O documento descreve o procedimento da coloração de Gram, que classifica bactérias em gram-positivas ou gram-negativas dependendo de como reagem ao corante e álcool. A diferença se deve à estrutura da parede celular, sendo mais espessa em gram-positivas. Gram-positivas retêm o corante violeta após o álcool, enquanto gram-negativas são coradas em rosa pela safranina. A coloração de Gram fornece informações úteis para tratamento de doenças.
O documento descreve o procedimento da coloração de Gram, que classifica bactérias em gram-positivas ou gram-negativas dependendo de como reagem ao corante e álcool. A diferença se deve à estrutura da parede celular, sendo mais espessa em gram-positivas. Gram-positivas retêm o corante violeta após o álcool, enquanto gram-negativas são coradas em rosa pela safranina. A coloração de Gram fornece informações úteis para tratamento de doenças.
O documento descreve o procedimento da coloração de Gram, que classifica bactérias em gram-positivas ou gram-negativas dependendo de como reagem ao corante e álcool. A diferença se deve à estrutura da parede celular, sendo mais espessa em gram-positivas. Gram-positivas retêm o corante violeta após o álcool, enquanto gram-negativas são coradas em rosa pela safranina. A coloração de Gram fornece informações úteis para tratamento de doenças.
Universidade Federal de Minas Gerais htp://www.icb.ufmg.br/mic Colorao de Gram 1 Introduo Colorao de Gram - www.icb.ufmg.br/mic A colorao de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarqus Hans Christan Gram. Ela um dos processos de colorao mais teis, pois classifca as bactrias em dois grandes grupos: gram-positvas (que coram em roxo) e gram-negatvas (coram em rosa). Tal reao colora- o de Gram se deve s diferenas na estrutura da parede celular de clulas gram-positvas e gram- negatvas, que permitem que o lcool descore as clulas gram-negatvas, mas no as gram-positvas. Os diferentes tpos de bactrias reagem de modo diferente colorao de Gram, provavelmente porque diferenas estruturais em suas paredes celulares (Figura 1) afetam a reteno ou libera- o de uma combinao de violeta de genciana e iodo, denominada complexo violeta-iodo (CV-I). Entre outras diferenas, as bactrias gram-positvas tm uma parede celular mais espessa de pep- tdeoglicano que as bactrias gram-negatvas. Alm disso, as bactrias gram-negatvas contm uma camada de lipopolissacardeo como parte de sua parede celular. Quando aplicada s clulas gram- positvas e gram-negatvas, a violeta de genciana e o iodo penetram facilmente nas clulas. Dentro das mesmas, a violeta de genciana e o iodo se combinam para formar o CV-I. Este complexo maior que a molcula de violeta de genciana que penetrou na clula e, devido a seu tamanho, no pode ser removido da camada intacta de peptdeoglicano das clulas gram-positvas pelo lcool. Con- seqentemente, as clulas gram-positvas retm a cor do corante violeta de genciana. Nas clulas gram-negatvas, contudo, a lavagem com lcool rompe a camada externa de lipopolissacardeo, e os complexos CV-I so removidos atravs da camada delgada de peptdeoglicana. Como resultado, as clulas gram-negatvas permanecem incolores at serem contracoradas com safranina, quando adquirem a cor rosa. Fig. 1: Paredes celulares de bactrias gram-negatva e gram-positva. 2 Colorao de Gram - www.icb.ufmg.br/mic Procedimento Neste procedimento, um esfregao fxado pelo calor recoberto com um corante bsico prpura, usualmente a violeta de genciana. Uma vez que a colorao prpura impregna todas as clulas, denomina colorao primria. Aps um curto perodo, o corante prpura lavado e o esfregao recoberto com iodo. Quando o iodo lavado, ambas as bactrias gram-positvas e gram-negatvas aparecem em cor violeta escuro ou prpura. A seguir, a lmina lavada com lcool ou uma soluo de lcool-acetona. Esta soluo um agente descolorante, que remove o prpura das clulas de algumas espcies, mas no de outras. O lcool lavado e a lmina ento corada com safranina (ou fucsina), um corante bsico vermelho. O esfregao lavado novamente, seco com papel e exami- nado microscopicamente. O corante prpura e o iodo se combinam com cada bactria e a coram de violeta escuro ou prpura. As bactrias que retm esta cor aps o lcool so classifcadas como gram-positvas; as bactrias que perdem a cor violeta escuro ou prpura aps a descolorao so classifcadas como gram- -negatvas. Como as bactrias gram-negatvas so incolores aps a lavagem com lcool, no so mais visveis. por isso que o corante bsico safranina (ou fucsina) aplicado; ele cora as bactrias gram-negatvas de rosa. Os corantes como a safranina, que possuem uma cor contrastante com a colorao primria, so denominados contracorantes. Como as bactrias gram-positvas retm a cor prpura original, no so afetadas pelo contracorante safranina. Etapas 1. Confeccionar o esfregao na lamina; 2. Corar com violeta de cristal por 60 segundos; 3. Lavar com de gua destlada; 4. Cobrir com Iodo de Gram ou Lugol por 60 segundos; 5. Lavar com de gua destlada; 6. Descorar com lcool a 95%, ou acetona, 10-20 segundos; 7. Lavar com de gua destlada; 8. Corar com safranina por 20 segundos; 9. Lavar com gua destlada, secar e observar ao microscpio. 1- Cristal violeta 2- Soluo de iodo (lugol) - I 3- lcool 4- Safranina Solues em Gram- positvas Gram- negatvas ordem de aplicao Clulas coradas em violeta Formao do complexo CV-I no interior das clulas, que per- manecem violetas Desidratao das paredes ce- -lulares, diminuio da porosi- -dade e da permeabilidade: o complexo CV-I no pode sair das clulas que permanecem violetas. As clulas no so afetadas, per- manecendo violetas. Clulas coradas em violeta Formao do complexo CV-I no interior das clulas, que per- manecem violetas Extrao dos lipdios da parede celular, aumentando a porosi- dade: O complexo CV-I remo- vido das clulas As clulas tomam o corante, tor- nando-se vermelhas. 3 Colorao de Gram - www.icb.ufmg.br/mic O mtodo de Gram uma das mais importantes tcnicas de colorao em microbiologia mdica. Porm, os resultados da colorao de Gram no so universalmente aplicveis, pois algumas clulas bacterianas coram-se fracamente ou no adquirem cor. A reao de Gram mais consistente quan- do usada em bactrias jovens, em crescimento. A reao de Gram de uma bactria pode fornecer informao valiosa para o tratamento da doena. As bactrias gram-positvas tendem a ser mortas facilmente por penicilinas e cefalosporinas. As bactrias gram-negatvas, geralmente, so mais resistentes, pois os antbitcos no podem pene- trar na camada de lipopolissacardeo. Alguma resistncia a estes antbitcos entre ambas as bact- rias gram-positvas e gram-negatvas devida inatvao bacteriana dos antbitcos. Morfologia das Clulas Bacterianas Tamanho - Variam de 0,3 por 0,8 m at 10 por 25 m. - As espcies de maior interesse mdi- co medem entre 0,5 a 1,0 m por 2 a 5 m. Forma e arranjo - Formas de cocos (esfricas): grupo mais homogneo em relao a tamanho sendo clulas menores (0,8-1,0 m). Os cocos rece- bem denominaes diferentes de acordo com o seu arranjo (Figura 2): - Diplococos: cocos agrupados aos pa- res. Ex: Neisseria meningitdes (meningococo); - Ttrades: agrupamentos de quatro co- cos. Ex: espcies do gnero Sarcina; - Estreptococos: cocos agrupados em cadeias. Ex: Streptococcus salivarius, Strepto- coccus pneumoniae (pneumococo), Strepto- coccus mutans; - Estaflococos: cocos em grupos irregu- lares, lembrando cachos de uva. Ex: Staphylo- coccus aureus; - Micrococos: cocos que se separam completamente aps a diviso celular. Forma de bastonete So clulas cilndricas, em forma de bastonetes que apresentam grande variao na forma Figura 2: Arranjo em forma de coco. Figura 3: Arranjo de bastonete e tamanho entre gneros e espcies (Figura 3). Dentro da mesma espcie os bastonetes so relat- vamente constantes sob condies normais de crescimento, podendo variar em tamanho e espes- sura (longos e delgados, pequenos e grossos, extremidade reta, convexa ou arredondada). Quanto ao arranjo podem variar em: 4 Colorao de Gram - www.icb.ufmg.br/mic - Diplobacilo: bastonetes agrupados aos pa- res; - Estreptobacilos: bastonetes agrupados em cadeias; - Paliada: bastonetes alinhados lado a lado como palitos de fsforo. Ex: bacilo da diferia; - Tricomas: similares a cadeias de bastone- tes, mas com uma rea de contato muito maior en- tre as clulas adjacentes. Ex: espcies dos gneros Beggiatoa e Saprospira Figura 4: Arranjo helicoidal ou espiralado Formas helicoidais ou espiraladas consttuem o terceiro grupo morfolgico, sendo caracterizado por clulas de forma espiral (Figura 4) que se dividem em: - Espirilos: possuem corpo rgido e se movem custa de fagelos externos, dando uma ou mais voltas espirais em torno do prprio eixo. Ex: Aquaspirillium; Alm desses trs tpos morfolgicos, existem algumas formas de transio. Quando os bacilos so muito curtos, podem se assemelhar aos cocos, sendo ento chamados de cocobacilos (Ex: Brucella melitensis). Quando as formas espiraladas so muito curtas, assumindo a forma de vrgula, eles so chamados de vibrio (Ex: V. cholerae). - Espiroquetas: So fexveis e locomovem-se provavelmente s custas de contraes do ci- toplasma, podendo dar vrias voltas completas em torno do prprio eixo. Ex: Treponema pallidum, Treponema dentcola. Colorao de Gram - www.icb.ufmg.br/mic Leitura Sugerida Ministrio da Sade, Programa Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e AIDS. Tcni- ca de Colorao de Gram. Braslia, 1997. Disponvel via URL em: htp://bvsms.saude.gov.br/bvs/ publicacoes/115_03gram.pdf FREITAS, V. R.; PICOLI, S. U. A Colorao de Gram e as Variaes na sua Execuo. Newslab, 2007. Disponvel via URL em: htp://www.newslab.com.br/ed_anteriores/82/art02/art02.pdf