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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA


DESARROLLO ANALTICO LABORATORIO
REA TERMINAL: FARMACIA CLNICA




Procedimiento para la cuantificacin de Diacepam en plasma por espectrofotometra UV.

Elabor:
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Revis:
Nombre:
Cargo:
Fecha:
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Autoriz:
Nombre:
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Material conocer
4 pipetas volumtricas de 1 mL.
2 pipetas volumtricas de5 mL.
1 pipeta graduada de 10 mL.
10 tubos de ensayo de 13X100.
4 tubos de ensayo de 15X10.
1 gradilla.
2 vasos de precipitados de 50mL,100 mL y 150 mL.
Celdas de cuarzo.
Papel absorbente.
2 matraces volumtricos de 100 mL.
4 matraces volumtricos de 10 mL.
Papel glassin.
indumentaria de seguridad (bata, guantes estriles, cubrebocas y lentes de seguridad).
Jeringa de 5 mL.
Portaobjetos
Capilares
Cmara de elusin
Bao Mara


Reactivos
HCl
Agua destilada.
Hipoclorito de Sodio al 0.5%.
Alcohol etlico al 70%.
cido sulfrico.
ter etlico.


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Procedimiento para la cuantificacin de Diacepam en plasma por espectrofotometra UV.

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NaCl
NaOH
Formaldehido.
Gel de slice para capa fina

Material biolgico

Plasma
Instrumentos
Espectrofotmetro UV Hitachi Modelo
Balanza analtica Modelo ?
Equipo
Vortex
Parrilla de calentamiento.
Precauciones
Sanitizar el rea de trabajo con alcohol al 70% o con hipoclorito al 0.5%.
Evitar calentar el plasma a no ms de 40C, ya que se pueden desnaturalizar las protenas.
Utilizar guantes de nitrilo o ltex para el manejo de la muestra.
Colocarse la indumentaria de seguridad.
Manejo de la muestra
El manejo de la muestra de plasma se realizara de la siguiente forma:
Retirar la bolsa de plasma del refrigerador y colocarla sobre la mesa de trabajo, dejar
temperizar a temperatura ambiente por 15 min y despus colocarla en un bao mara a 35
5C por 15 min.


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Procedimiento para la cuantificacin de Diacepam en plasma por espectrofotometra UV.

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Con una jeringa de 5 mL extraer este volumen de la bolsa de plasma y depositarlo en un tubo
de ensaye de 15X10 con tapn de vaquelita.

Preparacin de la solucin estndar de diacepam
Solucin Reactivo de cido clorhdrico 2N
En un matraz volumtrico de 100mL, depositar 30mL de agua destilada, agregar lentamente
16.87mL de cido clorhdrico. Enfriar a temperatura ambiente y llevar al aforo con agua destilada.
Solucin estndar de Diacepam
Pesar aproximadamente 12.5 mg en la balanza analtica sobre papel glassin de estndar secundario
de Diacepam y colocarlo en un matraz aforado de 25 mL, aadir agua y unas gotas de SR de HCl 2N
(vase anexo) hasta que se disuelva completamente, llevar al aforo con agua destilada.
Utilizando una pipeta volumtrica, pipetear 1 mL de la solucin estndar de Diacepam y depositarlo
en un matraz volumetrico de 10 mL, llevar al aforo con agua destilada. Repite el mismo
procedimiento con la ltima solucin. La concentracin final es de 5 mcg/mL.
Plasma cargado
A un tubo de ensayo que contiene 5 mL de plasma, adicionar 1 mL de solucin estndar de
Diacepam y agitar en vortex durante 1 min.
Pruebas de identificacin
Mtodo 1 Reaccin colorimtrica
Coloque una cantidad de sustancia a identificar en un tubo de ensayo, adicione dos gotas de reactivo
de Marquis (Ver Anexo 2) al tubo de ensayo con la con la muestra biolgica a identificar, agite el
tubo. Observe la coloracin de la muestra, si esta es violeta la prueba es positiva a Diacepam.
Mtodo 2 Cromatografa en capa fra


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Preparar las cromatoplacas introduciendo un portaobjetoslimpio en una suspensin de gel de slice
en acetato de etilo al 35%, dejar secar al aire y activarlas en una placa de calentamiento por 1
minuto aproximadamente.
Preparar la cmara de elusin, en la que en la fase mvil ser acetato de etilo. Disolver una cantidad
pequea del residuo solido obtenido en unas gotas de acetato de etilo, aplicar en la cromatoplaca
activada con ayuda de un tubo capilar de vidrio.
Repetir el mismo procedimiento con el estndar, colocndolo en la misma cromatoplaca a una
distancia de aproximadamente 1 cm de la muestra.
Introducir a la cmara de elusin y retirar hasta que la elusin sea partes de la cromatoplaca.
Retirar la cromatoplaca y visualizarla con la lmpara UV. Medir las distancias de elusin. Determinar
Rf.
El Rf del Diacepam en acetato de etilo es de 0.22.
Curva estndar
# de tubo mL de solucin estndar. mL de solucin de HCl 2N. Concentracin final
mcg/mL.
1 0.0 1.0 0
2 0.2 0.8 1
3 0.4 0.6 2
4 0.6 0.4 3
5 0.8 0.2 4
6 1.0 0.0 5

Procedimiento de cuantificacin
Precipitacin de protenas



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Adicionar 3 mL de cido tricloroacetico (TCA) al 50%, 3 mL de solucin saturada de NaCl, 1
mL de HCl y 5 mL de ter etlico.
Colocar en el vortex y agitar durante 5 min y centrifugar a 2000 rpm por 5 minutos.
Extraer la fase etrea con una pipeta Pasteur y evaporar a sequedad a 37C.
Reconstituir el residuo anterior con 5 mL de solucin de HCl 2N y leer en el espectrofotometro a una
longitud de onda de 242 nm (Ver PNO ).
Identificacin de protenas mediante la reaccin de Biuret.
Tomar y rotular un tubo de ensayo. Aadir 2 mL del residuo previamente reconstituido de la muestra y
depositarlo en un tubo de ensayo. Adicionar 2 mL del reactivo de Biuret (preparacin Ver Anexo 2).

Anexos
Anexo 1
Reactivo de Marquis
Preparacin: se colocan 9 gotas de formaldehido y 1 gota de H
2
SO
4
en un tubo de ensayo y agitar.
Anexo 2
Reaccin de Biuret
Interpretacin: coloracin violeta en la solucin y azul cielo en el fondo indica presencia de
protenas.
Coloracin amarilla no hay presencia de protenas.

Preparacin del Reactivo de Biuret
Disolver aproximadamente 0.87 g de sulfato cprico en 2.5 mL de agua caliente en un vaso de
precipitados de 50 mL y dejar enfriar (Solucin 1). Disolver aproximadamente 8.65 g de citrato de
sodio dihidrato y 5 g de carbonato de sodio en 20 mL de agua caliente y dejar enfriar (Solucin 2).
Mezclar la Solucin 1 y la Solucin 2 y diluir con agua a 50 mL. Este Reactivo de Biuret es estable a


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temperatura ambiente durante 6 meses. No usar el reactivo si aparece turbidez o contiene algn
precipitado.