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FACTORES DE VIRULENCIA

A nivel molecular, la patogenesis del colera es un proceso multifactorial que


involucra varios genes que codifican factores de virulencia que ayudan al patogeno
para la colonizacion y la expresion coordinada de la toxina (Tabla 1). La diarrea
masiva inducida por V. cholerae es causada por la toxina colerica (CT) (4), aun
cuando se ha reportado que cepas que pierden los genes que codifican para la CT,
todavia pueden causar diarrea.
Tabla 1. Factores de virulencia de Vibrio cholerae

TOXINA COLRICA
Cada molecula de CT, esta compuesta por cinco subunidades B (de enlace) y una
subunidad A (activa). Las subunidades B se unen a los receptores del gangliosido G
M1

en las celulas epiteliales de la mucosa intestinal. Despues de la union, se separan la
subunidad A1 y el componente A2, lo cual facilita la entrada del componente A1 en la
celula. El componente A1 de la toxina colerica estimula la produccion de la enzima
adenilciclasa, involucrada en la produccion del monofosfato ciclico de adenosina
(AMPc). Las altas concentraciones intracelulares de AMPc alteran el transporte activo
de los electrolitos a traves de la membrana celular, lo cual impide la adsorcion de
liquido y conduce a su secrecion en el intestino delgado.
La enterotoxina de V. cholerae esta codificada por los genes ctx. El gen ctxA codifica
la subunidad A de la toxina, y el gen ctxB codifica la subunidad B. Los genes son
parte del mismo operon ctxAB. El transcrito (ARNm) del operon ctx tiene dos sitios
de union a ribosoma (RBS), uno en el gen A y otro en el gen B. Este ultimo es, por lo
menos, siete veces mas fuerte que el sitio de la region A. De esta forma el
organismo es capaz de traducir mas proteinas B que A, lo cual se requiere para
ensamblar la toxina en la proporcion apropiada (1A:5B). Los componentes son
ensamblados en el periplasma despues de la traduccion. Cualquier subunidad B extra
puede ser excretada por la celula, pero la subunidad A debe estar adherida a 5
subunidades B, para poder salir de la celula. La subunidad A intacta no es activa
enzimaticamente, y se debe fraccionar en los fragmentos A1 y A2, los cuales estan
unidos por un puente disulfuro (48).
El operon ctxAB, forma parte del genoma del bacteriofago filamentoso CTX,
lisogenizado en la bacteria (40). Este genoma fagico esta compuesto por dos
dominios funcionalmente distintos, la region central o "core" y la region RS2 (49). En
la region central se encuentran, entre otros, los genes de la toxina colerica (ctxAB),
los genes implicados en la morfogenesis del bacteriofago (psh, cep, orfU, y ace) y un
gen que codifica una proteina necesaria para el ensamblaje del virion (zot). Antes de
conocer este origen fagico, algunos de estos genes se consideraban que codificaban
otras toxinas relacionadas con la patogenesis del Colera, ya que se habia detectado,
por ejemplo que el zot (zonula occludens toxin) aumentaba la permeabilidad de la
mucosa intestinal (50) y el ace (accesory cholera enterotoxin) era capaz de inducir la
acumulacion de liquidos (51). La region RS2 incluye los genes necesarios para la
replicacion (rstA), integracion (rstB) y regulacion (rstR) de CTX, tambien contiene
dos regiones intergenicas ig-1 y ig-2 (52). Dentro de las celulas de V. cholerae, el
genoma de CTX puede existir como la forma replicativa o co mo profago integrado
dentro del cromosoma (49). Bajo condiciones apropiadas, las cepas toxigenicas de V.
cho lerae pueden ser inducidas para producir particulas ex tracelulares de CTX (49,
53). Las cepas ambientales no toxigenicas pueden convertirse por transduccion con
CTX (53).
El profago de CTX esta usualmente flanqueado por un elemento genetico
relacionado conocido como RS1, si milar genetica y funcionalmente a la region RS2
del CTX (52). No se han identificado en aislamientos na turales de O1 El Tor y O139
profagos solitarios, no flan - queados por RS1 u otro profago (54). El elemento RS1
por ta un ORF denominado rstC que no esta presente en RS2 (52). RstC es un anti
represor que controla la produccion de particulas de CTX y la expresion de la toxina
colerica (55). Todo esto sugiere una interrelacion entre los progafos RS1 y CTX
que promueve una diseminacion mas eficiente de los genes ctx, mientras,
simultaneamente, aumenta el desempeno en virulencia de aquellas cepas de V.
cholerae que portan los genes de TCP.
ISLA DE PATOGENICIDAD
Las islas patogenicas (PAIs) son segmentos de ADN bacteriano que portan uno o mas
genes de virulencia, adquiridos en bloque a partir de una fuente externa. Las PAIs
son identificadas por su diferencia en el porcentaje de contenido de G+C en relacion
a la media del cromosoma y por otras caracteristicas, que sugieren su adquisicion a
traves de elementos geneticos moviles (56). La Isla de patogenicidad 1 de V.
cholerae (V. cholerae pathogenicity island, VPI-1) tiene un tamano de 39,5 kb. Todos
los genes en VPI-1 son potencialmente importantes para producir la enfermedad, ya
sea que tengan un rol directo en la patogenesis o indirecto en la transferencia y
motilidad de VPI-1. El elemento VPI-1 contienen genes como tcpA que codifica un
importante factor de colonizacion y el receptor para CTXO, y los genes toxT, tcpP y
tcpH que codifican factores reguladores y de virulencia (57). La identificacion de
genes potenciales de una integrasa y una transposasa a cada lado de VPI-1 sugieren
la transferencia e integracion de VPI en cepas epidemicas y pandemicas (57).
La isla VPI-2, es una region cromosomal de 57,3 kb con caracteristicas de una isla de
patogenicidad (58). Todas las cepas toxigenicas de V.choleraeO1 y O139 contienen
VPI-2, mientras los aislamientos no toxigenicos no-O1/no-O139 no tienen esta
region. VPI-2 codifica varios grupos de genes: un sistema de restriccion por
modificacion tipo 1, el cual podria proteger a la bacteria de la in feccion por virus
(59); un grupo de genes nan.nag ho - mologos a los genes involucrados al
metabolismo del acido sialico, el cual podria actuar en la obtencion de fuente de
carbono y nitrogeno (60); una Neuraminidasa, la cual actua en los gangliosidos de
alto orden en el in - testino y convertirlos en gangliosidos GM1, los cuales sub
secuentemente liberarian acidos sialicos (61); y una region con homologia al fago Mu
(58).
El analisis comparativo del genoma de V. cholerae usando la tecnica de
microarreglos de DNA, determino diferencias en el contenido entre la cepa de la
sexta pandemia (Clasico) y la septima pandemia (El Tor). Se han identificado dos
regiones designadas como: Isla 1 del Vibrio de la septima pandemia (Vibrio seventh
pandemic island-I, VSP-I) y VSP-II que unicamente estaban presentes en las cepas
de la septima pandemia El Tor (62). VSP-I y VSP-II muestran varias caracteristicas
de isla de patogenicidad. VSP-I es una region de 16 kb y con tiene 11 ORFs, con un
contenido de GC de 40%, en contraste con el promedio para todo el cromosoma del
47% (62). La region VSP-II tiene un tamano de 7.5 kb, y contiene ocho ORFs (62).
Estas dos PAIs y VPI-2 se pueden escindir del cromosoma y formar una molecula in
termediaria, circular, la cual es el primer paso para su transferencia horizontal (63).
MOTILIDAD
Se ha sugerido que la motilidad contribuye a la reactogenicidad de los candidatos a
vacuna de una cepa atenuada, por promover la penetracion de la barrera mu cosa
(64). El papel de la motilidad en la patogenesis del colera no esta completamente
entendido. Los primeros estudios usando mutantes no motiles, producian resultados
conflictivos del rol de la motilidad en la adherencia y enterotoxicidad, en el modelo
de asa ileal de conejo (65). La inhibicion de la motilidad incrementa la trascripcion de
toxT en el biotipo El Tor, pero no previene la induccion de ctxA y tcpA en el intestino
de los ratones. Sin embargo, en el modelo de asa ileal de conejo, la motilidad es
necesaria para la expresion completa de la enterotoxicidad (66). Esto sugiere que la
relacion entre la movilidad y la expresion de los factores de virulencia es compleja.
HEMAGLUTININA / PROTEASA
V. cholerae produce una hemaglutinina/proteasa (HapA), codificada por hapA (67),
tambien involucrada como factor de virulencia. HapA puede degradar
proteoliticamente varias proteinas de importancia fisiologica pa ra el hospedero,
incluyendo la mucina (68). HapA perturba la barrera paracelular en los cultivos de
celulas de epitelio intestinal, por la accion en las proteinas asociadas a la zona
ocludens (69) y se ha demostrado que se requiere la expresion de hapA para que V.
cholerae penetre un gel de mucina in vitro (70). Aunque el analisis de los efectos de
mutantes del gen hapA en conejos infantes y ratones lactantes no ha provisto
evidencia que HapA es un factor esencial de virulencia (67), se ha probado que la
proteasa HapA contribuye a la reactogenicidad en las vacunas de colera de cepas
atenuadas en humanos (71). La perdida de HapA no afecto la colonizacion en el
modelo de ratones lactantes, sin embargo la motilidad y HapA son necesarios para la
expresion total de la enterotoxicidad en asa ileal de conejo (66).
TOXINA MARTX DE VIBRIO CHOLERAE
La secuencia de nucleotidos del genoma de V. cholerae y su analisis con tecnicas
informaticas, ha revelado la presencia de otras toxinas desconocidas, entre ellas, la
Toxina RTX multifuncional autoprocesada de Vibrio cholerae (multifunctional,
autoprocessing RTX toxin, MARTX
Vc
). Esta proteina es homologa a los miem - bros de
la familia de las toxina RTX (Repeats in toxin), que contienen un motivo de repetidos
ricos en GD. Esta codificada por un elemento genetico situado muy cerca del lugar de
insercion del genoma del bacteriofago CTX, aunque su actividad es independiente
del elemento CTX (72). El gen rtxA es el marco abierto de lectura mas largo en el
genoma de V. cholerae (40), y se encuentra tanto en los aislamientos clinicos como
los ambientales (73, 74). La MARTX
Vc
es secretada por un sistema T1SS atipico,
compuesto por cuatro componentes (75). Esta toxina rompe los filamentos de actina
del citoesqueleto de un amplio rango de tipos celulares (76). Esta disrupcion se
produce por la inactivacion de las GTPasas pequenas, Rho, Rac y Cdc42 (77).
Adicionalmente esta toxina posee otro dominio responsable del entrecruzamiento
(actin cross-linking domain, ACD), el cual utiliza G-actina como substrato (78).
HEMOLISINA
La mayoria de los aislamientos de V. cholerae O1 biotipo El Tor y no-O1/no-O139
producen una exotoxina hemolitica, llamada El Tor Hemolisina o V. cholerae citolisina
(VCC) (79-81), codificada por el gene cromosomal hlyA (40). Se ha reportado que
VCC es capaz de causar severos efectos citotoxicos, tales como: lisis celular,
vacualizacion e incremento de la apoptosis en celulas del epitelio intestinal (82-84).
Esta hemolisina se puede encontrar como monomero con actividad hemolitica y
como oligomeros que aglutinan eritrocitos. Estas diferentes formas conducen a las
celulas inmunes a diferentes direcciones, los oligomeros inducen la expresion de IgM
e IgA, sin embargo, la mayoria de las celulas tratadas con monomeros resultan en
apoptosis (85).
HEMAGLUTININA MANOSA SENSIBLE
Una estrategia bacteriana alternativa para sobrevivir en el ambiente, es la formacion
de Biopeliculas. Estas estructuras son comunidades microbianas que se forman por la
adherencia de una bacteria a una superficie, a la que posteriormente se adicionan
multiples capas de interacciones celulas-celulas y desarrollan una estructura
tridimensional, que incluyen canales de agua a traves de los cuales entran nutrientes
y salen productos de desecho (86). En los ambientes acuaticos existen diferentes
superficies sobre las cuales se pueden formar biope liculas. Estas superficies incluyen
particulas de minerales en suspension, plantas, y los exoesqueletos de los crustaceos
y zooplancton. V. cholerae O1 El Tor se puede diferenciar del Clasico por la presencia
de un pilus del tipo IV, llamado Hemaglutinina manosa sensible (mannose-sensitive
hemagglutinin, MSHA), codificado por el gen mshA (87), implicado en la formacion
de biopeliculas en superficies abioticas y que facilita la supervivencia de la bacteria
en ambientes acuaticos (88).
TOXINA CHOLIX
Esta toxina tiene actividad de ADP-ribosiltransferasa, y es activa contra celulas de
mamiferos y crusta ceos, con actividad especifica contra el factor ribosomal de
elongacion tipo 2. Para su accion requiere de endo citosis mediada por un receptor,
traslocacion al cito plasma hospedero, donde produce la inhibicion de la sintesis
proteica por modificacion especifica del factor de elongacion. Se ha propuesto que
este factor juega un rol importante en la supervivencia del microorganismo en el
ambiente acuatico (89).
QUORUM-SENSING
Las bacterias son capaces de producir unas moleculas pequenas difusibles, llamadas
auto-inductores. Estas moleculas se acumulan en el medio cuando ocurre un
incremento de la densidad celular, y regulan la ex presion de un amplio numero de
genes, que a su vez controlan una variedad de funciones fisiologicas, en un proceso
que se conoce como "quorum-sensing" (90, 91). Este pro ceso permite a las
bacterias comunicarse, secretando senales quimicas, habilitando asi a la poblacion
bacteriana a regular de forma colectiva la expresion de ge nes, y por lo tanto su
desempeno como comunidad. Este "censo-poblacional", le permite al grupo
bacteriano modular la expresion de genes especificos solo en ciertos momentos de
densidad de poblacion, aquellos que serian improductivos que ocurrieran por una
bacteria individual, pero que son efectivos cuando se realizan en grupo. Asi, el
"quorum-sensing" es un proceso que involucra la secrecion y deteccion de
autoinductores que les permite a las bacterias funcionar como un organismo mul
ticelular. En V. cholerae se ha demostrado que el "quorum-sensing" regula
negativamente la expresion de los genes de virulencia (92, 93). Los principales
autoinductores en V. choleare son: Colera autoinductor 1 (CAI- 1) y el autoinductor
2 (AI-2), que funcionan de manera sinergistica para la regulacion de los genes (94).
La acumulacion de los auto-inductores modula la actividad de un regulador central,
LuxO, a traves de los receptores de membrana CqsS y LuxPQ (92). Cuando hay una
baja densidad celular, LuxO reprime la expresion de un regulador maestro "quorum-
sensing", HapR, por la activacion de la expresion de un grupo de RNA pequenos
(95). La represion de hapR permite la expresion de tcpP en la isla de patogenicidad
de V. cholerae. En este punto, el resultado es la expresion de los factores de
virulencia que le permiten a V. cholerae colonizar el intestino delgado, multiplicarse y
producir la toxina colerica. HapR tambien reprime el operon vps (Vibrio
polyssacharide synthesis), por lo que regula negativamente la formacion de
biopeliculas (96). Adicionalmente, HapR directamente regula po sitivamente la
expresion de hapA, lo cual produce una hemaglutinina/proteasa secretora,
responsable de la adherencia de los Vibrios al epitelio intestinal (97). En resumen,
HapR reprime el regulon de virulencia, los genes relacionados con la formacion de
biopeliculas y activa la produccion de proteasa, que puede promover la li beracion de
las celulas de V. cholerae adheridas, lo que facilita el establecimiento de un nuevo
punto de in - feccion en el epitelio gastrointestinal, o alternativamente, promover la
salida de V. cholerae del hospedador y asi en condiciones de alta densidad celular se
inhibe la virulencia en la bacteria.
Se ha sugerido que el sistema sensorial de dos com ponentes VarsS/VarA forma
parte de un sistema regulatorio dependiente de "quorum-sensing", el cual modula la
expresion de genes en V. cholerae (98). Mas aun, la expresion de hapR es reprimida
en alta densidad celular por si misma, aunque el significado de esta auto represion
no se conoce (99). Tambien se ha identificado un regulador transcripcional, VqmA,
que modula el "quo rum-sensing" de V. cholerae pues activa la expresion de hapR
cuando hay baja densidad de celulas (100). Adicionalmente, se ha reportado que el
"quorumsensing" aumenta la viabilidad de V. cholerae, bajo ciertas condiciones de
estres, mediante la regulacion de la expresion de RpoS (factor sigma de la RNA
polimerasa de fase estacionaria) (101). Por otra parte, se requiere la proteina
receptora de AMPc (CRP) para la biosintesis de CAI-1, que afecta la expresion de
multiples genes regulados por HapR (102), poniendose asi de manifiesto la
intrincada red regulatoria que garantiza la sobrevivencia de la bacteria y del
hospedero.

Bibliografa

http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0798-
04772009000200006