Antibiograma - estudio de la sensibilidad del microorganismo patolgico a los antimicrobianos; se debe
hacer antes de establecer el tto de una infeccin microbiana; diferentes metodos de
antibiograma => (1) por difusin que darn resultados cualitativos de resistencia, sensibilidad o intermedios a los diferentes ATB (2) por dilucin nos dar resultados cuantitativos en base a 2 conceptos (CMI/ Concentracin Mnima Inhibitoria y CMB/ CM Bactericida) (3) por deteccin enzimtica, consiste en detectar la enzima del germen que confiere resistencia a los ATB p.ej. deteccin de betalactamasa, adenilasa, acetilasa, etc.
Clasificacin de las sustancias anti-microbianas: (a) un microorganismo es sensible => cuando ATB alcanza niveles plasmticos => a CMI en el lugar de la infeccin; CMI => la mnima cantidad de ATB capaz de inhibir el crecimiento de un germen; CMB => la mnima cantidad de ATB que matara al germen; normalmente CMI es suficiente para combatir una infeccin y los mecanismos inmunitarios se encargan de eliminar el microorganismo, siendo por tanto la CMI es el termino mas utilizado.
(b) un microorganismo es resistente => cuando la concentracin mxima de ATB que se puede localizar en el lugar de la infeccin no es suficiente para eliminar el germen, es decir, la concentracin de ATB necesario para destruir el germen no se puede elevar mas por efectos txicos secundarios.
(c) microorganismo de sensibilidad intermedia => no esta afectado por dosis normales de ATB dadas a intervalos normales, pero con una dosis alta en el lugar de la infeccin sin llegar a dosis que produzcan efectos txicos, puede eliminar el germen.
Casos clnicos => Pseudomonas que da problemas respiratoria/ urinaria y es resistente a casi todos los ATB, se dar una dosis toxico o una combinacin de ATB por va endovenosa.
Normas bsicas => no efectuar un antibiograma directamente del producto patolgico, ni tampoco utilizar mezclas de grmenes (se debe realizar un aislamiento por agotamiento en placa), excepto para muestras de orina ambulatoria (normalmente es una infeccin mono-microbiana); para elegir un ATB se deber ensayar aquellos que son tiles clnicamente y se encuentran disponibles en el mercado farmacutico.
Factores a tener en cuenta => (1) caractersticas tintoriales del germen (Gram+o-) (2)lugar de la infeccin (especialmente las vas urinarias y meningitis); es importante porque es necesario que la CMI sea alcanzable en los lquidos corporales para que sea efectivo (3)bacteria investigada.
La seleccin de ATB representativo de cada grupo para realizar las pruebas de sensibilidad Normalmente se selecciona un ATB representativo de cada grupo para realizar las pruebas de sensibilidad; habitualmente se acepta que no es necesario hacer pruebas de sensibilidad para un ATB cuando no se han descrito resistencias en esas especies, p.ej. Streptococcus pyogenes.
1. Betalactmicos => todo el grupo tiene en comn que presenta un anilla betalactmico y el mecanismo de accin consiste en inhibir la formacin de peptidoglicano de la pared celular; son bactericidas. a. Penicilinas - tiene espectro desigual => aveces es mas efectivo a uno pero no a otro. * Penicilina G sodica - la forma oral es P V * Amoxicilina - infeccin del tracto respiratorio inferior: bronquitis aguda y crnica, neumonas bacterianas y bronconeumona, producidas por estreptococo, estafilococo sensible,neumococo y H.influenzae. Gastrointestinal: fiebre tifoidea o paratifoidea. Genitourinaria: cistitis, uretritis, pielonefritis, bacteriuria, gonorrea, aborto sptico, sepsis puerperal. De piel y tejido blando (incluida infeccin de herida quirrgica), por estreptococo, estafilococo sensible y E. coli. * Amoxicilina +acido clavulanico (es un inhibidor de las betalactmasas producida por algunas bacterias)
b. Cefalosporinas - actualmente se ha desarrollado la 4 generacin (semi- sintticos; bacteriostticas frente a cocos Gram+y bacilos Gram-) * Cefotaxima (indicado para gonorrea; profilaxis quirrgica; epiglotitis y meningitis porHaemophilus) * Cefuroxima (efectividad contra Neisseria gonorrheae y otras bacterias productoras de penicilinasa; es activa contra Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y estreptococo beta-hemoltico; son susceptibles Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis)
2. Derivados de betalactmicos: * Aztreonam - se utiliza comnmente frente a las infecciones causadas por Pseudomonas aeruginosa, pero su espectro abarca a las enterobacterias (incluida Escherichia coli), como p.ej. Klebsiella, Haemophilus, Citrobacter y Proteus.
3. Aminoglicosidos => en general su mecanismo de accin es la inhibicin de la sntesis de protena en diferentes fases segn el ATB; en general derivan de los hongos y son potentesbactericidas; son de amplio espectro y provocan toxicidad renal y audio vestbular en alta dosis o a las personas susceptible. * Estreptomicina (tratamiento de infecciones causadas por grmenes sensibles, como:Mycobacterium tuberculosis, Salmonellas, enterococos, estreptococos, neumococos y algunos Gram- como Haemophilus influenzae; es eficaz en infecciones del tracto respiratorio) * Gentamicina (Acta sobre bacterias Gram- aerobias, incluyendo enterobactericeas,Pseudomonas y Haemophilus. Acta tambin sobre estafilococos (S.aureus y S.epidermidis) * Tobramicina (Infecciones del tracto respiratorio inferior como neumona, bronconeumona y bronquitis aguda causadas por P.aeruginosa, Klebsiella sp., Enterobacter sp., Serratia sp., E.coli y S.aureus) * Neomicina (es activo in vitro contra Escherichia coli, Klebsiella y contra flora anaerbica intestinal)
4. Lincosamidas => inhibe la sntesis proteica * Clindamicina (es un buen ATB frente anaerobios) - Su actividad antibacteriana es similar a la de eritromicina (macrolidos) en contra de estafilococos y estreptococos; adems es efectiva en contra de anaerobios, en especial Bacteroides fragilis.
5. ATB polipeptdicos y glucopeptdicos => su mecanismo de accin es inhibir la formacin de peptido glicano de la pared celular (bactericidas) a. Activos frente a Gram+ * Bacitracina - es utilizado para la identificacin del estreptococo del grupo A a cual es sensible; es bactericida; se utiliza tpicamente para infecciones cutneas (por su efecto de nefrotoxicidad) acta sobre cocos y bacilos Gram+ (Neisseria y Treponema pallidum) * Vancomicina - por su alta toxicidad renal y ptica, se reservan para infecciones de Gram+ resistentes; es bactericida; tiene accin ante cocos Gram+ y bacilos Gram+ b. Activos frente a Gram- => ambas (polimixinas) se usan tpicamente sobre Gram-, tambin se usa como ATB de identificacin; tienen accin ante entero-bacterias (exceptoProteus, Providencia y Serratia), Pseudomonas aeruginosa, Vibrio, Pasteurella, Haemophillus y Bordetella; son ATB de segunda eleccin (para bacilos Gram- resistentes a otros ATB) * Polimixina B * Polimixina E (Colistina) c. Activos frente a Mycobacterium tuberculosis
6. Otros * Fosfomicina - es un ATB de origen espaol de un amplio espectro que acta sobre la pared celular (se usa en infeccin urinaria) * Acido fucsidico - acta sobre la sntesis proteica y destaca su accin sobre Staphylococcus aureus.
7. Tetraciclinas - son bacteriostticas y su mecanismo de accin es inhibir la sntesis de las protenas; no se deben administrar a menores de 8 aos por tener efecto secundarios sobre la denticin y los huesos; tambin pueden producir toxicidad sobre el tracto gastrointestinal y el higado; son de amplio espectro; origen biolgico o semi-sinttico; activas frente a cocos y bacilos Gram+y Gram- aerobios; son frmacos de eleccin en brucelosis, clera, granuloma inguinal (ETS). * Tetraciclina * Doxiciclina - es el tratamiento de fiebre tifus, fiebre Q, erupciones pustulosas por Ricketsiasy fiebre de las montaas rocosas por Ricketsias, infecciones del tracto respiratorio causadas por Mycoplasma pneumoniae; el tratamiento de infecciones causadas por Gram-: chancroidecausado por Haemophilus ducreyi, plaga debida a Yersinia pestis (anteriormente Pasteurella pestis), tularemia debida a Francisella tularensis (anteriormente Pasteurella tularensis), clera causada por Vibrio cholerae (anteriormente Vibrio comma), infecciones por Campylobacter en fetos causadas por Campylobacter fetus (anteriormente Vibrio fetus), brucelosis causada por especies de Brucella (junto con estreptomicina), bartonelosiscausada por Bartonella bacilliformis, granuloma inguinal causado por Calymmatobacterium granulomatis.
8. Cloranfenicol - es de amplio espectro; inhibe la sntesis proteica y es toxica a nivel medular; es de origen sinttico, bacteriosttico, acta frente a Gram+ y - (especialmenteHaemophilus influenzae y Salmonella)
9. Macrolidos y similares - inhiben la sntesis proteica; amplio espectro; se dan cuando es alrgica a penicilina; son bacteriostticos y bactericidas en alta dosis. a. Eritromicina (un buen ATB frente neumnia atpica, legionelosis, difteria, tos ferina) b. Azitromicina - para tratar ciertas infecciones causadas por las bacterias, como la bronquitis; neumona; enfermedades de transmisin sexual (ETS); y las infecciones en los odos, pulmones, piel y garganta; no tienen ningn efecto sobre los resfriados, la gripe y otras infecciones virales. c. Claritomicina - interfiere la sntesis de protenas en las bacterias sensibles; faringitis, amigdalitis, sinusitis, bronquitis aguda, reagudizacin de bronquitis crnica, neumona bacteriana (adquirida en la comunidad), infeccin de piel y tejidos blandos leve-moderada, foliculitis, celulitis, erisipela, infeccin localizada o diseminada por Mycobacterium avium oM.intracellulare, infeccin localizada por M.chelonae, M. fortuitum y M.kansaii. Prevencin de infeccin diseminada por M.avium complex en pacientes con VIH de alto riesgo
10. Quimioterpicos de sntesis a. Sulfamidas (es bacteriosttico, de origen sintetico; inhibe la sntesis de acido flico; activo frente Gram+ y -, Clamidias, Nocardia) b. Trimetropin+sulfametoxazol (cotrimoxazol) - inhibe la sntesis de acido flico; elimina las bacterias que provocan infecciones, incluyendo las infecciones que afectan las vas urinarias, los pulmones (neumona), odos e intestinos c. Quinolonas (6) - inhiben la replicacion del ADN bacteriano son buenos ATB de amplio espectro, pero se ha abusado mucho. d. Norfloxacina - infecciones de las vas urinarias y la prstata; inhibe la replicacin del ADN bacteriano. La norfloxacina pertenece a una clase de antibiticos llamados fluoroquinolonas; tomar norfloxacina aumenta el riesgo de que desarrolle tendinitis. e. Ciprofloxacina - inhibe la replicacin del ADN bacteriano; para tratar o prevenir determinadas infecciones bacterianas, tambin se usa para tratar o prevenir el ntrax (una infeccin grave que se puede propagar en forma intencional como parte de un ataque bioterrorista) en quienes han estado expuestos a los grmenes del ntrax suspendidos en el aire; tomar ciprofloxacina aumenta el riesgo de que desarrolle tendinitis.
11. Quimioterapia antituberculosa - actualmente se emplea: * Rifampicina - ATB sistmico, antituberculoso, bactericida. Inhibe la sntesis de ARN bacteriano. Tuberculosis en todas sus formas (asociado a otros tuberculostticos). Brucelosis.Erradicacin de meningococos en portadores asintomticos, no enfermos. Alrgicos o con contraindicaciones a otros antibiticos o quimioterpicos. Infecciones causadas porestafilococos (S.aureus, S.epidermidis, cepas polirresistentes) y por enterococos (S.faecalis, S.faecium). * Isoniacida - para tratar la tuberculosis, y para prevenirla en personas que han tenido contacto con las bacterias de la tuberculosis. Elimina slo las bacterias activas (en crecimiento). Debido a que las bacterias pueden estar en un perodo de incubacin (sin crecimiento) durante largos perodos, la terapia con isoniazida (y otros medicamentos para evitar la tuberculosis) debe hacerse durante mucho tiempo (por lo general entre 6 y 12 meses). * Etambutol - el tratamiento de tuberculosis pulmonar; debe ser usado en conjuncin con otros frmacos antituberculosos.
13. Quimioterapia anti-viral * Aciclovir - antiviral activo frente al virus herpes humano, inhibe la replicacin de ADN viral, interfiriendo con el ADN polimerasa viral. * Ribavirina - La ribavirina se utiliza con un medicamento interfern, para tratar la hepatitis C en personas que no han sido tratadas con interfern antes. La ribavirina pertenece a una clase de medicamentos antivirales llamados anlogos de nuclesidos. Esta acta impidiendo que el virus que provoca la hepatitis C se propague dentro del cuerpo.
Pruebas de sensibilidad anti-microbiana - tcnicas que investigan la actividad anti-microbiana de distintos quimioterpicos frente al microorganismo estudiado; sus principales aplicaciones: - contribuir a la identificacin de los microorganismos (p.ej. sensibilidad del neumococo/S.pneumonia a la optiquina; del S.pyogenes a la Bacitracina) - constituye una base fundamental para la instauracin de una terapia adecuada. Son tcnicas estandarizadas y se ha demostrado que existe un paralelismo entre los resultados de sensibilidad obtenidos in vitro con los efectos teraputicos in vivo; la prueba mas utilizada es la difusin en medio solido a excepcin de los grandes laboratorios que utilizan sistemas multiprueba o mtodos automatizados (Vitec, Pasco...)
Antibiticos - un grupo de compuestos qumicos teraputicamente muy tiles y que antaose caracterizaban por ser subproductos metablicos de un microorganismo siendo casi siempre letal para otros grmenes (p.ej. a los hongos); actualmente la mayora son sintetizados en el laboratorio; uno de los primeros es descubierto en 1927, cuando Alexander Flemming descubri la penicilina extrayendo-lo de un hongo (Penicillium notatum) siendo en 1929 cuando efectu los primero ensayos de sensibilidad anti- microbiana (se contaminaron las placas sin querer por un hongo); en 1939 Rose y Miller intentaron estandarizar las mltiples variantes de los anlisis de sensibilidad microbiana por difusin en placa y posteriormente en los aos 50, Kirby-Bauer y Anderson estandarizaron la tcnica que se utiliza actualmente por difusin en medio solido o en placa.
Los principales pruebas para hacer un antibiograma: a. Manuales 1. Prueba de dilucin en medio solido y liquido 2. Prueba de elucin en disco 3. Prueba de deteccin enzimtica 4. Prueba de difusin en medio solido (de Kirby-Bauer) b. Automatizadas
Trminos utilizados en las pruebas anti-microbianas: - Microorganismo sensible o sensibilidad => es inhibido por un ATB a dosis habituales - Microorganismo de sensibilidad intermedia => el germen "in vitro" no es claramente sensible al ATB, pero si lo seria "in vivo" incrementando la dosis habitual sin llegar a dosis toxicas - Microorganismo resistente o resistencia => no es sensible al ATB a dosis habituales y es necesario administrar dosis toxicas - CMI (cantidad mnima inhibitoria) => es la menor concentracin de un ATB capaz de inhibir el crecimiento bacteriano de una cepa dada - CMB (cantidad mnima bactericida) => es la menor concentracin de un ATB con la que no quedan bacterias vivas de una cepa dada
Tcnicas manuales de realizacin de las pruebas de sensibilidad anti-microbiana a. Pruebas de dilucin (es una tcnica de centros de investigacin /lenta /engorrosas) => se basan en el estudio al unisono de diferentes concentraciones de ATB, lo que les da un carcter cuantitativo en base a los conceptos CMB y CMI; 2 tipos => en medio liquido y solido; se utilizan 10 tubos con grmenes en caldo nutritivo o agar y a cada tubo se le aade una cantidad prefijada de ATB diluido seriadamente, excepto en el tubo de control; se incuban 18-24 horas a 37C y se examina la turbidez que indica crecimiento de grmenes; en el tubodonde no hay turbidez se ha inhibido el crecimiento de los grmenes; con estos datos estudiamos la CMI y la CMB de los antibiticos.
b. Pruebas de elucin en disco (disolver) => se realiza introduciendo discos de un ATB en tubos con caldo nutritivo; el ATB se disuelve en el caldo alcanzando una concentracin final conocida, posteriormente se inocula un volumen de una suspensin microbiana y se sigue la misma metodologa descrita antes obtenindose resultados cuantitativos o cualitativos en base a sensibilidad, sensibilidad intermedia o resistencia (no se utilizan habitualmente).
c. Pruebas enzimticas de deteccin => fundamentalmente se detectan las beta-lactamasas; un reducido numero de bacterias son resistentes a las penicilinas y cefalosporinas(ATB B-lactmicos) debido a que producen un enzima (b-lactamasa) capaz de inactivar estos ATB, p.ej. los gonococos, pneumococo y algunos estreptococos; consiste en observar el crecimiento de los grmenes en presencia de dichos ATB; se toma la colonia sospechosa y mezclar-la con un sustrato que si cambia de color nos indica que la colonia es B-lactamasa (+), por lo tanto es resistente a los ATB B-lactamico; se denomina Prueba de NITROCEFIN.
d. Prueba de difusin en medio solido (antibiograma clsico) => estandarizadodesde los aos 50 (se hace igual en todo el mundo) por Kirby-Bauer y Anderson en todos sus pasos y es mas utilizado actualmente en forma manual; fundamento => depositar discos impregnados de ATB sobre cultivos de microorganismos en placa; la difusin del ATB a traves del medio produce un halo de inhibicin del crecimiento cuyo dimetro sera proporcional a la potencia del ATB dando resultados cualitativos de resistencia, sensibilidad o sensibilidad intermedia a los ATB; material => placas de Petri (9cm), pinzas metlicas estriles o dispensador automtico, pie de rey o regla milimetrada, medio Mueller-Hinton, discos de ATB, suspensin microbiana al 0,5 escala Mc Farland (10 elevado 8 u.f.c./ml; escala Mc Farland => el 0,5 se prepara aadiendo 0,5 ml de Cl2Ba 0,04 M a 99,5 ml de acido sulfrico 0,36M); una placa llena => mas de 10 elevado 6.
Tcnica => el medio Mueller-Hinton se vierte en placas con un espesor de 4 mm; la siembra utilizada preferentemente (a) la de Kirby-Bauer: se introduce un escobilln en el inoculo preparado al 0,5 Mc Farland (no tenemos) y se siembra en 3 direcciones y se deja aproximadamente 4 minutos la placa semi- abierta e invertida antes de colocar los discos; (b)la de Barry: se hace una inoculacin previa al vertido de las placas, se aaden 0,1 ml del inoculo a 25 ml del medio Mueller-Hinton fundido y se vierte en placa (no se usa mas).
Eleccin de ATB => se debe seleccionar un ATB representativo de cada grupo excepto en los casos donde existan diferencias significativas en los espectros de actividad o resistencia; los aspectos importantes que prevalecen a la hora de seleccionar un ATB => las caractersticas tintoriales del germen (Gram+o-), el lugar de la infeccin (orina, meningitis) y la bacteria investigada. Concentracin de los discos => tiene que estar perfectamente estandarizada sigundose las normas de la Federacin de Drogas y Alimentos/ FDA => la actividad del disco debe estar entre 65% y 150% y de la OMS => entre 75% y 135%; siempre se debe utilizar un control para controlar la actividad de los discos; en general, se escogen discos con una concentracin que producen un halo de inhibicin entre 20 y 30 mm para organismos tipificados como sensibles y de menos de 10 mm para los resistentes. Implantacin de los discos (papel de filtro grueso de un dimetro 6mm que van impregnados con una concentracin determinada de ATB); Manual => se saca el disco de ATB con unas pinzas estriles y se deposita en la placa, la distancia mnima entre los discos es de 24 mm para evitar la superposicin de los halos, deben estar situados a 15 mm del borde como mnimo (se colocan 8 discos) una vez depositado el disco se presiona ligeramente con la punta de pinzas; Automtica => se utilizan dispensadores automticos que son unos dispositivos de plstico del tamao de una placa de Petri con unos orificios gua que permiten la colocacin simultanea de todos los discos en el lugar adecuado, y con una pinza se presionan ligeramente los discos para que al girar o invertir la placa no se caigan los discos. Incubacin => 18-24 horas a 35-37C (mximo 48 horas)
Lectura e interpretacin del antibiograma => los resultados se expresan segn el halo de inhibicin que aparece alrededor de cada disco; el halo se mide con una regla calibrada o pie de rey midiendo los dimetros, y segn cual sea clasificaremos al germen como sensible (la dosis habituales es eficaz), intermedio (se deben incrementar las dosis habituales sin llegar a dosis toxicas) o resistente (ATB es totalmente ineficaz); Observacin al mtodo: 1. preservar la estandarizacin en todos sus pasos 2. puesto que la difusin del ATB es casi instantnea no debe moverse ningn disco una vez que se ha puesto en contacto con la superficie del agar 3. los discos se tienen que conservar en la nevera 4. procurar que la lectura se haga a las 18-24 horas, evitndose el exceso de incubacin 5. Aunque el medio elegido es el Mueller-Hinton, se pueden emplear medios enriquecidos como AS (estreptococo), agar chocolate (Haemophylus) para grmenes exigentes 6. de vez en cuando hay que colocar controles de calidad 7. cuando el germen sea anaerobio el mtodo es diferente
Mtodo automatizados de identificacin y susceptibilidad - actualmente existen diferentes metodos automatizados para realizar el antibiograma; los mas utilizados se basan fundamentalmente en la medida bien fotomtrica o bien turbidimtrica del efecto de un ATB sobre el crecimiento de una bacteria en medio liquido comparndolo con el de la misma bacteria en un medio sin ATB; otros metodos se basan en tcnicas de impedancia elctrica microcalorimetra bioluminiscencia, radiometra ...
Los metodos fotomtrico y turbidimtrico p.ej. sistema Vitec, se resume: - se utilizan unas tarjetas desechables del tamao de un naipe donde se inyecta la muestra ya diluida mediante un modulo inyector; la tarjeta presenta unas perforaciones donde lleva incorporadas diferentes medios selectivos liofilizados; - la tarjeta se sella y se coloca en un modulo incubador y de lectura, leyndose de manera automtica los resultados cada hora; los datos los almacena un ordenador que los compara con valores umbrales ya almacenados; el ordenador puede dar resultados a las 4 horas (lo normal entre 4 -13 horas)
El sistema Microscan utiliza un sistema semejante al de dilucin en caldo pero en miniatura utilizando paneles con caldo de Mueller-Hinton deshidratado (como API); tras la inoculacin y re-hidratacin con una suspensin estandarizada del microorganismo y suincubacin a 35C por un mnimo de 16 horas, la CIM o una sensibilidad cualitativa (sensible, intermedio o resistente) para el organismo en prueba se determina observando la menor concentracin ATB, que muestre inhibicin de crecimiento; esta deteccin puede hacerse manualmente mediante un visualizador de micro-dilucin o mediante un lector conectado a un ordenador; viene en tripletes de un ATB con diferentes concentraciones.
Agentes antimicrobianos (ATB) activos frente a Gram- => Cefuroxima, Cefotaxima, Colistina, Tobramicina, ; frente a Gram+=> Eritromicina, Tetraciclina, Vancomicina, Meticilina, Clindamicina, Doxicilina; frente a ambos Gram+y - => Ampicilina, Cefalotina, Gentamicina, Cotrimoxazol, Cloranfenicol, Imipenem, Amoxicilina+acido clavulonico.
Clasificacin de los antibiticos segn su efecto bacteriano Bactericidas => Penicilinas, Cefalosporinas, Aminoglucsidos, Rifampicina, Quinolonas, Monobactmico s, Polimixinas. Bacteriostticos => Tetraciclinas, Eritromicina, Sulfonamida, Novobiocina, Cloranfenicol
Clasificacin de los antibiticos segn su mecanismo de accin sobre la estructura bacteriana I. Inhibicin de la sntesis de la pared celular Penicilinas Cefalosporinas Vancomicina Fosfomicina Tercoplanina Bacitracina II. Lesin en la permeabilidad de la membrana celular Poliomixinas Colistinas Nistatina Anfotericn B
III. Inhibicin de la sntesis proteica Cloranfenicol Tetraciclina Aminoglucsidos Lincomicinas Eritromicina IV. Inhibicin de la sntesis de cidos nucleicos Quinolonas Sulfonamidas Rifampicina Trimetropn