempeo de mtodo, stos deberan
adicionarse como informacin adicional.

Adems, deberan especificarse las condiciones de ensayo, la descripcin objeto y el
almacenamiento de muestras.


28
9. DETERMINACIN Y EXPRESIN DE CARACTERSTICAS DE DESEMPEO

9.1 GENERALIDADES

Las caractersticas de desempeo basadas en frecuencias de elementos en categoras
cualitativas se denominan categricas en lo sucesivo.

En conexin con los mtodos selectivos, stos se determinan mediante verificacin de presuntos
cultivos positivos y negativos.

9.2 CARACTERSTICAS CATEGRICAS RELACIONADAS CON LA ESPECIFICIDAD Y
LA SELECTIVIDAD

9.2.1 Generalidades

La visin cualitativa ms global del desempeo del mtodo se gana estudiando las muestras
naturales. Las muestras deberan cumplir el alcance completo del mtodo, incluyendo diferentes
muestras y situaciones de contaminacin lo mismo que las diferentes estaciones.

Una colonia o una placa es el equivalente de un ensayo P/A o un tubo en una serie de NMP. En
la validacin primaria, deberan verificarse tanto los presuntos cultivos positivos como los
presuntos negativos.

La forma ms atractiva biolgicamente y costo-efectiva de ensayar los mtodos de cultivo liquido
(tanto P/A como NMP) consiste en emplear un diseo de NMP. Se seleccionan para verificacin
los tubos en las diluciones donde ocurren tanto positivos como negativos. Estas son las
diluciones donde surgen tubos positivos de una o muy pocas celdas.

Las caractersticas de desempeo asociadas con la selectividad y especificidad pueden definirse
numricamente [17]. Estas se relacionan con las proporciones relativas de colonias o tubos que
se supone son positivos o negativos sobre la base de la primera impresin (presunta) comparada
con la "verdad" despus de la verificacin. Despus de haber realizado n ensayos de verificacin,
sus resultados se dividen en cuatro categoras:

a) nmero de presuntos positivos encontrados como positivos (verdaderos positivos);

b) nmero de presuntos negativos encontrados como positivos (falsos negativos);

c) nmero de presuntos positivos encontrados como negativos (falsos positivos);

d) nmero de presuntos negativos encontrados como negativos (verdaderos negativos).

Estas frecuencias pueden expresarse convenientemente en una tabla de 2 x 2:

Recuento presuntivo
+ -

+ a b a+ b
Recuento confirmado
- c d c +d
a+c b+d n

Las caractersticas de desempeo calculadas de estas observaciones se definen de la siguiente
manera:


29
1) sensibilidad = a/(a + b), la fraccin de los positivos totales correctamente asignada
en la presunta cuenta;

2) especificidad = d/(c + d), la fraccin de los negativos totales correctamente
asignados en la presunta cuenta;

3) tasa de falsos positivos = c/(a + c), la fraccin de los positivos observados
asignados errneamente;

4) tasa de falsos negativos = b/(b + d), la fraccin de los negativos observados
asignados errneamente;

El nmero total de ensayos es a + b + c + d = n.

5) la eficiencia E es un parmetro nico general, que presenta la fraccin de colonias
o tubos asignados correctamente:

E = (a + d)/n

Las colonias deberan tomarse aleatoriamente de todas las colonias (objeto y no objeto) consideradas
como un todo. Con cultivos lquidos, es probable que todos los positivos y negativos se ensayen en
sus proporciones reales.

Debido a las fueres influencias del operador y la poblacin microbiana, ninguna de las
caractersticas de desempeo detalladas anteriormente puede tener un valor constante de
mtodo especfico.

La validacin secundaria slo debe ocuparse de los falsos positivos, a menos que parezca
recurrente una tasa inferior que la especificada.

9.2.2 Selectividad

La selectividad de un mtodo microbiolgico se define en esta gua como el logaritmo de la
fraccin de presuntas colonias objeto (presuntos positivos) entre el total:

F = lg [(a + c)/n]

La selectividad puede ser tan baja en algunos tipos de muestra o durante ciertas estaciones que
no permiten obtener un recuento objeto confiable. La escala de trabajo superior se ve
grandemente influenciada por la selectividad.

La "presunta" selectividad definida anteriormente es una herramienta seleccionada por
conveniencia. Si se cuenta con recursos, la selectividad real basada en recuentos verificados de
positivos verdaderos es cientficamente mejor. Las restricciones econmicas pueden limitar su
uso a comparaciones finales entre mtodos.

La selectividad aparente vara considerablemente debido a los efectos de estaciones y otras
causas que cambian la abundancia relativa de las poblaciones objeto y de fondo. Esta no es una
constante especfica del mtodo. No obstante, la selectividad proporciona informacin acerca del
desempeo del mtodo y puede ayudar a escoger entre las alternativas. Se debera estudiar una
amplia variedad de casos. Puesto que no se cuenta con criterios de decisin, no existen
fundamentos para decidir qu cantidad especfica es suficiente. Se deberan recolectar
suficientes datos para ser convincentes de una u otra forma.


30
9.3 LMITES DE TRABAJO

9.3.1 Lmites inferiores de deteccin y determinacin

El lmite de trabajo inferior es cuestin de definicin en todos los mtodos (vase el Captulo 6).
Numricamente, el lmite debera expresarse como el nmero inferior suficiente de colonias o
partculas por conjunto de deteccin o placas paralelas.

9.3.2 Lmites superiores

Cada mtodo, de hecho cada determinacin individual, tiene un lmite superior confiable. No es
un nmero fijado claramente, sino una regin un poco vaga de nmeros de colonia donde los
recuentos por placa se vuelven demasiado inciertos para servir de base a una determinacin
valida.

El lmite de trabajo superior de un detector de colonia se indica por las siguientes seales:

a) La sobredispersin de recuentos de colonia paralelos puede hacerse ms
pronunciada y frecuente. La situacin puede reconocerse mediante la ayuda del
ndice de dispersin de Poisson (Vase el Ejemplo B.3).

b) Los recuentos de colonia de diferentes diluciones (volmenes) no concuerdan. Se
pierde la proporcionalidad (linealidad). La proporcionalidad puede ensayarse
mediante mtodos basados en el ndice G
2
(Anexo A y Ejemplo B.4).

El ensayo de proporcionalidad (linealidad) es el ms efectivo de los dos. Ambas caractersticas
pueden explorarse mediante el uso de un ensayo de proporcionalidad especialmente diseado
(Anexo C) [27,33] o mediante recoleccin de datos sobre los elementos anteriores a partir de
ensayos separados.

9.4 INTERVALO DE TRABAJO DE PROCEDIMIENTOS DE NMP

Los lmites prcticos inferiores y superiores de procedimientos de NMP son los casos extremos
cuando slo un tubo del conjunto de deteccin es positivo o negativo.

El intervalo de aplicacin aparente de un conjunto de deteccin de 3 x 5 es concordante con 0,2
a 160 partculas por volumen unitario (porcin analtica) o la primera serie (la menos diluida), sin
importar el medio nutriente o poblacin objeto.

9.5 PRECISIN

9.5.1 Generalidades

Cada medicin analtica debera estar acompaada con un clculo de precisin, incluso cuando
no sea factible determinar experimentalmente la precisin de cada determinacin individual. Por
tanto, existe considerable inters en obtener declaraciones de precisin generalmente vlidas
para diferentes mtodos.

De manera ideal, la validacin primaria debera ofrecer un clculo general sobre el cual puede
basarse la precisin de cualquier medicin. Esto slo es posible en microbiologa de dos
maneras. Se puede o asumir aleatoriedad total, y consecuentemente la validez de la distribucin
de Poisson, o determinar una constante general de sobredispersin por experimento.


31
Se pueden obtener clculos de precisin principalmente en dos diferentes formas que se han
denominado Tipo A y Tipo B (vase el numeral 2) [5,6].

9.5.2 Clculos de precisin Tipo A

Los clculos Tipo A se obtienen a partir de clculos estadsticos con base en determinaciones
paralelas. Se expresan como desviacin estndar (incertidumbre estndar) o desviacin estndar
relativa.

Los clculos ms generales de Tipo A se obtienen mediante ensayos de desempeo de mtodo
conjunto de acuerdo con los principios desarrollados principalmente por AOAC [18]. Los clculos
Tipo A de mediciones microbiolgicas hasta el presente se han calculado y expresado como
desviacin estndar en la escala logartmica.

Tales clculos no han hecho su aparicin an en las normas microbiolgicas.

Como resulta evidente de la discusin del numeral 6, la precisin de las determinaciones
microbiolgicas no es constante incluso en la escala logartmica, sino que depende del nmero
de colonias. Esta es una razn por la que los clculos Tipo A siempre son aproximativos y
tienden a ser grandes.

9.5.3 CLCULOS DE PRECISIN TIPO B

Los clculos Tipo B se basan en supuestas distribuciones de probabilidad u otra informacin.

La distribucin de Poisson se ha considerado como un modelo estadstico apropiado en
suspensiones perfectamente aleatorias en microbiologa. Las declaraciones de precisin basadas
en la distribucin de Poisson son bastante comunes en las normas microbiolgicas.

EJEMPLO Las normas estadounidenses (American Standard Methods) incluyen la siguiente declaracin de
incertidumbre sobre el Tipo B: "Para resultados con recuentos, c, mayores a 20 organismos, se calcula los lmites de
confianza aproximados del 95 % empleando las siguientes ecuaciones de distribucin normal:

- Lmite superior = c c 2 +

- Lmite inferior = c c 2

La desviacin estndar en estos casos se basa obviamente en el supuesto de igualdad de varianza y media (Poisson)

Por razones discutidas en el numeral 6, el modelo Poisson es bastante ideal y arroja clculos de
incertidumbre mnimos. Tiene la ventaja distintiva de que se puede adjuntar un clculo individual
a cada determinacin.

9.5.4 Un modelo mixto

Un modelo de sobredispersin basado en la distribucin binomial negativa combina el elemento
terico de Poisson con una constante de sobredispersin emprica (vase el numeral 6.2.3).

La determinacin del factor de sobredispersin es una meta realista para validacin primaria. Los
mtodos para determinarlo se tratan en (vase el numeral 6.2.3).


32
Debera darse el valor de incertidumbre para diferentes aplicaciones de un mtodo si vara de
situacin a situacin. Puede depender de la matriz en estudio. Se expresa convenientemente
como la desviacin estndar relativa.

9.5.5 Precisin de NMP

Los clculos de precisin de NMP dependen del supuesto de aleatoriedad completa de la
distribucin de partculas en el conjunto de deteccin. Al involucrar los nmeros de partculas
bajos, esta creencia no se valida fcilmente por ensayo experimental.

La precisin de los clculos de NMP se determina por el nmero de tubos paralelos por dilucin y por
el coeficiente de dilucin. En [12] se presenta una frmula aproximativa, asumiendo una
incertidumbre constante sobre la escala. Los lmites de confianza del 95 % para las combinaciones
estndar de tubos aparecen en las tablas de NMP (vase tambin el numeral 6.1).

10. PROCEDIMIENTOS Y PASOS DE VALIDACIN

10.1 GENERALIDADES

La validacin casi necesariamente ocurre en pasos. Las investigaciones de desempeo real de
mtodo deberan estar precedidas por una bsqueda del intervalo de trabajo confiable en la que
el desempeo del mtodo es pertinente. Cualquier comparacin de recuperacin entre dos
mtodos debera limitarse a casos para los cuales son confiables ambos mtodos.

10.2 VALIDACIN PRIMARIA

10.2.1 Identificacin de objeto

Los estudios de cultivos puros durante el desarrollo inicial del mtodo proporcionan la descripcin
bsica de las colonias objeto o tubos P/A. Obviamente, se debe ensayar ms de una cepa de
cultivo puro del objeto.

Se debe probar la validez de la descripcin bsica empleando el mtodo candidato en una
seleccin representativa (vase el numeral 4.2.6) de muestras naturales. Se ensayan las
presuntas colonias objeto, placas o cultivos aislando los cultivos y realizando ensayos de
confirmacin apropiados. Las presuntas colonias no-objeto o tubos negativos se ensayan de la
misma manera.

Se calculan los valores numricos de sensibilidad, selectividad, tasas de falsos positivos y falsos
negativos y eficiencia.

Se corrige la descripcin del objeto, si es necesario.

10.2.2 Incertidumbre del recuento y sensibilidad al tiempo

Despus de que se ha definido adecuadamente la morfologa del objeto, el mtodo se emplea
tentativamente sobre una coleccin de muestras naturales.

Se estudia la confiabilidad de lnea de base de los recuentos mediante recuento repetido de las
colonias de las placas de muestras dentro de un corto tiempo. Si va a trabajar ms de una
persona en el laboratorio con el mtodo, todos deberan participar.


33
El ejercicio debera producir clculos numricos individuales o colectivos de incertidumbre de
recuento, expresada como desviacin estndar relativa (vanse los Ejemplos B.1 y B.2). La
desviacin estndar calculada a partir de los resultados de diferentes personas es ms
informativa que la calculada a partir de recuentos duplicados realizados por una persona. (Por lo
general, una persona puede duplicar el recuento, aunque errneamente, con considerable
precisin). Tambin deberan detectarse y evaluarse las diferencias sistemticas entre personas.

Las observaciones sobre incertidumbre en el recuento y sensibilidad al tiempo proporcionarn la
primera indicacin de problemas potenciales con el amplio uso del mtodo.

10.2.3 Otras caractersticas de robustez

Si existen dudas acerca de los efectos de la temperatura de incubacin, la humedad o la
atmsfera de gas, stas deberan estudiarse mediante ensayos especiales que involucren la
incubacin de sub-muestras paralelas bajo las condiciones alternativas.

Se recomienda que la decisin en estos casos se base en ensayos estadsticos ms que en
simples impresiones superficiales. Los diseos experimentales basados en planes factoriales del
anlisis de varianza son generalmente los ms apropiados.

Los factores que no se ensayan especficamente se consideran ineficaces o bajo control.

10.2.4 Lmite de trabajo superior

Habiendo establecido las condiciones "ambientales" y las caractersticas del objeto, el siguiente
paso es explorar las limitaciones cuantitativas del detector en cuestin.

Esto puede realizarse con un nico tipo de experimento: una serie finamente graduada de
diluciones o volmenes, con paralelos [21, 25]. El ejercicio ofrece los datos para evaluar el lmite
superior sobre la base de proporcionalidad y repetibilidad (vase el Anexo C).

10.2.5 Precisin

El laboratorio responsable de introducir un nuevo mtodo debera tambin ser el responsable de
ofrecer los valores iniciales de sus clculos de precisin. Estos deberan incluir clculos de
incertidumbre de recuento y repetibilidad bsica y clculos de reproducibilidad de diferentes
repeticiones (placas paralelas, series de dilucin paralela, matrices). Otros laboratorios requieren
esta informacin para su validacin secundaria del mtodo y subsecuentemente para establecer
los sistemas de control de calidad analtico.

Si no se encuentran suficientes fundamentos para realizar un clculo Tipo B de distribuciones
estadsticas supuestas o conocidas y otra informacin, deben realizarse experimentos de
muestra dividida o muestra paralela para obtener clculos de precisin Tipo A.

Los estudios de desempeo de mtodo conjunto [18] que involucran varios laboratorios resultan
inapropiados para la validacin de nuevos mtodos puesto que presumen que cada participante
cuenta con experiencia slida en el mtodo y esto ser posible slo despus de un tiempo.

10.2.6 Veracidad y recuperacin relativa

La recuperacin absoluta (veracidad) del analito microbiolgico es inmensurable, lo cual
representa un problema en la validacin primaria de un nuevo mtodo.


34
Se puede aproximar a la verdadera recuperacin con ensayos en cultivos puros o muestras
esterilizadas fijas (spiked/alambre de pas) empleando un mtodo no selectivo como referencia.
Tambin se encuentran algunos materiales de referencia certificados, para dicho propsito.

A fin de observar la recuperacin relativa, se estudian las muestras naturales con el mtodo
candidato y un mtodo de referencia paralelamente. La baja recuperacin comparada con la
recuperacin en un mtodo estndar es una razn obvia para dudar del mtodo. Para que la
comparacin sea vlida, debe basarse en recuentos de colonia confirmados.

10.2.7 Especificaciones

Se deben anotar las caractersticas de desempeo numrico observadas en una seccin de
especificaciones en el protocolo del mtodo de acuerdo con el numeral 7 c).

10.3 VALIDACIN SECUNDARIA

Se deben obtener numerosas muestras naturales. Las muestras divididas o series de dilucin
duplicadas se estudian con estriado paralelo. Se practica el recuento duplicado con el fin de
verificar el desempeo de recuento esperado.

Se debe aislar y verificar numerosos presuntos positivos (por lo menos 100). Las caractersticas
de desempeo categricas se calculan y comparan con los valores especificados, si se
encuentran disponibles.

11. DISEOS PARA DETERMINAR LAS ESPECIFICACIONES

11.1 MODELO GENERAL PARA ESPECIFICACIONES CUANTITATIVAS BSICAS

Un diseo experimental basado en una serie finamente graduada de diluciones o volmenes
duplicados de estriado y recuento ofrece los datos para determinar el lmite de trabajo superior y
algunas otras especificaciones cuantitativas (Ejemplo B.1, Anexo C).

El diseo apropiado es una versin reducida [27] de un plan empleado como un ensayo de
desempeo del analista [33].

Se diluye previamente una muestra lquida mezclada cuidadosamente o una suspensin de un
material slido hasta alcanzar una densidad que d un nmero esperado de colonia por placa
que exceda un poco el lmite superior supuesto del desempeo del detector. Se continua una
serie de seis o siete diluciones adicionales con pasos de dilucin 1:2 desde la suspensin de
partida. Se siembran tres placas paralelas de cada dilucin.

Las placas de diluciones que promedian ms de 20 colonias por placa se leen en un orden
codificado aleatoriamente por una persona.

Si todas las placas o un subconjunto seleccionado aleatoriamente se leen por una segunda
persona, los resultados tambin ofreceran datos sobre incertidumbre del recuento. Con muchos
mtodos, la apariencia tpica de las colonias objeto podra cambiar durante el tiempo requerido
para realizar recuento duplicado de una extensa serie de placas. Entonces debera ensayarse
por separado el acuerdo/desacuerdo.

NOTA La serie geomtrica basada en los pasos de dilucin 1:2 es ms bien tosca. Los nmeros de colonia al
comienzo disminuyen en grandes pasos. Los mtodos con lmite de trabajo superior no se pueden evaluar
eficientemente. En tales casos se recomienda una proporcin de dilucin inferior a 1:2.


35
Los mtodos de filtracin de membrana permiten la fcil variacin del volumen de la muestra, permitiendo una
gradacin ms apropiada. En tales casos es practicable una serie aritmtica con proporciones de volumen
1:2:3:4:5:6:7. Esto tiene la ventaja adicional de que todas las porciones de ensayo se derivan de una nica suspensin.

Se analiza la proporcionalidad de los datos, la sobredispersin de paralelos y la incertidumbre del
recuento, asumiendo una aleatoriedad perfecta en cada paso como base de evaluacin.

El diseo unitario (vase el Ejemplo B.1, Anexo C) involucra slo una muestra. Se debera repetir
un plan similar con muchas muestras (mnimo diez) para poder generalizar los resultados.

Los clculos estadsticos se basan en procedimientos detallados en el Anexo A, con ejemplos
prcticos B.3 y B.4 en el Anexo B.

11.2 PRECISIN DEL PROCEDIMIENTO ANALTICO COMPLETO

El plan descrito en el numeral 11.1 no trata la precisin del procedimiento analtico completo. A
fin de determinar la precisin de la determinacin, se requieren ensayos con muestras divididas o
duplicadas de serie de dilucin (vase el Ejemplo B.2, Anexo C).

Se deberan obtener muestras naturales con nmeros medios o altos del analito. Despus de un
procedimiento de mezcla estndar, se realizan determinaciones duplicadas. Se recomienda el
estriado paralelo, aunque no es absolutamente necesario.

Por lo menos se requieren treinta muestras que abarquen el objeto por completo para tener
adecuado cubrimiento.

El nmero de determinaciones paralelas (series de dilucin) por muestra debe ser mnimo dos.
Cinco o seis paralelos ofrecen resultados ms confiables. Aunque es lo recomendado, no es
obligatorio que el nmero de paralelos sea el mismo para cada muestra.

Los resultados se emplean para calcular la constante de sobredispersin (vase el numeral 6.2.3) de
la manera ilustrada para placas paralelas en el ejemplo B.7.

11.3 CARACTERSTICAS CATEGRICAS

Las caractersticas relacionadas con selectividad, sensibilidad, especificidad, etc. (vase el
numeral 9.2) pueden estudiarse en conexin con los ensayos descritos en el numeral 11.2 a
menos que el tiempo de trabajo se vuelva un factor limitante.

Se seleccionan placas con nmeros de colonias bajos, es decir tcnica y biolgicamente
confiables. Se cuentan todas las colonias de tipo objeto y no-objeto.

En la validacin primaria las colonias de ambos tipos se aslan aleatoriamente para verificacin.
El nmero "no debera ser pequeo", lo que quiere decir mnimo 20 30 de ambos tipos por
muestra, si se encuentran disponibles. No es necesario que los dos tipos de colonia sean de las
mismas diluciones si la selectividad no lo permite. Cuando la selectividad es alta (colonias objeto
ms del 90 %) puede ser innecesario aislar presuntas colonias negativas.

En validacin secundaria, slo deben aislarse y verificarse presuntas colonias positivas.

11.4 DATOS NO PLANEADOS

Se pueden emplear resultados de varias observaciones paralelas reunidos con el tiempo sin
diseo especial como informacin adicional para apoyar o enmendar especificaciones de lmite
de trabajo superior o de sobredispersin.


36
ANEXO A

PROCEDIMIENTOS ESTADSTICOS Y PROGRAMAS DE COMPUTADOR

A.1 INCERTIDUMBRE DEL RECUENTO

La incertidumbre del recuento se calcula mediante la lectura de las mismas placas ms de una
vez. A partir de estos resultados, se puede calcular la desviacin estndar o desviacin estndar
relativa.

NOTA Puesto que los acrnimos de tres letras tales como RSD pueden ser confusos en las frmulas matemticas,
en su lugar se emplea consistentemente la letra u como el smbolo para la desviacin estndar relativa.

Se supone una placa con el nmero (desconocido) x de colonias caractersticas, y se denota con
x
1,
x
2,
..., x
n
los nmeros observados en el recuento de la placa por la misma persona
repetidamente o por diferentes personas.

La incertidumbre del recuento u
Z
se expresa como la desviacin estndar relativa:

x
) x ( s
uz

en donde

1
2
,
_

n
x xi
) x ( s

En caso de recuento duplicado, la misma puede calcularse a partir de

2 1
2 1
2
x x
x x
uZ
+

Con el tiempo se debera tomar aleatoriamente un gran nmero de casos (placas) con mnimo 20
colonias, sin seleccionar los inusuales. La media cuadrtica se toma como la incertidumbre de
recuento relativo promedio calculada.

n
u u u
uZ
Zn ... Z Z
2 2
2
2
1 + +

Para un clculo confiable, n debera ser mnimo 30.


37
Dependiendo de las personas que participan, se aplica la siguiente terminologa;

repetibilidad individual (o personal)
resumen de los resultados de una persona que lea las mismas placas dos veces (o ms):

repetibilidad dentro del laboratorio
valor promedio (cuadrtico) ponderado de las repetibilidades individuales del personal de
laboratorio; resumen de los resultados de recuento duplicado o rplica obtenidos por todas las
personas;

reproducibilidad dentro del laboratorio
media (cuadrtica) de resultados de varias personas del mismo laboratorio que leen las mismas
placas;

reproducibilidad entre laboratorios
media (cuadrtica) de resultados de personas de diferentes laboratorios que leen las mismas
placas.

Vanse los Ejemplos B.1, B.2 y B.3.

A.2 ENSAYO GENERAL DE PROPORCIONALIDAD (LINEALIDAD)

Se permite obtener n recuentos de colonia c
1
, c
2
,..., c
n
del estudio de la misma suspensin de
ensayo en volmenes o diluciones que se relacionan como los nmeros R
1
, R
2
, ..., R
n

El clculo de la relacin de probabilidad logartmica de la proporcionalidad (linealidad) de los
recuentos puede calcularse a partir de

( )
1
1
1
]
1
,
_
+ +
R
c
ln x c
n
cn
ln cn ...
R
c
ln c
R
c
ln c G
n
2
2
2 2
1
1
1
2
1

Se adjunta un programa de BASIC para calcular G
2
.

Se puede obtener un valor gua refirindose a las tablas de X
2
con n -1 grados de libertad. Los
valores que exceden un valor tabulado indican salida de la proporcionalidad en el nivel de
probabilidad seleccionado.

NOTA Esta frmula puede emplearse tambin para ensayar la concordancia de placas paralelas dando el mismo
nmero (por ejemplo R1= R2 = ...= Rn = 1) para cada volumen relativo. Por lo general, el resultado es casi el mismo que
el ndice Poisson de dispersin dado en A.3.
_____________________________________________________________________________

Programa de BASIC para calcular el ndice de relacin de probabilidad logartmica general G
2
de
acuerdo con A.2. Vase el Ejemplo B.5

10 PRINT "LIKELIHOOD RATIO INDEX G

2"
20 INPUT "NUMBER OF TERMS, n =;N
30 C=0: R =0: S=0: T=0: D= O
40 FOR I=1 TO N


38
50 PRINT "I=";I
60 INPUT "COLONY COUNT= ";C
70 INPUT "RELATIVE VOLUME=";R
80 IF C=0 THEN W=0; GO TO 100
90 W=C*LOG(C/R)
100 S=S+W
110 T=T+R
120 D=D+C
130 NEXT I
140 Y=2*(S+D*LOG(D/T))
150 Y=(INT(1000*Y+0.5))/1000
160 PRINT
170 PRINT "INDEX G

2=";Y
180 PRINT
190 PRINT
200 INPUT "ANOTHER SET? (Y/N)"; A$
210 IF A$="Y" OR A$="y" GOTO 20 ELSE 220
220 END
NOTA En la versin BASIC, LOG significa el logaritmo natural. En otras versiones se requiere el smbolo LN en las
filas numeradas con 90 y 140.

A.3 NDICE DE DISPERSIN DE POISSON

Se puede ensayar la aleatoriedad de los recuentos de colonia paralelos c
1,
c
2,
...,c
n
de porciones
iguales de una suspensin completamente mezclada mediante el clculo del ndice de Dispersin
de Poisson:

( )
i
i
i i i
n
c
c
c n
ci
c c n
X
2
2
2
2
1

NOTA 1 Con frecuencia tambin se emplean para X
2
los smbolos: D
2
, ?
2
y T1

NOTA 2 En su lugar se puede aplicar la frmula G
2
general.
La dispersin excesiva (sobredispersin) puede detectarse refirindose a una tabla de
distribucin ?
2
con n - 1 grados de libertad.


39
Un valor X
2
aislado tiene poca importancia, especialmente si el nmero de placas paralelas (n) es
pequeo. Se recomienda estudiar un nmero grande (por lo menos 100) de conjuntos de placas
paralelas sobre un perodo largo. Las muestras deberan representar diferentes fuentes y
estaciones.

Los valores X
2
y sus grados de libertad son aditivos. Se puede ensayar la concordancia general
de varios conjuntos de paralelos mediante la comparacin de la suma de valores X
2
con el valor

terico X
2
con grados de libertad correspondiente a la suma de los grados de libertad. El ensayo
es extremadamente poderoso.

Cuando se cuenta con cerca de 100 valores X
2
, stos tambin se pueden agrupar en clases de
frecuencia, con lmites de clase ledos de la Tabla ?
2
apropiada. Las frecuencias observadas se
pueden comparar con las frecuencias esperadas de acuerdo con la distribucin terica. La
comparacin de las distribuciones de frecuencia de dos mtodos en esta forma es ms
comparativa que las simples sumas. (Vase el Ejemplo B.6).

_____________________________________________________________________________

Programa de BASIC para calcular el ndice de Dispersin de Poisson X
2
de acuerdo con el literal A.3.
Vase el Ejemplo B.6

10 PRINT "DISPERSION INDEX X

2"

20 INPUT "NUMBER OF PARALLELS, n =;N

30 S1=0: S2 =0

40 FOR I=1 TO N

50 PRINT "I=";I

60 INPUT "COLONY COUNT= ";C

70 S1= S1+C

80 S2 = S2+C

2

90 NEXT I

100 X= (N*S2-S1

2)/S1

110 X2= (INT (1000*X+0.5))/1000

120 PRINT

130 PRINT "INDEX X

2=";X2

140 PRINT

150 INPUT "ANOTHER SET? (Y/N)";A$

160 IF A$="Y" OR A$= GOTO 20 ELSE 170

170 END


40
ANEXO B

EJEMPLOS NUMRICOS

B.1 GENERALIDADES

Los ejemplos B.1, B.2 y B.3 tienen que ver con la repetibilidad y reproducibilidad del recuento, es
decir, los resultados de la lectura de las mismas placas realizada por una ms personas. El
ejemplo B.4 est conectado con la robustez de los resultados con respecto al tiempo de
incubacin. El Ejemplo B.5 ilustra un anlisis de linealidad, el Ejemplo B.6 muestra formas de
emplear la informacin contenida en placas paralelas y el Ejemplo B.7 ilustra el clculo de la
constante de sobredispersin de los datos de ensayo paralelo.

Los ejemplos presentados en B.1 a B.3 ilustran los clculos recomendados siempre que se
cuente con resultados de recuento duplicado o de rplica. Tales resultados se basan en la lectura
de las mismas placas repetidamente bajo condiciones uniformes, es decir, dentro de un intervalo
de tiempo claramente ms corto que la supuesta tolerancia permitida para el mtodo. En la
prctica, esto significa un intervalo mximo de 1 h.

Dependiendo de las personas que participen, los mismos clculos formales (vase el literal A.1)
producen clculos de diferente cobertura.

Se deberan seleccionar aleatoriamente las placas para recuento repetido, ignorando las placas
con menos de 20 colonias. De otro modo, las placas recogidas deberan representar el intervalo
de aplicacin completo del mtodo.

Para un clculo general razonablemente confiable, se debera contar con mnimo 30 casos.

La repetibilidad entre laboratorios se estudia mejor transportando personas a sesiones comunes
que poniendo a circular placas.

NOTA En la tarea de recuento microbiolgico ms sencilla, la del recuento de colonias de un cultivo puro con
colonias de tamao medio regular en filtros de membrana, se puede esperar que el recuento sea repetible con una
desviacin estndar mejor que el 2 % (RSD < 0,02). Esto se aplica casi por igual cuando una persona o diferentes
personas de diferentes laboratorios repiten el recuento, hasta varios cientos de colonias por placa.

Cuando se deben identificar las colonias objetos en una poblacin mixta sobre la base de color, tamao, forma, textura
o reacciones con el medio de crecimiento, la tarea es ms difcil. Con frecuencia, un apersona puede repetir el recuento
con bastante precisin pero las desviaciones entre diferentes personas se hacen mayores. No se ha decidido que tan
grande una incertidumbre es tolerable. La desviacin estndar relativa mayor que 0,1 (cinco a diez veces el RSD del
recuento de cultivo puro) es una seal cierta de problemas o dificultades.

B.2 EJEMPLO B.1 - REPETIBILIDAD PERSONAL DE RECUENTO

B.2.1 Generalidades

En el siguiente ejemplo de datos reales en recuentos de colonia totales sobre medios no selectivos, la
desviacin estndar de repetibilidad fue la mayora de las veces mayor que la "ideal" (RSD < 0,02) a
la que se hizo referencia anteriormente.

Las personas A y B, trabajando en el mismo laboratorio de manera independiente, leen diferentes
placas dos veces dentro de un intervalo corto de tiempo. Los recuentos duplicados se denotan
por ?
1
y ?
2.


41
B.2.2 Clculos

Primero se calcula la media (m) y desviacin estndar (s) de cada par. A partir de estos se
obtienen los valores de RSD = s/m (penltima columna).

Placa ?1 ?2 m s RSD Persona
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
129
417
73
49
86
37
112
204
66
306
122
377
80
52
81
39
115
214
71
299
125,5
397,0
76,5
50,5
87,5
38,0
113,5
209,0
68,5
302,5
4,95
28,28
4,95
2,12
3,54
1,41
2,12
7,07
3,54
4,95
0,039 4
0,071 2
0,064 7
0,042 0
0,042 3
0,037 2
0,018 7
0,033 8
0,051 6
0,016 4
A
A
A
A
B
B
B
B
B
B

Los clculos personales de media de repetibilidad se obtienen de la siguiente manera:

Persona A:

056 0
4
0 042 0 7 064 0 0712 0 4 039 0
2 2 2 2
,
, , , ,
RSD
A

+ + +

Persona B:

036 0
6
4 016 0 3 042 0
2 2
,
, ... ,
RSD
B

+ +

A fin de obtener la desviacin estndar relativa agrupada ponderada en el laboratorio donde A y
B son los tcnicos, la media cuadrtica de todos los diez valores puede calcularse de la misma
manera:

046 0
10
4 016 0 2 071 0 4 039 0
2 2 2
,
, ... , ,
RSD
C

+ + +

Un clculo agrupado no ponderado podra ser ms apropiado. Se puede obtener tomando la
media cuadrtica de las medias personales:

047 0
2
036 0 056 0
2
2 2 2 2
,
, , RSD RSD
RSD
b A
C

+
+

B.3 EJEMPLO B.2 - CLCULO DE REPETIBILIDAD AGRUPADO: ANLISIS DE VARIANZA

Los valores promedio para una persona o el laboratorio como un todo tambin se pueden obtener
mediante anlisis de varianza de una va. Los recuentos de colonia ?
1
y ?
2.
en el Ejemplo B.1 se
convierten primero a sus valores-ln y se calculan las varianzas entre placas y dentro de cada una
de ellas.


42
A continuacin se muestra el anlisis de varianza de todos los resultados de repetibilidad:

DF SS MS
Entre placas
Dentro de las placas
9
10
10,4817
0,019,0
1,164,6
0,0019
de donde

DF grados de libertad;
SS suma de cuadrados;
MS media cuadrtica (varianza)

La MS dentro de las placas representa la repetibilidad ponderada agrupada.

La desviacin estndar para la repetibilidad es la raz cuadrada de la media cuadrtica dentro de
placas (puesto que la desviacin estndar en escala ln corresponde aproximadamente a la
desviacin estndar relativa en la escala aritmtica).

044 0 9 001 0 , , RSDC

Si el valor es alto (mayor a 0,1) puede ser til regresar a la tabla para examinar los valores RSD
individuales en bsqueda de las razones. Un valor grande accidental puede ser el responsable, o
puede estar presente una tendencia en el recuento de colonia promedio. Estos se ilustran mejor
grficamente mediante la representacin de los valores RSD contra el recuento de colonia.

Se requiere la repetibilidad del recuento personal o dentro del laboratorio como valor base al
calcular otras caractersticas de robustez tales como la sensibilidad al tiempo o la reproducibilidad
del recuento. El valor ideal de 0,02 frecuentemente es demasiado optimista.

B.4 EJEMPLO B.3 - REPRODUCIBILIDAD DE RECUENTO ENTRE LABORATORIOS

Se reunieron dos personas (A1, A2) del laboratorio A y tres (B1, B2, B3) del laboratorio B en una
sesin de recuento de colonias organizada por el laboratorio B. Se tomaron placas de agar estndar
de determinaciones de rutina y fueron ledas por cada participante. Se omitieron las placas con
menos de 30 colonias. En la lista a continuacin se muestran los resultados de seis placas.

Placa A1 A2 B1 B2 B3 Media RSD
1
2
3
4
5
6
33
160
142
78
89
38
26
156
128
97
94
44
33
166
142
81
81
38
34
176
146
81
94
42
33
174
139
83
92
40
31,8
166,4
139,4
84,0
90,0
40,4
0,102 9
0,052 0
0,049 1
0,089 1
0,060 3
0,064 5

Seis placas son demasiado pocas para un clculo general confiable, pero ilustran los clculos.

La media cuadrtica de las desviaciones estndar relativas es

4 072 0
6
5 064 0 3 060 0 1 089 0 0491 0 0 052 0 9 102 0
2 2 2 2 2 2
,
, , , , , ,
RSDC
+ + + + +

En comparacin con la reproducibilidad del recuento dentro de un laboratorio (Ejemplos B.1 Y B.2) el
valor obtenido en este experimento conjunto fue casi dos veces dicho valor. El anlisis de la varianza
puede emplearse en la bsqueda de diferencias sistemticas entre personas o entre laboratorios.


43
B.5 EJEMPLO B.4 - ROBUSTEZ: SENSIBILIDAD AL TIEMPO DE LOS RECUENTOS DE
COLONIAS

La dependencia del recuento de colonias del tiempo de incubacin se puede ensayar fcilmente
contando las mismas placas dos veces: en los dos tiempos de incubacin extremos permitidos
por el mtodo.

En el anlisis coliforme total mediante el mtodo de filtracin de membrana (FM) de acuerdo con
ISO, las membranas deberan incubarse durante 18 h a 24 h a una temperatura especificada.

A fin de ensayar la validez de los lmites dados, se ensayaron cinco muestras de agua mediante el
mtodo de FM. Se contaron las placas con nmeros "confiables" de colonias despus de 18 h y 24 h.

A continuacin se enuncian los resultados:

Muestra Recuento despus de 18 h Recuento despus de 24 h Cambio %
1
2
3
4
5
90
44
70
8
29
93
88
69
49
69
+3
+100
-2
+613
+238

En slo dos muestras (1 y 3), la diferencia entre recuentos despus de 18 h y despus de 24 h encaja
dentro de la repetibilidad normal del recuento (CV= 3 % a 4 %) ilustrada por los Ejemplos B.2 Y B.3.

Por lo general no es necesario probar los resultados de tales experimentos estadsticamente. En
principio, es suficiente una clara excepcin para rechazar la hiptesis de robustez. En este
ejemplo, cada una de las muestras 2, 4 y 5 indicaron que el recuento cambia demasiado dentro
del supuesto intervalo aceptable.

El resultad de este ejemplo debera interpretarse de modo que se reconsideren las
especificaciones para tolerancia del tiempo de incubacin o el objeto del mtodo.

B.6 EJEMPLO B.5 - ANLISIS DE UN ENSAYO DE PROPORCIONALIDAD: LMITE
SUPERIOR DEL DESEMPEO DEL DETECTOR

B.6.1 Generalidades

Se diluy previamente una muestra natural hasta el nivel adecuado despus de lo cual se
prepar una serie de dilucin de seis pasos sucesivos de 1:2 de acuerdo con el plan presentado
en el Anexo C.

Se elaboraron tres placas paralelas de cada dilucin empleando la tcnica de siembra superficial.
Se contaron las colonias despus de dos das de incubacin.

Dilucin Recuentos paralelos Suma

Si
Volumen relativo
VR, i
Proporcin

Si/ VR, i
2-
1

2
-2

2
-3

2
-4

2
-5

2
-6

121
109
111
56
36
11
204
128
114
60
29
13
163
148
97
68
24
17
487
385
322
184
89
41
32
16
8
4
2
1
15,22
24,06
40,25
46,00
44,50
41,00
Total: 1 508 63


44
B.6.2 ENSAYO DE PROPORCIONALIDAD GENERAL

A fin de ensayar la proporcionalidad general ("linealidad") de los recuentos de colonias y el
volumen de muestra, basta con calcular el ndice de relacin de probabilidad logartmica (G
2
)
para la concordancia de las sumas de nmeros de colonias paralelas con los respectivos
volmenes relativos.

Los recuentos deberan concordar con las series geomtricas 32/16/8/4/2/1.

La estadstica de ensayo tiene 6-1=5 grados de libertad.

De acuerdo con la frmula (vase el Anexo A, tem A.2):

[ ]
526 , 292
) 63 / 508 1 ( ln 508 ) 1 / 41 ( ln 41 ) 2 / 89 ( ln 89 ) 4 / 184 ( ln 184 ) 8 / 322 ( ln 322 ) 16 / 385 ( ln 385 ) 32 / 487 ln( 487
2
5
+ + + + + G

Se compara el valor del ndice con la distribucin ?
2
con cinco grados de libertad. El valor
calculado excede el valor terico para 0,1 % (20,515), lo cual significa que la linealidad general
de los resultados es extremadamente deficiente. (La conclusin es obvia en este caso incluso sin
clculo, y se puede alcanzar por simple observacin de las sumas en la tabla). Obviamente la
proporcin 2:1 entre diluciones sucesivas no se realiza en los recuentos de colonia.

Por lo tanto, la conclusin es que el sistema detector no fue lineal en esta muestra en el intervalo
de recuento de colonia desde 41/3=14 hasta 483/3=161 colonias por placa. A partir de la
inspeccin de las sumas, o incluso ms claramente de los recuentos por volumen relativo (S
i
/V
i
),
se puede concluir que los nmeros elevados de colonia se desvan la mayora de lo esperado. El
detector se ha vuelto no funcional incluso por debajo de 160 colonias por placa.

Se puede obtener un nmero de valores por pareja con ensayos de proporcionalidad similar
realizados en diferentes muestras: el recuento promedio ms alto (161 en este caso) y el valor de
ndice de dispersin observado (G
2
= 292,526 en este caso).La representacin de los valores
ndice en grficos de gua ayuda a determinar el ms alto recuento de colonia cuando la
proporcionalidad del mtodo es suficiente.

En la Figura B.1 se examina de esta manera un ejemplo de 14 muestras. Se seleccion un valor
de gua arbitrario de 15,09 (1% de probabilidad) y se mostr mediante una lnea horizontal. Los
puntos por encima de la lnea pertenecen a la serie con proporcionalidad deficiente. El eje
horizontal (c
mx
) presenta el recuento promedio por placa de la dilucin ms baja incluida en el
ensayo de proporcionalidad. Las lneas horizontal y diagonal se intersectan en el nmero de
colonia promedio donde la probabilidad de proporcionalidad "adecuada" se hace menor del 1 %.

La linealidad se mide en trminos de G
2
.c
mx
= recuento promedio de colonia por placa de la
dilucin con ms altos nmeros de colonia.

La conclusin no siempre es tan obvia como en este ejemplo. Se puede requerir un anlisis ms
detallado a fin de explicar la falta de proporcionalidad.

NOTA 1 El empleo de los presupuestos razonables mencionados anteriormente respecto a que todas las series
incluidas en el estudio de proporcionalidad tienen el mismo nmero de diluciones contables (grados de libertad). Si
ocurriera que todas las series no tuvieran el mismo nmero de diluciones contables, se debera emplear otra medida de
proporcionalidad I = G
2
/(n-1). El valor de gua se hace un poco ms vago en esta instancia puesto que I = ?
2
/(v) no es
una constante pero depende de los grados de libertad (v).

NOTA 2 I = ?
2
/(v) generalmente denominada la proporcin Lexis, en honor del economista alemn Lexis.
Frecuentemente se denot por el smbolo L.


45
200 0
0
150
50
100
400 600 800
G
n
d
i
c
e
REF X21
C G5
mx.
mx.
C

Figura B.1. Linealidad de serie de recuentos a partir de seis diluciones
binarias sucesivas de 14 muestras

Para ensayar con mayor detalle donde ocurre la prdida de linealidad, se puede subdividir el
ndice total G
5
2
=292,526 en comparaciones ortogonales avanzando o descendiendo poco a poco
en la tabla y formando sucesivamente los contrastes para cada suma individual, con todas las
sumas por debajo de dicho ndice tomadas en conjunto.

B.7 EJEMPLO B.6 -DATOS DE PLACAS PARALELAS

B.7.1 Generalidades

Los datos en recuentos de placa paralelos se corrigen con facilidad. Estos resultan tiles para la
validacin del mtodo puesto que la diferencia tcnica entre placas paralelas consiste en casi
nada ms que errores de volumen al pipetear. A menos que algo est radicalmente errneo en la
tcnica de pipeteo, la incertidumbre del volumen prcticamente desaparece entre la dispersin
aleatoria de partculas (vase el numeral 6.1).

La concordancia estadsticas (aleatoriedad) de un conjunto de placas paralelas puede medirse
calculando el ndice de dispersin de Poisson de acuerdo con el literal A.3 o el ndice de relacin
de probabilidad logartmica de acuerdo con el literal A.2.

Si se observa desacuerdo substancial con la aleatoriedad de Poisson, casi con seguridad la
causa ser algo diferente a la inexactitud del pipeteo. De esta manera, el anlisis de datos de
placas paralelas puede servir par los propsitos de validacin del mtodo.

Se puede emplear un valor de ndice individual para evaluar la confiabilidad estadstica del
conjunto de placas paralelas en particular. Un valor de ndice excesivamente alto, en
comparacin con la distribucin ?
2
, puede indicar que la media de dicho conjunto no es confiable.
De esta forma, el ndice de dispersin de Poisson es una herramienta de AQC importante.


46
De mayor importancia es que los valores ndice reunidos de un gran nmero de muestras diferentes
pueden emplearse para orientacin acerca de los aspectos de desempeo del mtodo. Los datos de
dos mtodos brindan una oportunidad de comparar su confiabilidad relativa, y la validacin
secundaria se beneficiar de una comparacin con especificaciones desarrolladas durante la
validacin primaria.

B.7.2 DISTRIBUCIONES DE FRECUENCIA DE NDICES DE POISSON

La siguiente tabla muestra las primeras pocas filas de datos de recuentos paralelos (B1, B2) de
sesenta muestras. stas representaban una amplia serie de concentraciones de partcula. El ndice
de dispersin de Poisson (?
2
) se calcul para cada conjunto paralelo de acuerdo con el literal A.3.

Suspensin B1 B2 ?
2

1
2
3
4
5
etc.
256
228
89
27
143
302
146
108
29
129
3,792
17,979
1,832
0,071
0,721

Por ejemplo, el primer par de resultados del valor ?
2
se obtuvo del clculo:

( )
792 3 302 256
302 256
302 256 2
2
2 2
, ) ( X +
+
+

El ndice tiene una distribucin estadstica terica. La distribucin de ndices observada puede
compararse con la expectativa terica mediante la anotacin de la frecuencia de los valores
ndice de diferente tamao. Estos lmites de clase se obtienen de los puntos de porcentaje de la
distribucin ?
2
. Para hacer esto, se deben consultar los puntos de porcentaje de la distribucin ?
2
con los grados apropiados de libertad (uno menos que el nmero de paralelos). Este caso, es
necesaria la tabla para un grado de libertad.

Puntos de porcentaje P de la distribucin ?
2
para un grado de libertad:

P 0,95 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,05
X
2
0,004 0,016 0,064 0,148 0,256 0,455 0,722 1,07 1,62 2,71 3,84

La forma ms simple de emplear la tabla consiste en construir lmites de clase para una distribucin
uniforme de frecuencias esperadas. Por ejemplo, de todos los valores ndice, se espera que el 20 %
encaje por casualidad en cada una de las cinco clases con los siguientes lmites:

Clase 1 0 a 0,064
Clase 2 0,064 a 0,256
Clase 3 0,256 a 0,722
Clase 4 0,722 a 1,62
Clase 5
> 1,62

La frecuencia esperada en cada clase depende del nmero de casos estudiados. Con 60 casos
(ejemplo a continuacin), la expectativa sera que 12 observaciones encajaran en cada clase.

De manera similar se pueden construir distribuciones que no sean uniformes. En el ejemplo a
continuacin se muestra una construccin diferente. Los datos se dividieron en seis clases, con el
5 %, 15 %, 30 %, 30 %, 15 % y 5 % de casos esperados en las clases respectivas.


47
Los datos mostrados en el caso de ejemplo son para un mtodo particular (Mtodo A). Otro
mtodo (Mtodo B) se ensay simultneamente en las mismas suspensiones exactamente en la
misma forma, Tambin se calcularon y se reunieron en las clases de frecuencia los ndices de
dispersin de las placas paralelas con dicho mtodo. En la Tabla B.1 se presentan los resultados

Tabla B.1. Comparacin de las frecuencias observadas de los ndices
de dispersin de dos mtodos con expectativa terica

Frecuencia observada Clase de frecuencia Lmite de clase
superior
Frecuencia esperada
Mtodo A Mtodo B
1 0,004 3 1 2
2 0,064 9 3 7
3 0,455 18 10 10
4 1,64 18 15 22
5 3,84 9 10 10
6 >3,84 3 21 9
Total 60 60 60

Obviamente, las determinaciones paralelas del Mtodo B son ms cercanas a las expectativas
tericas. El ajuste podra probarse mediante el ensayo clsico de bondad del ajuste de Pearson
en caso de que en las especificaciones se haya indicado acuerdo con la distribucin de Poisson.
Si, de otro modo, los Mtodos A y B son equivalentes, la observacin claramente favorece la
opcin del Mtodo B.

Una inspeccin ms detallada de los valores ndice podra revelar las razones para la excesiva
cantidad de valores elevados con el mtodo A. Si se encuentra correlacionada con los recuentos de
colonia, se podra emplear como informacin adicional acerca del lmite de trabajo superior del
mtodo.

B. 8 EJEMPLO B.7 - CLCULO DEL COMPONENTE DE SOBREDISPERSIN
U
A PARTIR
DE DATOS DE RECUENTO PARALELO

Siempre que se cuente con observaciones paralelas en forma de datos de recuento sin
transformar, se puede emplear el principio descrito en el numeral 6.2.3 [ecuacin (12)] para
calcular el componente adicional (sobredispersin) del procedimiento analtico.

El siguiente ejemplo se basa en un ensayo de desempeo de mtodo multicentral. Ms de 50
laboratorios participaron. Se tomaron los resultados de doce laboratorios para ilustrar los clculos.

Cada laboratorio estudi una muestra por su cuenta. De antemano, slo se acord que la
muestra deba representar el mismo tipo de material (agua de desecho municipal). Todos
emplearon el mismo procedimiento analtico, excepto que cada laboratorio tena completa
libertad en cuanto a la forma cmo mezclar y diluir la muestra que haban tomado.

Como consecuencia, los resultados de diferentes laboratorios tuvieron recuentos de colonia
promedio bastante diferentes en las diluciones que tenan para recuento.

El diseo experimental const de cuatro series de dilucin elaboradas de la suspensin de
muestra homogenizada. Se prepar una placa por dilucin. Se dio instrucciones a los laboratorios
para que escogieran la misma dilucin en todas las cuatro series para recuento.


48
Tabla B.2. Resultados de diferentes laboratorios

Resultados paralelos
Laboratorio
C1 C2 C3 C4
c Varianza VTM
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
198
155
58
37
124
28
167
10
66
8
204
162
233
145
53
42
106
17
238
12
84
13
186
141
218
150
64
38
92
11
213
13
94
7
225
166
254
131
66
31
117
20
206
8
71
5
216
199
225,8
145,3
60,3
37,0
109,8
19,0
206,0
10,8
78,8
8,3
207,8
167,0
506,2
106,9
34,9
20,7
194,9
50,0
864,7
4,9
160,9
11,6
284,2
575,3
2,48
0,75
0,58
0,56
1,78
2,63
4,20
0,46
2,04
1,40
1,37
3,45
c= recuento promedio por placa
VTM= proporcin varianza-a-media ("proporcin Lexis")

De acuerdo con el principio dado en el numeral 6.2.3, se espera que la lnea de regresin de
VTM (=Y) en c tenga la forma:

Y = 1 + u
2
c

As la pendiente de la lnea ofrece un clculo de la constante de sobredispersin al cuadrado.

Las medias y varianzas se basaron en un pequeo nmero (4) de paralelos. Se espera
considerable dispersin aleatoria en sus clculos de proporcin. Este hecho es claramente
evidente cuando se representan los resultados de este experimento (vase la Figura B.2).

0
0,3
1,1
80
Y
4,3
1,9
160
Nmero de recuentos
240
2,7
3,5

Figura B.2. Dependencia de la proporcin varianza-a -media en el recuento de colonia
promedio en un experimento con muestras de agua de desecho

Cada punto representa una muestra estudiada por un laboratorio diferente. Las medias y
varianzas se basaron en recuentos de colonia sin transformar en cuatro determinaciones
paralelas de una suspensin de ensayo.


49
Debido a la gran dispersin, existe considerable duda de si la lnea de regresin representa
exactamente la verdadera relacin. Se necesitaran ms datos para calcular la pendiente con un
alto grado de confiabilidad. No obstante, se puede continuar el clculo, a fin de ilustrar el mtodo.

La lnea de regresin de los cuadrados mnimos ajustada a los puntos de los datos tiene la
ecuacin:

Y = 0,09 + 0,007 66c

La constante (0,09) est muy cerca del valor esperado de 1,0. La pendiente presenta el valor de
sobredispersin al cuadrado u
2
= 0,007 66. Por consiguiente, la variacin excesiva como desviacin
estndar relativa es u= 0,088.

La pendiente no es significativa estadsticamente. No se ha demostrado de manera convincente
que existan fuentes de variacin adems de la distribucin de Poisson. no es aconsejable
proceder ms all en la interpretacin. no obstante, el resultado es lo suficientemente interesante
para poder concluir que vale la pena el esfuerzo de reunir ms datos similares para poder
calcular la pendiente con mayor confiabilidad.

NOTA Los componentes de incertidumbre que contiene la constante de sobredispersin dependen del plan
experimental. Los principales factores que pudieron haber causado variacin adicional en este plan experimental
particular fueron:

- posible falta de mezcla perfecta de muestras;

- errores aleatorios volumtricos en las diluciones;

- incertidumbre de recuento personal.

El valor de la constante 0,088 significa que el componente adicionado es slo aproximadamente
9 %. La heterogeneidad de la muestra, las incertidumbres volumtricas acumuladas y la repetibilidad
del recuento personal combinados pueden interpretarse como an dentro de los lmites aceptables.

En este plan, donde cada laboratorio emple una muestra propia, no se puede aprender nada
acerca de la competencia de los diferentes laboratorios. Han desaparecido todas las diferencias
en la recuperacin relativa, la interpretacin de la apariencia de la colonia y el funcionamiento de
los medios nutrientes. A fin de incluir estos factores, todos los laboratorios deberan haber
estudiado una muestra idntica y haber seguid procedimientos idnticos.

Si los resultados paralelos haban sido recuentos paralelos del mismo recipiente de dilucin final,
entonces el factor de sobredispersin no habra incluido heterogeneidad del material e
incertidumbre de la dilucin. Las nicas fuentes adicionales restantes habran sido el pipeteo y el
recuento.


50
ANEXO C

EJEMPLO DE EXPERIMENTO DE VALIDACIN

C.1 RECUENTO DE PLACA Y SIEMBRA SUPERFICIAL (repetidos para diferentes muestras)

Suspensin
bsica
Dilucin
1:2
C C C C
1:2
C C
1:2
C C
1:2
...
Diluciones dobles
(ej: 7 pasos de
dilucin repetido)
Siembra por
triplicado
Conteo por
diferentes personas
Repetido para
diferentes
mtodos

C.2 FILTRACIN DE MEMBRANA (repetida para diferentes muestras)

Suspensin
bsica
Filtracin de un volmen
graduado finamente
(ej: diferentes volmenes)
C C
1 x a ml
C C C C
C C C C C C
2 x a ml
C C C C C C
3 x a ml
n x a ml
C C C C C C
...
Repetido para diferentes mtodos
Conteo por diferentes personas

NOTA Cualquier dato disponible de recuento en rplica o placas paralelas se puede emplear para estudiar los
detalles especficos de la validacin. Se deberan probar la sensibilidad y selectividad antes de emplear este diseo.


51
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DOCUMENTO DE REFERENCIA

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Water Quality- Guidance on
Validation of Microbiological Methods. Geneva. 2000 47 p (ISO/TR 13843:2000(E))

GTC84 Validación de Análisis Microbiológicos

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