Anlisis de Protenas

Electroforesis, Transferencia e Inmunodeteccin

advansta
Western Blot es una tcnica analtica, ampliamente utilizada, para el estudio de protenas.
Este mtodo, descrito por primera vez por Towbin, et. al
1
, permite la deteccin de una sola
protena dentro de una muestra biolgica. La especificidad de Western Blot se logra me-
diante la utilizacin de un anticuerpo que reconoce y se une a un eptopo nico de la pro-
tena de inters.
Con la tcnica de Western Blot se puede estimar el tamao de una protena, confirmar la
presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilacin,
y ser utilizado para comparar cuantitativamente los niveles
de protena entre muestras.
Esta gua de laboratorio describe los pasos
involucrados en la realizacin de un Western
blot, incluyendo la preparacin de muestras,
la separacin de protenas, la transferencia y
la deteccin.
Anlisis de Protenas
Anlisis de Protenas:
Electroforesis, Transferencia e Inmunoprecipitacin.
Pgina 1
Un manual de laboratorio de la empresa Advansta
1. Towbin, H. et. al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some appli-
cations. Proc Natl Acad Sci U S A. 76(9):4350-4.
ndice de Contenidos
Pgina
1. Western Blot: Visin General 2
2. Preparacin de las muestras 4
3. Electroforesis en gel de Poliacrilamida 5
4. Transferencia Electrofortica 11
5. Hibridacin Anticuerpos 13
6. Deteccin 15
7. Solucin de Problemas 17
8. Herramientas y Referencias Tcnicas 21
Consulte los captulos siguientes para obtener ms detalles acerca de cada paso.
1. Western Blot: Visin General
Pgina 2
Western Blot:
Visin General
a. Preparacin de la muestra
Extraccin de las protenas de
las muestras biolgicas me-
diante disrupcin mecnica o
qumica.
Los materiales de partida incluyen
planta, tejidos animales, clulas
cultivadas, levadura, o bacterias.
La disrupcin mecnica
con un homogenizador
disgrega los tejidos.
Procesos adicionales
logran el fraccionamien-
to subcelular
Se usan tampones con-
teniendo detergentes
para la lisis celular
Figura 1. Preparacin de muestras
b. Electroforesis en gel de
Acrilamida
Las protenas en el extracto se
separan de acuerdo a su ta-
mao mediante electroforesis.
Se prepara un gel de acrilami-
da, bisacrilamida.
El dodecilsulfato de sodio
(SDS) aadido al gel se une a
las protenas y confiere, de
forma proporcional a la masa
de cada protena, una carga
negativa a cada una de ellas.
Figura 2. Electroforesis en Acrilamida
Se aade un coloran-
te de carga. As, la
migracin de la mues-
tra se puede monitori-
zar.
Se utiliza una pipeta para
cargar las muestras en los
pocillos del gel
Una fuente de ali-
mentacin propor-
ciona el voltaje
El gel se coloca dentro de un tanque
de electroforesis lleno de tampn,
que conducir la corriente. La prote-
nas con carga negativa migran des-
de el nodo.
c. Transferencia electroforti-
ca a una membrana
Las protenas son transferidas
electroforticamente a un
soporte rgido o membrana,
dnde quedan inmovilizadas.
El gel y la membrana se coloca
entre papel de filtro y almohadillas
de esponja..
Se aplica voltaje en el
tanque de transferencia y
las protenas migran desde
el gel a la membrana.
Figura 3. Transferencia de Protenas a la Membrana
Un cartucho aplica presin y
mantiene un estrecho contacto
entre el gel y la membrana.
a. Hibridacin del Anticuerpo
La membrana con las prote-
nas inmovilizadas debe tratar-
se para bloquear las zonas
con ausencia de protenas y
as evitar la unin no especfi-
ca de los anticuerpos.
A continuacin se incuba con
un anticuerpo primario dirigi-
do contra el eptopo especfi-
co de la protena diana.
Tras varios lavados de la mem-
brana, se adiciona un anti-
cuerpo secundario marcado
que se unir de forma espec-
fica al anticuerpo primario,
proporcionando una forma
de deteccin.
Figura 4. Hibridacin de Anticuerpo
e. Deteccin de las Bandas
Despus de un lavado de la
membrana para eliminar el
anticuerpo no unido, se pro-
cede a detectar la localiza-
cin de la banda en la mem-
brana. Para la deteccin de
quimioluminiscencia, se utiliza
un anticuerpo secundario
conjugado con el enzima pe-
roxidasa (HRP); la adicin de
un sustrato de HRP provoca
una reaccin enzimtica que
da como resultado final la
emisin de luz. Dicha luz pue-
de ser detectada en una pel-
cula de rayos X, o de forma
digital, mediante un sistema
de captacin de imgenes.
La deteccin de fluorescen-
cia se basa en la captacin
de luz emitid por sustancias
fluorforas conjugadas con el
anticuerpo secundario.
Anlisis de Protenas
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Figura 5. Deteccin quimioluminiscente de las bandas de protenas
Los materiales de partida incluyen
tejidos vegetales, tejidos animales,
clulas en cultivo, levadura, o bac-
terias.
Una adecuada preparacin de la muestra es
esencial para tener xito en un ensayo de Wes-
tern Blot. En la mayora de ensayos, las protenas
se extraen mediante procesos qumicos y/o
mecnicos. El mtodo elegido depender del
tipo de muestra de partida, de la localizacin
subcelular de la protena y de las condiciones
ptimas que requiera el anticuerpo para recono-
cer el eptopo proteico. En la tabla 1 se resumen
los mtodos mecnicos que habitualmente se
utilizan en la extraccin de protenas para inmu-
notransferencia.
A menudo, en muestras tisulares de plantas y ani-
males, se requiere el uso de un proceso mecni-
co para la disrupcin de la compleja matriz celu-
lar. Disrupcin mecnica que suele preceder a un
proceso qumico de lisis celular, mediante el uso
de solucin tampn que contiene detergentes,
que va dirigida a enriquecer la protena de inters
dentro del extracto final. Las clulas en cultivo,
frecuentemente, se suelen lisar utilizando una so-
lucin tampn con detergente y sin la aplicacin
de mtodos mecnicos.
La estructura qumica de los detergentes permite
romper las membranas celulares y solubilizar las
protenas. Estas substancias tienen una parte po-
lar y otra no polar y se pueden clasificar segn las
caractersticas del grupo polar: inicos si el grupo
polar tiene carga positiva o negativa, no inicos si
no poseen carga o zwiterinicos si poseen carga
negativa y positiva y la carga neta es 0.
La eleccin de la substancia detergente, depen-
de en parte de la localizacin, dentro de la clu-
la, de la protena de inters, citoplasmtica, uni-
da a la membrana, dentro de orgnulos celulares
como el ncleo y las mitocondrias, etc...Las pro-
tenas citoplasmticas se pueden unir a las prote-
nas del citoesqueleto, afectando as a los proce-
sos de fraccionamiento subcelular.
En la tabla 2 se clasifican las soluciones tampn y
detergentes, ms utilizados habitualmente, segn
el tipo de protena y localizacin subcelular.


2. Preparacin de la muestra
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Preparacin
de la muestra
Tabla 1. Mtodos fsicos para la dirupcin de muestras
Mtodo Descripcin Tipo de muestra
Licuadora La muestra se tritura
mediante cuchillas
rotatorias
Gran cantidad de
tejido
Homogenizador
Dounce
Tubo de vidrio con
pistn ajustado maja
las clulas por ac-
cin de corte.
Clulas tisulares; til
para protocolos de
enriquecimiento de
protenas mitocon-
driales o nucleares
Homogenizador de
ultrasonidos
Ondas de sonido
emitidas por una
sonda para romper
las membranas celu-
lares
Clulas, tejidos, bac-
terias.
Pulverizacin en
Nitrgeno lquido
La muestra se pulve-
riza utilizando un
mortero y una almi-
rez refrigerados
Tejido animal o o
vegetal
Perlas de vidrio La ruptura celular se
produce por agita-
cin de las perlas de
vidrio
Levaduras
Tipo/Localizacin
Protena de inters
Detergente o Solu-
cin Tampn
TComentarios
Nativa (no desnatu-
ralizada)
Detergente suave
no inico
Evitar detergentes
desnaturalizantes
(SDS, Deoxicolatos)
Citoplasmticos
(soluble)
Tris-HCl Puede combinarse
con mtodos mec-
nicos, tales como el
homogenizador
Dounce
Citoplasmtico
(unida a citoesque-
leto)
Tris-Triton Los detergentes
Triton son suaves y
no inicos
Membrana mitocon-
drial o nuclear
NP-40, RIPA
(multiples detergen-
tes), Triton X-100
Para antgenos con
niveles bajos de
expresin pueden
ser necesarios pro-
cesos de enriqueci-
miento
Lisado total de clu-
las
NP-40, RIPA,
Triton X-100

Tabla 2. Soluciones Tampn y detergentes, segn el tipo de pro-
tena de inters y la localizacin subcelular
Tabla 3. Inhibidores de fosfatasas y proteasas utilizans en la ex-
traccin de protenas.
Anlisis de Protenas
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Con la rotura celular, se liberan enzimas proteasas
que pueden degradar la protena de inters. Por
tanto, es importante evitar, durate la preparacin
de la muestra, cualquier actividad protesica.
La siguiente estrategia ayuda a evitar la degra-
dacin de protenas:
Evitar excesivos ciclos de congelacin/
descongelacin.
Trabajar rpido y mantener las muestras en
fro durante todo el proceso.
Aadir inhibidores de la proteasa en el
tampn de lisis.
Adems de inhibir la actividad de la proteasa,
puede ser interesante reducir la actividad de la
fosfatasa alcalina, en particular en estudios de
fosforilacin.
En la tabla 3 se muestran los inhibidores deprotea-
sa y fosfatasa de uso ms habitual.
3. Electroforesis en Acrilamida
Inhibidores Protea-
sas
Concentracin en
el Tampn de lisis
Enzimas diana
Aprotinina 1-2 g/ml Proteasas de Serina
EDTA 1-10 mM Mg
++
/Mn
++
Metalopro-
teasas
EGTA 1-10 mM Ca
++
Metaloproteasas
Leupeptin 1-2 g/ml Proteasas de Serinas,
Cisteinas
Pepstatina A 1g/ml Proteasas de Aspartico
PMSF (17-170 g/ml)
O,11 mM
Proteasas de Serina
Inhibidores
Fosfatasas
Concentracin en
el Tampn de lisis
Enzimas diana
- Glicerofosfato 1 mM Fosfatasas Serina/
Treonina
EDTA 1-10 mM Mg
++
/Mn
++
Metalopro-
teasas
EGTA 1-10 mM Ca
++
Metaloproteasas
Leupeptin 1-2 g/ml Proteasas de Serinas,
Cisteinas
Pepstatina A 1g/ml Proteasas de Asparti-
co
PMSF (17-170 g/ml)
O,11 mM
Proteasas de Serina
Las protenas del extracto se separan mediante
electroforesis en gel de poliacrilmaida (PAGE). En
primer lugar, las protenas, se revisten con carga
negativa, mediante la accin del detergente Do-
decilsulfato Sdico (SDS), as Las protenas, se
pueden separar en el gel segn su tamao (SDS-
PAGE).
Medicin de protena total
Previamente a la electroforesis, es importante de-
terminar la concentracin de protenas por las
siguientes razones:
1. Asegurar la carga de la cantidad correcta de
protenas en el gel.
La cantidad de protena ptima a cargar de-
pender de la prevalencia de la protena de
inters y de la sensibilidad del anticuerpo pri-
mario.
Cargar mucha cantidad puede dar lugar a un
mayor ruido de fondo y unin no especfica de
los anticuerpos. A menudo, para determinar la
carga de protena apropiada, se requiere
hacer experimentos preliminares con cantida-
des seriadas de protenas.
Nota: con el kit Afyon SDS-PAGE de preparacin de
muestra, se puede controlar la cantidad de carga de la pro-
tena mediante la cantidad de resina utilizada, evitando la
necesidad de determinar la concentracin de protena. Por
ejemplo, para 5 g de protena se utilizan 20 l de resina Af-
yon.

Informacin para pedidos

K-02101-025 Afyon SDS-PAGE ssmple preparation kit
2. Realizacin de Western Blots cuantitativos o
semi-cuantitativos.
Si la cantidad de protena cargada por carril
es la misma, se pueden comparar los niveles
relativos de la protena de inters. Un experi-
mento de Western Blot cuantitativo es til para
estudio de cambios de expresin de protenas
o de modificaciones proteicas como la fosfori-
lacin.
Descripcin del mtodo
Existen diversos mtodos para medir la protena
total de una muestra. Los ms habituales son los
mtodos Lowry, Bradford y cido Bincocinico
(BCA) (Tabla 4). Estos ensayos colorimtricos se
basan en las reacciones que se producen entre
las protenas de la muestra y los reactivos de de-
teccin.
Con el fin de determinar la concentracin de pro-
tenas totales en una muestra, se debe realizar
una curva estndar en cada ensayo. Esto se logra
con la realizacin de un ensayo de concentra-
cin crecientes, de protena pura. El estndar utili-
zado con mayor frecuencia es la albmina de
suero bovino (BSA), aunque se puede utilizar cual-
quier protena producida en el laboratorio o dis-
ponible comercialmente.
En la figura 6 se muestra un ejemplo de una curva
estndar. Los valores de absorvancia se trazan en
funcin del contenido conocido de la protena
estndar utilizada. El contenido de la protena de
inters en la muestra (lnea verde) se puede de-
terminar mediante la extrapolacin de la absor-
vancia obtenida a la cantidad o concentracin
de protena correspondiente.
Eleccin de un ensayo de protenas
Hay muchos kits de determinacin de protenas
disponibles comercialmente. La eleccin depen-
de de muchos factores:
El equipo de lectura disponible en el labora-
torio (espectrofotmetro, lector de placas,
etc).
Los reactivos del tampn de lisis - revisar el
protocolo del fabricante para identificar
sustancias interferentes.
La cantidad de muestra disponible.
La facilidad/rapidez del ensayo.
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Tabla 4. Mtodos fsicos para la dirupcin de muestras
Ensayo Descripcin Ventajas Inconvenientes
Bradford El colorante
azul de Coo-
masie se une a
las protenas y
sufre un cam-
bio de absor-
vancia
La realizacin
de los ensayos
son general-
mente rpidos
y sencillos
Interferencia
de SDS o de
otros deter-
gentes a
altas con-
centraciones
.
Rango lineal
pequeo.
BCA Reduccin de
iones de Cu
2+

mediante inter-
acin con las
protenas, el
BCA se une a
los iones de
Cu
1+
y forman
un producto
coloreado que
se puede me-
dir espectrofo-
metricamente
(reaccin de
Biuret)
Compatible
con la mayo
-
ra de deter-
gentes
Comercial-
mente dispo-
nible en for-
mato com-
patible con
agentes
reductores.
Menos varia-
cin prote-
na-protena
que en el
mtodo
Bradford.
Interferencia
con agentes
quelantes o
reductores del
Cobre
Lowry Similar al BCA
(reaccin de
Biuret)
Muy bien cita-
da en literatura
El tiempo de
ensayo pue-
de ser mayor
que en otros
mtodos
No es prcti-
co para
grupos gran-
des de
muestras
Se pueden
formar preci-
pitados
Figura 6. Ejemplo de la curva estndar de un ensayo de pro-
tenas. Se representa la absorvancia de las soluciones estndar
que contienen la protena conocida (lnea roja). La concentra-
cin de la protena de inters se puede determinar extrapolan-
do la absorvancia obtenida en la curva patrn o estndar
(lnea verde de puntos).
Protena (mg)
A
b
s
o
r
v
a
n
c
i
a

Electroforesis
en Acrilamida
Figura 7. Mecanismo de desnaturalizacin por SDS de las prote-
nas.
Anlisis de Protenas
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Reactivo Propsito
Glicero. Aportan Viscosidad/densidad para arrastrar
la muestra la fondo del pocillo y evitar que se
extienda a los pocillos adyacentes.
Azul de Bromofe-
nol
Molcula colorante pequea:
Da color a la muestra para ayudar a
la carga.
Migra por delante de las protenas, de
modo que se puede hacer el segui-
miento del movimiento de las muestras
en el gel.
SDS Detergente desnaturalizante
Cola hidrofbica que rodea la esque-
leto peptdico.
Unin a la protena de forma regular,
aportando carga negativa de forma
proporcional al tamao de la prote-
na.
Evita las interacciones hidrofbicas y
rompe los enlaces de hidrgeno.
Destruye la estructura secundaria/
terciaria y lineariza la protena.
Beta Mercaptoe-
tanol o DTT
Agentes reductores
Evita la oxidacin de cistenas.
Completan la linearizacin de la pro-
tena al romper los puentes disulfuro.
Tampn Tris Peps-
tatina A
Mantiene el pH adecuado
Tampn de carga de muestras
Una vez se tienen las muestras de protena, se
pueden conservar congeladas, teniendo cuida-
do en evitar ciclos repetitivos de congelacin/
descongelacin. Alternativamente, se pueden
utilizar inmediatamente, combinndolas con un
tampn de carga y cargar la muestra en un gel
de electroforesis. Los componentes del tampn
de carga varan, dependiendo de las condicio-
nes deseadas. Los ingredientes tpicos de un
tampn de carga para detectar protenas bajo
condiciones desnaturalizantes/reductoras se des-
criben en la Tabla 5. No se utilizarn ni SDS, beta
mercaptoetanol o ditiotreitol, si se necesitan con-
diciones no desnaturalizantes /no reductoras.
Previamente a la carga del gel, las muestras se
someten a una incubacin a 95C durante 5-10
minutos, para asegurar que la desnaturalizacin/
reduccin es total. En condiciones no desnaturali-
zantes/no reductoras, esta incubacin no es ne-
cesaria. En la Figura 7 se ilustra cual es el mecanis-
mo de desnaturalizacin del SDS.
Nota: Los tampones de carga permiten ahorrar tiempo y
garantizan que las muestras se separan de forma reproduci-
ble, carril a carril y gel a gel. Advansta dispone de tampones
de carga reductores y no reductores.

Informacin para pedidos

R 03018-B10 Non-reducing protein sample loading buffer (2x)

R-03019-B10 Reducing protein sample loading buffer (2x)
La protena se encuentra en su
estado conformacional, mante-
niendo su carga intrnseca
SDS
El SDS se une a la protena y da
lugar a una linearizacin y a una
uniformidad de la carga negativa
de sta.
Tabla 5. Componentes del tampn de carga.
Gel de Electroforesis
Si se requieren condiciones naturales para que el
anticuerpo pueda detectar el eptopo, en la
electroforesis no se aadir SDS ni en el gel ni en
el tampn de electroforesis. En esta situacin,
tambin conocida como PAGE nativo, las prote-
nas mantienen su estructura tridimensional y la
migracin en el gel depende de su masa: rela-
cin de carga de la protena por encima de su
tamao. Sin embargo, la mayora de ensayos
Western Blot, se realizan en geles de poliacrilami-
da conteniendo SDS (SDS-PAGE) en condiciones
desnaturalizantes. Bajo estas condiciones desna-
turalizantes y de reduccin, las protenas carga-
das negativamente, cuando se someten a un
campo elctrico, migran al electrodo positivo.
Debido a que el SDS iguala la carga en todas las
protenas, la tasa de migracin viene determina-
da por su peso molecular. Las molculas ms pe-
queas migran ms rpidamente que aquellas
con pesos moleculares mayores.
Los geles de SDS-PAGE estn disponibles comer-
cialmente o se pueden elaborar en el propio la-
boratorio. Los geles pre-fabricados son muy
prcticos pero debido al coste, no son tan renta-
bles como los elaborados por el usuario. En la ta-
bla 6, se describen los componentes qumicos de
un gel de SDS-PAGE.
Eleccin del grosor del gel y del tamao de poro
El tipo de muestra y el peso molecular de la pro-
tena de inters dictan el espesor y tamao de
poro del gel.
Los espaciadores de gel (ver Figura 8) con-
trolan el espesor del gel. Estn disponibles en
diversos tamaos.
Los geles con mayor espesor, pueden acep-
tar mayor volumen de carga. Tambin se
procesarn ms lentamente y requieren
tiempos de transferencia mas largos que los
geles ms delgados
El porcentaje del gel, segn la cantidad de
acrilamida y bisacrilamida, determina el ta-
mao del poro. A ms porcentaje menos
tamao de poro.
El tamao de poro determina la ratio de se-
paracin de las protenas. (tabla 7).
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Electroforesis
en Acrilamida
Tabla 6. Componentes del gel de acrilamida en las electroforesis
de protenas
Reactivos Propsito
Acrilamida Molculas que polimerizan para formar
cadenas.
Bisacrilamida Forman uniones con las cadenas de acri-
lamida para formar un entramado.
SDS Mantiene la linearidad y la uniformidad
de carga de las protenas segn la elec-
troforesis.
Tampn Tris Mantiene el pH adecuado.
Persulfato de Amonio Generacin de radicales libres que cata-
lizan la reaccin de polimerizacin.
TEMED Aumenta la generacin de radicales
libres por el persulfato de amonio.
Porcentaje Rango Peso Molecular (kDa)
7,5 25-500
10 15-300
12 10-200
15 10-45
20 5-40
Tabla 7. Rango de separacin de protenas segn el porcentaje
de acrilamida.
Anlisis de Protenas
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Elaboracin del gel
Si el gel de acrilamida esta elaborado en el labo-
ratorio, los distintos reactivos se mezclan y se vier-
te en el molde, formado por el conjunto de dos
cristales, espaciadores lateral, espaciador inferior,
peines y un sistema de sujecin (Figura 8), dnde
la acrilamida se polimeriza en aproximadamente
30 minutos. Para mejorar la nitidez de la banda el
gel resolutivo se corona con una acrilamida de
menor porcentaje (stacking gel).
Diseo Experimental; Controles y Estndares
Antes de la carga del gel, es importante disear
el experimento incorporando los controles y
estndares necesarios para la validacin de los
resultados. Los tipos de estndares y controles utili-
zados incluyen:
1. Marcadores de Peso Molecular.
Son una mezcla de protenas purificadas de
peso molecular conocido.
Se utilizan para verificar si la protena de in-
ters est dentro del rango de tamao apro-
piado.
Disponible en diversos intervalos de pesos
moleculares, as como teidos o incoloros.
Las versiones preteidas se utilizan para
controlar el progreso de la electroforesis y
comprobar la eficacia de la posterior trans-
ferencia.
Pueden estar marcadas por la deteccin
por fluorescencia o quimioluminiscencia.
2. Controles Positivos.
Para verificar si el anticuerpo primario se une
a la protena correcta.
Generalmente, si est disponible, son una
muestra de la protena de inters purificada.
Puede ser una lnea celular que sobreexpre-
se la protena de inters.
Puede ser una muestra de tejido del que se
conozca que expresa altos niveles de la pro-
tena de inters. Se pueden utilizar otras es-
pecies como tejido de control si el anticuer-
po tiene reactividad cruzada apropiada.
1. Colocar los espaciadores de la parte inferior y laterales entre
los cristales.
2. Tras fijacin de los lados, verter el gel resolutivo y esperar que
el gel se polimerice.
3. Colocar el peine en la parte superior del gel.
4. Verter el stacking gel y quitar el peine una vez el gel haya
polimerizado. Lavar los pocillos con ddH20. El gel est listo
para cargar las muestras y la electroforesis.
Controles de carga
Como norma general se utilizan protenas con
niveles de expresin constante para todas las
muestras. Similar a los housekeeping genes
en Biologa Molecular.
Algunos tratamientos pueden alterar la expre-
sin de estas protenas housekeeping.
Se utiliza para verificar que la carga de prote-
na por carril es ms o menos igual, as los nive-
les de protenas se pueden comparar de forma
cuantitativa.
La expresin cuantitativa de la protena de in-
ters puede normalizarse con la del control de
carga para cada muestra.
Pptidos de bloqueo
Algunos proveedores ofrecen pptidos de blo-
queo para sus anticuerpos.
El pptido de bloqueo se mezcla con el anti-
cuerpo primario antes de la incubacin con la
membrana y evita la unn del anticuerpo a la
protena diana. Por tanto no se detectar nin-
guna banda.
Estos estudios demuestran que el anticuerpo
utilizado se une de forma especfica a la prote-
na de inters.
Figura 8. Preparacin del gel de electroforesis para la separa-
cin de protenas.
Inicio de Electroforesis
Las muestras se cargan en los pocillos del gel me-
diante una pipeta. Normalmente se cargan de 20
a 40 g de protena total por carril. Es importante
conocer de antemano, el volumen que se puede
cargar por pocillo, para as evitar sobrecargas
que pueden dar lugar a la prdida de muestra o
derrames en pocillos adyacentes. Una vez finali-
zada la carga, el gel se somete a un campo elc-
trico generado por una fuente de alimentacin. El
tampn utilizado durante la electroforesis, contie-
ne Tris (mantiene el pH), Glicina (conductor elec-
tricidad) y SDS (mantiene las protenas cargadas
negativamente). El progreso en el gel se monitori-
za observando el frente coloreado por el coloran-
te presente en el tampn de carga y la posicin
de los marcadores de tamao siempre que estos
estn teidos.
La tcnica de electroforesis ms habitualmente
utilizada es la de Laemmli. En este mtodo, los
valores de pH de la capa de gel de apilamiento
o concentracin (Stacking Gel) y el gel de resolu-
cin (Resolving Gel) son diferentes. La figura 9 ilus-
tra el flujo de iones durante la electroforesis.
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Electroforesis
en Acrilamida
Muestra (pH 6,8)
Gly
Proteinas
CL
-

Stacking Gel
pH 6,8
Resolving Gel
pH 8,8
Gly
Proteinas
Tampn de Electroforesis (pH 8,3)
La glicina tiene carga negativa en el tampn de electrofo-
resis a pH 8,3.
Con la aplicacin de un campo elctrico, la glicina, en el
Stacking Gel, se aleja del electrodo negativo.
La glicina empieza a perder su carga a pH 6,8 y ralentiza
su movimiento. Los iones de cloruro avanzan por delante
de la Gly. El aumento de la resistencia, obliga a las prote-
nas a alejarse, de forma apilada, del electrodo negativo.
La glicina, debido a un mayor pH del Resolving Gel, au-
menta su carga negativa y se mueve por delante de las
protenas.
Las protenas se separan segn su peso molecular por el
Figura 9. Concentracin de bandas de protenas por el flujo
inico en el sistema discontinuo de Laemmli.
Anlisis de Protenas
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Una vez la electroforesis del gel ha terminado, las
protenas se transfieren a una membrana. La
membrana es un soporte slido que une e inmovi-
liza las protenas, permitiendo as que la hibrida-
cin de un anticuerpo las pueda detectar. La
mayora de los sistemas de transferencia utilizan la
generacin de un campo elctrico para condu-
cir a las protenas desde el electrodo negativo al
positivo. Los sistemas de transferencia estn dispo-
nibles en formato semiseco o hmedo. Los siste-
mas semisecos son ms rpidos y requeiren menor
cantidad de volumen de Tampn que los siste-
mas hmedos, sin embargo no son apropiados
para transferencia de protenas de gran tamao
(>70 kDa) y pueden causar, segn el sistema de
deteccin, un mayor ruido de fondo. Ambos
mtodos requieren, para una transferencia efecti-
va de las protenas, un estrecho contacto entre el
gel y la membrana.
Aunque ambas funcionan bien en experimentos
de inmunotransferencia, las diferencias en sus ca-
ractersticas puden influir a la hora de la eleccin.
La membrana de PVDF, ofrece una mayor resis-
tencai mecnica, resistencia la SDS y una mayor
unin que la nitrocelulosa. La membrana de nitro-
celulosa tiene la ventajas de proporcionar un me-
nor ruido de fondo y que no requieren un pre-
tratamiento con metanol. Recientemente se han
desarrollado, con el objetivo de reducir el ruido
de fondo al utilizar mtodos de deteccin de fluo-
rescencia, membranas PVDF de baja autofluores-
cencia.
Previamente a la transferencia, tanto el gel como
la membrana se equilibran en una solucin
tampn pre-enfriada. Tpicamente, el tampn de
transferencia contiene Tris, Glicina, SDS (opcional)
y metanos (para membranas de nitrocelulosa). La
figura 10 ilustra como se ensamblan el gel y la
membrana en un transferencia semiseca o hme-
da.
4. Transferencia a una Membrana
Nota: Advansta suministra membranas de transferencia pre
-cortadas de nitrocelulosa o PVDF aptas de tamao de mini-
gel. El uso de membranas pre-cortadas permite ahorrar tiem-
po y elimina la contaminacin accidental de las membranas
con guantes o tijeras contamindas.

Informacin para pedidos

L-08001-010 Membrana PVDF baja fluorescencia 7x9 cm

L-08002-010 Membrana Nitrocelulosa 0,45 m 8x10 cm

L-08003-010 Membrana Nitrocelulosa 0,22 m 8x10 cm
Figura 8. Transferencia de protenas a una membrana.
A continuacin se describen algunas sugerencias
para la consecucin exitosa de una transferen-
cia:
Evitar la manipulacin de las membranas con
las manos desnudas. Las protenas y aceites de
la piel pueden adherirse a la membrana y pue-
den dar lugar a manchas no deseadas en la
membrana.
Las burbujas de aire entre el gel y la membra-
na pueden causar transferencia defectuosa y
desigual. Se pueden eliminar haciendo rodar
suavemente una pipeta Pasteur por encima
del sndwich formado por el gel/
membrana/papel de filtro.
No permitir un sobrecalentamiento durante la
transferencia. Es aconsejable utilizar tampn
frio, un sistema de refrigeracin o hacer la
transferencia en una cmara fra. Disminuir el
voltaje o el tiempo si fuera necesario.
Ajustar las condiciones de transferencia al ta-
mao de la protena. Las protenas ms peque-
as se transferirn ms rpidamente y pueden
atravesar la membrana. Reducir o eliminar el
SDS o utilizar una membrana con un tamao
de poro menor puede ayudar a una mayor
retencin de la protena. Incrementar la canti-
dad de SDS y disminuir la concentracin de
Metanol pueden facilitar la transferencia de
protenas de gran tamao.
La aparicin de marcadores de tamao prete-
idos en la membrana es indicacin que se ha
completado la transferencia.
El colorante Ponceau S puede utilizarse para
teir la membrana y asegurarse de la eficacia
de la transferencia. La membrana debe ser
desteida antes del proceso de transferencia.
La tincin con Coomassie puede usarse para
la tincin del gel una vez realziada la transfe-
rencia y comprobar los residuos de protena en
el gel.
Pgina 12
Nota: Advansta ofrece soluciones optimizadas de bloqueo
y de lavado para su lnea de reactivos de deteccin, Wes-
ternBright, as como soluciones tampn en polvo de PCS, TBS,
...que facilitan una rpida y fcil preparacin

Informacin para pedidos

R-03024-D50 AdvanWash
TM
, 500 ml

R-03023-D20 AdvanBlock
TM
-PF, 200 ml

R-01038-020 AvantTM Buffer Pouches - PBS

R-01039-020 AvantTM Buffer Pouches - TBS
Bloqueo
El bloqueo de la membrana se lleva a cabo incu-
bando con una solucin diseada para reducir los
lugares de unin no especficos al anticuerpo. A me-
nudo, son soluciones a base de protenas, como la
leche descremada en polvo o la albmina de suero
bovino (BSA). La primera eleccin, cuando se inicia
un nuevo protocolo, es la utilizacin de la leche des-
cremada en polvo, ya que es ms rentable que el
BSA, sin embargo y debido a la presencia de biotina
en las fosfoprotenas, puede que no sea la mejor
eleccin cuando se van a utilizar anticuerpos fosfo-
especficos o en mtodos de deteccin de biotina.
Es preferible, para estas y otras situaciones, el uso
de agentes bloqueantes no proteicos.
El agente bloqueante se diluye en TBS (Tampn
Tris salino) o en PBS (Tampn Fosfato salino); se
puede aadir tambin detergente Tween 20.
Una i ncubaci n durante una hora
(temperatura ambiente o a 4C) suele ser sufi-
ciente para un bloqueo de los lugares de unin
no especficos del anticuerpo. Si los niveles del
ruido de fondo son demasiados altos, se pue-
den seleccionar otras soluciones de bloqueo
alternativas.
Electroforesis
en Acrilamida
Anlisis de Protenas
Pgina 13
Despus del proceso de bloqueo, la membrana
se incuba con el anticuerpo primario. En general,
los anticuerpos reconocen una secuencia de
aminocidos pequea (eptopo) que queda ex-
puesta al eliminar la estructura tridimensional de
la protena en condiciones desnaturalizantes y
reductoras. Los geles nativos se pueden utilizar
cuando los anticuerpos requieren de la protena
plegada para el reconocimiento del antgeno.



Anticuerpos Primarios:
Monoclonal vs Policlonal.

En la transferencia Western se pueden utilizar, tan-
to anticuerpos primarios monoclonales como poli-
clonales. Los dos tipos tienen distintas ventajas y
desventajas y se diferencian segn la forma en la
que se sintetizan. El primer paso en la produccin
de ambos anticuerpos, es la inyeccin de un ant-
geno en un animal, para provocar una respuesta
inmune. Los anticuerpos policlonales se obtienen
directamente a partir del suero del animal,
comnmente conejo, cabra, burro u oveja y son
finalmente purificados y probados. Los anticuer-
pos policlonales reconocen mltiples eptopos del
antgeno y en cambio los monoclonales recono-
cen un nico eptopo de la protena. Para la snte-
sis de un anticuerpo monoclonal, las clulas que
sintetizan anticuerpos se aslan del bazo del ani-
mal y se fusionan con clulas del mieloma. Lo
hibridomas resultantes secretan anticuerpos al
medio de cultivo, el cual se analiza y determina
la afinidad al antgeno. Los hibridomas con secre-
cin ms estable se seleccionan y pueden ser cul-
tivados indefinidamente. Algunas caractersticas
de los anticuerpos monoclonales y policlonales se
describen en la Tabla 8.
5. Hibridacin del Anticuerpo.
Tabla 8. Anticuerpos Policlonales vs Monoclonales.
Anticuerpos
Monoclonales
Anticuerpos
Policlonales
Reconocimiento
epitopo y
sensibilidad
Reconocimiento
de un nico ep-
topo
Menos sensibili-
dad debido a
que slo un anti-
cuerpo se une a
cada protena
Reconocimiento
mltiples eptopos
en una protena
Ms sensible debi-
do a los multiples
lugares de unin
de anticuerpo en
cada protena.
Bueno para prote-
nas poco abun-
dantes.
Reactividad cruza-
da potencial
Reactividad cru-
zada menos
probable.
Potencial para
reconocer otras
protenas que
contengan el
eptopo.
Reactividad cruza-
da ms probable.
Mayor ruido de
fondo potencial
debido al recono-
cimiento de multi-
ples eptopos.
Reactividad cruza-
da con otras espe-
cies ms probable.
Tiempo requerido
para su produccin
Largo Ms corto
Coste de Prepara-
cin
Mayor coste - re-
quiere personal
capacitado y equi-
pamiento especiali-
zado.
Menor coste
Variabilidad Los lotes de un mis-
mo hibridoma son
muy estables.
Propenso a cierta
variabilidad entre
lotes.
Tolerancia a condi-
ciones variables
Poca tolerancia -
puede dejar de
reconocer al ant-
geno en condicio-
nes de desnaturali-
zacin/reduccin
de la protena, o
por modificaciones
qumicas
(glicosilacin fosfori-
lacin) o por dife-
rencias en la se-
cuencia peptdica
debido a la presen-
cia de polimorfis-
mos.
Ms tolerante a con-
diciones variables.
Pgina 14
Nota: Advansta ofrece una lnea completa de anticuerpos
secundarios marcados para deteccin mediante quimiolu-
minscencia o fluorecencia.

Informacin para pedidos

R-05051-050 IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo, 50 l

R-05051-250 IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo, 250 l

R-05052-050 IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratn, 50 l

R-05051-250 IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratn, 250 l

R-05071-500 Anticuerpo Secundario conjugado HRP
cabra-anti-ratn, 500 l

R-05072-500 Anticuerpo Secundario conjugado APC
cabra-anti-conejo, 500 l
Incubacin de los anticuerpos
El anticuerpo primario se diluye en tampn de
bloqueo, TBST o en un tampn de disolucin de
anticuerpo comercial. El fabricante puede reco-
mendar una cantidad inicial, pero a menudo la
concentracin ptima de anticuerpo debe deter-
minarse empricamente. La afinidad del anticuer-
po, la abundancia de la protena en la muestra y
la sensibilidad del sistema de deteccin afec-
tarn a la cantidad de anticuerpo a utilizar.
Generalmente, un periodo de incubacin
de 1 hora a temperatura ambiente suele ser
suficiente. Tambin es posible una incuba-
cin a 4C durante toda la noche.
Durante la incubacin, la membrana debe
someterse a agitacin suave y sumergida en
la disolucin, e incubar en un agitador de
vaivn. Un menor volumen puede utilizarse si
la membrana se sella dentro de una bolsa e
incuba en un agitador orbital.
En algunos casos, la disolucin con el anti-
cuerpo, puede reutilizarse. Si se utiliza acida
sdica como conservante, debe ser total-
mente lavada de la membrana, ya que
puede eliminar la actividad de la peroxidasa
e interferir en los mtodos de deteccin.
Despus de la incubacin con el anticuerpo pri-
mario, se procede a la eliminacin del excedente
mediante tampones de lavado (TBS, PBS, TBST o
PBST). En mtodos de deteccin indirectos
(seccin 6), es necesario un anticuerpo secunda-
rio apropiado. A continuacin se describen las
consideraciones a tener en cuenta a la hora de la
eleccin de un anticuerpo secundario:
Las especie del primer Ac dicta la eleccin
del Ac secundario. Si el primer Ac es de co-
nejo, el segundo Ac debe ser anti-conejo, o
sea, deber ser producido en otra especie
distinta a conejo.
Para anticuerpos monoclonales se debe
considerar la clase de Inmunoglobulina (IgG,
IgM, IgA, IgD, IgE) y posiblemente la subclase
(IgG1, IgG2a,). Un anticuerpo con amplia
especificidad inmunoglobulnica debera ser
suficiente, ya que los anticuerpos especficos
para sub-clases se utilian mayoritariamente,
en experimentos de doble etiquetado u
otras aplicaciones.
Hibridacin
Anticuerpos
Anlisis de Protenas
Pgina 15
La deteccin de la protena se puede hacer me-
diante mtodos directos o indirectos, cada uno
con sus ventajas e inconvenientes. Los mtodos
directos utilizan un anticuerpo primario conjuga-
do con un marcaje detectable, como un enzima,
biotina o molcula fluorescente. Los anticuerpos
se pueden marcar mediante kits disponibles en le
mercado u obtenerlos ya marcados. Lo mtodos
indirectos utilizan dos anticuerpos; un anticuerpo
primario y un anticuerpo secundario contra la es-
pecie del primer anticuerpo. En la deteccin indi-
recta, es el anticuerpo secundario el que est
conjugado con un marcaje detectable. La figura
11,ilustra los mtodos de deteccin directos e in-
directos y en la Tabla 9 se resumen las ventajas e
inconvenientes de los dos mtodos.


Mtodos de deteccin.

Los mtodos ms comnmente utilizados para
detectar protenas son: 1. Quimioluminiscencia, 2.
Fluorescencia y 3. Colorimetra.
1. Quimioluminiscencia.
Los mtodos de deteccin de quimioluminiscen-
cia utilizan comnmente anticuerpos secundarios
conjugados con peroxidasa (HRP). La reaccin
entre el encima y el substrato produce luz, que
puede ser detectada mediante la exposicin de
la membrana a una pelcula de rayos X o capta-
da de forma digital utilizando una cmara CCD.
Ventajas: muy sensible, la membrana puede tra-
tarse para re-utilizarse, se pueden hacer multiples
exposiciones en pelculas de rayos X, fcil de do-
cumentar.
Inconvenientes: requiere una habitacin oscura
(pelcula rayos X) o sistemas de imagen caros, se-
micuantitativa - porque se basa en una reaccin
enzimtica, la pelcula tiene un rango dinmico
limitado, la intensidad de la seal puede variar
con la incubacin o el tiempo de exposicin, no
son posibles detecciones multiplex (deteccin de
mas de una protena, slo un color de reaccin)
6. Deteccin.
Figura 11 . Deteccin directa e indirecta de protenas
Indirecto Directo
Ventajas Amplificacin de
seal debido a la
unin de mlti-
ples Ac secunda-
rios a cada Ac
primario.
Verstil - el mis-
mo Ac secunda-
rio puede utilizar-
se para diversos
anticuerpos de
la misma espe-
cie.
Menos pasos.
Menos posibilida-
des de unin no
especfica.

Inconvenientes Mayor posibili-
dad de unin no
inespecfica.
Ms pasos.
Puede ser ms
costoso.
La inmunorreactivi-
dad del Anticuer-
po puede estar
afectada por el
marcaje.
Nota: LucentBlue
TM
es una pelcula que ha sido optimizada para
la deteccin de seales de quimioluminiscencia en experimentos
realizados con los substratos WesternBright HRP, incluyedo Western-
Bright
TM
ECL, Westernbright Quantum y WesternBright Sirius.
Informacin para pedidos

L07014-100 Pelcula Rayos X LucentBlue
TM
, 20x25 cm, 100 uds

L07013-100 Pelcula Rayos X LucentBlue
TM
, 13x18 cm, 100 uds
Tabla 9. Ventajas e Inconvenientes de los mtodos de detec-
cin
Pgina 16
Deteccin
Nota: WesternBright
TM
MCF permite la deteccin, mediante la
deteccin fluorescente multicolor, de dos protenas en una
sola membrana. Perfecto para aquellos experimentos en los
que se necesite comparar la protena de inters con un control
de carga.

Informacin para pedidos

K-12021-010 WesternBright
TM
fluorescent Western blotting kit

Re-utilizacin de la membrana
Despus de captar la imagen, la membrana pue-
de ser tratada para volver a ser utilizada para la
deteccin de otra protena. Este procedimiento
puede conservar las muestras, pero consume mu-
cho tiempo. Con la deteccin multiplex de fluo-
rescencia, se pueden detectar mltiples protenas
de forma simultanea, es ideal para comparar la
protena de inters con un control de carga, o
diferentes isoformas de la protena. Las membra-
nas PVDF son preferibles a la de nitrocelulosa en
protocolos de lavados para reutilizacin.
2. Fluorescencia.
El anticuerpo secundario se une a un fluorforo,
que cuando es excitado emite luz. La luz emiti-
da, se detecta mediante un dispositivo capaz de
medir la fluorescencia o mediante una cmara
CCD provista con los filtros de longitud de onda
apropiada. La imagen se digitaliza para su anli-
sis.
Ventajas: sensibilidad (la sensibilidad puede incre-
mentarse utilizando el sistema streptavidina/
biotina), apto para ensayos multiplex con mlti-
ples colorantes, amplio rango dinmico, no se
requiere el uso de una cmara oscura, aporta
datas cuantificables, fcil documentacin de re-
sultados, pueden usarse Ac primarios marcados
(para protenas abundantes) y eliminar pasos.
Inconvenientes: los reactivos y el equipamiento
pueden ser costosos, no es tan sensible como la
quimioluminiscencia (puede no ser apropiado
para protenas poco abundantes).
3. Colorimetra.
Los mtodos colorimtricos utilizan un Ac secun-
dario que ha sido conjugado previamente a un
enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina). El enzi-
ma convierte el colorante en un producto insolu-
ble que es visible en la membrana. La cantidad
de colorante convertido es proporcional al canti-
dad en la muestra. La intensidad de la tincin
puede ser medida por espectrofotometra o por
un densitmetro.
Ventajas: sencilla de realizar, no requiere cmara
oscura, las membranas se pueden documentar
fcilmente mediante fotografa.
Inconvenientes: no es tan sensible como los otros
dos mtodos, el color se desvanece con el tiem-
po. Nota: Advansta suministra una lnea completa de reactivos
de deteccin de quimioluminiscencia optimizados para los
diferenentes mtodos, concentracin de muestra y tipos expe-
rimentales.

Informacin para pedidos

K-12042-D10 WesternBright
TM
Quantum Western Blotting HRP
Substrate (para 1000 cm
2
de membrana)

K-12042-D10 WesternBright
TM
Sirius Western Blotting HRP Subs-
trate (para 1000 cm
2
de membrana)

K-12045-D20 WesternBright
TM
ECL Western Blotting HRP Substra-
te (para 2000 cm
2
de membrana)

K-12042-D10 WesternBright
TM
ECL Spray
Anlisis de Protenas
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7. Solucin de Problemas
Solucin de problemas con Western Blot
A. No se puede
ver la protena
de inters
Preparacin
Muestra
(ver 1)
B. Tamao inco-
rrecto de la
banda
C. Bandas arte-
factuales
D. Problemas en
la electroforesis
E. Ruido de fon-
do excesivo
Transferencia
Inadecuada
(ver 2)
Unin ineficien-
te del Anticuer-
po (ver 3, 4)
Problemas con
los reactivos
(ver 5, 6)
La protena es
menor de lo
esperado
(ver 7)
La protena es
mayor a lo es-
perado
(ver 8, 9)
Bandas Mlti-
ples (ver 10)
Las bandas
aparecen muy
altas o muy
bajas en el gel
(ver 11)
Bandas
Incompletas
(ver 12)
Bandas Difusas
(ver 13)
Rayas
Verticales
(ver 14)
Distorsin
Lateral
(ver 15)
Bandas distor-
sionadas
(ver 16)
El gel polimeriza
demasiado
rpido o dema-
siado lento
(ver 17,18,19)
El gel corre de-
masiado rpido
o demasiado
lento
(ver 20,21)
Frente corre
curvado
smiling
(ver 22)
Frente corre
inclinado
(ver 23)
Bloqueo
Insuficiente
(ver 24)
Lavado
inapropiado
(ver 25)
Contaminacin
Reactivos
(ver 26)
Eleccin de
Membrana
(ver 27)
Unin no es-
pecfica del
Anticuerpo
(ver 28)
Revelado de la
pelcula
(ver 29)
A. Problema Causa(s) Solucin
1. Preparacin Muestra Extraccin ineficiente Intentar mtodos alternativos; incluir con-
trol positivo en el gel
Baja expresin de la protena en el tejido
o las clulas
Cargar ms cantidad de protena total en
el gel; concentrar utilizando Afyon, juntar
mltiples muestras
La protena se ha degradado durante la
extraccin
Usar inhibidores de proteasa en le tampn
de lisis
2. Transferencia indadecua-
da
Tampn de transferencia preparado inco-
rrectamente/demasiado metanol en el
tampn
Revisar el protocolo/disminuir metanol
Protenas de mayor tamao necesitan
mas tiempo/voltaje
Repetir con un tiempo mayor/mayor vol-
taje
Contacto insuficiente entre el gel y la
membrana
Revisar la almohadilla de fibra; sustituir si es
muy delgada
3. Unin ineficiente del Anti-
cuerpo primario
Baja afinidad del anticuerpo por la prote-
na o el anticuerpo es antiguo/dbil
Incrementar la concentracin del Anti-
cuerpo; comprar un anticuerpo nuevo y
almacenarlo de forma apropiada
El Anticuerpo tiene reactividad cruzada
dbil con las especies de inters
Probar con un Anticuerpo primario de di-
ferente origen
El Anrticuerpo se ha eliminado con el lava-
do
Usar menor numero de lavados; disminuir
la concentracin de sales el tampn de
lavado
Antgeno enmascarado por el agente
bloqueante (ej.: Leche,)
Utilizar un agente de bloqueo alternativo
(ej.: BSA,)
4. Unin ineficiente del Anti-
cuerpo secundario
Eleccin de especies errnea Usar Anticuerpos dirigidos contra la espe-
cie del Anticuerpo primario
Concentracin insuficiente del Anticuerpo
o Anticuerpo antiguo
Aumentar concentracin o comprar uno
Anticuerpo nuevo
5. Conjugado/Substrato Inac-
tivo
Reactivos viejos o inestables Mezclar conjugado + substrato en un tu-
bo; o luminiscencia en oscuridad - conse-
guir un nuevo reactivo si no hay seal
Peroxidasa (HRP) inactiva por azida sdi-
ca
Evitar utilizar disoluciones conteniendo
este agente conservante
6. Reactivo de deteccin
(ECL)
La disolucin es antigua o est almacena-
da de forma inapropiada
Comprar reactivo nuevo
B. Problema Causa (s) Solucin
7. Protena ms pequea de
lo esperado
Protelisis; Congelacin/descongelacin
de la muestra
Uso de inhibidores de proteasa/muestras
frescas
Protena variante (Splicing) Consultar literatura/utilizar controles apro-
piados
8. Protena ms larga de lo
esperado y/o bandas mlti-
ples

Protenas modificadas de forma natural
(glicosilacin, fosforilacin, acetilacin,
etc)
Consultar literatura para encontrar aditi-
vos que puedan eliminar grupos qumicos
Cambio de la expresin de la protena en
la lnea celular
Utilizar cultivos anteriores; incluir un control
positivo
9. Protena ms larga de lo
esperado
Agregado de protenas - puentes disulfuro
intactos
Uso de DTT en tampn de muestra; pulso
de centrfuga previo a la carga de la
muestra
Pgina 18
Solucin de
Problemas
Pgina 19
B. Problema
(continuacin)
Causa(s) Solucin
10. Bandas Extras Unin no especfica del Anticuerpo prima-
rio o secundario
Disminuir concentraciones; intentar un
experimento de bloqueo de pptido
(eliminar la protena de inters)
11. La protena aparece muy
alta o muy baja en la mem-
brana
Porcentaje errneo/no ptimo del gel Incrementar el porcentaje para protenas
de pequeo tamao; disminuir para pro-
tenas de gran tamao
C. Problema Causa(s) Solucin
12. Bandas Incompletas Burbujas entre el gel y la membrana Usando una pipeta, hacer rodar por enci-
ma del paquete gel/membrana para for-
zar la salida de las burbujas
13. Bandas difusas Migracin lenta Incrementar voltaje; asegurarse de la co-
rrecta preparacin del tampn
Las muestras no se han calentado correc-
tamente
Asegurarse que las muestras se han incu-
bado durante 2 min a 90C antes de car-
garlas en el gel
El SDS del tampn es antiguo Preparar SDS nuevo para le tampn de
muestra
14. Rayas en los carriles Alta concentracin de sales en la muestra Disminuir la concentracin de sal en el
tampn de muestra
Muestra muy concentrada o insuficiente
SDS
Incrementar concentracin/usar ms SDS
15. Distorsin lateral de las
bandas
Difusin de la muestra en los pocillos du-
rante la carga
Minimizar el tiempo de carga
16. Distorsin de las bandas Fallo en la completa polimerizacin de los
pocillos
Incrementar TEMED/AP
Presin aplicada excesiva a la hora de
montar el gel
No apretar en exceso los tornillos del siste-
ma, apretar hasta encontrar primera resis-
tencia
Burbujas en el gel debido al uso de crista-
les sucios
Usar guantes en la preparacin de los ge-
les
Uso de Etanol y H2O desionizada en la lim-
pieza de los cristales
Burbujas introducidas en el gel por el dis-
positivo de llenado (jeringa o pipeta)
No expulsar totalmente el volumen de la
mezcla del gel
Burbujas de aire atrapadas por el peine Insertar el peine en ngulo y antes que se
polimerice el gel
D. Problema Causa (s) Solucin
17. El gel no polimeriza Fallo al aadir el TEMED y AP Repetir con TEMED y AP
La disolucin AP es estable durante dos o
tres das a 4C
Preparar AP fresco
El oxgeno inhibe la polimerizacin Aplicar isopropanol antes de verter el gel
de apilamiento (stacking gel)
18. El gel polimeriza muy len-
to
TEMED/AP Insuficiente Incrementar la cantidad de TEMED/AP
La disolucin de AP ha perdido su activi-
dad
Preparar disolucin fresca de AP
Anlisis de Protenas
D. Problema
(continuacin)
Causa(s) Solucin
19. El polimeriza demasiado
rpido
Cantidad excesiva de TEMED/AP Reducir la cantidad de TEMED/AP, mante-
niendo la relacin entre ambos
20. Tiempo de carrera in-
usualmente largo
Buffer de electroforesis demasiado con-
centrado
Revisar protocolo; diluir el tampn en caso
necesario
Voltaje insuficiente Incrementar voltaje
21. Tiempo de carrera in-
usualmente corto
Tampn demasiado diluido Revisar el protocolo; reemplazar tampn
en caso necesario
22. Frente curvado (smiling) Migracin demasiado rpida Disminuir voltaje
Generacin de calor Disminuir voltaje; refrigerar
23. Frente inclinado Burbuja atrapada entre los cristales en la
parte inferior del gel
Aguantar el gel en ngulo; colocar una
esquina en el tanque inferior del sistema
de electroforesis; lentamente volver a po-
sicin vertical
E. Problema Causa(s) Solucin
24. Bloqueo insuficiente La presencia de Biotina en la leche es in-
compatible con el uso de Estreptavidina,
o la leche contiene el antgeno de inters
Usar BSA
Si utiliza AdvanBlock-PF con WesternBright
MCF, algn Anticuerpo primario puede
requerir un bloqueante proteico
Incluir BSA o leche en la disolucin Advan-
Block-PF utilizada en la dilucin del Anti-
cuerpo primario
La disolucin est demasiado diluida Incrementar con un 5% la disolucin
Tiempo de bloqueo muy corto Incrementar el tiempo de incubacin
Algunos detergentes no son efectivos a
bajas temperaturas
Incubar a temperatura ambiente en vez
de toda la noche a 4C
25. Condiciones de lavado
inapropiadas
Nmero insuficiente de lavados Incrementar el nmero de lavados o la
duracin de cada uno de ellos
Concentracin insuficiente de detergente Incrementar la concentracin de deter-
gente o usar detergentes ms fuertes
(SDS, NP-40)
26. Contaminacin de los
reactivos
Crecimiento bacteriano o fngico en los
tampones
Revisar la turbidez de los tampones; pre-
parar nuevos
27. Eleccin de tipo de mem-
brana
Las membranas PVDF pueden tener ms
ruido de fondo que las de Nitrocelulosa
Elegir membranas de Nitrocelulosa
Algunas membranas tienen alta autofluo-
rescencia
Utilizar nicamente membranas PVDF con
baja autofluorescencia con Western Blots
fluorescentes
Membrana seca Estar seguro que la membrana esta hme-
da durante todo el proceso
28. Unin no especfica del
Anticuerpo primario o secun-
dario
Concentracin muy alta del Anticuerpo o
no purificado por afinidad
Disminuir la concentracin de Anticuerpo;
intentar con Anticuerpo monoclonal o
purificado por afinidad
Mucha cantidad de protena en el gel Disminuir la cantidad de protena
29. Sobreexposicin de la
imagen
El tiempo excesivo de exposicin a la pel-
cula o al CCD
Reducir los tiempos de exposicin; si no es
posible incrementar la dilucin de los Anti-
cuerpos o cargar menor cantidad de
muestra
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Solucin de
Problemas
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Anlisis de Protenas
8. Herramientas y Referencias Tcnicas
g de Soluto
Molaridad de una disolucin =
[Masa molecular de Soluto (g/mol) x (L de disolucin)
Tabla 10. Cdigo gentico y abreviaciones de los aminocidos
Peso molecular
(Da)
1 g 1 nmol
10.000 100 pmol o 6x10
13
molculas 10 g
20.000 20 pmol o 1,2x10
13
molculas 50 g
100.000 10 pmol o 6x10
12
molculas 100 g
150.000 6,7 pmol o 4x10
12
molculas 150 g
Tabla 11. Conversin entre masa y moles de protena
Proteina A280 Uds por 1 mg&ml
IgG 1,35
IgM 1,2
IgA 1,3
Proteina A 0,17
Avidina 1,5
Estreptavidina 3.4
Albumina suero bovino 0,7
Tabla 12. Absorvancia a 280 nm de Proteinas habituale
Segunda Posicin
U C A G

U
UUU Fenilalanina
UUC (Phe, F)

UUA Leucina
UUG (Leu, L)
UCU
UCC Serina
UCA (Ser, S)
UCG
UAU Tirosina
UAC (Tyr, T)

UAA STOP
UAG
UGU Cisteina
UGC (Cys, C)

UGA STOP

UGG Triptfano
(Trp, W)

C
CUU
CUC Leucina
CUA (Leu, L)
CUG
CCU
CCC Prolina
CCA (Pro, P)
CCG
CAU Histidina
CAC (His, H)

CAA Glutamina
CAG (Gln, Q)
CGU
CGC Arginina
CGA (Arg, R)
CGG

A
AUU Isoleucina
AUC (Ile, I)
AUA

AUG Metionina
(Met, M)
ACU
ACC Treonina
ACA (Thr, T)
ACG
AAU Asparagina
AAC (Asn, N)

AAA Lisina
AAG (Lys, K)
AGU Serina
AGC (Ser, S)

AGA Arginina
AGG (Arg, R)


G
GUU
GUC Valina
GUA (Val, V)
GUG
GCU
GCC Alanina
GCA (Ala, A)
GCG
GAU A. Asprtico
GAC (Asp, D)

GAA A. Glutmico
GAG (Glu, E)
GGU
GGC Glicina
GGA (Gly, G)
GGG
P
r
i
m
e
r
a

p
o
s
i
c
i

n

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Herramientas y
Referencias
M mega 10
6

K Kilo 10
3

m mili 10
-3

micro 10-
6

n nano 10
-9

K pico 10
-12

f femto 10
-15

a atto 10-
18

Tabla 13. Prefijos mtricos
ds doble cadena ( como en dsDNA)
ss cadena sencilla (como en ssDNA)
bp pares de base
kb kilobase; 1.000 bases o pares de base
Da Dalton, unidad de masa molecular
mol mol
M molaridad, moles de soluto por litro de disolucin
Tabla 14. Abreviaciones
Masa molecular media Cdigos Aminocidos
A Ala 71,08
C Cys 103,1
D Asp 115,1
E Glu 129,1
F Phe 147,2
G Gly 57,05
H His 137,1
I Ile 113,2
K Lys 128,2
L Leu 113,2
M Met 131,2
N Asn 114,1
P Peo 91,12
Q Gln 128,1
R Arg 156,2
S Ser 87,08
T Thr 101,1
V Val 99,07
W Trp 186,2
Y Tyr 163,2
Radioistopo Vida media
Carbono-14 (
14
C) 5.730 aos
Iodo-125 (
125
I) 60 das
Fsforo-32 (
32
P) 14,3 das
Azufre-35 (
35
S) 87,4 das
Tritio (
3
H) 12,4 aos
Tabla 16. Masa molecular media de los aminocidos
Tabla 15.. Vida media de los Radioistopos ms habituales
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