Microbiologa Celular

Prctica # 5
Integrantes:
Roberto Gutirrez Pozos
Ivn Moya de Santiago
Jos Saucillo Moreno
Imelda del Carmen Snchez Rubio del Cueto


Introduccin
Mtodos de Estudio y Diagnostico Viral
En las ltimas dcadas se han desarrollado una serie de tcnicas para el diagnstico viral
basadas en la deteccin de cido nucleicos, la ms utilizada es la Reaccin de cadena de la
polimerasa (PCR)
Recoleccin, transporte y procesamiento de las muestras
Para realizar el diagnstico adecuado de un virus, es importante llevar a cabo un mtodo bien
empleado en la tima y el procesamiento de la muestra. Las mejores muestras son las que se
obtienen en las primeras 72 horas, es cuando el virus se excreta en concentraciones elevadas y
aun no se han unido a los anticuerpos, posteriormente es intil la realizacin de medio de cultivos
virales, aunque en pacientes inmuno-comprometidos el virus puede estar presente durante
periodos prolongado. Las muestras deben de obtener se forma asptica, el volumen de la muestra
debe ser suficiente como para permitir la realizacin de los ensayos apropiados. La muestra debe
de obtener de: conjuntivas, geniales, recto, mucosa oral, lesiones cutneas, sangre aspirado
nasofarngeo, lavado bronquio alveolar, expectoracin, orina, LCR, materia fecal, biopsias.
Dado la labilidad de los virus, deben de ser transportados en un medio estable, el cual se obtiene
mediante la adicin de protenas (albumina, gelatina), se le debe agregar antibitico, antifngios y
se debe transportar a 4C
Tcnicas de aislamiento
Los mtodos para reconocer las infecciones por virus humanos se clasifican en: Directos e
Indirectos.
a. Directos
Aislamiento Viral- Detecta al virus como un agente infecciosos, es considerado el
estndar de oro por su alta sensibilidad y especificidad, se obtienen los cultivos de
explantes de rganos y se disocian con tripsina(enzima) que rompe el cemento celular,
la suspensin obtenida se coloca en la superficie de un recipiente de vidrio donde las
clulas se adhieren y multiplican formando una capa llamada Monocapa celular, la cual
crece en medio de cultivo, luego de inoculado el cultivo celular, se incuba a 35-37C
por 14 das, esperando el efecto citoptico, txico o la generacin de nuevas clulas.
Cuando el virus no produce un efecto citoptico , se recurre a la tcnica que pone en
evidencia el cultivo, las ms usadas son: Hemadsorcion, Hemaglutinacin y tinciones
con anticuerpos monoclonales
Tcnicas Inmunolgicas- Detectan la presencia de antgenos virales, se utiliza un
anticuerpo especfico antiviral a cuya fraccin Fc se conjuga una molcula marcada,
que puede ser isotiocianato de fluorescena, un istopo radioactivo 125I, o una enzima:
peroxidasa, fosfatasa alcalina, para objetivar la reaccin.
o Inmunofluorescencia Directa- Es de las tcnicas ms antiguas, las muestras clnicas
se fijan a un porta objetos y se le agregan anticuerpos especficos marcados con
isotiocianato de fluorescencia que difunde a travs de la membrana celular y se
combina con los antgenos vricos en el interior de la membrana, la reaccin
antgenos anticuerpo se observa la microscopio de fluorescencia, esta tcnica se
utiliza para la identificacin rpida de virus o para la confirmacin del efecto
citoptico observado en los cultivo.
o Test de aglutinacin- Se usa para la deteccin de antgenos virales en muestras
clnica, dependen de la fijacin de anticuerpos antivirales especficos sobre
eritrocitos o partculas de ltex, luego se incuba con el antgeno y las partculas se
aglutinan si el antgeno adecuado se encuentra presente, esta prueba tiene un
elevado porcentaje de reacciones inespecficas, por lo que no es tan eficaz.
o Enzimoinmunoanlisis- Deteccin de antgeno y se basa en la captura del antgeno
por anticuerpos especficos unidos a una base slida. El antgeno viral presente en
la muestra clnica se combina con el anticuerpo fijado a la fase slida y el antgeno
viral se detecta mediante la adicin de otro anticuerpo especfico conjugado a una
enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina).
o Amplificacin de cidos nucleicos virales mediante una reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) - Fue desarrollada para incrementar el nmero de molculas de
DNA blanco en las muestras, tiene una sensibilidad tan alta que puede amplificar
una nica molcula de DNA y una sola copia de genes. Se basa en la utilizacin de
secuencias cortas de nucletidos sintticos llamados primers que se hibridan de
forma especfica con cada una de las cadenas de DNA.

b. Indirectos
Inmunofluorescencia Indirecta- Ayuda a la determinacin de anticuerpos antivirales en
el suero de pacientes, se basa en la unin de anticuerpos antivirales a los antgenos
expresados en la superficie y citoplasma de clulas infectadas.
Enzimoinmunoanalisis Indirectos- Los antgenos virales se inmovilizan sobre una fase
slida y se agregan los sueros de estudios, se incuban, se lavan y se revela la reaccin
Ag- Ac por el agregado de una inmunoglobulina antiespecie conjugada con una enzima,
seguida por el substrato apropiado para esta.
Western Blot- Se basa en la separacin electrofortica de protenas virales que son
posteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa con el objeto de determinar la
presencia de anticuerpos especficos contra casa una de sus protenas
(1)
Imelda del
Carmen Snchez Rubio del Cueto.

Tcnicas moleculares de Microbiologa:
La Biologa molecular es la ciencia que se ocupa del estudio de las bases moleculares de la vida;
es decir, relaciona las estructuras de las biomolculas con las funciones especficas que
desempean en la clula y en el organismo. Por tanto su objetivo fundamental es la comprensin
de todos aquellos procesos celulares que contribuyen a que la informacin gentica se transmita
eficientemente de unos seres a otros y se exprese en los nuevos individuos. Para ello requiere de
la secuenciacin de los cidos nucleicos, del diagnstico molecular, de la produccin de
fragmentos de cidos nucleicos a gran escala, entre otras disciplinas
Las tcnicas de Biologa Molecular (BM) permiten la deteccin de material gentico tanto DNA
como RNA, que constituyen la caractersticas de especie y sus modificaciones como mutaciones,
deleciones y translocaciones, las cuales tienen diferentes implicancias segn la situacin
estudiada.
Los fundamentos de estas tcnicas son variables: estudios de restriccin del ADN cromosmico o
extracromosmico, anlisis del nmero de copias de determinadas secuencias de insercin o
repetitivas a lo largo del cromosoma o de las regiones entre secuencias de insercin o repetitivas
adyacentes o amplificacin arbitraria de fragmentos genticos (APPCR). La mayor ventaja de
estos mtodos radica en la estabilidad de los marcadores genticos utilizados y en la posibilidad
de aplicarlos universalmente a distintos gneros y especies de microorganismos.
En microbiologa permiten la deteccin de porciones de cidos nucleicos que son especficos de
cada microorganismo, en diferentes materiales clnicos. Su aplicacin, surge como una
necesidad para poder detectar microorganismos de difcil crecimiento en cultivos o desarrollos
tardos y donde las tcnicas serolgicas de deteccin de antgenos y anticuerpos carecen de
suficiente sensibilidad y especificidad diagnstica. Esta circunstancia se ajusta principalmente a
la deteccin de virus, es por ello, que el desarrollo de tcnicas moleculares comenz en esta
rea.
Las primeras tcnicas de BM, se utilizaron en los aos 70 basndose en el mismo principio que
las actuales, la hibridacin (unin de pares de bases complementarias) entre cadenas de cidos
Nucleicos.
Esta unin es de alta especificidad pero carecen de sensibilidad, lo que las convirti en poco tiles
para la deteccin y se utilizan principalmente para la identificacin de microorganismos.
En los 80, la incorporacin de la amplificacin de AN a travs de enzimas termoestables
(polimerasas) y la evolucin de los sistemas de deteccin, permiti mejorar notablemente la
sensibilidad. Siendo parte de una de las herramientas ms importantes en el diagnstico de alta
complejidad en la prctica.
Ejemplo: informes de carga viral de Citomegalovirus, en 24 hs, en urgencias clnicas de pacientes
transplantados.
Ventajas:
Las tcnicas de ELISA, Hibridacin, etc. Confieren su altsima sensibilidad.
Su rapidez
La caracterstica de detectar presencia de AN en vez de viabilidad de microorganismos
permite su realizacin en una gran variedad de muestras.
La capacidad de determinar la cantidad de AN especfico (Cuantificacin o Carga Viral), a
travs de la incorporacin de controles internos de concentracin conocida.
Desventajas:
La probabilidad de resultados falsos positivos por contaminacin con productos de
amplificados anteriores.
La probabilidad de falsos negativos por la presencia de inhibidores o inconvenientes en los
diferentes pasos de las tcnicas, esto se controla y detecta con la incorporacin de controles
internos.
No permite el aislamiento del microorganismo para la posterior deteccin de resistencia.
Los costos.
(2)(3)
Ivn Moya de Santiago.

De los mtodos empleados en el laboratorio de diagnstico molecular de hoy, ninguna es ms
penetrante que la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). La comprensin de sus
principios bsicos es crucial para la comprensin de los diagnsticos moleculares
En esencia, la PCR es una tcnica para amplificar una secuencia corta, predefinida de ADN
presente en una muestra a partir de un nmero muy bajo de copias (posiblemente una sola
copia), a los nmeros de secuencia idntica copias muy grande (y por lo tanto ms fcilmente
detectable). El mtodo en s es simple y se basa en los conceptos de estructura de cido
nucleico, filamento desnaturalizacin y la hibridacin, y la actividad de la polimerasa de ADN,
segn se regulan en las anteriores entregas de esta serie.

Para entender el proceso, vamos a considerar en primer lugar qu componentes va en el tubo
de PCR:
Un tampn acuoso, que contiene iones Mg 2 y un agente tampn pH plus (a veces) otros
cofactores particulares que ayudan a la polimerasa que se utilizarn;
dNTPs, como los bloques de construccin de las hebras de ADN naciente por la ADN
polimerasa;
ADN polimerasa termoestable (es decir, uno no inactivado por calentamiento);
Un par de cortos, de secuencia definida, oligonucleotidepdmers ADN sinttico de una sola
hebra. Dos aspectos de estos cebadores son crticos para el proceso: primero, que ha de ser
complementaria a dos secciones prximas de la secuencia diana a amplificar (por lo general
para aplicaciones de diagnstico, en el orden de 100 a 500 pares de bases de diferencia).
En segundo lugar, los cebadores deben ser complementarios a las cadenas opuestas de su
secuencia diana, y orientada de tal manera que cada cebador cuando hibrida con su
secuencia complementaria seala su extremo 3 ' hacia el lugar de la secuencia del otro
cebador. Cada cebador del par est presente en grandes cantidades en el tubo de reaccin.
Una muestra que contiene ADN entre los que existe la plantilla de secuencia diana.
A medida que el proceso se inicia en (A), nuestra plantilla de muestra se encuentra en su
forma nativa, de doble cadena como se muestra. Elevando la temperatura a 95 C
(desnaturalizacin, b) har que nuestra molcula de plantilla para desnaturalizar a hebras
individuales de ADN libres.
La reaccin se enfri ahora rpidamente a una temperatura en o ligeramente por debajo de la
temperatura de recocido o Tm de nuestros cebadores (aqu, por el bien de ejemplo, siendo 52
C) (de recocido, C). La rapidez con la que se produce este enfriamiento y la gran exceso
molar de cebador relativa a cadenas de molde significa que es mucho ms probable que los
cebadores se hibride con sus regiones complementarias en la plantilla de las dos molculas de
molde ms largos se hibridarse entre s .
A la luz de los artculos anteriores de esta serie, el lector ahora reconocen que las estructuras
presentes en (C) representan sustratos de ADN polimerasa para trabajar. Ser termoestable, la
polimerasa presente en nuestra reaccin no fue daada por la desnaturalizacin a alta
temperatura (B).

Pero tampoco era tremendamente activa a esta temperatura ms baja, que de este modo
acta solamente para sujetar al extremo 3 ' de cada cebador hibridado en su molcula
plantilla. Queda para elevar la temperatura a una ms favorable a la actividad enzimtica, 72
C, (extensin; D) y permitir que las polimerasas para actuar sobre sus sustratos, se extiende el
extremo 3 ' de cada cebador en una plantilla de manera dirigida hacia el opuesto secuencia de
cebador. Cada polimerasa est creando as una nueva copia de una cadena de la secuencia
diana
. (4)
Roberto Gutirrez Pozos
La reaccin en cadena de la polimerasa o PCR (siglas de su nombre en ingls Polymerase
Chain Reaction) permite generar una gran cantidad de copias de un fragmento de DNA (cido
desoxirribonulceico). El requisito fundamental para poder llevar a cabo la reaccin es disponer
de fragmentos cortos de DNA de cadena sencilla complementarios a los extremos del
fragmento a amplificar. Estos fragmentos servirn como cebadores para que una enzima
polimerasa sea capaz de incorporar nucletidos complementarios a la cadena molde. Una vez
completada la reaccin la cantidad fragmento amplificado se puede visualizar mediante
tcnicas sencillas de separacin de fragmentos de DNA.
(5)
Jos saucillo moreno
Hiptesis
Por medio de la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) identificaremos la
importancia y las ventajas del empleo de tcnicas moleculares en la identificacin
microbiolgica.
Materiales y Mtodo
Diagramas de flujo se encuentran en los anexos

Resultados
1. Se extrajo exitosamente la sangre del compaero voluntario.
2. Se siguieron las indicaciones de la prctica tal como se indic, se prepar la mezcla de
reaccin necesaria para cada uno de los tubos de muestra, ms el tubo adicional.
3. Se adiciono a cada tubo 1 L de la muestra
4. Se pasaron las sustancias al termociclador de acuerdo a los datos indicados
5. Posterior a esto el producto del PCR se pas a analizar por medio de electroforesis en gel.







6. Debido a un error en aplicacin del PCR, sobre el gel de agarosa, la replicacin no fue
posible observarla.

Anlisis
El PCR es una tcnica aparentemente sencilla y fcil de hacer. La reaccin de PCR es muy
sensible a cambios de iones, temperaturas, contaminantes que pueden estar en el ADN o en
el agua, un termociclador a otro puede haber variaciones.
Es una tcnica para la sntesis in vitro de secuencias especficas de ADN, con la cual se
amplifica el ADN problema. La tcnica se basa en la replicacin del ADN en los organismos
eucariotas realizada por la ADN polimerasa. Estas enzimas realizan la sntesis de una cadena
complementaria de ADN en el sentido 5' 3' usando un molde de cadena sencilla, pero a
partir de una regin de doble cadena
La reaccin de PCR se basa en la repeticin de un ciclo formado por 3 etapas:
- Desnaturalizacin del ADN de la doble cadena
- Hibridacin de los iniciadores a la zona 3' especfica de cada una de las hebras.
- Extensin del cebador 3' por medio de la ADN polimerasa.
(6)


De acuerdo a los pasos indicados realizamos de manera adecuada el procedimiento, sin
embargo por una mal aplicacin del PCR en el gel agarosa no pudimos observar la replicacin.

Conclusin
Aceptamos la hiptesis ya que realizamos el procedimiento e indicaciones para realizar una
prueba de PCR.
Aprendimos gracias a las indicaciones como realizar la prueba PCR as como interpretar el
resultado en la electroforesis.
En esta prctica supimos de la existencia del PCR y su metodologa para el uso en
diagnsticos, esta prueba se hace en tiempo real y tiene una eficiencia alta adems de que su
costo es accesible para las personas, se usa para la deteccin de virus en el cuerpo humano o
en locaciones que se encuentran endmicas, adems de su uso diagnstico, de igual forma el
PCR ha sido utilizado la identificacin de genes mediante la bsqueda en el genoma humano
Este tipo de deteccin de virus puede causar diversos sesgos pero no porque el propio PCR
los provoque sino que los sesgos son cometidos por las personas ya que en este tipo de
pruebas se necesita paciencia y precisin, y como sucedi en nuestra practica no se pudo
lograr con xito debido a la mala precisin al momento de la colocacin del reactivo en el
electroforesis
A pesar de que el PCR sea un excelente medio de diagnstico mdico, los propios mdicos no
lo llegan a utilizar debido a que no saben de su existencia o si lo saben no lo saben utilizar
para su diagnstico, pero si se llegar a popularizar en el mbito mdico muchos de los
diagnsticos se haran ms simples de realizar.

Referencias
1.-Sandin M; Mtodo de Estudio y Diagnstico Viral (2007)
2.- Centros Mdicos Dr. Stamboulian. Tcnicas moleculares de Microbiologa en la prctica diaria.
Rev. Bioanalisis N 8 Marzo- Abril 2006.
3.- Velasco Mosqueira R. LA BIOLOGA MOLECULAR Y EL ADN. Facultad de Ciencias
Agropecuarias Vol. 2 No.1 Marzo 2004; P 55-60.
4. - Brunstein J; PCR: the basics of the polymerase chain reaction; MLO: Medical Laboratory
Observer; 2013 Apr; Vol. 45 (4), pp. 32, 34-5.
6. - Livak K. Schmittgen T. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real- Time
Quantitative PCR and the 22DDCT Method. METHODS 25 (2001), 402408
Investigacin de PCR
Laboratorio de Anlisis Clnicos Responsable: QFB Familia Lucero Gonzlez
No cuenta con la prueba de PCR, ya que al
preguntar por ella solo nos ofrecan la
protena c reactiva.

Laboratorio Corycel Responsable: QFB Sergio Vega
Los ms comunes son:
Papiloma $2550 (Mas comn solicitado por
gineclogos)
Tuberculosis $2310
Sincitial respiratorio $7800
Tarda 10 das en entregar los resultados

Chopo Responsable: QFB Ana Estrada
Papiloma $1500
Mycobacterium TB $3000
Caga Viral VIH $5500
Hepatitis $6000
La responsable del laboratorio nos inform
que estos estudios son muy poco
solicitados, por el precio y porque los
mdicos no conocen el propsito de estos
estudios